CN105198995A - 白介素-6的结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合白介素-6(IL-6)和中和其生物学作用的结合成员，如人抗体分子。本发明还提供IL-6的结合成员在医疗，例如治疗与IL-6有关的炎性疾病和肿瘤中的应用。

Description

白介素-6的结合成员
本申请是2007.11.28提交的CN200780044214.7以及其分案201310446215.1，题为“白介素-6的结合成员”的分案申请。
本发明涉及抑制IL-6的生物学作用的结合成员，特别是抗体分子。该结合成员可用于治疗与IL-6有关的疾病，包括炎性疾病和肿瘤。
白介素6(IL-6)是各种细胞类型，包括刺激的成纤维细胞、单核细胞和内皮细胞产生的26kDa多效促炎细胞因子，它们构成了IL-6的主要体内来源。细胞如T细胞、B细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、成骨细胞和几种其它细胞受刺激后可产生IL-6。IL-6也由肿瘤细胞系和肿瘤细胞，例如肺癌、前列腺癌、骨髓瘤、肾上腺样瘤和心脏粘液瘤的细胞表达[1,2]。在非炎症条件下，IL-6由脂肪组织分泌[3]。
IL-6表达的调节取决于产生它的细胞。在多发性骨髓瘤细胞中，IL-6似乎以正反馈环路起作用–刺激细胞生长和产生更多的IL-6[4,5]。在其它细胞类型中，IL-6似乎能抑制细胞的生长和激活，并可用作一些促炎细胞因子的负调节物。
为了启动细胞信号转导，IL-6以低亲和力结合跨膜受体IL-6受体α(也称为IL-6Rα、IL-6Ra、IL-6R、gp80或CD126)，形成"IL-6:IL-6Ra"复合物。这种复合物与gp130信号受体结合；IL-6Rα和gp130一起形成高亲和IL-6结合位点，并诱导形成由IL-6、IL-6Ra和gp130各两拷贝组成的六聚体[6]。信号转导不需要IL-6Ra的跨膜和胞质结构域，因为IL-6Ra也存在可溶分泌形式(sIL-6R或sIL-6Ra)。可溶受体由IL-6Ra信使的差异剪接或蛋白质水解脱落产生。sIL-6R能够与IL-6形成配体-受体复合物"IL-6:sIL-6Ra"。这种复合物可结合细胞上的gp130，从而在gp130阳性细胞中启动细胞信号转导，即使这些细胞不表达IL-6Ra。因此，sIL-6R具有加宽IL-6响应性细胞的范围的潜能，认为它在IL-6-介导的炎症中起到重要作用[7]。
人IL-6配体的晶体结构已经阐明[6]。也已得到了人IL-6Ra胞外结构域的晶体结构[8]和IL-6/IL-6R/gp130复合物的六聚体结构[9]。将这些结构与诱变研究相结合后，在IL-6表面上鉴定到参与IL-6与各种受体组分形成复合物的功能活性的三个位点。位点1残基参与IL-6和IL-6Ra的相互作用。位点2残基参与IL-6和gp130细胞因子结合域的相互作用。IL-6的位点3残基参与与六聚体复合物中第二个gp130的Ig-样结构域的相互作用。也已鉴定到IL-6上的第四个位点，在该位点上IL-6与IL-6/IL-6R/gp130六聚体复合物中的第二个IL-6分子相互作用[10]。
已经分离到许多抗-IL-6配体单克隆抗体。已经进行作图研究，研究显示它们结合于人IL-6表面上如上所述的不同结合位点[11,12,13,14,15]。
也已产生许多抗-IL-6Ra单克隆抗体，对它们在IL-6Ra上的结合位点绘图[16,14,15,17]。
IL-6属于细胞因子家族，该家族包括白介素-11(IL-11)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、制瘤素M(OsM)、白血病抑制因子(LIF)、心肌营养素样细胞因子(CLC)和心肌营养素1(CT-1)。该家族的各成员具有其自身的特定受体α亚基，并与共同受体亚基gp130形成复合物。对胚胎而言，靶向破坏gp130基因是致死性的[18,19]。所有IL-6家族成员均可诱导肝细胞表达急性期蛋白质。
IL-6信号转导包括通过JAK家族激酶的酪氨酸磷酸化，接着激活两种主要的胞内信号转导级联反应，即SHP2/ERKMAPK和STAT1/3通路，通过NF-IL-6和AP-1导致基因表达[18,20]。
IL-6显示出广谱生物学功能，包括：造血、诱导急性期反应、T细胞激活、刺激抗体分泌、抵御感染的宿主防御、骨髓瘤细胞和破骨细胞激活[21,22]。有关IL-6效应的综述参见参考文献[23]。IL-6最初鉴定为T细胞产生的B细胞分化因子[24]，但随后鉴定为许多细胞类型的强效激活物和生长促进因子。它诱导B细胞最终成熟为产生抗体的细胞，是T细胞活化和增殖的必需辅助因子。研究证明，IL-6参与了自身反应性T淋巴细胞的活化以及细胞毒性T细胞的增殖和分化。已证明，IL-6作为辅因子参与了造血过程，引起造血干细胞的活化和分化。IL-6对急性期反应的作用也有记录[25]。IL-6诱导人肝细胞产生各种急性期蛋白质，包括纤维蛋白原、α-抗-糜蛋白酶、血清淀粉样蛋白A和C-反应性蛋白质。急性期蛋白质控制免疫应答和炎症，并对组织重建有影响。在各种疾病中，IL-6的血清水平与C反应性蛋白质的血清水平良好相关，这提示IL-6在急性期反应中的病因作用。也已证明，IL-6可由成骨细胞产生，似乎参与破骨细胞活化和骨再吸收[26，27，28]。自相矛盾的是，提示IL-6不仅可用作促炎细胞因子，而且在某些情况和细胞类型中可削弱其它促炎细胞因子的作用，导致炎症减轻。
由于IL-6具有多种生物学作用，所以IL-6水平升高可能是各种疾病病症中的关键细胞因子。已证明，在多种疾病，如类风湿性关节炎、卡斯特尔曼代病(Castleman’sdisease)、青少年特发性关节炎和克罗恩病[29]中循环IL-6水平升高。因此，IL-6参与驱动这些炎性病症的病理。而且，已证明IL-6能刺激多种肿瘤类型，包括黑色素瘤、肾细胞癌、卡波济氏肉瘤、卵巢癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤和前列腺癌[30]。另外，已报道在若干癌症中IL6循环水平升高。在一些癌症病症中，IL-6水平升高已用作该疾病的预后指标。
由于IL-6在疾病中的作用，已经开发了多种鼠和嵌合抗-人IL-6单克隆抗体作为潜在疗剂。
US5856135描述衍生自小鼠单克隆抗体"SK2"的IL-6的重构人抗体。
JP-10-66582报道IL-6的嵌合抗体，它能够识别IL-6的螺旋D区(位点1)。
WO2004/020633(EP1536012)记载了用噬菌体展示技术分离的IL-6的人scFv抗体分子。据报道，scFv的亲和力为13nM。
鼠抗-IL-6抗体艾思莫单抗(elsilimomab)(也称为B-E8)已经用于治疗多发性骨髓瘤[31，32]、肾细胞癌[33]和类风湿性关节炎[34]患者，在所治疗的所有三种疾病的患者中观察到某些诊断标记有改进。BE-8也已用于治疗HIV-阳性的免疫母细胞或多形大细胞淋巴瘤[35]患者，在约50％患者中全身症状(即发热、发汗、恶病质)缓解和淋巴瘤的自发生长受抑制。
然而，此种抗体的快速清除和由于对艾思莫单抗产生人抗-小鼠抗体(HAMA)而可能引起过敏反应限制了它的临床应用[36]。
通常，鼠单克隆抗体的临床应用受限，因为这种抗体常常诱导HAMA。常常对小鼠免疫球蛋白的Fc部分产生HAMA，导致抗-IL-6mAb快速清除和可能的过敏反应[36]。也知道，小鼠抗体在人体中的药代动力学特性不同于人抗体，其半衰期较短，清除率提高。
为了降低鼠抗体在人体内的免疫原性，构建具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。已经用嵌合的人-小鼠抗-IL-6抗体cCLB8(称为CNTO328)治疗多发性骨髓瘤患者[5，37]，在大部分患者中观察到疾病稳定下来。
然而，虽然嵌合抗体的免疫原性低于鼠MAb，但已报道人抗-嵌合抗体(HACA)反应[38]。
对cCLB8进行作图研究，该研究显示，它是IL-6活性的位点I抑制剂。Brakenhoff等[39]证明，cCLB8能结合IL-6氨基端缺失变体Pro46、Ser49、Glu51、Ile53、Asp54，也能结合缺失变体Asp62和Met77(虽然亲和力降低)。同一作者证明，在B9细胞增殖实验中cCLB8抑制野生型IL-6，但不抑制C末端缺失5，cCLB8不结合最后4个C末端氨基酸残基缺失的IL-6delC-4。这些数据表明，cCLB8结合包含IL-6的C末端残基的表位。
Kalai等[17]证明，cCLB8无法识别IL-6突变体F106E、F102E/F106E或R207E/R210E。然而，该抗体能识别IL-6突变体R207E和R207W。cCLB8与突变体R207W和R207E的结合性能约为野生型的50％，这表明残基F106和R210参与了cCLB8结合表位，残基R207参与结合但影响低于残基F106和R210。cCLB8结合IL-6位点-I突变体R196M、K199N/Q203L和Q203L，与野生型相比其活性为100％。Brakenhoff等[13]证明，cCLB8结合以下IL-6变体：Q182H、N183K、W185Q、W185G、W185R、T190P、Q182H/Q184P、W185R/S197N、Q187E/T190P、I164L/L186R/M189I，这并不令人惊讶，因为其中大部分与IL-6位点1残基相隔甚远。
使用人源化的抗-IL-6Ra抗体托珠单抗(也称为hPM-1、MRA和Actemra)进一步强调了在癌症和炎性疾病中抑制IL-6信号转导的有利作用。这是人源化的鼠抗-IL6Ra抗体PM-1。用这种抗体治疗患者对多种疾病有效，这些疾病包括类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、克罗恩氏病、骨髓增殖性疾病、卡斯特尔曼代病和系统性红斑狼疮[40]。
我们已经成功地分离到IL-6的高效、高亲和力结合成员。由于本发明结合成员亲和力和功效高，以及在本文所述功能研究中的性能，所以本发明结合成员特别适用于人体或动物体的治疗性和诊断性治疗。
结合成员可用于治疗与IL-6有关的疾病，如本文其它地方详述。
与现有方法相比，用于治疗炎性疾病和癌症的人抗-IL-6抗体具有显著优点。例如，与非人或嵌合抗体相比，人抗体不诱导HAMA或HACA反应并且体内半衰期较长。
我们也认识到，与IL-6Ra的结合成员相比IL-6结合成员具有显著优点，特别是在体内给药和治疗方面，如本文其它地方所述。
如实施例部分更详细描述的，我们分离含有如表7所示一组CDR序列的亲代抗体分子(CAN022D10)。通过优化，我们产生了一组抗体克隆：抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23，CDR序列衍生自亲代CDR序列且在表7所示位置上含有取代。
因此，例如，从表7可观察到，抗体2具有Kabat残基35被Thr取代的亲代HCDR1序列(SEQIDNO：13)。抗体14和22在HCDR3中含有额外残基，即氨基酸插入：在Kabat残基100D处含有Ile，亲代HCDR3序列SEQIDNO:5中没有这个残基。抗体7、8、10、16-19、21和23的LCDR3中不含Kabat残基95，而亲代LCDR3(SEQIDNO:10)在Kabat残基95上含有Pro。所有抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23的亲代HCDR3和HCDR3序列均在Kabat残基95上含有Trp，在Kabat残基101上含有Asp，这表明H95Trp和H101Asp可能促进本发明结合成员对IL-6的结合和/或功效。
亲代抗体CAN022D10和本文所述抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23的VH结构域、VL结构域和CDR序列见所附序列表。
如下文所详述，本发明结合成员能够高效地中和IL-6。中和表示抑制IL-6的生物学活性。本发明的结合成员可以中和IL-6的一种或多种生物学活性。被抑制的生物学活性一般是IL-6与一种或多种其结合伙伴结合。例如，被抑制的生物学活性可以是IL-6与跨膜和/或可溶性IL-6Rα的结合。这在以下试验中得到证实，这里简单描述了这些试验，其详述见下文：TF-1试验证明，本发明结合成员抑制IL-6与膜IL-6Ra的结合，因为TF-1细胞似乎不产生可溶性IL-6Ra。同样，本发明结合成员抑制IL-6与膜受体的结合。在滑膜成纤维细胞试验中，本发明结合成员抑制IL-6与可溶性IL-6Ra的结合，因为需要将sIL-6Ra加入该试验中它才能起作用。加入的IL-1β诱导产生内源性IL-6，被本发明结合成员抑制时能防止产生VEGF。
按照本发明，人或非人灵长动物如短尾猴的IL-6与IL-6Rα的结合可被抑制，例如结合成员可抑制成熟的人IL-6与IL-6Rα的结合。
可以部分或完全抑制生物学活性。与不存在结合成员时的活性相比，结合成员可以将IL-6生物学活性抑制100％，或至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。
可测定结合成员的中和效力。除非另有表述，效力通常表示为以nM计的IC50值。在功能试验中，IC50是将生物学反应从其最高值降低50％的结合成员浓度。在配体结合研究中，IC50是使配体-受体复合物形成水平降低最大特异性结合水平的50％的浓度。可通过绘制最高生物学反应％与log(结合成员浓度)的函数图，利用诸如图垫公司(GraphPad)的Prism或起源实验室(OriginLabs)的Origin等软件程序来计算IC50，从而能根据数据拟合S形函数以产生IC50值。可采用本领域技术人员已知或本文所述或述及的一种或多种试验测定或检测效力。
在本文所述试验，如TF-1增殖试验或其它下述细胞试验中结合成员中和IL-6活性表明该结合成员能结合和中和IL-6。可用于测定结合成员与IL-6的结合的其它方法包括ELISA、Western印迹、免疫沉淀、亲和层析和生化实验。
本文所述结合成员能够结合和中和内源性人IL-6的生物学作用，如本文实施例1.7和2.7中所报道的抑制人滑膜成纤维细胞响应内源性人IL-6而释放VEGF的试验所证实的。在本试验中，来自类风湿性关节炎患者的滑膜成纤维细胞响应IL-1β和可溶性IL-6Rα刺激产生IL-6，导致IL-6诱导的VEGF分泌。因此，人滑膜成纤维细胞产生的IL-6代表内源性人IL-6。内源性IL-6是对人进行医学治疗的分子靶点，因此中和内源性IL-6是结合成员治疗潜能的重要指标。由于利用获自类风湿性关节炎患者的滑膜成纤维细胞进行该试验，所以结果与使用结合成员治疗类风湿性关节炎特别相关。VEGF释放试验中检测的优化抗体分子的中和效力超过了已知的抗IL-6抗体CNTO-328。
在用0.6pM人IL-1β和2.4nM可溶性人IL-6Rα刺激的人滑膜成纤维细胞释放VEGF的抑制试验中本发明结合成员的IC50可能小于50nM，例如小于5nM，例如小于1nM。
已知内源性IL-6是糖基化和非糖基化形式的混合物。在滑膜成纤维细胞试验中证明了本发明结合成员与内源性IL-6的结合，因为该试验利用人滑膜成纤维细胞产生的IL-6，即内源性IL-6。
本发明结合成员可抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖。TF-1是从红白血病患者建立的人早幼粒细胞系(premyeloidcellline)(Kitamura等，1989)。TF-1细胞系的存活和增殖需要存在生长因子。TF-1细胞可响应的各生长因子包括IL-6、GM-CSF和制瘤素M。在抑制TF-1细胞对20pM人IL-6起反应而增殖的试验中，本发明结合成员的IC50可能小于100nM，例如小于20nM、10nM或1nM，例如小于100pM、70pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。如本文所述(参见实施例1.5)，已证明亲代IgG"CAN022D10"在TF-1增殖实验中的IC50为约93nM，我们随后产生效力显著提高的CAN022D10的优化变体(IC50通常小于100pM)，如实施例2.2、2.5和2.6所示(分别为表3、4和5)。尤其是一些优化克隆的IC50值检测为低至5pM或更低，例如种系化的IgG抗体7、抗体17和抗体18，这表示这些抗体的中和效力极高。
本发明结合成员可抑制IL-6诱导的B9细胞增殖。B9细胞是根据对IL-6的特异性应答选择的鼠B-细胞杂交瘤细胞系B13.29的亚克隆。B9细胞的存活和增殖需要IL-6，对极低浓度的IL-6起反应。因此，可评估IL-6抗体存在下这些细胞的增殖，并测定抗体的亲和力。本文所述实施例2.10证明，抗体18能抑制B9细胞响应于IL-6的增殖，并在此实验中显示高亲和力。
类风湿性关节炎中产生的自身抗体主要是IgM类型的抗体。SKW6.4是分泌IgM的克隆的人类淋巴母细胞B细胞系。用IL-6刺激后，这些细胞分泌IgM，因此认为该实验与类风湿性关节炎有关。可通过测定对IL-6起反应而分泌IgM的抑制，利用SKW6.4细胞测定结合成员中和IL-6的功效。在抑制对100pM人IL-6起反应而分泌IgM的SKW6.4细胞测定中，本发明结合成员的IC50可以小于10pM，例如小于5pM。已证明在该实验中抗体18能中和IL-6的作用-参见实施例2.11(表9)。
本发明提供人IL-6的高亲和结合成员。也显示与短尾猴的IL-6的高亲和力。本发明结合成员可结合人IL-6和/或短尾猴IL-6，其KD不超过1nM，例如不超过100pM、50pM、30pM或10pM。可通过表面等离振子共振，例如测定KD。利用测定亲和力的方法如本文实施例2.9所述。明显的是，发现抗体7和18的亲和力超过利用设备的测量极限，因此表明KD值低于10pM。
如本文它处所述，表面等离振子共振包括使分析物在液相中流过与支持物相连的配体，并测定分析物与配体之间的结合情况。例如，可使得IL-6在液相中流过与支持物相连的结合成员来实施等离振子共振。可将表面等离振子共振数据拟合至单价分析物数据模型。可采用单价分析物数据模型通过表面等离振子共振测定速度常数之比kd/ka，由该速度常数之比计算亲和力常数Kd。
或者，可通过席尔德(Schild)分析计算结合成员与IL-16的亲和力，例如根据抑制TF-1细胞对不同浓度人IL-6起反应而增殖的实验。经过席尔德分析计算，本发明结合成员的亲和力可小于10pM，例如小于1pM。如本文实施例2.10所报道，通过席尔德分析计算的抗体18与人IL-6的亲和力为0.4pM。
任选地，本发明结合成员可不与以下一种或多种、或者全部物质交叉反应：白血病抑制因子(LIF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、IL-11或制瘤素M。
任选地，本发明结合成员可不与大鼠IL-6、小鼠IL-6和/或犬IL-6交叉反应。
可在(例如)抑制人IL-6与支持物上固定的结合成员结合的时间分辨荧光实验，如实施例16所述的表位竞争实验中检测结合成员结合其它蛋白质或非人IL-6的交叉反应性。例如，在抑制标记人IL-6与支持物上固定的结合成员结合的时间分辨荧光实验中，可能LIF、CNTF、IL-11、制瘤素M、大鼠IL-6和小鼠IL-6中任何一个或全部均不显示抑制、小于50％抑制，或者IC50大于0.5mM或大于1mM。例如，在检测交叉反应性的时间分辨荧光实验中，可能LIF、CNTF、IL-11、制瘤素M、大鼠IL-6和小鼠IL-6中任何一个或全部均不显示抑制，或者IC50比未标记人IL-6高至少10倍或100倍。在该实验中，以与结合成员相互作用的Kd相等的终浓度使用标记的成熟野生型人IL-6。
本发明结合成员可与短尾猴IL-6交叉反应。在上述时间分辨荧光实验中，通过标记人IL-6与支持物上固定的结合成员结合的抑制，测定交叉反应性。例如，在此时间分辨的荧光实验中，短尾猴IL-6的IC50可以小于5nM，例如小于2.5nM，例如约1nM。在此实验中，短尾猴IL-6的IC50与未标记人IL-6的IC50的差异可以小于10倍，例如小于5倍。
材料和方法章节提供了测定交叉反应性的时间分辨荧光实验的详细方案。本实验获得的交叉反应数据的例子见实施例1.6的表2。
如实施例2.8所报道，本文所述结合成员与短尾猴IL-6有高交叉反应性，而与大鼠、小鼠或犬IL-6无交叉反应性或交叉反应性有限。
交叉反应数据表明，本文所述结合成员结合在人和短尾猴IL-6序列之间保守，而与人序列相比在小鼠、大鼠和犬IL-6序列中不同的IL-6表位。
相信本文所述结合成员能结合IL-6的"位点1"区，该区是与IL-6Rα相互作用的区域。因此，本发明结合成员可竞争性抑制IL-6与IL-6Rα的结合，从而中和IL-6Rα介导的IL-6的生物学作用。
我们研究了本文所述抗体之一——抗体18结合在位点1残基上经工程改造产生突变的突变型人IL-6的能力。如实施例3所述，我们鉴定到人IL-6中导致抗体18结合能力下降的突变，表明这些突变残基参与了抗体18的识别，并可能形成该抗体结合的IL-6表位的一部分。
例如，在抑制标记野生型人IL-6与支持物上固定的抗体18结合的时间分辨荧光实验中，用Arg207Glu突变型人IL-6(SEQIDNO：177)没有观察到抑制，这表明抗体18能结合人IL-6的残基Arg207。
由于抗体18和抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、19、21、22和23均衍生自亲代抗体CAN22C10，且均具有结构相关的CDR，预计所有这些抗体分子能结合相同或非常相似的重叠表位。因此，也预计用抗体18获得的表位作图结果能代表CAN22D10，本文所述的另一优化抗体。
本发明结合成员可结合人IL-6的Phe102和/或Ser204。本发明结合成员也可结合人IL-6的Arg207。任选地，除结合Phe102和/或Ser204外，结合成员还可结合IL-6分子中的侧接残基或结构相邻残基。按照惯例，残基编号对应于全长人IL-6(SEQIDNO:161)。然而，可利用成熟的人IL-6测定结合。通过如下所述的定点诱变测定与IL-6残基的结合。
本领域技术人员熟知为将结构与活性相联系而诱变蛋白质的单个氨基酸和多个区域，该方法用于确定蛋白质中与抗体结合的区域[41]。可利用结合和/或中和突变型人IL-6来评估结合成员是否结合Phe102、Ser204和/或Arg207。与野生型相比，与突变型IL-6不能结合或中和，或结合或中和作用显著降低表明结合成员结合该突变残基。
可以在抑制标记的野生型人IL-6与支持物上固定的结合成员结合的时间分辨荧光实验中,利用所选残基突变的IL-6测定与IL-6残基的结合，其中标记的野生型成熟人IL-6的终浓度等于它与该结合成员相互作用的Kd。实施例3中说明了这种实验的例子和获得的竞争数据，结果见表10。当突变型IL-6不抑制标记的野生型IL-6与结合成员的结合时，或者当突变型IL-6的IC50大于未标记的野生型IL-6时(例如超过10倍或100倍)，表明突变残基与结合成员结合。
在抑制标记的野生型人IL-6与支持物上固定的本发明结合成员的结合的时间分辨荧光实验中，Phe102Glu突变型人IL-6(SEQIDNO：175)、Ser204Glu突变型人IL-6(SEQIDNO：176)和/或Arg207Glu突变型人IL-6(SEQIDNO：177)可能显示无抑制，或者其IC50比野生型人IL-6(SEQIDNO：165)的IC50高100倍，其中标记的野生型人IL-6的终浓度等于它与结合成员相互作用的Kd。
任选地，本发明结合成员可以不结合和/或中和在残基Phe102、Ser204和/或Arg207处含有突变，例如突变Phe102Glu、Ser204Glu、Ser204Tyr和/或Arg207Glu的突变型人IL-6。突变型人IL-6序列的例子是SEQIDNO：175-177。因此，本发明结合成员可能不抑制一种或多种这些突变型IL-6分子与IL-6Rα的结合。
本发明结合成员可包含抗体分子，例如人抗体分子。结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。结合成员的VH和VL结构域也作为本发明的部分提供。各VH和VL结构域内是互补决定区(“CDR”)和构架区(“FR”)。VH结构域包含一组HCDR，VL结构域包含一组LCDR。抗体分子可包含含有VHCDR1、CDR2和CDR3及构架区的抗体VH结构域。或者其还可包含含有VLCDR1、CDR2和CDR3及构架区的抗体VL结构域。VH或VL结构域构架区包含散布有CDR的四个构架区FR1、FR2、FR3和FR4，结构如下：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本发明的抗体VH和VL结构域以及CDR的例子见随附的构成本文一部分的序列表。其它CDR见下文和表7。本文披露的所有VH和VL序列、CDR序列、多组CDR和多组HCDR及多组LCDR代表着本发明的诸方面和实施方式。本文所述的“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一组LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有表述，“CDR组”包括HCDR和LCDR。本发明的结合成员通常是单克隆抗体。
