JP6192862B2 - Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受容体α鎖 - Google Patents
Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受容体α鎖 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6192862B2 JP6192862B2 JP2016574302A JP2016574302A JP6192862B2 JP 6192862 B2 JP6192862 B2 JP 6192862B2 JP 2016574302 A JP2016574302 A JP 2016574302A JP 2016574302 A JP2016574302 A JP 2016574302A JP 6192862 B2 JP6192862 B2 JP 6192862B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- present
- acid sequence
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 title claims description 29
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 97
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 89
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 43
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102100038006 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 7
- 101000878611 Homo sapiens High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、医薬品として有用なFc融合高親和性IgE受容体α鎖（Fc-fused high affinity IgE receptor α-chain）に関する。
さらに詳しく述べれば、本発明は、低pHにおける優れた安定性を有するFc融合高親和性IgE受容体α鎖、及びその医薬用途に関する。
免疫グロブリンE（IgE）は、アレルギー反応を担う免疫グロブリン群の１つである。B細胞により分泌され、又はB細胞の表面上に発現されるIgEは、マスト細胞及び好塩基球等の表面上に認められる高親和性IgE受容体（FcεRI）に結合する。マスト細胞表面受容体上のIgEに抗原タンパク質が結合すると、IgEが抗原を架橋するような形になる。その後、細胞内顆粒中に貯蔵されているヒスタミンやセロトニン等のケミカルメディエーター等が放出される。この結果、炎症反応が誘起され、毛細血管拡張、血管透過性亢進等のI型アレルギー症状が引き起こされる（非特許文献１）。
したがって、IgEとFcεRIとの結合を阻害する化合物又はタンパク質は、IgEがマスト細胞及び好塩基球等の表面上に認められるFcεRIに結合することを阻害するので、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のI型アレルギー性疾患の治療剤として期待される（非特許文献２）。
近年、従来の低分子化合物を有効成分とする医薬品に加え、生体内の特定の受容体等に強く結合し、優れた治療効果を示すタンパク質医薬品の開発が行われている。例えば、関節リウマチの治療剤としてエタネルセプトが知られている。エタネルセプトは、腫瘍壊死因子（TNF）の可溶性レセプターが生体内においてTNFの作用を抑制する役割を果たしていることに着目し開発された、完全ヒト型可溶性TNFα／LTαレセプター製剤である。
タンパク質医薬品は高い治療効果が期待できるが、その反面、その製造工程において、タンパク質医薬品特有の問題が生じることもある。
一般に、抗体やFc融合タンパク質を医薬品として製造する際、プロテインAを用いた精製方法が用いられる。この方法には、プロテインAに結合した目的タンパク質を溶出させるために、低pHの緩衝液が用いられる。また、ウィルス不活化のために、目的タンパク質を一定時間、低pHで処理することが望ましい。
低pHにおける安定性が乏しいタンパク質は、凝集体を作りやすい。凝集体の割合が高い場合、タンパク質医薬品の製造において精製効率や生産量の低下が引き起こされる。また、医薬品に凝集体が混入することにより、免疫反応が惹起され、アナフィラキシー等の重大な副作用が引き起こされる可能性もある。
そのため、タンパク質医薬品の製造において、低pHにおける目的タンパク質の不安定性が問題になることがある。
免疫グロブリン及び細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド（免疫アドヘゾン）が特許文献１に記載されている。特許文献１において免疫アドヘゾンの例示の1つとして高親和性IgE受容体が記載されている。しかしながら、前記文献には、高親和性IgE受容体と免疫グロブリンとの融合タンパク質は、具体的に記載されていない。
高親和性IgE受容体α鎖（FcεRI α-chain、以下「FCER1A」とする。）と免疫グロブリンG1（IgG1）との融合タンパク質（以下、「Fusion protein A」とする。）が、非特許文献３に記載されている。しかしながら、前記文献に記載のFusion protein Aと、本願発明のタンパク質とは、FCER1A とIgG1（Fc）の接合様式が大きく異なる。すなわち、本願発明のタンパク質は、そのFcεRIとIgG1のリンカーフラグメント領域に特徴的なアミノ酸配列を有する。
高親和性IgE受容体（FcεRI）の水溶性断片とヒトFc領域とがペプチドリンカーで連結された融合タンパク質（NPB301）が特許文献２に記載されている。しかしながら、本願発明のタンパク質は、特許文献２に記載されたペプチドリンカーを含まない。また、特許文献２には、本願発明のリンカーフラグメント領域の特徴的なアミノ酸配列について、記載も示唆も無い。
FCER1Aと免疫グロブリンG2（IgG2）との融合タンパク質が、特許文献３に記載されている。しかしながら、前記IgG2との融合タンパク質と本願発明のタンパク質とは、リンカーフラグメント領域及びFc領域においてアミノ酸配列が異なる。
