KR101517627B1 - 인터루킨-6에 대한 결합 구성원 - Google Patents

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Abstract

인터루킨-6(IL-6)에 결합하고, 그의 생물학적 효과를 중화시키는 결합 구성원, 특히 인간 항체 분자. 예를 들면, IL-6과 관련된 염증성 질환 및 종양 치료를 위한 의학적 치료에서 IL-6에 대한 결합 구성원의 용도.
IL-6, 결합 구성원, 항체 분자, 염증성 질환, 종양

Description

인터루킨-6에 대한 결합 구성원{BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-6}
본 발명은 IL-6의 생물학적 효과를 저해하는 결합 구성원, 특히, 항체 분자에 관한 것이다. 결합 구성원은 염증성 질환 및 종양을 비롯한, IL-6과 관련된 질병의 치료에 유용하다.
인터루킨 6(IL-6: Interleukin 6)은 생체내에서 IL-6의 주요 공급원을 형성하는 것인, 자극받은 섬유모세포, 단핵구 및 내피 세포를 비롯한 다양한 유형의 세포에 의해 생산되는 26 kDa의 다면발현성의 염증전(pro-inflammatory) 사이토카인이다. 세포, 예로서, T 세포, B 세포, 대식세포, 각질세포, 골모세포 및 수개의 다른 세포들은 자극시 IL-6을 생산할 수 있다. IL-6은 또한 종양 세포주 및 종양 세포, 예로서, 폐암종, 전립선암, 골수종, 신선암 및 심장 점액종으로부터 유래된 세포로부터 발현된다[1, 2]. 비염증성 병태하에서 IL-6은 지방 조직으로부터 분비된다[3].
IL-6 발현 조절은 그를 생산하는 세포 유형에 따라 달라진다. 다발 골수종 세포에서 IL-6은 양성 피드백 루프에서 작용하여 세포를 자극시켜 성장하도록 함과 동시에 더 많은 IL-6을 생산하도록 하는 것으로 보인다[4, 5]. 다른 세포에서 IL-6은 세포의 성장 및 활성화를 저해하는 것으로 보이며, 이는 몇몇 염증전 사이토카 인에 대한 음성 조절 인자로서 작용할 수 있다.
세포 신호전달을 개시하기 위해 IL-6은 낮은 친화도로 트랜스막 수용체인 IL-6 수용체 알파(IL-6Rα, IL-6Ra, IL-6R, gp80 또는 CD126으로도 지칭된다)에 결합하여 복합체 "IL-6:IL-6Ra"를 형성한다. 이러한 복합체는 gp130 신호 수용체에 결합하고; IL-6Rα 및 gp130은 함께 고친화성 IL-6 결합 부위를 형성하며, IL-6, IL-6Ra 및 gp130 각각 2개의 카피로 구성된 육량체 형성을 유도한다[6]. IL-6Ra는 또한 가용성의 분비된 형태(sIL-6R 또는 sIL-6Ra)로 존재하기 때문에 IL-6Ra의 트랜스막 및 세포질 도메인은 신호 전달에는 필요하지 않다. 가용성 수용체는 IL-6Ra 메세지의 차별적 스플라이싱에 의해 또는 단백질분해 방출에 의해 생산된다. sIL-6R은 IL-6과의 리간드-수용체 복합체인 "IL-6:sIL-6Ra"를 형성할 수 있다. 이러한 복합체는 세포 상의 gp130과 결합함으로써, 심지어 gp130 양성 세포가 IL-6Ra를 발현하지 않는 경우라도 gp130 양성 세포에서 세포 신호전달을 개시한다. 따라서, sIL-6R은 IL-6에 반응하는 세포 레퍼토리를 확장시키는 잠재능을 가지며, IL-6에 의해 매개되는 염증에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다[7].
인간 IL-6 리간드의 결정 구조가 밝혀져 있다[6]. 인간 IL-6Ra의 세포외 도메인의 결정 구조[8], 및 IL-6/IL-6R/gp130 복합체의 육량체 구조[9] 또한 해명되었다. 돌연변이유발 연구와 조합된 이들 구조를 통해 다양한 수용체 성분들과의 복합체에서 IL-6의 기능적 활성에 관여하는 것으로서, IL-6 표면 상에 존재하는 3개의 부위가 확인되었다. 부위 1 잔기는 IL-6과 IL-6Ra 사이의 상호작용에 관여한다. 부위 2 잔기는 IL-6과 gp130 사이토카인 결합 도메인 사이의 상호작용에 관여한다. IL-6의 부위 3의 잔기는 육량체 복합체 중 제2 gp130의 Ig-유사 도메인과의 상호작용에 관여한다. IL-6 상의 네번째 부위는 또한 IL-6이 육량체 IL-6/IL-6R/gp130 복합체 중 제2 IL-6 분자와 상호작용 부위인 것으로 확인되었다[10].
다수의 항-IL-6 리간드 모노클로날 항체가 단리되었다. 이들이 상기 기술된 바와 같이, 인간 IL-6 표면 상의 상이한 결합 부위에 결합한다는 것을 보여주는 지도화 연구를 실시하였다[11, 12, 13, 14, 15].
다수의 항-IL-6Ra 모노클로날 항체 또한 생성되었고, IL-6Ra 상의 이들 결합 부위도 지도화되었다[16, 14, 15, 17].
IL-6은 사이토카인 계열에 속하는데, 사이토카인 계열은 인터루킨-11(IL-11), 섬모 향신경성 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 온코스타틴 M (OsM), 백혈병 저해 인자(LIF: Leukaemia inhibitory factor), 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC: cardiotrophin-like cytokine), 및 카디오트로핀 1(CT-1)을 포함한다. 이들 계열의 각 구성원들은 그의 각자의 특이적인 수용체 알파 하위유니트를 갖고 있으며, 공통의 수용체 하위유니트 gp130과 복합체를 형성한다. gp130 유전자의 표적화된 파괴는 배아발생에 있어서는 치명적이다[18, 19]. IL-6 계열의 모든 구성원은 간세포로부터 급성기 단백질의 발현을 유도할 수 있다.
IL-6 신호전달은 JAK 계열 키나제에 의한 티로신 인산화, 및 후속으로 2개의 주요 세포내 신호전달 캐스캐이드, SHP2/ERK MAPK 및 STAT1/3 경로를 활성화시켜 NF-IL-6 및 AP-1을 통해 유전자를 발현시키는 것을 포함한다[18, 20].
IL-6은 조혈, 급성기 반응 유도, T 세포 활성화, 항체 분비 자극, 감염, 골 수종 세포 및 파골세포 활성화에 대한 숙주 방어를 비롯한 광범위한 범위의 생물학적 기능을 나타낸다[21, 22]. IL-6 효과에 대한 리뷰를 위해서는 참고문헌 [23]을 참조한다. IL-6은 원래 T 세포에 의해 생성된 B 세포 분화 인자로서 확인되었지만[24], 이후 많은 세포 유형의 강력한 활성인자 및 성장 촉진 인자로서 확인되었다. 이는 B 세포가 최종적으로 항체 생산 세포로 성숙화되는 것을 유도하며, T 세포 활성화 및 증식에 대해 필수적인 보조 인자이다. 연구를 통해 IL-6이 자가반응성 T 림프구의 활성화 및 세포독성 T 세포의 증식과 분화에 관여한다는 것이 밝혀졌다. IL-6은 조혈 줄기 세포의 활성화 및 분화를 일으키는 보조 인자로서 조혈에 연루되어 있다. 급성기 반응에 미치는 IL-6의 효과 또한 문서로 잘 보고되어 있다[25]. IL-6은 피브리노겐, 알파-항-키모트립신, 인간 간세포로부터의 혈청 아밀로이드 A 및 C-반응성 단백질을 비롯한 다양한 급성기 단백질을 유도한다. 급성기 단백질이 면역 반응 및 염증을 제거하며, 조직 재형성에 영향을 미친다. IL-6의 혈청 수준은 다양한 병상에서의 C-반응성 단백질의 혈청 수준과 매우 관련이 있는데, 이는 급성기 반응에 있어서 IL-6의 인과 관계를 제안한다. IL-6은 또한 골모세포에 의해 생산되는 것으로도 밝혀졌으며, 이는 파골세포 활성화 및 골흡수에 관여하는 것으로 보인다[26, 27, 28]. 역설적으로, IL-6은 염증전 사이토카인으로서의 역할을 할 뿐만 아니라, 특정 환경 및 세포 유형하에서는 기타 염증전 사이토카인의 효과를 완충시켜 염증을 감소시키기도 한다는 것이 제안되었다.
IL-6은 다양한 생물학적 효과를 갖고 있기 때문에 IL-6의 상승은 각종 질환 징후에 있어서 중요한 사이토카인으로서 연루되어 있다. 순환하는 IL-6의 수준은 예로서, 류마티스 관절염, 캐슬만병, 소아 특발성 관절염 및 크론병과 같은 질환에서 상승한 것으로 나타났다[29]. 이 때문에 IL-6이 이들 염증성 징후에서 병상을 일으키는데 연루되어 있다. 추가로, 흑색종, 신세포 암종, 카포시 육종, 난소 암종, 림프종, 백혈병, 다발 골수종, 및 전립선 암종을 비롯한 각종 종양 유형은 IL-6에 의해 자극을 받는 것으로 나타났다[30]. 추가로 수개 암에서는 순환하는 IL-6 수준이 증가한 것으로 보고되어 있다. 몇몇 암 징후에서 IL-6 수준이 상승한 것은 질환의 예후적 징후로서 사용되어 왔다.
질환에서 IL-6의 역할 때문에 각종 뮤린 및 키메라 항-인간 IL-6 모노클로날 항체가 효능이 있는 치료제로서 개발되어 왔다.
US5856135에는 마우스 모노클로날 항체 "SK2"로부터 유래된, IL-6에 대한 재성형화된 인간 항체가 기술되어 있다.
JP-10-66582에는 IL-6에 대한 키메라 항체가 보고되어 있는데, 이는 IL-6의 나선형 D 부위(부위 1)를 인식하는 것으로서 기술되어 있다.
WO2004/020633(EP1536012)은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 단리된 IL-6에 대한 인간 scFv 항체 분자가 기술되어 있다. scFv의 친화도는 13 nM인 것으로 보고되어 있다.
뮤린 항-IL-6 항체인 엘시리모마브(elsilimomab)(B-E8로도 공지)는 다발 골수종[31, 32], 신세포 암종[33], 및 류마티스 관절염[34]을 앓는 환자를 치료하는데 사용되었으며, 치료를 받은, 상기 3개의 질환 모두를 앓는 환자에서는 특정 진단적 마커가 개선된 것이 관찰되었다. BE-8은 또한 면역모세포 또는 다형 대세포 림프종[35]을 앓는 HIV-양성 환자를 치료하는데 사용되었는데, 전신 증상(즉, 발열, 발한, 악액질)이 완화되고, 림프종의 자발성 성장은 대략 50% 환자에서 억제되었다.
그러나, 엘시리모마브에 대한 인간 항-마우스 항체(HAMA: human anti-mouse antibodies)의 생산에 기인하여 상기 항체의 신속한 제거 및 가능한 아나필락시스 반응은 병원에서 그를 사용함에 있어 제한을 받는다[36].
일반적으로, 뮤린 모노클로날 항체는 빈번하게 HAMA를 유도하기 때문에 뮤린 모노클로날 항체의 임상적 사용은 제한된다. 마우스 면역글로불린의 Fc 부분에 대해 지정된 HAMA가 주로 생산되며, 이는 항-IL-6 mAb를 신속하게 제거하고, 가능한 아나필락시스 반응을 일으킨다[36]. 또한 인간에서의 마우스 항체의 약물동력학은 인간 항체와는 상이한데, 이는 더 짧은 반감기를 가지며, 제거율이 증가된 것으로 알려져 있다.
인간에서의 뮤린 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 마우스 가변 부위와 인간 불변 부위를 갖는 키메라 항체를 작제하였다. 키메라 인간-마우스 항-IL-6 항체 cCLB8(CNTO 328로도 공지)을 사용하여 다발 골수종을 앓는 환자를 치료하였는데[5, 37], 대부분의 환자에서 상기 질환이 안정화되는 것이 관찰되었다.
그러나, 키메라 항체가 뮤린 MAb보다 면역원성이 작기는 하지만, 인간 항-키메라 항체(HACA: human anti-chimeric antibody) 반응이 보고된 바 있다[38].
cCLB8이 IL-6 활성의 부위 I의 저해제임을 밝혀내기 위해 cCLB8에 대한 지도화 연구를 수행하였다. 문헌 (Brakenhoff et al[39])에서는 cCLB8이 IL-6 아미노- 말단 결실 돌연변이체 Pro46, Ser49, Glu51, Ile53, Asp54에 결합하고, 그리고 또한 (비록 친화도가 감소되었지만) 결실 돌연변이체 Asp62 및 Met77에도 결합하는 것이 입증되었다. 동일 저자는 B9 세포 증식 분석에서 CCLB8이 야생형 IL-6을 저해하지만, C-말단 결실 5는 저해하지 못하며, cCLB8은 마지막 4개의 C-말단 아미노산이 결실되어 있는 IL-6 del C-4에는 결합하지 못할 것이라고 제시하였다. 이러한 데이타는 cCLB8이 IL-6의 C-말단 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다는 것을 제안한다.
문헌 (Kalai et al[17])에서는 cCLB8이 IL-6 돌연변이체 F106E, F102E/F106E 또는 R207E/R210E를 인식하지 못했음을 입증하였다. 그러나, 항체는 IL-6 돌연변이체 R207E 및 R207W를 인식한다. 돌연변이체 R207W & R207E와 cCLB8의 결합은 야생형과 비교하여 대략 50%를 차지하는데, 이는 잔기 F106 및 R210이 cCLB8 결합 에피토프에 관여하며, 잔기 R207은 결합에는 관여하지만, 잔기 F106 및 R210보다는 효과가 작다는 것을 제안한다. CCLB8은 IL-6 부위-I 돌연변이체 R196M, K199N/Q203L 및 Q203L과 결합하는데, 그의 활성은 야생형과 비교하여 100%이다. 문헌 (Brakenhoff et al[13])에는 cCLB8이 하기 IL-6 변이체: Q182H, N183K, W185Q, W185G, W185R, T190P, Q182H/Q184P, W185R/S197N, Q187E/T190P, I164L/L186R/M189I에 결합한다는 것이 입증되었는데, 이는 이중 대부분이 IL-6 부위 1 잔기로부터 멀리 분리되어 있다는 점에서 놀라운 것은 아니다.
인간화된 항-IL-6Ra 항체인 토실리주마브(hPM-1, MRA 및 악템라(Actemra)로도 공지)의 사용으로 암 및 염증성 질환에서 IL-6 신호전달을 저해하는 양성 효과 에 대해 추가로 관심이 집중되었다. 이는 뮤린 항-IL6Ra 항체 PM-1의 인간화된 버젼이다. 이러한 항체를 사용하여 환자를 치료하는 것이 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 크론병, 골수증식성 질환, 캐슬만병 및 전신 홍반 루푸스를 비롯한 다수의 질환에서 유효한 것으로 입증되었다[40].
본 발명자들은 IL-6에 대하여 효능이 매우 높고, 친화성이 높은 결합 구성원을 성공적으로 단리시켰다. 본원에 기술된 바와 같이 본 발명의 결합 구성원은 친화도 및 효능이 높기 때문에, 기능 연구에 있어 그의 성능으로 인하여 본 발명의 결합 구성원은 인체 및 동물 신체의 치료학적 요법 및/또는 진단학적 요법을 위해 사용하기에 특히 적합하다.
결합 구성원은 본원 다른 경우에도 상세히 기술되어 있는 바와 같이, IL-6과 관련된 질병을 치료하는데 유용하다.
염증성 질환 및 암 치료를 위한 인간 항-IL-6 항체는 기존 접근법보다 유의적인 잇점을 제공한다. 예를 들면, 인간 항체는 HAMA 또는 HACA 반응을 유도하지 않고, 비인간 또는 키메라 항체와 비교하였을 때 보다 장기간의 생체내 반감기를 갖는다.
본 발명자들은 또한 본원 다른 경우에도 상세히 기술되어 있는 바와 같이, IL-6에 대한 결합 구성원은 특히 생체내 투여 및 요법에 의하면 IL-6Ra에 대한 결합 구성원과 비교하여 유의적인 잇점을 제공한다는 것을 인식하였다.
실시예에 더욱 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 표 7에 제시된 하나의 CDR 서열 세트를 갖는 것으로서, CAN022D10으로 지정된 모체 항체 분자 를 단리시켰다. 최적화시키는 과정을 거쳐 본 발명자들은 모체 CDR 서열로부터 유래되고, 표 7에 명시된 위치에 치환을 갖는 CDR 서열을 포함하는, 항체 클론 패널: 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23을 생성하였다.
따라서, 예를 들어 표 7로부터 살펴보면 항체 2는 카바트 잔기 35가 Thr로 대체된 모체 HCDR1 서열(서열 번호 13)을 갖는 것을 알 수 있다. 항체 14 및 22는 HCDR3에 부가 잔기, 즉, 아미노산 삽입을 함유하는데; 이는 모체 HCDR3 서열에는 존재하지 않는 카바트 잔기 100D에 위치한다(서열 번호 5). 항체 7, 8, 10, 16-19, 21 및 23은 LCDR3에 카바트 잔기 95를 함유하지 않는 반면, 모체 LCDR3(서열 번호 10)은 카바트 잔기 95에 Pro를 포함한다. 모체 HCDR3, 및 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 모두의 HCDR3 서열은 카바트 잔기 95에 Trp를, 및 카바트 잔기 101에 Asp를 갖는데, 이는 H95 Trp 및 H101 Asp가 본 발명의 결합 구성원에서 IL-6에 대한 결합 및/또는 효능에 기여할 수 있음을 시사한다.
본원에 기술된 모체 항체 CAN022D10, 및 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23의 VH 도메인, VL 도메인 및 CDR 서열은 첨부된 서열 목록에 제시되어 있다.
하기에 더욱 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명의 결합 구성원은 높은 효능으로 IL-6을 중화시키는 것으로 나타났다. 중화란 IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 것을 의미한다. 본 발명의 결합 구성원은 IL-6의 하나 이상의 활성을 중화시킬 수 있다. 저해되는 생물학적 활성은 전형적으로 하나 이상의, IL-6의 결합 파트너에 대한 IL-6의 결합이다. 예를 들면, 저해되는 생물학적 활성은 트랜스막 및/또 는 가용성 IL-6Rα에 대한 IL-6의 결합일 수 있다. 이는 여기서 간단히 설명되며, 하기에서 더욱 상세히 설명되는 다음과 같은 분석법으로 입증된다: TF-1 분석에서는 TF-1 세포가 가용성 IL-6Ra를 생산하지 않는 것으로 보이는 바, 본 발명에 따른 결합 구성원이 막 IL-6Ra에 대한 IL-6 결합을 저해한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 그 자체로서 본 발명에 따른 결합 구성원은 막 수용체에 대한 IL-6 결합을 저해한다. 활막 섬유모세포(synovial fibroblast) 분석에서, sIL-6Ra는 그가 작동하기 위해서는 본 분석에 첨가되어야 하기 때문에 본 발명에 따른 결합 구성원은 가용성 IL-6Ra에 대한 IL-6 결합을 저해한다. 첨가된 IL-1베타는, 본 발명에 따른 결합 구성원에 의해 저해되었을 때에 VEGF 생산을 막는 내인성 IL-6의 생산을 유도한다.
본 발명에 따라 IL-6Rα에 대한 인간 또는 비인간 영장류, 예로서, 사이노몰구스 IL-6의 결합은 저해될 있으며, 예로서, 결합 구성원은 IL-6Rα에 대한 성숙한 인간 IL-6의 결합을 저해할 수 있다.
생물학적 활성 저해는 부분적이거나, 전체적일 수 있다. 결합 구성원은 결합 구성원 부재시의 활성에 100% 만큼, 또는 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 만큼 IL-6 생물학적 활성을 저해할 수 있다.
결합 구성원의 중화 효능을 측정할 수 있다. 효능은 보통 달리 언급되지 않는 한, IC50 값(nM)으로 표시된다. 기능 분석에서 IC50은 생물학적 반응을 그 최대의 50% 만큼 감소시키는 결합 구성원의 농도이다. 리간드-결합 연구에서, IC50은 리간드-수용체 복합체의 형성을 최대 특이 결합 수준의 50% 만큼 감소시키는 농도이다. IC50은 결합 구성원 농도의 로그 함수로서 최대 생물학적 반응(%)을 플롯팅하고, 소프트웨어 프로그램, 예로서, 프리즘(Prism)(GraphPad) 또는 오리진(Origin)(Origin Labs)을 사용하여 S자 모양 함수를 데이타에 피팅하여 IC50 값을 작성함으로써 계산할 수 있다. 당업자에게 공지되고/거나 본원에서 기술하거나 언급하는 하나 이상의 분석법을 사용하여 효능을 결정하거나 측정할 수 있다.
본원에 기술된 분석법, 예로서, 하기 기술하는 TF-1 증식 분석법 또는 기타 세포-기초 분석법에서 결합 구성원에 의한 IL-활성의 중화라는 것은 결합 구성원이 IL-6에 결합하여 그를 중화시키는 것을 나타낸다. IL-6에 대한 결합 구성원의 결합을 측정하는데 사용될 수 있는 다른 방법으로는 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역침전법, 친화성 크로마토그래피 및 생화학적 분석법을 포함한다.
본원 실시예 1.7 및 2.7에 보고되어 있는 바, 내인성 인간 IL-6에 대한 반응으로 인간 활막 섬유모세포로부터 VEGF가 방출되는 것을 저해하는 것에 관한 분석에서 제시된 바와 같이, 본원에 기술된 결합 구성원은 내인성 인간 IL-6에 결합하고, 그의 생물학적 효능을 중화시키는 것으로 입증되었다. 이러한 분석에서, 류마티스 관절염 환자로부터 유래된 활막 섬유모세포는 IL-1β 및 가용성 IL-6Rα를 사용한 자극에 대한 반응으로 IL-6을 생산함으로써 IL-6에 의한 유도로 VEGF가 분비될 수 있도록 한다. 따라서, 인간 활막 섬유모세포에 의해 생산된 IL-6은 내인성 인간 IL-6을 나타낸다. 내인성 IL-6은 인간에서의 의학적 치료를 위한 분자 표적이며, 이로써, 내인성 IL-6의 중화가 결합 구성원의 치료학적 가능성에 관한 중요한 식별자가 된다. 본 분석법은 류마티스 관절염 환자로부터 유래된 활막 섬유모세포를 사용하여 수행되기 때문에 본 결과는 특히 류마티스 관절염 치료를 위한 결합 구성원의 용도에 관한 것이다. VEGF 방출 분석에서 시험된 최적화된 항체 분자의 중화 효능은 공지된 항 IL-6 항체 CNTO-328의 효능을 능가하였다.
0.6 pM 인간 IL-1β 및 2.4 nM 가용성 인간 IL-6Rα로 자극받은 인간 활막 섬유모세포로부터의 VEGF 방출 저해에 관한 분석에서 본 발명에 따른 결합 구성원은 50 nM 미만, 예로서, 5 nM 미만, 예로서, 1 nM 미만의 IC50을 가질 수 있다.
내인성 IL-6은 당화된 형태 및 당화되지 않는 형태의 혼합물인 것으로 알려져 있다. 본 발명의 결합 구성원이 내인성 IL-6에 결합하는 것은 활막 섬유모세포 분석에서 입증되었는데, 이는 상기 분석법이 인간 활막 섬유모세포로부터 유래된 IL-6, 즉, 내인성 IL-6을 이용하기 때문이다.
본 발명의 결합 구성원은 IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 저해할 수 있다. TF-1은 적백혈병을 앓는 환자로부터 확립된 인간 전골수성 세포주이다(문헌 [Kitamura et al 1989]). TF-1 세포주가 생존 및 증식을 하기 위해서는 성장 인자가 존재하여야 한다. TF-1 세포가 반응할 수 있는 개개의 성장 인자로는 IL-6, GM-CSF 및 온코스타틴(Oncostatin) M을 포함한다. 20 pM 인간 IL-6에 대한 반응으로 TF-1 세포가 증식하는 것을 저해하는 것에 관한 분석에서 본 발명의 결합 구성원은 100 nM 미만, 예로서, 20 nM, 10 nM 또는 1 nM 미만, 예로서, 100 pM, 70 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 미만의 IC50을 가질 수 있다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이(실시예 1.5 참조), 모체 IgG "CAN022D10"은 TF-1 증식 분석에서 약 93 nM의 IC50을 나타내었고, 이어서 본 발명자들은 실시예 2.2, 2.5 및 2.6(각각 표 3, 4 및 5)에 나타낸 바와 같이, 실질적으로 효능이 증가된(일반적으로 100 pM 미만의 IC50), 최적화된 CAN022D10 변이체를 생성하였다. 특히, 최적화된 클론 중 몇몇에 대한 IC50 값은 5 pM 이하인 것으로 낮게 측정되었으며, 예를 들면, 생식세포화된 IgG 항체 7, 항체 17 및 항체 18은 이들 항체의 극도로 높은 중화 효능을 나타낸다.
본 발명의 결합 구성원은 IL-6에 의해 유도된 B9 세포 증식을 저해할 수 있다. B9 세포는 IL-6에 대한 그의 특이적인 반응을 기초로 하여 선별된 뮤린 B 세포 하이브리도마 세포주, B13.29의 하위클론이다. B9 세포는 생존과 증식을 위해 IL-6을 필요로 하며, 매우 낮은 농도의 IL-6에 대해서도 반응을 한다. 그 자체로서, IL-6 항체 존재하에 이들 세포의 증식이 평가될 수 있으며, 항체의 친화도도 측정될 수 있다. 본원 실시예 2.10은 항체 18이 IL-6에 대한 반응으로 일어난 B9 세포 증식을 저해하였고, 이러한 분석에서 높은 친화도를 나타내었음을 보여준다.
류마티스 관절염에서 자가항체 생산은 대개 IgM 부류로 이루어진다. SKW6.4는 클로날 IgM을 분비하는 인간 림프아구양 B 세포주이다. IL-6에 의한 자극을 받았을 때 이들 세포는 IgM을 분비하기 때문에, 이로써, 이들 분석에서는 류마티스 관절염과 관련이 있는 것으로 인지되었다. SKW6.4 세포는, IL-6에 대한 반응으로 일어나는 IgM을 분비하는 것을 저해하는 것을 측정함으로써 IL-6을 중화시키는 결합 구성원의 효능을 측정하는 분석에서 사용될 수 있다. 100 pM 인간 IL-6에 대한 반응으로 일어나는 IgM을 분비하는 것을 저해하는 것에 관한 SKW6.4 세포 분석에서 본 발명의 결합 구성원은 10 pM 미만, 예로서, 5 pM 미만의 IC50을 가질 수 있다. 항체 18은 이러한 분석에서 IL-6의 효능을 중화시키는 것으로 나타났다-실시예 2.11(표 9) 참조.
본 발명은 인간 IL-6에 대하여 높은 친화성을 보이는 결합 구성원을 제공한다. 사이노몰구스 원숭이로부터 유래된 IL-6에 대한 높은 친화성 또한 입증되었다. 본 발명의 결합 구성원은 1 nM 이하, 예로서, 100 pM, 50 pM, 30 pM 또는 10 pM 이하의 KD로 인간 IL-6 및/또는 사이노몰구스 IL-6에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라스몬 공명에 의해, 예로서, 비아코어(BIAcore)®에 의해 측정될 수 있다. 비아코어®에 의한 친화도 측정치는 본원 실시예 2.9에 기재되어 있다. 현저하게 항체 7 및 18의 친화도는 10 pM 아래의 KD 값을 보이는데, 이는 비아코어® 기구를 사용하여 측정될 수 있는 한도를 넘어서는 것으로 밝혀졌다.
본원 다른 경우에도 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 표면 플라스몬 공명은 유체상 중의 분석물을 지지체에 부착된 리간드 상에 통과시키는 단계, 및 분석물과 리간드 사이의 결합을 측정하는 단계를 포함한다. 표면 플라스몬 공명은 예를 들면, 지지체에 부착된 결합 구성원 상에 유체상을 통과시킴으로써 실시될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이타를 1가 분석물 데이타 모델에 피팅할 수 있다. 1가 분석물 데이타 모델을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 속도 상수비 kd/ka로부터 친화도 상수 Kd를 계산할 수 있다.
별법으로, IL-16에 대한 결합 구성원의 친화도는 예로서, 다양한 농도의 인간 IL-6에 대한 반응으로 TF-1 세포 증식이 이루어지는 것을 저해하는 것에 관한 분석법에 기초하는, 쉴드(Schild) 분석에 의해 계산될 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 쉴드 분석법에 의해 계산된 바와 같이, 10 pM 미만, 예로서, 1 pM 미만의 친화도를 가질 수 있다. 본원 실시예 2.10에 보고되어 있는 바와 같이, 인간 IL-6에 대한 항체 18의 친화도는 쉴드 분석법 사용으로 0.4 pM인 것으로 계산되었다.
본 발명의 결합 구성원은 임의로 백혈병 저해 인자(LIF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), IL-11 또는 온코스타틴 M 중 하나 이상, 또는 이들 모두와 교차 반응을 하지 않을 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 임의로 래트 IL-6, 마우스 IL-6 및/또는 개 IL-6과 교차 반응을 하지 않을 수 있다.
기타 단백질 또는 비인간 IL-6에 대한 결합 구성원의 교차 반응성은 예를 들면, 지지체 상에 고정화된 결합 구성원에 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것에 관한 시간 분해 형광 분석법, 예로서, 실시에 1.6에 기술되어 있는 DELFIA® 에피토프 경쟁 분석법으로 시험될 수 있다. 예를 들면, 지지체 상에 고정화된 결합 구성원에 표지화된 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것에 관한 시간 분해 형광 분석에서 LIF, CNTF, IL-11, 온코스타틴 M, 래트 IL-6 및 마우스 IL-6 중 임의의 것, 또는 그들 모두는 저해를 나타내지 않을 수 있거나, 50% 미만의 저해를 나타내거나, 0.5 mM 초과, 또는 1 mM 초과의 IC50을 가질 수 있다. 예를 들면, 교차 반응성을 시험하는 시간 분해 형광 분석에서 LIF, CNTF, IL-11, 온코스타틴 M, 래트 IL-6 및 마우스 IL-6 중 임의의 것, 또는 그들 모두는 저해를 나타내지 않을 수 있거나, 비표지화된 인간 IL-6보다 적어도 10배 또는 100배 큰 IC50을 가질 수 있다. 이러한 분석에서 표지화된 야생형의 성숙한 인간 IL-6은 그와 결합 구성원 사이의 상호작용의 Kd의 최종 농도로 사용된다.