本发明的结合成员可包含非抗体分子内的抗原结合位点，通常由非抗体蛋白质支架中的一个或多个CDR，如一组CDR提供，下文将进一步讨论。
本文描述了包含母体CAN022D10的表7所示亲代组CDR的结合成员，其中HCDR1是SEQIDNO:3(Kabat残基31-35)、HCDR2是SEQIDNO:4(Kabat残基50-65)、HCDR3是SEQIDNO:5(Kabat残基95-102)、LCDR1是SEQIDNO:8(Kabat残基24-34)、LCDR2是SEQIDNO:9(Kabat残基50-56)和LCDR3是SEQIDNO:10(Kabat残基89-97)。
本发明结合成员可包含本文所述一个或多个CDR，例如CDR3，还任选包含CDR1和CDR2，从而形成一组CDR。CDR或CDR组可以是亲代CDR或亲代CDR组，或者可以是抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23中任一种的CDR或CDR组，或者可以是其变体，如本文所述。
例如，本发明的结合成员或VL结构域可包含具有氨基酸序列SEQIDNO：120的LCDR3。
结合成员可包含亲代抗体或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23中任何抗体的H和/或LCDR组，所述H和/或LCDR组中含有一个或多个氨基酸突变。氨基酸突变是一个氨基酸的取代、缺失或插入。例如，H和/或LCDR组内可能有至多20个，例如至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变，如取代。例如，HCDR3中可能有至多6、5、4、3或2个突变，例如取代，和/或LCDR3中可能有至多6、5、4、3或2个突变，例如取代。任选地，与所述的H和/或LCDR组相比，HCDR3和/或LCDR3可含有一个氨基酸的插入或缺失。例如，取代可以是在抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23中任何抗体中取代的位置，如表7所示。因此，取代可以任选地发生在选自下组的Kabat编号上：
HCDR1中的Kabat残基35；
HCDR2中的Kabat残基64；
HCDR3中的Kabat残基96、97、98、99、100、100A、100B、100C和/或102；
LCDR1中的Kabat残基34；
LCDR3中的Kabat残基89、90、91、92、93、94、96或97。
氨基酸突变可包含表7所示的突变，例如所示氨基酸取代。
例如，本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基Ile35被Thr或Val取代的亲代HCDR1。
本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基Lys64被Arg取代的亲代HCDR2。
结合成员或VH结构域可包含含一个或多个以下突变的亲代HCDR3：
Kabat残基Ala96被Glu取代；
Kabat残基Asp97被Glu或Asn取代；
Kabat残基Asp98被Gly、Glu或His取代；
Kabat残基His99被Gly或Thr取代；
Kabat残基Tyr100被Pro、Asn、Arg、Trp或Ala取代；
Kabat残基Tyr100A被Ala、Arg、Thr、Gly、Asn、Pro或Ser取代；
Kabat残基100B被His、Trp、Gln、Pro或Thr取代；
Kabat残基Ile100C被Ala、Val、His、Tyr或Leu取代；
Ile插入Kabat残基100D；
Kabat残基Val102被Leu、His、Met或Ile取代。
因此，本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基100D是Ile或Kabat残基100D不存在的HCDR3。
本发明结合成员或VL结构域可包含Kabat残基Ala34被Thr取代的亲代LCDR1。
本发明VL结构域的结合成员可包含含有一个或多个以下突变的亲代LCDR3：
Kabat残基Gln89被Met或Ala取代；
Kabat残基Gln90被Asn、Ser或Ala取代；
Kabat残基Ser91被Asn、Gly、Ala或His取代；
Kabat残基Tyr92被Trp、Ser、Lys或Phe取代；
Kabat残基Ser93被Leu、Lys、Arg或Ala取代；
Kabat残基Thr94被Ala、Gly或Pro取代；
Kabat残基Pro95缺失；
Kabat残基Trp96被Gly取代；
Kabat残基Thr97被Ser取代。
因此，本发明结合成员或VL结构域可包含Kabat残基95是Pro或Kabat残基95不存在的LCDR3。
本发明提供分离的人IL-6结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR含有来自一组CDR的22个或更少的氨基酸改变，例如至多21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个改变或无改变，其中：
HCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:3；
HCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:4；
HCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:115；
LCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:8；
LCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:9；和
LCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:120。
氨基酸改变可以是取代、插入或缺失。下面讨论可取代的Kabat位置的例子和残基取代的例子，表7说明一些取代。
如表7所示，在本文所述不同优化抗体之间，HCDR3和LCDR3的长度有差异。相对于CAN022D10的亲代CDR，在一些抗体中观察到Kabat残基100至102之间的插入(如表7所示，Kabat残基100D)，在其它抗体中观察到Kabat残基92至97之间的缺失。Kabat残基95的缺失并未与插入同时出现。因此，对较长的12残基HCDR3序列与较长的9残基LCDR3序列组合可能有利，且对较短的11残基HCDR3序列与较短的8残基LCDR3序列组合可能有利。
按照Kabat编号系统，LCDR3的残基编号为89至97。Kabat编号系统没有考虑短于9个残基的LCDR3序列。在本发明中，结合成员可能含有短于9个残基的LCDR3，例如LCDR3的长度可能是8个残基，如表7所示。我们将LCDR3的8个残基分别编号为89、90、91、92、93、94、96和97。因此，在表7中，缺失出现在Kabat残基95上。然而应理解，缺失的作用是缩短LCDR3序列，原则上认为缺失可以在残基89至97，例如残基92至97中的任何残基上发生。
在HCDR3中，Kabat编号系统通过在Kabat残基100和101之间延伸编号系统而能容纳CDR长度变化，例如适当地包括残基100A是9个残基的HCDR3，加上100B是10个残基的HCDR3，加上100C是11个残基的HCDR3，加上100D是12残基的HCDR3。在表7中，相对于亲代HCDR3在一些优化克隆的HCDR3中插入额外氨基酸显示在Kabat残基100D处。然而应理解，原则上认为这种插入可以在Kabat残基100至102中的任何位置上发生。
如本文所述，结合成员的一个或多个CDR，例如HCDR3和/或LCDR3中可能出现一个或多个插入或缺失。例如，本发明结合成员可包含抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体或其变体(本文所述)的一组CDR，其中各CDR任选包含插入以使该CDR延长一个残基，或者包含一个残基的缺失以使该CDR缩短一个残基。可以在HCDRs和/或LCDR，例如HCDR3和/或LCDR3中产生插入和/或缺失。
例如，结合成员可包含含有20个或更少的氨基酸取代的一组CDR，其中：
HCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:3；
HCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:4；
HCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:115；
LCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:8；
LCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:9；和
LCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:120；
其中结合成员任选含有一个残基的插入以使HCDR3延长一个残基，或者包含一个残基的缺失以使HCDR3缩短一个残基，和/或
含有一个残基的插入以使LCDR3延长一个残基，或者包含一个残基的缺失以使LCDR3缩短一个残基。
本发明结合成员可以在HCDR3SEQIDNO:115中包含一个残基的插入和/或在LCDR3SEQIDNO:120中包含一个残基的插入。
插入或缺失可以在CDR中任何位点上产生。例如，在HCDR3中，插入或缺失可以出现在Kabat残基95-102的任何位置，例如Kabat残基100-102的任何位置上。例如，在LCDR3中，插入或缺失可以出现在Kabat残基89至97的任何位置，例如Kabat残基92至97的任何位置上。
本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基35是Ile、Thr或Val的HCDR1。
本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基64是Lys或Arg的HCDR2。
本发明结合成员或VH结构域可包含Kabat残基95是Trp和/或Kabat残基101是Asp的HCDR3。
本发明结合成员或VH结构域可包含HCDR3，其中：
Kabat残基96是Ala或Glu；
Kabat残基97是Asp、Glu或Asn；
Kabat残基98是Asp、Gly、Glu或His；
Kabat残基99是His、Gly或Thr；
Kabat残基100是Pro、Tyr、Asn、Arg、Trp或Ala；
Kabat残基100A是Pro、Tyr、Ala、Arg、Thr、Gly、Asn、Pro或Ser；
Kabat残基100B是Trp、Tyr、His、Gln、Pro或Thr；
Kabat残基100C是Ile、Ala、Val、His、Tyr或Leu；和
Kabat残基102是Leu、Val、His、Met或Ile。
本发明结合成员或VL结构域可包含Kabat残基34是Ala或Thr的LCDR1。
本发明结合成员或VL结构域可包含LCDR3，其中：
Kabat残基89是Gln、Met或Ala；
Kabat残基90是Gln、Asn、Ser或Ala；
Kabat残基91是Ser、Asn、Gly、Ala或His；
Kabat残基92是Trp、Tyr、Ser、Lys或Phe；
Kabat残基93是Leu、Ser、Lys、Arg或Ala；
Kabat残基94是Gly、Thr、Ala或Pro；
Kabat残基96是Gly或Trp；和
Kabat残基97是Ser或Thr。
本发明提供包含亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如表7所示的亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的一组CDR的结合成员。
例如，本发明结合成员可包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1是SEQIDNO：113；HCDR2是SEQIDNO：114；HCDR3是SEQIDNO：115；LCDR1是SEQIDNO：118；LCDR2是SEQIDNO：119；和LCDR3是SEQIDNO：120，代表抗体18的CDR。
结合成员可包含这些抗体之一的一组VHCDR。其还可任选包含这些抗体之一的一组VLCDR，所述VLCDR可以来自与VHCDR相同或不同的抗体。
本发明也提供包含亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的一组HCDR的VH结构域，和/或包含亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的一组LCDR的VL结构域。
VH结构域通常与VL结构域配对以提供抗体抗原-结合位点，虽然如下文进一步讨论的，VH或VL结构域可单独用于结合抗原。抗体2VH结构域可与抗体2VL结构域配对，从而形成同时包含抗体2VH和VL结构域的抗体抗原-结合位点。提供了本文所述其它VH和VL结构域的类似实施方式。在其它实施方式中，抗体2VH与该抗体VL以外的VL结构域配对。本领域熟知轻链混杂。本发明还提供了本文所述其它VH和VL结构域的类似实施方式。
因此，亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的VH可与亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的VL配对。
结合成员可以包含在抗体构架中具有一个或多个CDR，例如一组CDR的抗体分子。例如，可以将抗体的一个或多个CDR或一组CDR嫁接入构架(例如，人构架)以提供抗体分子。构架区可以来自人种系基因区段序列。因此，可以将构架种系化(germlined)，从而将构架内的一个或多个残基更换以与大多数相似的人种系构架中等价位置处的残基相匹配。技术人员可以选择序列最接近种系化之前的抗体构架序列的种系区段，并在本文所述试验中测试该抗体的亲和力或活性以证实种系化未明显降低抗原结合或效力。本领域技术人员已知人种系基因区段序列，可通过例如Vbase编译(软件)存取。
本发明结合成员可以是具有人种系构架区中包含一组HCDR的VH结构域，例如Vh3_DP-86_(3-66)的分离的人抗体分子。因此，VH结构域构架区FR1、FR2和/或FR3可包含人种系基因区段Vh3_DP-86_(3-66)的构架区，和/或可通过突变构架残基以匹配这种人种系基因区段的构架残基而种系化。FR4可包含人种系j区段JH2的构架区。VHFR1的氨基酸序列可以是SEQIDNO:167。VHFR2的氨基酸序列可以是SEQIDNO：168。VHFR3的氨基酸序列可以是SEQIDNO:169。VHFR4的氨基酸序列可以是SEQIDNO:170。
结合成员通常还具有VL结构域，其包含例如人种系构架区，如Vk1_L12中的一组LCDR。因此，该VL结构域构架区可包含人种系基因区段Vk1_L12的构架区FR1、FR2和/或FR3，和/或可通过突变构架残基以匹配这种人种系基因区段的构架残基而种系化。FR4可包含人种系j区段JK2的构架区。VLFR1的氨基酸序列可以是SEQIDNO:171。VLFR2的氨基酸序列可以是SEQIDNO:172。VLFR3的氨基酸序列可以是SEQIDNO:173。VLFR4的氨基酸序列可以是SEQIDNO:174。
种系化的VL结构域可以在一个或多个微调残基(Vernierresidue)处种系化或不在一个或多个微调残基处种系化，但通常不在一个或多个微调残基处种系化。
本发明的抗体分子或VH结构域可包含下组重链构架区：
FR1SEQIDNO:167；
FR2SEQIDNO:168；
FR3SEQIDNO:169；
FR4SEQIDNO:170；
或者，包含的所述一组重链构架区含有1、2、3、4或5个氨基酸改变，例如取代。
本发明的抗体分子或VL结构域可包含下组轻链构架区：
FR1SEQIDNO:171；
FR2SEQIDNO:172；
FR3SEQIDNO:173；
FR4SEQIDNO:174；
或者，包含的所述一组轻链构架区可含有1、2、3、4或5个氨基酸改变，例如取代。
氨基酸改变可以是取代、插入或缺失。
例如，本发明抗体分子可包含一组重链和轻链构架区，其中：
重链FR1是SEQIDNO：167；
重链FR2是SEQIDNO：168；
重链FR3是SEQIDNO：169；
重链FR4是SEQIDNO：170；
轻链FR1是SEQIDNO：171；
轻链FR2是SEQIDNO：172；
轻链FR3是SEQIDNO：173；
轻链FR4是SEQIDNO：174；
或者，包含的所述一组重链和轻链构架区含有10个或更少，例如5个或更少的氨基酸改变，例如取代。例如，在所述一组重链和轻链构架区中可以有1或2个氨基酸取代。
与种系化抗体分子相比，未种系化的抗体分子具有相同的CDR，但构架不同。在本文所附序列表的抗体序列中，7、10、17和18号抗体的序列是种系化的。可通过种系化这些抗体中本文所示VH和VL结构域序列的构架区产生种系化抗体2-5、8、14、16、19和21-23。
这些抗体的表达的scFv和IgG序列中包含抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23的κVL结构域的核苷酸和氨基酸序列中显示的3'cgt密码子和相应的精氨酸残基。该序列的C末端精氨酸残基对应于Kabat残基108。下文解释此残基的来源和其编码三联体cgt。
为表达IgG的轻链，提供了编码抗体轻链的核苷酸序列，包含编码VL结构域的第一外显子，编码CL结构域的第二外显子，将第一外显子与第二外显子隔开的内含子。在正常情形下，细胞mRNA加工机制剪接掉内含子，从而使第一外显子的3’端与第二外显子的5’端相连。因此，当具有所述核苷酸序列的DNA表达为RNA时，该第一和第二外显子剪接在一起。翻译该剪接的RNA可产生包含VL结构域和CL区的多肽。
恒定区的选择很重要，因为对κ轻链而言，桥接氨基酸是cga密码子形成的精氨酸，其中第一个胞嘧啶由外显子1编码，鸟嘌呤和腺嘌呤由外显子2编码。
剪接后，对抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23而言，Kabat残基108处的Arg由VL结构域构架4序列的最后一个碱基(c)和CL区的前两个碱基(gt)编码。
Kabat残基108处的精氨酸残基可以认为是抗体分子的VL结构域的C末端残基。
本发明的结合成员可以是与任何结合成员竞争结合IL-6的结合成员，所述任何结合成员(i)结合IL-6且(ii)包括本文披露的结合成员、VH和/或VL结构域、CDR如HCDR3和/或CDR组。
不难在体外检验结合成员之间的竞争，例如采用ELISA和/或用特定的报道分子给一种结合成员作标记(可在一种或多种其它未标记的结合成员存在下检测)，从而能鉴定结合相同表位或重叠表位的结合成员。本领域普通技术人员不难了解这类方法，更详细的描述参见本文(参见详述和实施例中材料和方法章节的表位竞争实验)。因此，本发明另一方面提供含有人抗体抗原-结合位点的结合成员，它与抗体分子，例如含有VH和/或VL结构域，CDR例如亲代抗体或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的HCDR3或CDR组的抗体分子竞争结合IL-6。
在其它方面，本发明提供包含编码本发明结合成员、VH结构域和/或VL结构域的分离核酸，以及制备本发明结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，包括在致使产生所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸并回收之。
本发明另一方面提供编码本文披露的VHCDR或VLCDR序列的核酸，通常是分离的。
另一方面提供含有本发明核酸或用本发明核酸转化的宿主细胞。
本发明其它方面提供含有本发明结合成员的组合物，和它们在结合、抑制和/或中和IL-6的方法中的应用，包括治疗人或动物体的方法。
本发明的结合成员可用于治疗或诊断方法，例如治疗(可包括预防性治疗)人体或动物体(如人患者)的疾病或病症的方法，该方法包括给予所述患者有效量的本发明结合成员。可按照本发明治疗的病症包括IL-6在其中起作用的任何病症，如本文它处详述的。
下文进一步详述了本发明的这些和其它方面。
术语
本文中应指出，本文使用“和/或”之处应理解成具体公开了两种所述特征或组分的每一种，包括或不包括另一种。例如，“A和/或B”应该理解成具体公开了(i)A、(ii)B及(iii)A和B中每一种，就如同各自在本文中专门列出一样。
IL-6和IL-6受体
IL-6是白介素6。IL-6在本文中也可称为"抗原"。
人IL-6的全长氨基酸序列是SEQIDNO：161。在体内切割此种序列，以去除N末端先导肽，产生成熟的IL-6。成熟的人IL-6具有氨基酸序列SEQIDNO:165。成熟序列代表体内循环的IL-6，它是本文所述治疗性和体内诊断应用的靶抗原。因此，在本文中IL-6通常指成熟的人IL-6，除非另有说明。
IL-6可偶联于可检测标签，如HISFLAG，例如用于本文所述的实验。例如，可使用包含偶联于HISFLAG序列的IL-6的融合蛋白。HISFLAG标记的人IL-6的序列是SEQIDNO:162。
IL-6受体a，即IL-6Ra是白介素6的受体。IL-6Ra也称为IL-6Rα、IL-6Ra、IL-6R和CD126。IL-6Ra在体内以跨膜形式和可溶形式存在。IL-6Ra可以是跨膜IL-6Ra和/或可溶性IL-6Ra，除非另有说明。
在本文中，IL-6受体通常指人IL-6受体，除非另有说明。人可溶性IL-6Ra(sIL-6Ra，sIL-6R)的氨基酸序列是SEQIDNO:163。人跨膜IL-6Ra的氨基酸序列是SEQIDNO:164。
IL-6与IL-6Ra结合形成复合物IL-6:IL-6Ra。该复合物可以是可溶性(与sIL-6Ra)或膜结合的(与跨膜IL-6Ra)。当IL-6Ra为可溶形式时，该复合物称为IL-6:sIL-6Ra。IL-6:IL-6Ra可包含与跨膜IL-6Ra或与可溶性IL-6Ra形成复合物的IL-6，除非另有说明。
gp130
gp130是IL-6:IL-6Ra复合物的受体。gp130的克隆和鉴定方法参见Hibi等，Cell63:1149-1157(1990)。人gp130的序列见SEQIDNO:166。
结合成员
该术语描述了彼此结合的一对分子中的一个成员。结合对的成员可以天然产生或完全或部分合成产生。分子对的成员在其表面具有一定区域或空腔，从而能与该分子对另一成员的特定空间和极性结构结合，因此与之互补。结合对的类型的例子是抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
结合成员通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是抗体分子或含有抗原结合位点的非抗体蛋白。
可通过在例如纤连蛋白或细胞色素B等非抗体蛋白质支架上排列CDR[42,43,44]，或通过使蛋白支架内环的氨基酸残基随机化或突变来提供抗原结合位点，从而能赋予对所需靶标的结合特异性。Nygren等[44]总结了用于工程改造蛋白质中新型结合位点的支架。抗体模拟物的蛋白支架披露于通过引用全文纳入本文的WO/0034784，其中发明人描述了包含具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。可通过免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供要嫁接入一个或多个CDR，例如一组HCDR的合适支架。所述支架可以是人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优点之一是其可在至少比一些抗体分子更小和/或更易于操作的支架分子中提供抗原结合位点。结合成员的体积小可赋予有用的生理学特性，例如能进入细胞、更深地穿透入组织或与其它结构内的靶标反应，或结合于靶抗原的蛋白质空腔内。Wess，2004[45]总结了非抗体蛋白质支架中的抗原结合位点的用途。蛋白质通常具有稳定的骨架和一个或多个可变环，其中所述一个或多个环的氨基酸序列经专门或随机突变从而产生与靶抗原结合的抗原结合位点。这些蛋白质包含金黄色葡萄球菌(S.aureus)A蛋白、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如，第10个III型纤连蛋白结构域)、脂笼蛋白以及γ-晶体和其它AffilinTM支架(丝耳蛋白质(ScilProteins))的IgG-结合结构域。其它方法的例子包括基于环肽(cyclotide)的合成"微体"-含有分子内二硫键的小蛋白质，微生物蛋白(VersabodiesTM，阿缪尼克斯公司(Amunix))和锚蛋白重复蛋白(DARPins，分子伙伴公司(MolecularPartners))。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，本发明的结合成员可包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折叠域，或赋予该分子除结合抗原的能力以外的另一种功能特征。本发明结合成员可携带可检测标记物，或者可与毒素或靶向部分或酶偶联(例如，通过肽键或接头)。例如，结合成员可包含催化位点(例如，在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中所述抗原结合位点与抗原结合，因此将催化位点靶向抗原。催化位点可以，例如通过切割来抑制抗原的生物学功能。