非ヒト霊長類FCER1AとIgG1との融合タンパク質が、特許文献４に記載されている。また、FCER1AとIgG1との融合タンパク質が、特許文献５〜７に記載されている。しかしながら、前記文献には、本願発明のリンカーフラグメント領域の特徴的なアミノ酸配列について、記載も示唆も無い。
上述の非特許文献３、及び特許文献１〜７には、本発明のタンパク質は、記載も示唆もない。
羅智靖、「アレルギーの分子細胞機構」、BIO INDUSTRY、2008年、第25巻、第9号、P．23-39
Chisei Raら、「International Immunology」、1993年、第5巻、第1号、P．47-54
M. Haak-Frendschoら、「Journal of Immunology」、1993年、第151巻、第1号、P. 351-358
本発明は、低pHにおける優れた安定性を有するFc融合高親和性IgE受容体α鎖を提供することを課題とする。
本発明者らは、低pHや熱に対して安定性の高いFc融合高親和性IgE受容体α鎖を得ようと鋭意検討を行った。その結果、高親和性IgE受容体α鎖とIgG1のFc領域を含む融合タンパク質において、リンカーフラグメントとして３つのCysを含むものを用いることにより、安定性の高いFc融合高親和性IgE受容体α鎖を得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
本発明は、以下の〔１〕〜〔５〕等に関する。
〔１〕（i）高親和性IgE受容体α鎖；及び
（ii）IgG1のFc領域
とを含有し、前記（i）及び（ii）のリンカーフラグメント領域が、配列番号２のアミノ酸配列であることを特徴とするFc融合タンパク質。
〔２〕〔１〕のFc融合タンパク質であって、配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列のC末端のリシン（K）が欠損したアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質。
〔３〕２量体である、〔１〕又は〔２〕のFc融合タンパク質。
〔４〕リンカーフラグメント領域のシステイン残基同士が３つのジスルフィド結合を形成する、〔３〕のFc融合タンパク質。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかのFc融合タンパク質を有効成分として含有する、医薬組成物。
〔１〕（i）高親和性IgE受容体α鎖；及び
（ii）IgG1のFc領域
とを含有し、前記（i）及び（ii）のリンカーフラグメント領域が、配列番号２のアミノ酸配列であることを特徴とするFc融合タンパク質。
〔２〕〔１〕のFc融合タンパク質であって、配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列のC末端のリシン（K）が欠損したアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質。
〔３〕２量体である、〔１〕又は〔２〕のFc融合タンパク質。
〔４〕リンカーフラグメント領域のシステイン残基同士が３つのジスルフィド結合を形成する、〔３〕のFc融合タンパク質。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかのFc融合タンパク質を有効成分として含有する、医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-032231号、2015-252231号の開示内容を包含する。
本発明のタンパク質は、低pHにおける優れた安定性を有する。また、本発明のタンパク質は、IgEに対する優れた中和活性を有する。したがって、本発明のタンパク質は、IgEが介在するI型アレルギー性疾患の予防又は治療用のタンパク質医薬品として有用である。
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
本発明において、各用語は、特に断らない限り、以下の意味を有する。
本発明において、「高親和性IgE受容体α鎖（FCER1A)」とは、高親和性IgE受容体の細胞外ドメインであるα鎖部分を含むタンパク質をいう。高親和性IgE受容体α鎖は、例えば、以下の配列番号１で表されるタンパク質をいう。
配列番号１：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWL
配列番号１：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWL
上記高親和性IgE受容体α鎖には、配列番号１に表されるアミノ酸配列に対して、例えば、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IgEに対する結合能を有するタンパク質が含まれる。また、配列番号１に表されるアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IgEに対する結合能を有するタンパク質が含まれる。
本発明において、「IgG1のFc領域」とは、免疫グロブリンG1のFcフラグメント、すなわち、天然の免疫グロブリンG1のCH2及びCH3定常ドメインをいう。前記IgG1のFc領域には、天然の突然変異体、人工変異体、及びトランケートされた形態のいずれも含まれる。
本発明において、「高親和性IgE受容体α鎖及びIgG1のFc領域のリンカーフラグメント領域」とは、上記高親和性IgE受容体α鎖と上記IgG1のFc領域の接合点からFｃ領域方向に14アミノ酸残基の領域をいう。
本発明において、「Fc融合タンパク質」とは、高親和性IgE受容体α鎖及び免疫グロブリンのFcフラグメントを含む組換えタンパク質をいう。
本発明のタンパク質は、その高親和性IgE受容体α鎖及びIgG1のFc領域のリンカーフラグメント領域が、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列であることを特徴とする。
配列番号２：
EPKSCDKTHTCPPC
配列番号２：
EPKSCDKTHTCPPC
本発明のタンパク質は、好ましくは、以下の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質（以下、「Protein 1」とする。）である。
