JP2021510689A - プロバイオティクスおよびIgEへの結合親和性を有するポリペプチドを含む組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、有効成分としてプロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物は、インビボでアレルギーを改善する優れた効果を発揮する。したがって、該組成物は、重度のアレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物として使用することができる。さらに、本発明の組成物が経口免疫療法に適用できるという観点から、該組成物は、食物アレルギーに対してより効果的であり、副作用を減少させるだけでなく、IgE媒介性アレルギーに苦しむ子供を治療するためにも理想的である。したがって、該組成物は、アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品として使用することができる。
本発明の1つの態様では、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(配列番号:17)、ここで、Xaa1は、LysまたはGlyであってもよく、およびXaa2は、Glu、Gly、またはSerであってもよい。具体的には、リンカーは、配列番号:3および配列番号:19のアミノ酸配列を有することができ、それによって、タンパク質生産プロセス中のトランケート型の生成を最小限にする。
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(配列番号:18)、ここで、Xaa3は、LysまたはGlyであってもよく、およびXaa4は、Glu、Gly、またはSerであってもよい。具体的には、リンカーは、配列番号:4のアミノ酸配列を有することができ、それによって、タンパク質生産プロセス中のトランケート型の生成を最小限にする。
上記の物質が追加される可能性のある食品は、製造時に通常追加される成分を含み、成分の例として、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、香味剤、および調味料が挙げられる。上記の炭水化物は、典型的な糖、たとえば、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、ならびにデキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、およびエリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、タウマチンおよびステビア治療などの天然香料、サッカリンおよびアスパルテームなどの合成香料などを使用することができる。
発明の詳細な記載
IgE TRAP のための細胞株構築およびその精製
IgETRAPのヌクレオチド配列は、FcεRIα細胞外ドメインのC末端(26番目から205番目)をIgD/IgG4ハイブリッドFcドメイン(IgD、133番目から170番目;IgG4、121番目から327番目)のN末端に連結させることによって構築された。該タンパク質は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣DG44細胞において発現された。IgETRAPを、HiTrap rProtein A FFカラム(GE Healthcare)を用いて精製し、その純度を還元および非還元条件下のSDS-PAGEで確認した。
IgETRAPの構造モデルを、WinCootを使用して設計し、Protein Data BankのFcεRIα(PDB受託番号1F6A)およびIgD/IgG4 Fc(PDB受託番号1ADQ)に関する情報に基づいてPyMOLソフトウェアを用いて構築された。
SPRアッセイを、ProteOn XPR36(Bio-Rad)装置を使用して行った。動態解析を使用して、オマリズマブおよびIgETRAPのヒトIgE(Calbiochem)への結合の程度を同定した。酢酸緩衝液(pH5.5)中の850応答単位(RU)のオマリズマブおよび酢酸緩衝液(pH4.0)中の500 RUのIgETRAPを、ProteOn(商標)GLCセンサーチップ(Bio-Rad)に固定化した。Tween-20を含むPBSをランニング緩衝液として用い、流速を30μl/分に設定した。各データセットのグラフを、ProteOn Managerソフトウェア(Bio-Rad)を用いて分析した。
IgETRAPおよびオマリズマブのIgG受容体への結合の程度を、Octet RED384システム(Pall ForteBio、CA、USA)を使用して同定した。300mM酢酸緩衝液(pH5)中で希釈されたFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、およびFcγRIIIB組換えタンパク質(R&D Systems Inc.、5μg/ml)を、400mM EDCおよび10mMスルホ-NHSの組み合わせによって活性化さたれたAmine Reactive 2 Generation(AR2G)バイオセンサーに固定化した。次に、さまざまな濃度のIgETRAPおよびオマリズマブとの会合およびそれらからの解離を、それぞれ300秒間測定した。ここで、使用した動態緩衝液は、0.1%Tween-20および1%ウシ血清を含むPBSであり、すべての実験を、30℃にてサンプルプレートシェーカーを1,000rpmの速度で使用して行なった。