본 발명의 결합 구성원은 사이노몰구스 IL-6과 교차 반응할 수 있다. 교차 반응성은 시간 분해 형광 분석법으로 지지체 상에 고정화된 결합 구성원에 표지화된 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것으로서 측정될 수 있다. 예를 들면, 사이노몰구스 IL-6은 이러한 시간 분해 형광 분석에서 5 nM 미만, 예로서, 2.5 nM 미만, 예로서, 약 1 nM의 IC50을 가질 수 있다. 사이노몰구스 IL-6은 이러한 분석에서 비표지화된 인간 IL-6의 IC50보다 10배 미만으로 상이한 IC50, 예로서, 5배 미만으로 상이한 IC50을 가질 수 있다.
교차 반응성을 측정하는 시간 분해 형광 분석법에 관한 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에서 제공된다. 이러한 분석에서 수득한 교차 반응성 데이타에 관한 예는 실시예 1.6의 표 2에 제시한다.
실시예 2.8에 보고되어 있는 바와 같이, 본원에 기술된 결합 구성원은 사이 노몰구스 IL-6과 고도의 교차 반응성을 나타내었고, 래트, 마우스 또는 개 IL-6과는 교차 반응성을 나타내지 않거나, 제한된 교차 반응성을 나타내었다.
교차 반응성 데이타는 본원에 기술된 결합 구성원이, 인간과 사이노몰구스 IL-6 서열 사이에서는 보존적이지만, 인간 서열과 비교된 마우스, 래트 및 개 IL-6 서열에서는 상이한 IL-6 상의 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
본원에 기술된 결합 구성원은 IL-6의 "1번 위치" 부위에 결합하는 것으로 여겨지는데, 상기 부위는 IL-6Rα와 상호작용하는 부위이다. 따라서, 본 발명의 결합 구성원은 IL-6이 IL-6Rα에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해함으로써 IL-6Rα를 통해 매개되는 IL-6의 생물학적 효능을 중화시킬 수 있다.
본 발명자들은 1번 위치의 잔기에서 조작되어 돌연변이화된 돌연변이체 인간 IL-6에 결합할 수 있는, 본원에 기술된 항체들 중 하나인 항체 18의 능력을 조사하였다. 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 항체 18이 결합하는 것을 감소시키는 인간 IL-6 상의 돌연변이를 확인하게 되었으며, 이는 돌연변이화된 잔기가 항체에 의한 인식에 관여하며, 이러한 항체가 결합하는 IL-6 상의 에피토프의 일부를 형성할 수 있음을 시사한다.
예를 들면, 지지체 상에 고정화된 항체 18에 표지화된 야생형의 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것에 관한 시간 분해 형광 분석에서 Arg207Glu 돌연변이체 인간 IL-6(서열 번호 177)에 대해서는 저해되는 것이 관찰되지 않았는데, 이는 항체 18이 잔기 Arg207에서 인간 IL-6에 결합한다는 것을 시사한다.
항체 18 및 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 19, 21, 22 및 23은 모 두 모체 항체 CAN22C10으로부터 유도되었고, 이들 모두는 구조적으로 관련된 CDR을 갖고 있는 바, 이들 항체 분자 모두는 동일하거나, 매우 유사한 중복 에피토프에 결합할 것으로 기대된다. 따라서, 항체 18을 사용하여 수득한 에피토프 지도화 결과 또한 CAN22D10 및 본원에 기술된 기타 최적화된 항체를 대표하는 것으로 기대된다.
본 발명의 결합 구성원은 Phe102 및/또는 Ser204에서 인간 IL-6에 결합할 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 또한 Arg207에서 인간 IL-6에 결합할 수 있다. 임의로, 결합 구성원은 Phe102 및/또는 Ser204에 결합하는 것 이외에, IL-6 분자 중 측면에 위치하는 잔기 또는 구조적으로 이웃에 인접해 있는 잔기에 결합할 수 있다. 관습상, 잔기 넘버링은 전장의 인간 IL-6(서열 번호 161)에 상응한다. 그러나, 결합은 성숙한 인간 IL-6을 사용하여 결정될 수 있다. IL-6 잔기에 대한 결합은 하기 설명하는 바와 같이, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 결정된다.
구조와 활성을 관련시키기 위하여 단일 아미노산 및 단백질 부위들을 돌연변이유발하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이는 항체에 결합하는 단백질 부위를 정의하는데 사용되어 왔다[41]. 돌연변이체 인간 IL-6에 대한 결합 및/또는 돌연변이체 인간 IL-6의 중화를 사용하여 결합 구성원이 Phe102, Ser204 및/또는 Arg207에 결합하는지 여부를 평가할 수 있다. 야생형과 비교하여 돌연변이체 IL-6을 사용하였을 때, 결합 또는 중화가 일어나지 않거나, 결합 또는 중화가 유의적으로 감소하였다는 것은 결합 구성원이 돌연변이화된 잔기에 결합하였음을 시사한다.
IL-6 내의 잔기에 결합하는 것은 지지체 상에 고정화된 결합 구성원에 표지 화된 야생형의 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것에 관한 시간 분해 형광 분석법으로 선택된 잔기에서 돌연변이화된 IL-6을 사용함으로써 측정될 수 있는데, 여기서, 표지화된 야생형의 성숙한 인간 IL-6은 그와 결합 구성원 사이의 상호작용의 Kd와 동일한 최종 농도로 존재한다. 이러한 분석법 및 수득한 경쟁 데이타의 예는 실시예 3에 제시되어 있고, 결과는 표 10에 제시되어 있다. 돌연변이체 IL-6이, 표지화된 야생형 IL-6이 결합 구성원에 결합하는 것을 저해하지 않는 경우, 또는 돌연변이체 IL-6이 비표지화된 야생형 IL-6의 IC50보다 더 큰(예로서, 10배 초과 또는 100배 초과) IC50을 갖는 경우, 이는 돌연변이화된 잔기에 결합 구성원이 결합한다는 것을 시사한다.
지지체 상에 고정화된 본 발명의 결합 구성원에 표지화된 야생형 인간 IL-6이 결합하는 것을 저해하는 것에 관한 시간 분해 형광 분석에서 Phe102Glu 돌연변이체 인간 IL-6(서열 번호 175), Ser204Glu 돌연변이체 인간 IL-6(서열 번호 176), 및/또는 Arg207Glu 돌연변이체 인간 IL-6(서열 번호 177)은 저해시키지 않는 것으로 나타날 수 있거나, 또는 야생형 인간 IL-6(서열 번호 165)의 IC50보다 100배 초과로 더 큰 IC50을 가질 수 있으며, 여기서, 표지화된 야생형 인간 IL-6은 그와 결합 구성원 사이의 상호작용의 Kd와 동일한 최종 농도로 존재한다.
본 발명의 결합 구성원은 임의로 잔기 Phe102, Ser204 및/또는 Arg207에 돌연변이를 갖는 돌연변이체 인간 IL-6, 예로서, 돌연변이 Phe102Glu, Ser204Glu, Ser204Tyr 및/또는 Arg207Glu를 갖는 돌연변이체 인간 IL-6에 결합하지 못하고/거 나 그를 중화시키지 못할 수 있다. 돌연변이체 인간 IL-6 서열의 예는 서열 번호 175-177이다. 따라서, 본 발명의 결합 구성원은 이들 돌연변이체 IL-6 분자들 중 하나 이상이 IL-6Rα에 결합하는 것을 저해시키지 않을 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 항체 분자, 예로서, 인간 항체 분자를 포함할 수 있다. 결합 구성원은 보통 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 구성원의 VH 및 VL 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 상보성 결정 부위("CDR": complementarity determining region), 및 프레임워크 부위("FR": framework region)는 각각의 VH 및 VL 도메인 내에 포함된다. VH 도메인은 한 세트의 HCDR을 포함하고, VL 도메인은 한 세트의 LCDR을 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 또한 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. VH 또는 VL 도메인 프레임워크는 4개의 프레임워크 부위 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는데, 하기 구조와 같이 CDR 사이에 산재되어 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
본 발명에 따른 항체 VH 및 VL 도메인 및 CDR 예는 본 개시의 일부를 형성하는 첨부된 서열 목록에 열거되어 있는 바와 같다. 추가로 CDR은 하기와 표 7에서 개시한다. 본원에서 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트 및 HCDR 세트 및 LCDR 세트는 본 발명의 측면 및 실시태양을 나타낸다. 본원에서 기술하는 바, "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, 하나의 HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭하고, 하나의 LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭한 다. 달리 언급하지 않는 한, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 결합 구성원은 모노클로날 항체이다.
본 발명의 결합 구성원은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 보통 비항체 단백질 스캐폴드 중 하나 이상의 CDR, 예로서, CDR 세트로 제공되는, 비항체 분자내 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에서는 HCDR1이 서열 번호 3(카바트 잔기 31-35)이고, HCDR2가 서열 번호 4(카바트 잔기 50-65)이며, HCDR3이 서열 번호 5(카바트 잔기 95-102)이고, LCDR1이 서열 번호 8(카바트 잔기 24-34)이며, LCDR2가 서열 번호 9(카바트 잔기 50-56)이고, LCDR3이 서열 번호 10(카바트 잔기 89-97)인, 표 7에 제시한 것과 같은 모체 CAN022D10에 대한 모체 CDR 세트를 포함하는 결합 구성원을 기술한다.
본 발명의 결합 구성원은 본원에 기술된 하나 이상의 CDR, 예로서, CDR3, 및 임의로는 CDR 세트를 형성하기 위해서 CDR1 및 CDR2도 포함할 수 있다. CDR 또는 CDR 세트는 모체 CDR 또는 모체 CDR 세트일 수 있거나, 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23 중 임의의 것의 CDR 또는 CDR 세트일 수 있거나, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 그의 변이체일 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 따른 결합 구성원 또는 VL 도메인은 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.
결합 구성원은 모체 항체, 또는 개시된 H 및/또는 L CDR 세트내 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23 중 어느 것의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 아미노산 돌연 변이는 아미노산 1개의 치환, 결실, 또는 삽입이다. 예를 들면, H 및/또는 L CDR 세트내 20개 이하, 예로서, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예로서, 치환이 존재할 수 있다. 예를 들면, HCDR3내 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예로서, 치환이 존재할 수 있고/거나, LCDR3내 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예로서, 치환이 존재할 수 있다. HCDR3 및/또는 LCDR3은 임의로 개시된 H 및/또는 LCDR 세트와 비교되는 바, 아미노산 1개의 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다. 치환은 예를 들면, 표 7에 제시한 바와 같은 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23 중 어느 것의 치환 위치에서 이루어질 수 있다. 따라서, 치환은 임의로 하기:
HCDR1 중 카바트 잔기 35;
HCDR2 중 카바트 잔기 64;
HCDR3 중 카바트 잔기 96, 97, 98, 99, 100, 10OA, 10OB, 100C 및/또는 102;
LCDR1 중 카바트 잔기 34;
LCDR3 중 카바트 잔기 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96 또는 97로부터 선택되는 카바트 번호에서 이루어질 수 있다.
아미노산 돌연변이는 표 7에 제시되어 있는 것과 같은 돌연변이, 예로서, 명시된 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 Ile 35가 Thr 또는 Val에 의해 대체된 모체 HCDR1을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 Lys 64가 Arg에 의해 대체된 모체 HCDR2를 포함할 수 있다.
결합 구성원 또는 VH 도메인은
하기 돌연변이:
카바트 잔기 Ala 96이 Glu에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Asp 97이 Glu 또는 Asn에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Asp 98이 Gly, Glu 또는 His에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 His 99가 Gly 또는 Thr에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Tyr 100이 Pro, Asn, Arg, Trp 또는 Ala에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Tyr 100A가 Ala, Arg, Thr, Gly, Asn, Pro 또는 Ser에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 100B가 His, Trp, Gln, Pro 또는 Thr에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Ile 100C가 Ala, Val, His, Tyr 또는 Leu에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 100D에 Ile가 삽입된 것;
카바트 잔기 Val 102가 Leu, His, Met 또는 Ile에 의해 대체된 것 중 하나 이상을 포함하는 모체 HCDR3을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 100D가 Ile이거나, 카바트 잔기 100D가 존재하지 않는, HCDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VL 도메인은 카바트 잔기 Ala 34가 Thr에 의해 대체된 모체 LCDR1을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VL 도메인은
하기 돌연변이:
카바트 잔기 Gln 89가 Met 또는 Ala에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Gln 90이 Asn, Ser 또는 Ala에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Ser 91이 Asn, Gly, Ala 또는 His에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Tyr 92가 Trp, Ser, Lys 또는 Phe에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Ser 93이 Leu, Lys, Arg 또는 Ala에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Thr 94가 Ala, Gly 또는 Pro에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Pro 95가 결실된 것;
카바트 잔기 Trp 96이 Gly에 의해 대체된 것;
카바트 잔기 Thr 97이 Ser에 의해 대체된 것 중 하나 이상을 포함하는 모체 LCDR3을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 결합 구성원 또는 VL 도메인은 카바트 잔기 95가 Pro이거나, 카바트 잔기 95가 존재하지 않는 LCDR3을 포함할 수 있다.
본 발명은 CDR 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 인간 IL-6에 대한 단리된 결합 구성원을 제공하는데, 여기서, CDR 세트는
HCDR1이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR2가 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR3이 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR1이 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR2가 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR3이 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트로부터 22개 이하의 아미노산 변경, 예로서, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 이하의 변경을 갖거나, 변경을 갖지 않는다.
아미노산 변경은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 치환될 수 있는 카바트 위치의 예, 및 잔기 치환의 예는 하기에 논의되며, 표 7은 치환 중 일부를 명시한다.
표 7에 제시되어 있는 바와 같이, HCDR3 및 LCDR3의 길이는 본원에 기술된 상이한 최적화 항체마다 다르다. CAN022D10의 모체 CDR과 비교하여 카바트 잔기 100 내지 102(표 7에서 카바트 잔기 10OD에 제시된 것) 사이의 삽입은 몇몇 항체에서 관찰되었고, 카바트 잔기 92 내지 97 사이의 결실은 다른 항체에서 관찰되었다. 카바트 잔기 95에서의 결실은 삽입과 함께는 관찰되지 않았다. 따라서, 더욱 긴 12개의 잔기 HCDR3 서열은 더욱 긴 9개의 잔기 LCDR3 서열과 조합되는 것이 이로울 수 있고, 더욱 짧은 11개의 잔기 HCDR3 서열은 더욱 짧은 8개의 잔기 LCDR3 서열과 조합되는 것이 이로울 수 있다.
카바트 넘버링 시스템에 따라 LCDR3의 잔기는 89부터 97까지로 넘버링된다. 9개의 잔기보다 짧은 LCDR3 서열은 카바트 넘버링 시스템으로 파악되지 않는다. 본 발명에서, 결합 구성원은 9개의 잔기보다 짧은 LCDR3을 가질 수 있으며, 예로서, LCDR3은 표 7에 제시한 바와 같이, 그의 길이가 8개의 잔기일 수 있다. 본 발명자들은 LCDR3의 8개의 잔기를 각각 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96 및 97로 넘버링하였다. 따라서, 표 7에서, 결실은 카바트 잔기 95에 제시되어 있다. 그러나, 결실의 효과는 LCDR3 서열의 길이를 감소시키는 것이며, 기본적으로 결실은 잔기 89 내지 97 중 임의의 것, 예로서, 잔기 92 내지 97 중 임의의 것에서 이루어질 수 있음을 고려할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
HCDR3에서, 카바트 넘버링 시스템은 적절하게는 예로서, 9개의 잔기로 이루어진 HCDR3에 대해서는 잔기 100A, 그리고, 10개의 잔기로 이루어진 HCDR3에 대해서는 잔기 100B, 그리고, 11개의 잔기로 이루어진 HCDR3에 대해서는 잔기 100C, 그리고, 12개의 잔기로 이루어진 HCDR3에 대해서는 잔기 100D를 비롯한 것으로서, 카바트 잔기 100 내지 101 사이에 넘버링 시스템을 확장시킴으로써 CDR 길이상의 변화성을 수용한다. 표 7에서 모체 HCDR3과 비교하여 최적화된 클론들 중 몇몇의 HCDR3내 추가의 아미노산 삽입은 카바트 잔기 100D에 제시되어 있다. 그러나, 기본적으로 이러한 삽입은 잔기 100 내지 102 중 임의의 것에서 이루어질 수 있음을 고려할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 입증된 바와 같이, 하나 이상의 삽입 또는 결실은 결합 구성원의 하나 이상의 CDR, 예로서, HCDR3 및/또는 LCDR3에 존재할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 결합 구성원은 본원에 기술된 바와 같이, 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 임의의 것, 또는 그의 변이체의 CDR 세트를 포함할 수 있으며, 여기서, 각각 CDR은 임의로 잔기 1개 만큼 CDR의 길이를 증가시키기 위한 삽입을 갖거나, 잔기 1개 만큼 CDR의 길이를 감소시키기 위한 잔기 1개의 결실을 갖는다. 삽입 및/또는 결실은 HCDR DR및/또는 LCDR, 예로서, HCDR3 및/또는 LCDR3에서 이루어질 수 있다.
예를 들면, 결합 구성원은 예를 들면,
HCDR1이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR2가 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR3이 서열 번호 115의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR1이 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR2가 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR3이 서열 번호 120의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트내 20개 이하의 아미노산 치환을 갖는 CDR 세트를 포함할 수 있으며,
여기서, 결합 구성원은 임의로 잔기 1개를 삽입함으로써 HCDR3의 길이가 증가되어 있거나, 잔기 1개가 결실됨으로써 HCDR3의 길이가 감소되어 있고/거나,
잔기 1개를 삽입함으로써 LCDR3의 길이가 증가되어 있거나, 잔기 1개가 결실됨으로써 LCDR3의 길이가 감소되어 있다.
본 발명의 결합 구성원은 서열 번호 115의 HCDR3내 잔기 1개의 삽입을 가질 수 있고/거나, 서열 번호 120의 LCDR3내 잔기 1개의 삽입을 가질 수 있다.
삽입 또는 결실은 CDR DR중 임의 위치에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, HCDR3에서 삽입 또는 결실은 카바트 잔기 95-102 중 임의의 것, 예로서, 카바트 잔기 100-102 중 임의의 것에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, LCDR3에서 삽입 또는 결실은 카바트 잔기 89 내지 97 중 임의의 것, 예로서, 카바트 잔기 92 내지 97 중 임의의 것에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 35가 Ile, Thr 또는 Val인 HCDR1을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 64가 Lys 또는 Arg인 HCDR2를 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은 카바트 잔기 95가 Trp이고/거나, 카바트 잔기 101이 Asp인 HCDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VH 도메인은
카바트 잔기 96이 Ala 또는 Glu이고;
카바트 잔기 97이 Asp, Glu 또는 Asn이고;
카바트 잔기 98이 Asp, Gly, Glu 또는 His이고;
카바트 잔기 99가 His, Gly 또는 Thr이고;
카바트 잔기 100이 Pro, Tyr, Asn, Arg, Trp 또는 Ala;
카바트 잔기 100A가 Pro, Tyr, Ala, Arg, Thr, Gly, Asn, Pro 또는 Ser이고;
카바트 잔기 100B가 Trp, Tyr, His, Gln, Pro 또는 Thr이고;
카바트 잔기 100C가 Ile, Ala, Val, His, Tyr 또는 Leu이고;
카바트 잔기 102가 Leu, Val, His, Met 또는 Ile인, HCDR3을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VL 도메인은 카바트 잔기 34가 Ala 또는 Thr인 LCDR1을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원 또는 VL 도메인은
카바트 잔기 89가 Gln, Met 또는 Ala이고;
카바트 잔기 90이 Gln, Asn, Ser 또는 Ala이고;
카바트 잔기 91이 Ser, Asn, Gly, Ala 또는 His이고;
카바트 잔기 92가 Trp, Tyr, Ser, Lys 또는 Phe이고;
카바트 잔기 93이 Leu, Ser, Lys, Arg 또는 Ala이고;
카바트 잔기 94가 Gly, Thr, Ala 또는 Pro이고;
카바트 잔기 96이 Gly 또는 Trp이고;
카바트 잔기 97이 Ser 또는 Thr인 LCDR3을 포함할 수 있다.
본 발명은 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 및/또는 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예로서, 표 7에 제시된 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 CDR 세트를 포함하는 결합 구성원을 제공한다.
예를 들면, 본 발명의 결합 구성원은 HCDR1이 서열 번호 113이고; HCDR2가 서열 번호 114이고; HCDR3이 서열 번호 115이고; LCDR1이 서열 번호 118이고; LCDR2가 서열 번호 119이고; LCDR3이 서열 번호 120인, 항체 18의 CDR을 나타내는 것인 CDR 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
결합 구성원은 이들 항체 중 하나의 VH CDR 세트를 포함할 수 있다. 임의로, 이들 항체 중 하나의 VL CDR을 포함할 수도 있으며, 상기 VL CDR는 VH CDR과 동일하거나 상이한 항체로부터 유래된 것일 수 있다.
모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인, 및/또는 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인 또한 본 발명에 의해 제공된다.
하기 추가로 논의되는 바와 같이, VH 또는 VL 도메인은 항원에 결합하기 위해 단독으로 사용될 수 있기는 하지만, 항체 항원 결합 부위를 제공하기 위해서 전형적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 항체 2 VH 도메인은 항체 2 VL 도메인과 쌍을 형성할 수 있고, 이로써 항체 2 VH 및 VL 도메인, 둘 모두를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사 실시태양을 제공한다. 다른 실시태양에서, 항체 2 VH는 항체 VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄 혼잡성은 당업계에 잘 확립되어 있다. 이에 다시, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사 실시태양이 본 발명에 의해 제공된다.
따라서, 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 VH는 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 VL과 쌍을 형성할 수 있다.
결합 구성원은 항체 프레임워크내 하나 이상의 CDR, 예로서, CDR 세트를 갖는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 분자를 제공하기 위해 프레임워크(예로서, 인간 프레임워크) 내로 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트를 이식시킬 수 있다. 프레임워크 부위는 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열로 이루어질 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포화됨으로써, 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포 프레임워크내 동일 위치상에 존재하는 잔기에 매치되도록 변경된다. 당업자는 생식세포화에 앞서 서열이 항체의 프레임워크 서열과 가장 가까운 생식세포 세그먼트를 선별할 수 있으며, 항체의 친화성 및 활성을 시험함으로써 생식세포화가 본원에 기술된 분석에서 항원 결합 또는 효능을 유의적으로 감소시켰는지 여부를 확인할 수 있다. 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열는 당업자에게 알려져 있으며, 이는 예를 들면, VBase 컴파일링으로부터 평가할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 인간 생식세포 프레임워크, 예로서, Vh3_DP-86_(3-66) 중 하나의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 인간 항체 분자일 수 있다. 따라서, VH 도메인 프레임워크 부위 FR1, FR2 및/또는 FR3은 인간 생식세포 유전자 세그먼트 Vh3 DP-86_(3-66)의 프레임워크 부위를 포함할 수 있고/거나, 프레임워크 잔기를 상기 인간 생식세포 유전자 세그먼트의 프레임워크 잔기에 매치되도록 돌연변이화시킴으로써 생식세포화될 수 있다. FR4는 인간 생식세포 j 세그먼트 JH2의 프레임워크 부위를 포함할 수 있다. VH FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 167일 수 있다. VH FR2의 아미노산 서열은 서열 번호 168일 수 있다. VH FR3의 아미노산 서열은 서열 번호 169일 수 있다. VH FR4의 아미노산 서열은 서열 번호 170일 수 있다.
보통, 결합 구성원은 또한 인간 생식세포 프레임워크, 예로서, Vk1_L12에 하나의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. 따라서, VL 도메인 프레임워크 부 위는 인간 생식세포 유전자 세그먼트 Vk1_L12의 프레임워크 부위 FR1, FR2 및/또는 FR3을 포함할 수 있고/거나, 프레임워크 잔기를 상기 인간 생식세포 유전자 세그먼트의 프레임워크 잔기에 매치되도록 돌연변이화시킴으로써 생식세포화될 수 있다. FR4는 인간 생식세포 j 세그먼트 JK2의 프레임워크 부위일 수 있다. VL FR1의 아미노산 서열은 서열 번호 171일 수 있다. VL FR2의 아미노산 서열은 서열 번호 172일 수 있다. VL FR3의 아미노산 서열은 서열 번호 173일 수 있다. VL FR4의 아미노산 서열은 서열 번호 174일 수 있다.
생식세포화된 VL 도메인은 버니어(Vernier) 잔기 또는 잔기들에서 생식세포화될 수 있거나, 또는 생식세포화될 수 없지만, 보통은 생식세포화되지 않는다.
본 발명의 항체 분자 또는 VH 도메인은 하기 중쇄 프레임워크 부위 세트:
FR1 서열 번호 167;
FR2 서열 번호 168;
FR3 서열 번호 169;
FR4 서열 번호 170을 포함할 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변경, 예로서, 치환을 갖는 상기 중쇄 프레임워크 부위 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자 또는 VL 도메인은 하기 경쇄 프레임워크 부위 세트:
FR1 서열 번호 171;
FR2 서열 번호 172;
FR3 서열 번호 173;
FR4 서열 번호 174를 포함할 수 있거나, 또는 5개의 아미노산 변경, 예로서, 치환을 갖는 상기 경쇄 프레임워크 부위 세트를 포함할 수 있다.
아미노산 변경은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항체 분자는
중쇄 FR1이 서열 번호 167이고;
중쇄 FR2가 서열 번호 168이고;
중쇄 FR3이 서열 번호 169이고;
중쇄 FR4가 서열 번호 170이고;
경쇄 FR1이 서열 번호 171이고;
경쇄 FR2가 서열 번호 172이고;
경쇄 FR3이 서열 번호 173이고;
경쇄 FR4가 서열 번호 174인 중쇄 및 경쇄 프레임워크 부위 세트를 포함할 수 있거나, 또는 10개 이하, 예로서, 5개 이하의 아미노산 변경, 예로서, 치환을 갖는 상기 중쇄 및 경쇄 프레임워크 부위 세트를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 중쇄 및 경쇄 프레임워크 부위 세트 중에 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 존재할 수 있다.
비생식세포화된 항체 분자는 생식세포화된 항체 분자와 비교하여 동일한 CDR을 갖지만, 상이한 프레임워크를 갖는다. 첨부된 서열 목록 중 본원에 제시되어 있는 항체 서열 중에서 항체 번호 7, 10, 17 및 18의 서열은 생식세포화된 것이다. 생식세포화된 항체 2 내지 5, 8, 14, 16, 19 및 21 내지 23은 이들 항체에 대한 본 원에 제시되어 있는 VH 및 VL 도메인 서열의 프레임워크 부위를 생식세포화시킴으로써 생산될 수 있다.
항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23의 카파 VL 도메인에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 제시된 3' cgt 코돈, 및 상응하는 아르기닌 잔기는 각각 이들 항체의 발현된 scFv 및 IgG 서열에 포함되어 있었다. 상기 서열의 C 말단 아르기닌 잔기는 카바트 잔기 108에 상응한다. 이러한 잔기 및 그의 코딩 삼중항 cgt의 기원은 하기에 설명한다.
IgG의 경쇄를 발현시키기 위하여 VL 도메인을 코딩하는 제1 엑손, CL 도메인을 코딩하는 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손을 분리하는 인트론을 포함하는, 항체 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하였다. 보통은 제1 엑손의 3' 말단과 제2 엑손의 5' 말단을 연결시키는 세포 mRNA 프로세싱 절차에 의해 인트론이 스플라이싱된다. 따라서, 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA가 RNA로 발현되었을 경우, 제1 및 제2 엑손이 함께 스플라이싱되었다. 스플라이싱된 RNA가 번역되면 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 생산된다. 카파 경쇄의 경우, 연결 아미노산은 cga 코돈에 의해 형성된 아르기닌인데, 여기서, 제1 사이토신은 엑손 1에서 코딩되고, 구아닌 및 아데닌은 엑손 2에서 코딩된다는 점에서 불변 도메인 선택은 중요하다.
스플라이싱 이후, 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23의 경우 카바트 잔기 108에 있는 Arg는 VL 도메인 프레임워크 4의 마지막 염기(c)와 CL 도메인 맨앞에 있는 2개(gt)에 의해 코딩된다.
카바트 잔기 108에 있는 아르기닌 잔기는 항체 분자의 VL 도메인의 C 말단 잔기인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 (i) IL-6에 결합하고, (ii) 본원에 개시된 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, CDR 예로서, HCDR3, 및/또는 CDR 세트를 포함하는 임의의 결합 구성원과 IL-6에 결합하는 것에 대하여 경쟁하는 것일 수 있다.
결합 구성원 사이의 경쟁은 시험관내에서, 예를 들면, ELISA를 사용하고/거나, 하나 이상의 다른 태깅되지 않은 결합 구성원의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 구성원에 특이적인 리포터 분자를 태깅하여 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인할 수 있도록 함으로써 쉽게 분석될 수 있다. 그러한 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 본원에 더욱 상세시 기술되어 있다(상세한 설명, 및 실시예의 물질 및 방법 섹션내 에피토프 경쟁 분석법 참조). 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 IL-6에 결합하는 것에 대하여 항체 분자, 예를 들면, 모체 항체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예로서, HCDR3 또는 CDR 세트를 포함하는 항체 분자와 경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 구성원을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 상기 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인이 생산될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 이를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 구성원, VH 도메 인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 코딩하는 핵산, 일반적으로는 단리된 핵산을 제공한다.