配列番号３：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（配列番号３で表されるアミノ酸配列の１番目のValから１７９番目のLeuまで）と配列番号２で表されるアミノ酸配列（配列番号３で表されるアミノ酸配列の１８０番目のGluから１９３番目のCysまで）と免疫グロブリンのFcフラグメントのアミノ酸配列（配列番号３で表されるアミノ酸配列の１９４番目のProから４１１番目のLysまで）をこの順で融合した配列を有する。該Fc融合タンパク質は、配列番号３に表されるアミノ酸配列のうち配列番号２のアミノ酸配列に相当する１８０番目のGluから１９３番目のCysまでのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列に対して、例えば、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IgEに対する結合能を有するタンパク質が含まれる。また、配列番号３に表されるアミノ酸配列のうち配列番号２のアミノ酸配列に相当する１８０番目のGluから１９３番目のCysまでのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列に対して、1又は複数若しくは数個(1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IgEに対する結合能を有するタンパク質が含まれる。
リコンビナント抗体を製造する際、C末端のリシンが翻訳後修飾により欠失する場合がある。従って、本発明のタンパク質は、上記Protein 1のC末端のリシン（K）が欠損したアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質であっても良い。例えば、配列番号３に表されるタンパク質のProtein 1のC末端のリシン（K）が欠損したアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の１番目から４１０番目のアミノ酸配列からなる。
本発明のタンパク質は、高親和性IgE受容体α鎖及びIgG1のFc領域が、配列番号２のアミノ酸配列からなるリンカーフラグメントを介したFc融合タンパク質の単量体も、２量体も含む。上記リンカーフラグメント領域には３つのCys残基が存在し（配列番号３で表されるアミノ酸配列の第１８４番目、第１９０番目及び第１９３番目のCys)、ジスルフィド結合により２量体を形成し得る。通常、２つのFc融合タンパク質単量体は上記の３つのCysの同じ位置のCys同士間の３つのジスルフィド結合の形成により２量体を形成する。上記３つのジスルフィド結合により２量体は安定化され、低pH、熱に対して高い安定性を有する。低pH、熱に対する安定性が高いとは、例えば、低pH条件下、加熱下における凝集体の形成が少ないことをいい、例えば、低pH処理又は加熱処理した後に、ゲル濾過クロマトグラフィーで凝集体の含有量を測定することにより確認することができる。例えば、本発明のFc融合タンパク質を２〜８℃、好ましくは４℃の低温下、pH１〜５、好ましくはpH２〜４で、１日〜１か月間、好ましくは１日〜14日間、さらに好ましくは５〜12日間保存しても、あるいは、25〜45℃、好ましくは30〜40℃で１日〜１か月間、好ましくは１日〜14日間、さらに好ましくは１日〜７日間保存しても、凝集体含有率変化は少ない。例えば、本発明のタンパク質の凝集体含有率変化はゲル濾過クロマトグラフィーのピーク面積に基づいて計算した場合に10％以下、好ましくは８％以下である。また、リンカーフラグメントとして、２つ以下のCysを有するものを有するFc融合タンパク質に比べて、本発明のタンパク質の凝集体含有率変化は小さい。
本発明のタンパク質は、例えば、以下の方法若しくはそれに準じた方法、又は文献記載の方法若しくはそれに準じた方法に従い、製造することができる。
本発明のタンパク質は、当該技術分野の当業者にとって周知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするDNAを用意し、このDNAを含む発現ベクターを構築する。次いで、前記ベクターを用いて原核又は真核細胞を形質転換又はトランスフェクションし、得られた細胞の培養上清から目的のタンパク質を単離及び精製することができる。
本発明のタンパク質は、当該技術分野の当業者にとって周知のタンパク質発現細胞を用いて製造することもできる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードするcDNAを、哺乳類発現プラスミドベクターに組込んでタンパク質発現プラスミドを調製したのち，チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）等の動物細胞に導入して、安定発現細胞株を樹立する。この細胞を培養して培養上清中から本発明のタンパク質を得ることができる。
本発明のタンパク質は、必要に応じて、当該技術分野の当業者にとって周知の単離及び精製手段により、単離及び精製することができる。例えば、単離及び精製方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、透析、沈殿分画法、電気泳動等が挙げられる。これらの方法を適宜組み合わせて、本発明のタンパク質を単離及び精製することもできる。
本発明のタンパク質は、当該技術分野の当業者にとって周知の化学修飾がされていてもよい。例えば、化学修飾には、グリコシル化、ポリエチレングリコール（PEG）化、アセチル化、アミド化等が挙げられる。
本発明のタンパク質は、IgEに対する優れた中和活性を有するので、IgEが介在する種々の疾患の予防又は治療薬として使用することができる。例えば、本願発明のタンパク質は、気管支喘息、好酸球性中耳炎、好酸球性副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、食物アレルギー、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック等のI型アレルギーが関与する疾患等の予防又は治療薬として有用である。
本発明のタンパク質は、IgEに対する優れた親和性を有する。そのため、抗体薬物複合体（ADC）のように、本発明のタンパク質は、その親和性を利用した「タンパク質−薬物複合体」としても使用することもできる。例えば、「Protein 1−薬物」、「Protein 1−リンカー−薬物」等の使用態様が挙げられる。薬物としては抗アレルギー剤等を用いることができ、複合体は当該技術分野の当業者にとって周知の方法で作製することができる。