虽然知道非抗体支架可携带CDR，但本发明的携带CDR或一组CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或其实质部分，其中CDR或CDR组位于重排的免疫球蛋白基因编码的天然产生VH和VL抗体可变区的CDR或CDR组的相应位置。可参考Kabat，等，1987[46]和其更新确定免疫球蛋白可变区的结构和位置。可通过多个学术和商业在线资源查询该数据库。例如，参见参考文献[47]和相关在线资源，目前可访问网址http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html。
通过CDR区域或CDR是要表明Kabat等，1991[48]和随后的版本定义的免疫球蛋白的重链和轻链的超变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文利用术语CDR表示(视情形而定)这些区域中的一个或几个或甚至全部，这些区域含有负责通过抗体与其识别的抗原或表位的亲和力来结合的大多数氨基酸残基。
在6个短CDR序列中，重链的第三CDR(HCDR3)的体积可变性较大(主要是因为产生它的基因重排机制而导致差异较大)。其可短至2个氨基酸，虽然已知的最长体积是26。CDR长度也可按照特定的潜在构架区所能提供的长度变化。功能上，HCDR3在确定抗体特异性方面起部分作用[参考文献49、50、51、52、53、54、55、56]。
HCDR1的长度可以是5个氨基酸，由Kabat残基31-35构成。
HCDR2的长度可以是17个氨基酸，由Kabat残基50-65构成。
HCDR3的长度可以是11或12个氨基酸，由Kabat残基95-102组成，任选包含Kabat残基100D。
LCDR1的长度可以是11个氨基酸，由Kabat残基24-34构成。
LCDR2可以是7个氨基酸长，由Kabat残基50-56构成。
LCDR3的长度可以是8或9个氨基酸，由Kabat残基89-97组成，任选包含Kabat残基95。
抗体分子
该术语描述了无论天然或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖包含抗体抗原-结合位点的任何多肽或蛋白质。在本文中必须知道，本发明不涉及天然形式的抗体，即它们不处于其天然环境中，但它们能经纯化从天然来源分离或获得，或者可通过遗传重组或化学合成获得，它们随后可含有非天然氨基酸，下文将进一步描述。含有抗体抗原-结合位点的抗体片段包括但不限于：诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd等分子。现已工程改造包含一个或多个抗体抗原-结合位点的各种其它抗体分子，包括例如，Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和小抗体。抗体分子及其构建和使用方法参见[57]。
可能利用单克隆抗体或其它抗体并采用重组DNA技术等技术来产生结合靶抗原的其它抗体或嵌合型分子。这些技术可包括引入编码免疫球蛋白可变区，或抗体的CDR，或不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区的DNA。参见，例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400，和大量的后续文献。可对产生抗体的杂交瘤或其它细胞作出遗传突变或其它改变，从而可改变或不改变所产生抗体的结合特异性。
由于可以多种方式修饰抗体，术语“抗体分子”应理解成涵盖具有所需特异性，具有抗体抗原-结合位点和/或能与抗原结合的任何结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括含有抗体抗原-结合位点的任何多肽，而无论其是天然或完全或部分合成的。因此包括包含抗体抗原-结合位点并与另一多肽(例如，衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚类)融合的嵌合型分子，或其等价物。EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量的后续文献描述了嵌合型抗体的克隆和表达。
抗体工程改造领域中可用的其它技术能分离人和人源化抗体。例如，可如Kontermann和Dubel[58]所述制备人杂交瘤。例如以下许多出版物详细描述了产生结合成员的另一种现有技术-噬菌体展示：Kontermann和Dubel[58]以及WO92/01047(下文进一步讨论)和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404。
可利用转基因小鼠分离人抗体，该小鼠中小鼠抗体基因被灭活并功能性替换为人抗体基因，但小鼠免疫系统的其它组分维持完好[59]。可利用本领域已知技术，例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US565,332和WO93/17105所述的技术产生人源化抗体。另外，WO2004/006955记载了使抗体人源化的方法，该方法基于：将非人抗体可变区CDR序列的经典CDR结构类型与人抗体序列，例如种系抗体基因区段的文库中相应CDR的经典CDR结构类型作比较，以便选择人抗体基因中的可变区构架序列。具有与非人CDR相似的经典CDR结构类型的人抗体可变区形成一个人抗体序列成员亚组，从中选择人构架序列。还可通过人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性对该亚组成员进行排序。在WO2004/006955的方法中，选择排序靠前的人序列提供构架序列，以便利用所选亚组成员人构架区，以非人CDR对应物功能性替代人CDR序列来构建嵌合抗体，从而在无需比较非人和人抗体的构架序列的情况下提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体。也公开了按照该方法制备的嵌合抗体。
可借助合成的寡核苷酸产生基因，并将该基因装配在合适的表达载体中，从而表达产生合成的抗体分子，如Knappik等[60]或Krebs等[61]所述。
现已证明完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域构成的dAb片段[62,63,64]；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab')2片段，其是包含两个连接的Fab片段的一种二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，从而能连接两个结构域以形成抗原结合位点[65,66]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”，多价或多特异性片段(WO94/13804；[67])。可通过包含连接VH和VL结构域的二硫键来稳定Fv、scFv或双抗体分子[68]。还可制备包含与CH3结构域相连的scFv的小抗体(minibody)[69]。结合片段的其它例子是Fab’，其与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端加入少许残基，包含抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸，以及Fab’-SH，其是恒定区的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’片段。
Qui等[70]记载了仅含通过构架区连接的两个CDR的抗体分子。将VH或VL结构域的CDR3连接于其它结构域的CDR1或CDR2环。通过FR区将所选CDR1或CDR2的C末端与CDR3的N末端连接。Qui等选择具有最少疏水性区域的FR区。发现所检测抗体的最佳组合是通过VHFR2连接的VLCDR1和VHCDR3(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)。分子量约为3kDa时，与完整免疫球蛋白分子(约150kDa)或scFv(约28kDa)相比这些抗体分子具有组织穿透性提高的优点。
可由亲代抗体分子或抗体分子2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中的任何抗体开始，通过诸如酶消化，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原切割二硫桥，获得本发明抗体片段。在另一种方式中，可通过本领域技术人员熟知的遗传重组等技术，或者借助，例如自动肽合成仪，如应用生物系统公司(AppliedBiosystems)等公司提供的那些仪器通过肽合成或通过核酸合成和表达来获得本发明的抗体片段。
本发明的功能性抗体片段包括通过化学修饰，特别是通过PEG化，或通过掺入脂质体而增加了半衰期的任何功能性片段。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体性抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区[64]。VHdAb在驼科动物(例如，骆驼、美洲驼)中天然产生，并可通过用靶抗原免疫驼类动物，分离抗原特异性B细胞和直接克隆各B细胞的dAb基因来产生。还可在细胞培养物中产生dAb。体积小、溶解性良好和温度稳定性使得它们在生理学上特别有用，从而适于选择和亲和力成熟。正在开发的治疗用羊驼VHdAb的商品名为"纳米抗体(Nanobody)TM″。本发明的结合成员可以是包含基本上如本文所述的VH或VL结构域或包含基本上如本文所述一组CDR的VH或VL结构域的dAb。
双特异性或双功能抗体构成将两个不同的可变区组合在同一分子中的第二代单克隆抗体[71]。现已证明它们因能募集新的效应功能或靶向肿瘤细胞表面的几种分子而可用于诊断领域和治疗领域。如果要利用双特异性抗体，这些抗体可以是用常规方法[72]，例如化学方法制备或从杂交瘤制备的常规双特异性抗体，或者可以是上述双特异性抗体片段的任一种。这些抗体可通过化学方法[73,74]或体细胞方法[75,76]获得，但也可优选通过遗传改造技术以迫使进行异二聚化，因而促进所寻求抗体的纯化过程[77]。双特异性抗体的例子包括BiTETM技术获得的那些抗体，其中可以利用特异性不同的两种抗体的结合结构域并通过短的柔韧性肽直接相连。该抗体在短的单一多肽链上组合两种抗体。可只利用可变区构建不含Fc区的双抗体和scFv，从而可能降低抗独特型反应的效应。
可将双特异性抗体构建成完整的IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或者双特异性scFv。此外，可采用本领域已知的常规方法连接两个双特异性抗体以形成四价抗体。
与完整的双特异性抗体相反，双特异性双抗体可能还特别有用，因为它们不难构建以及在大肠杆菌中表达。采用噬菌体展示(WO94/13804)不难从文库中选择结合特异性合适的双抗体(和许多其它多肽，例如抗体片段)。如果要将双抗体的一根臂维持恒定，例如对IL-6的特异性，则可制备另一臂不同的文库并选择特异性合适的抗体。可如Ridgeway1996[78]所述通过交替工程改造方法制备完整的双特异性抗体。
本领域可采用各种方法获得针对IL-6的抗体。这些抗体可以是单克隆抗体，特别是人、鼠科、嵌合型或人源化来源的，这些抗体可通过本领域技术人员熟知的标准方法获得。
就制备单克隆抗体或它们的功能片段，特别是鼠源的而言，通常可能表示手册“Antibodies(抗体)”[79]特别描述的技术或如和Milstein[80]所述从杂交瘤制备的技术。
单克隆抗体可以从，例如用IL-6或含有所述单克隆抗体识别表位的IL-6片段之一免疫的动物的B细胞获得。本文记载了包含它们的合适的片段和肽或多肽，这些片段和肽或多肽可用于免疫动物以产生针对IL-6的抗体。尤其可按照常规方法，通过自含有编码IL-6或其片段的cDNA序列的核酸序列开始的遗传重组，通过自包含在IL-6和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列开始的肽合成来制备所述IL-6或其片段之一。
单克隆抗体可以利用，例如亲和柱纯化，所述亲和柱上已经固定了含有所述单克隆抗体识别的表位的IL-6或其片段之一。更具体地说，可通过A蛋白和/或G蛋白层析，然后进行或不进行离子交换层析以除去自身中残留蛋白污染物以及DNA和LPS，再进行或不进行琼脂糖凝胶排阻层析以除去因存在二聚体或其它多聚体而导致的潜在凝聚体来纯化单克隆抗体。在一个实施方式中，可以同时采用或连续采用所有这些技术。
抗原结合位点
该术语描述了分子中结合靶抗原的全部或部分并与之互补的部分。在抗体分子中，该术语表示抗体抗原-结合位点，包括抗体中结合靶抗原的全部或部分并与之互补的部分。如果抗原较大，抗体可以只结合该抗原的特定部分，该部分称为表位。可以由一个或多个抗体可变区提供抗体抗原-结合位点。抗体抗原-结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
WO2006/072620记载了工程改造在免疫球蛋白结构域β链之间延伸的结构(非CDR)环中的抗原结合位点。可以在与CDR的天然位置相分离的抗体分子区域，如VH或VL结构域构架区中，或抗体恒定区，如CH1和/或CH3中工程改造抗原结合位点。结构区中经工程改造的抗原结合位点可以是VH和VL结构域的CDR组形成的抗原结合位点的额外结合位点或替换这些结合位点。当抗体分子中存在多个抗原结合位点时，它们可结合相同抗原(IL-6)，从而提高结合成员的化合价(valency)。或者，多个抗原结合位点可结合不同抗原(IL-6和一种或多种其它抗原)，这可用于添加效应功能、延长半衰期或改进抗体分子的体内递送。
分离的
该术语表示本发明的结合成员，或编码这种结合成员的核酸通常合乎本发明的状态。因此，提供的本发明结合成员、VH和/或VL结构域和编码核酸分子及载体可以是例如从其天然环境分离的和/或纯化的，基本上纯的或均质的形式，或者在核酸的情形中，为不含或基本上不含编码具有所需功能的多肽的序列以外来源的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸不含或基本上不含天然与其相连的物质，例如在其天然环境或在体外或体内实施重组DNA技术之时在其制备环境(例如细胞培养液)中发现的其它多肽或核酸。可用稀释剂或佐剂配制诸成员和核酸，但为实际目的仍是分离的-例如，如果用于包被免疫测定所用的微量滴定板，通常将这些成员与明胶或其它载体混合，或者用于诊断或治疗中时，将其与药学上可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以天然地或通过异源真核细胞(例如，CHO或NS0(ECACC85110503))的系统糖基化，或者它们可以是(例如，如果在原核细胞中表达)非糖基化的。
包含抗IL-6抗体分子的异质制品也构成本发明的一部分。例如，这些制品可以是抗体混合物，所述抗体具有全长重链、缺乏C-末端赖氨酸的重链、糖基化程度不同和/或具有衍生化的氨基酸，例如N-末端谷氨酸环化以形成吡咯型谷氨酸残基。
本文所用的短语“基本上所述”表示本文所述结合成员的VH或VL结构域的相关CDR的特征与本文所述序列的特定区域相同或高度相似。如本文所述，对于一个或多个可变区的指定区域，短语“高度相似”包括在CDR和/或VH或VL结构域中可进行1-约5个，例如1-4，包括1-3个，或者1、2、3或4个氨基酸取代。
附图简要说明
图1.该图显示给予抗-IL-6抗体(抗体18)对小鼠体内人重组IL-6诱导的触珠蛋白增加的影响。
发明详述
如上所述，本发明结合成员能调节并可能中和IL-6的生物学活性。如本文所述，可以优化本发明的IL-6结合成员的中和效力。效力优化通常包括使选择的结合成员的序列(通常是抗体的可变区序列)突变以产生结合成员文库，然后检验效力并选择更强效的结合成员。因此，选择的“效力优化的”结合成员的效力可能高于产生文库的结合成员。然而，还可不经优化获得高效力结合成员，例如可从最初的筛选，例如生物化学中和试验直接获得高效力结合成员。“效力优化的”结合成员指中和IL-6的特定活性或下游功能的效力得到优化的结合成员。本文它处更详细描述了试验和效力。本发明提供效力优化的和未优化的结合成员，以及效力优化所选结合成员的方法。因此，本发明使得技术人员能产生高效结合成员。
在另一方面，本发明提供获得能结合抗原的一种或多种结合成员的方法，该方法包括使本发明的结合成员文库与所述抗原接触，选择该文库中能结合所述抗原的一种或多种结合成员。
该文库可展示在颗粒或分子复合物上，例如可复制的遗传包装体(replicablegeneticpackage)，如酵母菌、细菌或细菌噬菌体(例如，T7)颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其它体外展示系统，各颗粒或分子复合物含有编码展示于其上的抗体VH可变区和任选展示的VL结构域(如果存在的话)的核酸。以下文献描述了噬菌体展示：WO92/01047和例如，美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404，各篇文献通过引用的方式全文纳入本文。
选择能结合抗原并展示在细菌噬菌体或其它文库颗粒或分子复合物上的结合成员后，可从展示所述选择的结合成员的细菌噬菌体或其它颗粒或分子复合物上获得核酸。这种核酸随后可用于通过表达含有从展示所述选择的结合成员的细菌噬菌体或其它颗粒或分子复合物获得核酸的核酸序列来产生结合成员或抗体VH或VL可变区。
可以分离形式提供含所述选择的结合成员的抗体VH可变区的氨基酸序列的抗体VH可变区，例如包含这种VH结构域的结合成员。
可进一步检测结合IL-6的能力，以及与(例如)亲代抗体分子或抗体分子2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23(例如scFv形式和/或IgG形式，例如IgG1)竞争结合IL-6的能力。中和IL-6的能力可如本文它处所述测试。
本发明结合成员结合IL-6的亲和力可以是亲代或其它抗体分子如scFv，或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23之一如IgG1的亲和力，或更好的亲和力。
本发明结合成员中和IL-6的生物学活性的效力可以是亲代或其它抗体分子，或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23之一如scFv或IgG1的效力，或更好的效力。
可以在合适条件下比较不同结合成员的结合亲和力与中和效力。
可通过序列改变或突变，以及筛选具有所需特性的抗原结合成员的方法获得本发明VH和VL结构域和CDR的变体，包括本文列明氨基酸序列且可用于本发明结合成员的那些。所需特性的例子包括但不限于：
·相对于已知的抗原特异性抗体，对抗原结合亲和力提高
·如果已知某抗原活性，则相对于已知的抗原特异性抗体，对该活性的中和水平提高。
·在特定摩尔比下与抗原的已知抗体或配体有特定竞争能力
·免疫沉淀复合物的能力
·结合特定表位的能力
·线性表位，例如用本文所述肽结合扫描鉴定的肽序列，例如利用筛选的线性和/或限定构象的肽
·通过非连续残基形成的构象表位
·调节IL-6，或下游分子的新生物学活性的能力。
本文也提供了这类方法。
可以制备本文公开的抗体分子的变体并用于本发明。根据计算化学的指导将多变量数据分析技术应用于结构/特性-活性关系[81]，可采用熟知的数学技术，例如统计回归、模式识别和分类[82,83,84,85,86,87]获得抗体的定量活性-特性关系。可从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，分析可能接触的残基或计算的理化特性)获得抗体的特性，这些特性可单独考虑，也可组合考虑。
由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原-结合位点通常由6个多肽环形成：3个来自轻链可变区(VL)，3个来自重链可变区(VH)。对原子结构已知的抗体的分析阐明了序列和抗体结合位点的三维结构之间的关系[88,89]。这些关系暗示，除了VH结构域中的第三区(环)外，结合位点环具有少量主链构象:经典结构之一。在特定环中形成经典结构显示由其大小和在环及构架区的关键位点中存在某些残基决定[88,89]。
可采用这种序列-结构关系研究预测序列已知但三维结构未知的抗体中，对于维持其CDR环的三维结构从而维持结合特异性至关重要的那些残基。通过比较预测与前导优化实验的结果可支持这些预测。在结构方法中，采用任何可自由使用或购得的软件包，例如WAM[91]可产生抗体分子的模型[90]。然后可采用蛋白质目测和分析软件包，例如阿克赛勒里公司(Accelerys,Inc.)的InsightII或DeepView[92]评估CDR中各位置处可能的取代。然后可利用该信息进行可能对活性的影响最小或有利的取代。
本领域通常已知在CDR、抗体VH或VL结构域和结合成员的序列内进行取代所需的技术。可以制备含有取代的变体序列，测试其结合和/或中和IL-6的能力和/或任何其它所需特性，所述取代可能预计或不能预计对活性的影响最小或有利。
本发明可利用序列如本文特别公开的任何VH和VL结构域的可变区氨基酸序列变体，如本文所述。
本发明VL结构域的变体和包含它们的结合成员或抗体分子包括Kabat残基108上不存在精氨酸，例如Kabat残基108是不同残基或缺失的VL结构域。例如，抗体分子，例如缺少恒定区的抗体分子如scFv可包含具有本文所述VL结构域序列或其变体的VL结构域，其中Kabat残基108上是精氨酸、除精氨酸以外的氨基酸残基或缺失。
本发明另一方面是包含VH结构域和/或VL结构域的抗体分子，所述VH结构域的氨基酸序列与所附序列表所示的抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的VH结构域有至少60、70、80、85、90、95、98或99％相同，所述VL结构域的氨基酸序列与所附序列表所示的抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗体的VL结构域有至少60、70、80、85、90、95、98或99％相同。可用于计算两个氨基酸序列的相同性百分数的算法包括例如BLAST[93]、FASTA[94]或史密斯-沃特曼算法(Smith-Watermanalgorithm)[95]，例如采用默认参数。
特定变体可包含一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的加入、缺失、取代和/或插入)。
可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中作出改变。改变通常不导致功能丧失，因此包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可保留结合和/或中和IL-6的能力。其可保留与未作改变的结合成员同样的定量结合和/或中和能力，例如在本文所述试验中测得。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员结合和/或中和IL-6的能力可能提高。