骨髄由来肥満細胞(BMMC)を、10%熱不活化FBS、10ng/mLマウスIL-3(PeproTech, Inc.)、および50ng/mLマウスSCF(PeproTech, Inc.)を含むRPMI中、37℃にて培養した。分析前に、1μg/mLの抗ジニトロフェニルIgE(Sigma-Aldrich)およびさまざまな濃度のIgETRAPを室温にて30分間インキュベートした。骨髄由来肥満細胞を、抗ジニトロフェニルIgE(Sigma-Aldrich)およびIgETRAPの混合物中で37℃にて30分間インキュベートし、それに0.1μg/mlの抗ジニトロフェニルIgEを加えた。結果物を再度37℃にて30分間インキュベートした。培養上清を回収し、3mM p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニドとともに37℃にて20分間インキュベートした。0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10)を加えて反応を停止し、405nmにて吸光度を測定した。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼの比率を、0.1%Triton X-100で溶解したBMMCの全細胞内含有量との比較によって計算した。
0日目と14日目に、OVA(グレードV;Sigma-Aldrich)50μgおよび硫酸アルミニウムカリウムアジュバント(Sigma-Aldrich)1mgをマウスの腹腔内に投与した。14日後、マウスに50mgのOVA(グレードIII;Sigma-Aldrich)を2日間隔で5回経口投与した。マウスは、OVAの経口投与前に約4〜5時間絶食させた。下痢の発生を、OVA接種後1時間までマウスを監視することによって評価した。B.ロンガムを凍結乾燥し、粉末マウス飼料と3×109 cfu/gで混合した。マウスは、飼料に自由にアクセスさせた。鮮度を保つために、B.ロンガムと混合したマウスの餌を2〜3日ごとに交換した。
小腸の空腸を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋してブロックを作製した。次に、パラフィン切片スライドを作製した。スライドを脱パラフィンし、肥満細胞をナフトールAS-Dクロロ酢酸エステラーゼキット(Sigma-Aldrich)で染色した。杯細胞については、スライドを過ヨウ素酸シッフ染色キット(ScyTek Laboratories, Inc.)で染色した。染色したスライドの画像を、Pannoramic MIDI(3D HISTECH Ltd.)を使用して撮影した。
製造者のプロトコルに従って、マウス総IgE ELISAキット(BioLegend)およびMCPT-1 ELISAキット(Invitrogen)を使用して、マウス血清中のIgEおよびMCPT-1の総濃度を測定した。遊離IgEを測定するために、プレートを1mg/mLのIgETRAPでコーティングし、4℃にて一晩反応させた。残りの分析を、マウス総IgE ELISAキットの製造者のプロトコルに従って行った。
すべてのデータの統計分析は、GraphPad Prism 5ソフトウェア(GraphPad Software Inc.)を使用して行なった。下痢発生を計算するために、ログ-ランク(Mantel-Cox)アッセイを用いるカプラン-マイヤー生存曲線分析を用いた。ニューマン-コイルスの多重比較検定を用いる一元配置分散分析を用いて、検定の有意差を同定した。
実施例1:FcεRIα-ECDおよび改変Fc領域を含むポリペプチドの調製
IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIα-ECD)のC末端改変ポリペプチドを、米国特許第7,867,491号に開示された方法に従って調製した。
上記実施例1で選択された細胞株のうち、i)FcεRIαECD-Fc3、ii)FcεRIαECD-Fc3ST、およびiii)FcεRIαECD-Fc2STを、回分培養法によって、60mlスケールで培養した。得られる培養物を、プロテインAアフィニティーカラムを使用して精製し、次に、精製したタンパク質をSDS-PAGEおよびサイズ排除HPLC(SE-HPLC)に付して、タンパク質の純度を同定した。
IgEへの結合能は、上記の実施例2の方法で精製された4つのタンパク質、i)FcεRIαECD-Fc2、ii)FcεRIαECD-Fc2ST、iii)FcεRIαECD-Fc3、およびiv)FcεRIαECD-Fc3ST、ならびに市販の抗IgE抗体、オマリズマブ(商品名:ゾレア)について比較的に測定された。具体的には、Protein GLCセンサーチップ(Bio-Rad Laboratories, Inc.)のチャネル上にIgEをコーティングし、さまざまな濃度のオマリズマブまたは各FceR1αECD-Fcタンパク質を30μl/分の速度で流すことによって、IgEへの結合能を測定した。
IgETRAPは、IgG媒介アナフィラキシーに関連する低親和性IgG受容体に結合しない。オマリズマブの主要な副作用であるアナフィラキシーは、低親和性IgG受容体への結合の可能性によって引き起こされると予想されたので、BLIアッセイを使用して、オマリズマブをコントロールとして使用しながら、IgETRAPのIgG受容体への結合能を確認した。具体的には、IgETRAPおよびオマリズマブのIgG受容体への結合の程度を、Octet RED384システム(Pall ForteBio、CA、USA)を使用して同定した。
本発明のFcεRIαECD融合タンパク質のインビトロ活性分析のためにベータ-ヘキソサミニダーゼアッセイを行った。具体的には、本発明の実施態様によるFcεRIαECD-Fc2タンパク質を、各濃度でマウスIgE(1μg/mL)と混合し、室温(20℃)にて30分間インキュベートして、サンプルを調製した。肥満細胞活性化のための培養中のマウス骨髄由来肥満細胞を、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)緩衝液で洗浄して、培地を除去し、細胞数を測定した。次に、5×105個の細胞が40μLのHBSS緩衝液に注入されるように調整した。