추가의 측면은 본 발명의 핵산을 함유하거나, 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 결합 구성원을 함유하는 조성물, 및 요법에 의한 인체 또는 동물 신체 치료 방법을 비롯한, IL-6 결합, 저해 및/또는 중화 방법에서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 유효량의 본 발명의 결합 구성원을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 진단 방법에서, 예로서, 인체 또는 동물 신체(예로서, 인간 환자에서)에서의 질환 또는 질병의 치료(이는 예방적 치료를 포함할 수 있다) 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병태는 본원 다른 경우에도 상세히 논의되어 있는 바와 같이, IL-6이 중요한 역할을 하는 임의의 것을 포함한다.
본 발명의 이런 측면들과 기타 측면들은 하기에 추가로 상세히 기술된다.
용어 정의
본원에서 사용된 "및/또는"이란 편의상, 2개의 구체적인 특징 또는 성분 중 각각 어느 하나에 대한 것을 다른 것에 대한 것과 함께 또는 그런 것 없이 구체적으로 기술하고자 하는 것을 의미한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각 (i) A, (ii) B, 및 (iii) A 및 B의 경우가 마치 본원에서 개별적으로 기재된 것처럼 구체적으로 기술된 것을 의마한다.
IL-6 및 IL-6 수용체
IL-6은 인터루킨 6이다. IL-6은 또한 본원에서 "항원"으로서 지칭될 수도 있다.
인간 IL-6의 전장의 아미노산 서열은 서열 번호 161이다. 이러한 서열은 생체내에서 절단되어 N-말단 리더 펩티드를 제거함으로써 성숙한 IL-6을 생산하게 된다. 성숙한 인간 IL-6은 서열 번호 165의 아미노산 서열을 갖는다. 성숙한 서열은 생체내에서 순환하는 IL-6을 나타내며, 이는 본원에서 기술하는 바, 치료용 및 생체내 진단용의 표적 항원이 된다. 따라서, 본원에서 지칭되는 IL-6은 문맥상 달리 명시되지 않는 한은 보통 성숙한 인간 IL-6이다.
IL-6은 예로서, 본원에 기술된 것과 같은 분석에서 사용하기 위한 것으로 검출가능한 표지, 예로서, HIS FLAG에 접합될 수 있다. 예를 들면, HIS FLAG 서열에 접합된 IL-6을 포함하는 융합 단백질이 사용될 수 있다. HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6의 서열은 서열 번호 162이다.
IL-6 수용체 a인, IL-6Ra는 인터루킨 6에 대한 수용체이다. IL-6Ra는 또한 6Rα, IL-6Ra, IL-6R 및 CD126으로도 알려져 있다. IL-6Ra는 생체내에서 트랜스막 형태로 및 가용성 형태로 존재한다. 문맥상 달리 명시되지 않는 한, IL-6Ra는 트랜스막 IL-6Ra 및/또는 가용성 IL-6Ra일 수 있다.
본원에서 지칭되는 IL-6 수용체는 달리 명시되지 않는 한, 보통 인간 IL-6 수용체이다. 인간 가용성 IL-6Ra(sIL-6Ra, sIL-6R)의 아미노산 서열은 서열 번호 163이다. 인간 트랜스막 IL-6Ra의 아미노산 서열은 서열 번호 164이다.
IL-6은 IL-6Ra에 결합하여 복합체, IL-6:IL-6Ra를 형성한다. 복합체는 가용성(sIL-6Ra와의 복합체의 경우)이거나, 막에 결합한 형태(트랜스막 IL-6Ra와의 복합체의 경우)일 수 있다. IL-6Ra가 가용성 형태인 경우, 복합체는 IL-6:sIL-6Ra로 지정된다. IL-6:IL-6Ra에 대해 언급하는 것은 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 트랜스막 IL-6Ra와, 또는 가용성 IL-6Ra와 복합체를 형성한 IL-6을 포함할 수 있다.
gp130
gp130은 IL-6:IL-6Ra 복합체에 대한 수용체이다. gp130의 클로닝 및 특징 규명에 대해서는 문헌 [Hibi et al, Cell 63:1149-1157 (1990)]에 보고되어 있다. 인간 gp130의 서열은 서열 번호 166에 기재되어 있다.
결합 구성원
이는 서로서로에게 결합하는 한 쌍의 분자들 중 하나의 구성원을 기술한다. 결합 쌍의 구성원들은 천연적으로 유도된 것이거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성하여 생산된 것일 수 있다. 분자 쌍의 하나의 구성원은 그의 표면상 한 영역, 또는 공동을 갖는데, 이는 분자 쌍의 나머지 한 구성원과 결합하고, 이로써 그의 특정 공간 및 극성 구조와 상보성을 이루게 된다. 결합쌍 유형의 예로는, 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이 있다. 본 발명은 항원-항체 유형의 반응에 관한 것이다.
결합 구성원은 보통 항원 결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, 결합 구성원은 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 예로서, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등과 같은 비항체 단백질 스캐폴드 상의 CDR 배열에 의해 제공될 수 있거나[42, 43, 44], 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화하거나 돌연변이화시켜 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하여 제공할 수 있다. 단백질 내에 새로운 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 (Nygren) 등에 의해 상세히 기재되었다[44]. 항체 모방체를 위한 단백질 스캐폴드는 WO/0034784(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있으며, 여기서 발명자들은 적어 하나의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 기술하고 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어, HCDR 세트가 그 내로 이식될 수 있는 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼계열 중 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비인간 단백질일 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드의 장점은 항원 결합 부위를 적어도 일부 항체 분자보다는 작거나 생산하기 쉬운 스캐폴드 분자 내에 제공한다는 것이다. 결합 구성원의 크기가 작으면 여러 가지 유용한 생리학적 특성, 예를 들어, 세포 내 침투하거나, 조직 내 깊숙이 들어가거나, 다른 구조 내의 표적에 다다르는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에 결합하는 능력을 가질 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드내 항원 결합 부위를 사용하는 것은 문헌 (Wess, 2004 [45])에 기재되어 있다. 전형적인 것은 안정한 골격과 하나 이상의 가변적 루프를 갖는 단백질로서, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이되어 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성하게 된 것이다. 그러한 단백질은 S. 아우레우스(S. aureus)로부터의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예를 들어, 열번째 피브로넥틴 III형 도메인), 리포칼린 뿐만 아니라, 감마-결정질 및 기타 아필린(Affilin)™ 스캐폴드(Scil Proteins)를 포함한다. 다른 접근법은 분자내 이황화 결합을 갖는 작은 단백질인 사이클로티드에 기초하는 합성 "마이크로바디", 마이크로단백질(Versabodies™, Amunix) 및 안키린 리피트 단백질(DARPins, Molecular Partners)을 포함한다.
항체 서열 및/또는 항원 결합 부위 이외에도 본 발명에 따른 결합 구성원은 예로서, 폴딩된 도메인, 또는 분자에 항원에 결합할 수 있는 능력 이외의 또다른 기능적 특징을 부여하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는, 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 검출 가능한 표지를 수반하거나, 독소 또는 표적 부분 또는 효소에(예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통하여) 결합될 수 있다. 예를 들면, 결합 구성원은 항원 결합 부위뿐만 아니라, 촉매 부위(예를 들어, 효소 도메인 내에)를 포함할 수 있으며, 항원 결합 부위가 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원에 표적화시킨다. 촉매 부위는, 예컨대, 절단에 의하여 항원의 생물학적 기능을 저해시킬 수 있다.
언급한 바와 같이, CDR이 비항체 스캐폴드에 의해 수반될 수 있는 것이지만, 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 수반하는 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 그의 실질적인 부분으로서, 이들에서 CDR 또는 CDR 세트는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연적으로 발생된 VH 및 VL 항체 가변 도메인 중의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 배치되어 있다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 배치는 문헌 (Kabat, et al., 1987 [46]), 및 그의 최신판에 의해 결정될 수 있다. 이들 데이타베이스에 질의하는데 다수의 학업적 및 상업적 온라인 공급원이 이용가능하다. 예를 들면, 참고 문헌 [47] 및 웹 주소 http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html인 관련 온라인 공급원을 참조한다.
CDR 부위 또는 CDR은 문헌 (Kabat et al. 1991 [48])과 그의 최신판에 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 부위를 나타내고자 한다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. 본 명세서에서 CDR 또는 CDR란 경우에 따라 이들 부위 중의 하나, 또는 수개, 또는 항원 또는 그가 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화도에 의해 결합에 관여하는 대부분의 아미노산 잔기를 포함하는 부위의 전부를 나타내기 위해 사용된다.
6개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세번째 CDR(HCDR3)은 보다 큰 크기 변동성을 갖는다(본질적으로 다양성을 제공하는 유전자 배열의 기전에 기인하여 더욱 더 큰 다양성을 갖는다). 이것은 아미노산 2개 길이만큼 짧을 수도 있지만, 가장 긴 것은 아미노산 26개에 이르는 것으로 알려져 있다. CDR 길이는 또한 특정의 기본적 프레임워크에 의해 조정될 수 있는 길이에 따라서 달라질 수 있다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성을 결정하는데 부분적으로 역할을 한다[참고 문헌 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56].
HCDR1은 카바트 잔기 31-35로 이루어지는 5개 아미노산 길이일 수 있다.
HCDR2는 카바트 잔기 50-65로 이루어지는 17개 아미노산 길이일 수 있다.
HCDR3은 임의로 카바트 잔기 100D를 포함하는, 카바트 잔기 95-102로 이루어지는, 11 또는 12개 아미노산 길이일 수 있다.
LCDR1은 카바트 잔기 24-34로 이루어지는 11개 아미노산 길이일 수 있다.
LCDR2는 카바트 잔기 50-56로 이루어지는 7개 아미노산 길이일 수 있다.
LCDR3은 임의로 카바트 잔기 95를 포함하는, 카바트 잔기 89-97로 이루어지는 8 또는 9개 아미노산 길이일 수 있다.
항체 분자
이는 천연 또는 부분적 또는 전체적으로 합성되어 생산되었든 간에 면역글로불린을 이른다. 이 용어는 또한 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 발명은 천연 형태의 항체에 관한 것이 아니며, 다시 말해서 본 발명의 항체가 천연의 환경에 존재하는 것이 아니라, 천연 공급원으로부터 정제에 의해 단리 또는 수득될 수 있거나, 유전적 재조합에 의해서 얻거나, 화학 합성에 의해서 얻을 수 있다는 것, 또한 그들이 후술하는 바와 같은 비천연의 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 항체 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편은 예로서, Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd와 같은 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자를 포함한다. 하나 이상의 항체 항원 결합 부위를 포함하는 각종 다른 항체 분자가 조작되었으며, 이는 예로서, Fab2, Fab3, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 항체 분자 및 그의 작제 방법 및 사용 방법은 [57]에 기재되어 있다.
표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 얻기 위하여 모노클로날 또는 다른 항체를 취하고, 재조합 DNA 기술의 기법을 사용할 수 있다. 그러한 기법은 항체의 면역글로불린 가변 부위 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 다른 면역글로불린의 불변 부위 또는 불변 부위 + 프레임워크 부위로 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 아주 다양한 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포에 유전적 돌연변이 또는 다른 변화를 일으킬 수 있으며, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 그러하지 않을 수 있다.
항체가 다수의 방법으로 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 요구되는 결합 특이성 및/또는 항원에의 결합을 포함하는 항체 항원 결합 부위를 갖는 임의의 결합 구성원 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연이든 부분 또는 전체적으로 합성된 것이든 간에 불문하고, 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 항체 단편 및 유도체를 포함하는 것이다. 항체 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 등가물로서, 또다른 폴리펩티드에 융합된 것(예로서, 또다른 종으로부터 유도된 것 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것)도 따라서 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 다수의 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가의 기법들은 인간 및 인간화된 항체를 단리하는 것을 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 (Kontermann & Dubel [58])에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 결합 구성원을 생산하는 또다른 확립된 기법인 파지 디스플레이는 예로서, 문헌 (Kontermann & Dubel [58]) 및 WO92/01047(하기 상세히 논의됨), 및 US 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404와 같은 많은 공개문헌에 상세히 기재되어 왔다.
마우스 면역계에서 다른 성분들은 온전하게 보존되고 마우스 항체 유전자는 불활성화되고 기능적으로 인간 항체 유전자로 교체된 트랜스제닉 마우스가 인간 항체를 단리해내는데 사용될 수 있다[59]. 인간화된 항체는 당업계에 공지된 기법, 예를 들면, WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 및 WO93/17105에 개시되어 있는 것과 같은 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 추가로, WO2004/006955는, 비인간 항체의 가변 부위의 CDR 서열에 대한 정규 CDR 구조 유형을 인간 항체 서열, 예로서, 생식세포 항체 유전자 세그먼트의 라이브러리로부터의 상응하는 CDR에 대한 정규 CDR 구조 유형을 비교함으로써 인간 항체로부터 가변 부위 프레임워크 서열을 선별하는 것에 기초하는, 항체를 인간화하는 방법을 기술하고 있다. 비인간 CDR에 대해 유사한 정규 CDR 구조 유형을 갖는 인간 항체 가변 부위는 인간 항체 서열로부터 인간 프레임워크 서열을 선별할 수 있도록 하는 구성원들의 하위세트를 형성한다. 상기 하위세트 구성원들은 추가로 인간과 비인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 대해 등급화될 수 있다. WO2004/006955의 방법에서는 선별된 하위세트 구성원 인간 프레임워크를 사용하여 인간 CDR 서열을 기능적으로 비인간 CDR 대응물로 대체한 키메라 항체를 작제함으로써 비인간과 인간 항체 사이의 프레임워크 서열을 비교할 필요없이 높은 친화성과 낮은 면역원성을 갖는 인간화된 항체를 제공할 수 있도록 하기 위해 상위권의 인간 서열을 선별하여 프레임워크 서열을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 키메라 항체 또한 개시한다.
합성 항체 분자는 예를 들면, 문헌 ([Knappik et al. [60]] 또는 [Krebs et al. [61]])에 기재되어 있는 바와 같이, 적합한 발현 벡터에서 합성되고 어셈블링된 올리고뉴클레오티드에 의해 생산된 유전자로부터 발현되어 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편은 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진, dAb 단편[62, 63, 64]; (v) 단리된 CDR 부위; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되어 2개의 도메인이 회합되어 항원 결합 부위를 형성하는 것인 단일 쇄 Fv 분자(scFv)[65, 66]; (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이합체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 작제된 "디아바디," 다가 또는 다중특이적 단편(WO94/13804; [67]). Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 이황화 브릿지를 혼입하여 안정화시킬 수 있다[68]. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디를 또한 제조할 수 있다[69]. 결합 단편의 다른 예는 Fab'로서, 이는 중쇄 CH1 도메인의 카보닐 말단에 항체 힌지 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 수개의 잔기 부가에 의해 Fab 단편과 차이나는 것이며, 다른 예는 Fab'-SH로서 이는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 포함하는 Fab' 단편이다.
문헌 (Qui et. al. [70])에는 프레임워크 부위에 의해 연결되는 단지 2개의 CDR을 함유하는 항체 분자가 기재되어 있다. VH 또는 VL 도메인으로부터의 CDR3은 다른 도메인의 CDR1 또는 CDR2 루프에 연결되어 있었다. 선별된 CDR1 또는 CDR2의 C 말단을 거쳐 FR 부위에 의해 CDR3의 N 말단으로 연결되어 있었다. (Qui) 등은 소수성이 가장 적은 패치를 갖는 FR 부위를 선별하였다. 시험하기에 가장 좋은 항체 조합은 VL CDR1이 VH FR2에 의해서 VH CDR3에 연결된 것(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)이라는 것이 밝혀졌다. 분자량이 약 3 kDa일 경우, 이들 항체 분자는 전체 면역글로불린(대략 150 kDa) 또는 scFv(대략 28 kDa)와 비교하여 조직 침투성이 개선되었다는 점에서 잇점을 제공한다.
본 발명의 항체 단편은 예로서, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 브릿지의 절단과 같은 방법에 의해 모체 항체 분자 또는 항체 분자 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 임의의 것으로부터 출발하여 수득할 수 있다. 또다른 방식으로 본 발명에 포함되는 항체 단편은 당업자에 잘 알려진 바와 같은 유전자 재조합 기법, 또는 다르게는 어플라이드 바이오시스템즈 사(Applied Biosystems) 등에 의해 공급되는 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성에 의해서 또는 핵산 합성 및 발현에 의해서 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 기능적 항체 단편은 반감기가 화학적 변형, 특히 PEG화 또는 리포좀 내의 혼입에 의해 증가될 수 있는 임의의 기능적 단편을 포함한다.
dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체성 항원 결합 단편, 즉, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 부위이다[64]. VH dAbs는 낙타류(예를 들어, 낙타, 라마)에서 천연적으로 발생하며, 낙타류를 표적 항원으로 면역시키고, 항원 특이적 B 세포를 단리한 다음, 각개의 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝하여 생산될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양물에서 생산될 수 있다. 그들은 작은 크기, 우수한 용해도 및 온도 안정성으로 인해 특히 생리학적으로 유용하고, 선택 및 친화도 성숙에 적절하다. 낙타류 VH dAbs는 "나노바디(nanobodies)™"라는 상표명하에 치료용으로 개발중에 있다. 본 발명의 결합 구성원은 실질적으로 본원에 개시된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb, 또는 실질적으로 본원에 개시된 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인일 수 있다.
이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 가변 부위가 동일 분자내에 조합된 제2세대 모노클로날 항체를 형성한다[71]. 그들의 용도는 새로운 효과기 기능을 보충할 수 있는 능력 또는 종양 세포 표면상의 수개의 분자를 표적으로 하는 능력으로부터 진단 및 치료 분야에서 모두 입증된 바 있다. 이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 통상의 이중특이적 항체로서, 다양한 방법[72], 예를 들어, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 생산될 수 있는 것이거나, 상술한 어느 하나의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법[73, 74] 또는 신체적 방법[75, 76], 또는 마찬가지로 그리고 우선적으로 이종이합체화를 강제할 수 있고, 그로써 구하고자 하는 항체의 정제 과정을 용이하게 할 수 있는 유전 공학 기술에 의해 얻을 수 있다[77]. 이중특이적 항체의 예는 바이트(BiTE)™ 기술의 항체를 포함하며, 여기서 상이한 특이성을 갖는 두 항체의 결합 도메인이 사용되어 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결될 수 있다. 이는 2개의 항체를 짧은 단일 폴리펩티드 쇄 상에 조합한다. 디아바디 및 scFv는 단지 가변 도메인만을 사용하여 Fc 부위 없이 작제될 수 있으며, 잠재적으로는 항-이디오타입 반응의 효과를 감소시킨다.
이중특이적 항체는 전체 IgG로서, 이중특이적 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 디아바디 또는 이중특이적 scFv로 작제될 수 있다. 또한, 2개의 이중특이적 항체를 당업계에 공지된 통상의 기술로 연결시켜 4가 항체를 형성할 수 있다. 이중특이적 전체 항체에 대립되는 개념으로서의 이중특이적 디아바디는 또한 그들이 E. 콜라이(E. coli) 내에서 쉽게 작제되고 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성을 갖는 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택할 수 있다. 디아바디의 한쪽 암이, 예를 들어, IL-6에 대해 특이성을 갖는 채로 일정하게 유지되는 경우, 다른 암이 가변적인 라이브러리를 만들고, 적절한 특이성의 항체가 선택된다. 이중특이적 전체 항체는 문헌(Ridgeway et al., 1996 [78])에 기재된 바와 같은 대체 방법으로 제조될 수 있다.
IL-6에 대한 항체를 얻는 다양한 방법들이 당업계에서 이용될 수 있다. 항체는 특히 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화된 기원의 모노클로날 항체일 수 있으며, 이는 당업자에 잘 알려진 표준 방법으로 수득할 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 기원의, 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 제조하는 것은 특히 매뉴얼 "항체"[79]에 기재된 기법, 또는 문헌 (Kohler and Milstein [80])에 기재된 바에 따라 하이브리도마로부터 제조하는 기법을 지칭할 수 있다.
모노클로날 항체는, 예를 들어, IL-6 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그들의 단편들 중 하나에 대해 면역화된 동물의 B 세포로부터 수득할 수 있다. 적합한 단편 및 그를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 기술되어 있고, 이는 동물을 면역화시켜 IL-6에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. IL-6, 또는 그의 단편 중의 하나는 특히 통상의 실험 방법에 따라서, IL-6 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유된 핵산 서열로부터 출발하는 유전적 재조합에 의해, IL-6 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열에 포함된 아미노산 서열로부터 출발하는 펩티드 합성법에 의해 생산될 수 있다.
모노클로날 항체는 IL-6 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그들의 단편이 미리 고정되어 있는 친화도 칼럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 특히, 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서 크로마토그래피하고, DNA 및 LPS 뿐만 아니라 잔류 단백질 오염물의 제거를 위한 이온-교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않고, 이합체나 다른 다합체의 존재에 기인한 잠재적인 응집물을 제거할 목적으로 세파로스 겔 상의 크기 배제 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않고서 정제할 수 있다. 하나의 실시태양에서 위와 같은 모든 기술을 동시에 또는 연속적으로 사용할 수 있다.
항원 결합 부위
이는 표적 항원의 일부 또는 전체에 결합하고 그에 상보적인 분자의 부분을 이른다. 항체 분자에서, 이는 항체 항원 결합 부위라고 불리우며, 표적 항원의 일부 또는 전체에 결합하고 그에 상보적인 항체의 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합하게 되며, 이 부분을 에피토프라 한다. 항체 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 부위(VL) 및 항체 중쇄 가변 부위(VH)를 포함할 수 있다.
WO2006/072620에는 면역글루불린 도메인의 베타 스트랜드 사이로 확장되어 있는 구조(비-CDR) 루프에서 항원 결합 부위를 조작하는 것이 기재되어 있다. 항원 결합 부위는 CDR의 천연 위치와는 별개인 항체 분자 부위, 예로서, VH 또는 VL 도메인의 프레임워크 부위에서, 또는 항체 불변 도메인, 예로서, CH1 및/또는 CH3에서 조작될 수 있다. 구조 부위에서 조작된 항원 결합 부위는 VH 및 VL 도메인의 CDR 세트에 의해 형성된 항원 결합 부위에 부가적이거나, 그를 대신할 수 있다. 다중 항원 결합 부위가 항체 분자에 존재할 경우, 이는 동일 항원(IL-6)에 결합함으로써 결합 구성원의 원자가는 증가하게 된다. 별법으로, 다중 항원 결합 부위는 상이한 항원(IL-6 및 하나 이상의 또다른 항원)에 결합할 수 있으며, 이는 항체 분자의 효과기 기능을 부가하거나, 반감기를 연장시키거나, 생체내 전달을 개선시키는데 사용될 수 있다.
단리된
이는 본 발명의 결합 구성원 또는 그러한 결합 구성원을 코딩하는 핵산이 본 발명에 따라서 일반적으로 존재하게 되는 상태를 이른다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 예를 들어, 천연 환경으로부터 단리 및/또는 정제되어 실질적으로 순수 또는 균질한 형태로, 또는 핵산의 경우는 필요한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 다른 핵산 또는 기원의 유전자가 없거나 실질적으로 없는 상태로 제공된다. 단리된 구성원 또는 단리된 핵산은 그들이 천연적으로 결합되어 있던 물질, 예로서, 그의 천연 환경, 또는 생체내 또는 시험관내 수행된 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 경우 그들이 제조된 환경(예로서, 세포 배양물)에서 그들과 같이 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 실질적으로 없는 상태로 존재할 것이다. 구성원 및 핵산은 희석제 또는 애주번트와 함께 제제화하거나 실제로는 여전히 단리된 상태일 수 있는데, 예를 들어, 결합 구성원은 일반적으로 면역분석에 사용하기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는데 사용되는 경우 젤라틴 또는 다른 담체와 함께 혼합되거나, 진단 또는 치료에 사용되는 경우 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 결합 구성원은 천연적으로 또는 이종 진핵 세포(예로서, CHO 또는 NSO (ECACC 85110503) 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 그들은(예를 들어, 원핵 세포 중 발현에 의해 생산되는 경우) 글리코실화되지 않을 수 있다.
항-IL-6 항체 분자를 포함하는 비균질 제제 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 예를 들어, 그러한 제제는 전장의 중쇄 및 C-말단 리신이 결여된 중쇄를 갖는 항체, 다양한 정도의 글리코실화 및/또는 유도된 아미노산, 예를 들어, N-말단 글루탐산을 폐환화시켜 형성된 피로글루탐산 잔기를 갖는 항체들의 혼합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 기재된 바와 같은"이란 어구는 본원에 기술된 결합 구성원의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특징이 그 서열이 본원에 기재된 특정 부위와 동일하거나 매우 유사한 것을 이른다. 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 특정 부위(들)와 관련한 "매우 유사한"이란 어구는 1 내지 약 5, 예를 들어, 1 내지 4, 예를 들어, 1 내지 3, 또는 1 또는 2, 또는 3 또는 4개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에 만들어질 수 있다는 것을 나타낸다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. 본 도면은 항-IL-6 항체(항체 18) 투여가 마우스 생체내에서 인간 재조합 IL-6에 의해 유도된 합토글로빈 증가에 미치는 효과를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 구성원은 IL-6의 생물학적 활성을 조절하고 중화시킬 수 있다. 본원에 기술된된 바와 같이, 본 발명의 IL-6-결합 구성원은 중화 효능에 대하여 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 결합 구성원의 서열(일반적으로 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이화시켜 결합 구성원의 라이브러리를 생성하고, 이를 효능에 대해 분석하여 보다 강한 결합 구성원을 선택하는 단계를 포함한다. 따라서, 선택된 "효능이 최적화된" 결합 구성원은 그로부터 라이브러리가 생성된 결합 구성원보다 높은 효능을 갖는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 고효능 결합 구성원은 또한 최적화 없이도 수득될 수 있으며, 예를 들어, 고효능 결합 구성원은 초기 스크린, 예를 들어, 생화학적 중화 분석법에 의해 직접 수득될 수 있다. "효능이 최적화된" 결합 구성원이란 IL-6의 특정 활성 또는 하류 기능을 중화시키는 최적화된 효능을 갖는 결합 구성원을 지칭한다. 분석 및 효능은 본원 다른 경우에도 상세히 기술되어 있다. 본 발명은 효능이 최적화된 결합 구성원 및 비최적화된 결합 구성원, 둘 모두와, 선택된 결합 구성원으로 효능을 최적화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 따라서 당업자가 고효능의 결합 구성원을 생산할 수 있도록 한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 구성원 라이브러리와 항원을 접촉시키는 단계, 및 라이브러리 중 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 결합 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 구성원을 수득하는 방법을 제공한다.
라이브러리는 입자 또는 분자 복합체, 예를 들어, 효모, 세균 또는 박테리오파지(예를 들어, T7) 입자, 바이러스, 세포와 같은 복제 가능한 유전적 패키지 또는 공유 결합, 리보솜 또는 다른 시험관내 디스플레이 시스템 상에 디스플레이 될 수 있으며, 각 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인 및 임의로는 존재하는 경우 디스플레이된 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 WO92/01047 및 예로서, US 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
항원에 결합할 수 있고, 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이된 결합 구성원을 선별한 후, 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하고 있는 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 취할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하고 있는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 취한 핵산 서열을 갖는 핵산으로부터 발현시켜 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 생산하는 추후 과정에 사용할 수 있다.
상기 선별된 결합 구성원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 그러한 VH 도메인을 포함하는 결합 구성원과 같이 단리된 형태로 제공될 수 있다.
IL-6에 결합할 수 있는 능력은 추가로 시험될 수 있으며, IL-6에 결합하기 위해 예로서, 모체 항체 분자 또는 항체 분자 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23 중 어느 것(예를 들어, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷, 예를 들어, IgG 1)과 경쟁하는 능력 또한 시험될 수 있다. IL-6을 중화시키는 능력은 본원 다른 경우에서 추가로 논의되는 바와 같이 시험될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 모체 또는 다른 항체 분자, 예로서, scFv, 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 하나, 예로서, IgG1의 친화도로, 또는 그보다 양호한 친화도로 IL-6에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 IL-6의 생물학적 활성을 모체 또는 다른 항체 분자, 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 하나, 예로서, scFv, 또는 IgG1의 효능으로, 또는 그보다 양호한 효능으로 중화시킬 수 있다.
다른 결합 구성원의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건하에 비교될 수 있다.
그에 대한 아미노산 서열이 본원에 기재되어 있는 것과, 본 발명의 결합 구성원에서 사용될 수 있는 것을 비롯한 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이시키는 방법 및 원하는 특징을 갖는 항원 결합 구성원을 스크리닝하는 방법을 수단으로 하여 수득할 수 있다. 원하는 특징의 예로는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
● 항원에 특이적인 공지 항체에 비하여 항원에 대한 결합 친화성의 증가
● 활성이 알려져 있을 경우, 항원에 특이적인 공지 항체에 비하여 항원 활성의 중화 증가
● 특정 몰비에서 항원에 대해 공지 항체 또는 리간드와 경쟁할 수 있는 구체화된 능력
● 복합체를 면역침전시킬 수 있는 능력
● 하기 언급하는 에피토프에 결합할 수 있는 능력
o 본원에 기술된 바와 같은 펩티드-결합 스캔을 사용하여, 예로서, 선형 및/또는 제한적인 구조로 스크리닝된 펩티드를 사용하여 확인된 펩티드 서열과 같은 선형 에피토프
o 비연속 잔기에 의해 형성된 입체 입체 구조적 에피토프
● IL-6, 또는 하류 분자의 새로운 생물학적 활성을 조절할 수 있는 능력.
그러한 방법 또한 본원에서 제공한다.
본원에 개시된 항체 분자의 변이체가 본 발명에서 생산되고 사용될 수 있다. 다변수 데이타 분석기술을 구조/특성-활성 관계에 적용하는 컴퓨터 화학의 리드를 따라[81], 항체의 정량적 활성-특성 관계가 통계학적 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 잘 알려진 수학적 기술에 의해 유도될 수 있다[82, 83, 84, 85, 86, 87]. 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 및 3차원 구조의 경험적 및 이론적 모델(예를 들어, 예상되는 접촉 잔기 분석 또는 계산된 물리화학적 특성)로부터 유도할 수 있으며, 이들 특성들은 단독으로 또는 병합되어 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체 항원 결합 부위는 전형적으로는 6개의 폴리펩티드 루프에 의해 형성된다: 이들 중 3개는 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터, 다른 3개는 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터의 것이다. 알려진 원자 구조의 항체 분석은 항체 결합 위치의 서열과 3차원 구조간의 관계를 해명해왔다[88, 89]. 이와 같은 관계는, VH 도메인 중 제3 부위(루프)를 제외하고는, 결합 부위 루프는 소수의 주쇄 구조: 정규 구조 중의 하나를 갖는다는 것을 암시한다. 특정 루프 안에 형성된 정규 구조는 그의 크기, 및 그 루프와 프레임워크 부위 중 중요 위치의 특정 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 나타났다[88, 89].