本発明の医薬組成物は、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。例えば、経口剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤、吸入粉末剤、吸入液剤、点眼剤、液剤、ローション剤、スプレー剤、点鼻剤、点滴剤、軟膏剤、坐剤、貼付剤等を挙げることができる。
本発明の医薬組成物は、用法に応じ種々の投与方法が用いられる。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、局所投与、筋肉内投与等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、本発明のタンパク質及び少なくとも１つの医薬品添加物を用いて調製される。本発明の医薬組成物は、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により調製することができる。例えば、医薬品添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物が挙げられる。前記医薬品添加物には、生理食塩水、注射用水等も含まれる。本発明の医薬組成物は、前記医薬品添加物と混合、希釈又は溶解することにより調製することができる。
本発明の医薬組成物を予防又は治療に用いる場合、その有効成分である本発明のタンパク質の投与量は、患者の年齢、性別、体重、疾患の程度、剤型、投与経路等により、適宜決定される。成人に対する投与量は、経口投与の場合、例えば、0.1μg/kg 〜1000mg/kg／日の範囲で定めることもできる。経口投与の1日投与量は、剤型に応じて、好ましくは0.1mg/kg 〜10mg/kg／日の範囲である。１日投与量を、１回、２回又は３回に分けて投与しても良い。また、成人に対する投与量は、非経口投与の場合の0.01μg/kg 〜1000mg/kg／日範囲で定めることもできる。非経口投与の1日投与量は、剤型に応じて、好ましくは0.1μg/kg 〜10μg/kg／日、1μg/kg 〜100μg/kg／日、又は10μg/kg 〜1000μg/kg／日の範囲である。
本発明の内容について、以下の実施例及び試験例により、さらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は、その内容に限定されるものでない。
実施例１
Protein 1の発現及び調製
（１）Protein 1発現ベクターの調製
配列番号３のアミノ酸配列をコードするcDNAを、哺乳類発現プラスミドベクターに組み込んでProtein 1発現プラスミドを調製した。
Protein 1の発現及び調製
（１）Protein 1発現ベクターの調製
配列番号３のアミノ酸配列をコードするcDNAを、哺乳類発現プラスミドベクターに組み込んでProtein 1発現プラスミドを調製した。
（２）Protein 1発現細胞の調製
Protein 1発現プラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）に導入して、Protein 1の安定発現細胞株を樹立した。培養上清中へのProtein 1の分泌をSDS-PAGEにて確認した。
Protein 1発現プラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）に導入して、Protein 1の安定発現細胞株を樹立した。培養上清中へのProtein 1の分泌をSDS-PAGEにて確認した。
試験例１
IgE結合阻害活性（IgE中和活性）
（１）アッセイプレートの調製
Protein 1をコーティング緩衝液に溶解して、マイクロプレートに一定量を添加した。4℃で18時間以上放置後、洗浄用緩衝液（PBS-Tween20）にて洗浄し、ブロッキング液（Assay Diluent）（BD Biosciences）を添加した。室温で１時間放置後にブロッキング液を除去し、洗浄用緩衝液で洗浄し、結合阻害活性測定に用いた。
IgE結合阻害活性（IgE中和活性）
（１）アッセイプレートの調製
Protein 1をコーティング緩衝液に溶解して、マイクロプレートに一定量を添加した。4℃で18時間以上放置後、洗浄用緩衝液（PBS-Tween20）にて洗浄し、ブロッキング液（Assay Diluent）（BD Biosciences）を添加した。室温で１時間放置後にブロッキング液を除去し、洗浄用緩衝液で洗浄し、結合阻害活性測定に用いた。
（２）結合阻害活性の測定方法
陽性対照としてomalizumab（抗ヒトIgE抗体）を用いて、Protein 1のIgE結合阻害活性を以下の方法で測定した。
陽性対照としてomalizumab（抗ヒトIgE抗体）を用いて、Protein 1のIgE結合阻害活性を以下の方法で測定した。
一定量のヒトIgE（ANTIBODYSHOP）と任意の濃度のProtein 1またはomalizumab（Novartis）を混合して、上記（１）で調製したプレートに添加して室温にて約2時間放置した。混合液を廃棄後、洗浄用緩衝液で洗浄し、HRP標識抗ヒトIgE抗体（BD Biosciences）を添加し、室温にて約1時間放置した。抗体液を廃棄後、洗浄用緩衝液を用いて洗浄した。TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）溶液を添加し、一定時間後にリン酸を加えて発色反応を停止した。その後、プレートリーダーを用いて吸光度（OD450）を測定した。プレートに固定したProtein 1に結合した IgE量よりProtein 1 およびomalizumabのIgE結合阻害活性（IgE中和活性）を評価した（図１）。
（３）結果
本発明のProtein 1は、IgEのFCER1Aへの結合を濃度依存的に阻害した。
本発明のProtein 1は、IgEのFCER1Aへの結合を濃度依存的に阻害した。
試験例２
低pHにおける安定性試験
（１）サンプルの調製