改变可包括用非天然产生或非标准氨基酸替代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然产生或非标准形式，或者将一个或多个非天然产生或非标准氨基酸插入序列。本文它处描述了本发明序列中改变的示例性数目和位置。天然产生的氨基酸包括20种“标准”L-氨基酸，根据它们的标准单字母密码鉴别为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可掺入多肽主链中的任何其它残基或由现有氨基酸残基修饰产生。非标准氨基酸可以是天然产生的或非天然产生的。本领域已知几种天然产生的非标准氨基酸，例如4-羟脯氨酸、5-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰基丝氨酸等[96]。在其N-α位置衍生的那些氨基酸残基只位于氨基酸序列的N-末端。在本发明中，氨基酸通常是L-氨基酸，但也可以是D-氨基酸。因此，改变包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸，或用D-氨基酸替代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的，在本发明中，氨基酸可进行这种修饰。
本发明的抗体结构域和结合成员的氨基酸序列可包含上述非天然或非标准氨基酸。可在合成过程中将非标准氨基酸(例如D-氨基酸)掺入氨基酸序列，或在合成氨基酸序列后修饰或取代"原始"标准氨基酸。
利用非标准和/或非天然产生的氨基酸能增加结构和功能差异，因此能增加本发明结合成员获得所需IL-6结合与中和特性的可能性。此外，与标准L-氨基酸相比，D-氨基酸和类似物已显示不同的药代动力学分布概况，因为具有L-氨基酸的多肽在给予动物，例如人后会体内降解，这意味着在一些体内应用中D-氨基酸比较有利。
可采用随机诱变一个或多个选择的VH和/或VL基因以在整个可变区中产生突变，从而产生本发明的携带CDR衍生序列的新型VH或VL结构域。Gram等[97]描述了这种技术，他采用易错PCR。在一些实施方式中，在整个可变区或CDR组中作出一个或两个氨基酸取代。
可采用的另一种方法是VH或VL基因的CDR区域的定点诱变。Barbas等[98]和Schier等[99]公开了这些技术。
本领域已知所有上述技术，技术人员能采用这些技术，从而能利用本领域常规方法提供本发明结合成员。
本发明另一方面提供获得IL-6的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括通过将一个或多个氨基酸添加、删除、取代或插入本文所示VH结构域的氨基酸序列来提供VH结构域，其是本文所示VH结构域的氨基酸序列变体，任选组合如此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域，并测试该VH结构域或一种或多种VH/VL组合以鉴定IL-6的结合成员或抗体抗原结合位点，和任选一种或多种所需特性，例如中和IL-6活性的能力。所述VL结构域的氨基酸序列基本上如本文所示。可采用类似方法，其中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
如上所述，所携带的基本上如本文所示的CDR氨基酸序列可以是人抗体可变区中的CDR或其实质性部分。基本上如本文所示的HCDR3序列代表着本发明的诸多实施方式，携带的这些序列各自可以是人重链可变区中的HCDR3或其实质性部分。
本发明所用的可变区可以从任何种系或重排人可变区获得或衍生，或者可以是基于已知人可变区的共有或实际序列的合成可变区。可变区可以衍生自非人抗体。可以采用重组DNA技术将本发明的CDR序列(例如，CDR3)引入缺乏CDR(例如，CDR3)的可变区库(repertoire)。例如，Marks等[100]描述了产生抗体可变区库的方法，其中可变区5’端处或与之毗邻的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物连用以提供缺乏CDR3的VH可变区库。Marks等还描述了如何将该库与特定抗体的CDR3组合。采用类似的技术，本发明的CDR3衍生序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域库改组，改组的完整VH和VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供本发明的结合成员。然后可以在合适的宿主系统中展示该库，因而可以选择合适的结合成员，所述宿主系统例如是通过引用方式全文纳入本文的WO92/01047或大量后续文献，包括Kay，Winter和McCafferty[101]所述的噬菌体展示系统。一个库可由104以上单个成员的构成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个或更多成员。其它合适的宿主系统包括但不限于：酵母菌展示、细菌展示、T4展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。
提供了制备IL-6抗原的结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸起始库，所述核酸包含待替代的CDR3或缺乏CDR编码区；
(b)将所述核酸库与编码基本上如本文所示VHCDR3的氨基酸序列的供体核酸组合，从而将所述供体核酸插入核酸库的CDR3区域，进而提供编码VH结构域的核酸产物库；
(c)表达所述产物库的核酸；
(d)选择IL-6的结合成员；和
(e)回收所述结合成员或其编码核酸。
还可采用类似方法，其中本发明的VLCDR3与编码VL结构域的核酸库组合，所述核酸包含待替代的CDR3或缺乏CDR3编码区。
类似地，可以将一个或多个或所有3个CDR嫁接入VH或VL结构域库，然后筛选该库中IL-6的一种或多种结合成员。
例如，可采用一种或多种亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23的HCDR组，和/或可采用一种或多种亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23的LCDR1、LCDR2和LCDR3或亲代或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23的LCDR组。
类似地，可以利用本文公开的其它VH和VL结构域，多组CDR和多组HCDR和/或多组LCDR。
免疫球蛋白可变区的实质性部分可包含至少所述三个CDR区，以及它们的间插构架区。该部分还可包含至少约50％的第一或第四构架区或二者，所述50％是第一构架区的C-末端50％和第四构架区的N-末端50％。可变区的实质性部分的N-末端或C-末端处其它残基可以是通常不与天然产生的可变区相连的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建本发明的结合成员可导致将引入以促进克隆或其它操作步骤的接头所编码的N-或C-末端残基引入。其它操作步骤包括引入接头以连接本发明的可变区与包含抗体恒定区、其它可变区(例如，在双抗体的产生中)或可检测/功能标记物的其它蛋白质序列，如本文它处详述的。
虽然在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH和VL结构域，但基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域构成本发明的其它方面。已知单一免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域能以特定方式结合靶抗原。例如，参见以上dAb的讨论。
在每一种单一结合结构域的情形中，可用这些结构域筛选能形成与IL-6能结合的两维结合成员的互补结构域。可采用以引用方式全文纳入的WO92/01047公开的所谓分级双重组合方案，通过噬菌体展示筛选方法实施，其中含有H或L链克隆的各集落用于感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库，按照噬菌体展示技术，例如该参考文献中描述的那些技术选择得到的双链结合成员。该技术也参见Marks等，同上[100]。
本发明的结合成员还可包含抗体恒定区或其诸部分，例如人抗体恒定区或其诸部分。例如，可将VL结构域在其C-末端与含有人Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定区相连。类似地，基于VH结构域的结合成员可以在其C-末端与衍生自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任何同种型亚类，特别是IgG1和IgG4的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如，CH1结构域)相连。IgG1因其效应功能和便于操作而优选。具有这些特性并稳定可变区的任何合成或其它恒定区变体也可用于本发明。
可用可检测或功能标记物标记本发明的结合成员。因此，结合成员或抗体分子可以免疫偶联物的形式存在，以便获得可检测和/或可定量的信号。免疫偶联物可包含与可检测或功能标记物偶联的本发明抗体分子。标记物可以是能产生或经诱导产生信号的任何分子，包括但不限于：荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合情况。
合适标签包括例如但不限于：
-酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶("G6PDH")、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化镁、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶，如辣根过氧化物酶；
-染料；
-荧光标记物或荧光剂，如荧光素和其衍生物、荧光染料、罗丹明化合物和衍生物、GFP(GFP指"绿色荧光蛋白”)、丹酰、伞形酮、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝素、邻苯二醛和荧胺；荧光团如镧系穴合物和螯合物，如铕等(帕金埃尔默公司(PerkinElmer)和西斯生物国际(CisBiointernational))，
-化学发光标记物或化学发光素，如异氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼和二氧杂环丁烷(dioxetane)；
-生物发光标记物，如荧光素酶和萤光素；
-感光剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射性标记，包括但不限于：溴77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氢3(氚)、铟111、铟113m、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、钇199和本文所述的其它放射性标记物；
-可进一步用染料、催化剂或其它可检测基团标记的颗粒，如胶乳或碳颗粒；.金溶胶；微晶；脂质体；细胞等；
-分子，如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；
-毒素部分，例如选自下组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒素片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒素片段或突变体，肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒蛋白或其细胞毒素片段如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒素或其细胞毒素片段、皂草毒蛋白或其细胞毒素片段、商陆抗病毒毒素或其细胞毒素片段和异株泻根毒蛋白1或其细胞毒素片段。
合适的酶和辅酶公开于Litman等，美国专利号4,275,149，和Boguslaski等，美国专利号4,318,980，各份专利以引用的方式全文纳入本文。合适的荧光剂和化学发光剂公开于以引用的方式全文纳入本文的Litman等，美国专利号4,275,149。标记物还包括化学部分，例如可通过与特定的相关可检测部分，如标记的亲和素或链霉亲和素结合来检测的生物素。可检测标记物可以采用本领域已知的常规化学方法连接于本发明抗体。
免疫偶联物或它们的功能片段可通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接或通过间隔基团或连接基团，例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)的中介作用，或在偶联剂，例如以上治疗性偶联物所述那些偶联剂存在下偶联于酶或荧光标记物。可通过与异硫氰酸酯反应制备包含荧光素类标记物的偶联物。
本领域技术人员已知现有的将治疗性放射性同位素直接或通过螯合剂，例如上述EDTA、DATA偶联于抗体的方法，该方法可利用诊断所用的放射性元素。还可能通过氯胺T方法[102]用Na125标记，或通过Crockford等的技术(以引用方式全文纳入本文的美国专利号4,424,200)用锝99m标记或通过Hnatowich(以引用方式全文纳入本文的美国专利号4,479,930)所述经DPTA相连进行标记。
可以通过许多方法使标记物产生可通过外部方法检测的信号，例如通过目测、电磁辐射、加热和化学试剂。所述标记物还可与结合本发明抗体的另一结合成员结合，或与支持物结合。
标记物可直接产生信号，因此，无需其它组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂能吸收紫外线和可见光，吸收的光将能量转移给这些分子并将它们提高到激发能级。然后该吸收的能量通过发射第二波长的光而消散。该第二波长的射线也能将能量转移给标记的接受分子，得到的能量通过发射光，例如荧光共振能量转移(FRET)而从接受分子消散。直接产生信号的其它标记物包括放射性同位素和染料。
或者，标记物可能需要其它组分来产生信号，那么信号产生系统将包括产生可检测信号所需的所有组分，包括底物、辅酶、增强剂、其它酶、与酶产物反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子和结合信号产生物质所需的特定结合物质。有关合适的信号产生系统的详述见以引用方式全文纳入本文的Ullman等，US5,185,243。
本发明提供的方法包括使得本文提供的结合成员与IL-6结合。应注意，这种结合可在体内发生，例如在给予结合成员或编码结合成员的核酸后，或者可在体外发生，例如ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析和生物化学或细胞试验，例如TF-1细胞增殖实验。
本发明还能利用本发明结合成员，例如在生物传感器系统中直接检测抗原水平。例如，本发明包括检测和/或测量与IL-6的结合情况的方法，包括(i)使所述结合成员与IL-6接触和(ii)检测所述结合成员与IL-6的结合情况，其中采用本文所述任何方法或可检测标记物检测结合情况。该方法和本文所述的任何其它结合检测方法可直接由实施该方法的人员解读，例如目测观察可检测标记物。或者，该方法或本文所述的任何其它结合检测方法可产生放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图片、图表、含有结果的试管或容器或孔、或该方法结果的任何其它可见或物理表现形式的报道。
可以测定结合成员与IL-6的结合量。定量测定可与测试样品中诊断感兴趣的抗原量有关。筛选IL-6结合和/或其定量测定可用于，例如筛选患有本文所述疾病或失调和/或与IL-6表达和/或活性异常有关的任何其它疾病或失调的患者。
本发明诊断方法可包括(i)获得对象的组织或液体样品；(ii)使所述组织或液体样品与一种或多种本发明结合成员接触；和(iii)与对照样品相比，检测结合的IL-6等步骤，其中与对照相比，IL-6结合量增加可表明IL-6表达或活性水平异常。待测试的组织或液体样品包括怀疑含有IL-6水平异常的血液、血清、尿、生物活检材料、肿瘤或任何组织。经测试IL-6水平或活性异常的阳性对象还可受益于本文随后公开的治疗方法。
借鉴本文公开的方法，本领域技术人员可根据他们的偏好和普通知识选择测定结合成员与抗原结合的合适方式。
可通过任何合适的方式测定样品中结合成员的反应性。放射免疫测定(RIA)是可能的一种。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，使之与结合成员结合。将结合的抗原与未结合的抗原物理分离，测定与结合成员结合的放射性抗原量。测试样品中的抗原越多，与结合成员结合的放射性抗原越少。还可采用含非放射性抗原的竞争性结合试验，利用与报道分子相连的抗原或类似物。报道分子可以是具有光谱学上分开的吸收或发射特征的荧光染料、磷或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和镧系螯合剂或穴合物。合适的生色染料包括二氨基联苯胺。
其它报道分子包括大分子胶态颗粒或颗粒材料，例如有色的、磁性或顺磁性的乳胶珠和能直接或间接产生可通过目测观察、电子检测或其它方式记录的可检测信号的生物学或化学活性剂。例如，这些分子可以是酶，其催化反应以产生或改变颜色或导致电子特性改变。它们可以是可激发的分子，因而能级之间的电子转移可导致特征性吸收光谱或发射光谱。它们可包括与生物传感器联用的化学实体。可以采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
可利用各结合成员-报道分子偶联物产生的信号获得样品(普通和测试)中与结合成员结合情况有关的可定量绝对或相对数据。
本发明一方面还提供包含本发明任何方面或实施方式的结合成员的试剂盒。在试剂盒中，可标记结合成员，从而能测定其在样品中的反应性，例如下文所述。结合成员还可与或不与固体支持物相连。试剂盒的诸组分通常是无菌的，放置在密封小瓶或其它容器中。试剂盒可用于利用结合成员的诊断分析或其它方法。试剂盒可装有在某方法，例如本发明方法中使用这些组分的使用说明书。本发明试剂盒中可装有辅助物质从而能协助或实施这种方法。辅助物质包括第二种不同的结合成员，其能结合第一结合成员并偶联于可检测标记物(例如，荧光标记物、放射性同位素或酶)。抗体试剂盒还可装有用于实施免疫沉淀的珠。试剂盒的各组分通常装在自身的合适容器中。因此，这些试剂盒通常包含适合于各结合成员的不同容器。此外，这些试剂盒可装有实施试验及解读和分析实施试验所得数据的方法的使用说明书。
本发明还提供以上结合成员在竞争试验中检测抗原水平的应用，即在竞争试验中利用本发明提供的结合成员检测样品中抗原水平的方法。这可能无需物理分离结合的与未结合的抗原。将报道分子连接于结合成员，从而结合时可能发生物理或光学改变。报道分子可以直接或间接产生可定量的可检测信号。可以直接或间接，共价，例如通过肽键或非共价连接报道分子。经由肽键连接可能是重组表达编码抗体或报道分子的基因融合体所致。
在各个方面和实施方式中，本发明扩展至与本文定义的任何结合成员，例如亲代抗体或抗体2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中的任何抗体，例如IgG1形式的抗体竞争结合IL-6的结合成员。不难在体外检验结合成员之间的竞争，例如用特定的报道分子给一种结合成员作标记(可在其它未标记的结合成员存在下检测)，从而能鉴定结合相同表位或重叠表位的结合成员。例如，可采用ELISA测定竞争，其中IL-6固定于平板，将标记或带标签的第一结合成员连同一种或多种未标记或未带标签的其它结合成员一起加入该平板。通过标记的结合成员发出的信号降低观察到有能与标记的结合成员竞争的未标记结合成员存在。
例如，本发明包括鉴定IL-6结合化合物的方法，包括(i)将IL-6固定于支持物，(ii)使所述固定的IL-6同时或以分步方式与至少一种标记的本发明结合成员和一种或多种未标记的测试结合化合物接触，和(iii)通过观察标记的结合成员的结合标签量的降低来鉴定新IL-6结合化合物。可采用多孔或阵列形式，以高通量方式实施这些方法。这种实验可以在溶液中进行。例如，参见以引用方式全文纳入本文的U.S.5,814,468。如上所述，结合的检测可以直接由实施该方法的人员解读，例如通过目测观察可检测标记物，或其存在量降低。或者，本发明的结合成员可产生放射自显影照片、照片、计算机打印输出、流式细胞术报道、图片、图表、含有结果的试管或容器或孔、或该方法结果的任何其它可见或物理表现形式的报道。
竞争试验还可用于表位作图。在一个例子中，表位作图可用于鉴定IL-6结合成员所结合的表位，所述结合成员可任选具有优化的中和和/或调节特征。这种表位可以是线形表位或构象表位。构象表位可包含至少两个不同的IL-6片段，其中当IL-6折叠成其三级或四级结构以形成IL-6抑制剂，例如IL-6结合成员识别的构象表位时所述片段的位置彼此毗邻。在测试竞争时，可利用抗原的肽片段，特别是包含感兴趣表位或基本上由其构成的肽。可利用具有表位序列并在各端加有一个或多个氨基酸的肽。本发明结合成员可以如下所示，即它们与抗原的结合被具有或包含所给定序列的肽抑制。
本发明还提供编码本发明结合成员的分离核酸。核酸可包含DNA和/或RNA。在一方面，本发明提供编码上述本发明的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原-结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG1的核酸。
本发明还提供质粒、载体、转录或表达盒形式的构建物，其包含至少一种上述多核苷酸。
本发明还提供包含以上一种或多种构建物的重组宿主细胞。编码所述CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原-结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG1的核酸本身构成本发明的一方面，这与产生所编码产物的方法一样，该方法包括表达其编码核酸。在合适的条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞不难实现表达。通过表达产生后，可采用任何合适的技术分离和/或纯化VH或VL结构域或结合成员，然后适当使用。
本发明核酸可包含DNA或RNA，其可以是完全或部分合成的。除非另有表述，述及本文所示核苷酸序列包括具有所示序列的DNA分子，还包括具有所示序列的RNA分子，其中U取代T。
还有另一方面提供产生抗体VH可变区的方法，该方法包括表达编码核酸。该方法可包括在产生所述抗体VH可变区的条件下培养宿主细胞。
产生VL结构域和包含VH和/或VL结构域的结合成员的类似方法是本发明的其它方面。
制备方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。制备方法可包括将产物配制成含有至少一种其它组分，例如药学上可接受的赋形剂的组合物。
熟知在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母菌和杆状病毒系统及转基因植物和动物。本领域熟知在原核细胞中表达抗体和抗体片段。综述可参见Plückthun[103]。常用的细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。
作为产生结合成员的替代方案，本领域技术人员也可利用培养的真核细胞来表达[104,105,106]。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其它细胞。
可以选择或构建含有合适的调节序列的合适载体，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列(如果需要的话)。载体可以是质粒，例如噬菌粒，或病毒，例如噬菌体(如果需要的话)[107]。Ausubel[108]详细描述了操作核酸的许多已知技术和方法，例如制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及分析蛋白质。
本发明的另一方面提供含有本文公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以在体外并可处于培养物中。这种宿主细胞可以在体内。宿主细胞的体内存在可以将本发明结合成员分子内表达成“胞内抗体”或细胞内抗体。胞内抗体可用于基因疗法。
还有另一方面提供了包括将本发明核酸引入宿主细胞的方法。可采用任何合适的技术实施这种引入。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和利用逆转录病毒或其它病毒的转导，例如痘苗病毒，或者就昆虫细胞而言是杆状病毒。将核酸引入宿主细胞，特别是真核细胞可利用病毒或质粒系统。质粒系统可以维持于附加体或可掺入宿主细胞或掺入人工染色体。掺入可以是将一份或多份拷贝随机或靶向整合在单一或多个基因座处。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和利用细菌噬菌体转染。
引入后可表达核酸，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。可通过本领域技术人员已知的方法纯化表达的产物。
可将本发明核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。按照标准技术，纳入促进与基因组重组的序列可促进整合。
本发明还提供包括在表达系统中利用上述构建物以表达上述结合成员或多肽的方法。
有证据表明，IL-6参与各种疾病，如本文其它地方所述。因此，本发明结合成员可用于诊断或治疗与IL-6有关的疾病的方法。这种疾病可以是，例如炎性疾病和/或自身免疫病，例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、恶病质、慢性阻塞性肺病、青少年特发性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、炎性肠病、克罗恩氏病或动脉粥样硬化。也可利用本发明结合成员治疗诸如肿瘤和/或癌症等疾病。
本发明结合成员也可用于诊断或治疗患者、动物、器官、组织或细胞的至少一种IL-6相关疾病的方法，所述IL-6相关疾病包括但不限于：
-(呼吸道)阻塞性气道疾病，包括慢性阻塞性肺病(COPD)；哮喘，如支气管、变应性、内源性、外源性和尘埃性哮喘，特别是慢性或积习性哮喘(例如晚期哮喘和气道高反应性)；支气管炎；急性、变应性、萎缩性鼻炎和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化脓性鼻炎、干燥性鼻炎和药物性鼻炎；膜性鼻炎，包括格鲁布性、纤维蛋白性和假膜性鼻炎，以及腺病性鼻炎；季节性鼻炎，包括神经性鼻炎(枯草热)和血管运动性鼻炎、鼻窦炎、特发性肺纤维化(IPF)；结节病、农民肺和相关疾病、成人呼吸窘迫综合征、超敏性肺炎、纤维化肺和特发性间质性肺炎；
(骨和关节)类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、青少年关节炎全身发病、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎和莱特病)、贝切特病、舍格伦综合征和全身性硬化症、痛风、骨质疏松和骨关节炎；
(皮肤)银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和其它湿疹性皮肤病、变应性接触性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔藓、硬皮病、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解症、荨麻疹、干皮病(angiodermas)、血管炎、红斑、皮肤嗜酸性细胞增多、葡萄膜炎、斑秃、变应性结膜炎和春季结膜炎(vernalvemalconjunctivitis)；
(胃肠道)胃溃疡、腹部疾病、直肠炎、嗜酸性肠胃炎、肥大细胞增生病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征))、产生远离内脏的影响，如偏头痛、鼻炎和湿疹的食品相关性变态反应；
(其它组织和全身性疾病)恶病质、多发性硬化、动脉粥样硬化、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、系膜增生性肾小球肾炎、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、局部或盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、卡斯尔曼病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、I型糖尿病、B型胰岛素抗性糖尿病、镰状细胞贫血、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、肾炎综合征、嗜酸细胞增多性筋膜炎、高IgE综合征、全身性血管炎/韦格纳肉芽肿病、睾丸炎/输精管切除术逆转术(reversalprocedure)、瘤型麻风、酒精诱导的肝炎、塞扎里综合征和特发性血小板减少紫癜；术后粘连、肾病、全身性炎症反应综合征、败血症综合征、革兰阳性败血症、革兰阴性败血症、培养阴性败血症、真菌性败血症、中性粒细胞减少性发热、急性胰腺炎、尿脓毒症、格拉夫斯病、雷诺病、抗体介导的细胞毒型、III型超敏反应、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)、混合型结缔组织病、特发性阿狄森病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、MI后(心切开术)综合征、IV型超敏症、胞内生物体引起的肉芽肿、威尔逊病、血色病、α-I-抗胰蛋白酶缺陷、糖尿病视网膜病、桥本甲状腺炎、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、甲状腺炎、脑脊髓炎、新生儿慢性肺病、家族性噬血淋巴组织细胞增多病(familialhematophagocyticlymphohistiocytosis)、脱发、放疗(包括例如但不限于：虚弱、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸中毒、睡眠性呼吸暂停、肥胖、心力衰竭和脑膜炎球菌血症；
(同种异体移植物排斥)肾脏、心脏、肝脏、肺、胰腺、骨髓、骨、小肠、皮肤、软骨和角膜移植后的急性和慢性排斥；和慢性移植物抗宿主病；
(恶性疾病)白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性白血病，T细胞、B细胞或FABALL，慢性髓细胞性白血病(CML)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞性白血病、骨髓异常增生综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、恶性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、肾细胞癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多病、肿瘤伴随综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、转移病、癌症相关性骨再吸收、癌症相关性骨痛；癌症转移的抑制；癌症恶病质的改进；
囊性纤维化病，中风，心脏、脑、四肢(peripherallimbs)和其它器官的再灌注损伤；
烧伤、外伤/出血、电离辐射照射、慢性皮肤溃疡；
生殖疾病(如排卵、月经和着床的疾病，早产，先兆子痫，子宫内膜异位)；
(感染)急性或慢性细菌感染，急性和慢性寄生过程或感染过程，包括细菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型、或者其它病毒性肝炎等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血尿毒症综合征/血栓性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌性肌炎、气性坏疽、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鸟-胞内分枝杆菌、卡氏肺囊虫(pneumocystiscarinii)性肺炎、盆腔炎疾病、睾丸炎/附睾炎、军团菌、莱姆病、甲型流感、爱波斯坦-巴尔病毒、致命相关性噬血综合征(vital-associatedhemaphagocyticsyndrome)、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎等。
因此，本发明提供治疗IL-6相关疾病的方法，所述方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或以联合治疗方案与本领域已知或本文所述的另一合适药物联合给予需要的患者。
本文其它地方小结了IL-6参与某些疾病的证据。此外，本文提供的数据还说明，本发明结合成员可用于治疗这类疾病，包括预防性治疗和降低这些疾病的严重程度。因此，本发明提供了一种治疗或减轻本文所述任何疾病的至少一种症状的严重程度的方法，包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或以组合治疗方案与本领域已知或本文所述的另一种合适药物联合给予有此需要的患者，从而能降低上述疾病的至少一种症状的严重程度。
因此，本发明结合成员可用作治疗剂，用于治疗与IL-6和/或IL-6Ra表达和/或活性，特别是表达/活性异常有关的疾病或失调。一种治疗方法可包括将有效量的本发明结合成员给予需要其的患者，其中IL-6和/或IL-6Ra的异常表达和/或活性降低。一种治疗方法可包括(i)鉴定证明IL-6:IL-6Ra水平或活性异常的患者，例如采用上述诊断方法，和(ii)将有效量的本发明结合成员给予该患者，其中IL-6Ra和/或IL-6的异常表达和/或活性降低。根据本发明，有效量是能降低IL-6和/或IL-6Ra的异常表达和/或活性的用量，从而能降低或减轻所治疗疾病或病症的至少一种症状，但无需治愈该疾病或病症。
本发明也一种提供拮抗IL-6的至少一种作用的方法，所述方法包括接触或给予有效量的一种或多种结合成员，以便拮抗IL-6的所述至少一种作用。可被本发明方法拮抗的IL-6的作用包括IL-6与gp130的结合和此种结合后产生的下游效应。
因此，本发明的其它方面提供治疗方法，包括给予所提供的结合成员、包含这种结合成员的药物组合物，以及这种结合成员在制备给予的药物中的应用，例如制备药物或药物组合物的方法，包括用药学上可接受的赋形剂配制结合成员。药学上可接受的赋形剂可以是化合物或化合物的组合，其可纳入药物组合物但不会造成继发性反应并能，例如促进活性化合物的给予，增加其体内寿命和/或其效力，增加其在溶液中的溶解度或者延长其储存时间。这些药学上可接受的载体是熟知的，本领域技术人员可改进这些载体以适应所选择活性化合物的性质和给药方式。
本发明结合成员通常以药物组合物的形式给予，所述组合物可包含除结合成员外的至少一种成分。因此，为用于本发明，除活性成分外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这些物质应无毒，不应干扰活性成分的效力。载体或其它物质的精确性质取决于给药途径，其可以是口服、吸入、气管内、局部、囊内或经注射给药，如下所述。
本发明还考虑了口服给予的药物组合物，例如单结构域抗体分子(如纳米抗体TM)等。这种口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成的油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘油，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或在病患部位注射，活性成分可以是胃肠外可接受的水溶液形式，其不含热原，pH、等渗性和稳定性合适。本领域相关技术人员能利用，例如等渗载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。如果需要，可利用防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂，包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵，氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间-甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TM、普流罗尼克TM或聚乙二醇(PEG)。
根据分子的理化特性和递送途径，可将本发明结合成员配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包含，例如以下赋形剂或赋形剂的组合：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂包含的抗体浓度和pH范围很广。可通过，例如冷冻干燥、喷雾干燥或超临界液体技术干燥来制备固体制剂。结合成员的制剂取决于所需递送途径：例如，肺部递送的制剂可由其物理特性确保在吸入后能透入肺深部的颗粒构成；局部制剂(例如用于治疗疤痕，如皮肤疤痕的局部制剂)可包含能延长药物在作用部位停留时间的粘性改性剂。可用能防止结合成员快速释放的载体制备结合成员，例如控释制剂，包括植入体、透皮贴剂和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。本领域技术人员已知制备这些制剂的许多方法[109]。
可口服(例如单结构域抗体分子(例如"纳米抗体TM"))、通过注射(例如，皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内)、通过吸入、气管内、囊内途径(滴注入膀胱)或通过局部(例如，眼内、鼻内、直肠、给入伤口或给予皮肤上)给予治疗。可通过脉冲输注，特别是以剂量渐降的结合成员来给予治疗。可以通过治疗的理化特征、通过疾病的具体考虑因素或优化效力或尽可能降低副作用的要求来决定给药途径。一种具体的给药途径是静脉内。给予本发明药物组合物的另一种途径是皮下。估计治疗不会局限于在诊所中使用。因此，优选利用无针头装置的皮下注射。
组合物可单独给药或与其它治疗联合给药，联合给药可以是同时或依次进行的，这取决于所要治疗的病症。
本发明结合成员可作为组合治疗的一部分与其它药物组分联用。可采用组合治疗提供明显的协同作用，特别是本发明结合成员与一种或多种其它药物的组合。就治疗本文所述的一种或多种疾病而言，本发明结合成员可同时或依次或作为含另一种治疗剂或多种药剂的组合制品而给予。
本发明结合成员可用作化学增敏剂以提高细胞毒剂的疗效，因此可与一种或多种细胞毒剂同时或依次联合给药。结合成员也可用作射线增敏剂以提高放疗疗效，因此可与放疗同时或依次联合给药。
可以组合或加入了一种或多种以下药剂的形式提供本发明结合成员：
-细胞因子或者细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如，作用于细胞因子信号传导途径的药剂，例如SOCS系统的调节剂)，例如α-、β-和/或γ-干扰素；I型胰岛素样生长因子(IGF-1)、其受体和相关结合蛋白；白介素(IL)，例如IL-1-33中的一种或多种，和/或白介素拮抗剂或抑制剂，例如阿那白滞素；白介素家族成员的受体的抑制剂或这些受体的特定亚单位的抑制剂；肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂，例如抗-TNF单克隆抗体(例如，英夫利昔单抗；阿达木单抗和/或CDP-870)、和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫球蛋白分子(例如依那西普)和/或低分子量药剂，例如已酮可可碱(pentoxyfylline)；
-B细胞调节剂，例如靶向B-淋巴细胞(例如CD20(利妥昔单抗)或MRA-aILl6R)或T-淋巴细胞(例如，CTLA4-Ig、HuMaxIl-15或阿巴西普(Abatacept))的单克隆抗体；
-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如RANKL的抗体；
-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，例如以下趋化因子的拮抗剂：CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11(就C-C家族而言)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5及CXCR6(就C-X-C家族而言)和C-X3-C家族的CX3CR1；
-基质金属蛋白酶(MMP)，即以下一种或多种的抑制剂：间质溶解素、胶原酶和明胶酶以及聚集蛋白聚糖酶；特别是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、间质溶解素-1(MMP-3)、间质溶解素-2(MMP-10)和/或间质溶解素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如强力霉素等药剂；
-白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂，例如：齐留通；ABT-761；芬留顿；替泊沙林；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺酰胺；2,6-二叔丁基苯酚腙；甲氧基四氢吡喃，例如泽尼卡ZD-2138；化合物SB-210661；吡啶基-取代的2-氰基萘化合物，例如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，例如L-746,530；吲哚和/或喹啉化合物，例如MK-591、MK-886和/或BAYx1005；
-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自：吩噻嗪-3-1s，例如L-651,392；脒基化合物，例如CGS-25019c；氨基苯并恶唑类(benzoxalamines)，例如昂唑司特；苄脒类(benzenecarboximidamides)，例如BIIL284/260；和诸如扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYx7195等化合物；
-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，例如甲基黄嘌呤(methylxanthanine)，如茶碱和/或氨茶碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或同种型PDE4D的抑制剂，和/或PDE5抑制剂；
-1型组胺受体拮抗剂，例如西替立嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴司汀、氯苯那敏、普鲁本近、赛克利嗪和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或胃肠外应用)；
-质子泵抑制剂(例如奥美拉唑)或胃保护性组胺2型受体拮抗剂；
-组胺4型受体拮抗剂；
-α-1/α-2肾上腺素受体激动剂、血管收缩剂、拟交感神经药，例如环己丙甲胺、苯福林、苯丙醇胺、麻黄素、伪麻黄碱、盐酸萘甲唑啉、盐酸氧甲唑啉、盐酸四氢唑啉、盐酸木甲唑啉、盐酸曲马唑啉和盐酸乙基去甲肾上腺素；
-抗胆碱能药，例如毒蕈碱受体(M1、M2和M3)拮抗剂，例如阿托品、东莨菪碱、甘罗溴铵(glycopyrrrolate)、异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平和替仑西平；
-β-肾上腺素受体激动剂(包括β受体亚型1-4)，例如异丙肾上腺素、柳丁氨醇、福莫特罗、沙美特罗、叔丁喘宁、间羟异丙肾上腺素、双甲苯喘定甲磺酸盐和/或吡布特罗，例如它们的手性对映体；
-色酮，例如色甘酸钠和/或奈多罗米钠；
-糖皮质激素，例如氟尼缩松、羟氢化泼尼松缩丙酮、二丙酸氯地米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和/或糠酸莫米松；
-调节核激素受体的药剂，例如PPAR；
-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，例如抗-IgE(例如，奥玛立珠单抗(奥马珠单抗))；
-其它全身性或局部应用的抗炎药，例如沙利度胺或其衍生物、类维生素A、蒽三酚和/或卡泊三醇；
-氨基水杨酸盐和磺胺吡啶的组合，例如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奥沙拉秦；免疫调节剂，例如巯基嘌呤(thiopurines)和皮质类固醇，例如布地奈德；
-抗菌剂，例如青霉素衍生物、四环素、大环内酯类、β-内酰胺、氟喹诺酮、甲硝哒唑和/或吸入性氨基糖苷类；和/或抗病毒剂，例如阿昔洛维、泛昔洛韦、缬昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；三环癸烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥塞米韦；蛋白酶抑制剂，例如印地那韦、那非那韦、利托那韦和/或沙奎那韦；核苷逆转录酶抑制剂，例如地达诺新、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定；非核苷逆转录酶抑制剂，例如奈韦拉平、依法韦仑；
-心血管药物，例如钙通道阻断剂、β-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；降脂剂，例如他汀类和/或贝特类；血细胞形态的调节剂，例如已酮可可碱；溶解血栓和/或抗凝剂，例如血细胞聚集抑制剂；
-CNS药，例如抗抑郁药(例如舍曲林)、抗-帕金森药(例如塞利吉林、左旋多巴、罗平尼咯、普拉克索、MAOB抑制剂，如塞乐金(selegine)和雷沙吉兰、comP抑制剂，如托卡朋、A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、多巴胺激动剂和/或神经元一氧化氮合酶抑制剂)和抗阿尔茨海默病药物，例如多奈哌齐、利凡斯的明、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲磷酯；
-治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如中枢或外周作用的镇痛剂，例如阿片类似物或衍生物、卡巴米嗪、苯妥英、丙戊酸钠、阿米替林(amitryptiline)或其它抗抑郁药、对乙酰氨基酚或非类固醇抗炎药；
-胃肠外或局部-应用的(包括吸入的)局部麻醉剂，例如利诺卡因或其类似物；
-抗-骨质疏松剂，例如激素药物，如雷洛昔芬或双膦酸盐，如阿伦膦酸盐；
-(i)胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗剂；(iii)白介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂(例如，Btk、Itk、Jak3MAP抑制剂的例子可包括吉非替尼(Gefitinib)、甲磺酸伊马替尼)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，MAP激酶，如p38、JNK、蛋白激酶A、B和C及IKK的抑制剂)、或参与细胞周期调节的激酶(例如，依赖周期蛋白的激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽-B1-和/或B2–受体拮抗剂；(x)抗-痛风药剂，例如秋水仙素；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌呤醇；(xii)排尿酸剂，例如，丙磺舒、苯磺唑酮和/或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子(TGFβ)；(xv)血小板衍生的生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒碱乳膏；(xix)速激肽NK1和/或NK3受体拮抗剂，例如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或(xxiii)表达在TH2细胞上的化学引诱物受体-同源分子，(例如，CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38的抑制剂；(xxv)调节Toll-样受体(TLR)的功能的药剂和(xxvi)调节嘌呤能受体活性的药剂，例如P2X7；(xxvii)转录因子活化的抑制剂，例如NFkB、API和/或STATS。
抑制剂可以是特异性抑制剂或可以是混合型抑制剂，例如靶向上述多种分子(例如受体)或分子类型的抑制剂。
结合成员还可以共同给予或免疫偶联物的形式与化疗剂或另一种酪氨酸激酶抑制剂联用。所述抗体非片段还可用在通过重组机制或生物化学偶联获得的双特异性抗体中，从而能结合上述抗体的特异性与其它抗体的特异性，所述其它抗体能识别涉及IL-6有关活性的其它分子。
为了治疗炎性疾病，本发明结合成员可与一种或多种药物联用，这些药物包括例如，非类固醇抗炎药(以下称为NSAID)，包括无选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂，无论局部或全身性应用(例如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸，如甲氧萘丙酸、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬和布洛芬、芬那酯，如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑酮，例如苯丁唑酮、水杨酸盐，例如阿司匹林)；选择性COX-2抑制剂(例如，美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、陆玛考昔(lumarocoxib)、帕瑞考昔和艾托考昔)；抑制一氧化氮供体的环加氧酶(CINODs)；糖皮质激素(无论通过局部、口服、肌肉内、静脉内或关节内途径)；甲氨蝶呤、来氟米特；羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬或其它胃肠外或口服金制品；镇痛剂；双醋瑞因；关节内治疗，例如透明质酸衍生物；和营养添加剂，例如葡糖胺。
本发明结合成员还可与治疗癌症的现有治疗剂组合使用。可组合使用的合适药剂包括：
(i)用于医学肿瘤学的抗增殖/抗肿瘤药物和它们的组合，例如格列卫(甲磺酸伊马替尼)、烷化剂(例如，顺铂、碳铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、瘤可宁、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，抗叶酸剂，如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲、吉西他滨和紫杉醇；抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类抗生素，如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗(有丝分)裂剂(例如，长春花碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨及紫杉烷，如紫杉酚和泰索帝)；和拓扑异构酶抑制剂(例如，鬼臼乙叉甙，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康及喜树碱)；
(ii)细胞抑制药，例如抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和吲哚昔芬(iodoxyfene))、雌激素受体下调剂(例如，氟维司群)、抗雄激素(例如，比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙氯地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α-还原酶的抑制剂，例如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵袭的药剂(例如，金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能的抑制剂，例如，这种抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如，抗-erbb2抗体，曲妥珠单抗和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如，表皮生长因子家族抑制剂(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼(埃罗替尼)、OSI-774)和6-丙烯基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))，例如，血小板衍生的生长因子家族的抑制剂和例如，肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成药剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些药剂，(例如，抗血管内皮生长因子抗体贝伐珠单抗、国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856和WO98/13354公开的化合物，各份专利全文纳入本文)和以其它机制起作用的化合物(例如，利诺胺、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管他丁)；
(vi)血管破坏剂，例如考布他汀A4和国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物(通过引用将各份专利全文纳入本文)；
(vii)反义治疗，例如，针对上述靶标的那些，如ISIS2503、抗-ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如，替代异常基因，如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法、GDEPT(基因指导的酶前药治疗)方法，例如利用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法和增加患者对化疗或放疗耐受性的方法，例如多药抗性基因治疗；和
(ix)免疫治疗方法，包括例如，离体和体内方法以增加患者肿瘤细胞的免疫原性，如用细胞因子，如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转染，降低T细胞无反应性的方法，利用转染的免疫细胞，例如细胞因子转染的树突细胞的方法，利用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和利用抗独特型抗体的方法。
本发明的结合成员和一种或多种上述其它医学组分可用于制备药物。药物可以单独或组合给予个体，因此可包含结合成员和其它组分，例如组合制品或单独的制品。单独的制品可用于促进单独且依次或同时给药，并能通过不同途径，例如口服和胃肠外给药而给予诸组分。
按照本发明，提供的组合物可给予哺乳动物。给药通常是对于患者足以显示益处的“治疗有效量”。这种益处可以至少缓解至少一种症状。所给予的实际量和给药速度及时程取决于所治疗疾病的性质和严重程度，所治疗的具体哺乳动物，各患者的临床情况，疾病的诱因，组合物的递送部位，结合成员的类型，给药方法，给药时间表和医学从业人员已知的其它因素。普通从业人员和其它医生负责治疗处方，例如剂量的决定等，其取决于所治疗疾病症状的严重程度和/或进展。合适的抗体剂量是本领域熟知的[110，111]。可利用适合于所给予药物类型的本文所述或Physician'sDeskReference(医师案头参考)(2003)的具体剂量。可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来测定本发明结合成员的治疗有效量或合适剂量。已知将小鼠和其它测试动物中的有效剂量外推至人的方法。精确剂量取决于许多因素，包括抗体是用于诊断、预防还是治疗，治疗区域的大小和部位，抗体的精确性质(例如，全抗体、片段或双抗体)和任何可检测标记物或与抗体相连的其它分子的性质。对于全身性给药，典型抗体剂量是100μg-1g，对于局部应用是1μg-1mg。可以先给予较高的加载剂量，然后给予一次或多次较低剂量。抗体一般是全抗体，例如IgG1同种型。这是成年患者单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可作适当调整，对于其它抗体形式也可根据分子量成比例地调节。治疗可遵医嘱以每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。治疗可以是每2-4周皮下给予和每4-8周静脉内给予。治疗可以是周期性的，给药之间的时期约为两周或更长，例如约3周或更长，约4周或更长，或约每月一次。可以在手术前和/或手术后给予治疗，和/或可以在手术治疗的解剖部位直接给予或施用。
在剂量和给药要求方面，与sIL-6Ra的抗体相比，本发明IL-6结合成员具有优势。如本文其它地方所述，患病时IL-6的循环水平显著低于sIL-6Ra的循环水平。因此，与抗-IL-6R结合成员相反，使用IL-6结合成员具有显著优势，因为所生产的给予患者的每剂量药量可能较低。另外，如果抗-IL6治疗的剂量较低，则可能有明显优势，因为较低剂量有利于皮下注射和静脉内(i.v.)注射。本领域技术人员熟知，皮下给药可能受每剂量所需的结合成员，如抗体分子含量的限制。这是因为皮下注射受限于皮肤某一部位可注射的体积。一般利用的皮下注射体积为1.2ml或更少。由于在浓度高于50mg/ml时配制用于皮下注射的结合成员的难度增加，所以通过此种途径给予100mg以上的剂量通常需要多次注射，这对于患者来说更为不适。
与全身性sIL-6Ra相比，较低剂量的抗-IL-6治疗也可能需要较低“加载”剂量的抗体来抑制所有全身性IL-6，因为其浓度较高。
其它益处可能与靶向IL-6而非IL-6受体有关，这代表与IL-6Ra的结合成员相比本发明结合成员具有额外优点。
例如，有文献报道称，患病时IL-6循环水平显著低于sIL-6Ra的循环水平[112，113]。由于sIL-6R的水平显著高于IL-6的水平，所以与中和IL-6所需的抗-IL-6结合成员量相比，可能需要更多抗-sIL-6R结合成员来中和sIL-6Ra。因此，与使用抗-受体结合成员时相比，可能需要较低剂量的抗-配体结合成员。
靶向IL-6配体而非IL-6受体可降低疾病中的IL-6水平，但仍然允许IL-6水平在感染期间升高，其中IL-6作为免疫应答的一部分被上调。
Krebs等[4]证明，IL-6是有效的生长因子，从患者新鲜分离的骨髓瘤细胞能产生IL-6并表达其受体。而且，抗-IL-6抗体能抑制骨髓瘤细胞的体外生长。这是人骨髓瘤肿瘤发生中自分泌环工作的直接证据。该研究之后，VanZaanen等[5]证明用抗-IL-6配体抗体治疗时，多发性骨髓瘤患者中IL-6产量降低。
许多进一步研究证明，IL-6参与了其它细胞类型，例如平滑肌细胞(SMC)[114]、U373-MG星形神经胶质瘤细胞[115]、3T3脂肪细胞[116]、神经元[117]、内皮细胞[118]和卡波济氏肉瘤细胞[119]的自分泌反馈环。因此，在疾病中用抗-IL6结合成员抑制IL-6可导致IL-6的基础疾病产量降低。
另外，抗-IL-6结合成员结合全身循环中的IL-6，相反，IL-6受体的结合成员则需要穿透组织以占据参与所治疗疾病病理的细胞表面上的受体。
在全身循环中IL-6结合成员可与IL-6形成平衡，产生跨越屏障如滑膜的梯度，其净效应是去除关节中的活性IL-6和与结合成员形成失活复合物。其结果是，与IL-6R结合成员相比，IL-6结合成员可较快起效，剂量方案可以不同，且可能易于优化。
IL-6信号转导是由IL-6与IL-6R结合和该复合物与gp130结合介导的。倘若IL-6和IL-6Ra的结合亲和力为纳摩尔级(约5nM)，IL6:IL6R复合物和gp130结合亲和力为皮摩尔级，那么对于结合IL-6，靶向IL-6的结合成员面临的竞争较低，因此可能抑制较高比例的IL-6信号转导。虽然这也可能适用于靶向可溶性IL-6Ra和防止IL-6:IL-6Ra复合物形成的结合成员，但如果IL-6Ra是膜结合的，那么由于空间限制，抗IL-6Ra可能更加难以结合并抑制膜上的IL-6Ra。
实施例
实施例1先导物分离
1.1选择
利用克隆入依据丝状噬菌体M13的噬菌粒载体的原初人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库进行选择[120，121]。基本如以前Vaughan等[120]和Hawkins等[122]所述，利用一系列重组人IL-6的选择循环由噬菌体展示文库分离抗IL-6特异性scFv抗体。简言之，在生物淘选中，将PBS(杜贝克(Dulbecco)PBS，pH7.4)配制的人IL-6吸附在微量滴定板的各孔上，4℃过夜。用PBS洗涤各孔，然后用PBS-Marvel(3％w/v)封闭1小时。将PBS-Marvel(3％w/v)配制的纯化噬菌体加入各孔，使之与包被的抗原结合1小时。用PBS-吐温(0.1％v/v)和PBS进行多轮洗涤以除去未结合的噬菌体。洗脱结合的噬菌体颗粒，感染入细菌并拯救以进行下一轮选择[120]。
1.2通过粗制scFv抑制IL-6与IL-6受体的结合
使代表性数量的第二轮选择的各克隆在96-孔板中生长。在细菌周质中表达ScFv，采用(时间分辨的均一荧光(HomogeneousTime-ResolvedFluorescence)，CIS生物国际公司(CISBiointernational))人IL-6/人IL-6受体结合试验筛选它们的抑制活性。在本试验中，样品与生物素化IL-6R(派普技术公司(Peprotech))竞争结合穴合物标记的人IL-6(R&D系统公司(R&DSystems))。在所有效力试验中包含参比抗-IL-6mAb(生物源公司(Biosource)AHC0562)作为阳性对照。详细的试验方法见材料与方法章节。
1.3将scFv变型(reformatting)成IgG1
通过将VH和VL结构域分别亚克隆入表达完整的抗体重链和轻链的载体而将克隆从scFv转换成IgG形式。将VH结构域克隆入含有人重链恒定域和调节元件的载体(pEU15.1)以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG重链。相似地，将VL结构域与调控元件克隆到载体pEU3.4中表达人κ轻链或克隆到pEU4.4中表达人λ轻链恒定区，从而在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。参考文献[123]首先描述了表达重链和轻链的载体。可通过引入OriP元件简单地工程改造剑桥抗体技术公司(CambridgeAntibodyTechnology)的载体。为获得IgG，将重链和轻链IgG表达载体转染入EBNA-HEK293哺乳动物细胞。IgG经表达分泌入培养基。合并收集物，过滤后纯化。采用A蛋白层析纯化IgG。将培养物上清液加载于大小合适的A蛋白陶瓷柱(生物谱公司(BioSepra))上，用50mMTris-HClpH8.0，250mMNaCl洗涤。利用0.1M柠檬酸钠(pH3.0)将结合的IgG从柱上洗脱，加入Tris-HCl(pH9.0)中和。利用Nap10柱(安玛西亚公司(Amersham)，第17-0854-02号)将洗脱物质的缓冲液替换成PBS，利用基于IgG的氨基酸序列的消光系数，通过分光光度法测定IgG的浓度[124]。采用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析纯化IgG的凝聚或降解。
1.4通过纯化的scFv和IgG抑制IL-6与IL-6受体的结合
对IL-6A:IL-6RA相互作用显示明显抑制作用的scFv(作为周质粗提物)进行DNA测序[120,125]。再次在细菌中表达独特scFv，并通过亲和层析纯化(如Bannister等[126]所述)。这些克隆的纯化IgG样品也可按照章节1.3所述来制备。通过与针对抗生物素化sIL-6R的纯化制剂的连续稀释液竞争结合HISFLAG标记的人IL-6(内部大肠杆菌衍生的)来确定这些样品的功效。
作为具有人重链和κ轻链恒定区的scFv和IgG，克隆CAN022D10的结果见表1。材料和方法章节提供了详细方案。
表1：CAN022D10scFv和IgG在受体-配体HTRF生化实验中的功效
克隆 IC50scFv(nM) IC50IgG(nM)
CAN022D10 45 0.31
1.5通过纯化scFv和IgG抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖
利用TF-1细胞增殖试验评估纯化scFv制剂对抗人和短尾猴IL-6生物活性的中和功效。TF-1是由红白血病患者建立的人早幼粒细胞系[134]。TF-1细胞系的存活和增殖依赖某些因子。TF-1细胞能够对人和短尾猴IL-6(内部大肠杆菌衍生的)起反应，在含有人GM-CSF(4ng/ml，R&D系统公司)的培养基中维持。通过检测氚标记的胸苷向分裂细胞新合成的DNA中掺入减少确定IL-6依赖性增殖被抑制。该方法的详述参见材料和方法章节。
在所检测的最高浓度下，CAN022D10的纯化scFv制剂能够抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖，但未观察到完全抑制。因此，不可能由所得结果计算准确的IC50功效数据。作为纯化IgG检测时，CAN022D10的IC50计算为93nM。
1.6在表位竞争试验中抗体的选择性和物种交叉反应性
用表位竞争实验，通过测定生物素化HISFLAGIL-6(内部大肠杆菌衍生的)与各固定抗-IL-6抗体结合的抑制来鉴定IL-6家族成员抗体的物种交叉反应性和选择性。
在各试验中检测纯化的白血病抑制因子(LIF)(开米康公司(Chemicon))、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、IL-11和制瘤素M(均来自R&D系统公司)的滴度，以确定各结构相关蛋白质的功效，如试验中IC50值所测的。
在各试验中测试包括短尾猴(内部大肠杆菌衍生的)、人HISFLAGIL-6(内部HEK-EBNA衍生的)，大鼠和鼠科IL-6(均来自R&D系统公司)在内的各种IL-6物质的滴度以确定这些抗体的物种交叉反应性。该实验的示范性结果列于表2。该方法的详述参见材料和方法章节。
表2：在CAN22D10竞争实验中IL-6相关蛋白质和不同IL-6物质的效力
蛋白质 IC50(nM)
人IL-6 32*
短尾猴IL-6 100*
鼠科IL-6 无抑制
大鼠IL-6 无抑制
人IL-11 无抑制
人CNTF 无抑制
人LIF 无抑制
人制瘤素M 无抑制
*数值是由样品获得的不完整曲线的近似值
1.7通过纯化IgG抑制内源性IL-6诱导人滑膜成纤维细胞释放VEGF
评估抗体抑制IL-6诱导的人滑膜成纤维细胞释放VEGF的效力，所述人滑膜成纤维细胞是由类风湿性关节炎供体移出的。该方法的详细方案参见材料和方法章节。简要说，将一定滴度的受试IgG加入培养的成纤维细胞中，然后通过加入人IL-1β和可溶性人IL-6Rα进行刺激以诱导IL-6表达，并启动细胞信号转导以诱导VEGF表达。培育48小时后，取出上清液，利用市售试剂盒(R&D系统公司)通过ELISA检测VEGF表达。利用这些数据确定CAN022D10的IC50，计算为45nM。
实施例2抗体优化
2.1鉴定可能增强先导抗体与IL-6的结合的氨基酸
通过在整个CAN022D10scFv序列中引入随机突变实施鉴定亲代抗体序列中可能增强与IL-6结合的关键残基的方案。利用DiversifyTMPCR随机诱变试剂盒(BD生物科学公司(BDbiosciences))，按照生产商说明书进行两轮诱变，以便在每轮诱变中，在每一千个核酸序列的碱基中平均掺入8.1个突变。基本如前所述(Hanes等，2000；MethodsinEnzymology.328.404-430)地进行选择。简要说，将亲代克隆的随机诱变文库转录到mRNA中，利用受阻翻译(stalledtranslation)方法形成mRNA-核糖体-scFv复合物。将这些复合物与bio-huIL-6一起培育，然后结合抗原的那些被链霉亲和素包被的磁珠捕获。洗去非特异性核糖体复合物，由结合的核糖体复合物分离mRNA，逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增。将此种DNA用于下一轮选择，和/或克隆出来进行筛选。在浓度递减的bio-huIL-6存在下重复该选择过程(4轮筛选中bio-huIL-6浓度由100nM降低至0.1nM)。通过Nco1/Not1限制性核酸内切酶消化(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))核糖体展示构建物，然后用T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室公司)连接至Nco1/Not1消化的pCANTAB6中[127]而将利用核糖体展示分离的ScFv克隆到噬菌粒载体pCANTAB6中。然后，将连接的DNA转化到化学感受态TG-1细胞中，来自各克隆的粗制scFv与CAN022D10IgG竞争结合在配体-抗体生化实验中检测的HIS/FLAGIL-6。
2.2利用抗体-配体生化实验(利用CAN022D10IgG)鉴定改进克隆
在CAN022D10IgG–IL-6结合实验中筛选第3轮和第4轮所得物中代表性数量的各克隆的粗制scFv制剂的抑制活性。在该实验中，利用穴合物标记的抗-FLAG单克隆抗体和链霉亲和素XLent！(TM)检测生物素化抗体和FLAG标记的IL-6的结合。详细的测定方法参见材料和方法章节。
对显示出明显抑制作用的ScFv进行测序，并生产成章节1.4所述纯化制剂的形式。然后，由HTRF抗体-配体生化实验和TF-1增殖实验中一系列测试稀释度的纯化样品获得的数据计算各scFv的IC50值。如前所述，将TF-1增殖实验中最有效的克隆转化为含有重链恒定区和κ轻链恒定区的IgG，并在TF-1增殖实验中再次检测。各样品的纯化的scFv和IgG的示例性效力数据见表3。
表3：在配体-抗体生化实验和TF-1增殖实验中由核糖体展示CAN022D10随机诱变文库分离的效力提高的克隆的例子
*改变方案以便测定IgG效力，所以不应直接比较各克隆的scFv和IgG效力。所述改变的详情参见材料和方法。
2.3通过靶向诱变优化亲代克隆
采用亲和力噬菌体展示选择，通过定向诱变方法优化前导抗体。在靶向诱变方法中，采用标准分子生物学技术[128]，通过寡核苷酸指导的可变重链(VH)和轻链(VL)互补决定区3(CDR3)诱变产生衍生自前导克隆的scFv-噬菌体大文库。对这些文库进行基于亲和力的噬菌体展示选择以选择对IL-6的亲和力较高的变体。因此，这些变体应显示对IL-6与其受体结合的抑制活性提高。基本上如前所述[129]进行选择。简言之，将scFv-噬菌体颗粒与重组生物素化人IL-6在溶液中温育(bio-huIL-6，内部大肠杆菌衍生的和内部修饰的)。然后按照生产商的推荐用链霉亲和素包被的顺磁性珠(M280)捕捉与抗原结合的scFv-噬菌体。然后如前所述[125]拯救选择的scFv-噬菌体颗粒，在浓度递减的bio-huIL-6(在3轮中从50nM降低至0.1nM)存在下重复该选择过程。
一旦完成3轮选择后，则合并VH和VL随机化文库以形成单一文库，其中克隆含有随机配对的单独随机化的VH和VL序列。然后，在浓度递减的bio-huIL-6(再在4轮中由0.1nM降低至0.1pM)存在下继续如前所述进行选择。
2.4利用抗体-配体生化实验(利用抗体5IgG)鉴定通过靶向诱变改进的克隆
基本如章节2.2所述，在抗体-配体生化实验中，检测从靶向诱变选择所得物分离的克隆的粗制scFv。在这些所得物中，重新改造该生化实验以使用抗体5IgG。该抗体是TF-1增殖实验中效力较高的CAN02210的改进变体。掺入此种更有效的IgG导致该实验能够区分效力更高的克隆。此改进试验的方案与利用CAN022D10的原始抗体-配体生化实验基本相同，但改变了以下几处。首先，所用的HISFLAGIL-6浓度从1nM降低至0.5nM。其次，抗IL-6抗体和链霉亲和素XLent！(TM)的浓度从1nM和20nM分别升高至16nM和40nM。对显示出显著抑制作用的scFv进行测序，并制备成纯化的scFv和IgG，然后在TF-1增殖实验中检测。
2.5.通过优化克隆的纯化scFv和IgG抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖
利用如前所述的IL-6诱导的TF-1增殖实验测定优化克隆的效力。作为纯化的scFv制剂和变型的IgG检测克隆。scFv和IgG的结果的例子见表4。
表4：在TF-1细胞增殖实验中检测时由靶向诱变文库鉴定的克隆的示例性效力
N.D.未测定
克隆显示明显的抑制作用，但准确IC50值无法由连续稀释的纯化scFv测定。
2.6.种系化
将优化的抗-IL-6抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据库中的已知人种系序列比对[130]，通过序列相似性鉴定最接近的种系。就CANDY022D10抗体谱系的VH结构域而言，最接近的种系v区段是Vh3_DP-86_(3-66)，最接近的种系j区段是JH2。就VL结构域而言，最接近的种系v区段是Vk1_L12，最接近的种系j区段是JK2。
如果不考虑未改变的微调残基[131]，VH结构域的构架区中有三个改变，VL结构域中有4个改变，用标准的定点诱变技术和合适的诱变引物，将它们都回复成最接近的种系序列以便完全匹配人抗体。
在由种系突变的CAN022D10的scFv序列中鉴定到总共5个微调残基。这些残基在重链中位于Kabat残基29(I代替V)、69(M代替I)、73(I代替N)和78(V代替L)。也在轻链序列中的Kabat残基46(V代替L)处鉴定到单个Vernier突变。
然后，在IL-6诱导的TF-1增殖实验中再次评估种系化IgG，以确认效力未降低。种系化的(GL)抗体的效力见表5。
表5：在IL-6诱导的TF-1细胞增殖实验中评估时种系化的优化克隆的示例性效力数据
克隆 IC50(pM)
抗体7(GL) 5
抗体10(GL) 71
抗体17(GL) 1
抗体18(GL) 3
CNTO-328 101
2.7.通过优化IgG抑制内源性IL-6诱导的人滑膜成纤维细胞释放VEGF
在滑膜成纤维细胞VEGF释放实验中检测优化的IgG，以评估对抗内源性表达的IL-6的效力。该方法可参见章节1.7，详细记载于材料和方法章节。所检测IgG的示例性效力见表6a。所检测IgG的平均效力数据见表6b。
表6a：在IL-6诱导的滑膜成纤维细胞VEGF释放实验中评估对抗内源性IL-6的效力时优化克隆的示例性效力数据
克隆(GL＝种系化克隆) IC50(nM)
抗体2 0.59
抗体3 0.38
抗体4 0.52
抗体5 0.70
抗体7(GL) 0.75
抗体10(GL) 0.55
抗体17(GL) 0.57
抗体18(GL) 0.93
CNTO-328 1.31
表6b：在IL-6诱导的滑膜成纤维细胞VEGF释放实验中评估对抗内源性IL-6的效力时优化克隆的平均效力数据
克隆(GL＝种系化克隆) IC50(nM)(95％CI) n
抗体7(GL) 0.78(0.54-1.11) 3
抗体17(GL) 0.57(0.51-0.64) 3
抗体18(GL) 0.67(0.20-2.25) 4
CNTO-328 1.02(0.39-2.63) 4
2.8.在表位竞争试验中优化抗体的选择性和物种交叉反应性
再次利用如前所述(参见章节1.6以及材料和方法)的表位竞争实验评估一系列克隆的选择性和物种交叉反应性。人和短尾猴IL-6产生重叠抑制曲线，因此所有所检测IgG的IC50值不确定。没有观察到鼠、大鼠或犬IL-6或者所检测的任何相关人蛋白质对所述一系列抗体的抑制作用。这些数据表明，所检测的一系列克隆能与短尾猴IL-6交叉反应，但不结合鼠、大鼠或犬IL-6，或与人IL-6最相关的人蛋白质。
2.9利用BIAcore计算优化克隆的亲和力数据
通过表面等离振子共振，利用BIAcore2000生物传感器(BIAcore公司(BIAcoreAB))，基本如参考文献[132]所述，测定代表性抗体7和18的纯化IgG样品与人和短尾猴IL-6的结合亲和力。简要说，利用胺偶联试剂盒(BIAcore公司)将纯化抗体偶联于CM5传感器芯片表面，以提供220-225Ru的表面密度。使HBS-EP缓冲液配制的200nM和0.2nM之间一系列浓度的人和短尾猴IL-6通过传感器芯片表面。利用BIA评估3.1软件评估所得传感图，以提供相对结合数据。
BIAcore2000TM生物传感器的亲和力测定范围的下限约为10pM(BIAcore2000设备手册)。由所得数据可以看出，抗体与人和短尾猴IL-6的亲和力低于此10pM检测限，即抗体比可测定值更强效。因此，未计算准确的亲和力测定值。利用此种方法，认为两种抗体与两种IL-6物质的亲和力小于10pM。
2.10利用TF-1细胞增殖体外实验计算优化克隆的亲和力数据
利用TF-1实验，以席尔德分析计算抗体18的亲和力。将IL-6标准曲线(7.7x10-15M至3x10-9M)与一系列IgG浓度(2.67x10-13M至8.3x10-10M)混合，重复两次。利用Log10(抗体浓度)对Log10(剂量比)作图，从而确定IgG的亲和力。利用此种方法，抗体18(GL)与人IL-6的亲和力计算为0.40pM(95％CI0.12pM–0.69pM，n＝6)。
2.11利用IL-6介导的B9细胞体外增殖测定人重组IL-6的拮抗剂功效
在抗体18和同种型对照抗体存在下评估IL-6诱导的B9细胞增殖。评估一系列浓度的各抗体(1x10-13M至1x10-9M)对IL-6标准曲线(浓度范围1x10-14M至1x10-9M)的影响。数据点为一式两份。通过阿拉马蓝(alamarblue)的还原(荧光法)，在培育4天后测定B9增殖。
抗体18显示能抑制IL-6诱导的B9增殖。同种型对照无抑制作用。平均数据见表8。
表8：抑制IL-6诱导B9增殖的平均Kb数值
平均Kb pM(95％CI) n
抗体18(GL) 0.3(0.1–0.5) 6
2.12利用IL-6介导的SKW6.4细胞体外释放IgM测定拮抗剂对人重组IL-6的功效
IL-6诱导人B淋巴母细胞系SKW6.4分泌IgM。SKW6.4细胞与一系列IL-6浓度(1x10-13M至3x10-8.5M)一起培育得到对IgM分泌的平均[A]50为77pM(n＝3)。通过观察100pMIL-6存在下不同抗体浓度(1x10-12.5M至1x10-8M)的抑制作用评估抗人IL-6抗体7、17和18以及同种型对照抗体对IL-6诱导的IgM分泌的影响。4天后，利用抗-人IgMELISA测定IgM分泌。数据点为一式两份。
抗体7、17和18抑制IL-6诱导的IgM分泌。在这些实验中同种型对照无抑制作用。平均数据见表9。
表9：对SKW6.4细胞的IgM分泌的平均抑制
平均IC50pM n
抗体7(GL) 2.64 3
抗体17(GL) 3.21 3
抗体18(GL) 2.63 3
实施例3表位作图
3.1抗-IL-6抗体表位与已知抗-人IL-6抗体的比较
将抗体18(GL)的表位与两种抗-人IL-6抗体B-E8和cCLB8的表位作比较。已知这两种抗体能抑制IL-6与IL-6Ra结合，并已作为潜在治疗剂进行研究[5,31,34,37,133]。为了对这三种抗体的表位进行比较，构建与野生型(wt)序列相比各自含有一个氨基酸突变的一组IL-6突变体。然后，利用生化竞争实验评估这些突变体与不同抗体的结合。这些实验基于实施例1.6所述的生化竞争实验，按需改变了抗体和IL-6变体的浓度。简要说，将PBS配制的浓度为2nM(抗体18)或4nM(B-E8和cCLB8)抗体包被到96-孔NM免疫测定(NuncMaxisorpimmunoassay)板的表面，4℃培育过夜。用3％(w/v)BSA的PBS溶液封闭孔表面后，将与终浓度0.15nM的生物素化人IL-6混合的浓度范围为200nM至10pM的抑制剂稀释液加入抗体包被的孔中使其结合。利用铕标记的链霉亲和素测定生物素化IL-6与抗体的结合。
通过比较突变体与未标记野生型人IL-6的IC50值，可建立各突变体的效力比。然后，通过比较不同抗体的这些比例，可评估各突变对抗体与IL-6分子结合的影响。这些实验的典型结果见表10，实验再重复两次。
表10：一组IL-6突变体对于抗-人IL-6抗体抗体18、B-E8和cCLB8的IC50和效力比
表10中的残基编号代表全长人IL-6(SEQIDNO:161)的氨基酸序列。
结果表明，三种抗体对该组IL-6突变体有不同的结合特性，因此结合该细胞因子表面上的不同表位。Kalai等(1997)以前观察到，cCLB8不识别IL-6突变体F106E。这一点在我们的实验中得到证实，因为它不抑制生物素化IL-6与抗体的结合。相反，在使用抗体18的竞争实验中，IL-6突变体F106E的效力只比wtIL-6低5倍，这表明它能强烈结合该抗体。利用突变体Q211A观察到相似结果，其中对抗体18的效力比为1.5，而对cCLB8为158。相反，在cCLB8实验中突变体F102E、R207E、R207L和S204E是有效抑制剂，但在抗体18实验中观察到明显不如wtIL-6有效。
用突变体R58E和S204E观察到抗体18和B-E8的结合差异。R58E与抗体18的效力比为2.009，而与B-E8的效力比为79.083，这表明此突变降低了B-E8与IL-6的结合。在所检测的三种抗体中，突变S204E的作用似乎是抗体18特有的。如同cCLB8那样，此突变对IL-6与B-E8结合的效力影响很小，然而对于抗体18，在生化实验中该突变体的效力比野生型IL-6低100倍以上。
实施例4体内给予抗-IL-6抗体
4.1给予抗-IL-6抗体对小鼠中人重组IL-6诱导的嗜中性粒细胞和触珠蛋白增加的影响
已知全身给予IL-6能引起嗜中性粒细胞和急性期蛋白质浓度的全身性增加。将人IL-6腹膜内注射给雄性C57/B/6/J小鼠产生体内模型，测定嗜中性粒细胞和急性期反应蛋白质触珠蛋白的浓度。测定通过皮下注射给予的抗体18(GL)抑制应答的能力。
4.2触珠蛋白测定
在7天中腹膜内注射人IL-6(5.2nmol/kg，等于12mg/kg，每日两次)导致血浆触珠蛋白水平从0.02±0.01mg/mL(运载体对照)明显增加到1.19±0.27mg/mL(IL-6处理组)(T检验，P<0.01)。虽然IgG1同种型对照没有作用，但抗体18剂量依赖性地抑制应答，在10.6nmol/kg(156mg/kg)和更高的剂量下观察到显著的抑制水平(ANOVA，与单用IL-6相比P<0.01)(图1)。
4.3嗜中性粒细胞测定
在7天中腹膜内注射人IL-6(5.2nmol/kg，等于12mg/kg，每日两次)导致中性粒细胞计数从1.1±0.44x109个细胞/升(运载体对照)明显增加到2.47±0.12x109个细胞/升(IL-6处理组)(T检验，P<0.01)。虽然IgG1同种型对照没有作用，但抗体18剂量依赖性地抑制应答，在1.5nmol/kg(23mg/kg)和更高的剂量下观察到显著的抑制水平(ANOVA，与单用IL-6相比P<0.01)。
这些结果确认，抗-IL-6抗体具有在体内抑制IL-6的全身作用的能力。
材料和方法
通过粗制scFv抑制IL-6与IL-6受体结合
用受体-配体结合(时间分辨的均一荧光)测定形式中筛选选择所得物抑制穴合物标记的人IL-6(R&D系统公司206-IL)或HISFLAG标记的人IL-6(内部大肠杆菌衍生的)与生物素化IL-6R(派普公司200-06R)的结合。
先导物分离期间的所得物筛选为未稀释的粗制scFv，其含有在200mMhepes缓冲液pH7.4、0.5mMEDTA和0.5M蔗糖中配制的周质提取物。用8nM链霉亲和素XLent！(TM)(CIS生物国际公司(CISBioInternational)611SAXLA)室温下避光预孵育8nM生物素化人IL-6R30分钟。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(试验缓冲液)中进行。
试剂预温育后，将10μl粗制scFv样品加入384孔低体积试验平板(Costar3676)。然后加入5μl预培育的生物素化受体和链霉亲和素XLent！(TM)混合物，然后是5μl11.2nM穴合物标记的人IL-6。
然后在室温下将试验平板以1000rpm离心1分钟，室温下温育2小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
通过纯化的scFv和IgG抑制IL-6与IL-6受体的结合
在测定中检测来自筛选鉴定的阳性克隆的纯化scFv和IgG对HISFLAG标记的人IL-6与生物素化IL-6R结合的抑制。用8nM链霉亲和素XLent！(TM)室温下避光预孵育8nM生物素化人IL-6R30分钟。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(试验缓冲液)中进行。
通过滴定纯化样品以确定由试验的IC50值测定的克隆效力。试剂预温育后，将10μl纯化scFv样品的滴定液加入384孔低体积试验平板(Costar3676)。然后加入5μl预培育的生物素化受体和链霉亲和素XLent！(TM)混合物。将2nMHISFLAG标记的人IL-6与1.732nM穴合物标记的抗-flagIgG(CIS生物国际61FG2KLB)混合后，立即将5μl混合物加入测定平板中。
然后在室温下将试验平板以1000rpm离心1分钟，室温下温育2小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。
数据处理
用以下方法分析来自上述测定的数据。
通过计算各样品的％ΔF值分析数据。按照方程1测定ΔF。
方程1：
随后用％ΔF值计算％特异性结合，如方程2所述。
方程2：
利用4-参数逻辑方程(方程3)，采用图垫公司Prism软件通过曲线拟合测定IC50值。
方程3：
Y＝底+(顶–底)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))
X是浓度的对数。Y是特异性结合。
Y从“底”开始，以S形上升到“顶”。
所有试验包含参比抗-IL-6mAb(生物源公司(Biosource)AHC0562)作为阳性对照。
通过纯化scFv和IgG抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖
TF-1细胞由R&D系统公司赠与，按照提供的方案培养。测定培养基包括含有GLUTAMAXI(英杰公司(Invitrogen))、5％胎牛血清(JRH)和1％丙酮酸钠(西格玛公司(Sigma))的RPMI-1640。各测定前，300xg离心5分钟以沉淀TF-1细胞，吸除培养基，将细胞重悬于测定培养基。利用以5x105个细胞/毫升的终浓度重悬于测定培养基的细胞重复该过程两次。用100微升/孔的密度将细胞接种于96孔测定板。在37℃和5％CO2下培育该平板24小时，除去GM-CSF以饥饿细胞。用测定培养基将纯化scFv或IgG(一式两份)的测试溶液稀释至所需浓度。不针对IL-6的无关抗体用作阴性对照。以总体积100微升/孔与合适的测试抗体混合时，加入重组细菌衍生的人(R&D)和短尾猴(内部)IL-6，至终浓度分别为20pM(人IL-6)或100pM(短尾猴)。将测定中所用的IL-6浓度选定为最终测定浓度时产生约80％最大增殖反应的剂量。在室温下培育所有样品30分钟。然后将100微升IL-6和抗体混合物加入100微升细胞中，使得总测定体积为200微升/孔。在37℃和5％CO2下培育平板24小时。然后，在各测定点加入20μl氚标记的胸苷(5μCi/ml)，然后将平板放回培养箱再温育24小时。用细胞收获器在玻璃纤维滤板(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))上收获细胞。用帕克托克(PackardTopCount)微孔板液体闪烁计数器测定胸苷掺入。然后，用图垫公司Prism软件分析数据。
用时间分辨荧光实验测定对生物素化人IL-6与固定的抗IL-6抗体结合的 抑制的方法
此测定所用且由实施例2.6提供结果的特定方法采用试剂，如上所示。以下对该方法作更一般地描述，它适合用作测定和/或定量测定其它IL-6形式和相关蛋白质与抗IL-6Mab结合的实验。
在该测定中，抗-IL-6单克隆抗体结合于固体支持物，例如通过Fc连接于该支持物。聚苯乙烯高蛋白结合平板，例如NM平板(NuncMaxisorbplate)可用作合适支持物。
-以50微升/孔将PBS配制的抗IL-6Mab包被在平板上，4℃过夜。
-所有后续步骤均在室温下进行。
-用PBS洗涤平板3次，含有0.05％吐温20(PBST，目前可购自西格玛公司(Sigma)，P1379)，然后用300微升/孔含3％(w/v)BSA的PBS(目前可购自罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)，70129138)封闭1小时。
-用PBST洗涤平板三次。
-用含有3％(w/v)BSA的PBS制备抑制剂滴定液，并加入‘稀释’平板(40微升/孔)，然后加入40微升/孔生物素化IL-6，生物素化IL-6的终浓度等于该蛋白与抗体的KD。将50μl样品从稀释平板转移到测定平板的相应孔中
-培育平板1小时。
-用PBST洗涤平板三次，然后向各孔中加入50微升/孔0.1μg/ml铕标记的链霉亲和素，该链霉亲和素是用含有0.9％NaCl、0.5％纯化BSA、0.1％吐温20和20μMEDTA的50mMTris-HCl，pH7.5配制的，然后培育1小时。
-用由0.05MTris缓冲盐水(0.138MNaCl，0.0027MKCl)、0.05％(v/v)吐温20，pH8.0组成的洗涤缓冲液(25℃)洗涤平板七次。
-向各孔中加入50微升增强溶液，用含有曲通X-100以及螯合剂βNTA和TOPO的乙酸酸化。所引起的pH由碱性向酸性的改变导致铕离子与链霉亲和素偶联物快速分离。然后，游离的铕离子与可用螯合剂形成荧光螯合物。通过提供TOPO去除水，使螯合剂形成胶束，延长螯合剂的荧光性。
-培育5分钟，然后在620nm发射波长处测定时间分辨荧光。按照方程1将荧光数据转变为％特异性结合。在含有生物素化huIL-6但不含竞争物的对照孔中测定总结合。在含有生物素化huIL-6和100倍过量的huIL-6的孔中测定非特异性结合。将所得数据拟合至S形曲线，以按照方程2计算IC50值。
测定生化表位竞争实验的抗体包被和生物素化huIL-6浓度
用于包被的抗体浓度和用于表位竞争实验的生物素化huIL-6浓度取决于两种试剂的相互作用的亲和力和抗体固定效率。因此，必须测定所检测各抗体的标准抗体包被浓度和所需的生物素化huIL-6浓度。
通用原则是，各测定所用的生物素化huIL-6的终浓度等于经饱和分析测定的配体与相应抗体的KD。用于包被的抗体浓度应该是，以KD加入生物素化huIL-6时，在竞争测定条件下测得的最低信号背景比为10:1。
在 表位竞争试验中抗体的选择性和物种交叉反应性
在PBS中将纯化的IgG吸附到96-孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)上，其浓度为当将生物素化人IL-6大致以对该具体IgG的估计Kd加入时能获得明显的信号。用PBS-吐温(0.1％v/v)洗去过量的IgG，用PBS-Marvel(3％w/v)封闭各孔1小时。从生物素化人IL-6和相应IgG相互作用的KD的约200倍浓度开始，用PBS制备以下各竞争物的连续稀释液：人IL-6、短尾猴IL-6、大鼠IL-6(R&D系统公司506-RL/CF)、鼠IL-6(R&D系统公司406-ML/CF)、人CNTF(R&D系统公司257-NT/CF)、人LIF(开米康公司，LIF1010)、人IL-11(R&D系统公司518-IL/CF)、人制瘤素M(R&D系统公司295-OM/CF)。未生物素化的人IL-6用作阳性对照。向该连续稀释液中加入浓度约是Kd两倍的等体积生物素化重组人IL-6(获得竞争抗原:生物素化人IL-6的起始比例约为100:1的连续稀释液)。然后将这些混合物转移到封闭的IgG上，平衡1.5小时。用PBS-吐温(0.1％v/v)洗涤除去未结合的抗原，而用链霉亲和素-铕3+偶联物(检测，帕金埃尔默公司(PerkinElmer))检测剩下的生物素化人IL-6。利用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)检测620nm的时间-分辨荧光。将荧光数据转换为％特异性结合(100％是从含有生物素化人IL-6但不含竞争对手的对照孔测定，0％是从含有生物素化人IL-6和超过100倍的未生物素化人IL-6的孔测定)。按照方程3，利用图垫公司的Prism曲线拟合软件分析得到的数据以测定IC50值。
用时间分辨荧光实验测定对生物素化人IL-6与固定的抗IL-6抗体结合的 抑制的方法
此测定所用且由实施例2.8提供结果的特定方法采用试剂，如上所示。以下对该方法作更一般地描述，它适合用作测定和/或定量测定其它IL-6形式和相关蛋白质与抗IL-6Mab结合的实验。
在该测定中，抗-IL-6单克隆抗体结合于固体支持物，例如通过Fc连接于该支持物。聚苯乙烯高蛋白结合平板，例如NM平板(NuncMaxisorbplate)可用作合适支持物。
-以50微升/孔将PBS配制的抗IL-6Mab包被在平板上，4℃过夜。
-所有后续步骤均在室温下进行。
-用PBS洗涤平板3次，含有0.05％吐温20(PBST，目前可购自西格玛公司(Sigma)，P1379)，然后用300微升/孔含3％(w/v)BSA的PBS(目前可购自罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)，70129138)封闭1小时。
-用PBST洗涤平板三次。
-用含有3％(w/v)BSA的PBS制备抑制剂滴定液，并加入‘稀释’平板(40微升/孔)，然后加入40微升/孔生物素化IL-6，生物素化IL-6的终浓度等于该蛋白与抗体的KD。将50μl样品从稀释平板转移到测定平板的相应孔中
-培育平板1小时。
-用PBST洗涤平板三次，然后向各孔中加入50微升/孔0.1μg/ml铕标记的链霉亲和素，该链霉亲和素是用含有0.9％NaCl、0.5％纯化BSA、0.1％吐温20和20μMEDTA的50mMTris-HCl，pH7.5配制的，然后培育1小时。
-用由0.05MTris缓冲盐水(0.138MNaCl，0.0027MKCl)、0.05％(v/v)吐温20，pH8.0组成的洗涤缓冲液(25℃)洗涤平板七次。
-向各孔中加入50微升增强溶液，用含有曲通X-100以及螯合剂βNTA和TOPO的乙酸酸化。所引起的pH由碱性向酸性的改变导致铕离子与链霉亲和素偶联物快速分离。然后，游离的铕离子与可用螯合剂形成荧光螯合物。通过提供TOPO去除水，使螯合剂形成胶束，延长螯合剂的荧光性。
-培育5分钟，然后在620nm发射波长处测定时间分辨荧光。按照方程1将荧光数据转变为％特异性结合。在含有生物素化huIL-6但不含竞争物的对照孔中测定总结合。在含有生物素化huIL-6和100倍过量的huIL-6的孔中测定非特异性结合。将所得数据拟合至S形曲线，以按照方程2计算IC50值。
测定生化表位竞争实验的抗体包被和生物素化huIL-6浓度
用于包被的抗体浓度和用于表位竞争实验的生物素化huIL-6浓度取决于两种试剂的相互作用的亲和力和抗体固定效率。因此，必须测定所检测各抗体的标准抗体包被浓度和所需的生物素化huIL-6浓度。
通用原则是，各测定所用的生物素化huIL-6的终浓度等于经饱和分析测定的配体与相应抗体的KD。用于包被的抗体浓度应该是，以KD加入生物素化huIL-6时，在竞争测定条件下测得的最低信号背景比为10:1。
利用抗体-配体生化实验鉴定改进克隆
在表位竞争测定形式中筛选先导物优化获得的选择产物对HISFLAG标记的人IL-6(内部大肠杆菌衍生的)与生物素化抗IL-6抗体(先导物分离产生的内部IgG，CAN022D10)结合的抑制能力。
先导物优化期间的产物筛选为未稀释的粗制scFv，其含有在50nMMOPS缓冲液pH7.4、0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中配制的周质提取物。在室温下用1.732nM穴合物标记的抗-flagIgG(CIS生物国际61FG2KLB)避光预孵育1nM人HISFLAGIL-630分钟。所有稀释在测定缓冲液中进行。平行地，用20nM链霉亲和素XLent！(TM)(CIS生物国际611SAXLB)在室温下避光预培育1nM生物素化抗-IL-6IgG(待检测的受试结合成员与它的竞争)30分钟。
预培育试剂后，将10μl粗制scFv样品加入黑色384孔光学平板(帕金埃尔默目录号6007279)。然后向整个平板中加入10μl测定缓冲液。然后加入10μl预培育的生物素化抗-IL-6IgG和链霉亲和素XLent！(TM)混合物，以及10μl预培育的带HISFLAG标记的人IL-6抗-flag穴合物混合物。
然后在室温下将试验平板以1000rpm离心1分钟，室温下温育2小时，再用EnVision平板读数计(帕金埃尔默公司)读取620nm和665nm发射波长的时间-分辨荧光。如前所述计算％ΔF和％特异性结合，以便分析数据。
由随机诱变文库鉴定改进的先导物后，以改进的表位竞争试验筛选未稀释的CDR3靶向诱变选择的粗制scFv所得物，该试验包括以下改进：用1.732nM穴合物标记的抗-flagIgG(CIS生物国际61FG2KLB)在室温下避光预培育0.5nM人HISFLAGIL-630分钟。平行地，用40nM链霉亲和素XLent！(TM)(CIS生物国际611SAXLB)在室温下避光预培育16nM生物素化抗-IL-6IgG(抗体5，由CAN022D10随机诱变选择鉴定的内部IgG)30分钟。所有其它条件与CAN022D10表位竞争试验相同。如前所述计算％ΔF和％特异性结合，以便分析数据。
通过纯化IgG抑制内源性IL-6诱导的人滑膜成纤维细胞释放VEGF
将来自全关节置换术的类风湿性关节炎膝盖样品放入含抗生素的DMEM中。在培养基浸浴中由关节分离滑膜并细细切碎。用含有10％FCS的培养基洗涤滑膜组织。37℃在CO2培养箱中用胶原酶溶液培育细胞悬液2小时。通过10ml移液管反复吹打以分离消化的滑膜细胞悬液，在室温下400g离心5分钟以收集细胞。将细胞重悬于含有10％FCS的DMEM中，通过细胞过滤器(strainer)，将细胞密度调整至1x106个细胞/毫升，37℃在CO2培养箱中用225-cm2细胞培养瓶(3001，克斯康宁公司(CoStarCorningInc.))培育。贴壁后，弃去大部分培养基，更换新鲜培养基，放回培养箱长期培养。每周检测细胞，铺满时通过胰蛋白酶消化传代，传代比例为三分之一。
每个培养瓶用10mL0.1％胰蛋白酶-EDTA溶液(25300-054，吉布科生命科学公司(GibcoLifeSciences))37℃处理5-10分钟，以便从培养瓶上分离铺满的成纤维细胞(P3-5)。将等体积的含10％FCS的DMEM基培养基加入细胞中，然后通过330g室温离心5分钟沉淀细胞。用含10％FCS的DMEM基培养基洗涤细胞一次后，将细胞悬液(1x105个细胞/毫升)加入(150微升/孔)无菌96孔细胞培养群平底聚苯乙烯平板(3598，克斯康宁公司)的孔中，密度为1.5x104个细胞/孔。还向各孔中加入含10％FCS的DMEM基培养基(100微升/孔)，得到总体积为250微升/孔。37℃培育细胞过夜，以使其贴壁和休眠(quiescence)。
检查该96孔板，以保证细胞铺满且处于良好状态(例如无污染)。然后，吸出孔中的培养基，并立即加入100μL含10％FCS的DMEM基培养基。至此，将50μL包含样品IgG的含10％FCS的DMEM基培养基或单独的培养基加入各孔(1:5稀释至实验中)。
然后每孔加入50μL包含重组人可溶性(rhs)IL-6Rα(500ng/mL；12nM)和rhIL-1β(50pg/mL；2.95pM，1:5稀释至实验中)的含10％FCS的DMEM基培养基。
在不同孔中，加入50μL包含rh-IL-6(0，100ng/mL；21.5nM)、sIL-6Rα(500ng/mL；12nM)、rhIL-1β(50pg/mL；2.95pM)的含10％FCS的DMEM基培养基或单独的培养基(1:5稀释至实验中)。各孔的最终体积为250μL。
37℃培育该平板48小时。如平板形式所述，在两复孔或三复孔中进行培育。室温下330g离心平板5分钟，去除培养液上清，在平底微量滴定板(611F96，Sterilin)中-40℃保存。
按照生产商说明，用ELISA(DY293B，R&D系统公司)测定VEGF。简要说，用小鼠抗-人VEGF抗体4℃包被ELISA平板过夜，用1％BSA/PBS封闭。用0.05％吐温20/PBS洗涤平板，用人滑膜衍生的成纤维细胞培养上清液和生物素化山羊抗-人VEGF抗体室温培育过夜。洗涤后，使用链霉亲和素辣根过氧化物酶检测VEGF。利用1:1H2O2:四甲基联苯胺使平板发色。用2MH2SO4终止反应，将校正波长设定为540nm，在450nm测定光密度。
BIAcore测定
利用BIAcore2000TM进行BIAcore研究。利用胺偶联试剂盒将抗体偶联于CM-5传感器芯片表面，以提供220-225Ru的表面密度。使HBS-EP缓冲液配制的200nM和0.2nM之间一系列浓度的人IL-6通过传感器芯片表面。利用BIA评估3.1软件评估所得传感图，以计算所检测抗体的k结合、k解离和KD值。
IL-6介导的B9细胞增殖试验
B9细胞是根据对IL-6的特异性应答选择的鼠B-细胞杂交瘤细胞系B13.29的亚克隆。B9细胞的存活和增殖需要IL-6，对极低浓度的IL-6起反应。
在抗体18和同种型对照(CAT-002)存在下评估IL-6诱导的B9细胞增殖。评估一系列浓度的各抗体(1x10-13M至1x10-9M)对IL-6标准曲线(浓度范围1x10-14M至1x10-9M)的影响。数据点为一式两份。通过阿拉马蓝的还原(荧光法)，在培育4天后测定B9增殖。
在含有5％FCS、2mML-谷胺酰胺和50μM2-巯基乙醇的RPMI-1640中培养B9细胞。每2-4天传代细胞，至细胞密度为0.05x106mL-1至0.1x106mL-1，补充5x10-13M人IL-6。实验所用细胞在实验前在未补充IL-6的条件下培养至少48小时，但在实验的96小时内在补充IL-6的条件下培养。实验所用细胞取自密度不超过0.8x106mL-1的母液培养瓶。
在测定培养基(RPMI+5％FCS、2mML-谷胺酰胺、50μM2-巯基乙醇、青霉素100UmL-1和链霉素100mgmL-1)中适当稀释，以便将各抗体从母液稀释至最大所需测定浓度的10倍。再用培养培养基稀释10倍，以获得所需浓度的各抗体。
通过加入合适体积的无菌PBS+0.1％BSA将冻干粉末重建成1x10-5M的IL-6溶液。用培养基进一步稀释至1x10-8M。1x10-8M等份冷冻保存待用。在测定当天，按需稀释1x10-8M等份，以获得十倍于所需最终测定浓度的一系列溶液。
从培养瓶中取出所需体积的细胞，300g离心8分钟。取出上清液，将细胞重悬于适当体积的培养基以获得0.5x106mL-1的细胞密度。
在组织培养物处理的聚苯乙烯96孔平底板中进行测定。最终测定体积为200μL。将20μL10x抗体(抗体18或CAT-002)溶液或培养基加入各板的合适孔中，然后再加入140μL培养基和20μL合适浓度的IL-6或培养基。
将平板放入潮湿的5％CO2、37℃培养箱2小时。然后将20μL细胞加入各孔。最终每孔的细胞数量为10000。然后，将该平板放回培养箱，静置4天。通过阿拉马蓝掺入评估细胞增殖。将10％v/v阿拉马蓝加入各孔，将平板放回培养箱静置6小时。然后，在分光荧光计上以544nm激发后，以590nm阅读平板。
根据各平板上的对照IL-6的曲线标准化原始数据，以便将最大荧光确定为100％，基础荧光确定为0％。用图垫公司Prism4.01中的非线性回归、S形剂量反应(可变斜率)拟合程序拟合标准化数据。利用对照pEC50值和各浓度抗体存在下的pEC50值确定剂量比(DR)。利用以下化学拮抗方程测定在IL-6浓度效应曲线中引起3倍或更多漂移的抗体最低浓度的Kb值：
Kb＝([Ab]/(DR-1))
(KenakinTP.刊于：药物受体相互作用的药理学分析(PharmacologicAnalysisofDrug-ReceptorInteractions).第1版.纽约：雷文出版社(RavenPress)；1987.第205-24页)。
IL-6介导的SKW6.4细胞释放IgM的测定
IL-6参与B细胞最终成熟为产生抗体的细胞(B-淋巴细胞分化过程)。SKW细胞曾用于研究B细胞应答(Nawata等，Ann.N.Y.Acad.Sci.557:230-238.1989)。类风湿性关节炎中产生的自身抗体主要是IgM类型的抗体。SKW6.4是分泌IgM的克隆的人类淋巴母细胞B细胞系。细胞来自ATCC，参考号#TIB215。用IL-6刺激时，这些细胞分泌IgM，因此认为该实验与类风湿性关节炎有关。
在CAT6001和CAT-002(同种型对照)存在下评估IL-6诱导SKW6.4细胞分泌IgM。在100pMIL-6存在下评估一系列浓度的各抗体(1x10-12.5M至1x10-8M)的影响。数据点为一式两份。培育4天后，利用抗-人IgMELISA试验测定细胞上清中的IgM分泌。
在37℃，95％相对湿度和95/5％(v/v)空气/CO2下，在含有2mML-谷胺酰胺和10％(v/v)胎牛血清的RPMI1640中培养SKW6.4细胞。将细胞密度维持在0.4和2x106个细胞/毫升之间。在常规细胞传代中，室温下300xg离心5分钟以收获细胞，去除旧培养基，将细胞重悬于所需体积的新鲜培养基。
在测定培养基(RPMI+10％FCS，2mML-谷胺酰胺)中适当稀释，以便将各抗体从母液稀释至最大所需测定浓度的50倍。再用培养培养基稀释10倍，以获得所需浓度的各抗体。
在组织培养物处理的聚苯乙烯96孔平底板中进行测定。用新鲜培养基将SKW6.4细胞母液稀释至细胞密度为0.3x106ml-1，并以100微升/孔(30,000个细胞/孔)的密度种板。向各孔中加入2μl所示终浓度的抗体，然后加入2μl终浓度100pM的IL-6。
然后，将平板放回37℃、5％CO2的培养箱。培育4天后，通过离心收获无细胞上清液，然后在收获当天通过IgMELISA测定或冷冻保存于-20℃，以后进行进一步分析。
用来自赛罗泰克(Serotec)的一对抗体产生ELISA。包被抗体是小鼠抗-人IgM(MCA1662)，检测抗体是连接HRP的山羊抗-人IgM(STAR98P)。通过标准方法优化该测定，以得到良好的信噪比，其中利用1:2000稀释的包被抗体(5μg/ml)和1:3500稀释的检测抗体(200ng/ml)。
IgM标准溶液(目录号PHP003人Mκ纯化蛋白质)购自赛罗泰克公司，用于产生标准曲线。
利用标准拟合程序，对IgM标准曲线数据进行多项式拟合，以便分析数据。相对于不存在抗体时对照IgM产量，计算各抗体样品的抑制百分数，并产生IC50值。
产生IL-6和IL-6突变蛋白进行表位作图
人和短尾猴IL-6cDNA的克隆
人和猕猴IL-6的序列获自Embl(人和短尾猴的登录号分别为BC015511和AB000554)。使用这些序列设计寡核苷酸引物，以扩增编码人和猕猴IL-6的cDNA。就人和短尾猴而言，N-末端引物分别是hIL6_5'NdeI和macIL6_5'NdeI，macIL6_3'NheI用作二者的C末端引物(寡核苷酸序列参见表11)。
表11：引物序列
进行PCVR反应以扩增这两个cDNA。各PCR反应的模板是分别获自人肝脏和短尾猴肝脏的10ngcDNA。纯化由各反应扩增的cDNA，并按照生产商说明用拓扑异构酶连接反应克隆到pCR4blunttopo(英杰公司)中。
鉴定阳性克隆并进行测序。用标准技术将得到的cDNA亚克隆到各种大肠杆菌T7-启动子表达载体中，以便将编码成熟的人或短尾猴IL-6的cDNAN末端融合于恰好在成熟IL-6的N末端缬氨酸上游的N末端HIS6-FLAG标签。
产生突变体
利用司查塔基公司(Stratagene)的快变(Quikchange)XL试剂盒，按照生产商方案进行定点诱变。按照生产商方案进行诱变引物的设计。利用质粒pT7flagHISIL-6作模板，按照方案进行诱变反应。然后进行后续DpnI消化，并转化到化学感受态Top10细胞中，在含有合适抗生素的琼脂平板上37℃培养过夜以进行选择。对各单独诱变反应而言，对几个克隆进行测序，将每个反应的一个正确克隆的质粒DNA保留待用。
IL-6和IL-6突变蛋白的表达
用生产商方法将IL-6表达质粒转化到化学感受态BL21(DE3)星形细胞(starcell)(英杰公司)中。用转化细胞接种1LTerrific肉汤培养物，在轨道培养箱上37℃培育，直到A600达到0.5。然后加入IPTG至0.25mM，继续于22℃培育过夜。离心收获细胞，将细胞沉淀储存于-80℃。
IL-6和IL-6突变蛋白的纯化
融化细胞沉淀，每份细胞沉淀重悬于50ml含50mM磷酸钾，pH7.4、10mM咪唑、0.3MNaCl、5mMβ-巯基乙醇、10％甘油(缓冲液A)+无EDTA的完全蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的溶液中。在冰上超声裂解细胞3x30秒。100,000g和4℃离心裂解物30分钟，对上清液进行NiNTA亲和层析。用缓冲液A以3毫升/分钟平衡5mlNi-NTA超流(Superflow)柱(凯杰公司)。加载IL-6样品，用10倍柱体积的缓冲液A配制的15mM咪唑洗柱。然后用10倍柱体积的缓冲液A配制的30mM咪唑洗柱。用5倍柱体积的缓冲液A配制的0.3M咪唑洗液上行洗涤从柱上洗脱IL-6。在洗涤步骤中收集10ml组分，在洗脱步骤中收集5ml组分。该柱在4℃下，用AKTA探索者100空气(Explorer100Air)操作。汇集含有纯化IL-6蛋白的组分，用5LPBS4℃透析过夜。
用凝胶过滤层析进一步纯化透析的IL-6蛋白。在每次纯化中，以100,000g和4℃离心透析的IL-6蛋白20分钟。将至多13ml施加于用PBS以2.5毫升/分钟平衡过的318mlSuperdex20026/60柱(GE健康护理公司(GEHealthcare))。该柱在4℃下，用AKTA纯化气(Purifier)操作。收集含有单体IL-6蛋白峰的组分进行进一步分析。
用标准SDS层析检查各蛋白质的纯度，测定蛋白质浓度，用Q-ToF质谱测定蛋白质质量。将纯化IL-6冷冻于液氮中，并保存于–80℃。
体内研究的材料和方法
将动物随机分配到测试组。然后，每天用设定的皮下剂量(10ml/kg)的运载体对照(PBS配制的0.05％BSA)或467μg/kgIgG1同种型对照或抗体18(范围从467μg/kg至8μg/kg)处理各测试组的小鼠。同时，通过腹膜内注射给予小鼠(10ml/kg)运载体对照(PBS配制的0.05％BSA)或12μg/kg人重组IL-6，每日两次。
在第7天，在09:00h给予最后一剂IL-6后2小时，处死小鼠，获得最终血样。将血液转移到LabTek1mlEDTA血液试管中，在滚轮(roller)上放置5分钟。然后将样品保持在冰上待用。利用塞思美可斯(Sysmex)细胞计数器进行差异细胞计数。将其余样品转移至微量离心管中，离心(300g，5分钟)获得血浆，再次将其等分并保存于–20℃，直到分析触珠蛋白水平。
按照英国海山的生物诊断公司(Biognosis，Hailsham，UK)的PHASETMRANGETriDeltaFormat试剂盒(目录号TP-801)中提供的说明书进行触珠蛋白测定。
所有结果均表示为平均值±SEM。通过非配对T检验或单向ANOVA后接邓奈特检验(Dunnett’stest)(GI公司(GraphPadInstat))进行数据分析。
序列
结合成员的VH结构域、VL结构域和CDR序列见所附序列表，其中SEQIDNO对应含义如下：
1CAN022D10VH核苷酸
2CAN022D10VH氨基酸
3CAN022D10VHCDR1氨基酸
4CAN022D10VHCDR2氨基酸
5CAN022D10VHCDR3氨基酸
6CAN022D10VL核苷酸
7CAN022D10VL氨基酸
8CAN022D10VLCDR1氨基酸
9CAN022D10VLCDR2氨基酸
10CAN022D10VLCDR3氨基酸
11抗体2VH核苷酸
12抗体2VH氨基酸
13抗体2VHCDR1氨基酸
14抗体2VHCDR2氨基酸
15抗体2VHCDR3氨基酸
16抗体2VL核苷酸
17抗体2VL氨基酸
18抗体2VLCDR1氨基酸
19抗体2VLCDR2氨基酸
20抗体2VLCDR3氨基酸
21抗体3VH核苷酸
22抗体3VH氨基酸
23抗体3VHCDR1氨基酸
24抗体3VHCDR2氨基酸
25抗体3VHCDR3氨基酸
26抗体3VL核苷酸
27抗体3VL氨基酸
28抗体3VLCDR1氨基酸
29抗体3VLCDR2氨基酸
30抗体3VLCDR3氨基酸
31抗体4VH核苷酸
32抗体4VH氨基酸
33抗体4VHCDR1氨基酸
34抗体4VHCDR2氨基酸
35抗体4VHCDR3氨基酸
36抗体4VL核苷酸
37抗体4VL氨基酸
38抗体4VLCDR1氨基酸
39抗体4VLCDR2氨基酸
40抗体4VLCDR3氨基酸
41抗体5VH核苷酸
42抗体5VH氨基酸
43抗体5VHCDR1氨基酸
44抗体5VHCDR2氨基酸
45抗体5VHCDR3氨基酸
46抗体5VL核苷酸
47抗体5VL氨基酸
48抗体5VLCDR1氨基酸
49抗体5VLCDR2氨基酸
50抗体5VLCDR3氨基酸
51抗体7VH核苷酸
52抗体7VH氨基酸
53抗体7VHCDR1氨基酸
54抗体7VHCDR2氨基酸
55抗体7VHCDR3氨基酸
56抗体7VL核苷酸
57抗体7VL氨基酸
58抗体7VLCDR1氨基酸
59抗体7VLCDR2氨基酸
60抗体7VLCDR3氨基酸
61抗体8VH核苷酸
62抗体8VH氨基酸
63抗体8VHCDR1氨基酸
64抗体8VHCDR2氨基酸
65抗体8VHCDR3氨基酸
66抗体8VL核苷酸
67抗体8VL氨基酸
68抗体8VLCDR1氨基酸
69抗体8VLCDR2氨基酸
70抗体8VLCDR3氨基酸
71抗体10VH核苷酸
72抗体10VH氨基酸
73抗体10VHCDR1氨基酸
74抗体10VHCDR2氨基酸
75抗体10VHCDR3氨基酸
76抗体10VL核苷酸
77抗体10VL氨基酸
78抗体10VLCDR1氨基酸
79抗体10VLCDR2氨基酸
80抗体10VLCDR3氨基酸
81抗体14VH核苷酸
82抗体14VH氨基酸
83抗体14VHCDR1氨基酸
84抗体14VHCDR2氨基酸
85抗体14VHCDR3氨基酸
86抗体14VL核苷酸
87抗体14VL氨基酸
88抗体14VLCDR1氨基酸
89抗体14VLCDR2氨基酸
90抗体14VLCDR3氨基酸
91抗体16VH核苷酸
92抗体16VH氨基酸
93抗体16VHCDR1氨基酸
94抗体16VHCDR2氨基酸
95抗体16VHCDR3氨基酸
96抗体16VL核苷酸
97抗体16VL氨基酸
98抗体16VLCDR1氨基酸
99抗体16VLCDR2氨基酸
100抗体16VLCDR3氨基酸
101抗体17VH核苷酸
102抗体17VH氨基酸
103抗体17VHCDR1氨基酸
104抗体17VHCDR2氨基酸
105抗体17VHCDR3氨基酸
106抗体17VL核苷酸
107抗体17VL氨基酸
108抗体17VLCDR1氨基酸
109抗体17VLCDR2氨基酸
110抗体17VLCDR3氨基酸
111抗体18VH核苷酸
112抗体18VH氨基酸
113抗体18VHCDR1氨基酸
114抗体18VHCDR2氨基酸
115抗体18VHCDR3氨基酸
116抗体18VL核苷酸
117抗体18VL氨基酸
118抗体18VLCDR1氨基酸
119抗体18VLCDR2氨基酸
120抗体18VLCDR3氨基酸
121抗体19VH核苷酸
122抗体19VH氨基酸
123抗体19VHCDR1氨基酸
124抗体19VHCDR2氨基酸
125抗体19VHCDR3氨基酸
126抗体19VL核苷酸
127抗体19VL氨基酸
128抗体19VLCDR1氨基酸
129抗体19VLCDR2氨基酸
130抗体19VLCDR3氨基酸
131抗体21VH核苷酸
132抗体21VH氨基酸
133抗体21VHCDR1氨基酸
134抗体21VHCDR2氨基酸
135抗体21VHCDR3氨基酸
136抗体21VL核苷酸
137抗体21VL氨基酸
138抗体21VLCDR1氨基酸
139抗体21VLCDR2氨基酸
140抗体21VLCDR3氨基酸
141抗体22VH核苷酸
142抗体22VH氨基酸
143抗体22VHCDR1氨基酸
144抗体22VHCDR2氨基酸
145抗体22VHCDR3氨基酸
146抗体22VL核苷酸
147抗体22VL氨基酸
148抗体22VLCDR1氨基酸
149抗体22VLCDR2氨基酸
150抗体22VLCDR3氨基酸
151抗体23VH核苷酸
152抗体23VH氨基酸
153抗体23VHCDR1氨基酸
154抗体23VHCDR2氨基酸
155抗体23VHCDR3氨基酸
156抗体23VL核苷酸
157抗体23VL氨基酸
158抗体23VLCDR1氨基酸
159抗体23VLCDR2氨基酸
160抗体23VLCDR3氨基酸
161全长人IL-6氨基酸
162HISFLAG标记的人IL-6
163可溶性IL-6Ra(人)
164跨膜IL-6Ra(人)
165成熟的人IL-6氨基酸
166人gp130
167种系化的VHFR1
168种系化的VHFR2
169种系化的VHFR3
170种系化的VHFR4
171种系化的VLFR1
172种系化的VLFR1
173种系化的VLFR1
174种系化的VLFR1
175F102E突变IL-6
176S204E突变IL-6
177R207E突变IL-6
178F106E突变IL-6
179Q211A突变IL-6
180R58E突变IL-6
181E200W突变IL-6
182R207L突变IL-6
183引物macIL6_5’NdeI
184引物macIL6_3’NheI
185引物hIL6_5’NdeI
抗体7、10、17和18的序列是种系化的。
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本说明书中任何地方引用的，包括以上任何地方引用的所有参考文献出于所有目的，通过引用全文纳入本文。
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Claims (10)

1.一种分离的人IL-6结合成员，经表面等离振子共振测定，其结合人IL-6的KD不超过30pM。
2.如权利要求1所述的结合成员，其特征在于，所述KD不超过10pM。
3.一种分离的人IL-6结合成员，其在残基Phe102和/或Ser204上结合人IL-6，所述残基编号是按照全长人IL-6氨基酸序列SEQIDNO:161定义的。
4.如权利要求3所述的结合成员，其特征在于，所述结合成员在残基Arg207上结合人IL-6。
5.一种分离的人IL-6结合成员，其中在抑制0.6pM人IL-1β和2.4nM可溶性人IL-6Rα刺激人滑膜成纤维细胞释放VEGF的实验中所述结合成员的IC50小于1nM。
6.如前述任一项权利要求所述的结合成员，其特征在于，所述结合成员结合短尾猴IL-6，并且在抑制标记的人IL-6与支持物上固定的结合成员结合的时间分辨荧光实验中，短尾猴IL-6的IC50与未标记人IL-6的IC50的差异小于10倍，其中标记的人IL-6的终浓度等于它与结合成员相互作用的Kd的两倍。
7.如前述任一项权利要求所述的结合成员，其特征在于，在抑制TF-1细胞响应于20pM人IL-6而增殖的实验中，所述结合成员的IC50小于100pM。
8.一种分离的人IL-6结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR含有来自一组CDR的22个或更少的氨基酸改变，其中：
HCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:3；
HCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:4；
HCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:115；
LCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:8；
LCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:9；和
LCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:120；且其中
在抑制TF-1细胞响应于20pM人IL-6而增殖的实验中，所述结合成员的IC50小于100pM。
9.如权利要求1-7中任一项所述的分离的人IL-6结合成员，其包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR含有来自一组CDR的22个或更少的氨基酸改变，其中：
HCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:3；
HCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:4；
HCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:115；
LCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:8；
LCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:9；和
LCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:120。
10.如权利要求8或9所述的结合成员，其包含一组CDR，该组CDR含有来自一组CDR的20个或更少的取代，其中：
HCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:3；
HCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:4；
HCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:115；
LCDR1含有氨基酸序列SEQIDNO:8；
LCDR2含有氨基酸序列SEQIDNO:9；和
LCDR3含有氨基酸序列SEQIDNO:120；
其中所述结合成员任选包含一个残基的插入，以便相对于SEQIDNO:115增加HCDR3的长度，和/或包含一个残基的插入，以便相对于SEQIDNO:120增加LCDR3的长度。
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