서열-구조 관계에 대한 이와 같은 연구는, 서열은 알려졌으나 3차원 구조는 알려지지 않은 항체 중 그의 CDR 루프의 3차원 구조를 유지하는데 있어서, 결과적으로는 그의 결합 특이성을 유지하는데 있어서 중요한 잔기를 예측하는데 사용될 수 있다. 이러한 예측은 그 예측을 리드(lead) 최적화 실험으로부터의 결과와 비교함으로써 지지될 수 있다. 입체 구조적 접근법에서, 무료로 이용할 수 있거나, 또는 예로서, WAM[91]과 같은 시판 팩키지를 사용하여 항체 분자의 모델을 생성할 수 있다[90]. 이어서, 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 인사이트 II(Insight II, Accelerys, Inc.) 또는 딥 뷰(Deep View)[92]를 사용하여, CDR 중 각 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이어서, 이러한 정보를 이용하여 활성에 최소 또는 유익힌 효과를 나타낼 수 있는 치환을 만들 수 있다.
CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열 내에 치환을 만드는데 필요한 기법은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다. 변이체 서열이 활성에 최소 또는 유익한 효과를 부여할 것으로 예상되거나 그러하지 않은 치환을 갖도록 만들고, IL-6에의 결합 및/또는 중화 능력, 및/또는 다른 바람직한 특성에 대해 시험할 수 있다.
본원에 그의 서열이 구체적으로 개시된 임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 VL 도메인의 변이체, 및 그를 포함하는 결합 구성원 또는 항체 분자는 아르기닌이 카바트 잔기 108에 존재하지 않는 VL 도메인, 예로서, 카바트 잔기 108이 다른 잔기이거나, 카바트 잔기 108이 결실되어 있는 VL 도메인을 포함한다. 예를 들면, 항체 분자, 예로서, 불변 도메인, 예로서, scFv가 결실되어 있는 항체는 카바트 잔기 108의 아르기닌이 아르기닌 이외의 아미노산 잔기이거나, 결실되어 있는 것인, 본원에 기술되어 있는 것과 같은 VL 도메인 서열 또는 그의 변이체를 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 VH 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하고/거나, 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것의 VL 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체 분자이다. 두 아미노산 서열의 동일성(%)을 계산하는데 사용될 수 있는 알고리즘은 예로서, BLAST[93], FASTA[94], 또는 예로서, 디폴트 파라미터를 사용하는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘[95]을 포함한다.
특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다.
변경은 하나 이상의 프레임워크 부위 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 변경은 보통 기능을 손실시키지는 않으며, 이로써 그와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 IL-6에 결합하고/거나 그를 중화시킬 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 분석법으로 측정된 바와 같이, 결합 구성원내에서의 변경은 이루어지지 않기 때문에 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 그와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 IL-6에 결합하고/거나 그를 중화시키는 것이 개선된 능력을 가질 수 있다. 변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산으로 대체하는 것, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연적으로 발생된 또는 비표준 형태로 변형시키는 것, 또는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산을 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 갯수 및 위치의 예가 본원 다른 경우에 기재되어 있다. 천연적으로 발생된 아미노산은 20개의 "표준" L-아미노산을 포함하며, 이는 표준 단문자 코드 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 표시된다. 비표준 아미노산은 폴리펩티드 골격 내로 혼입될 수 있거나 기존의 아미노산 잔기를 변형시켜 생겨난 임의의 다른 아미노산 잔기를 포함한다. 비표준 아미노산은 천연적으로 발생되거나 비천연적으로 발생된 것일 수 있다. 수개의 천연적으로 발생된 비표준 아미노산이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이다[96]. N-알파 위치에서 유도체화된 아미노산 잔기는 단지 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 보통 본 발명에서 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수 있다. 따라서 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변형시키거나, 대체하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 포스포릴화된 형태 또한 알려져 있으며, 본 발명의 아미노산을 그와 같이 변형시킬 수 있다.
본 발명의 항체 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열은 상기한 바와 같은 비천연 또는 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비표준 아미노산(예를 들어, D-아미노산)이 합성시에 아미노산 서열 내로 혼입될 수 있거나, 비표준 아미노산이 아미노산 서열 합성 이후에 "원래의" 표준 아미노산의 변형 또는 대체에 의해 도입될 수 있다.
비표준 및/또는 비천연적으로 발생된 아미노산의 사용은 구조 및 기능적 다양성을 증가시키며, 따라서 본 발명의 결합 구성원 중에 원하는 IL-6 결합 및 중화 특성에 도달할 수 있는 잠재능을 증가시킬 수 있다. 또한, D-아미노산 및 유사체는 표준 L-아미노산과 비교할 때 상이한 약물동력학 프로파일을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 동물, 예를 들어, 인간에 투여한 후에 L-아미노산을 갖는 폴리펩티드의 생체내 분해에 기인하는 것인데, 이는 D-아미노산이 일부 생체내 적용에 있어 이롭다는 것을 의미한다.
본 발명의 CDR-유도 서열을 수반하는 신규 VH 또는 VL 부위는 하나 이상의 선별된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발법을 사용하여 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 일으키는 방법으로 생성될 수 있다. 그러한 기법은 문헌(Gram et. al. [97])에 기재되어 있는데, 이는 오류 빈발(error-prone) PCR을 사용한 것이다. 일부 실시태양에서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에 만들어진다.
사용될 수 있는 또다른 방법은 돌연변이유발을 VH 또는 VL 유전자의 CDR 부위 내로 유도하는 것이다. 그와 같은 기법은 문헌(Barbas et al. [98] 및 Schier et al. [99])에 기재되어 있다.
상기 기술된 모든 기법은 당업계에 그 자체로 알려져 있으며, 당업자는 그러한 기법을 이용하여 당업계의 통상적인 방법을 사용함으로써 본 발명의 결합 구성원을 제공할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에 기재된 VH 도메인의 아미노산 서열 중에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하는 것을 통해 상기 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 및 임의로는 그와 같은 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하여 임의로는 하나 이상의 원하는 특성, 예를 들어, IL-6 활성을 중화시키는 능력을 갖는, IL-6에 대한 결합 구성원 또는 항체 항원 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, IL-6에 대한 항체 항원 결합 부위를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 본원에 실질적으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합시키는 유사한 방법을 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 아미노산 서열이 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적 부분에 CDR로서 함유될 수 있다. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 실시태양을 대표하며, 이들 각각이 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적 부분에 HCDR3로서 함유될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득되거나 유도될 수 있거나, 또는 알려진 인간 가변 도메인의 공통 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비인간 항체로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR(예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Marks et al. [100])은 도메인 영역의 5' 말단에 또는 그에 인접하여 유도된 공통 프라이머를 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 부위에의 공통 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기술하고 있다. 상기 문헌(Marks et al.)은 추가로 이와 같은 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3와 어떻게 조합될 수 있는지를 기술하고 있다. 유사한 기법을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유도된 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링될 수 있으며, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동종 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 결합 구성원을 제공한다. 레퍼토리는 이어서 적합한 숙주 시스템, 예를 들어, WO92/01047(그의 전문이 본원에서 참고로 인용됨), 또는 임의의 다수의 후속 문헌(Kay, Winter & McCafferty [101] 포함)의 파지 디스플레이 시스템 중에 디스플레이되어 적합한 결합 구성원이 선별되게 할 수 있다. 레퍼토리는 104 이상의 개개 성분, 예를 들면 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109 또는 적어도 1010 이상의 구성원으로 이루어질 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(a) 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 영역이 결여된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) 상기 레퍼토리를 실질적으로 본원에서 VH CDR3에 대해 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여체 핵산과, 상기 공여체 핵산이 레퍼토리 내 CDR3 부위내로 삽입되도록 조합하여 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) IL-6에 대한 결합 구성원을 선택하는 단계; 및
(e) 상기 결합 구성원 또는 그를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함하는, IL-6 항원에 대한 결합 구성원의 제조 방법을 제공한다.
이에 다시, 본 발명의 VL CDR3을, 대체되는 CDR3을 포함하거나 CDR3 코딩 부위가 결여된 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
유사하게, 하나 이상, 또는 3개 모두의 CDR을 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 이식한 다음, IL-6에 대한 결합 구성원 또는 결합 구성원들 대해 스크리닝할 수 있다.
예를 들면, 하나 이상의 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 또는 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23의 HCDR 세트가 사용될 수 있고/거나, 하나 이상의 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 또는 모체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 또는 23의 LCDR 세트가 사용될 수 있다.
유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트가 사용될 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적 부분은 적어도 3개의 CDR 부위를 그 사이에 개재된 프레임워크 부위와 함께 포함할 수 있다. 그 부분은 또한 적어도 약 50%의, 단독으로 또는 합쳐서 첫번째 및 네번째 프레임워크 부위를 포함할 수 있으며, 50%는 프레임워크 부위의 C-말단 50%, 및 네번째 프레임워크 부위의 N-말단 50%이다. 실질적 가변 도메인 부분의 N-말단 또는 C-말단 단부에서의 추가의 잔기는 천연적으로 발생된 가변 도메인 부위와는 보통 관련이 없는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 본 발명의 결합 구성원의 작제는 클로닝 또는 다른 조작단계를 촉진시키기 위하여 도입된 링커에 의해 코딩된 N-또는 C-말단 잔기를 도입시킬 수 있다. 다른 조작 단계는 링커의 도입으로 본 발명의 가변 도메인을 추가의 단백질 서열, 예로서, 항체 불변 부위, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디의 생산시에) 또는 본원 다른 경우에도 상세히 기술되는 바와 같은 검출 가능한/기능적 표지 등에 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 몇몇 측면에서, 결합 구성원은 한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 측면을 구성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 상기 dAb에 대한 논의를 참조한다. 단일 결합 도메인의 경우에, 이러한 도메인은 IL-6에 결합할 수 있는 2개의도메인 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이는 WO92/01047(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시된 바와 같은, 소위 계층적 이중 조합 접근법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 개개의 콜로니가 다른 쇄(L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키는데 사용되어, 생성된 2쇄 결합 구성원을 상기 문헌에 기재되어 있는 바와 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선택한다. 이와 같은 기법은 문헌(Marks et al, ibid. [100])에도 개시되어 있다.
본 발명의 결합 구성원은 추가로 항체 불변 부위 또는 그의 부분, 예로서, 인간 항체 불변 부위 또는 그의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, VL 도메인을 그의 C-말단 단부에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착시킬 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 결합 구성원을 그의 C-말단 단부에서 임의의 항체 이소타입, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 임의의 이소타입 하위부류, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유도된 면역글로불린 중쇄의 전체 또는 부분(예를 들어, CH1 도메인)에 부착시킬 수 있다. IgG1이 그의 효과기 기능 및 조작 용이성에서 유리하다. 이들 특성을 가지며 가변 부위를 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 부위 변이체 또한 본 발명의 실시태양에서 유용할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 검출가능한 표지 또는 기능적 표지로 표지화될 수 있다. 따라서, 결합 구성원 또는 항체 분자는 검출가능한 신호 및/또는 정량가능한 신호를 얻기 위한 면역접합체 형태로 존재할 수 있다. 면역접합체는 검출가능한 표지 또는 기능적 표지와 접합체를 형성한 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 표지는 신호를 생성하거나 생산하도록 유도할 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 형광체, 방사성 표지, 효소, 화학발광체 또는 광감작체를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사능, 효소 활성 또는 광 흡수를 탐지하여 검출 및/또는 측정될 수 있다.
적합한 표지로는, 제한하고자 하는 것이 아닌, 단지의 예시의 목적으로 하기를 포함한다:
- 알칼리성 포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 카본산 무수물, 아세틸콜린스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제 예로서, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소;
- 염료;
- 형광 표지 또는 형광체, 예로서, 플루오레세인 및 그의 유도체, 형광 색소, 로다민 화합물 및 유도체, GFP(GFP: "녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein)"을 나타냄), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오레스카민; 플루오로포어, 예로서, 란탄계열 크립테이트 및 킬레이트, 예로서, 유로퓸 등(Perkin Elmer 및 Cis Biointernational),
- 화학발광체 표지 또는 화학발광체, 예로서, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄;
- 생체발광 표지, 예로서, 루시페라아제 및 루시페린;
- 감작제;
- 조효소;
- 효소 기질;
- 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨68, 수소3(삼중수소), 인듐111, 인듐113m, 요오드123m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은1O7, 수은203, 인32, 레늄99m, 레늄1Ol, 레늄1O5, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄1O3, 루테늄1O5, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99m, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본원에서 언급된 기타 방사성표지를 포함하나, 이에 한정되지 않는 방사성표지;
- 입자, 예로서, 라텍스 또는 탄소 입자; 금속 졸; 결정체; 리포좀; 세포 등(이들은 추가로 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 표지화될 수 있다);
- 분자, 예로서, 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘;
- 독소 부분, 예로서, 예를 들면, 슈도모나스 외독소(PE(Pseudomonas exotoxin) 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예로서, 리신 A, 아브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 포키위드(pokeweed) 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 그의 세포독성 단편의 군으로부터 선택되는 독소 부분.
적합한 효소 및 조효소들이 문헌 (US4275149(Litman, et al.), 및 US4318980(Boguslaski, et al.,)(이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다))에 개시되어 있다. 적합한 형광체 및 화학발광체는 문헌 (US4275149(Litman, et al.)(전문이 본원에서 참고로 인용된다))에 기재되어 있다. 표지는 추가로 특이적 동종의 검출가능한 부분, 예를 들어, 표지화된 아비딘 또는 스트렙타비딘에의 결합에 의해 검출될 수 있는, 비오틴과 같은 화학 부분을 포함한다. 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 통상의 화학적 방법으로 본 발명의 항체에 부착될 수 있다.
면역접합체 또는 그의 기능적 단편은 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 그들은 효소 또는 형광 표지에 직접 결합되거나, 스페이서기 또는 결합기, 예를 들어, 글루타르알데히드와 같은 폴리알데히드, 에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산(DPTA)의 매개체를 통해서, 또는 치료용 접합체를 위해서는 상술한 바와 같은 커플링제의 존재하에 커플링될 수 있다. 플루오레세인 유형의 표지를 함유하는 접합체는 이소티오시아네이트와 반응시켜 제조할 수 있다.
치료용 방사성 동위원소를 항체에 직접 또는 상술된 EDTA, DTPA와 같은 킬레이팅제를 통하여 커플링시키는 방법으로서, 당업자에게 공지된 방법은 진단에 사용될 수 있는 방사성 원소에도 사용될 수 있다. 또한, 클로라민 T 방법[102]을 사용하여 Na125로 표지화하거나, 문헌 (US4424200(Crockford et al.)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다))의 기술을 사용하여 테크네튬99m으로 표지화하거나, (US4479930(Hnatowich)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다))에 기재되어 있는 바와 같이, DTPA를 통해 부착시키는 것이 가능하다.
표지가 외부적 수단, 예를 들어, 시각 검사, 전자기 방사, 열 및 화학 시약에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 표지는 또한 본 발명의 항체에 결합하거나 또는 지지체에 결합하는 또다른 결합 구성원에 결합될 수 있다.
표지는 직접 신호를 생성할 수 있으며, 따라서, 신호를 생성하는데 추가의 성분이 필요하지 않다. 많은 유기 분자, 예를 들어, 형광체는 자외광 및 가시광을 흡수할 수 있는데, 광 흡수는 이들 분자에 에너지를 전달하고, 분자를 여기된 에너지 상태로 상승시킨다. 이와 같이 흡수된 에너지가 제2의 파장에서 광을 방출하여 소산된다. 이 제2의 파장 방출이 에너지를 표지화된 수용체 분자에 전달하고, 그 결과 전달된 에너지가 수령체 분자로부터 빛의 방출을 통해, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(FRET: fluorescence resonance energy transfer)에 의해 소산된다. 신호를 직접 생성하는 다른 표지는 방사성 동위원소 및 염료이다.
별법으로, 표지는 신호를 생산하는 다른 성분을 필요로 할 수 있으며, 그와 같은 신호 발생 시스템은 측정가능한 신호를 생성하는데 요구되는 모든 성분을 포함할 것이며, 예를 들어, 기질, 조효소, 증진제, 추가의 효소, 효소 생성물과 반응하는 물질, 촉매, 활성화제, 보조인자, 억제제, 스캐빈져, 금속 이온 및 신호 생성 물질의 결합에 요구되는 특이적 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 신호 생성 시스템에 대한 상세한 논의는 문헌(US5185243(Ullman, et al.)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다))에 기재되어 있다. 본 발명은 본원에서 제공되는 바와 같은 결합 구성원이 IL-6에 결합하도록 하거나, 또는 결합할 수 있게 하는 방법을 제공한다. 언급한 바와 같이, 그러한 결합은 예로서, 결합 구성원, 또는 결합 구성원을 코딩하는 핵산의 투여 이후에 생체내에서 발생할 수 있거나, 시험관내에서, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학법, 면역침전법, 친화성 크로마토그래피, 및 생화학적 또는 세포 기초 분석법, 예로서, TF-1 세포 증식 분석법으로 발생할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 결합 구성원을, 예를 들어, 바이오센서에 사용하여 항원의 수준을 직접 측정하는 것을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 상기 결합 구성원을 IL-6에 노출시키는 단계, 및 (ii) 상기 결합 구성원의 IL-6에의 결합을 측정하는 단계로서, 여기서, 결합은 본 명세서에 기술된 임의의 방법 또는 검출가능한 표지를 사용하여 검출되는 것인 단계를 포함하는, IL-6에의 결합을 검출 및/또는 측정하는 방법을 포함한다. 이 방법 및 본원에 기술된 임의의 다른 결합 검출 방법은 그 방법을 수행하는 당업자에 의해서, 예를 들어, 검출가능한 표지를 시각적으로 관찰하는 것에 의해 직접 해석될 수 있다. 별법으로, 이 방법 및 본원에 기술된 임의의 다른 결합 검출 방법은 자동방사선사진, 사진, 컴퓨터 인쇄물, 유동 세포측정 리포트, 그래프, 차트, 결과를 함유하는 시험관, 용기 또는 웰, 또는 본 방법의 결과를 나타내는 임의의 다른 시각적 또는 물리적 표시물의 형태로 리포트를 작성할 수 있다.
IL-6에 결합된 결합 구성원의 양이 측정될 수 있다. 정량은 시험 샘플 중의 항원의 양과 관련될 수 있으며, 이는 진단에서 관심의 대상이 될 수 있다. IL-6 결합에 대한 스크리닝 및 그의 정량화는, 예를 들어, 환자를 본원에서 언급된 바와 같은 질환 또는 질병 또는 비정상적인 IL-발현 및/또는 활성을 포함하는 임의의 다른 질환 또는 질병에 대해 스크리닝하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 진단 방법은 (i) 피험체으로부터 조직 또는 체액 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 조직 또는 체액 샘플을 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원에 노출시키는 단계; 및 (iii) 대조군 샘플에 비하여 결합된 IL-6을 검출하는 단계로서, 여기서, 대조군 샘플에 비하여 결합된 IL-6 양의 증가는 비정상적 수준의 IL-6 발현 또는 활성을 지시하는 것일 수 있는 단계를 포함한다. 시험하고자 하는 조직 또는 체액 샘플로는 혈액, 혈청, 소변, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적 수준의 IL-6을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다. 비정상적 IL-6 수준 또는 활성의 시험 결과 양성인 피험체는 본원에 후술하는 바와 같은 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 방법을 토대로 그들의 선호도와 일반적 지식에 따라 결합 구성원의 항원에의 결합을 측정하는 적합한 방법을 선택할 수 있다.
샘플 중 결합 구성원의 반응성은 적절한 수단으로 측정될 수 있다. 방사성면역분석법(RIA: radioimmunoassay)은 가능한 한 방법이다. 방사성 표지화된 항원을 비표지화된 항원(시험 샘플)과 혼합하고, 결합 구성원에 결합하도록 둔다. 결합된 항원을 물리적으로 비결합된 항원과 분리시키고, 결합 구성원에 결합된 방사성 항원의 양을 측정한다. 시험 샘플 중에 항원이 많을수록, 더 적은 방사성 항원이 결합 구성원에 결합될 것이다. 경쟁 결합 분석법 또한 리포터 분자에 결합된 항원 또는 유사체를 사용하여 비방사성 항원에도 사용할 수 있다. 리포터 분자는 형광 색소, 인 또는 스펙트럼 분리된 흡수 또는 방출 특성을 갖는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광 색소는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드, 및 란탄계열 킬레이트 또는 크립테이트를 포함한다. 적합한 발색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터는 거대분자 콜로이드 입자 또는 미립자 물질, 예를 들어, 유색, 자성 또는 상자성 라텍스 비드, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호가 시각적으로 관찰되거나 전자적으로 검출되거나 또는 다른 식으로 기록될 수 있게 하는 생물학적 또는 화학적 활성제를 포함한다. 이들 분자는 예를 들면, 색상을 발현 또는 변화시키거나, 전기적 특성의 변화를 일으키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 그들은 에너지 상태간의 전자 전이가 특징적 스펙트럼 흡수 및 방출을 나타낼 수 있도록 분자적으로 여기될 수 있다. 그들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학적 엔티티를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템을 사용할 수 있다.
개개의 결합 구성원-리포터 접합체에 의해 생성되는 신호는 샘플 중 관련 결합 구성원의 결합에 대한 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이타를 유도하는데 사용할 수 있다(정상 및 시험).
본 발명의 임의의 측면 또는 실시태양에 따른 결합 구성원을 포함하는 키트 또한 본 발명의 측면으로서 제공된다. 그러한 키트에서, 결합 구성원은 표지화되어 샘플 중 그의 반응성이, 예컨대, 추가로 하기에 기술되는 바와 같이 측정될 수 있도록 한다. 추가로 결합 구성원은 고체 지지체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균처리되어 밀봉 바이알 또는 다른 용기에 보관된다. 키트는 진단 분석 또는 결합 구성원이 유용할 수 있는 다른 방법에 사용될 수 있다. 키트는 방법, 예를 들어, 본 발명에 따른 방법에 성분을 사용하는 지침서를 포함할 수 있다. 그와 같은 방법을 보조하거나 그 수행을 가능하게 하는 보조 물질을를 본 발명의 키트 내에 포함시킬 수 있다. 보조 물질은 제1의 결합 구성원에 결합하며 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 접합되어 있는, 제2의 상이한 결합 구성원을 포함한다. 항체-기초 키트는 면역침전법을 수행하는 비드를 또한 포함할 수 있다. 키트의 각 성분은 일반적으로 그 자신의 적합한 용기 내에 들어 있다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각 결합 구성원에 적합한 분리된 용기들을 포함한다. 추가로, 키트는 분석 및 분석을 수행하여 나온 데이타를 해석하고 분석하는 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 바와 같은 결합 구성원의 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 용도, 즉, 경쟁 분석에서 본 발명에 의해 제공되는 결합 구성원을 사용하여 샘플 중 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이는 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 필요하지 않은 경우일 수 있다. 리포터 분자를 결합 구성원에 결합시켜 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 결합시키는 것이 한 가지 방법이다. 리포터 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있고, 이 신호는 정량될 수 있다. 리포터 분자의 결합은 직접 또는 간접적으로, 펩티드 결합과 같은 공유결합, 또는 비-공유 결합일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 결합은 항체와 리포터 분자를 코딩하는 융합 유전자의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
다양한 측면 및 실시태양에서, 본 발명은 IL-6에 대한 결합에 대하여 본원에서 정의된 임의의 결합 구성원, 예로서, 모체 항체 또는 항체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 및 23 중 어느 것, 예로서, IgG1 포맷으로서의 것과 경쟁하는 결합 구성원으로 확장된다. 결합 구성원들 사이의 경쟁은 예를 들면 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인할 수 있도록 하기 위하여 다른 태깅되지 않은 결합 구성원(들)의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 구성원에 특이적인 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관내에서 쉽게 분석될 수 있다. 경쟁은 예를 들어, ELISA를 사용하여 측정될 수 있는데, 여기서 IL-6은 플레이트에 고정되고, 제1의 태깅된 결합 구성원 또는 표지화된 결합 구성원을 하나 이상의 다른 태깅되지 않은 결합 구성원 또는 비표지화된 결합 구성원과 함께 플레이트에 가한다. 태깅된 결합 구성원과 경쟁하는 태깅되지 않은 결합 구성원의 존재는 태깅된 결합 구성원에 의해 방출되는 신호의 감소로 관찰된다.
예를 들어, 본 발명은 (i) IL-6을 지지체에 고정시키는 단계, (ii) 상기 고정된 IL-6을 본 발명에 따른 적어도 하나의 태깅된 결합 구성원 또는 표지화된 결합 구성원 및 하나 이상의 태깅되지 않은 시험 결합 화합물 또는 비표지화된 시험 결합 화합물과 동시에 또는 단계적으로 접촉시키는 단계, 및 (iii) 태깅된 결합 구성원으로부터의 결합된 태그의 양의 감소를 관찰하여 새로운 IL-6 결합 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, IL-6 결합 화합물을 확인해내는 방법을 포함한다. 그러한 방법은 다중웰 또는 어레이 포맷을 사용하여 고수율 방식으로 수행될 수 있다. 그러한 분석법은 용액 중에서 수행될 수 있다. U.S. 5,814,468(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 상술한 바와 같이, 결합의 검출은 방법을 수행하는 사람이, 예를 들어, 검출가능한 표지 또는 그의 존재의 감소를 시각적으로 관찰함으로써 직접 해석될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 결합 구성원은 자동방사선사진, 사진, 컴퓨터 인쇄물, 유동 세포측정 리포트, 그래프, 차트, 결과를 함유하는 시험관, 용기 또는 웰, 또는 방법 결과의 다른 시각적 또는 물리적 표시물의 형태로 리포트를 산출할 수 있다.
경쟁 분석 또한 에피토프 지도화에 사용될 수 있다. 일례로, 에피토프 지도화는 임의로는 최적화된 중화 및/또는 조절 특징을 가질 수 있는 IL-6 결합 구성원에 의해 결합되는 에피토프를 확인하는데 사용될 수 있다. 그러한 에피토프는 선형이거나 입체 구조를 가질 수 있다. 입체 구조는 IL-6의 적어도 2개의 상이한 단편을 포함할 수 있으며, 상기 단편은 IL-6이 그의 3차 또는 4차 구조로 있을 때 서로에게 근접하게 위치하여 IL-6 결합 구성원과 같은 IL-6의 저해제에 의해 인식되는 입체 구조적 에피토프를 형성할 수 있다. 경쟁 시험을 할 때, 항원의 펩티드 단편이 사용될 수 있으며, 특히 관심의 대상이 되는 에피토프를 포함하거나 실질적으로 그로 구성된 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열과 함께 어느 쪽 말단에서든 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 구성원은 그들의 항원에 대한 결합이 주어진 서열을 갖거나 포함하는 펩티드에 의해 저해되도록 하도록 하는 것이다.
본 발명은 본 발명의 결합 구성원을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예로서, scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다.
본 발명 또한 상기한 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 제공되는 바와 같은 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예로서, scFv 또는 IgG1을 코딩하는 핵산 자체가 본 발명의 하나의 측면을 형성하며, 그에 대한 코딩 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는 코딩된 생성물의 제조 방법 또한 그 자체로 본 발명의 한 측면을 이룬다. 발현은 적절한 조건하에 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 통상적으로 수행될 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 구성원은 적절한 기법을 사용하여 단리 및/또는 정제될 수 있으며, 그 다음 적절하게 사용된다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 관해 언급하는 것은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, T가 U로 치환된 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
본 발명의 추가의 다른 측면은 코딩 핵산 서열로부터의 발현 단계를 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법을 제공한다. 그러한 방법은 숙주 세포를 상기 항체 VH 가변 도메인을 생산하는 조건하에 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원을 생산하는 유사한 방법은 본 발명의 추가의 측면으로 제공된다.
생산 방법은 생성물을 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 생산 방법은 생성물을 적어도 하나의 추가의 성분, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 부형제 내로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.
폴리펩티드를 각종의 상이한 숙주 세포에서 클로닝 및 발현하는 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상성 진균, 효모 및 배큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업자에 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 문헌 (Pluckthun [103])을 리뷰한다. 통상의 세균 숙주는 E. 콜라이이다.
배양물에서의 진핵 세포에서의 발현은 또한 결합 구성원의 제조 방법에 대한 한 가지 선택 사항으로서 당업자에게 이용될 수 있다[104, 105, 106]. 이종 폴리펩티드의 발현에 당업계에서 이용될 수 있는 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, 헬라세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 기타 다수의 세포를 포함한다.
프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택 또는 작제할 수 있다. 벡터는 적절하게는 플라스미드, 예를 들어, 파지미드, 또는 바이러스, 예를 들어, 파지일 수 있다[107]. 핵산 조작을 위한 많은 공지 기법과 프로토콜, 예를 들어, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이유발, 서열화, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 단백질 분석이 문헌 (Ausubel et al. [108])에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 측면은 상술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 그러한 숙주 세포는 시험관내이거나 배양물 중에 있을 수 있다. 그러한 숙주 세포는 생체내 있을 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 발명의 결합 구성원을 "내부체(intrabody)" 또는 세포내 항체로서 세포 내에서 발현하게 한다. 내부체는 유전자 치료에 사용될 수 있다.