β-ヘキソサミニダーゼアッセイを行い、インビトロ活性分析によりゾレアと比較したFcεRIαECD融合タンパク質の優位性を確認した。それぞれの薬剤、FcεRIαECD-Fc2ST(IgETRAP)およびゾレアを各濃度にて調製し、次に、ヒトIgE(1μg/mL)と混合した。次に、室温にて30分間インキュベーションを行った。薬物のプレインキュベーション中に、ヒトFcεRI遺伝子を導入し、マウスFcεRI遺伝子が除去されたマウス骨髄由来の肥満細胞およびマウス骨髄から分化した肥満細胞を調製した。調製した肥満細胞をHBSS緩衝液で洗浄し、次に、5×105個の細胞を60μLのHBSS緩衝液に注入した。プレインキュベートしたサンプル20μLを、調製した肥満細胞に加え、5% CO2インキュベーター中、37℃にて30分間インキュベートした。
50μgのオボアルブミン(OVA)および1mgのミョウバンをBalb/cマウス(Orientbio Inc.)に14日間隔で2回腹腔内投与して、感作を誘発した。その後、28、30、32、34、および36日目に50mgのOVAを合計5回経口投与して、腸内で食物アレルギーを誘発した。
実施例3:プロバイオティクスの培養および投与
L.カゼイ(ラクトバチルス・カゼイ;KACC 12413)、Lc.ラクチス(ラクトコッカス・ラクチス;KACC 13877)、L.ファーメンタム(ラクトバチルス・ファーメンタム;KACC 11441)、およびL.ラムノサス(ラクトバチルス・ラムノサス;KACC 11953)を、MRSブロスまたはブレインハートインフュージョン(BHI)培地上でインキュベートし、37℃インキュベーター(N-Biotek カタログ# NB201L)中、24時間培養した。L.ロイテリ(ラクトバチルス・ロイテリ;KACC 11452)およびS.サーモフィルス(ストレプトコッカス・サーモフィルス;KACC 11857)を、それらの好気性を考慮して、振とうインキュベーター中、37℃および50rpmにて24時間培養した。
実施例1で得られたIgEへの結合能を有するポリペプチドおよび実施例3で得られたプロバイオティクスを混合して、アレルギー治療用組成物を調製した。
50μgのオボアルブミン(OVA)および1mgのミョウバンをBalb/cマウス(Orientbio Inc.)に14日間隔で2回腹腔内投与して、感作を誘発した。その後、28、30、32、34、および36日目に50mgのOVAを合計5回経口投与して、腸内で食物アレルギーを誘発した。食物アレルギーを誘発したマウスを、それぞれ7匹のマウスを含む5つのグループに分けた。5つの分割グループは、以下の通りである:高濃度(200μg)のFcεRIαECD組換えタンパク質を投与される第一のグループ、低濃度(20μg)のFcεRIαECD組換えタンパク質を投与される第二のグループ、高濃度(200μg)のFcεRIαECD組換えタンパク質+B.ロンガムを投与される第三のグループ、低濃度(20μg)のFcεRIαECD組換えタンパク質+B.ロンガムを投与される第四のグループ、および何も投与されない第五のグループ。
食物アレルギーにおけるIgETRAPの影響を評価するために、BALB/cマウスに用量依存性急性下痢を誘発して、アレルゲン誘発性食物アレルギーのマウスモデルを作成した。具体的には、実験例6と同様に実験を行ったが、FcεRIαECD組換えタンパク質であるIgETRAPは、100μg/頭で投与された。さらに、プロバイオティクスB.ロンガムを凍結乾燥し、粉末マウス飼料と3×109cfu/gで混合した。マウスは、飼料に自由にアクセスできた。鮮度を維持するために、B.ロンガムと混合したマウスの飼料は、2〜3日ごとに交換した。その結果、以下の表6および図18に示すように、プロバイオティクスB.ロンガムおよびFcεRIαECDポリペプチド二量体であるIgETRAPを同時に投与された実験グループでは、優れたアレルギー緩和効果が見出された。
さらに、血清MCPT-1のレベルを測定して、肥満細胞の脱顆粒を確認した。IgETRAPおよびB.ロンガムの単独投与はMCPT-1のレベルを低下させなかったが、IgETRAPおよびB.ロンガムの組み合わせはMCPT-1のレベルを有意に低下させた(図20)。したがって、B.ロンガムおよびIgETRAPが協力して肥満細胞の脱顆粒を阻害することがわかる。食物アレルギーのマウスモデルでは、IgEを低下させる治療薬の有効性を調査するために、ELISAを使用して、血清中の総IgEおよび遊離IgEのレベルを分析した。IgETRAP、およびIgETRAPとB.ロンガムの組み合わせにより、総IgEのレベルはわずかに増加した(図21)。しかしながら、IgETRAP、およびIgETRAPとB.ロンガムの組み合わせにより、遊離IgEのレベルは大幅に低下した(図22)。対照的に、B.ロンガム単独の投与は、総IgEおよび遊離IgEのレベルに影響を与えなかった(図21および22)。したがって、IgETRAPおよびB.ロンガムはいくつかの方法で食物アレルギー症状を緩和し、この組み合わせが食物アレルギーに対して効果的な治療効果を発揮する可能性があることを示唆する。