精製操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用いて実施した。実施例１記載の方法と同様の方法によりProtein 1を発現し、その培養上清をD-PBS(-)（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)で2倍希釈し、HiTrap rProtein A FF（GEヘルスケア、17-5079-01）に負荷した。前記カラムをD-PBS(-)で洗浄後、100mMグリシン塩酸緩衝液（pH2.2）で溶出し、プロテインA吸着フラクションを1.0mL/tubeで分取した。ピークフラクションを混合し低pH処理サンプル（pH2.9）とした。前記低pH処理サンプルを4℃で保存したものを評価用サンプルとした。評価用サンプルから所定の時間（4℃保存から5日〜12日後）に0.25mLのサンプリングを行い、0.05mLの1M トリス塩酸緩衝液（pH9.0）を加えて中和し、中和処理サンプルを得た。
低pHにおける安定性試験
（１）サンプルの調製
精製操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用いて実施した。実施例１記載の方法と同様の方法によりProtein 1を発現し、その培養上清をD-PBS(-)（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)で2倍希釈し、HiTrap rProtein A FF（GEヘルスケア、17-5079-01）に負荷した。前記カラムをD-PBS(-)で洗浄後、100mMグリシン塩酸緩衝液（pH2.2）で溶出し、プロテインA吸着フラクションを1.0mL/tubeで分取した。ピークフラクションを混合し低pH処理サンプル（pH2.9）とした。前記低pH処理サンプルを4℃で保存したものを評価用サンプルとした。評価用サンプルから所定の時間（4℃保存から5日〜12日後）に0.25mLのサンプリングを行い、0.05mLの1M トリス塩酸緩衝液（pH9.0）を加えて中和し、中和処理サンプルを得た。
比較対照として、非特許文献３記載のFusion protein Aを用いた。実施例１と同様の方法によりFusion protein Aを発現し、上記方法と同様の方法により、中和処理サンプルを得た。なお、本試験に用いたFusion protein Aは、以下の配列番号４のアミノ酸配列で表されるタンパク質である。配列番号４のアミノ酸配列は、第１８０番目のAspから第１８８番目のCysからなるリンカーフラグメントを含み、該リンカーフラグメントに含まれるCysの数は２個である。
配列番号４：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号４：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
（２）凝集体含量の解析方法
凝集体の解析操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用い、移動相をD-PBS(-)としてSuperdex200 10/300GL（GEヘルスケア、17-5175-01）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより確認した。溶出位置が単量体であるピークと、高分子領域に溶出される凝集体ピークについての面積を算出し、Protein 1及びFusion protein Aの低pH処理に対する凝集体含有率変化（％）の推移を評価した（図２）。
凝集体の解析操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用い、移動相をD-PBS(-)としてSuperdex200 10/300GL（GEヘルスケア、17-5175-01）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより確認した。溶出位置が単量体であるピークと、高分子領域に溶出される凝集体ピークについての面積を算出し、Protein 1及びFusion protein Aの低pH処理に対する凝集体含有率変化（％）の推移を評価した（図２）。
（３）結果
本発明のタンパク質は、Fusion protein Aに比べ低pH処理時間に伴う凝集体形成の増加量が大幅に少なく、低pH暴露に対する高い安定性を示した。したがって、本発明のタンパク質は低pHにおける安定性に優れ、製造プロセスおいて精製効率や生産性の向上が期待される。
本発明のタンパク質は、Fusion protein Aに比べ低pH処理時間に伴う凝集体形成の増加量が大幅に少なく、低pH暴露に対する高い安定性を示した。したがって、本発明のタンパク質は低pHにおける安定性に優れ、製造プロセスおいて精製効率や生産性の向上が期待される。
試験例３
熱に対する安定性試験
（１）サンプルの調製
精製操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用いて実施した。実施例１記載の方法と同様の方法によりProtein 1を発現し、その培養上清をHiTrap MabSelect SuRe（GEヘルスケア、17-0034-94）に負荷した。前記カラムをD-PBS(-)及び100mM クエン酸緩衝液（pH4.0）で洗浄後、プロテインA吸着物を100mMグリシン塩酸緩衝液（pH3.3）で溶出した。回収したフラクションに1/10容量の1M トリス塩酸緩衝液（pH9.0）を加えて中和し、プロテインA精製タンパク質を得た。このプロテインA精製タンパク質を1 N HClでpH4.0に調整し、疎水性相互作用と陽イオン交換のミックス-モード樹脂を充填したカラムに負荷した。50mM 酢酸緩衝液（pH4.0）で非吸着タンパク質を洗浄後、50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）への100％リニアグラジエント溶出を行い、ピークフラクションを回収して精製タンパク質を得た。得られたタンパク質を、移動相をD-PBS(-)としてHiLoad 16/60 Superdex200 prep grade（GEヘルスケア、17-1069-01）を用い、ゲル濾過分画を行った。単量体に相当するピークフラクションを回収してゲル濾過精製サンプルを得た。このゲル濾過精製サンプルについてD-PBS(-)で再調製してマイクロチューブに分注し、37℃でインキュベーションしたものを評価用サンプルとした。評価用サンプルから所定の時間（37℃保存から1日〜7日後）にサンプリングを行い、熱処理サンプルを得た。
熱に対する安定性試験
（１）サンプルの調製