추가의 다른 측면은 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기법을 사용할 수 있다. 진핵 세포에 있어서 적절한 기법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀 -매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스를 사용한 형질도입, 예를 들어, 백시니아, 또는 곤충 세포에 대해서는 배큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함한다. 핵산을 숙주 세포, 특히 진핵 세포 내로 도입하는 것은 바이러스 또는 플라스미드 기초 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지되거나 숙주 세포 또는 인공 염색체 내로 혼입될 수 있다. 혼입은 무작위로 이루어지거나, 단일의 또는 다중의 유전자좌에서 하나 이상의 카피의 표적화된 통합에 의해 이루어질 수 있다. 세균 세포에 있어서, 적합한 기법은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입에 이어서 예를 들면, 숙주 세포를 유전자 발현 조건하에 배양하여 핵산으로부터 발현을 일으키거나, 발현될 수 있도록 할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에 의해 알려진 방법으로 달성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기법에 따라서 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시켜 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 결합 구성원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템 중에서 상기 작제물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원 다른 경우에서도 논의된 바와 같이, IL-6이 각종 질병에 관여하는 것은 입증되어 있다. 따라서, 본 발명의 결합 구성원은 IL-6과 관련된 질병의 진단 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. 그러한 질병으로는 예를 들면, 염증성 및/또는 자가면역 질병, 예로서, 류마티스 관절염, 골관절염, 악액질, 만성 폐쇄성 폐질환, 소아 특발성 관절염, 천식, 전신 홍반 루푸스, 염증성 장질환, 크론병 또는 죽상동맥경화증일 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 또한 예로서, 종양 및/또는 암과 같은 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 환자, 동물, 기관, 조직 또는 세포에서, 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 IL-6과 관련된 질환을 진단 또는 치료하는 방법에 사용될 수 있다:
(호흡기) 만성 폐쇄성 폐질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease)을 비롯한 폐쇄성 기도 질환; 천식, 예로서, 기관지, 알레르기성, 내인성, 외인성 및 먼지 유발 천식, 특히, 만성 또는 난치성 천식(예로서, 후기 천식 반응 및 기도 과민반응); 기관지염; 건락성 비염, 비후 비염, 화농성 비염, 건성 비염 및 약물성 비염을 비롯한, 급성-, 알레르기성-, 위축성 비염 및 만성 비염; 크룹, 섬유소성 및 거짓막 비염 및 결핵성 비염을 비롯한 막 비염; 신경성 비염(건초) 및 혈관운동 비염을 비롯한 계절성 비염, 동염, 특발성 폐섬유화증(IPF: idiopathic pulmonary fibrosis); 사코이드증, 농부폐 및 관련 질환, 성인성 호흡곤란증후군, 과민성 폐렴, 폐섬유증 및 특발성 간질성 폐렴;
(뼈 및 관절) 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 전신적으로 발병된 소아 관절염, 혈청검사 음성인 척추관절병증(강직 척추염, 건선 관절염 및 라이터병), 베체트병, 쇼그렌 증후군 및 전신 경화증, 통풍, 골다공증 및 골관절염;
(피부) 건선, 아토피 피부염, 접촉성 피부염 및 기타 습진 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 공피증, 천포창, 수포성 유천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 두부종, 혈관염, 홍반, 피부 호산구다증, 포도막염, 원형 탈모증, 알레르기성 결막염 및 봄철 결막염;
(위장관) 위 궤양, 복강 질환, 직장염, 호산성 위창자염, 비만세포증, 염증성 장질환, 크론병, 궤양 대장염, 항인지질 증후군), 소화관과는 멀리 떨어진 부위에 영향을 미치는 식품 알레르기, 예로서, 편두통, 비염 및 습진;
(다른 조직 및 전신 질환) 악액질, 다발경화증, 죽상동맥경화증, 후천성 면역 결핍증(AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome), 혈관간 세포증식 사구체신염, 신증후군, 신장염, 사구체성 신염, 급성 신부전, 혈액투석, 요독증, 국소 또는 원반모양 홍반 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 캐슬만병, 하시모토 갑상선염, 중증근육무력증, I형 당뇨병, B형 인슐린 저항 당뇨병, 겸상적혈구성 빈혈, 홍채섬모체염/포도막염/시각신경염, 신염증후군, 호산구성 근막염, 고 IgE 증후군, 전신 혈관염/베게너 육아종, 고환염/정관 복원 수술, 나병종나병, 알코올-유도성 간염, 세자리 증후군 및 특발성 혈소판 감소성 자반증; 수술 후 유착증, 신장증, 전신성 염증 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그램 양성 패혈증, 그램 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균 패혈증, 호중구감소성 열, 급성 췌장염, 요로성 패혈증, 그레이브스병, 레이노병, 항체-매개 세포독성, III형 과민 반응, POEMS 증후군(다발신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 혼합 결합 조직병, 특발성 에디슨 질환, 당뇨, 만성 활동 간염, 원발성 담즙성 간경변, 백반증, MI(심장절개) 후 증후군, IV형 과민, 세포내 기관에 기인한 육아종, 윌슨병, 헤마크로마토시스, 알파-I-항트립신 결핍, 당뇨 망막병증, 하시모토 갑상선염, 시상하부 하수체 부신계 평가, 갑상선염, 뇌척수염, 신생아 만성 폐 질환, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 탈모증, 방사선 요법(예로서, 무력증, 빈혈, 악액질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 만성 살리실레이트 중독, 수면 무호흡, 비만, 심장 부전, 및 수막알균혈증;
(동종이식 거부) 예를 들어, 신장, 심장, 간, 폐, 췌장, 골수, 뼈, 소장, 피부, 연골 및 각막 이식 후의 급성 및 만성 동종이식 거부; 또는 만성 이식편 대 숙주 질환;
(악성 질환) 백혈병, 급성 림프모구 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukaemia), 급성 백혈병, T-세포, B 세포, 또는 FAB ALL, 만성 골수성 백혈병 (CML: chronic myeloid leukemia), 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukaemia), 만성 림프성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukaemia), 모발상 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군(MDS: myelodyplastic syndrome), 임의의 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 임의의 악성 림프종, 버킷 림프종, 다발 골수종, 카포시 육종, 신세포 암종, 직장결장 암종, 전립선 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 신생물딸림 증후군/악성종양으로 인한 고칼슘혈증, 고형 종양, 샘암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 흡수, 암 관련 뼈 통증; 암 전이 억제; 암 악액질 호전;
낭성 섬유증, 뇌졸중, 심장, 뇌, 말초 사지 및 기타 기관에서의 재관류 손상;
화상, 외상/출혈, 이온화 방사선에 노출, 만성 피부 궤양;
생식계 질환(예로서, 배란 질병, 월경 및 착상, 조산, 전자간증, 자궁내막증);
(감염) 급성 또는 만성 세균 감염, 세균, 바이러스, 및 진균 감염을 비롯한 급성 및 만성 기생충 또는 감염 과정, HIV 감염/HIV 신경장애증, 수막염, 간염(A, B 또는 C, 또는 기타 바이러스성 간연 등), 패혈 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, E. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전 저혈소판 혈증 자색반병, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈만편모충증, 나병, 독성 쇼크 증후군, 스트렙토코커스 근육염, 가스 괴저, 미코박테리엄 튜버큐로시스, 미코박테리엄 아비움 인트라셀루라, 뉴모시스티스 카리니이 폐렴, 골반염 질환, 고환염/부고환염, 레기오넬라, 라임병, 인플루엔자 a, 엡스타인바 바이러스, 생명-관련 식혈세포성 증후군, 바이러스성 뇌염/무균성 뇌막염 등.
따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원을 단독으로 또는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기술되어 있는 또다른 적절한 약제와 함께 병용 치료 요법으로 투여하는 단계를 포함하는, IL-6과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 질병에서 IL-6이 관여한다는 것에 관한 증거는 본원 다른 경우에서도 요약되어 있다. 또한, 본원에서 제시된 데이타는 추가로 본 발명의 결합 구성원이 질병의 예방적 치료 및 그의 중증도 완화를 비롯한 상기 질병 치료에 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원을 단독으로 또는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기술되어 있는 또다른 적절한 의약과 함께 병용 치료 요법으로 투여하여 상기 질병 중 어느 것의 적어도 하나의 증상의 중증도를 완화시킬 수 있도록 하는 단계를 포함하는, 본원에서 언급된 질병들 중 어느 것을 치료하거나, 그의 적어도 하나의 증상의 중증도를 완화시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 결합 구성원은 IL-6 및/또는 IL-6Ra 발현 및/또는 활성, 특히, 비정상적인 발현/활성이 관여하는 질환 또는 질병의 치료에서 치료제로서 유용하다. 치료 방법은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 본 발명의 결합 구성원을 투여하는데, 여기서, IL-6 및/또는 IL-6Ra의 비정상적인 발현 및/또는 활성은 감소하는 것인 단계를 포함할 수 있다. 치료 방법은 (i) 비정상적인 IL-6:IL-6Ra 수준 또는 활성을 나타내는 환자를, 예를 들어, 상기한 바와 같은 진단 방법을 사용하여 확인하는 단계, 및 (ii) 유효량의 본 발명의 결합 구성원을 상기 환자에 투여하여 IL-6Ra 및/또는 IL-6의 비정상적 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 유효량이라 함은 치료하고자 하는 특정 질환 또는 질병의 적어도 하나의 증상의 중증도를 감소 또는 약화시키기 위해(반드시 그 질환 또는 질병을 완치하는 것은 아님) IL-6 및/또는 IL-6Ra의 비정상적 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양이다.
본 발명은 유효량의, 본 발명의 하나 이상의 결합 구성원과 접촉시키거나 그를 투여하여 상기의, 적어도 하나의 IL-6의 효과를 길항시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 IL-6의 효과를 길항시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 길항될 수 있는 IL-6의 효과로는 gp130에 대한 IL-6의 결합, 이러한 결합의 결과로서 발생되는 하류의 효과를 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 제공되는 것과 같은 결합 구성원, 그러한 결합 구성원을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법, 및 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제과 함께 결합 구성원을 제제화시키는 것을 포함하는 의약 또는 약제학적 조성물 제조 방법에서 투여용 의약 제조에서의 상기 결합 구성원의 용도를 제공한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 2차적 반응을 일으키지 않으며, 예를 들어, 활성 화합물(들) 투여의 촉진, 생체내 활성 화합물의 존속기간 및 효능의 증가, 용액 중의 활성 화합물의 용해도 증가, 그 보관의 개선 등을 허용하는, 약제학적 조성물 내로 유입되는 화합물 또는 그들의 조합일 수 있다. 이들 약제학적으로 허용가능한 비히클은 잘 알려져 있으며, 선택된 활성 화합물(들)의 특성 및 투여 방식에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 것이다.
본 발명의 결합 구성원은 보통 결합 구성원 외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물은 활성 성분 이외에 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업자에 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비-독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특질은 경구, 흡입, 기관내, 국소, 소포내, 또는 주사에 의한 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
경구투여용 약제학적 조성물, 예를 들어, 단일 도메인 항체 분자(예로서, "나노바디™") 등 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 그러한 경구 투여 제형은 정제, 캡슐제, 분제, 액제 또는 반고형 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 액상 약제학적 조성물은 일반적으로, 예로서, 물, 페트롤륨, 동물성 오일 또는 식물유, 광유 또는 합성 오일과 같은 액상 담체를 포함한다. 생리식염수, 덱스트로스 또는 기타 사카라이드 용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜도 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 환부에서의 주사를 위해서 활성 성분은 발열 물질이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 첨가 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있을 것이다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있으며, 이들은 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 예로서, 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 보존제(옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3'-펜타놀; m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드; 예로서, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 예로서, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 예로서, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노오즈 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; 예로서, EDTA와 같은 킬레이트제; 예로서, 수크로스, 만닛톨, 트레할로즈 또는 솔비톨과 같은 당; 예로서, 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 예로서, 트윈™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 결합 구성원은 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라서 액상, 반고형 또는 고형 형태로 제형화될 수 있다. 제제는 부형제 또는 부형제의 조합, 예를 들어, 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 제제는 넓은 범위의 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고형 제제는 동결 건조, 분무 건조에 의해 제조되거나, 예를 들어, 초임계 유체 기술에 의해 건조시켜 제조될 수 있다. 결합 구성원 제제는 의도된 전달 경로에 따라 달라질 것이다: 예를 들어, 폐 전달용 제제는 흡입시 폐 깊은 곳까지 관통할 수 있는 물리적 특성의 입자로 구성될 수 있다; 국소용 제제는 약물이 작용 부위에 잔류하는 시간을 늘리는 점도 조절제를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 결합 구성원은 결합 구성원의 빠른 방출을 막는 담체와 함께, 예를 들어, 서방형 제제로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 임플란트, 경피용 패취, 및 마이크로캡슐화 전달계를 포함한다. 생분해성, 생물친화성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 그러한 제제를 제조하는 많은 방법들이 당업자에게 알려져 있다[109].
치료는 경구 투여로(예를 들어, 단일 도메인 항체 분자(예로서, "나노바디™") 형태로), 주사에 의해(예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 복강내, 동맥내 또는 근육내), 흡입에 의해, 기관내, 소포내 경로에 의해(방광 내로 점적주입), 또는 국소적으로(예를 들어, 안내, 비내, 직장내, 환부내, 피부상에) 수행될 수 있다. 치료는 특히 결합 구성원의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특징에 의해, 질병을 특별히 고려하여, 효능을 최적화할 필요에 따라 또는 부작용을 최소화할 필요에 따라 결정될 것이다. 하나의 특정 투여 경로는 정맥내 투여이다. 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 또다른 경로는 피하 투여이다. 치료는 병원 내에서 하는 것에 국한되는 것이 아니다. 따라서, 바늘이 없는 기구를 사용한 피하 주사 또한 유리하다.
조성물은 치료될 증상에 따라서, 단독으로 또는 다른 치료와 병행하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 추가의 약제 성분과 함께 병용 요법의 부분으로 사용될 수 있다. 병용 치료는 상당한 상승 효과를 얻기 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 본 발명의 결합 구성원을 하나 이상의 다른 약물과 병용할 수 있다. 본 발명의 결합 구성원은 상기한 바와 같은 하나 이상의 병태를 치료하기 위해 또다른 치료제(들)와 함께 동시에, 순차적으로 또는 복합 제제로 투여될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 세포독성제의 치료학적 효능을 증가시킬 수 있는 화학감작제로서 사용될 수 있으며, 따라서, 하나 이상의 세포독성제와 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 결합 구성원은 또한 방사선의 효능을 개선시킬 수 있는 방사선 감작제로서도 사용될 수 있으며, 따라서, 방사선과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 하기 제제들 중 하나 이상과 병행하여 또는 이에 더하여 제공될 수 있다:
- 사이토카인 또는 사이토카인 기능의 효현제 또는 길항제(예를 들어, SOCS 시스템의 조절제와 같은, 사이토카인 신호 경로에 작용하는 물질), 예컨대, 알파 -, 베타 -및/또는 감마 -인터페론; 인슐린-유사 성장 인자 I형(IGF-I: insulin-like growth factor type I), 그의 수용체 및 관련 결합 단백질; 인터루킨(IL), 예를 들어, 하나 이상의 IL-1 내지 33, 및/또는 아나킨라와 같은 인터루킨 길항제 또는 저해제; 인터루킨 계열 구성원 수용체의 저해제 또는 그러한 수용체의 특정 하위유니트의 저해제; 종양 괴사 인자 알파(TNF-α: tumor necrosis factor alpha) 저해제, 예컨대, 항-TNF 모노클로날 항체(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 및/또는 CDP-870), 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예를 들어, 면역글로불린 분자(예를 들어, 에타너셉트) 및/또는 펜톡시필린과 같은 저분자량 물질;
- B 세포 조절제, 예를 들어, B-림프구 표적 모노클로날 항체(예컨대, CD20( 리툭시맙) 또는 MRA-aIL16R) 또는 T-림프구 표적 모노클로날 항체(예를 들어, CTLA4-Ig, HuMax Il-15 또는 아바타셉트);
- 파골세포 활성을 저해하는 조절제, 예를 들어, RANKL에 대한 항체;
- 케모카인 또는 케모카인 수용체 기능의 조절제, 예를 들어, CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11(C-C 계열) 길항제; CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CXCR6(C-X-C 계열) 길항제 및 C-X3-CR1(C-X3-C 계열) 길항제;
-매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 저해제, 즉, 스트로멜리신, 콜라게나제, 및 젤라티나제, 어그리카나제 저해제 중 하나 이상; 특히, 콜라게나제-1(MMP-1), 콜라게나제-2(MMP-8), 콜라게나제-3(MMP-13), 스트로멜리신-1(MMP-3), 스트로멜리신 -2(MMP-10), 및/또는 스트로멜리신-3(MMP-11) 및/또는 MMP-9 및/또는 MMP-12의 저해제, 예를 들어, 독시사이클린;
-류코트리엔 생합성 저해제, 5-리폭시게나제(5-LO) 저해제 또는 5-리폭시게나제 활성화 단백질(FLAP: 5-lipoxygenase activating protein) 길항제; 예를 들어, 질루톤; ABT-761; 펜루톤; 테폭살린; 애보트-79175; 애보트-85761; N-(5-치환 )-티오펜-2-알킬설폰아미드; 2,6-디-t-부틸페놀하이드라존; 메톡시테트라하이드로피란, 예컨대, 제네카 ZD-2138; 화합물 SB-210661; 피리디닐-치환 2-시아노나프탈렌 화합물, 예컨대, L-739,010; 2-시아노퀴놀린 화합물, 예를 들어, L-746,530; 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물, 예컨대, MK-591, MK-886, 및/또는 BAY x 1005;
- 예를 들어, L-651,392와 같은 페노티아진-3-1s; CGS-25019c와 같은 아미디노 화합물; 온타졸라스트와 같은 벤족살아민; BIIL 284/260과 같은 벤젠카복스이미드아미드; 및 자피르루카스트, 아브루카스트, 몬테루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트(MK-679), RG-12525, Ro245913, 이라루카스트(CGP 45715A), 및 BAY x 7195로 구성된 군으로부터 선택되는 류코트리엔(LT: leukotriene) B4, LTC4, LTD4, 및 LTE4의 수용체 길항제;
- 포스포디에스터라제(PDE: phosphodiesterase) 저해제, 예로서, 테오필린 및/또는 아미노필린과 같은 메틸잔타닌; 및/또는 선택적 PDE 이소엔자임 저해제, 예를 들어, PDE4 저해제 및/또는 이소폼 PDE4D 저해제 및/또는 PDE5 저해제;
- 히스타민 1형 수용체 길항제, 예를 들어, 세티리진, 로라타딘, 데스로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 테르페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로로페니라민, 프로메타진, 사이클리진 및/또는 미졸라스틴(일반적으로 경구, 국소 또는 비경구 투여됨);
- 프로톤 펌프 저해제(예를 들어, 오메프라졸) 또는 위장보호 히스타민 2형 수용체 길항제;
- 히스타민 4형 수용체 길항제;
- 알파-1/알파-2 아드레날린 수용체 효현제 혈관수축 교감신경 흥분제, 예를 들어, 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로파놀라민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 테트라하이드로졸린 하이드로클로라이드, 크실로메타졸린 하이드로클로라이드, 트라마졸린 하이드로클로라이드 및 에틸노르에피네프린 하이드로클로라이드;
- 항콜린제, 예를 들어, 무스카린 수용체(M1, M2, 및 M3) 길항제, 예컨대, 아트로핀, 하이오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 티오트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드, 피렌제핀, 및 텔렌제핀;
- 베타-아드레날린 수용체 효현제(베타 수용체 아형 1-4 포함), 예를 들어, 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 터부탈린, 오르씨프레날린, 비톨테롤 메실레이트, 및/또는 피르부테롤, 예를 들어, 그의 키랄 에난티오머;
-크로몬, 예를 들어, 소듐 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 소듐;
-글루코코르티코이드, 예를 들어, 플루니졸라이드, 트리암씨놀론 아세토나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소나이드, 플루티카존 프로피오네이트, 시클레조나이드 및/또는 모메타존 프로에이트;
- PPAR과 같은 핵 호르몬 수용체를 조절하는 물질;
- 면역글로불린(Ig) 또는 Ig 제제, 또는 항-IgE(예를 들어, 오말리주맙)과 같은 Ig 기능을 조절하는 길항제 또는 항체;
- 다른 전신 또는 국소 투여용 소염제, 예를 들어, 탈리도마이드 또는 그의 유도체, 레티노이드, 디트라놀, 및/또는 칼시포트리올;
- 아미노살리실레이트와, 설파살라진, 메살라진, 발살라지드 및 올살라진과 같은 설파피리딘의 조합, 및 티오퓨린과 같은 면역조절제, 부데소나이드와 같은 코르티코스테로이드;
- 항균제, 예를 들어, 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마크롤리드, 베타-락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 및/또는 흡입 아미노글리코시드; 및/또는 항바이러스제, 예를 들어, 아사이클로비어, 팜씨클로비어, 발라사이클로비어, 간사이클로비어, 시도포비어; 아만타딘, 리만타딘; 리바비린; 자나마비어 및/또는 오셀타마비어; 프로테아제 저해제, 예를 들어, 인디나비어, 넬피나비어, 리토나비어, 및/또는 사퀴나비어; 뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 예를 들어, 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘; 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 예를 들어, 네비라핀, 에파비렌츠;
- 심혈관계 치료제, 예를 들어, 칼슘 채널 차단제, 베타-아드레날린 수용체 차단제, 안지오텐신 전환 효소(ACE: angiotensin-converting enzyme) 저해제, 안지오텐신-2 수용체 길항제; 예로서, 스타틴, 피브레이트와 같은 지질 저하제; 펜톡시필린과 같은 혈액 세포 형태 조절제; 혈소판 응집 저해제와 같은 혈전용해 및 항응고제;
- CNS 치료제, 예를 들어, 항우울제(예를 들어, 세르트랄린), 항-파킨슨 약물(예를 들어, 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔, 또는 셀레진, 라사질린과 같은 MAOB 저해제, 타스마르와 같은 comP 저해제, A-2 저해제, 도파민 재흡수 저해제, NMDA 길항제, 니코틴 효현제, 도파민 효현제 및/또는 뉴런 산화질소 합성효소 저해제), 및 항-알츠하이머 약물, 예를 들어, 도네페질, 리바스티그민, 타크린, COX-2 저해제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트;
- 급성 및 만성 통증 치료제, 예를 들어, 중추 또는 말초 신경 작용 진통제, 예를 들어, 아편 유사체 또는 유도체, 카바마제핀, 펜토인, 소듐 발프로에이트, 아미트리프틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰 또는 비-스테로이드 소염제;
- 비경구 또는 국소 투여(흡입 포함) 국부 마취제, 예를 들어, 리그노케인 또는 그의 유사체;
- 항-골다공증제, 예를 들어, 랄록시펜과 같은 호르몬제, 또는 알렌드로네이트와 같은 비포스포네이트;
- (i) 트립타제 저해제; (ii) 혈소판 활성화 인자(PAF: platelet activating factor) 길항제; (iii) 인터루킨 전환 효소(ICE: interleukin converting enzyme) 저해제; (iv) IMPDH 저해제; (v) 부착 분자 저해제, 예를 들어, VLA-4 길항제; (vi) 카텝신; (vii) 키나제 저해제, 예를 들어, 티로신 키나제 저해제(예를 들어, Btk, Itk, Jak3 MAP 저해제, 또한 제피티닙, 이마티닙 메실레이트), 세린/트레오닌 키나제 저해제(예를 들어, p38, JNK와 같은 MAP 키나제, 프로테인 키나제 A, B 및 C 및 IKK 저해제), 또는 세포주기 조절에 관여하는 키나제(예를 들어, 사이클린 의존적 키나제)의 저해제; (viii) 글루코스-6 포스페이트 데하이드로게나제 저해제; (ix) 키닌-B.서브1 및/또는 B.서브2-수용체 길항제; (x) 통풍 치료제, 예를 들어, 콜히친; (xi) 크잔틴 옥시다제 저해제, 예를 들어, 알로퓨리놀; (xii) 요산 배출 촉진제, 예를 들어, 프로벤시드, 설핀피라존 및/또는 벤즈브로마론; (xiii) 성장 호르몬 분비촉진제; (xiv) 전환성장인자(TGFβ: transforming growth factorβ); (xv) 혈소판-유도 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor); (xvi) 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어, 기초 섬유모세포 성장 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor); (xvii) 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor); (xviii) 캡사이신 크림; (xix) 타치키닌 NK.서브1. 및/또는 NK.서브3. 수용체 길항제, 예를 들어, NKP-608C, SB-233412(탈네탄트), 및/또는 D-4418; (xx) 엘라스타제 저해제, 예를 들어, UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-알파 전환 효소 저해제(TACE: TNF-alpha converting enzyme inhibitor); (xxii) 유도된 산화질소 합성효소(iNOS: induced nitric oxide synthase) 저해제; (xxiii) TH2 세포 상에 발현된 화학유인물 수용체-유사 분자(예를 들어, CRTH2 길항제); (xxiv) P38 저해제; (xxv) Toll-유사 수용체(TLR: Toll-like receptor) 기능을 조절하는 물질; (xxvi) P2X7와 같은 퓨린 수용체 활성을 조절하는 물질; 및 (xxvii) NFkB, API, 및/또는 STATS와 같은 전사인자 활성화 저해제.
저해제는 특이적이거나 혼합 저해제, 예를 들어, 상기한 분자(예를 들어, 수용체) 또는 분자 부류 둘 이상을 표적으로 하는 저해제일 수 있다.
결합 구성원은 또한 공동투여 또는 면역접합체 형태로 화학요법제 또는 다른 티로신 키나제 저해제와 함께 사용될 수 있다. 상기 항체의 단편은 또한 재조합 기전 또는 생화학적 커플링 이후 상기 기술한 항체의 특이성을 IL-6이 관련된 다른 활성에 관여하는 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성과 결합시켜 수득되는 이중특이적 항체에 사용될 수 있다.
염증성 질환의 치료를 위해, 본 발명의 결합 구성원은 하나 이상의 재제, 예로서, 비스테로이드 소염제(이후, NSAID라 함), 예를 들어, 국소적으로 또는 전신적으로 투여되는 비선택적 사이클로-옥시게나제(COX-1/COX-2) 저해제, 예로서, 피록시캄, 디클로페낙, 프로피온산, 예로서, 나프록센, 플루비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜, 페나메이트, 예로서, 메페남산, 인도메타신, 설린닥, 아자프로파존, 피라졸론, 예로서, 페닐부타존, 살리실레이트, 예로서, 아스피린); 선택적 COX-2 저해제(예를 들어, 멜록시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루마로콕시브, 파레콕시브 및 에토리콕시브); 사이클로-옥시게나제 저해 산화질소 공여제(CINOD: cyclo-oxygenase inhibiting nitric oxide donor); 글루코코르티코스테로이드(국소, 경구, 근육내, 정맥내 또는 관절내 투여); 메토트렉세이트, 레플루노마이드; 하이드록사이클로로퀸, d-페니실라민, 오라노핀 또는 다른 비경구 또는 경구 금 제제; 진통제; 다이아세레인; 하이알루론산 유도체와 같은 관절내 치료제; 및 글루코사민과 같은 영양 보충제와 조합될 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 또한 암의 치료를 위한 현존하는 치료제와 조합하여 사용할 수 있다. 조합하여 사용될 수 있는 적합한 제제로는
(i) 암치료에 사용되는 항증식/항종양 약물 및 그의 조합, 예로서, 글리벡(이마티닙 메실레이트), 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판 및 니트로소우레아); 항대사제(예를 들어, 항엽산대사제, 예로서, 5-플루오로우라실 및 테가푸르와 같은 플루오로피리미딘, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드, 하이드록시우레아, 젬시타빈 및 파클리탁셀); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라사이클린으로서 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항분열제(예를 들어, 빈카알칼로이드로서 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈, 및 탁소이드로서 탁솔 및 탁소테어); 및 토포이소머라제 저해제(예를 들어, 에피포도필로톡신으로서 에토포사이드 및 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸 및 캄토테씬);
(ii) 세포증식억제제, 예를 들어, 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜 및 요독시펜), 에스트로겐 수용체 하향조절제(예를 들어, 플베스트란트), 항안드로겐(예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 효현제(예를 들어, 고세렐린, 류프로렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 저해제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 피나스테라이드와 같은 5α-리덕타제 저해제;
(iii) 암세포 침윤을 저해하는 약제(예를 들어, 메탈로프로테이나제 저해제로서 마리마스타트 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체 기능의 저해제);
(iv) 성장 인자 기능의 저해제, 예를 들어, 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 항-erbb2 항체 트라스투주맙 및 항-erbb1 항체 세툭시맙 [C225]), 파르네실 트랜스퍼라제 저해제, 티로신 키나제 저해제 및 세린/트레오닌 키나제 저해제, 상피 성장 인자 계열 저해제(예를 들어, EGFR 계열 티로신 키나제 저해제로서 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(제피티닙, AZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(에를로티닙, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(CI 1033)), 예를 들어, 혈소판-유도 성장 인자 계열 저해제 및 헤파토사이트 성장 인자 계열 저해제;
(v) 혈관신생 저해제, 예를 들어, 혈관 내피세포 성장 인자 저해제(예를 들어, 항-혈관 내피세포 성장 인자 항체인 베바시주맙, 국제 특허 출원 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354(그들 각각의 전문이 본원에서 인용됨)에 개시된 바와 같은 화합물) 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들어, 리노마이드, 인테그린 αvβ3 기능의 저해제 및 안지오스타틴);
(vi) 혈관손상제, 예를 들어, 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213(그들 각각의 전문이 본원에서 인용됨)에 개시된 화합물;
(vii) 안티센스 요법제, 예를 들어, 상기한 바와 같은 표적에 유도된 것들, 예컨대, ISIS 2503, 항-ras 안티센스;
(viii) 유전자 요법 접근법, 예를 들어, 비정상 p53 또는 비정상 BRCA1 또는 BRCA2와 같은 비정상 유전자를 교체하는 요법, GDEPT(유전자 유도 효소 프로드럭 요법: gene directed enzyme pro-drug therapy)로서 예컨대, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 세균 니트로리덕타제 효소를 사용하는 요법, 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자의 내성을 증가시키는 요법으로 예컨대, 다중-약물 내성 유전자 요법; 및
(ix) 면역치료 접근법, 예를 들어, 환자 종양 세포의 면역발생을 증가시키는 생체외 및 생체내 요법, 예로서, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극인자와 같은 사이토카인으로 형질감염, T 세포 면역결여를 감소시키는 요법, 사이토카인 형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 사용하는 요법, 사이토카인 형질감염된 종양 세포를 사용하는 요법 및 항-이디오타입 항체를 사용하는 요법.