IgETRAPおよびB.ロンガム、およびそれらの組み合わせが肥満細胞の数を減少させるかどうかを調査するために、クロロ酢酸エステラーゼ活性を使用して肥満細胞を染色した。その結果、IgETRAPおよびB.ロンガム単独の投与により、肥満細胞の数が大幅に減少し、両者の組み合わせは、より効果的であることが示された(図23および24)。B.ロンガムの結果は、以前に報告されたものと一致することがわかる。Th2サイトカイン環境によって誘発される杯細胞過形成が、IgETRAP、B.ロンガム、およびそれらの併用療法によって阻害されうるかどうかについて調査を行った。予想通り、食物アレルギーマウスの小腸の杯細胞のサイズが大きくなること、および細胞数の増加に伴って過形成が起こることが確認された(図25および26)。
IgETRAP(300μg)をマウスに経口投与し、2時間後、眼窩後採血によって血清を採取した。室温で30分間反応させた後、4℃および1300rpmにて15分間遠心して上清(血清)を得た。96ウェルの免疫プレートを抗FcεRI抗体(Abcam、ab54411)でコーティングし、4℃にて一晩反応させた。プレートを洗浄緩衝液(0.05%Tween-20を含むPBS)で洗浄し、次に、ブロッキング緩衝液(1%ウシ血清アルブミンを含むPBS)をそれに添加した。プレートを1時間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄し、標準サンプルおよび希釈したマウス血清サンプルをプレートに加えた。プレートを2時間反応させ、洗浄緩衝液で再度洗浄した。抗ヒトIgG4 Fc抗体(Abcam、ab99823)を加え、プレートを1時間反応させた。プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄し、TMB基質(Supmodics)を加えた。遮光しながら20分間反応させた後、反応停止液(1M H2SO4)を加えて反応を停止した。濃度値を、波長を450 nmに設定することによってマイクロプレートリーダー(Epochマイクロプレート分光光度計)で測定した。結果として、正常マウスの血清においてIgETRAPが検出された(図35)。これらの結果から、IgETRAPタンパク質を経口投与した場合、粘膜内のFcRnとの結合を介してIgETRAPタンパク質が血清中に送達され、治療効果を発揮することができることがわかる。
食物アレルギー対するIgETRAPおよびプロバイオティクスの効果を評価するために、BALB/cマウスに用量依存性急性下痢を誘発して、アレルゲン誘発性食物アレルギーのマウスモデルを作成した。
具体的には、実験例7と同様に実験を行ったが、FgεRIαECD組換えタンパク質であるIgETRAPは、図17の実験スケジュールのとおり、100μg/頭でマウスに腹腔内投与された。さらに、凍結乾燥されたプロバイオティクスを、実験中に2〜3日間隔で経口ゾンデを使用して、マウスあたり1×109〜2.5×109cfuで継続的に与え、ネガティブコントロールには、等量の凍結乾燥培地を与えた。
B.ロンガム:ビフィドバクテリウム・ロンガム
OIT:経口免疫療法
PSA:受動全身性アナフィラキシー
SPR:表面プラズモン共鳴
BLI:バイオレイヤー干渉法
BMMC:骨髄由来肥満細胞
cfu:コロニー形成単位
MCPT-1:肥満細胞 プロテアーゼ1
OVA:オボアルブミン
Treg細胞:制御性T細胞
Th2細胞:2型Tヘルパー細胞
ILC2:2型自然リンパ球
配列番号:1
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ
配列番号:2
SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
配列番号:3
RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP
配列番号:4
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP
配列番号:5
gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag
配列番号:6
tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g
配列番号:7
aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc
配列番号:8
gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c
配列番号:9
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA
配列番号:10
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgcc
配列番号:11
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQRNTGR GGEEKKGSKE KEEQEERETK TPECPSHTQP LGVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
配列番号:12
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag
配列番号:13
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKGSKEK EEQEERETKT PECPSHTQPL GVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK
配列番号:14
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag
配列番号:15
MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIIImMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