精製操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用いて実施した。実施例１記載の方法と同様の方法によりProtein 1を発現し、その培養上清をHiTrap MabSelect SuRe（GEヘルスケア、17-0034-94）に負荷した。前記カラムをD-PBS(-)及び100mM クエン酸緩衝液（pH4.0）で洗浄後、プロテインA吸着物を100mMグリシン塩酸緩衝液（pH3.3）で溶出した。回収したフラクションに1/10容量の1M トリス塩酸緩衝液（pH9.0）を加えて中和し、プロテインA精製タンパク質を得た。このプロテインA精製タンパク質を1 N HClでpH4.0に調整し、疎水性相互作用と陽イオン交換のミックス-モード樹脂を充填したカラムに負荷した。50mM 酢酸緩衝液（pH4.0）で非吸着タンパク質を洗浄後、50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）への100％リニアグラジエント溶出を行い、ピークフラクションを回収して精製タンパク質を得た。得られたタンパク質を、移動相をD-PBS(-)としてHiLoad 16/60 Superdex200 prep grade（GEヘルスケア、17-1069-01）を用い、ゲル濾過分画を行った。単量体に相当するピークフラクションを回収してゲル濾過精製サンプルを得た。このゲル濾過精製サンプルについてD-PBS(-)で再調製してマイクロチューブに分注し、37℃でインキュベーションしたものを評価用サンプルとした。評価用サンプルから所定の時間（37℃保存から1日〜7日後）にサンプリングを行い、熱処理サンプルを得た。
比較対照として、非特許文献３記載のFusion protein Aを用いた。実施例１と同様の方法によりFusion protein Aを発現し、上記方法と同様の方法により熱処理サンプルを得た。なお、試験に用いたFusion protein Aは、試験例２で用いたタンパク質と同じアミノ酸配列のタンパク質である。
（２）凝集体含有量の解析方法
凝集体の解析操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用い、移動相をD-PBS(-)としてSuperdex200 10/300GL（GEヘルスケア、17-5175-01）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより確認した。溶出位置が単量体であるピークと、高分子領域に溶出される凝集体ピークについての面積を算出し、Protein 1及びFusion protein Aの熱処理における凝集体含有率変化（％）の推移を評価した（図３）。
凝集体の解析操作はAKTA Explorer 10 S（GEヘルスケア）を用い、移動相をD-PBS(-)としてSuperdex200 10/300GL（GEヘルスケア、17-5175-01）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより確認した。溶出位置が単量体であるピークと、高分子領域に溶出される凝集体ピークについての面積を算出し、Protein 1及びFusion protein Aの熱処理における凝集体含有率変化（％）の推移を評価した（図３）。
（３）結果
本発明のタンパク質は、Fusion protein Aに比べ37℃保存での凝集体含量の増加が少なく、37℃暴露に対してより安定であることを示した。したがって、本発明のタンパク質は、低pHにおける安定性に加え、熱に対する安定性にも優れ、製造プロセスおいて精製効率や生産性の向上が期待される。
本発明のタンパク質は、Fusion protein Aに比べ37℃保存での凝集体含量の増加が少なく、37℃暴露に対してより安定であることを示した。したがって、本発明のタンパク質は、低pHにおける安定性に加え、熱に対する安定性にも優れ、製造プロセスおいて精製効率や生産性の向上が期待される。
本発明のタンパク質は、IgEに対する優れた中和活性を有するので、IgEが介在する種々の疾患の予防又は治療用のタンパク質医薬品として使用することができる。
配列番号２ 合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (5)
- （i）高親和性IgE受容体α鎖；及び
（ii）IgG1のFc領域
とを含有し、前記（i）及び（ii）のリンカーフラグメント領域が、配列番号２のアミノ酸配列であることを特徴とするFc融合タンパク質。 - 請求項１に記載のFc融合タンパク質であって、配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列のC末端のリシン（K）が欠損したアミノ酸配列を含むFc融合タンパク質。
- ２量体である、請求項１又は２に記載のFc融合タンパク質。
- リンカーフラグメント領域のシステイン残基同士が３つのジスルフィド結合を形成する、請求項３記載のFc融合タンパク質。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のFc融合タンパク質を有効成分として含有する、医薬組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015032231 | 2015-02-20 | ||
| JP2015032231 | 2015-02-20 | ||
| JP2015252231 | 2015-12-24 | ||
| JP2015252231 | 2015-12-24 | ||
| PCT/JP2016/054854 WO2016133197A1 (ja) | 2015-02-20 | 2016-02-19 | Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受容体α鎖 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016133197A1 JPWO2016133197A1 (ja) | 2017-06-15 |
| JP6192862B2 true JP6192862B2 (ja) | 2017-09-06 |
Family
ID=56692248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016574302A Active JP6192862B2 (ja) | 2015-02-20 | 2016-02-19 | Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受容体α鎖 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10077297B2 (ja) |