본 발명의 결합 구성원 및 상기 추가의 의약 성분 중 하나 이상은 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 분리하여 또는 배합되어 개체에게 투여될 수 있으며, 따라서 결합 구성원 및 추가의 성분은 복합 제제 또는 개별 제제 중에 포함될 수 있다. 개별 제제는 분리된, 순차적 또는 동시 투여를 촉진하는데 사용할 수 있으며, 성분을 상이한 경로, 예를 들어, 경구 및 비경구 투여하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따라서, 제공된 조성물은 포유류에 투여될 수 있다. 투여는 보통 "치료학적 유효량"으로 할 수 있으며, 이는 환자에게 유익하기에 충분한 양이다. 그와 같은 이익은 적어도 하나의 증상을 적어도 완화시킬 수 있다. 실제 투여되는 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 증상의 특성 및 중증도, 치료되는 포유동물, 개개 환자의 임상 증상, 질병의 원인, 조성물 전달 부위, 결합 구성원의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄 및 임상의에게 알려진 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 처방, 예로서, 투여량 결정 등은 일반의 및 다른 내과의의 결정 사항이며, 치료될 질병의 증상의 중증도 및/또는 진행 상황에 따라 달라진다. 항체의 적절한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다[110, 111]. 투여되는 의약의 유형에 적절한 것으로 본 명세서 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에 기재된 구체적 투여량이 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 구성원의 치료학적 유효량 또는 적합한 투여량은 동물 모델에서 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교하여 결정될 수 있다. 마우스 또는 다른 시험 동물의 유효 투여량을 인간에 대한 것으로 외삽하는 방법이 알려져 있다. 정확한 투여량은 다수의 인자, 예를 들어, 항체가 진단용인지, 예방용인지 또는 치료용인지 여부, 치료될 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성(예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 검출가능한 표지 또는 항체에 부착된 다른 분자의 성질에 따라 달라질 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 투여의 경우, 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 투여의 경우 1 ㎍ 내지 1 mg이다. 초기의 보다 높은 투여량, 및 이어지는 1회 이상의 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 전형적으로는, 항체는 전체 항체, 예를 들어, IgG1 이소타입일 수 있다. 상기한 것은 성인 환자의 1회 치료를 위한 투여량으로, 영유아에 대하여는 비례하여 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대하여 조정될 수 있다. 치료는 매일, 주 2회, 매주 또는 1개월 간격으로 반복될 수 있으며, 의사의 재량에 따른다. 치료는 피하 투여에 대해서는 매 2 내지 4주 마다, 정맥내 투여에 대해서는 매 4 내지 8주 마다 이루어질 수 있다. 치료는 주기적이며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 월 1회이다. 치료는 외과 수술 전 및/또는 후에 주어질 수 있으며, 투여되거나 외과적 처리 부위에 직접 도포될 수 있다.
본 발명의 IL-6 결합 구성원은 sIL-6Ra에 대한 항체와 비교하여 투여량 및 투여 요건면에서 잇점을 제공할 수 있다. 본원 다른 경우에서도 언급된 바와 같이, 질환에 걸린 경우 순환하는 IL-6 수준은 순환하는 sIL-6Ra 수준보다 현저히 더 낮다. 따라서, IL-6 결합 구성원을 사용하는 것은 항-IL-6R 결합 구성원과 반대로 환자에게로의 매 투약을 위해 제조되는 약물의 양이 더 낮을 수 있다는 점에서 유의적인 잇점을 제공한다. 또한, 항-IL6 치료제의 투여량이 더 낮다면, 낮은 투여량은 피하 주사 뿐만 아니라, 정맥내(i.v.) 주사를 촉진시킬 수 있다는 유의적인 잇점이 존재할 수 있다. 피하 투약은 투약당 필요한 결합 구성원, 예로서, 항체 분자의 양에 의해 제한될 수 있다는 것이 당업자에게 잘 알려져 있다. 이는, 피하 주사는 피부의 한 부위에서 주사될 수 있는 부퓌에 의해 제한될 수 있다는 점에 기인하는 것이다. 사용되는 피하 주사량으로는 전형적으로 1.2 ml이다. 50 mg/ml 초과의 농도의 피하 주사용 결합 구성원을 제제화시키는 것은 점점 어려워질 수 있기 때문에 상기 경로를 통한 100 mg 초과의 투여량은 일반적으로 다회에 걸쳐 주사될 것을 필요로 하며 환자에게는 더 많은 불쾌감을 줄 수 있다.
저 낮은 투여량으로 항-IL-6 치료제를 갖는다는 것은 또한 더 고농도로 존재하는 전신 sIL-6Ra와 비교하여 전신 IL-6 모두를 저해하는 항체를 더 낮은 "적재"량으로 필요로 할 수 있다.
추가의 잇점은 IL-6 수용체보다는 IL-6을 표적한다는 것과 관련이 있을 수 있으며, 이는 IL-6Ra에 대한 결합 구성원과 비교하여 본 발명의 결합 구성원의 추가적인 잇점을 나타낸다.
예를 들면, 질환에 걸린 경우 순환하는 IL-6 수준은 순환하는 sIL-6Ra 수준보다 현저히 더 낮다는 것이 문헌상으로 보고되어 있다[112, 113]. sIL-6R 수준은 IL-6 수준보다 현저히 더 높기 때문에 IL-6을 중화시키기 위하여 필요한 항-IL-6 결합 구성원의 양과 비교하여 sIL-6Ra을 중화시키기 위해서는 더 많은 항-sIL-6R 결합 구성원이 필요할 수 있다. 그러므로, 항-수용체 결합 구성원을 사용할 경우와 비교하면 더 낮은 투여량의 항-리간드 결합 구성원이 필요할 수 있다.
질환에 걸린 경우 IL-6 수용체보다는 IL-β 리간드를 표적하는 것이 IL-6의 수준을 감소시킬 수 있지만, 면역 반응의 일부로서 IL-6이 상향조절되는 감염시에는 IL-6 수준은 여전히 증가할 수 있고,
문헌 (Kawano et al. [4])는, IL-6이 강력한 성장 인자라는 것이 제시되어 있으며, 환자로부터 새로 단리된 골수종 세포는 IL-6을 생산하고 그의 수용체를 발현시키는 것이 제시되어 있다. 추가로, 항-IL-6 항체는 시험관내의 골수종 세포의 성장을 저해한다. 이것은 자가분비 루프가 인간 골수종 종양발생에 있어 작동한다는 것에 대한 직접적인 증거가 된다. 상기 연구에 대한 후속 연구로 문헌 (Van Zaanen et al. [5])에서는 다중 골수종 환자에서의 IL-6 생산은 항-IL-6 리간드 항체로 치료할 때 감소한다는 것이 입증되었다.
많은 추가 연구에서는, IL-6이 기타 세포 유형, 예로서, 평활근 세포(SMC: smooth muscle cell)[114], U373-MG 성상교종 세포[115], 3T3 지방세포[116], 뉴런[117], 내피 세포[118] 및 카포시 육종 세포[119]에서 자가분비 피드백 루프에 관여하는 것을 제시한 바 있다. 그러므로, 질환에 걸린 경우 항-IL6 결합 구성원을 사용하여 IL-6을 저해하는 것은 기본 질환에서 IL-6 생산을 감소시킬 수 있다.
추가로, 항-IL-6 결합 구성원은, 치료하고자 하는 질환의 병상에 관여하는 세포 표면상에 존재하는 수용체를 점유하기 위해서는 조직을 침투하여야 하는 IL-6 수용체에 대한 결합 구성원과는 대조적으로 전신 순환에서 IL-6에 결합한다.
IL-6에 대한 결합 구성원은 전신 순환에서 IL-6과 평형을 이룰 수 있으며, 이는 예로서, 윤활막과 같은 막을 가로지른 구배를 유발하는 효과를 가지는데, 이는 관절로부터의 활성 IL-6을 제거하고, 결합 구성원과 불활성 복합체를 형성하는 순 효과를 갖는다. 상기 결과로서 IL-6 결합 구성원은 IL-6R 결합 구성원과 비교하여 더 빨리 개시될 수 있으며, 투약 요법은 상이할 수 있고, 잠재적으로는 최적화시키기가 더욱 용이할 수 있다.
IL-6 신호 전달은 IL-6R에 결합하는 IL-6과 gp130에 결합하는 상기 복합체에 의해 매개된다. IL-6과 IL-6Ra 결합은 나노몰랄의 친화도(약 5 nM)이고, 상기 IL6:IL6R 복합체 및 gp130 결합은 피코몰랄 친화도일 경우, IL-6을 표적하는 결합 구성원은 IL-6 결합에 대하여 더 소량으로 경쟁하는 것은 것에 직면하게 됨으로써 더 많은 IL-6 신호전달을 억제시킬 수 있다. 또한 가용성 IL-6Ra를 표적하고, IL-6:IL-6Ra 복합체 형성을 막는 결합 구성원에 대해 적용될 수 있지만, IL-6Ra가 공간적 제약 때문에 막에 결합되어 있는 상태라면 항-IL-6Ra가 막상에 존재하는 IL-6Ra에 결합하고, 그를 저해하는 것은 더욱더 어려울 수 있다.
실시예 1: 리드(lead) 단리
1.1 선택
사상성 파지 M13에 기초한 파지미드 벡터 내로 클로닝된 본래의 인간 단쇄 Fv(scFv: single chain Fv) 파지 디스플레이 라이브러리를 선택에 사용하였다[120, 121]. 항-IL-6 특이적 scFv 항체를 재조합 인간 IL-6 상에서 일련의 선택 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였으며, 이는 실질적으로 문헌 (Vaughan et al[120] 및 Hawkins et al[122])에 이미 기재된 바와 같이 하였다. 간략하면, 바이오패닝 선택을 위해 PBS(둘베코 PBS, pH 7.4) 중 인간 IL-6을 4℃에서 밤새도록 마이크로타이터 플레이트의 웰 상으로 흡착시켰다. 웰을 PBS로 세척한 다음, 1h 동안 PBS-마벨(Marvel)(3% w/v)로 차단하였다. PBS-마벨(3% w/v) 중 정제된 파지를 웰에 가하고, 코팅된 항원에 1h 동안 결합하도록 두었다. 비결합된 파지를 PBS-트윈(0.1% v/v) 및 PBS를 사용한 일련의 세척 사이클로 제거하였다. 결합된 파지 입자를 용리시키고, 세균 내로 감염시킨 다음, 다음 회의 선택을 위해 구제하였다[120].
1.2 조 scFv에 의한 IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합 저해
제2회차의 선택으로부터의 대표적인 수의 개개의 클론을 96웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 세균 원형질막공간에서 발현시키고, HTRF®(균질적 시간 분해 형광: Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, CIS Bio international) 인간 IL-6/인간 IL-6 수용체-결합 분석법으로 그들의 저해 활성에 대해 스크리닝하였다. 이러한 분석에서 샘플은 크립테이트 표지화된 인간 IL-6(R&D Systems)에 결합하는 것에 대하여 비오틴화된 IL-6R(Peprotech)과 비교하였다. 기준 항-IL-6 mAb(Biosource AHC0562)는 양성 대조군으로서 모든 효능 분석법에 포함시켰다. 상세한 분석 방법은 물질 및 방법 섹션에서 제공된다.
1.3 scFv의 IgG1로의 리포맷팅
VH 및 VL 도메인을 전체 항체 중쇄 및 경쇄를 각각 발현하는 벡터 내로 하위-클로닝하여 클론을 scFv로부터 IgG1 포맷으로 전환시켰다. VH 도메인을 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 벡터(pEU15.1) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, VL 도메인은 조절 요소와 함께, 인간 카파 경쇄의 발현을 위해서는 벡터 pEU3.4내로, 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인의 발현을 위해서는 벡터 pEU4.4내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 원래 문헌 [123]에 기재되어 있다. 캠브릿지(Cambridge) 항체 테크놀로지 벡터에 단순히 OriP 요소를 도입하여 조작하였다. IgG를 얻기 위하여, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 EBNA-HEK293 포유동물 세포 내로 형질감염시켰다. IgG가 발현되었으며, 배지로 분비되었다. 수확물을 풀링하고, 정제 이전에 여과하였다. IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 배양 상등액을 적절한 크기의 세라믹 프로테인 A(BioSepra) 칼럼에 로딩하고, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl로 세척하였다. 결합된 IgG를 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.0)을 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, Tris-HCl(pH 9.0)을 가하여 중화시켰다. 용리된 물질을 Nap10 칼럼(Amersham, #17-0854-02)을 사용하여 PBS 내로 완충액 교환시키고, IgG 농도를 IgG의 아미노산 서열에 기초한 소광 계수를 이용하여 분광학적으로 측정하였다[124]. 정제된 IgG를 SEC-HPLC를 사용하여, 그리고 SDS-PAGE에 의해서 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.
1.4 정제된 scFv 및 IgG에 의한 IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합 저해
조 원형질막공간 추출물로서 IL-6:IL-6R 상호작용에 대하여 현저한 저해 효과를 보이는 ScFv를 DNA 서열화하였다[120, 125]. 독특한 scFv를 이에 다시 세균에서 발현시켰으며, 친화성 크로마토그래피로 정제하였다(문헌 (Bannister et al[126])에 기재되어 있는 바와 같이 정제하였다). 이들 클론의 정제된 IgG 샘플 또한 섹션 1.3에 기술되어 있는 바와 같이 제조하였다. 이들 샘플을 효능은 HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨)에 대한 결합하여 비오틴화된 sIL-6R과 정제된 제제의 일련의 희석액을 경쟁시킴으로써 측정하였다.
인간 중쇄 및 카파 경쇄 불변 도메인을 갖는 IgG으로서 및 scFv로서 클론 CAN022D10에 대한 결론은 표 1에서 제공한다. 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에서 제공된다.
수용체-리간드 HTRF 생화학적 분석에서 CAN022D10 scFv 및 IgG의 효능
클론 IC50 scFv(nM) IC50 IgG(nM)
CAN022D10 45 0.31
1.5 정제된 scFv 및 IgG에 의한, IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식 저해
TF-1 세포 증식 분석법을 사용하여 인간 및 사이노몰구스 IL-6 생체활성에 대한 정제된 scFv 제제의 중화 효능을 평가하였다. TF-1은 적백혈병을 앓는 환자로부터 확립된 인간 전골수성 세포주이다[134]. TF-1 세포주는 생존 및 증식에 대해 의존하는 인자이다. TF-1 세포는 인간 및 사이노몰구스 IL-6(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨) 둘 모두에 대하여 반응하는 것으로 나타났으며, 인간 GM-CSF(4 ng/ml, R&D Systems)를 함유하는 배지에서는 보존되었다. IL-6에 의존하는 증식의 저해는 분열 세포에서 새로 합성되는 DNA내로 혼입되는 삼중수소화 티미딘의 감소를 측정함으로써 결정하였다. 프로토콜의 상세한 설명은 물질 및 방법 섹션에서 제공된다.
완전하게 저해되는 것이 관찰되지는 않았지만, CAN022D10의 정제된 scFv 제제는 최대 시험 농도에서 IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 저해할 수 있다. 그러므로, 수득한 결과로부터 정확한 IC50 효능 데이타를 계산할 수 없었다. 정제된 IgG로서 시험한 경우, CAN022D10에 대한 IC50은 93 nM인 것으로 계산되었다.
1.6 DELFIA® 에피토프 경쟁 분석에서 항체의 선택성 및 종 교차 반응성
IL-6 계열의 구성원에 대한 항체의 선택성 및 종 교차 반응성을 DELFIA® 에피토프 경쟁 분석법을 사용하여, 비오틴화된 HIS FLAG IL-6(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨)이 각각의 고정된 항-IL-6 항체에 결합하는 것을 저해하는 것을 측정하여 확립하였다.
정제된, 백혈병 저해 인자(LIF)(Chemicon), 섬모 향신경성 인자(CNTF), IL-11 및 온코스타틴 M(모두 R & D Systems)의 적정액을 각 분석에서 시험하여, 분석에서 IC50 값으로 측정되는 바와 같은, 각각의 구조적으로 관련된 단백질에 대한 효능을 확립하였다.
사이노몰구스(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨), 인간 HIS FLAG IL-6(실험실내 HEK-EBNA에서 유래됨), 래트 및 뮤린 IL-6(둘 모두 R & D Systems)을 비롯한, IL-6 종의 적정액을 각 분석에서 시험하여, 항체의 종 교차 반응성을 확립하였다. 본 실험의 예시적인 결과는 표 2에서 제공한다. 프로토콜의 상세한 설명은 물질 및 방법 섹션에서 제공한다.
CAN22D10 경쟁 분석에서 IL-관련 단백질 및 상이한 IL-6 종의 효능
단백질 IC 50 (nM)
인간 IL-6 32*
사이노몰구스 IL-6 100*
뮤린 IL-6 저해되지 않음
래트 IL-6 저해되지 않음
인간 IL-11 저해되지 않음
인간 CNTF 저해되지 않음
인간 LIF 저해되지 않음
인간 온코스타틴 M 저해되지 않음
* 샘플에 대해 불완전한 곡선을 수득하였기 때문에 값은 근사값이다.
1.7 정제된 IgG에 의한, 내인성 IL-6에 의해 유도되는 인간 활막 섬유모세포로부터의 VEGF 방출 저해
항체의 효능은 IL-6에 의해 유도되는, 류마티스 관절염을 앓는 기증자로부터 외식된 인간 활막 섬유모세포로부터의 VEGF 방출 저해에 대하여 평가하였다. 이러한 방법에 관한 상세한 프로토콜은 물질 및 방법 섹션에서 제공한다. 간략하면, 시험 IgG의 적정액을 배양된 섬유모세포에 가한 후, 이는 인간 IL-1β 및 가용성 인간 IL-6Ra를 가함으로써 자극시켜 IL-6 발현을 유도하고, 세포가 신호전달을 할 수 있도록 하여 VEGF 발현을 유도하였다. 48h 동안 인큐베이션시킨 후, 상등액을 제거하고, 상업적으로 이용가능한 키트(R & D Systems)를 사용하여 VEGF의 발현에 대해 ELISA로 시험하였다. 이들 데이타를 사용하여 CAN022D10에 대한 IC50을 측정하였는데, 이는 45 nM으로 계산되었다.
실시예 2. 항체 최적화
2.1 IL-6에 대한 리드 항체의 결합을 개선시킬 수 있는 아미노산의 확인
IL-6에 대한 결합을 개선시킬 수 있는 모체 항체 서열 중 중요한 잔기를 확인하는 전략법은 CAN022D10 scFv 서열 전역에 걸쳐 무작위 돌연변이를 도입시킴으로써 수행하였다. 이는 돌연변이유발 1회당 핵산 서열 1 킬로베이스에 대하여 평균 8.1개의 돌연변이를 혼입하기 위해 제조사의 지침서에 따라 에이 다이버시파이(A Diversify)™ PCR 무작위 돌연변이유발 키트(BD biosciences)를 사용하여 2회의 돌연변이유발을 통해 달성하였다. 본질적으로 앞서 기술된 바와 같이(문헌 ([Hanes et al 2000]; [Methods in Enzymology. 328. 404-430]) 선택을 실시하였다. 간략하면, 모체 클론의 무작위 돌연변이유발 라이브러리는 mRNA로 전사시키고, 무산된 번역 과정을 사용하여 mRNA-리보솜-scFv 복합체를 형성하였다. 이들 복합체를 바이오-huIL-6과 함께 인큐베이션시킨 후, 항원에 결합되어지 것을 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드상에서 포획하였다. 비특이 리보솜 복합체를 세척해내고, mRNA를 결합된 리보솜 복합체로부터 단리시키고, cDNA로 역전사시킨 후, PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 DNA를 다음 회차의 선택에 사용하고/거나 스크리닝을 수행하였다. 선택 과정은 바이오-huIL-6의 농도를 감소시키면서 반복하였다(4회에 걸쳐 100 nM에서 0.1 nM). 리보솜 디스플레이에 의해 단리된 ScFv는 리보솜 디스플레이 작제물의 Nco1/Not1 제한 엔도뉴클레아제 분해(New England Biolabs)에 의해 파지 벡터 pCANTAB6 내로 클로닝한 후, T4 DNA 리가제(New England Biolabs)를 사용하여 Nco1/Not1 분해된 pCANTAB6으로 결찰시켰다[127]. 이어서, 결찰된 DNA를 화학적으로 적격한 TG-1 세포로 형질전환시키고, 개개의 클론으로부터 유래된 조 scFv는 리간드-항체 생화학적 분석법으로 시험되는 HIS/FLAG IL-6에 대한 결합에 대하여 CAN022D10 IgG과 경쟁되었다.
2.2 항체-리간드 생화학적 분석법을 사용한(CAN022D10 IgG 사용) 개선된 클론의 확인
3회 및 4회차 결과물에 대한 대표적인 수의 개개의 클론으로부터 얻은 조 scFv 제제를 CAN022D10 IgG-IL-6 HTRF® 결합 분석법으로 그의 저해 활성에 대하여 스크리닝하였다. 이 분석에서 비오틴화된 항체 및 FLAG-태깅된 IL-6의 결합은 크립테이트 표지화된 항-FLAG 모노클로날 항체 및 스트렙타비딘 XLent!™을 사용하여 검출하였다. 상세한 분석 방법은 본원의 물질 및 방법에서 제공한다.
유의적인 저해 효과를 나타내는 scFv를 서열화하고, 섹션 1.4에 기술되어 있는 바와 같이 정제된 제제로서 생산하였다. 이어서, 각 scFv에 대한 IC50 값은 HTRF 항체-리간드 생화학적 분석법 및 TF-1 증식 분석법으로 정제된 샘플의 일련의 희석액을 시험하여 수득한 데이타로부터 계산하였다. TF-1 증식 분석에서 가장 효능이 있는 클론은 앞서 기술되어 있는 바와 같이 중쇄 불변 도메인 및 카파 경쇄 불변 도메인을 갖는 IgG로 전환시키고, TF-1 증식 분석에서 재시험하였다. 각 샘플의 정제된 scFv 및 IgG, 둘 모두에 대한 예시적인 효능 데이타는 표 3에서 제공한다.
리보솜 디스플레이 CAN022D10 무작위 돌연변이유발 라이브러리로부터 단리된 것으로서, 리간드-항체 생화학적 분석법 및 TF-1 증식 분석법에 있어 효능이 개선된 클론의 일례

클론
 IC 50 (pM)
생화학적 분석법 TF-1 증식 분석법
scFv IgG * scFv IgG
항체 2 35 36 9600 16
항체 3 22 43 7300 50
항체 4 24 43 13400 61
항체 5 65 26 12400 42
* 각 클론에 대한 scFv 및 IgG 효능은 직접 비교되지 않아야 하기 때문에 프로토콜을 IgG 효능 측정으로 변형시켰다. 변형에 관한 상세한 설명은 물질 및 방법을 참조한다.
2.3 표적화된 돌연변이유발에 의한 모체 클론의 최적화
친화도에 기초한 파지 디스플레이 선택법을 사용함으로써 표적화된 돌연변이유발 접근법으로 리드 항체를 최적화시켰다. 표적화된 돌연변이유발 접근법을 위해 리드 클론으로부터 유래된 대형 scFv-파지 라이브러리를 표준 분자 생물학 기법[128]을 사용하여 가변성 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 상보성 결정 부위 3(CDR3)을 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발로 생성하였다. 라이브러리를 친화도에 기초한 파지 디스플레이 선택하여 IL-6에 대해 보다 높은 친화도를 갖는 변이체를 선택하였다. 결과적으로, 이는 IL-6이 그의 수용체에 결합함에 있어 개선된 저해 활성을 나타내어야 한다. 선택은 본질적으로 상기 기술되어 있는 바와 같이 수행되었다[129]. 간략하면, scFv 파지 입자를 용액 중 재조합 비오틴화된 인간 IL-6(바이오-huIL-6, 실험실내 E. 콜라이에서 유래 및 실험실내에서 변형됨)와 인큐베이션시켰다. 이어서, 항원에 결합된 scFv 파지를 제조자의 권장 사항에 따라 스트렙타비딘으로 코팅된 상자성 비드(Dynabeads® M-280) 상에서 포획하였다. 선택된 scFv 파지 입자를 상기 기술된 바와 같이[125] 구제하고, 바이오-huIL-6 농도를 감소시키면서(3회에 걸쳐 50 nM 내지 0.1 nM) 선택 과정을 반복하였다.
3회에 걸친 선택 종결시 VH 및 VL 무작위화된 라이브러리를 재조합하여 클론이, 개별적으로 무작위화된 VH 및 VL 서열이 무작위로 쌍을 이룬 것을 함유하고 있는 단일 라이브러리를 형성하였다. 이어서 상기 기술된 바와 같이 바이오-huIL-6 농도를 감소시키면서(추가의 4회에 걸쳐 0.1 nM 내지 0.1 pM) 선택을 계속하였다.
2.4 항체-리간드 생화학적 분석법을 사용한(항체 5 IgG 사용) 표적화된 돌연변이유발로부터의 개선된 클론의 확인
표적화된 돌연변이유발 선택의 결과물로부터 단리된 클론으로부터 수득한 조 scFv를 본질적으로는 섹션 2.2에 기술된 바와 같이 항체-리간드 생화학적 분석법으로 시험하였다. 이들 결과물에 대하여는 항체 5 IgG를 사용하기 위해 생화학적 분석법을 재형성하였다. 이러한 항체는 TF-1 증식 분석에서 더욱더 큰 효능을 갖는 CAN02210에 대한 개선된 변이체이다. 이러한 효능이 더욱 큰 IgG를 혼입함으로써 효능이 더욱더 높은 클론들 사이를 식별할 수 있는 분석법을 얻게 되었다. 이러한 변형된 분석법에 대한 프로토콜은 CAN022D10을 사용하는 원래의 항체-리간드 생화학적 분석법에 대해 기술된 바와 같으며, 하기와 같은 변경 사항도 포함하였다. 첫번째로 사용된 HIS FLAG IL-6의 농도 1 nM으로부터 0.5 nM으로 감소되었다. 두번째로, 항 IL-6 항체 및 스트렙타비딘 XLent!™의 농도를 각각 1 nM 및 20 nM에서 16 nM 및 40 nM으로 증가시켰다. 유의적인 저해 효과를 나타내는 scFv를 서열화하고, 정제된 scFv 및 IgG로서 생산한 후, TF-1 증식 분석법으로 시험하였다.
2.5. 최적화된 클론의 정제된 scFv 및 IgG에 의한, IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포 증식 저해
최적화된 클론의 효능은 앞서 기술된 바와 같이 IL-6에 의해 유도된 TF-1 증식 분석법을 사용하여 측정하였다. 클론은 정제된 scFv 제제 및 리포맷팅된 IgG, 둘 모두로서 시험하였다. scFv 및 IgG, 둘 모두에 대한 예시적인 결과는 표 4에서 제공한다.
TF-1 세포 증식 분석에서 시험하였을 때의 표적화된 돌연변이유발 라이브러리로부터 확인된 클론의 예식적인 효능
클론
(생식세포화되지 않은 클론) 		IC 50 (pM)
scFv IgG
항체 7 11 3
항체 8 419 48
항체 10 549 40
항체 14 448 31
항체 16 154 4.9
항체 17 38 16
항체 18 51 30
항체 19 508 68
항체 21 42 N.D.
항체 22 41 N.D.
항체 23 161 20
CNTO-328 N.D. 74
N.D. 미측정
클론이 유의적인 저해 효과를 나타내기는 하였지만, 정제된 scFv의 일련의 희석액으로부터 정확한 IC50 값은 측정될 수 없었다.
2.6. 생식세포화
최적화된 항-IL-6 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이타베이스 [130] 중의 공지된 인간 생식세포 서열에 대해 배열하고, 가장 근접한 생식세포를 서열 유사도에 의해 확인하였다. CANDY022D10 항체 계통의 VH 도메인의 경우, 가장 근접한 생식세포 v 세그먼트는 Vh3_DP-86_(3-66)이었고, 가장 근접한 생식세포 j 세그먼트는 JH2였다. VL 도메인의 경우, 가장 근접한 생식세포 v 세그먼트는 Vk1_L12이고, 가장 근접한 생식세포 j 세그먼트는 JK2였다.
변하지 않은 채 남아있는 버니어 잔기[131]를 고려하지 않으며, VH 도메인의 프레임워크 중 3개의 변화 및 VL 도메인 중 4개의 변화가 있었으며, 이들 모두를 적절한 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 표준 부위 지정 돌연변이유발 기법을 사용하여 인간 항체에 똑같이 매칭되는 가장 근접한 생식세포 서열로 재전환시켰다.
생식세포로부터 돌연변이화된 CAN022D10의 scFv 서열 중에서 총 5개의 버니어 잔기가 확인되었다. 중쇄 중 카바트 잔기 29(V 대신 I 존재), 69(I 대신 M 존재), 73(N 대신 I 존재) 및 78(L 대신 V 존재)에 존재하였다. 단일의 버니어 돌연변이는 또한 경쇄 서열 중 카바트 잔기 46(L 대신 V)에서 확인되었다.
이어서, 생식세포화된 IgG를 IL-6에 의해 유도된 TF-1 증식 분석법으로 재평가하여 효능이 감소되었는지를 확인하였다. 생식세포화(GL) 항체에 대한 예식적인 효능을 표 5에서 제공한다.
IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포 증식 분석에서 평가되었을 때의 생식세포화된 최적화 클론에 대한 평균 효능 데이타
클론 IC 50 (pM)
항체 7 (GL) 5
항체 10 (GL) 71
항체 17 (GL) 1
항체 18 (GL) 3
CNTO-328 101
2.7. 최적화된 IgG에 의한, 내인성 IL-6에 의해 유도된 인간 활막 섬유모세포로부터의 VEGF 방출 저해
내인적으로 발현된 IL-6에 대한 효능을 평가하기 위하여 활막 섬유모세포 VEGF 방출 분석법으로 최적화된 IgG를 시험하였다. 이러한 방법에 관해서는 섹션 1.7에 리뷰되어 있고, 물질 및 방법 섹션에 상세히 기술되어 있다. 시험된 IgG에 대한 예식적인 효능은 표 6a에서 제공한다. 시험된 IgG에 대한 평균 효능 데이타는 표 6b에서 제공한다.
IL-6 유도성 활막 섬유모세포 VEGF 방출 분석에서 내인성 IL-6에 대한 것으로 평가하였을 때의 최적화된 클론에 관한 예식적인 효능 데이타
클론 (GL= 생식세포화된 클론) IC 50 (nM)
항체 2 0.59
항체 3 0.38
항체 4 0.52
항체 5 0.70
항체 7 (GL) 0.75
항체 10 (GL) 0.55
항체 17 (GL) 0.57
항체 18 (GL) 0.93
CNTO-328 1.31
IL-6 유도성 활막 섬유모세포 VEGF 방출 분석에서 내인성 IL-6에 대한 것으로 평가하였을 때의 최적화된 클론에 관한 평균 효능 데이타
클론 (GL= 생식세포화된 클론) IC 50 (nM) (95% CI) n
항체 7 (GL) 0.78 (0.54-1.11) 3
항체 17 (GL) 0.57 (0.51-0.64) 3
항체 18 (GL) 0.67 (0.20-2.25) 4
CNTO-328 1.02 (0.39-2.63) 4
2.8. DELFIA® 에피토프 경쟁 분석에서 최적화된 항체의 선택성 및 종 교차 반응성
앞서 기술된 바와 같이(섹션 1.6 및 물질 및 방법 참조) DELFIA® 에피토프 경쟁 분석법을 사용하여 클론 패널에 대한 선택성 및 종 교차 반응성을 재평가하였다. 인간 및 사이노몰구스 IL-6은 중복되는 저해 곡선을 형성하였는 바, 이로써, 시험된 모든 IgG에 대하여 미정의 IC50 값을 형성하였다. 항체 패널에 대하여, 시험된 뮤린, 래트 또는 개 IL-6 또는 임의의 관련 인간 단백질에 관해서는 어떤 저해도 관찰되지 않았다. 이러한 데이타는 시험된 클론 패널이 사이노몰구스 IL-6에 대하여 교차 반응하지만, 뮤린, 래트 또는 개 IL-6에, 또는 인간 IL-6과 가장 관련성이 있는 인간 단백질에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다.
2.9 비아코어를 사용한 최적화된 클론에 대한 친화도 데이타 계산
본질적으로 참고문헌 [132]에 기재되어 있는 바와 같이, 비아코어 2000 바이오센서(BIAore AB)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 인간 및 사이노몰구스 IL-6에 대한 대표적인 항체 7 및 18의 정제된 IgG 샘플의 결합 친화도를 측정하였다. 간략하면, 아민 커플링 키트(BIAcore)를 사용하여 220-225 Ru 사이의 표면 밀도를 제공할 수 있도록 정제된 항체를 CM5 센서칩 표면에 커플링시켰다. HBS-EP 완충액 중 200 nM 내지 0.2 nM 사이의 농도 범위의 인간 및 사이노몰구스 IL-6을 센서 칩 표면상에 통과시켰다. BIA 평가 3.1 소프트웨어를 사용하여 생성된 센서그램을 평가함으로써 상대적인 결합 데이타를 제공하였다.
비아코어 2000™ 바이오센서의 친화도 측정 범위의 하한은 대략 10 pM(비아코어 2000 기구 핸드북)이다. 수득한 데이타로부터 살펴본 결과, 인간 및 사이노몰구스 IL-6, 둘 모두에 대한 항체의 친화도는 상기 한도 10 pM 미만이었고, 즉, 항체는 측정가능한 것보다 더 큰 효능을 가졌다. 그러므로, 정확한 친화도 측정치는 계산되지 못했다. 이러한 접근법을 사용함으로써 IL-6 종 둘 모두에 대한 두 항체 모두의 친화도는 10 pM 미만인 것으로 간주된다.
2.10 시험관내 TF-1 세포 증식 분석법을 사용한 최적화된 클론에 대한 친화도 데이타 계산
TF-1 분석법을 사용하여 쉴드 분석법의 사용으로 항체 18의 친화도를 계산하였다. IL-6 표준 곡선(7.7 x 10-15 M 내지 3 x 10-9 M)을 이중으로 IgG 농도 범위(2.67 x 10-13 M 내지 8.3 x 10-10 M)와 함께 혼합하였다. Log10 용량비에 대해 Log10 항체 농도를 플로팅함으로써 IgG의 친화도를 측정하였다. 이러한 접근법의 사용으로 인간 IL-6에 대한 항체 18(GL)의 친화도는 0.40 pM(95% CI 0.12 pM - 0.69 pM, n=6)으로 계산되었다.
2.11 시험관내 IL-6에 의해 매개되는 B9 세포 증식을 사용한 인간 재조합 IL-6에서의 길항제 효능
IL-6에 의해 유도된 B9 세포 증식은 항체 18 및 이소타입 대조군 항체의 존재하에서 평가하였다. IL-6 표준 곡선(농도 범위 1 x 10-14 M 내지 1 x 10-9 M)에 대한 다양한 농도 범위의 각 항체(1 x 10-13 M 내지 1 x 10-9 M)의 효과를 평가하였다. 데이타 점은 이중으로 제시되었다. B9 증식은 4일간 인큐베이션시킨 후 알라마 블루 환원(형광법)에 의해 측정하였다.
항체 18은 IL-6에 의해 유도된 B9 증식을 저해시키는 것으로 나타났다. 이소타입 대조군은 어떤 저해 효과도 나타내지 않았다. 평균 데이타는 표 8에 나타낸다.
IL-6에 의해 유도되는 B9 증식 저해에 대한 평균 Kb 값
평균 Kb pM(95% CI) n
항체 18 (GL) 0.3(0.1-0.5) 6
2.12 시험관내에서의 IL-6에 의해 매개되는, SKW6.4 세포로부터의 IgM 방출을 사용한 인간 재조합 IL-6에서의 길항제 효능
IL-6은 인간 B 림프모구 세포주 SKW 6.4로부터의 IgG 분비를 유도한다. 다양한 농도 범위(1 x 10-13 M 내지 3 x 10-8.5 M)의 IL-6과 함께 인큐베이션된 SKW6.4 세포는 IgM 분비에 있어서 평균 [A] 50의 77 pM(n=3)을 제공하였다. 100 pM IL-6의 존재하에서 다양한 항체 농도(1 x 10-12.5 M 내지 1 x 10-8 M)의 저해를 관찰함으로써 IL-6에 의해 유도된 IgM 분비에 대한 항-인간 IL-6 항체 IL 17 및 18, 및 이소타입 대조군 항체의 효과를 평가하였다. IgM 분비는 4일 후 항-인간 IgM ELISA에 의해 측정하였다. 데이타 점은 이중으로 제시되었다.
항체 7, 17 및 18은 IL-6에 의해 유도된 IgM 분비를 저해하였다. 이소타입 대조군은 이들 분석에서 어떤 저해 효과도 나타내지 않았다. 평균 데이타를 표 9에 나타낸다.
SKW6.4 세포로부터의 IgM 분비의 평균 저해값
평균 IC50 PM n
항체 7 (GL) 2.64 3
항체 17 (GL) 3.21 3
항체 18 (GL) 2.63 3
실시예 3. 에피토프 지도화
3.1 항-IL-6 항체 에피토프와 공지된 항-인간 IL-6 항체의 비교
항체 18 (GL)의 에피토프를 2개의 항-인간 IL-6 항체, B-E8 및 cCLB8의 에피토프와 비교하였다. 이들 항체 둘 모두 IL-6Ra에 대한 IL-6의 결합을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 이는 효능이 있는 치료제로서 연구된 바 있다[5, 31, 34, 37, 133]. 3개 항체의 에피토프를 비교할 수 있도록 하기 위해 각각은 야생형(wt) 서열과 비교되는 단일의 아미노산 돌연변이를 함유하는 IL-6 돌연변이체 패널을 작제하였다. 이어서, 이들 돌연변이체가 상이한 항체에 결합하는 것에 관해 생화학적 경쟁 분석법으로 평가하였다. 이러한 실험은 실시예 1.6에 기술된 생화학적 경쟁 분석법에 기초하였는데, 단, 필요에 따라 항체 및 IL-6 변이체의 농도는 달리하였다. 간략하면, 항체를 PBS 중 2 nM(항체 18) 또는 4 nM(B-E8 and cCLB8)의 농도로 96-웰 눙크 맥시소르프(Nunc Maxisorb) 면역분석법 플레이트 표면 상에 코팅하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 웰의 표면을 PBS 중 3% (w/v) BSA를 사용하여 차단한 후, 최종 농도 0.15 nM의 비오틴화된 인간 IL-6과 혼합된, 농도 범위가 200 nM 내지 10 pM인 저해제 희석액을 항체로 코팅된 웰에 첨가하고, 결합할 수 있도록 하였다. 유로퓸 표지화된 스트렙타비딘을 사용하여 항체에 대한 비오틴화된 IL-6의 결합을 측정하였다.
돌연변이체에 대해 수득된 IC50 값을 비표지화된 야생형 인간 IL-6과 비교하여 각 돌연변이체에 대한 효능 비율을 확립할 수 있었다. 이어서, 상이한 항체에 걸쳐서 이들 비율을 비교함으로써 항체가 IL-6에 결합하는 것에 대한 각개 돌연변이가 미치는 효과를 평가할 수 있었다. 이들 실험의 전형적인 결과는 표 10에 제시되어 있으며, 실험은 2회에 걸쳐 추가로 반복되었다.
Figure 112009027151458-pct00001
3개 항체가 IL-6 돌연변이체 패널에 대해 상이한 결합 프로파일을 가지며, 따라서, 사이토카인 표면 상의 상이한 에피토프에 결합한다는 결과를 나타낸다. 앞서 문헌 [Kalai et al (1997)]에서는 cCLB8이 IL-6 돌연변이체 F106E를 인식하지 못한다는 것이 관찰되었다. 이는, 비오틴화된 IL-6이 항체에 결합하는 것으로 저해하지 못하였는 바, 본 실험에서 확인되었다. 대조적으로, IL-6 돌연변이체 F106E는 항체 18을 사용한 경쟁 분석에서 wt IL-6보다 단지 5배 낮은 효능을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 상기 항체에 강하게 결합한다는 것을 시사한다. 돌연변이체 Q211A의 경우에도 유사한 결과가 관찰되었는데, cCLB8에 대한 158과 비교하여 항체 18에 대한 효능 비율은 1.5였다. 반대로, 돌연변이체 F102E, R207E, R207L 및 S204E는 cCLB8 분석에서 효능이 있는 저해제이지만, 항체 18 분석에서는 wt IL-6에 비하여 상당히 효능이 더 작은 것으로 관찰되었다.
항체 18 및 B-E8의 결합에 있어서의 차이는 돌연변이체 R58E 및 S204E에 의한 것으로 관찰되었다. B-E8에 대해서는 79.083인 것과 비교하여, R58E에 대한 효능 비율은 항체 18에 대하여 2.009였는데, 이는 상기 돌연변이가 B-E8이 IL-6에 결합하는 것을 감소시킨다는 것을 시사한다. 돌연변이 S204E의 효과는 시험된 3개 항체들 중 항체 18에 특이적이라는 것을 나타낸다. cCLB8을 사용한 경우에서와 같이 상기 돌연변이는 B-E8에 대한 IL-6 결합에 대한 효능에는 거의 영향을 미치지 않았지만, 항체 18에 대한 생화학적 분석법에 있어서 야생형 IL-6과 비교하면 상기 돌연변이체는 100배 초과로 효능이 낮은 것으로 나타났다.
실시예 4. 생체내 항-IL-6 항체 투여
4.1 항-IL-6 항체 투여가 마우스에서 인간 재조합 IL-6-유도성 중성구 및 합토글로빈 증가에 미치는 효과
IL-6을 전신 투여하는 것은 중성구 및 급성기 단백질 농도을 전신으로 증가시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IL-6을 수컷 C57/B/6/J 마우스 내 복강내로 주사하여 투여하는 생체내 모델을 생산하고, 중성구 및 급성기 단백질 합토글로빈 농도를 측정하였다. 반응을 저해할 수 있는 피하 주사에 의해 투여된 항체 18 (GL)의 능력을 측정하였다.
4.2 합토글로빈 분석법
7일간 인간 IL-6(5.2 nmol/kg, 12 mg/kg과 동일, b.i.d.)을 복강내 주사하여 IL-6 처리군에서 혈장 합토글로빈 수준은 0.02 ± 0.01 mg/ml(비히클 대조군)로부터 1.19 ± 0.27 mg/ml로 유의적으로 증가하였다(T-테스트, P<0.01). IgG1 이소타입 대조군은 어떤 효과도 없는 반면, 항체 18은 용량에 의존하는 방식으로 반응을 저해하였으며, 10.6 nmol/kg(156 mg/kg) 및 그 초과의 용량에서 유의적으로 저해(ANOVA, P<0.01 대 IL-6 단독)된 것이 관찰되었다(도 1).
4.3 중성구 분석법
7일간 인간 IL-6(5.2 nmol/kg, 12 mg/kg과 동일, b.i.d.)을 복강내 주사하여 IL-6 처리군에서 중성구 계수는 1.1 ± 0.44 x109 세포/L(비히클 대조군)로부터 2.47 ± 0.12 x109 세포/L로 유의적으로 증가하였다(T-테스트, P<0.01). IgG1 이소타입 대조군은 어떤 효과도 없는 반면, 항체 18은 용량에 의존하는 방식으로 반응을 저해하였으며, 1.5 nmol/kg(23 mg/kg) 및 그 초과의 용량에서 유의적으로 저해(ANOVA, P<0.01 대 IL-6 단독)된 것이 관찰되었다.
이들 결과는 생체내 IL-6의 전신 효과를 저해할 수 있는 항-IL-6 항체의 능력을 확인시켜 준다.
물질 및 방법
조 scFv에 의한, IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합 저해
수용체-리간드 결합 HTRF®(균질적 시간 분해 형광) 분석 포맷으로 비오틴화된 IL-6R(Peprotech 200-06R)에 결합하는 크립테이트 표지화된 인간 IL-6(R&D Systems 206-IL), 또는 HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨) 저해에 대하여 선택 결과를 스크리닝하였다.
200 mM hepes 완충액 pH7.4, 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 수크로스 중에서 제조된 원형질막공간 추출물을 함유하는 희석되지 않은 조 scFv로서 리드 단리시 결과를 스크리닝하였다. 8 nM 비오틴화된 인간 IL-6R을 8 nM 스트렙타비딘 XLent!(™)(CIS Bio International 611SAXLA)과 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다. 0.4 M 불화칼륨 및 0.1% BSA을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)(분석 완충액)에서 모든 희석을 수행하였다.
시약을 사전에 인큐베이션시킨 후, 10 ㎕의 조 scFv 샘플을 384 웰의 저부피 분석 플레이트(Costar 3676)에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕의 사전에 인큐베이션된 비오틴화된 수용체 및 스트렙타비딘 XLent!(™) 믹스를 첨가한 후, 5 ㎕의 11.2nM 크립테이트 표지화된 인간 IL-6을 첨가하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1분 동안 실온에서 1000 rpm으로 원심분리하고, 실온에서 2h 동안 인큐베이션시킨 이후에 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서, 인비젼(Envision) 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 시간-해상 형광을 판독하였다.
정제된 scFv 및 IgG에 의한, IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합 저해
스크리닝으로부터 확인된 양성 클론으로부터의 정제된 scFv 및 IgG를 비오틴화된 IL-6R에 대한 HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6 결합 저해에 관하여 HTRF® 분석법으로 시험하였다. 8 nM 비오틴화된 인간 IL-6R을 8 nM 스트렙타비딘 XLent!(™)과 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다. 0.4 M 불화칼륨 및 0.1% BSA을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)(분석 완충액)에서 모든 희석을 수행하였다.
분석에서 IC50 값으로 클론 효능을 확립하기 위해 정제된 샘플의 적정액을 사용하였다. 시약을 사전에 인큐베이션시킨 후, 10 ㎕의 정제된 scFv 샘플의 적정액을 384 웰의 저부피 분석 플레이트(Costar 3676)에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕의 사전에 인큐베이션된 비오틴화된 수용체 및 스트렙타비딘 XLent!(™) 믹스를 첨가하였다. 2 nM HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6을 크립테이트(CIS Bio International 61FG2KLB)으로 표지화된 1.732 nM 항-플래그 IgG와 조합하고, 즉시 5 ㎕의 믹스를 분석 플레이트에 첨가하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1분 동안 실온에서 1000 rpm으로 원심분리하고, 실온에서 2h 동안 인큐베이션시킨 이후에 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서, 인비젼 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 시간-해상 형광을 판독하였다.
데이타 분석
하기 방법을 사용하여 상기 기술된 HTRF® 분석법으로부터 얻은 데이타를 분석하였다.
각 샘플에 대한 델타 F 값(%)을 계산하여 데이타를 분석하였다. 델타 F는 수학식 1에 따라 결정되었다.
Figure 112009027151458-pct00002
이어서, 델타 F 값(%)을 사용함으로써 수학식 2에 기술되어 있는 것과 같은 특이 결합율(%)을 계산하였다.
Figure 112009027151458-pct00003
IC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 4개의 파라미터 로그 방정식(수학식 3)으로 곡선 핏팅으로 결정하였다.
Y = 기저값 +(최고치 -기저값)/(1+10^((LogEC 50 -X) * 기울기))
X는 농도의 로그이고, Y는 특이적 결합이다.
Y는 기저값에서 시작하여 최고치로 S자 모양으로 간다.
모든 분석에 양성 대조군으로서 기준 항-IL-6 mAb(Biosource)를 포함시켰다.
정제된 scFv 및 IgG에 의한, IL-6에 의해 유도된 TF-1 세포 증식 저해
TF-1 세포는 R&D 시스템으로부터 기증받았고, 공급된 프로토콜에 따라 유지시켰다. 분석 배지는 5% 우태아 혈청(JRH) 및 1% 피브루산나트륨(Sigma)를 함유하는 GLUTAMAX I(Invitrogen)와 함께 RPMI-1640을 포함하였다. 각각을 분석하기에 앞서 5분 동안 300xg으로 원심분리하여 TF-1 세포를 펠릿화하고, 흡인시켜 배지를 제거하고, 세포를 분석 배지에 재현탁시켰다. 세포를 최종 농도 5x105 세포/ml로 분석 배지에 재현탁시키면서 상기 과정을 2회에 걸쳐 반복하였다. 96 웰 분석 플레이트 에 100 ㎕/웰을 사용하여 세포를 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켜 세포를 굶주리게 하였다. 정제된 scFv 또는 IgG의 시험 용액(이중)을 분석 배지 중 원하는 농도로 희석시켰다. IL-6에 대해 지시되지 않는 무관한 항체는 음성 대조군으로서 사용하였다. 세균으로부터 유래된 재조합 인간(R&D) 및 사이노몰구스(실험실내) IL-6은 100 ㎕/웰의 총 부피로 적절한 시험 항체와 혼합될 때 최종 농도 2O pM(인간 IL-6) 또는 100 pM(사이노몰구스)으로 첨가하였다. 본 분석에서 사용된 IL-6의 농도는 최종 분석시 상기 농도가 최대 증식 반응의 대략 80%를 제공할 수 있는 용량으로서 선택되었다. 모든 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 100 ㎕의 IL-6 및 항체 혼합물을 100 ㎕의 세포에 가하여 200 ㎕/웰의 총 분석 부피를 제공하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 20 ㎕의 삼중수소화 티미딘(5 μCi/ml)을 각 분석점에 가하고, 플레이트는 추가의 24시간 동안 인큐베이터로 돌려 보냈다. 세포 수확기를 사용하여 유리 섬유 필터 플레이트(Perkin Elmer) 상에서 세포를 수확하였다. 티미딘 혼입은 패커드 탑카운트(Packard TopCount) 마이크로플레이트 액체 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다. 이어서, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
고정화된 항 IL-6 항체에 대한 비오틴화된 인간 IL-6 결합 저해에 관한 시간 해상 형광 분석 방법
이러한 분석에 사용되고, 그에 대한 결과가 실시예 2.6에 제공되어 있는 구 체적인 방법은 DELFIA® 시약을 사용하였으며, 이는 상기에 기재되어 있다. 본 방법은 하기에 보다 일반적으로 기재되어 있으며, 이는 항 IL-6 MAbs에 대한 다른 IL-6 형태 및 관련 단백질의 결합을 측정하고/거나 정량하는 분석법으로서 적합하다.
본 분석에서 항-IL-6 모노클로날 항체는 예를 들면, Fc를 통해 지지체에 부착되는 것과 같이 고체 지지체에 결합되어 있다. 폴리스티렌 고 단백질 결합 플레이트, 예로서, 넝크 맥시소르프 플레이트를 적합한 지지체로서 사용될 수 있다.
- 4℃에서 밤새도록 PBS 중 50 ㎕/웰으로 항 IL-6 MAb를 플레이트에 코팅한다.
- 후속의 모든 단계는 실온에서 실시한다.
- 0.05% 트윈20(PBST, 현재는 Sigma P1379하에 이용가능)을 함유하는 PBS로 3회에 걸쳐 플레이트를 세척한 후, 1시간 동안 3% (w/v) BSA(현재는 Roche Diagnostics, 70129138하에 이용가능)를 함유하는 300 ㎕/웰 PBS로 차단한다.
- PBST로 플레이트를 3회에 걸쳐 세척한다.
- 3% (w/v) BSA를 함유하는 PBS 중 저해제 적정액을 제조하고, '희석' 플레이트(40 ㎕/웰)에 가한 후, 40 ㎕/웰 비오틴화된 IL-6에 가하여 항체에 대한 단백질의 KD와 동일한 최종 농도의 비오틴화된 IL-6을 수득한다. 50㎕의 샘플을 희석 플레이트로부터 분석 플레이트 중 상응하는 웰로 옮긴다.
- 1h 동안 플레이트를 인큐베이션시킨다.
- 플레이트를 3회에 걸쳐 PBST로 세척한 후, 각 웰에 0.9 % NaCl, 0.5 % 정 제된 BSA, 0.1 % 트윈20 및 20 μM EDTA를 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 중 O.1 ㎍/ml 유로퓸-표지화된 스트렙타비딘을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1h 동안 인큐베이션시킨다.
- 0.05 M Tris 완충처리된 염수(0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl), 0.05% (v/v) 트윈20, pH8.0(25℃에서)으로 구성된 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 7회에 걸쳐 세척한다.
- 각 웰에, 아세트산으로 산성화되고, 킬레이터 βNTA 및 TOPO와 함께 트리톤 X-100을 함유하는 증강액 50 ㎕를 첨가한다. 알칼리로부터 산성으로의 생성된 pH 변화는 스트렙타비딘 접합체로부터 유로퓸 이온을 신속하게 해리시킨다. 이어서, 유리 유로퓸 이온은 이용가능한 킬레이터와 형광발생 킬레이트를 형성한다. 킬레이가 미셀을 형성할 수 있도록 하고, 킬레이트의 형광발생을 연장시킬 수 있는 TOPO의 존재하에 물을 제거한다.
- 5분간 인큐베이션시킨 후, 620 nm 방출 파장에서 시간 분해 형광을 측정한다. 형광 데이타를 수학식 1에 따라 특이 결합율(%)로 전환시킨다. 비오틴화된 huIL-6은 함유하나, 경쟁자는 함유하지 않는 대조군 웰로부터 전체 결합을 측정한다. 비오틴화된 huIL-6 및 100배 과량의 huIL-6을 함유하는 웰로부터 비특이 결합을 측정한다. 수학식 2에 따라 IC50 값을 계산하기 위해 결과 데이타를 S자모양의 곡선으로 피팅한다.
생화학적 에피토프 경쟁 분석법을 위한 항체 코팅 및 비오틴화된 huIL-6 농 도 측정
코팅을 위해 사용된 항체의 농도 및 에피토프 경쟁 분석법에 사용된 비오틴화된 huIL-6의 농도는 두 시약 상호작용의 친화도 및 항체 고정화 효율에 의존하게 될 것이다. 그러므로, 항체 코팅의 표준 농도 및 필요한 비오틴화된 huIL-6의 농도는 시험하고자 하는 각 항체에 대해서 결정되어야 한다.
일반적으로 각 분석법에 사용되는 비오틴화된 huIL-6의 최종 농도는 포화 분석법에 의해 측정된 바, 상응하는 항체에 대한 리간드의 KD와 동일하다. 코팅에 사용되는 항체의 농도는 비오틴화된 huIL-6이 KD로 첨가되었을 경우, 경쟁 분석 조건하에서 검출될 때 최소 신호 대 배경의 비율이 10:1이 수득되어지는 농도이어야 한다.
DELFIA® 에피토프 경쟁 분석에서 항체의 선택성 및 종 교차 반응성
정제된 IgG를 PBS 중 96-웰 맥시소르프 마이크로타이터 플레이트(Nunc) 상으로, 비오틴화된 인간 IL-6이 그 특정 IgG에 대한 대략 그의 예상되는 Kd로 가해질 때 상당한 신호를 부여하는 농도에서 흡착시켰다. 과량의 IgG를 PBS-트윈(0.1% v/v)으로 세척해낸 다음, 웰을 PBS-마벨(3% w/v)로 1h 동안 차단하였다. 하기 경쟁자 각각의 희석액 시리즈를 PBS 중에 제조하였는데, 이는 비오틴화된 인간 IL-6과 각 IgG: 인간 IL-6, 사이노몰구스 IL-6, 래트 IL-6(R & D Systems 506-RL/CF), 뮤린 IL-6(R & D Systems 406-ML/CF), 인간 CNTF(R & D Systems 257-NT/CF), 인간 LIF (Chemicon, LIF1010), 인간 IL-11(R & D Systems 518-IL/CF) 인간 온코스타틴 M(R & D Systems 295-OM/CF) 사이의 상호작용의 Kd 값의 대략 200배 되는 농도로부 터 시작되는 것이었다. 비오틴화되지 않은 인간 IL-6을 양성 대조군으로서 사용하였다. 이 시리즈에, 동량의 비오틴화된 재조합 인간 IL-6을 대략 Kd 값의 2배 되는 농도로 가하였다(결과적으로 시리즈는 경쟁자 항원:비오틴화된 인간 IL-6의 비율이 대략 100:1에서 시작함). 이어서, 이들 혼합물을 차단된 IgG 상으로 옮기고, 1.5h 동안 평형을 이루도록 하였다. 비결합 항원을 PBS-트윈(0.1% v/v)로 세척하여 제거한 반면, 잔류 비오틴화된 인간 IL-6을 스트렙타비딘-유로퓸3+ 컨쥬게이트(DELFIA® 검출, PerkinElmer)로 검출하였다. 시간-해상 형광을 620 nm, 인비젼 플레이트 판독기(PerkinElmer) 상에서 측정하였다. 형광 데이타를 특이 결합율(%)로 전환하였다(100%는 비오틴화된 인간 IL-6을 함유하나, 경쟁자를 함유하지 않는 대조군 웰로부터 결정되고, 0%는 비오틴화된 인간 IL-6과 100배 과량의 비오틴화되지 않은 인간 IL-6을 함유하는 웰로부터 결정됨). 결과 데이타를 프리즘(Prism) 곡선 핏팅 소프트웨어(Graphpad)를 사용하여 분석하여 수학식 3에 따라 IC50 값을 결정하였다.
고정화된 항 IL-6 항체에 대한 비오틴화된 인간 IL-6 결합 저해에 관한 시간 해상 형광 분석 방법
이러한 분석에 사용되고, 그에 대한 결과가 실시예 2.8에 제공되어 있는 구체적인 방법은 DELFIA® 시약을 사용하였으며, 이는 상기에 기재되어 있다. 본 방법은 하기에 보다 일반적으로 기재되어 있으며, 이는 항 IL-6 MAbs에 대한 다른 IL-6 형태 및 관련 단백질의 결합을 측정하고/거나 정량하는 분석법으로서 적합하다.
본 분석에서 항-IL-6 모노클로날 항체는 예를 들면, Fc를 통해 지지체에 부착되는 것과 같이 고체 지지체에 결합되어 있다. 폴리스티렌 고 단백질 결합 플레이트, 예로서, 넝크 맥시소르프 플레이트를 적합한 지지체로서 사용될 수 있다.
- 4℃에서 밤새도록 PBS 중 50 ㎕/웰으로 항 IL-6 MAb를 플레이트에 코팅한다.
- 후속의 모든 단계는 실온에서 실시한다.
- 0.05% 트윈20(PBST, 현재는 Sigma P1379하에 이용가능)을 함유하는 PBS로 3회에 걸쳐 플레이트를 세척한 후, 1시간 동안 3% (w/v) BSA(현재는 Roche Diagnostics, 70129138하에 이용가능)를 함유하는 300 ㎕/웰 PBS로 차단한다.
- PBST로 플레이트를 3회에 걸쳐 세척한다.
- 3% (w/v) BSA를 함유하는 PBS 중 저해제 적정액을 제조하고, '희석' 플레이트(40 ㎕/웰)에 가한 후, 40 ㎕/웰 비오틴화된 IL-6에 가하여 항체에 대한 단백질의 KD와 동일한 최종 농도의 비오틴화된 IL-6을 수득한다. 50㎕의 샘플을 희석 플레이트로부터 분석 플레이트 중 상응하는 웰로 옮긴다.
- 1h 동안 플레이트를 인큐베이션시킨다.
- 플레이트를 3회에 걸쳐 PBST로 세척한 후, 각 웰에 0.9 % NaCl, 0.5 % 정제된 BSA, 0.1 % 트윈20 및 20 μM EDTA를 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 중 O.1 ㎍/ml 유로퓸-표지화된 스트렙타비딘을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 1h 동안 인큐베이션시킨다.
- 0.05 M Tris 완충처리된 염수(0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl), 0.05% (v/v) 트윈20, pH8.0(25℃에서)으로 구성된 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 7회에 걸쳐 세척한다.
- 각 웰에, 아세트산으로 산성화되고, 킬레이터 βNTA 및 TOPO와 함께 트리톤 X-100을 함유하는 증강액 50 ㎕를 첨가한다. 알칼리로부터 산성으로의 생성된 pH 변화는 스트렙타비딘 접합체로부터 유로퓸 이온을 신속하게 해리시킨다. 이어서, 유리 유로퓸 이온은 이용가능한 킬레이터와 형광발생 킬레이트를 형성한다. 킬레이가 미셀을 형성할 수 있도록 하고, 킬레이트의 형광발생을 연장시킬 수 있는 TOPO의 존재하에 물을 제거한다.
- 5분간 인큐베이션시킨 후, 620 nm 방출 파장에서 시간 분해 형광을 측정한다. 형광 데이타를 수학식 1에 따라 특이 결합율(%)로 전환시킨다. 비오틴화된 huIL-6은 함유하나, 경쟁자는 함유하지 않는 대조군 웰로부터 전체 결합을 측정한다. 비오틴화된 huIL-6 및 100배 과량의 huIL-6을 함유하는 웰로부터 비특이 결합을 측정한다. 수학식 2에 따라 IC50 값을 계산하기 위해 결과 데이타를 S자 모양의 곡선으로 피팅한다.
생화학적 에피토프 경쟁 분석법을 위한 항체 코팅 및 비오틴화된 huIL-6 농도 측정
코팅을 위해 사용된 항체의 농도 및 에피토프 경쟁 분석법에 사용된 비오틴화된 huIL-6의 농도는 두 시약 상호작용의 친화도 및 항체 고정화 효율에 의존하게 될 것이다. 그러므로, 항체 코팅의 표준 농도 및 필요한 비오틴화된 huIL-6의 농도 는 시험하고자 하는 각 항체에 대해서 결정되어야 한다.
일반적으로 각 분석법에 사용되는 비오틴화된 huIL-6의 최종 농도는 포화 분석법에 의해 측정된 바, 상응하는 항체에 대한 리간드의 KD와 동일하다. 코팅에 사용되는 항체의 농도는 비오틴화된 huIL-6이 KD로 첨가되었을 경우, 경쟁 분석 조건하에서 검출될 때 최소 신호 대 배경의 비율이 10:1이 수득되어지는 농도이어야 한다.
항체-리간드 생화학적 분석법을 사용한 개선된 클론의 확인
비오틴화된 항 IL-6 항체(리드 단리로부터 유래된 실험실내 IgG, CAN022D10)에 결합하는 HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6(실험실내 E. 콜라이에서 유래됨)을 저해하는 것에 관해 리드 최적화로부터 얻은 선택 결과를 에피토프 경쟁 HTRF® 분석 포맷으로 스크리닝하였다.
5O nM MOPS 완충액 pH7.4, 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 소르비톨 중에서 제조된 원형질막공간 추출물을 함유하는 희석되지 않은 조 scFv로서 리드 최적화시 결과를 스크리닝하였다. 1 nM 인간 HIS FLAG IL-6을 크립테이트(CIS Bio International 61FG2KLB)로 표지화된 1.732nM 항-플래그 IgG와 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다. 분석 완충액에서 모든 희석을 수행하였다. 동시에, (이에 대해 시험 결합 구성원이 경쟁이 시험되는) 1 nM 비오틴화된 항-IL-6 IgG를 20 nM 스트렙타비딘 XLent!(™)(CIS Bio International 611SAXLB)과 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다.
시약을 사전에 인큐베이션시킨 후, 10 ㎕의 조 scFv 샘플을 블랙 384 웰의 옵티플레이트(optiplate)(Perkin Elmer 카탈로그 번호 6007279)에 첨가하였다. 이어서, 10 ㎕의 분석 완충액을 전체 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 10 ㎕의 사전에 인큐베이션된 항-IL-6 IgG 및 스트렙타비딘 XLent!(™) 믹스를 첨가한 후, 10 ㎕의 사전에 인큐베이션된 HIS FLAG 태깅된 인간 IL-6 항-플래그 크립테이트 믹스를 첨가하였다.
이어서, 분석 플레이트를 1분 동안 실온에서 1000 rpm으로 원심분리하고, 실온에서 2h 동안 인큐베이션시킨 이후에 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서, 인비젼 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 시간-해상 형광을 판독하였다. 데이타는 앞서 기술된 바와 같이 델타F(%) 및 특이 결합율(%)을 계산하여 데이타를 분석하였다.
무작위 돌연변이유발 라이브러리로부터 개선된 리드를 확인한 후, CDR3 표적화된 돌연변이유발 선택으로부터 얻은 희석되지 않은 조 scFv 결과를, 하기와 같은 변경 사항을 포함하는 에피토프 경쟁 HTRF® 분석법의 변형된 버젼으로 스크리닝하였다. 0.5 nM 인간 HIS FLAG IL-6을 크립테이트(CIS Bio International 61FG2KLB)로 표지화된 1.732nM 항-플래그 IgG와 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다. 동시에, 16 nM의 비오틴화된 항-IL-6 IgG(항체 5, CAN022D10 무작위 돌연변이유발 선택으로부터 확인된 실험실내 IgG)를 40 nM 스트렙타비딘 XLent!(™)(CIS Bio International 611SAXLB)와 함께 암실에서 실온하에 30분 동안 사전에 인큐베이션시켰다. 기타 모든 조건은 CAN022D10 에피토프 경쟁 분석법에 기술되어 있는 것과 같았다. 데이타는 앞서 기술된 바와 같이 델타F(%) 및 특이 결합율(%)을 계산하여 데이타를 분석하였다.
정제된 IgG에 의한, 내인성 IL-6에 의해 유도된 인간 활막 섬유모세포로부터의 VEGF 방출 저해
항생제를 함유하는 DMEM 중에 있는 관절 전체 대치 수술로부터 류마티스 관절염 무릎의 샘플을 얻었다. 배지에 담긴 윤활막을 관절로부터 절개하고, 미세하게 절단하였다. 윤활 조직은 10% FCS로 보충된 배지로 세척하였다. 세포 현탁액은 37℃ CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 콜라게나제 용액 중에서 인큐베이션시켰다. 10 ml 피펫을 통해 반복적으로 흡인시켜 분해된 윤활 세포 현탁액을 파괴시키고, 세포를 긴장시키고, 5분 동안 실온에서 400 g으로 원심분리하였다. 세포를, 10% FCS를 함유하는 DMEM에 재현탁시키고, 세포 여과체를 통해 통과시키고, 1 x 106 세포/mL로 조정하고, 225-㎠ 세포 배양 플라스크(3001, CoStar Corning Inc.) 중 37℃ CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 부착시킨 후, 대부분의 배지를 버리고, 새 배지로 교체하고, 장기간 인큐베이션시키기 위해 인큐베이터에 다시 놓았다. 세포를 매주 조사하고, ⅓의 계대율로 트립신 처리하여 융합시까지 계대접종하였다.
37℃에서 5 내지 10분 동안 플라스크 1개당 10 ml 0.1% 트립신-EDTA 용액 (25300-054, Gibco Life Sciences)과 함께 인큐베이션시켜 융합시 섬유모세포(P3-5)를 플라스크로부터 제거하였다. 10% FCS로 보충된 동량의 DMEM 기초 배양 배지를 세포에 가한 후, 이어서, RT에서 5분 동안 330 g로 원심분리하여 펠릿화하였다. 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지를 사용한 1차 세척 단계를 마친 후, 세포 현탁액(1 x105 세포/mL)을 웰당 1.5 x104개의 세포로 멸균 96 웰 세포 배양 클러스터 편평한 바닥 폴리스티렌 플레이트(3598, Corning CoStar)의 웰(150 ㎕/웰)에 가하였다. 추가의 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지를 각 웰(100 ㎕/웰)에 가하여 총 부피가 250 ㎕/웰이 되도록 하였다. 세포를 밤새도록 37℃에서 인큐베이션시켜 부착시키고 정지시켰다.
세포가 융합되어 있는지, 그리고 우수한 조건(예로서, 오염물 무함유)에 있는지를 확인하기 위하여 96-웰 플레이트를 검사하였다. 이어서, 배지를 웰로부터 흡인시키고, 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지 100 ㎕를 즉시 가하였다. 여기에 샘플 IgG를 함유하는 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지 50 ㎕를 또는 배지만을 단독으로 하여 50 ㎕를 웰에 가하였다(분석에서 1/5로 희석).
이어서, 재조합 인간 가용성(rhs)IL-6Rα(500 ng/mL; 12 nM) 및 rhIL-1β(50 pg/mL; 2.95 pM, 분석에서 1/5로 희석)을 함유하는, 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지를 50 ㎕/웰로 가하였다.
별도의 웰에는 rh-IL-6(0, 100 ng/mL; 21.5 nM), sIL-6Rα(500 ng/mL; 12 nM), rhIL-1β(50 pg/mL; 2.95 pM)을 함유하는 10% FCS로 보충된 DMEM 기초 배양 배지 50 ㎕를, 또는 배지만을 단독으로 하여 50 ㎕를 가하였다(분석에서 1/5로 희석). 각 웰의 최종 부피는 250 ㎕였다.
플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트 포맷에 기술되어 있는 바와 같이 이중으로 또는 삼중으로 웰에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 RT에서 5분 동안 330 g으로 원심분리시키고, 상등액 배지를 제거하고, 마이크로타이터 편평한 바닥 플레이트(611F96, Sterilin) 중 -4O℃에서 저장하였다.
제조사의 지침서에 따라 ELISA(DY293B, R&D Systems)를 사용하여 VEGF를 측정하였다. 간략하면, ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새도록 마우스 항-인간 VEGF 항체로 코팅하고, 1% BSA/PBS로 차단하였다. 플레이트를 0.05% 트윈 20/PBS으로 세척하고, 실온에서 밤새도록 인간 윤활 유래의 섬유모세포 배양 상등액과 비오틴화된 염소 항-인간 VEGF 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 VEGF를 검출하였다. 1:1 H2O2:테트라메틸벤지딘을 사용하여 플레이트를 현상시켰다. 2 M H2SO4을 사용하여 반응을 중단시키고, 보정 파장을 540 nm으로 설정하여 450 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다.
비아코어 측정
비아코어 2000™을 사용하여 비아코어 연구에 착수하였다. 아민 커플링 키트를 사용하여 CM-5 센서칩 표면에 항체를 커플링시켜 표면 밀도가 220-225 Ru이 되도록 하였다. HBS-EP 완충액 중 20O nM 내지 0.2nM 사이의 농도 범위의 인간 IL-6을 센서 칩 표면 상에 통과시켰다. BIA 평가 3.1 소프트웨어를 사용하여 생성된 센서그램을 평가함으로써 시험된 항체에 대한 k온, k오프 및 KD 값을 계산하였다.
IL-6에 의해 매개되는 B9 세포 증식 분석법
B9 세포는 IL-6에 대한 그의 특이적인 반응을 기초로 하여 선별된 뮤린 B 세포 하이브리도마 세포주, B13.29의 하위클론이다. B9 세포는 생존과 증식을 위해 IL-6을 필요로 하며, 매우 낮은 농도의 IL-6에 대해서도 반응을 한다.
IL-6에 의해 유도된 B9 세포 증식은 항체 18 및 이소타입 대조군(CAT-002) 존재에서 평가하였다. IL-6 표준 곡선(농도 범위 1 x 10-14 M 내지 1 x 10-9 M)에 대한 다양한 농도 범위의 각 항체(1 x 10-13 M 내지 1 x 10-9 M)의 효과를 평가하였다. 데이타 점은 이중으로 제시되었다. B9 증식은 4일간 인큐베이션시킨 후 알라마 블루 환원(형광법)에 의해 측정하였다.
B9 세포는 5% FCS, 2 mM L-글루타민 및 50 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640에서 배양하였다. 세포는 매 2일 내지 4일마다 0.05x106 mL-1 내지 0.1 x 106 mL-1 사이의 밀도로 분할하고, 5x10-13 M 인간 IL-6으로 보충하였다. 실험을 위해 사용되는 세포는 실험 전 적어도 48시간 동안은 IL-6으로 보충하지 않았지만, 실험 96시간 이내에는 보충하였다. 분석에 사용된 세포는 0.8x106 mL-1 이하의 밀도로 스톡 플라스크로부터 채취하였다.
각 항체를 분석 배지(RPMI +5% FCS, 2 mM L-글루타민, 50 μM 2-머캅토에탄올, 페니실린 100 UmL-1 및 스트렙토마이신 100 mgmL-1)에 적절히 희석시켜 스톡 용액으로부터 10 x 최대의 필요한 분석 농도로 희석시켰다. 배양 배지 중 추가로 10 배 희석시켜 각 항체의 필요한 농도를 얻었다.
적절한 부피의 멸균 PBS+0.1% BSA를 첨가하여 동결 분말로부터 1 x 10-5 M 용애으로 IL-6을 재구성하였다. 배양 배지에서 1 x 10-8 M으로 추가로 희석시켰다. 필요시까지 1 x 10-8 M 분취량을 냉동 보관하였다. 분석 수행일날 1 x 10-8 M 분취량을 필요에 따라 희석시켜 10x 필요한 최종 분석 농도의 용액 범위에 도달하였다.
필요한 부피의 세포를 배양 플라스크로부터 제거하고, 8분 동안 300 g로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 적절한 부피의 배양 배지에 세포를 재현탁시켜 세포 밀도가 0.5x106 mL-1이 되도록 하였다.
분석은 편평한 바닥의, 조직 배양물로 처리된 폴리스티렌 96 웰 플레이트에서 실시하였다. 최종 분석 부피는 200 ㎕였다. 20 ㎕의 1Ox 항체 (항체 18 또는 CAT-002) 용액 또는 배양 배지를 각 플레이트의 적절한 웰에 가한 후, 추가로 140 ㎕의 배양 배지 및 20 ㎕의 적절한 농도의 IL-6 또는 배양 배지를 가하였다.
플레이트를 2시간 동안 습윤화된 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에 놓았다. 이어서, 20 ㎕의 세포를 각 웰에 가하였다. 웰당 세포의 최종 갯수는 10000개였다. 이어서, 플레이트를 4일 동안 인큐베이터에 다시 놓았다. 세포 증식은 알라마 블루 혼입에 의해 평가하였다. 10% v/v 알라마 블루를 각 웰에 가하고, 플레이트를 6시간 동안 인큐베이터에 다시 놓았다. 이어서, 플레이트를 590 nm에서 형광을 측정한 후, 544 nm에서 여기를 측정하는 분광 형광계 상에서 판독하였다. 미가공 데이타를 각 플레이트 상의 대조군 IL-6으로 정규화하여 최대 형광은 100%로 한정하고, 기본 형광은 0%로 한정하였다. 그래프패드 프리즘 4.01 중 비선형 회귀, S자 모양의 용량-반응(가변 기울기)을 사용하여 정규화된 데이타를 피팅하였다. 대조군 pEC50 값 및 각 농도의 항체 존재하의 pEC50 값을 사용하여 용량 비율(DR: dose ratio)를 결정하였다. Kb 값은 하기 화학적 길항작용 수학식을 사용하여 IL-6 농도-효과 곡선에서 3배 이상의 변동을 유도한 최저 농도의 항체에 대하여 결정되었다:
Kb =([Ab]/(DR-I))
(문헌 [Kenakin TP. In: Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interactions. 1st ed. New York: Raven Press; 1987. p. 205-24.])
IL-6에 의해 매개되는 SKW6.4 세포 IgM 방출 분석법
IL-6은 B 세포가 최종적으로 항체 생산 세포로 성숙화되는데 관여한다(B-림프구 분화). SKW 세포는 앞서 B 세포 반응 연구에 사용된 바 있다(문헌 [Nawata et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 557:230-238. 1989]). 류마티스 관절염에서 자가항체 생산은 주로 IgM 부류에 의해 이루어진다. SKW6.4는 클론성 IgM 분비 인간 림프아구양 B 세포주이다. 세포는 참조번호 TIB 215로, ATCC로부터 공급받았다. IL-6으로 자극하였을 때 이들 세포는 IgM을 분비하는 바, 이로써, 이러한 분석법은 류마티스 관절염에 관련이 있는 것으로 이해되었다.
IL-6에 의해 유도된 SKW6.4 세포 IgM 분비를 CAT6001 및 CAT-002(이소타입 대조군) 존재하에 평가하였다. 100 pM IL-6 존재하에 다양한 농도의 각 항체(1 x 10-12.5 M 내지 1 x 10-8 M)의 효과를 평가하였다. 데이타 점은 이중으로 제시되었다. 세포 상등액 중 IgM 분비는 4일간 인큐베이션시킨 후 항-인간 IgM ELISA 분석법을 사용하여 측정하였다. 데이타 점은 이중으로 제시되었다.
상대 습도 95%, 95/5% (v/v) 대기/CO2하에 37℃에서 2 mM L-글루타민 및 10% (v/v) 우태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 중에서 SKW 6.4 세포를 배양하였다. 세포는 0.4 내지 2 x 106 세포/ml로 유지시켰다. 통상적인 세포 계대접종을 위해 실온에서 5분 동안 300xg으로 원심분리하여 세포를 회수하고, 폐 배지를 제거하고, 필요한 부피의 새로운 배지에 세포를 재현탁시켰다.
각 항체를 분석 배지(RPMI +10%FCS, 2 mM L-글루타민)에 적절히 희석시켜 스톡 용액으로부터 5O x 최대의 필요한 분석 농도로 희석시켰다. 배양 배지 중 추가로 10배 희석시켜 각 항체의 필요한 농도를 얻었다.
분석은 편평한 바닥의, 조직 배양물로 처리된 폴리스티렌 96 웰 플레이트에서 실시하였다. SKW 6.4 세포 스톡을 새 배지 중 세포 밀도 0.3x106 ml-1로 희석시키고, 100 ㎕/웰(30,000 세포/웰)로 플레이팅하였다. 각 웰에 지정된 최종 농도로 2 ㎕의 항체를, 이어서, 100 pM 최종 농도로 2 ㎕의 IL-6을 가하였다.
이어서, 플레이트를 37℃ 5% CO2 인큐베이터에 다시 놓았다. 4일 동안 인큐베이션시킨 후 원심분리하여 무세포 상등액을 회수한 후, 수거 당일 IgM ELISA에 의해 분석하거나, 추가 분석에 앞서 -20℃에서 냉동시켰다.
세로테크(Serotec)로부터 얻은 한쌍의 항체를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 코팅 항체는 마우스 항-인간 IgM(MCA1662)이고, 검출 항체는 염소 항-인간 IgM: HRP 결합(STAR98P)이었다. 분석법을 표준 방법에 의해 최적화시켜 1:2000 희석율의 코팅 항체(5 ㎍/ml) 및 1:3500 희석율의 검출 항체(200 ng/ml)를 사용함으로써 우수한 신호 대 잡음비를 수득하였다.
IgM 표준 용액(카탈로그 번호 PHP003 인간 M 카파 정제된 단백질)을 세로테크로부터 구입하여 표준 곡선을 작성하였다.
데이타는 표준 피팅 프로그램을 사용하여 IgM 표준 곡선 데이타에 대한 다항식 적합도를 사용함으로써 분석하였다. 항체 부재하의 대조군 IgM 생산에 대한 각 항체 샘플의 저해율(%)을 계산하고, IC50 값을 얻었다.
에피토프 지도화를 위한 IL-6 및 IL-6 돌연변이체 단백질 생성
인간 및 사이노 IL-6 cDNA
인간 및 마카쿠 IL-6의 서열을 Emb1로부터 입수하였다(인간 및 사이노에 대해 각각 수탁 번호: BC015511 및 AB000554). 이들 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하여 인간 & 마카쿠 IL-6을 코딩하는 cDNA을 증폭시켰다. N-말단 프라이머는 인간 및 사이노에 대해 각각 hIL6_5'NdeI 및 macIL6_5'NdeI이고, macIL6_3'NheI를 둘 모두에 대한 C 말단 프라이머로서 사용하였다(올리고뉴클레오티드 서열에 대해서는 표 11을 참조한다).
Figure 112009027151458-pct00004
2개의 cDNA를 증폭시키는 PCVR 반응을 수행하였다. 각 PCR 반응에 대한 주형은 각각 인간 간 및 사이노몰구스 간으로부터 수득한, 10 ng의 cDNA였다. 각 반응으로부터 얻은 증폭된 cDNA를 정제하고, 제조사에 따라 토포이소머라제 결찰 반응을 사용하여 pCR4blunt topo(Invitrogen)로 클로닝하였다.
양성 클론을 확인하고 서열화하였다. 생성된 cDNA는 표준 기법을 사용하여 성숙한 인간 또는 사이노몰구스 IL-6을 코딩하는 cDNA가 N-말단에서 성숙한 IL-6의 N-말단 발린의 상류에 인접하게 위치하는 N-말단 HIS6-FLAG 태그 어느 한쪽과 융합될 수 있도록 하는 방식으로 다양한 E. 콜라이 T7-프로모터 발현 벡터 내로 하위클로닝시켰다.
돌연변이체 생성
제조사의 프로토콜에 따라 스트라테이진(Stratagene)으로부터 입수한 퀵체인지 XL(Quikchange XL)을 사용하여 부위 지정 돌연변이유발을 실시하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 돌연변이유발 프라이머 디자인을 실시하였다. 주형으로서 플라스미드 pT7플래그HISIL-6을 사용하여 프로토콜에 따라 돌연변이유발 반응을 수행하였다. 이어서 DpnI 분해하고, 화학적으로 적격한 Top10 세포로 형질전환시키고, 밤새도록 37℃에서 적절한 항생제를 함유하는 아가 플레이트 상에서 선택하였다. 각각의 개별 돌연변이유발 반응을 위해 수개의 클론을 서열화하고, 각 반응으로부터 얻은 하나의 올바른 클론의 플라스미드 DNA를 추가 사용을 위해 보유하였다.
IL-6 및 IL-6 돌연변이체 단백질 발현
제조사의 방법에 따라 IL-6 발현 플라스미드를 화학적으로 적격한 BL21(DE3) 스타 세포(Invitrogen)로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 사용하여 1 L의 테러픽 브로쓰(Terrific Broth) 배양물에 접종하고, 이들은 A600이 0.5에 도달할 때까지 37℃ 궤도형 인큐베이터 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, IPTG를 0.25 mM으로 가하고, 22℃에서 밤새도록 계속하여 인큐베이션시켰다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 세포 펠릿을 -80℃에서 저장하였다.
IL-6 및 IL-6 돌연변이체 단백질 정제
세포 펠릿을 해동시키고, 펠릿당 5O mM 인산칼륨, pH7.4, 1O mM 이미다졸, 0.3 M NaCl, 5 mM 베타-머캅토에탄올, 10% 글리세롤 (완충액 A) + 완전한 EDTA 무함유 프로테아제 저해제(Roche) 50 ml 중에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 3 x 30초 동안 초음파처리하여 세포를 용해시켰다. 용해물은 30분 동안 4℃에서 100,000g으로 원심분리하고, 상등액을 Ni NTA 친화성 크로마토그래피하였다. 5 ml의 Ni-NTA 수퍼플로우 칼럼(Qiagen)을 (완충액 A)를 사용하여 3ml/분으로 평형화시켰다. IL-6 샘플을 로딩하고, 완충액 A 중 10 칼럼 부피의 15 mM 이미다졸을 사용하여 칼럼을 세척하였다. 이어서, 완충액 A 중 10 칼럼 부피의 3O mM 이미다졸을 사용하여 세척하였다. 완충액 A 중 5 칼럼 부피의 0.3 M 이미다졸을 사용하여 상향 흐름식 방향으로 세척하여 IL-6을 칼럼으로부터 용리시켰다. 세척 단계시 10 ml의 분획을 수집하고, 용리 단계시에 5 ml의 분획을 수집하였다. AKTA 익스플로러100 에어(AKTA Explorer100 Air)를 사용하여 4℃에서 칼럼을 전개시켰다. 정제된 IL-6 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새도록 5 L의 PBS에 대해 투석시켰다.
겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 투석된 IL-6 단백질을 추가로 정제하였다. 각각의 정제를 위해 투석된 IL-6 단백질을 20분 동안 100,000g 및 4℃에서 원심분리하였다. 2.5ml/분으로 PBS 중에서 평형화된 318 ml의 수퍼덱스(Superdex) 200 26/60 칼럼(GE Healthcare)에 13 ml까지 가하였다. AKTA 정제기를 사용하여 4℃에서 칼럼을 전개시켰다. 추가 분석을 위해 단량체 IL-6 단백질 피크를 함유하는 분획을 풀링하였다.
표준 SDS-크로마토그래피를 사용하여 각 단백질의 순도를 체크하고, 단백질 농도를 측정하고, Q-ToF 질량분광법을 사용하여 단백질 질량을 측정하였다. 정제된 IL-6을 액상 질소에서 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
생체내 연구를 위한 물질 및 방법
동물을 무작위로 시험군으로 지정하였다. 이어서 각 시험군에 있는 마우스를 매일 한 세트의 피하 투여량(1O ml/kg)의 비히클 대조군(PBS 중 0.05% BSA) 또는 467 ㎍/kg IgG1 이소타입 대조군 또는 항체 18(범위 467 ㎍/kg 내지 8 ㎍/kg)로 처리하였다. 동시에 마우스에 비히클 대조군(PBS 중 0.05% BSA) 또는 12 ㎍/kg 인간 재조합 IL-6를 복강내 주사(10 ml/kg) b.i.d.하였다.
7일째 09:00h에 최종적으로 IL-6을 투여한 후 2시간이 경과한 후에 마우스를 희생시키고, 최종의 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액을 Lab Tek 1 ml EDTA 혈액 튜브로 옮기고, 이를 5분 동안 롤러에 놓았다. 이어서, 사용시까지 샘플을 보관하였다. 시스스멕스(Sysmex) 세포 계수기를 사용하여 분화 세포를 계수하였다. 남은 샘플은 에펜도르프 튜브로 옮기고, 회전시켜(30O g, 5분) 혈장을 수득하고, 이를 소분취시키고, 합토글로빈 수준 분석시까지 -20℃에 저장하였다.
바이오그노시스(Biognosis)의 페이스™ 레인지 트리델타 포맷(PHASE™ RANGE TriDelta Format) 키트(영국 헤일샴 소재; 카탈로그 번호 TP-801)에 제공되는 지침서에 따라 합토글로빈 분석법을 수행하였다.
모든 결과는 평균±SEM으로 표시하였다. 데이타는 독립 표본 T-검정(unpaired T-test) 또는 일원 ANOVA에 이어서, 던네트(Dunnett) 검정(GraphPad Instat)에 의해서 분석하였다.
서열
결합 구성원의 VH 도메인, VL 도메인 및 CDR 서열은 첨부된 서열 목록에 제시되어 있으며, 여기서, 서열 번호는 하기와 같다:
Figure 112009027151458-pct00005
Figure 112009027151458-pct00006
Figure 112009027151458-pct00007
항체 7, 10, 17 및 18의 서열은 생식세포화된 것이다.
참고문헌
상기 인용된 문헌을 포함하여 본 명세서 전체에서 인용된 문헌 모두 모든 목적을 위해 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.
Figure 112009027151458-pct00008
Figure 112009027151458-pct00009
Figure 112009027151458-pct00010
Figure 112009027151458-pct00011
Figure 112009027151458-pct00012
Figure 112009027151458-pct00013
Figure 112009027151458-pct00014
SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca AB MedImmune Limited <120> Compounds <130> 102483-1 CAT082 IL-6 ligand <150> US60/861,704 <151> 2006-11-30 <160> 185 <170> CAT version 1.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 1 gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccatcagc agcaactaca tgatttgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctccgat ctttattatt atgctggtga cacatattac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca tttccaagaa caccgtgtat 240 cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acgggtgtct attattgtgc gagatgggcc 300 gatgaccact actattacat tgacgtctgg ggcaggggca ccctggtcac cgtctcgagt 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ala Asp Asp His Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 3 Ser Asn Tyr Met Ile 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 4 Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 5 Trp Ala Asp Asp His Tyr Tyr Tyr Ile Asp Val 5 10 <210> 6 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CAN022D10 <400> 6 gacatcgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gggtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggagagccc ctaaggtctt gatctataag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat 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atgctggtga cacatattac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca tttccaagaa caccgtgtat 240 cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attattgtgc gagatgggcc 300 gatgaccacc cggcctgggt ggacctctgg ggcaggggca ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 07 <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ala Asp Asp His Pro Ala Trp Val Asp Leu Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 07 <400> 53 Ser Asn Tyr Met Ile 5 <210> 54 <211> 17 <212> 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240 cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acgggtgtct attattgtgc gagatgggcc 300 gatgaccacc cccggtacat cgaccactgg ggcaggggca ccctggtcac cgtctcgagt 360 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 08 <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ala Asp Asp His Pro Arg Tyr Ile Asp His Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 08 <400> 63 Ser Asn Tyr Met Ile 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 08 <400> 64 Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr 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gggggtacat tgacgtctgg ggcaggggca ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 10 <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Glu Glu Glu Gly Arg Gly Tyr Ile Asp Val Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 10 <400> 73 Ser Asn Tyr Met Ile 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 10 <400> 74 Asp Leu Tyr Tyr Tyr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 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Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Ala Met 210 <210> 180 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Arg58Glu mutant full length IL-6 <400> 180 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Glu Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 181 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Glu200Trp mutant full length IL-6 <400> 181 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Trp Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 182 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Arg207Leu mutant full length IL-6 <400> 182 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Leu Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 183 <211> 33 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <223> Primer macIL6_5'NdeI <400> 183 ttatcatatg gtactcccag gagaagattc caa 33 <210> 184 <211> 30 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <223> Primer macIL6_3'NheI <400> 184 ttatgctagc ctacatttgc cgaagagccc 30 <210> 185 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Primer hIL6_5'NdeI <400> 185 ttatacatat ggtaccccca ggagaagatt cc 32

Claims (73)

  1. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 인간 IL-6에 대한 단리된 항체 분자로서,
    HCDR1이 서열 번호 113의 아미노산 서열을 가지고;
    HCDR2가 서열 번호 114의 아미노산 서열을 가지고;
    HCDR3이 서열 번호 115의 아미노산 서열을 가지고;
    LCDR1이 서열 번호 118의 아미노산 서열을 가지고;
    LCDR2가 서열 번호 119의 아미노산 서열을 가지고;
    LCDR3이 서열 번호 120의 아미노산 서열을 가지는 것인 단리된 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, VH 및/또는 VL 도메인의 프레임워크 부위가 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열로 생식세포화된 것인 단리된 항체 분자.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 112의 아미노산 서열을 가진 VH 도메인 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 포함하는 단리된 항체 분자.
  5. 제1항에 따른 단리된 항체 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역 질환 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 따른 단리된 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제7항에 따른 단리된 핵산 분자로 시험관내 형질전환된 숙주 세포.
  9. 삭제
  10. 삭제
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  73. 삭제
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