配列番号:16
atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc
配列番号:17
RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP
配列番号:18
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP
配列番号:19
RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP
配列番号:20
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
配列番号:21
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
配列番号:22
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECPS HTQPLGVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWESngQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK
Claims (21)
- 有効成分として、
プロバイオティクス;および
IgEへの結合能を有するポリペプチド;
を含む組成物。 - プロバイオティクスが、乳酸菌またはビフィドバクテリウムである、請求項1に記載の組成物。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス、ラクトコッカス、エンテロコッカス、およびストレプトコッカスからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項2に記載の組成物。
- ラクトバチルスが、L.アシドフィルス、L.カゼイ、L.ガセリ、L.デルブルエッキイー ssp. ブルガリクス、L.ヘルベティカス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.プランタラム、L.ロイテリ、L.ラムノサス、L.ペントーサス、およびL.サリバリウスからなる群から選択されるいずれか1つであり;
ラクトコッカスが、Lc.ラクチスであり;および
ストレプトコッカスが、S.サーモフィルスである、請求項3に記載の組成物。 - ビフィドバクテリウムが、B.ビフィダム、B.ブレベ、B.ロンガム、およびB.アニマリス ssp. ラクチスからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項2に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、L.カゼイまたはB.ロンガムである、請求項2に記載の組成物。
- IgEへの結合能を有するポリペプチドが、抗IgE抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 抗IgE抗体が、オマリズマブである、請求項7に記載の組成物。
- IgEへの結合能を有するポリペプチドが、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む組換えタンパク質である、請求項1に記載の組成物。
- IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインが、配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の組成物。
- 組換えタンパク質が、免疫グロブリンFc領域を含む、請求項9に記載の組成物。
- 免疫グロブリンFc領域が、天然型または改変型である、請求項11に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、乾燥粉末の形態である、請求項1に記載の組成物。
- 組換えタンパク質が、単量体のそれぞれが、IgE Fc受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン(FcεRIαECD)を含む2つの単量体を含むポリペプチド二量体であり、
単量体が、改変Fc領域を含み、および
改変Fc領域およびFcεRIαECDが、リンカーを介して連結される、請求項9に記載の組成物。 - 請求項1に記載の組成物を含む、アレルギー性疾患を治療または予防するための医薬組成物。
- アレルギー性疾患が、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、およびアレルギー性接触皮膚炎からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む、アレルギー症状を改善または緩和するための健康機能性食品組成物。
- アレルギー性疾患を治療または予防するためのキットであって、
プロバイオティクスを含む第一の組成物;および
IgEへの結合能を有するポリペプチドを含む第二の組成物;
を含む、キット。 - 第二の組成物が、皮下または静脈内投与用の組成物である、請求項18に記載のキット。
- アレルギー性疾患を治療または予防するための方法であって、
個体に、有効成分として、プロバイオティクスおよびIgEへの結合能を有するポリペプチドを投与するステップを含む、方法。 - アレルギー性疾患を治療または予防するための方法であって、
プロバイオティクスを投与するステップ;および
IgEへの結合能を有するポリペプチドを投与するステップ;
を含む、方法。
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