| EP (1) | EP3260469B1 (ja) |
| JP (1) | JP6192862B2 (ja) |
| KR (2) | KR102602539B1 (ja) |
| CN (1) | CN107207623B (ja) |
| AU (1) | AU2016220766B2 (ja) |
| BR (1) | BR112017017609A2 (ja) |
| CA (1) | CA2976623C (ja) |
| ES (1) | ES2806205T3 (ja) |
| HK (1) | HK1244016A1 (ja) |
| IL (1) | IL253832B (ja) |
| MX (1) | MX2017010359A (ja) |
| PL (1) | PL3260469T3 (ja) |
| PT (1) | PT3260469T (ja) |
| RU (1) | RU2715606C2 (ja) |
| SG (1) | SG11201706543UA (ja) |
| TW (1) | TWI691512B (ja) |
| WO (1) | WO2016133197A1 (ja) |
| ZA (2) | ZA201706281B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3538558A4 (en) * | 2016-11-09 | 2020-07-15 | North Carolina State University | TREATMENT OF ALLERGIC DISEASES WITH A CHIMERAL PROTEIN |
| KR102038672B1 (ko) * | 2018-01-08 | 2019-10-30 | (주)지아이이노베이션 | IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 약학적 조성물 |
| CN118638245A (zh) * | 2018-01-08 | 2024-09-13 | Gi 医诺微新 | IgE Fc受体的α亚基的胞外域、包含其的药物组合物及其制备方法 |
| BR112020013818A2 (pt) * | 2018-01-12 | 2020-12-01 | Gi Innovation, Inc. | composição compreendendo probióticos e polipeptídeo com afinidade de ligação para ige e uso dos mesmos |
| WO2019183437A1 (en) | 2018-03-23 | 2019-09-26 | North Carolina State University | Methods and compositions for antibody to high affinity receptor for ige |
| CN114080398B (zh) * | 2019-07-08 | 2024-05-31 | Gi医诺微新 | 包含IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域且具有高唾液酸含量的多肽二聚体及包含其的药物组合物 |
| KR20210006300A (ko) * | 2019-07-08 | 2021-01-18 | 주식회사 프로젠 | 신규 알러지 질환 치료용 약학적 조성물 |
| WO2021006375A1 (ko) * | 2019-07-08 | 2021-01-14 | (주)지아이이노베이션 | Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5336603A (en) | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
| US5641870A (en) * | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| WO2003048334A2 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokines with modulated selectivity |
| WO2008028068A2 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Genentech, Inc. | NON-HUMAN PRIMATE FCεR1α POLYPEPTIDES |
| JP2010519194A (ja) | 2007-02-15 | 2010-06-03 | アストラゼネカ・アクチエボラーグ | ＩｇＥ分子に対する結合要素 |
| AR065368A1 (es) | 2007-02-15 | 2009-06-03 | Astrazeneca Ab | Anticuerpos para moleculas de ige |
| ES2478242T3 (es) * | 2007-03-22 | 2014-07-21 | Genentech, Inc. | Anticuerpos anti IgE apoptóticos que se unen con el IgE unido a membrana |
| KR101631454B1 (ko) | 2008-10-31 | 2016-06-17 | 가부시키가이샤 한도오따이 에네루기 켄큐쇼 | 논리회로 |
| CN101633698B (zh) | 2009-08-26 | 2011-12-21 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用 |
| JP6139885B2 (ja) | 2009-10-26 | 2017-05-31 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 治療的抗ＩｇＥ抗体に特異的な抗体を検出するためのアッセイ及びアナフィラキシーにおけるそれらの使用 |
| ES2826894T3 (es) * | 2010-02-19 | 2021-05-19 | Xencor Inc | Nuevas inmunoadhesinas CTLA4-IG |
| GB201014033D0 (en) * | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
| WO2012169735A2 (ko) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | (주)네오팜 | FCεRI의 수용성 단편을 포함하는 복합체 및 이를 포함하는 IGE 매개 알레르기성 질환 치료용 조성물 |
| GB201203051D0 (en) * | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
| GB201203071D0 (en) | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
| WO2014087010A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Ablynx N.V. | IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE |
-
2016
- 2016-02-17 TW TW105104590A patent/TWI691512B/zh active
- 2016-02-19 WO PCT/JP2016/054854 patent/WO2016133197A1/ja active Application Filing
- 2016-02-19 US US15/552,065 patent/US10077297B2/en active Active
- 2016-02-19 PL PL16752583T patent/PL3260469T3/pl unknown
- 2016-02-19 SG SG11201706543UA patent/SG11201706543UA/en unknown
- 2016-02-19 KR KR1020177021139A patent/KR102602539B1/ko active IP Right Grant
- 2016-02-19 CA CA2976623A patent/CA2976623C/en active Active
- 2016-02-19 PT PT167525831T patent/PT3260469T/pt unknown
- 2016-02-19 AU AU2016220766A patent/AU2016220766B2/en active Active
- 2016-02-19 CN CN201680010238.XA patent/CN107207623B/zh active Active
- 2016-02-19 JP JP2016574302A patent/JP6192862B2/ja active Active
- 2016-02-19 KR KR1020237029823A patent/KR20230132610A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-02-19 RU RU2017132689A patent/RU2715606C2/ru active
- 2016-02-19 BR BR112017017609-2A patent/BR112017017609A2/ja not_active Application Discontinuation
- 2016-02-19 ES ES16752583T patent/ES2806205T3/es active Active
- 2016-02-19 EP EP16752583.1A patent/EP3260469B1/en active Active
- 2016-02-19 MX MX2017010359A patent/MX2017010359A/es unknown
-
2017
- 2017-08-03 IL IL253832A patent/IL253832B/en active IP Right Grant
- 2017-09-15 ZA ZA2017/06281A patent/ZA201706281B/en unknown
-
2018
- 2018-03-13 HK HK18103481.0A patent/HK1244016A1/zh unknown
- 2018-06-22 ZA ZA2018/04191A patent/ZA201804191B/en unknown
- 2018-07-13 US US16/034,648 patent/US20180312566A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6192862B2 (ja) | Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受容体α鎖 | |
| EP2964674B1 (en) | Anti-tnf-anti-il-17 bispecific antibodies | |
| US9708402B2 (en) | Anti-BAFF-anti-IL-17 bispecific antibodies | |
| WO2023061390A1 (en) | Treatment of ige-mediated diseases | |
| NZ734482B2 (en) | Fc FUSION HIGH AFFINITY IgE RECEPTOR α-CHAIN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161220 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20161220 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20170210 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170221 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170405 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170718 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170808 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6192862 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |