CN104119438A - 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用 - Google Patents

延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104119438A
CN104119438A CN201410349897.9A CN201410349897A CN104119438A CN 104119438 A CN104119438 A CN 104119438A CN 201410349897 A CN201410349897 A CN 201410349897A CN 104119438 A CN104119438 A CN 104119438A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibodies
antibody
days
present
weeks
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410349897.9A
Other languages
English (en)
Inventor
M·鲍恩
H·吴
W·达拉夸
P·基纳
B·加莱
A·科伊尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
MedImmune Vaccines Inc
Original Assignee
MedImmune Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Vaccines Inc filed Critical MedImmune Vaccines Inc
Publication of CN104119438A publication Critical patent/CN104119438A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

本发明提供了具有延长的体内半衰期的人抗IL-6抗体。本发明还涉及药物组合物、治疗组合物及使用与具有延长的体内半衰期的IL-6结合的治疗抗体治疗和预防IL-6介导的疾病和病症的方法，所述疾病和病症比如，但不局限于，炎症性疾病和病症、自身免疫性疾病和病症及肿瘤。

Description

延长体内半衰期的人抗IL-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2010/022478、国际申请日为2010年1月29日，进入中国国家阶段的申请号为201080010391.5，名称为“延长体内半衰期的人抗IL-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用”的发明专利申请的分案申请。
优先权声明
本发明要求2009年1月29日递交的申请号为61/148,106的美国申请和2009年6月4日递交的申请号为61/184,182美国申请的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及抑制IL-6生物学效应的抗IL-6抗体分子，其具有延长的体内半衰期。抗IL-6抗体在治疗与IL-6相关的疾病中十分有用，所述疾病包括炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和抑郁症。
背景技术
白介素6(IL-6)是由多种细胞类型产生的26kDa多效细胞促炎因子，其包括刺激成纤维细胞、单核细胞核内皮细胞，它们构成了体内IL-6的主要来源。细胞例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、角质细胞、成骨细胞和其他几种细胞在刺激时能够产生IL-6。IL-6同样也在肿瘤细胞系和肿瘤细胞中表达，所述肿瘤细胞是例如来自肺癌、前列腺癌、骨髓瘤、肾上腺样瘤和心脏粘液瘤的细胞(Kishimoto,T.,(1989)Blood74:1-10；Smith P.C.等，(2001)Cytokine and Growth factor Reviews12:33-40)。在非炎症条件下，IL-6从脂肪组织中分泌(Wallenius等，(2002)Nat.Med.8:75)。
为启动细胞信号转导，IL-6以低亲和性与跨膜受体、IL-6受体α(也被称为IL-6Rα、IL-6Ra、IL-6R、gp80或CD126)结合形成“IL-6:IL-6Ra”复合物。该复合物与gp130信号受体结合，IL-6Rα与gp130共同形成高亲和性IL-6结合位点，并诱导形成由IL-6、IL-6Ra和gp130的各两个复制体组成的六聚物(Somers,W.,等(1997)1.9EMBO J.16:989-997)。该IL-6Ra的跨膜和细胞质结构域不需要信号转导，因为IL-6Ra也作为一种可溶性分泌形式存在(sIL-6R或sIL-6Ra)。该可溶性受体通过IL-6Ra信息的差别剪切或蛋白酶降解脱落的方式产生。sIL-6R能够与IL-6形成配体-受体复合物“IL-6:sIL-6Ra”。该复合物可以与gp130在细胞上结合，从而在gp130阳性细胞内启动细胞信号转导，即使那些细胞不表达IL-6Ra。因此，sIL-6R具有潜力拓宽对IL-6应答的细胞指令表，并被认为在IL-6-介导炎症中起重要作用(Jones,S.A等，(2001)FASEB J.15:43-58)。
已经阐明了人IL-6配体的晶体结构((Somers,W.,等(1997)1.9EMBO J.16:989-997)。也已经解析了人IL-6的胞外结构域的晶体结构(Varghese等，(2002)PNAS USA99:15959-15964)和IL-6/IL-6R/gp130复合物的六聚物结构(Boulanger等(2003)Science300:2101-2104)。与诱变发生的研究相结合的这些结构已经识别出在IL-6表面上的三个位点，其参与与各种受体元件复合的IL-6的功能活性。位点1残基参与IL-6与IL-6Ra之间的相互作用。位点2残基参与IL-6与gp130细胞因子结合区域之间的相互作用。IL-6的位点3中的残基参与六聚物复合物内的第二gp130的免疫球蛋白样结构域的相互作用。在IL-6与六聚物IL-6/IL-6R/gp130复合物内IL-6的第二分子相互作用的位置上也已经识别出在IL-6上的第四个位点(Menziani等(1997)Proteins:Structure Function and Genetics29,528)。
已经分离出了许多抗IL-6配体单克隆抗体。进行的图谱研究显示它们结合于不同的结合位点，如上所述，在人IL-6的表面(Brakenhoff等，(1990)J.Immunol.145:561-568；Wijdenes等，(1991)Mol Immunol.28:1183-1191；Brakenhoff等，(1994)JBC269:86；Kalai等，(1996)Eur JBiochem238714-723；Kalai等，(1997)Blood89:1319-1333)。
作为主要细胞因子的IL-6的增加与各种疾病表征有联系。已经示出了IL-6的循环水平在诸如类风湿性关节炎、Castleman病、青少年特发性关节炎和克罗恩氏病等疾病中增加了(Nishimoto N,和Kishimoto T.(2004)Curr Op in Pharmacology4:386-391)。因为该IL-6与驱动这些炎症表征中的病理学有联系。此外，已经示出了由IL-6激发的各种肿瘤类型，其包括黑素瘤、肾细胞癌、卡波西氏肉瘤、卵巢癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤和前列腺癌(Keller E.T.等，(1996)Front Biosci.1:340–57)。另外，已经在几种癌症中报道了增加的IL-6的循环水平。在一些癌症表征中，将增加的IL-6水平用作该疾病的预后指示物。
由于IL-6在各种鼠的、嵌合的、人源化的和人体疾病中的作用，已经将抗人IL-6单细胞系抗体研发成潜在的治疗方法(比如US5856135、WO2004/020633、US20060257407A1、US7291721)。已经将嵌合的人-鼠抗IL-6抗体cCLB8(指CNTO328)用于治疗患有多发性骨髓瘤的患者(van Zaanen等，(1998)Brit.Journal.Haematology102:783)，观察到大多数患者的病症稳定。
通过使用人源化的抗IL-6Ra抗体托西珠单抗(也指hPM-1、MRA和Actemra)进一步突显了其在癌症和炎症疾病中抑制IL-6信号转导的积极作用。此为鼠的抗IL6Ra抗体PM-1的人源化版本。使用该抗体对患者的治疗已经证实在很多疾病中有效果，其包括类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、克罗恩氏病、骨髓增生性疾病、Castleman病和系统性红斑狼疮(SLE)(Mihara等，(2005)Expert Opinion on Biological Therapy.5:683-90)。
在基于抗体的治疗方法中的一个关键问题是，在循环中的免疫球蛋白的持久性。免疫球蛋白清除的比率直接影响免疫球蛋白的数量和剂量频率。增加的剂量和剂量频率可能在受体内产生副作用，还可能增加医疗费用。鉴于基于抗IL-6抗体的治疗方法在制药方面的重要性，有需要研发具有增加的体内半衰期的修饰的高亲和性人抗IL-6抗体。
发明内容
本发明涉及高亲和性人抗IL-6抗体，其特异性结合人IL-6并具有延长的体内半衰期。在一实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体的体内半衰期是10天至40天。在一具体实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体的体内半衰期是25天至35天。在一实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体包括PCT申请号为WO2008/065378的专利中描述的抗IL-6抗体VH和/或VL结构域。在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG恒定区，其相对于野生型人IgG恒定区具有一个或多个氨基酸取代。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括具有M252Y、S254T和T256E氨基酸取代的人IgG恒定区，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括SEQ ID NO:9的序列的重链和SEQ ID NO:10序列的轻链。
本发明还涉及编码人抗IL-6抗体的核酸，包括所述核酸的载体，包括所述载体的细胞以及制造具有延长半衰期的人抗IL-6抗体的方法，其中所述人抗IL-6抗体具有延长的半衰期。
在另一方面，本发明提供一种分离的核苷酸，其包括根据本发明的编码人抗IL-6抗体的序列，所述抗IL-6抗体具有延长的半衰期，以及制备具有延长的半衰期的人抗IL-6抗体的方法，其包括在一定条件下，使所述核酸表达以产生所述人抗IL-6抗体并使其再生。
在另一方面，提供了含有或转化本发明核酸的宿主细胞。
本发明的另一些方面提供了包括本发明的抗IL-6抗体的组合物，及其在结合、抑制和/或中和IL-6方法中的使用，包括通过治疗人体或动物体的治疗方法。在一实施例中，本发明的组合物是无菌的液体制剂。在一具体实施例中，本发明的组合物包括至少100mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的组合物是冻干制剂。在另一实施例中，本发明的制剂是药物制剂。
根据本发明的抗体可用于治疗方法或诊断方法，例如人体或动物体(例如，在人患者内)的疾病或病症的治疗方法(可包括预防治疗)，其包括对所述患者施用有效量的本发明的结合元件。根据本发明的能治疗的症患包括如本文在其它地方详细讨论的IL-6在其中发挥作用的任何症患。
本发明同样包括有所需患者类患者的血清中，中和IL-6活性的方法，其包括对人类患者施用有效量的本发明的抗IL-6抗体。本发明还提供了预防、处理、治疗或改善炎症疾病或病症、自身免疫性疾病或病症、增殖性疾病、与IL-6异常表达和/或活性相关或以其为特征的疾病或病症、或其一个或多个症状的方法。所述方法包括对需要的受体施用预防或治疗有效量的本发明的抗IL-6抗体。
本发明的一方面涉及分离的修饰抗体，其与IL-6特异性结合，其中所述修饰抗体包括可变区和人IgG恒定区，其相对于野生型人IgG恒定区具有一个或多个氨基酸取代，其中，与包括所述可变区和野生型人IgG恒定区的亲本抗体的半衰期相比，所述抗体具有增加的半衰期。在本发明这一方面的一个实施例中，修饰抗体的半衰期长于野生型抗体的半衰期至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。在另一实施例中，修饰抗体的半衰期长于野生型抗体的半衰期2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在另一实施例中，修饰抗体的半衰期长于野生型抗体的半衰期2倍至3倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍、或3倍至10倍。在还一实施例中，修饰抗体的半衰期是至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。在还一实施例中，修饰抗体的半衰期是10天、15天、20天、25天、26天、27天、28天、29天,30天、35天、40天、45天50天。在还一实施例中，修饰抗体的半衰期是10天至20天、10天至30天、10天至40天、10天至50天、20天至30天、20天至40天、20天至50天、25天至30天、25天至40天、25天至50天、30天至40天、30天至50天或40天至50天。在还一实施例中，修饰抗体的半衰期是在哺乳动物体内测定的半衰期。在另一实施例中，修饰抗体的半衰期是在非人灵长动物内测定的半衰期。在另一实施例中，修饰抗体的半衰期是在人体内测定的半衰期。
本发明的另一方面涉及分离的修饰抗体，其与IL-6特异性结合，其中修饰抗体包括人IgG恒定区其相对于野生型人IgG恒定区具有一个或多个氨基酸取代，其中与包括野生型人IgG恒定区的野生型抗体的清除率相比，所述抗体具有降低的清除率。在本发明该方面的一实施例中，修饰抗体的清除率低于野生型抗体的清除率至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。在另一实施例中，修饰抗体的清除率低于野生型抗体的清除率2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在还一实施例中，修饰抗体的清除率低于野生型抗体的清除率2倍至3倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍、或3倍至10倍。在另一实施例中，修饰抗体的清除率是至多1mL/kg/天、至多2mL/kg/天、至多3mL/kg/天、至多4mL/kg/天、至多5mL/kg/天、至多7mL/kg/天、至多10mL/kg/天、至多15mL/kg/天或至多20mL/kg/天。在另一实施例中，修饰抗体的清除率是1mL/kg/天、2mL/kg/天、3mL/kg/天、4mL/kg/天、5mL/kg/天、7mL/kg/天、10mL/kg/天、15mL/kg/天或20mL/kg/天。在还一实施例中，修饰抗体的清除率是1mL/kg/天至2mL/kg/天、1mL/kg/天至3mL/kg/天、1mL/kg/天至5mL/kg/天、1mL/kg/天至10mL/kg/天、1mL/kg/天至15mL/kg/天、2mL/kg/天至5mL/kg/天、2mL/kg/天至10mL/kg/天、3mL/kg/天至5mL/kg/天、3mL/kg/天至10mL/kg/天或5mL/kg/天至10mL/kg/天。在还一实施例中，修饰抗体的清除率是哺乳动物中测定的清除率。在另一实施例中，修饰抗体的清除率实在非人类的灵长动物中测定的。在另一实施例中，修饰抗体的清除率在人体中测定。在还一实施例中，氨基酸取代选自：M252Y、M252F、M252W、M252T、S254T、T256S、T256R、T256Q、T256E、T256D、T256T、L309P、Q311S、H433R、H433K、H433S、H433I、H433P、H433Q、N434H、N434F、N434和N436H，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在另一实施例中，氨基酸取代的至少一种选自：M252Y、S254T、T256E、H433K、N434F和N436H，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在还一实施例中，修饰IgG恒定区包括M252Y、S254T和T256E氨基酸取代，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在还一实施例中，修饰IgG恒定区与野生型IgG恒定区相比对FcRn有更高的亲和性。在另一实施例中，人IgG恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在还一实施例中，IgG是IgG1。
本发明的另一方面涉及上述修饰抗体，其中可变区包括：具有与SEQ ID NO:1一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:1包括1、2或3个氨基酸残基取代的VH CDR1；具有与SEQ ID NO:2一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:2包括1、2或3个氨基酸残基取代的VHCDR2；具有与SEQ ID NO:3一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:3包括1、2或3个氨基酸残基取代的VH CDR3；具有与SEQ ID NO:4一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:4包括1、2或3个氨基酸残基取代的VL CDR1；具有与SEQ ID NO:5一致的氨基酸序列或者相对于SEQID NO:5包括1、2或3个氨基酸残基取代的VL CDR2；和具有与SEQID NO:6一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:6包括1、2或3个氨基酸残基取代的VL CDR3。在一实施例中，权利要求1至26项中任一项所述的修饰抗体，其中可变区包括：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH CDR1；具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2；具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的VH CDR3；具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VL CDR3。在另一实施例中，可变区包含包括3个CDR的VH结构域和包括3个CDR的VL结构域，其中VH结构域3个CDR包括：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH CDR1；具有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2；和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR3。在另一实施例中，可变区包含包括3个CDR的VH结构域和包括3个CDR的VL结构域，其中VL结构域3个CDR包括：具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL CDR1；具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL CDR3。在还一实施例中，可变区包括具有与SEQ ID NO:7一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:7包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基取代的VH结构域和具有与SEQ ID NO:8一致的氨基酸序列或者相对于SEQ ID NO:8包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基取代的VL结构域。在另一实施例中，可变区包括SEQ ID NO:7的VH结构域和SEQ ID NO:8的VL结构域。
本发明的另一方面涉及编码上述修饰抗体的氨基酸序列的核酸。在一实施例中，核酸包括选自SEQ ID NO:11-14的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及包括上述核酸的载体。
本发明的另一方面涉及包括上述载体的分离的细胞。
本发明的另一方面涉及表达上述修饰抗体的分离的细胞。
本发明的另一方面涉及一种制备修饰抗体的方法，其包括在足以制备抗体的条件下培养上述分离的细胞并从培养物中回收抗体。
本发明的另一方面涉及包括上述修饰抗体的药物组合物。
本发明的另一方面涉及一种中和所需患者的血清中的90％的游离IL-6的方法，其包括施用有效量的上述修饰抗体。
本发明的另一方面涉及一种抑制所需患者的血清中的90％的IL-6介导的信号转导的方法，其包括对人体施用有效量的上述修饰抗体。
本发明的另一方面涉及一种中和所需患者的滑液中的90％的游离IL-6的方法，其包括对人体施用有效量的上述修饰抗体。
本发明的另一方面涉及一种抑制所需患者的滑液中的90％的IL-6介导的信号转导的方法，其包括对人体施用有效量的上述修饰抗体。
本发明的另一方面涉及一种降低人体中滑膜细胞生长的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。
本发明的另一方面涉及一种降低人体中滑膜炎症的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。
本发明的另一方面涉及一种治疗人类自身免疫性疾病或病症的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。
本发明的另一方面涉及一种治疗人类恶性肿瘤的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。
本发明的另一方面涉及一种治疗人类炎症免疫疾病或病症的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。
本发明的另一方面涉及治疗人类系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或炎症性的方法，其包括对所需患者施用治疗有效量的上述抗体。在一实施例中，根据权利要求40至49中任一项所述的方法，其中治疗上有效的量包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg或约0.5至1mg/kg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在另一实施例中，治疗上有效的量包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg或约50至100mg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在还一实施例中，治疗有效量的修饰抗体给药频率为每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次。在还一实施例中，治疗有效量的修饰抗体静脉给药或者皮下注射给药。在另一实施例中，病人在施用至少一次维持剂量的修饰抗体之前，给药一次单次负荷剂量的修饰抗体。在还一实施例中，负荷剂量包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在还一实施例中，负荷剂量包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在还一实施例中，维持剂量包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在还一实施例中，维持剂量包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg的单次剂量或分剂量的修饰抗体。在另一实施例中，在负荷剂量给药之后，维持剂量的给药频率为一周、两周、三周、四周、八周、或十二周。在还一实施例中，至少对病人施用两次维持剂量并且维持剂量的给药频率为每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次。在还一实施例中，修饰抗体的负荷剂量静脉给药或者皮下注射给药。在另一实施例中，维持剂量静脉给药或者皮下注射给药。在另一实施例中，治疗有效量的修饰抗体连同第二治疗剂一起给药。
本发明的另一方面涉及包括上述抗体的无菌稳定的水性制剂。在根据本发明的一方面的一个实施例中，抗体没有经过冷冻干燥。在另一实施例中，抗体经过冷冻干燥。在另一实施例中，所述修饰抗体的浓度是至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约15mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、至少约100mg/ml、至少约120mg/ml、至少约150mg/ml、至少约160mg/ml、至少约180mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml、或至少约300mg/ml。在另一实施例中，该制剂还包括至少约一种缓冲组分。在另一实施例中，该制剂还包括至少一种赋形剂。在还一实施例中，缓冲组分选自组氨酸、柠檬酸、磷酸盐、甘氨酸和醋酸。在还一实施例中，缓冲组分的浓度为约1mM至约200mM、约1mM至约50mM或约5mM至约20mM。在还一实施例中，缓冲组分的浓度为约10mM、约15mM、约20mM或约25mM。在另一实施例中，赋形剂是糖类。在还一实施例中，所述糖类是二糖。在还一实施例中，所述二糖是海藻糖或蔗糖。在另一实施例中，二糖的浓度为约1％至约40％、约2％至约20％、或约2％至约10％。在还一实施例中，二糖的浓度为约约2％、约4％或约8％。在还一实施例中，赋形剂是盐类。在还一实施例中，所述盐类是氯化钠。在另一实施例中，氯化钠的浓度为约50mM至约200mM。在另一实施例中，氯化钠的浓度为约70mM、约75mM、约80mM、约100mM、约120mM、或约150mM。在另一实施例中，赋形剂是表面活性剂。在另一实施例中，表面活性剂是多山醇酯。在还一实施例中，所述多山醇酯是多山醇酯20或多山醇酯80。在还一实施例中，表面活性剂的浓度为约0.001％至约2％。在另一实施例中，表面活性剂的浓度为约0.01％、约0.02％、约0.04％或约0.08％。在还一实施例中，赋形剂是氨基酸。在还一实施例中，氨基酸选自甘氨酸、组氨酸或精氨酸。在还一实施例中，氨基酸的浓度为约10mM至约400mM。在还一实施例中，氨基酸的浓度为约25mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、或约400mM。在还一实施例中，该制剂的pH值为约5.5至约6.5。在还一实施例中，所述制剂的pH值为约6.0。在还一实施例中，该制剂是等渗的。在另一实施例中，该制剂保存在40℃下至少约4周是稳定的。在还一实施例中，该制剂保存在5℃下至少约3个月是稳定。在另一实施例中，该制剂保存在5℃下至少约12个月是稳定。在还一实施例中，将所述制剂保存在40℃下至少约4周时，抗体丧失至多20％的IL-6结合活性。在还一实施例中，将所述制剂保存在5℃下至少约3个月时，抗体丧失至多20％的IL-6结合活性。在还一实施例中，将所述制剂保存在5℃下至少约12个月时，抗体丧失至多20％的IL-6结合活性。在还一实施例中，在所述制剂保存在40℃下至少约4周时，抗体丧失至多10％的IL-6结合活性。在另一实施例中，根据权利要求64至93中任一项所述的制剂，其中在所述制剂保存在5℃下至少约3个月时，所述抗体丧失至多10％的IL-6结合活性。在另一实施例中，根据权利要求64至93中任一项所述的制剂，其中在所述制剂保存在5℃下至少约12个月时，所述抗体丧失至多10％的IL-6结合活性。在另一实施例中，抗体是易聚集或断裂。在另一实施例中，保存在40℃下至少约4周时，通过高效体积排阻色谱测定少于约2％的所述抗体形成聚集体。在另一实施例中，保存在5℃下至少约3个月时，通过高效体积排阻色谱测定少于约2％的所述抗体形成聚集体。在另一实施例中，保存在5℃下至少约12个月时，通过高效体积排阻色谱测定少于约2％的所述抗体形成聚集体。在另一实施例中，保存在40℃下至少约4周时，通过尺寸排阻层析测定少于约2％的所述抗体断裂。在另一实施例中，保存在5℃下至少约3个月时，通过尺寸排阻层析测定少于约2％的所述抗体断裂。在另一实施例中，保存在5℃下至少约12个月时，通过尺寸排阻层析测定少于约2％的所述抗体断裂。在另一实施例中，制剂是可注射的制剂。在另一实施例中，制剂适用于静脉给药，皮下给药或肌肉给药。在另一实施例中，制剂适用于气溶胶给药。
本发明的另一方面涉及一种适用于对人体肠胃外给药的药物的单位剂型，其包括在一合适容器中的任何一种上述抗体制剂。在一实施例中，抗体制剂进行静脉给药、皮下给药或肌肉给药。
本发明的另一方面涉及一种适用于对人体进行气溶胶给药的药物的单位剂型，其包括任何一种上述抗体制剂。在根据本发明的一方面的一个实施例中，鼻内给药抗体制剂。
本发明的另一方面涉及含有上述制剂的任一种的密闭容器。
本发明的另一方面涉及含有上述制剂的任一种的预充注射器。
本发明的另一方面涉及包括上述制剂的任一种的试剂盒。
将在下文对本发明的这些方面和其他方面进行详细描述。
附图说明
图1抗体18E，但不是包括YTE表位的抗体18Fc区。在酶联免疫吸附测定(ELISA)中，使用抗YTE捕获抗体检测位于Fc区中的YTE表位的存在。其示出了抗体18和抗体18E的ELISA滴定曲线。
图2被抗体18结合的IL-6，使用ELISA法监测抗体18E、IL-6抗体A(AB A)和IL-6抗体B(AB B)。将源自大肠杆菌的重组IL-6用作捕获剂。抗体18和抗体18E示出了基本上相同的IL-6结合活性。检测到抗体18和抗体18E的EC50分别为6.1pM和6.5pM。
图3抗体18和抗体18E在抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖方面具有基本上相同的效率。测定抗体18、抗体18E、IL-6抗体A(AB A)和IL-6抗体B(AB B)的IC50值。示出了抗体浓度函数的最大抑制曲线百分比。检测到抗体18和抗体18E的IC50分别为4.5pM和5.2pM。
图4抗体18和抗体18E在抑制内源性IL-6诱导的VEGF从人类滑膜成纤维细胞中的释放方面具有基本上相同的效率。测定抗体18、抗体18E、IL-6抗体A(AB A)和IL-6抗体B(AB B)的IC50值。示出了抗体浓度函数的最大抑制曲线百分比。检测到抗体18和抗体18E的IC50分别为1.3pM和1.2pM。
图5抗体18和抗体18E的药代动力学特征。对猕猴皮下给药或静脉注射5mg/kg的单剂量的抗体18或抗体18E。在施用抗体后接着检测血浆抗体水平，以时间函数示出。静脉和皮下给药后，抗体18的半衰期分别大约为8.5天和9.1天。静脉和皮下给药后，抗体18E的半衰期分别大约为28.4天和28.8天。
图6抗体18和抗体18E的药代动力学和药效学的特征。对猕猴皮下给药5mg/kg的抗体18或抗体18E。在施用抗体后接着检测血浆抗体水平，以时间函数示出。静脉和皮下给药后，抗体18的半衰期分别大约为8.5天和9.1天。静脉和皮下给药后，抗体18E的半衰期分别大约为28.4天和28.8天。符号表示实验的PK和PD数据，虚线是同时适用于PK和PD数据的PKPD模型。估计的抗体18和抗体18E的半衰期分别为9.1天和28.8天。估计的抗体18和抗体18E的清除率分别为13.1ml/天/kg和2.8ml/天/kg。
图7在皮下给药不同剂量的抗体18E后，在RA患者血浆中游离的IL-6水平的模拟实验。该模拟实验预测在每8周皮下给药100mg的抗体18E，或每4周皮下给药50mg的抗体18E后，应该能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。预测每12周皮下给药100mg的抗体18E不能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。
图8在皮下给药不同剂量的抗体18E后，在RA患者血浆中游离的IL-6水平的模拟实验。该模拟实验预测在施用单独负荷剂量的200mg的抗体18E，每8周施用维持剂量的100mg抗体18E时，应该能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。该模拟实验还预测每8周皮下给药500mg的抗体18E不能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。
图9在皮下给药不同剂量的抗体18或抗体18E后，在RA患者血浆中游离的IL-6水平的模拟实验。该模拟实验表明，在皮下给药单独负荷剂量的100mg的抗体18E，接着每月施用维持剂量的50mg的抗体18E时，应该能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。该模拟实验还预测，每两周皮下给药100mg剂量的抗体18，而不是每月皮下给药100mg剂量的抗体18能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。
图10在皮下给药不同剂量的抗体18或抗体18E后，在RA患者血浆中游离的IL-6水平的模拟实验。该模拟实验表明，在皮下给药单独负荷剂量的200mg的抗体18E，接着每4周或每8周施用维持剂量的100mg的抗体18E时，应该能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。该模拟实验还预测每4周或每8周给药100mg的抗体18不能达到持续抑制至少90％IL-6介导的信号转导。
图11示出了在小鼠FCA尾模型中46℃时mAab406对热过敏性的影响。没有副作用；**＝p<0.01，***＝p<0.001，在每个时间点上非成对的t检验(IgG1vs mAb406)，FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406。
图12示出了在小鼠FCA尾模型中mAab406对机械压力过敏性的影响。没有副作用；**＝p<0.05，在每个时间点上非成对的t检验(IgG1vsmAb406)，FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406。
图13.示出了在小鼠FCA24小时模型中mAab406对热过敏性的影响。没有副作用；显著性水平：**p<0.01，***p<0.001，统计：单因素方差分析，接着进行Holm Sidak事后检验；FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406，NT指的是“没有处理的”小鼠。
图14.示出了在小鼠FCA48小时模型中mAb406对热过敏性的剂量依赖型影响。没有副作用；显著性水平：**p<0.05，***p<0.001，统计：单因素方差分析，接着进行Holm Sidak事后检验；FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406，NT指的是“没有处理的”小鼠。
图15.示出了在小鼠FCA24小时模型中mAb406对机械压力过敏性的剂量依赖型影响。没有副作用的检验；显著性水平：**p<0.05，***p<0.001，统计：单因素方差分析，接着进行Holm Sidak事后检验；FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406，NT指的是“没有处理的”小鼠。
图16.示出了在小鼠FCA48小时模型中mAb406对机械压力过敏性的剂量依赖型影响。没有副作用；显著性水平：**p<0.01，***p<0.001，统计：单因素方差分析，接着进行Holm Sidak事后检验；FCA试验6小时后静脉给药IgG1对照或mAb406，NT指的是“没有处理的”小鼠。
图17.示出了在48小时在小鼠FCA尾模型中，小分子甲氧萘丙酸对热过敏性的影响。无副作用；*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，单因素方差分析一侧的Holm Sidak事后检验。
图18.示出了在48小时在小鼠FCA尾模型中，小分子甲氧萘丙酸对机械压力过敏性的影响。无副作用；*＝p<0.05，***＝p<0.001，单因素方差分析一侧的Holm Sidak事后检验。
具体实施方式
术语
在此说明以方便理解的是，本文中所使用的“和/或”是用于具体的公开两个具体特征或成分中的一个，连同或不连同另一个。例如“A和/或B”应被认为是(i)A，(ii)B和(iii)A与B之一的具体公开，就像每个被单独列出一样。
IL-6和IL-6受体
IL-6是白介素6。IL-6在本文中也称为“抗原”。
人IL-6的全长氨基酸序列是SEQ ID NO:15。在体内将该序列切开以去除N端前导肽，从而产生成熟的IL-6。成熟的人IL-6具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。成熟序列代表体内循环IL-6，其是如本文所述的治疗和体内诊断应用的靶抗原。因此，在本文中除非另有说明，IL-6指的是正常的成人IL-6。
IL-6可以与一个可检测的标签偶联，例如HIS FLAG，例如如本文所述适用于试验中。例如，使用与HIS FLAG序列偶联的IL-6的融合蛋白。
IL-6受体，IL-6Ra是白介素6的受体。IL-6Ra也被称为IL-6Rα、IL-6Ra、IL-6R和CD126。在体内IL-6Ra以跨膜形式和可溶形式存在。除非本文另有说明，否则提到的IL-6Ra可以是跨膜IL-6Ra和/或可溶性IL-6Ra。
除非另有说明，本文中的IL-6受体指的是正常的人IL-6受体。人类可溶性IL-6Ra(sIL-6Ra,sIL-6R)的氨基酸序列是SEQ ID NO:17。人类跨膜IL-6Ra的氨基酸序列是SEQ ID NO:18。
IL-6结合IL-6Ra从而形成IL-6：IL-6Ra复合物。复合物可以是可溶性的(具有sIL-6Ra)，也可以是与膜结合的(具有跨膜IL-6Ra)。当IL-6Ra是可溶性的形式，复合物被定义为IL-6:sIL-6Ra。除非本文中另有说明，所指的IL-6:IL-6Ra可能包括IL-6与跨膜IL-6Ra或可溶性IL-6Ra的复合物。
gp130
gp130是IL-6:IL-6Ra复合物的受体。在Hibi等人Cell63:1149-1157(1990)中报道了gp130的克隆与特征。人gp130的序列测定为SEQ ID NO:19。
结合元件
此处描述了一对互相结合的分子的一个元件。该结合对的元件可以自然衍生或全部或部分合成产生。结合对之一的元件在其表面具有一个区域，或者空腔，其与分子对的另一个元件结合并从而与其特定的空间和极性构成互补。结合对的典型例子是抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
结合元件通常包括具有抗原结合位点的分子。例如，结合元件可以是抗体分子或包括抗原结合位点的非抗体蛋白质。
可以通过CDR在如人纤连蛋白或细胞色素B等的非抗体蛋白支架上的排列(Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A6；Koide等，(1998)Journal of Molecular Biology,284:1141-1151；Nygren等，(1997)Curr.Op.Structural Biology,7:463-469)，或通过使位于蛋白骨架内的环的氨基酸残基随机化或者突变，使抗原结合位点与所需靶标特异性结合。Nygren等人对蛋白质中新结合位点进行工程化的骨架详细评述(Nygren等，(1997)Curr.Op.Structural Biology,7:463-469)。在WO/0034784中公开了用于抗体模拟物的蛋白骨架，其中发明人描述了包括具有至少一个随机环的III型纤连蛋白域的蛋白质(抗体模拟物)。可以向其中移植一个或多个CDR，例如一组HCDR，其可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域元件提供。骨架可以是人类或非人类的蛋白质。非抗体蛋白骨架的一个优点在于其可以在骨架分子内提供抗原结合位点，其小于至少一些抗体分子和/或比一些抗体分子易于制造。结合元件的小尺寸可以赋予有用的生理特性，例如进入细胞的能力，穿透渗入到组织或到达位于其他结构内的靶标的能力，或在靶抗原的蛋白质腔内结合的能力。Wess评述了在非抗体蛋白骨架内的抗原结合位点的用途(Wess,L.(2004)In:BioCentury,TheBernstein Report on BioBusiness,12(42),A1-A7)。典型的蛋白质具有一个稳定的骨架和一个或多个可变环，其中环的氨基酸序列特异性地或随机地突变以产生结合靶抗原的抗原结合位点。这样的蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A的IgG结合域、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(例如第十纤连蛋白III型域)、脂笼蛋白以及伽马结晶和其他AffilinTM骨架(Scil蛋白)。其他方法的例子包括基于环蛋白(具有分子内二硫键的小蛋白)合成的“微体”，微生物蛋白(VersabodiesTM,Amunix)和锚蛋白重复蛋白(DARPins,Molecular Partners)。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，根据本发明的结合元件可以包括其他氨基酸，例如形成肽或者多肽的氨基酸，例如折叠域，或除了结合抗原外赋予分子其他的功能特性。本发明的结合元件可以载有一可检测的标记，或可以与毒素或靶基团或酶(例如通过肽键或连接子)偶联。例如，结合元件可以包括催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中，抗原结合位点与抗原结合，并因此使催化位点与抗原靶定。催化位点可以抑制抗原的生物学功能，例如通过分裂。
虽然，如所述，CDR能够被非抗体骨架承载，载有本发明的CDR或一组CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或其基本上的一部分，其中CDR或一组CDR位于对应于自然产生的VH和VL抗体可变区的一个位置，所述抗体可变区由重新排序的免疫球蛋白基因编码。免疫球蛋白可变区的结构和定位可以参照Kabat等(Kabat,E.A.等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and HumanServices.(1987))及其更新的内容确定。获得许多学术和商业在线资源可以查询该数据库。例如，参见Martin,A.C.R.(Accessing the Kabat antibodySequence Database by Computer PROTEINS:Structure,Function and Genetics,25(1996),130-133)和联合在线资源，目前其世界范围的网址为bioinf.org.uk/abs/simkab.html。
通过CDR区或CDR，它的目的在于表明如Kabat等定义的免疫球蛋白的轻链和重链的高变区(Kabat,E.A.等，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Edition.US Department of Health and HumanServices,Public Service,NIH,Washington或稍后版本)或Chothia和Lesk(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)。抗体通常包括3个重链CDR和3个轻链CDR。本文使用的术语CDR或CDRs为了表明，根据情况，这些区域中的一个或几个，或甚至这些区域的整体，所述区域包括大多数的氨基酸残基，其与通过亲和性与识别的抗原或表位结合的抗体有关。
在六个短的CDR序列中，重链的第三CDR(HCDR3)具有更大的尺寸变化(更大的多样性主要是由于对编码其基因的排列机制)。它也可以只有2个氨基酸，尽管已知最长的尺寸为26个氨基酸。CDR的长度根据可适应特定基本框架的长度而改变。就其功能而言，HCDR3起到部分地决定抗体特异性的作用(Segal等,(1974)PNAS,71:4298-4302；Amit等,(1986)Science,233:747-753；Chothia等,(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia等,(1989)Nature,342:877-883；Caton等,(1990)J.Immunol.,144:1965-1968；Sharon等,(1990)PNAS,87:4814-4817；Sharon等,(1990)J.Immunol.,144:4863-4869；Kabat等,(1991)J.Immunol.,147:1709-1719；Holliger&Hudson,Nature Biotechnology23(9):1126-11362005)。
HCDR1可以是5个氨基酸长，由Kabat残基31-35组成。
HCDR2可以是17个氨基酸长，由Kabat残基50-65组成。
HCDR3可以是11个或12个氨基酸长，由Kabat残基95-102组成，非必要的包括Kabat残基100D。
LCDR1可以是11个氨基酸长，由Kabat残基24-34组成。
LCDR2可以是7个氨基酸长，由Kabat残基50-56组成。
LCDR3可以是8个或9个氨基酸长，由Kabat残基89-97组成，非必要的包括Kabat残基95。
抗体分子
这描述了自然产生的或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语也涵盖任何包括抗体抗原结合位点的多肽或蛋白。可以理解的是本发明并不涉及自然形式的的抗体，也就是说抗体并不是处于其自然环境中，但是他们能够被分离或者通过纯化从自然产生的抗体中获得，或者通过基因重组获得，或者通过化学合成获得，并且如下文所述，抗体可以具有非自然的氨基酸。由抗体抗原结合位点组成的抗体片段包括，但不局限于，如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb和Fd分子。多种其他各种抗体分子，包括设计一个或多个抗体的抗原结合位点，例如包括Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。在Holliger和Hudson中描述了抗体分子及其构建方法与使用方法(Nature Biotechnology23(9):1126-1136(2005))。
可能采取单克隆抗体和其他抗体使用DNA重组技术生产另一抗体或结合靶抗原的嵌合抗体分子。这种技术可能涉及引入编码免疫球蛋白可变区的DNA，或者抗体恒定区的CDR，或者不同的免疫球蛋白的恒定区和构架区。详见，如，EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400，以及随后的大量文献。杂交瘤细胞或产生抗体的其他细胞可受到基因突变或其他变化，这可以改变或可以不改变产生的抗体的结合特异性。
由于抗体可以在许多方面进行修饰，术语“抗体分子”应解释为包括任何结合元件或者具有特异性和/或结合抗原的抗体抗原结合位点的物质。因此，这个术语涵盖了抗体片段及其衍生物，包括任何具有抗体抗原结合位点的多肽，不论是自然产生或全部或部分合成。因此，包括抗体抗原结合位点、或与其他多肽(如来自另一个物种或属于另一个抗体类或子类)融合的等效物的嵌合分子包括在内。在EP-A-0120694和EP-A-0125023，以及随后的大量文献中介绍了嵌合抗体的克隆和表达。
抗体工程技术可进一步使人们有可能对人和人源化的抗体进行分离。例如，人类杂交瘤可如Kontermann&Dubel(Kontermann，R&Dubel，S，Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC；2001年，ISBN：3540413545)中所述制备。噬菌体展示，另一个已确定的产生结合元件的技术已在许多出版物中被详细介绍，如Kontermann&Dubel(Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC；2001年，ISBN：3540413545)和WO92/01047(下文将进一步讨论)，美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404。
转基因小鼠可用于分离人类抗体，所述小鼠如其中鼠抗体基因失活并被人类抗体基因功能上地取代，而留下小鼠免疫系统的完整的其他组件的小鼠(Mendez,M.等.(1997)Nature Genet，15(2)：146-156)。人源化的抗体可应用本领域的已知技术来生产，例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US565,332和WO93/17105的公开报道。此外，WO2004/006955描述了基于从人类抗体基因选择可变区框架序列的人源化抗体的方法，其通过比较非人类抗体的可变区CDR序列的标准CDR结构类型与人类抗体序列库中相应的CDR序列的标准CDR结构类型，如生殖细胞抗体基因片段。人类抗体的可变区具有与非人类CDR类似的标准CDR结构类型，形成人类抗体序列的元件子集，从中选择人类框架序列。该子集元件可根据人类和非人类CDR序列的氨基酸相似性进行进一步的排名。在WO2004/006955中的方法，选择最高排名的人类序列为构建嵌合抗体提供框架序列，使用选定的子集元件人类框架在功能上取代人类CDR序列与非人类CDR序列，从而提供了具有高亲和性和低免疫原性的人源化抗体，并无需比对非人类和人类抗体的框架序列。根据公开的方法制作嵌合抗体。
可通过合成的寡核苷酸基因表达并在合适的表达载体上组装构建合成抗体分子，例如，由Knappik等人阐述的方法(Knappik等，(2000)J.Mol.Biol.296,57-86)或Krebs等，(Krebs等，(2001)J.ImmunologicalMethods25467–84)。
已证明整体抗体的片段可以行使结合抗原的功能。结合片段的例子是：(i)VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)VH和CH1结构域组成的FD片段；(iii)单一的抗体的VL和VH结构域组成的抗体片段；(iv)dAb片段(Ward,E.S.等,(1989)Nature341,544-546；McCafferty等(1990)Nature,348,552-554；Holt等(2003)Trends inBiotechnology21,484-490)，其由一个VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包括两个相连的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过连接肽使VH和VL结构域相连，所述连接肽使两个结构域相连形成一个抗原结合位点(Bird等,(1988)Science,242,423-426；Huston等,(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双特异性单链抗体二聚体(PCT/US92/09965)及(ix)“双抗体”，通过基因融合构建多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger,P.等,(1993)PNAS USA906444-6448)。抗体、单链抗体或双链抗体分子通过二硫键连接VH和VL结构域维持稳定(Reiter,Y.等,(1996)NatureBiotech,14,1239-1245)。微型抗体包括连接到CH3结构域的单链抗体(Hu,S.等，(1996)Cancer Res.,56,3055-3061)。结合片段的另一个例子是Fab’，与Fab片段不同的是重链CH1结构域的羧基末端加入少量残基，包括一个或多个抗体绞链区的半胱氨酸和Fab'-SH，因此Fab'片段，其中半胱氨酸残基的恒定区承载一个游离的巯基组。
Qui等(Qui等(2007年)Nat.Biotechnol.25:921-929)描述了只含有两个通过框架区连接的CDR的抗体分子。VH或VL结构域的CDR3连接到其他结构域的CDR1或CDR2环。通过FR区域，选定CDR1或CDR2的C端与CDR3的N端相连接。Qui等选择具有最少疏水性基团的FR区。测试抗体的最佳组合为通过VH FR2连接VL CDR1与VH CDR3(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)。在分子量大约3kDa，这些抗体分子提供改进的组织渗透方面的优势与完整免疫球蛋白(约150kDa的)或单链抗体(约28kDa)相比较(Qui等,(2007)Nat.Biotechnol.25:921-929)。
本发明的抗体片段可从亲本抗体分子或任何抗体分子的2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23获得，通过如酶消化的方法，例如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通过化学还原使二硫键断裂。另一种方式，本发明包括的抗体片段可以通过领域内被人所熟知的基因重组技术或其他肽合成的手段获得，例如，自动多肽合成仪，如由美国应用生物系统公司提供等，或通过核酸的合成和表达获得。
根据本发明的功能性抗体片段包括任何半衰期通过化学修饰提高的功能片段，尤其是聚乙二醇化，通过融合白蛋白或其片段来并入脂质体。
dAb(结构域抗体)是小的单体的抗原结合的抗体片段，即抗体重链或轻链的可变区域(Holt等(2003)Trends in Biotechnology21,484-490)。VHdAb在骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼)中自然存在，且可通过靶抗原免疫骆驼科动物，分离抗原特异性的B细胞并直接从个体B细胞克隆dAb基因产生。dAb也可由细胞培养产生。dAb的小尺寸、可溶性和温度稳定性使其尤其是生理学上可用的且适合于选择和亲和性成熟。正在研发用于治疗用途的骆驼科动物VH dAb，其称为“纳米抗体TM”。本发明的结合元件可能是dAb，其包括基本上如本文所述的VH或VL结构域，或包括一组基本上如本文所述的CDR的VH或VL结构域。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，两个不同的可变区结合在同一分子上(Holliger和Bohlen(1999)Cancer&Metastasis Rev.18:411-419)。已证明由于他们补充新效应物功能或在肿瘤细胞表面靶向几种分子的能力，双特异性或双功能抗体可用于诊断领域和治疗领域。凡使用的双特异性抗体，这些可是传统的双特异性抗体，可由多种方式制造(Holliger,P.和Winter G.(1993)Curr.Op.Biotech.4,446-449)，例如化学制备或来自于混合杂交瘤，或可能是任何的上述双特异性抗体片段。这些抗体可通过化学方法(Glennie M J等，(1987)J.Immunol.139,2367-2375；Repp R.等，(1995)J.Hematother.4:415-21)或体细胞方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.(1986)PNAS USA83:1453-7；Suresh M.R.等，(1986)MethodEnzymol.121:210-228)获得，但优选地还可通过基因工程技术获得，其允许异源二聚化作用形成并因此促进抗体的纯化过程(Merchand等，(1998)Nature Biotech.16:677-681)。双特异性抗体的实施例包括BiTETM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两个抗体的结合域并通过短的可弯曲多肽直接连接。短的可弯曲多肽在短的单链多肽上使两个抗体结合。构建双抗体和scFv不需要Fc区域，只使用可变区，潜在地降低了抗个体遗传型翻译的效果。
可将双特异性抗体构建为完整IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或双特异性scFv。此外，使用本领域已知的常规方法连接两个双特异性抗体以形成四价抗体。
与双特异性整体抗体相反，双特异性双抗体，也可能是特别有用的，因为其很容易被构建并在大肠杆菌中表达。使用噬菌体展示库(WO94/13804)可以很容易地选择适当结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持不变，例如，具有对IL-6的特异性，然后可构建另一变化的臂和选择的适当特异性的抗体的库。可通过其他工程方法构建双特异性整体抗体，如Ridgeway等所述(Ridgeway,J.B.B.等(1996)Protein Eng.,9,616-621)。
可以使用各种本领域获得抗IL-6的抗体的方法。抗体可以是单克隆抗体，特别是人类、小鼠、嵌合或人源化来源，其可以通过本领域技术人员已知的标准方法获得。
一般来说，单克隆抗体或其功能片段的制备，尤其是鼠源的，可能涉及在特定描述手册中的“抗体”技术(Harlow和Lan，antibody:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.,pp.726,1988)或者涉及和Milstein描述的从杂交瘤中的制备技术(and Milstein(1975)Nature,256:495-497)。
单克隆抗体可以例如从免疫的抗IL-6的动物的B细胞，或含有被所述单克隆抗体识别的表位的片段中获得。本文描述了包括这些的合适的片段和肽或多肽，并可以用于免疫动物以产生抗IL-6的抗体。所述IL-6，或其片段之一，尤其地能够根据通常的工作方法，通过以包含在编码IL-6或其片段的cDNA序列中的核酸序列起始，通过包含在IL-6和/或其片段的肽序列的氨基酸序列起始的基因重组制造。
单克隆抗体可以例如在亲和柱上进行纯化，其中IL-6或者其含有被所述单克隆抗体识别的表位的片段被预先固定。更特别地，单克隆抗体可以通过关于蛋白A和/或G的色谱纯化，接下来进行或不进行旨在清除残留蛋白质污染物及DNA和LPS的离子交换色谱，本身接下来进行或不进行琼脂糖凝胶排阻色谱，其用于去除由于二聚体或其他多聚体存在导致的潜在的聚集体。在一实施例中，这些技术可以整体同时或连续使用。
抗原结合位点
这描述了与靶抗原的全部或部分结合并与其互补的分子的部分。在抗体分子中，其被称作抗体抗原结合位点，并且包括与靶抗原的全部或部分结合并与其互补的抗体部分。当抗原较大时，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分被称为表位。抗体抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变区提供。抗体抗原结合位点包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
WO2006/072620描述了在结构(非-CDR)环中的抗原结合位点的工程化，所述环在免疫球蛋白结构域β折叠之间延伸。抗原结合位点可以被设计在从CDR自然区位分离的抗体分子的区域中，例如在VH或VL结构域的构架区，或者在抗体恒定区例如CH1和/或CH3。设计在结构域中的抗原结合位点可以额外地，或取代地形成VH和VL结构域的CDR组的抗原结合位点。其中在抗体分子中存在多个抗原结合位点，它们可以结合相同的抗原(IL-6)，从而增加结合元件的化合价。可取代地，多个抗原结合位点可以结合不同的抗原(IL-6和一个或多个其他抗原)，其可以用于增加效应物功能，延长半衰期或者改进体内抗体分子的递送。
分离的
这指本发明的结合元件或编码该结合元件的核酸一般与本发明一致所处的状态。因此，根据本发明的结合元件、VH和/或VL结构域以及编码的核酸分子和载体可以以分离的和/或纯化的形式提供，例如来自自然环境，基本上是纯的，或同源形式的，或者，如果是核酸，其是游离的，或基本上是游离的核酸或者原始的基因，而不是编码具有所需功能的多肽的序列。分离的元件和分离的核酸没有或基本没有其自然相关的物质，如在其自然环境中，或通过体外或体内实施的重组DNA技术制备时的制备环境(如细胞培养)中发现的其它多肽或核酸。元件和核酸可以利用稀释剂或辅剂制成，并且出于实际目的可以仍然是分离的一例如，如果在免疫试验中用于涂覆微滴定板，元件通常与凝胶或者其它载体混合，或者当用于诊断或治疗时元件与药物可接受的载体或稀释剂混合。结合元件可以自然地或通过异源真核细胞系统(如CHO或NSO(ECACC85110503))被糖基化，或者其可以是未糖基化的(例如，如果通过在原核细胞中表达产生)。
包括抗IL-6抗体分子的异构体制剂也构成了本发明的部分。例如这种制剂可以是具有全长重链和缺乏C末端赖氨酸的重链的抗体的混合物，其具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如N-末端谷氨酸的环化作用形成焦谷氨酸残基。
正如本文所使用的，短语“基本上列出”指的是本文中描述的结合元件的VH或VL结构域的相关CDR，其可以与本文中列出的序列的特异性区域一致或高度相似。如本文所述，短语“高度相似”与一个或多个可变区的特异性区域相关，设想在CDR和/或VH或VL结构域中，可以有1到约5，例如从1到4，包括1到3、或1、或2、或3、或4个氨基酸取代。
发明详述
本发明涉及产生具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的方法。使用本发明的方法，抗IL-6亲本抗体可能被修饰为产生具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体。为了实现本发明的方法，可以使用任何与人IL-6抗原特异性结合的抗IL-6抗体。在一实施例中，在PCT公开号为WO2008/065378的专利中公开的抗IL-6抗体可被修饰或为了实现本发明的方法使用。在一具体实施例中，在PCT公开号为WO2008/065378中所指定的抗体18(以下称为抗体18或Ab18)可被修饰或为了实现本发明的方法使用。
本发明提供了具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，本文中所描述的抗IL-6抗体具有延长的体内半衰期，其长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体具有长于抗体18的延长的体内半衰期。
本发明提供了具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在哺乳动物体内测定的半衰期。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在非人灵长动物内测定的半衰期(例如，但不限于食蟹猴或猕猴)。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在人受试者中测定的半衰期。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的2倍至3倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍或3倍至10倍。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或至少约20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或约20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期长于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期约2倍至约3倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约3倍至约5倍、或约3倍至约10倍。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是10天、15天、20天、25天、28天、29天、30天、35天、40天、45天或50天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是10天至20天、10天至30天、10天至40天、10天至50天、20天至30天、20天至40天、20天至50天、25天至30天、25天至40天、25天至50天、30天至40天、30天至50天或40天至50天。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天或至少约50天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是约10天、约15天、约20天、约25天、约28天、约29天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是约10天至约20天、约10天至约30天、约10天至约40天、10天至约50天、约20天至约30天、约20天至约40天、约20天至约50天、约25天至约30天、约25天至约40天、约25天至约50天、约30天至约40天、约30天至约50天或约40天至约50天。
本发明还提供具有降低的清除率的抗IL-6抗体。应将本文中所使用的术语清除理解为反映从血浆体积中，药物，即抗IL-6抗体每单位时间被彻底清除。在一实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体相比于亲本抗IL-6抗体具有降低的清除率。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体相比于抗体18具有降低的清除率。
本发明提供了具有降低的清除率的抗IL-6抗体。在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在哺乳动物体内测定的半衰期。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在非人灵长动物内测定的半衰期(例如，但不限于食蟹猴或猕猴)。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的半衰期是在人体中测定的半衰期。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率低于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率低于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率低于具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的2倍至3倍、2倍至5倍、2倍至10倍、3倍至5倍、或3倍至10倍。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或至少约20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或约20倍。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率具有相同的可变区和野生型恒定区的抗体的半衰期的约2倍至约3倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约3倍至约5倍、或约3倍至约10倍。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是至多1mL/kg/天、至多2mL/kg/天、至多3mL/kg/天、至多4mL/kg/天、至多5mL/kg/天、至多7mL/kg/天、至多10mL/kg/天、至多15mL/kg/天或至多20mL/kg/天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是1mL/kg/天、2mL/kg/天、3mL/kg/天、4mL/kg/天、5mL/kg/天、7mL/kg/天、10mL/kg/天、15mL/kg/天或20mL/kg/天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是1mL/kg/天至2mL/kg/天、1mL/kg/天至3mL/kg/天、1mL/kg/天至5mL/kg/天、1mL/kg/天至10mL/kg/天、1mL/kg/天至15mL/kg/天、2mL/kg/天至5mL/kg/天、2mL/kg/天至10mL/kg/天、3mL/kg/天至5mL/kg/天、3mL/kg/天至10mL/kg/天或5mL/kg/天至10mL/kg/天。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是至多约1mL/kg/天、至多约2mL/kg/天、至多约3mL/kg/天、至多约4mL/kg/天、至多约5mL/kg/天、至多约7mL/kg/天、至多约10mL/kg/天、至多约15mL/kg/天或至多约20mL/kg/天。另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是约1mL/kg/天、约2mL/kg/天、约3mL/kg/天、约4mL/kg/天、约5mL/kg/天、约7mL/kg/天、约10mL/kg/天、约15mL/kg/天或约20mL/kg/天。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体的清除率是约1mL/kg/天至约2mL/kg/天、约1mL/kg/天至约3mL/kg/天、约1mL/kg/天至约5mL/kg/天、约1mL/kg/天至约10mL/kg/天、约1mL/kg/天至约15mL/kg/天、约2mL/kg/天至约5mL/kg/天、约2mL/kg/天至约10mL/kg/天、约3mL/kg/天至约5mL/kg/天、约3mL/kg/天至约10mL/kg/天或约5mL/kg/天至约10mL/kg/天。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，其具有对Fc配体蛋白改变的亲和力。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，其具有对FcRn改变的亲和力。在一具体实施例中，FcRn可以是鼠、人或灵长类(例如猕猴)的FcRn蛋白。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，具有对Fc配体蛋白增加的亲和力。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，具有对FcRn增加的亲和力。在一具体实施例中，FcRn可以是鼠、人或灵长类(例如猕猴)的FcRn蛋白。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，其对Fc配体蛋白的结合亲和力取决于pH值。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括变体Fc区，其对FcRn的结合亲和力取决于pH值。在一具体实施例中，FcRn可以是鼠、人或灵长类(例如猕猴)的FcRn蛋白。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括相对于野生型人IgG恒定区的具有一个或多个氨基酸取代的人IgG恒定区。在不同的实施列中，人IgG恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括相对于野生型人IgG恒定区的具有一个或多个氨基酸取代的人IgG1恒定区。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG恒定区，其具有一个或多个选自下组的氨基酸取代：M252Y、M252F、M252W、M252T、S254T、T256S、T256R、T256Q、T256E、T256D、T256T、L309P、Q311S、H433R、H433K、H433S、H433I、H433P、H433Q、N434H、N434F、N434Y和N436H，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG恒定区，其具有一个或多个选自下组的氨基酸取代：M252Y、S254T、T256E、H433K、N434F和N436H，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG恒定区，其具有一个或多个选自下组的氨基酸取代：M252Y、S254T和T256E，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG恒定区，其包括M252Y、S254T和T256E氨基酸取代，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。在不同的实施列中，人IgG恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括人IgG1恒定区，其包括M252Y、S254T和T256E氨基酸取代，其中根据Kabat中的EU索引给氨基酸残基进行编号。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括抗体18的1个、2个、3个、4个、5个或者全部6个CDR(参见公开号为WO2008/065378的PCT专利)。
根据Kabat限定的抗体18的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。根据Kabat限定的抗体18的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
Kabat编号基于Kabat等人的开创性工作(1991)。免疫目标蛋白的序列，公开号91-3242，被美国国立卫生研究院，国家技术信息服务公布于第三卷中(下文称“Kabat”)。Kabat提供了来自多种抗体亚型的免疫球蛋白链的多序列比对。根据单独的编号系统(Kabat编号系统)给比对的序列进行编号。从1991年公开后，Kabat序列已经更新并且可以获得其电子序列数据库(最新的下载版本为1997)。根据Kabat，通过与Kabat参考序列进行比对后，可以给任何免疫球蛋白进行编号。因此，Kabat编号系统为免疫球蛋白链编号提供了统一的方法。除非另有说明，本文中所描述的所有免疫球蛋白氨基酸序列都根据Kabat编号系统进行编号。同样地，本文提到的所有氨基酸位置根据Kabat编号系统进行编号。
在某些实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体可包括重链可变区VH，其包括至少一个CDR，所述CDR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。在特定实施例中，本发明的抗IL-6抗体可包括VH域，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在某些实施例中，本文中描述的抗IL-6抗体可包括轻链可变区VL，其包括至少一个CDR，所述CDR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。在特定实施例中，本发明的抗IL-6抗体可包括VL域，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL结构域，还包括具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列VH域。
本发明包含与人IL-6结合的抗体，其包括VH结构域的衍生物，VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3，VL结构域，VL CDR1、VL CDR2或VLCDR3，其可与人IL-6结合。本领域技术人员已知的标准技术可以用于在核苷酸序列中引入突变(例如增加，缺失和/或取代)，所述核苷酸序列编码抗体，包括例如，位点定向诱变和PCR导致的诱变，其能够常规地用于产生氨基酸取代。在一实施例中，相比于抗体18抗IL-6抗体的原始VH和/或VL CDR衍生物，VH和/或VL CDR衍生物，可包括少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、少于2个氨基酸取代或1个氨基酸取代。在另一实施例中，VH和/或VL CDR衍生物可包括保守的氨基酸取代(例如上文)，其发生在一个或多个预测的非必要氨基酸残基中(也就是，在抗体与人IL-6特异性结合中不起关键作用的氨基酸残基)。可以在VH和/或VL CDR编码序列中全部或部分随机引入突变，例如包括饱和诱变，由此产生的突变体对其生物活性进行筛选，以鉴定出保持活性的突变体。诱变后，表达编码的抗体并且测定抗体的活性。
本发明还包括与人IL-6结合的抗体，所述抗体或抗体片段包括一个或多个CDR，其中所述CDR包括与抗体18的一个或多个CDR氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。两个氨基酸序列的相同百分比可以通过本领域任何已知的方法确定，包括但不局限于BLAST蛋白检索。
本发明还包括与人IL-6结合的抗体，所述抗体或抗体片段包括VH和/或VL结构域，其中所述VH和/或VL结构域包括与抗体18的一个或多个CDR氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。两个氨基酸序列的相同百分比可以通过本领域任何已知的方法确定，包括但不局限于BLAST蛋白检索。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体可与人IL-6结合，相比于抗体18，其具有亲和性。
在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体与抗体18一样，与IL-6的相同表位特异性结合。
在一实施例中，与IL-6结合时，抗IL-6抗体特异性地与抗体18竞争。使用本领域已知的结合试验进行竞争试验，例如，但不局限于ELISA试验或放射免疫法。
本发明还提供了由编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的核苷酸序列组成的多核苷酸。本发明还包含多核苷酸，其在本文中限定的严格或低严格杂交条件下与编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的多核苷酸杂交。
在一实施例中，本发明的多核苷酸编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体，在此处包括优化的多核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的编码抗IL-6抗体的VH结构域的多核苷酸，在此处包括SEQ IDNO:11的核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的编码抗IL-6抗体的VL结构域的多核苷酸，在此处包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的编码抗IL-6抗体的重链的多核苷酸，在此处包括SEQ ID NO:13的核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的编码抗IL-6抗体的轻链的多核苷酸，在此处包括SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
本发明的另一实施例是载体，其包括编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的多核苷酸。
在一实施例中，本发明的载体包括编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的一个或多个核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是优化的核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的载体包括SEQ ID NO:11-14的核苷酸序列中的任意一个。在另一具体实施例中，本发明的载体包括编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的一个或多个核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:11-14。
本发明还涉及分离的包括载体的细胞，其中所述载体包括编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的一个或多个核苷酸序列。在一具体实施例中，本发明的分离的细胞包括选自SEQ ID NO:11-14的多核苷酸序列的多核苷酸。
本发明的抗IL-6抗体包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人类同型抗体。
本发明还涉及包括抗IL-6抗体的药物组合物，所述抗体包括SEQ IDNO:1-10的氨基酸序列中的任意一种。
本文中描述的抗IL-6抗体与人IL-6抗原可具有高亲和力。例如，本文中描述的抗体可具有至少2X105M-1s-1、至少5X105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5X106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5X107M-1s-1、或至少108M-1s-1的结合速率常数或kon速率(抗体(Ab)+抗原(Ag)kon→Ab-Ag)。
在另一实施例中，抗IL-6抗体可具有少于5x10-1s-1、少于10-1s-1、少于5x10-2s-1、少于10-2s-1、少于5x10-3s-1、少于10-3s-1、少于5x10-4s- 1,或少于10-4s-1的koff速率((Ab-Ag)koff→抗体(Ab)+抗原(Ag))。在另一实施例中，本发明的抗体具有少于5x10-5s-1、少于10-5s-1、少于5x10-6s-1、少于10-6s-1、少于5x10-7s1、少于10-7s-1、少于5x10-8s-1、少于10-8s- 1、少于5x10-9s-1、少于10-9s-1或少于10-10s-1的koff。
在另一实施例中，抗IL-6抗体可具有至少102M-1、至少5X102M-1、至少103M-1、至少5X103M-1、至少104M-1、至少5X104M-1、至少105M-1、至少5X105M-1、至少106M-1、至少5X106M-1、至少107M-1、至少5X107M-1、至少108M-1、至少5X108M-1、至少109M-1、至少5X109M-1、至少1010M-1、至少5X1010M-1、至少1011M-1、至少5X1011M-1、至少1012M-1、至少5X1012M-1、至少1013M-1、至少5X1013M-1、至少1014M-1、至少5X1014M-1、至少1015M-1、或至少5X1015M-1的亲和常数或Ka(kon/koff)。在还一实施例中，抗IL-6抗体可具有少于5x10-2M、少于10-2M、少于5x10-3M、少于10-3M、少于5x10-4M、少于10-4M、少于5x10-5M、少于10-5M、少于5x10-6M、少于10-6M、少于5x10-7M、少于10-7M、少于5x10-8M、少于10-8M、少于5x10-9M、少于10-9M、少于5x10-10M、少于10-10M、少于5x10-11M、少于10-11M、少于5x10-12M、少于10-12M、少于5x10-13M、少于10-12M、少于5x10-14M、少于10-14M、少于5x10-155M、或少于10-15M的解离常数或Kd(koff/kon)。
用于根据本文描述的方法的抗体可与IL-6免疫特异性地结合并可具有少于3000pM、少于2500pM、少于2000pM、少于1500pM、少于1000pM、少于750pM、少于500pM、少于250pM、少于200pM、少于150pM、少于100pM、少于75pM的解离常数，该解离常数使用本发明描述的方法或本领域任何已知一种方法(例如BIAcore试验，ELISA)(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)测定。在一具体实施例中，用于根据本文描述的方法的抗体可与人IL-6抗原免疫特异性地结合并可具有25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25至2000pM、25至1500pM、25至1000pM、25至750pM、25至500pM、25至250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM的解离常数(kd)，该解离常数使用本发明描述的方法或本领域任何已知一种方法(例如BIAcore试验，ELISA)(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)测定。在另一实施例中，用于根据本文描述的方法的抗IL-6抗体可与IL-6免疫特异性地结合并可具有500pM、100pM、75pM或50pM的解离常数(kd)，该解离常数使用本发明描述的方法或本领域任何已知一种方法(例如BIAcore试验，ELISA)测定。
本发明还提供了由编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的核酸序列组成的多核苷酸。本发明还包含多核苷酸，其在本文中限定的严格或低严格杂交条件下与编码具有延长的体内半衰期的抗IL-6抗体的多核苷酸杂交。
严格杂交条件包括，但不局限于，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃下，与滤器结合的DNA杂交，然后在0.2X SSC/0.1％SDS中，在约50-65℃下洗涤一次或多次。高度严格杂交条件，例如为在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃下，与滤器结合的DNA杂交，然后在0.2X SSC/0.1％SDS中，在约60℃下洗涤一次或多次，或者本领域技术人员已知的任何其他严格杂交条件(参见例如Ausubel,F.M.等,eds.1989Current Protocols in Molecular Biology,vol.1,Green PublishingAssociates,Inc.和John Wiley and Sons,Inc.,NY,pages6.3.1至6.3.6和2.10.3)。
抗体可以是获得的，并且通过本领域已知的方法测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，那么编码该抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡聚核苷酸中聚集(如Kutmeier等,BioTechniques17:242(1994)中所描述)，简言之，其涉及包括编码该抗体的序列部分的寡聚核苷酸的重叠、这些寡聚核苷酸的退火和连接、以及通过PCR将连接的寡聚核苷酸扩增的合成方法。
编码抗体的多核苷酸同样可以是来自合适的来源的核苷酸产生的。如果不能克隆含有编码特定抗体的核苷酸，但是该抗体分子的序列已知，那么编码免疫球蛋白的核苷酸可以化学合成或者从合适的来源(例如，从任何表达抗体的组织或细胞分离的抗体cDNA文库、或者cDNA文库、或者核酸、优选多聚腺苷酸RNA，所述组织或细胞例如是选择表达抗体的杂交瘤细胞)获得，通过使用合成的引物进行PCR扩增，所述合成引物与序列的3'端和5'端杂交，或者通过使用特异于需识别的特定的基因序列的寡聚核苷酸探针克隆，例如，来自编码抗体的cDNA文库中的cDNA克隆。然后可以使用任何本领域已知的方法，将通过PCR产生的扩增的核苷酸克隆到可复制的克隆载体中。
IL-6与许多疾病与病症相关。这些疾病和病症包括，但不局限于，炎症、疼痛和癌症。本发明的抗IL-6抗体，优选能够，例如中和IL-6，降低体内IL-6水平，并对抗IL-6信号转导。因此，本发明的抗IL-6抗体，优选能够作为治疗这些病症或疾病的药物。
本发明还提供了能够有效地中和受试者内的IL-6活性的抗体，其具有延长半衰期。不被特定的作用机制约束，本发明的抗IL-6抗体可以通过与IL-6结合而将其中和，从而阻止IL-6参与对于IL-6介导的信号转导所必须的蛋白质间的相互作用。在一实施例中，本发明的抗体能够降低游离的(也就是没有与抗IL-6抗体结合的)IL-6的血清浓度。在生物流体(例如血浆)中游离的IL-6水平可以通过使用定量生物测定进行测定，例如，但不局限于Papadopoulos等人描述的Jurnal of ClinicalLaboratory Analysis9:234-37(1995)的生物测定。简言之，生物测定测量IL-6诱导的特定杂交瘤细胞(例如，B9杂交瘤细胞)的增殖。可以通过双抗原夹心法测定游离的IL-6浓度。简言之，在血清中游离的IL-6可以被抗IL-6捕获抗体所捕获。该捕获抗体仅与缺乏抗体18E的IL-6和可溶性IL-6受体结合。使用检测抗体检测捕获的IL-6，所述检测抗体不与捕获抗体竞争，并且也没有用钌或HRP标记。测量的电化学发光或比色信号与血清中游离的IL-6的浓度成正比。基于标准曲线计算血清中游离的IL-6的浓度。
在一实施例中，本发明的抗体能够降低游离的(也就是没有被抗IL-6抗体结合的)IL-6的血清浓度。施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％游离的IL-6的血清浓度。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。游离IL-6水平的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在另一实施例中，施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到持续的降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％游离的IL-6的血清浓度。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。在一具体实施例中，每4周施用一次50mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％游离的IL-6的血清浓度。在一具体实施例中，每8周施用一次100mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％游离的IL-6的血清浓度。在一具体实施例中，每12周施用一次200mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％游离的IL-6的血清浓度。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，本发明的抗体能够中和受试者内的血清。施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6的。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。血清IL-6的中和可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在另一实施例中，施用多于一次剂量的本发明的抗IL-6抗体，可以达到持续中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％血清IL-6。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。在一具体实施例中，每4周施用一次50mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续中和至少90％的血清IL-6。在一具体实施例中，每8周施用一次100mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续中和至少90％的血清IL-6。在一具体实施例中，每12周施用一次200mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续中和至少90％的血清IL-6。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，本发明的抗体能够抑制受试者内IL-6介导的信号转导。施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内IL-6介导的信号转导。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。受试者内IL-6介导的信号转导的抑制作用持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在另一实施例中，施用多于一次剂量的本发明的抗IL-6抗体，可以达到持续抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内IL-6介导的信号转导在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。在一具体实施例中，每4周施用一次50mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续抑制至少90％的受试者内IL-6介导的信号转导。在一具体实施例中，每8周施用一次100mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续抑制至少90％的受试者内IL-6介导的信号转导。在一具体实施例中，每12周施用一次200mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续抑制至少90％的受试者内IL-6介导的信号转导。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，本发明的抗体能够降低受试者内滑膜细胞的生长速度。施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内滑膜细胞的生长速度。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。受试者内滑膜细胞的生长速度的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在另一实施例中，施用多于一次剂量的本发明的抗IL-6抗体，可以达到持续降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内滑膜细胞的生长速度。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。在一具体实施例中，每4周施用一次50mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜细胞的生长速度。在一具体实施例中，每8周施用一次100mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜细胞的生长速度。在一具体实施例中，每12周施用一次200mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜细胞的生长速度。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，本发明的抗体能够降低受试者内的滑膜炎症。施用有效剂量的本发明的抗IL-6抗体可以达到降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内的滑膜炎症。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。受试者内的滑膜炎症的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在另一实施例中，施用多于一次剂量的本发明的抗IL-6抗体，可以达到持续降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％受试者内的滑膜炎症。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。在一具体实施例中，每4周施用一次50mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜炎症。在一具体实施例中，每8周施用一次100mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜炎症。在一具体实施例中，每12周施用一次200mg剂量的本发明的抗IL-6抗体，达到持续降低至少90％的受试者内滑膜炎症。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
本发明还提供降低游离IL-6的血清浓度、中和受试者内血清IL-6、抑制受试者内IL-6介导的信号转导、降低受试者内滑膜细胞生长速度、并降低受试者内滑膜炎症的方法。
在一实施例中，降低受试者内游离(也就是没有与抗IL-6抗体结合的)IL-6的血清浓度的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用有效剂量的抗IL-6抗体可以达到降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％游离IL-6的血清浓度。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。游离IL-6水平的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天降低至少90％游离IL-6的血清浓度。
在一实施例中，降低受试者内游离IL-6的血清浓度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的游离IL-6的血清浓度。在一实施例中，维持受试者内降低的游离IL-6的血清浓度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以维持至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％降低的游离IL-6的血清浓度。在一实施例中，达到持续降低受试者内游离IL-6的血清浓度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到持续降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％游离IL-6的血清浓度。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内游离IL-6的血清浓度至少约90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度至少降低90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度至少降低90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度至少降低90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内至少约90％的游离IL-6的血清浓度的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度降低至少90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度降低至少90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内游离IL-6的血清浓度降低至少90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内游离IL-6的血清浓度持续降低至少90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，中和受试者内血清IL-6的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用有效剂量的抗IL-6抗体可以达到中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的血清IL-6。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。血清IL-6的中和可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天或至少约20天中和至少90％的血清IL-6。
在一实施例中，中和受试者内血清IL-6的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的血清IL-6。在一实施例中，维持受试者内血清IL-6中和的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的血清IL-6。在一实施例中，达到持续中和受试者内血清IL-6的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到中和降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的血清IL-6。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的血清IL-6的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内血清IL-6的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，中和受试者内IL-6的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用有效剂量的抗IL-6抗体可以达到中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。IL-6的中和可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天中和至少90％的IL-6。
在一实施例中，中和受试者内IL-6的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6。在一实施例中，维持受试者内IL-6中和的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以中和至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6。在一实施例中，达到持续中和受试者内血清IL-6的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到中和降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6持续的至少90％中和的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6持续的至少90％中和的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6持续的至少90％中和的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，中和受试者内至少约90％的IL-6的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％中和受试者内IL-6的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内血清IL-6持续的至少90％中和的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用有效剂量的抗IL-6抗体可以达到抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6介导的信号转导。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。IL-6介导的信号转导的抑制可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。
在一实施例中，抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6介导的信号转导。在一实施例中，维持抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6介导的信号转导。在一实施例中，达到持续抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的IL-6介导的信号转导。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持至少90％抑制受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导信号转导持续的至少90％抑制的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导信号转导持续的至少90％抑制的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导信号转导持续的至少90％抑制的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，抑制受试者内至少约90％的IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持抑制至少90％受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持抑制至少90％受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持抑制至少90％受试者内IL-6介导的信号转导的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导的信号转导持续的至少90％抑制的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导的信号转导持续的至少90％抑制的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内IL-6介导的信号转导持续的至少90％抑制的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用抗IL-6抗体有效剂量的可以达到至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％降低的滑膜细胞生长速度。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。滑膜细胞生长速度的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度至少约90％方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。
在一实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度。在一实施例中，维持降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度。在一实施例中，达到持续降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受体内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受体内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的细胞滑膜生长速度至少约90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中维持受试者内细胞滑膜生长速度降低至少90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内细胞滑膜生长速度持续的至少90％降低的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用抗IL-6抗体有效剂量的可以达到至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％降低的滑膜细胞生长速度。有效剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。滑膜细胞生长速度的降低可持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。在一具体实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度至少约90％方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体，所述有效剂量为1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg，其中持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约10天、至少约15天、或至少约20天。
在一实施例中，降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度。在一实施例中，维持降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以抑制至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度。在一实施例中，达到持续降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。施用多于一次剂量的抗IL-6抗体可以达到至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或至少约100％的降低受试者内滑膜细胞生长速度的方法。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。单剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，分离剂量的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次或每十二周一次进行给药。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，降低受试者内的滑膜炎症至少约90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中维持受试者内滑膜炎症降低至少90％的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，达到受试者内滑膜炎症持续的至少90％降低的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。可以通过本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。受试者可以是人类或非人的灵长类动物。
本发明的另一些方面提供了包括本发明结合元件的组合物及其用于结合、抑制和/或中和IL-6的方法，包括通过治疗人类或动物体的治疗方法。
根据本发明的结合元件可以用于治疗或诊断方法，例如人或动物体(例如人类患者)中疾病或病症的治疗方法(其可包括预防法)，其包括给所述患者施用有效量的本发明的结合元件。根据本发明的治疗条件包括如本文其他地方详细讨论的任何IL-6在其中起作用的条件。
在一实施例中，治疗所需患者的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎,血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括施用治疗上有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内炎症性肠道疾病或SLE的方法包括施用有效剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗上的有效剂量可包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗上的有效剂量可包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg抗IL-6抗体。在另一实施例中，治疗上的有效剂量可包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg抗IL至6抗体。可以使用本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括施用1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括施用约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg的具有延长的半衰期的抗IL至6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括施用约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg具有延长的半衰期的抗IL至6抗体。
在一实施例中，治疗所需患者的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎,血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎的方法包括施用多于一次剂量的具有延长的半衰期的抗IL-6抗体。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。在一实施例中，单剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在一实施例中，单剂量可以包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg的抗IL至6抗体。在另一实施例中，单剂量可以包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg的抗IL至6抗体。在一实施例中，多于一次剂量的每次剂量包括相同量的抗IL-6抗体。在另一实施例中，在初始负荷剂量之后施用维持剂量。初始负荷剂量可以包括多于维持剂量的抗IL-6抗体2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一实施例中，负荷剂量可以包括1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg的本发明的抗IL-6抗体。在一实施例中，负荷剂量可以包括约0.1至5mg/kg、约0.1至2mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.3至2mg/kg、约0.3至1mg/kg、约0.5至2mg/kg、或约0.5至1mg/kg的抗IL至6抗体。在另一实施例中，负荷剂量可以包括约20至500mg、约20至200mg、约20至100mg、约50至500mg、约50至200mg、或约50至100mg抗IL至6抗体。在一实施例中，分离剂量给药的时间间隔是固定的。抗IL-6抗体剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每八周一次、每十二周一次、每十六周一次或每六个月一次进行给药。可以使用本领域已知的任何方法施用抗IL-6抗体，例如但不局限于，通过皮下注射或静脉注射。
在一实施例中，治疗所需病人的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗所需病人的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗所需病人的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗所需病人的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗所需病人的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗所需病人的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。
在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎,血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎,血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、幼年性慢性关节炎、全身性青年关节炎,血清阴性脊柱关节病(包括关节强硬性脊椎柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏病)、牛皮癣或SLE的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。
在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括(a)施用100mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每4周施用50mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括(a)施用200mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每8周施用100mg剂量的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，治疗人体内类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病或SLE的方法包括(a)施用400mg负荷剂量的抗IL-6抗体和(b)每12周施用200mg剂量的抗IL-6抗体。
抗IL-6抗体
根据本发明的结合元件已经被证明能够高效能的中和IL-6。中和作用意味着抑制IL-6的生物活性。根据本发明的结合元件可以中和一个或多个IL-6的活性。抑制的生物活性通常是IL-6与一个或多个其结合配体结合。例如，抑制的生物活性可以是IL-6与跨膜和/或可溶性IL-6Rα结合。这可以在以下试验中被证明，此处进行简要介绍，并且下文将详细介绍：TF-1试验表明根据本发明的结合元件抑制IL-6与膜IL-6Ra结合，因为TF-1似乎不产生可溶性IL-6Ra。因此，本发明的结合元件抑制IL-6与膜受体结合。在滑膜成纤维细胞实验中，根据本发明的结合元件抑制IL-6与可溶性IL-6Ra结合，由于sIL-6Ra需要被加入到该实验中发挥作用。添加的IL-1β导致内源性IL-6的产生，此时其被本发明的结合元件抑制阻止VEGF的产生。
根据本发明，人类或非人类灵长动物(例如猕猴)的IL-6与IL-6Rα的结合可能被抑制，例如，结合元件可抑制成熟的人IL-6与IL-6Rα的结合。
生物活性的抑制可以是部分地或全部的。与缺乏结合元件的活性相比，结合元件可以至少100％、或至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的抑制IL-6的生物活性。
测定结合元件的中和效力。效力通常表达为IC50值，除非另有说明，用nM表示。在功能分析中，IC50是生物应答降低为最大值50％时的结合元件的浓度。在配体结合研究中，IC50是配体-受体复合物制剂降低到最大特异结合水平的50％时的浓度。IC50可以通过绘制最大生物应答的百分比曲线计算，其作为结合元件浓度的log函数存在，并使用软件程序，例如Prism(GraphPad)或Origin(Origin Labs)以适合S形函数的数据，从而得出IC50值。可以使用一个或多个本领域技术人员已知的和/或本发明中描述或提到的试验确定或测定效力。
在本发明中描述了在一试验中通过结合元件中和IL-6活性，所述试验例如TF-1增殖试验或者下文描述的其他基于细胞的试验，试验表明结合元件结合并中和IL-6。可以使用其他的方法测定结合元件与IL-6的结合，包括ELISA、免疫印迹法、免疫沉淀法、亲和色谱法和生物化学试验。
本发明中的结合元件已经被证明能够结合和中和内源性人IL-6，正如在根据内源性人IL-6，VEGF从人类滑膜成纤维细胞中的释放的抑制试验中所示，本发明的实施例1.7和2.7对此进行了叙述。在该试验中，来自类风湿性关节炎病人的滑膜成纤维细胞随着IL-1β和可溶性IL-6Rα的刺激产生IL-6，导致IL-6诱导的VEGF分泌。因此由人类滑膜成纤维细胞产生的IL-6代表了内源性人IL-6。内源性人IL-6是人类医学治疗中的分子靶标，所以内源性人IL-6的中和是结合元件治疗潜力的一个重要的指标。由于试验是在来自类风湿性关节炎病人的滑膜成纤维细胞中进行的，结果与结合元件治疗类风湿性关节炎的用途特别相关。在VEGF释放试验中测试的优化的抗体分子的中和效力超过已知的抗IL-6抗体CNTO-328的中和效力。
根据本发明的结合元件，在用0.6pM人IL-1β和2.4nM可溶性人IL-6Rα刺激后，在从人滑膜成纤维细胞中释放的VEGF的抑制试验中，可以具有少于50nM的IC50值，例如少于5nM，例如少于1nM。
已知内源性IL-6是糖基化形式和未糖基化形式的混合物。在滑膜成纤维细胞中已经证明了本发明结合元件与内源性IL-6的结合，由于该试验利用了来自人滑膜成纤维细胞的IL-6，即内源性IL-6。
本发明的结合元件可以抑制IL-6诱导的TF-1细胞的增殖。TF-1是在患有红白血病的患者中建立的premyeloid细胞系(Kitamura等1989)。TF-1细胞系需要存在用于存活和增殖的生长因子。个体生长因子TF-1细胞能够对IL-6、GM-CSF和抑瘤素M进行应答。在对于应答20pM人IL-1β的TF-1细胞的增殖抑制试验中，本发明的结合元件可以具有少于100nM的IC50值、例如少于20nM、10nM或1nM，例如少于100pM、70pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。正如本文所述(参见实施例1.5)，亲本IgG"CAN022D10"显示出在TF-1增殖试验中具有约93nM的IC50值，随后我们生产了CAN022D10的优化的变体，其具有增加的效力(IC50值通常小于100pM)，如实施例2.2、2.5和2.6所示(分别为表3，4和5)。特别地，测定的优化的克隆中的一些IC50值为5pM或更低，例如生殖系IgG抗体7、抗体17和抗体18，代表这些抗体具有极高的中和效力。
本发明的结合元件可以抑制IL-6诱导的B9细胞的增殖。B9细胞是鼠B细胞杂交瘤细胞系的亚克隆，B13.29，其基于对IL-6的特异性应答。B9细胞系需要用于存活和增殖的IL-6并对非常低浓度的IL-6进行应答。因此，在存在IL-6抗体时，能够评估这些细胞的增殖并且测定抗体的亲和性。本发明的实施例2.10示出了抗体18抑制B9细胞增殖，以响应IL-6，且在该试验中显示了高亲和性。
类风湿性关节炎中自身抗体的生产大多是IgM类。SKW6.4是纯系的IgM，其分泌自人类淋巴母细胞B细胞系。一旦用IL-6刺激，这些细胞分泌IgM，因此该试验被视为与类风湿性关节炎相关。SKW6.4细胞可以用于中和IL-6的结合元件的效力的测定，其通过测定对于IL-6应答，IgM分泌的抑制而测定。在对于应答100pM人IL-6的IgM分泌的抑制的SKW6.4细胞试验中，本发明的结合元件可以具有少于10pM的IC50值，例如少于5pM。在该试验中，抗体18示出了IL-6的中和作用，参见实施例2.11(表9)。
本发明提供了对于人IL-6的高亲和性结合元件。也同样证明了其对于食蟹猴IL-6的高亲和性。本发明的结合元件可以与人IL-6和/或猕猴IL-6结合，其分子量大小不超过1nM，例如不超过100pM、50pM、30pM或10pM。可以通过表面等离子体共振例如测定分子量。在实施例2.9中对亲和性的测量进行描述。显著地，发现抗体7和18的亲和性超过使用仪器的限制测量范围，表明其KD值低于10pM。
正如本文其他地方所述，表面等离子共振涉及在流体相中使分析物流过连接配体的支撑物，并测定分析物与配体的结合。表面等离子共振可以例如这样进行，其中在流体相中，IL-6流过连接结合元件的支撑物。表面等离子共振数据可以被放入单价分析物数据模型中。亲和常数Kd可以用速率常数常数的比值kd/ka计算，如使用单价分析物数据模型的表面等离子共振测定。
可选择地，对于IL-6的结合元件的亲和性可以用Schild试验计算，例如基于随着人IL-6浓度变化的TF-1细胞增殖的抑制试验。本发明的结合元件的亲和性可以少于10pM，例如少于1pM，如Schild试验所计算。如本发明的实施例2.10所叙述，使用Schild分析计算抗体18对于人IL-6的亲和性为0.4pM。
本发明的结合元件可以非必须地不与一个或多个或全部下列物质发生交叉反应：白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、IL-11或抑瘤素M。
本发明的结合元件可以非必要地不与大鼠IL-6、小鼠IL-6和/或狗IL-6发生交叉反应。
用于结合其他蛋白质或非人IL-6的结合元件的交叉反应性可以被测定，例如在时间分辨荧光分析中，所述分析用于抑制人IL-6与固定在支撑物上的结合元件结合，例如，如实施例1.6中所描述的表位竞争试验。例如，任何或所有的LIF,CNTF、IL-11、抑瘤素M、大鼠IL-6和小鼠IL-6可以显示出不抑制、少于50％抑制或在时间分辨荧光分析中，其可能具有大于0.5mM或大于1mM的IC50值，所述分析用于抑制人IL-6与固定在支撑物上的结合元件结合。例如，任何或所有的LIF,CNTF、IL-11、抑瘤素M、大鼠IL-6和小鼠IL-6可以显示出不抑制，或在用于测试交叉反应性的时间分辨荧光分析中，可具有至少10或100倍大于未标记的人IL-6的IC50值。在该分析中，在其与结合元件反应的Kd的终浓度处使用标记的野生型成人IL-6。
本发明的结合元件可以与猕猴IL-6发生交叉反应。在上述的时间分辨荧光分析中，交叉反应性可以确定为标记的人IL-6与固定在支撑物上的结合元件结合的抑制作用。例如，在时间分辨荧光分析中，猕猴IL-6可以具有少于5nM的IC50值，例如少于2.5nM、例如少于约1nM。在该分析中，与未标记的人IL-6相比，猕猴IL-6可以具有少于10倍的IC50值，例如少于5倍。
在一实施例中，抗IL-6抗体与IL-6的表位结合，所述表位在人与猕猴的IL-6序列中是保守的，相比于人的序列，在小鼠、大鼠和狗IL-6的序列中是不同的。
在一实施例中，结合元件结合IL-6的“位点1”区域，该区域与IL-6Rα相互作用。因此，本发明的结合元件可以竞争性地抑制IL-6与IL-6Rα结合，从而中和通过IL-6Rα介导的IL-6的生物学效应。
本发明的结合元件可以在Phe102和/或Ser204与人IL-6结合。本发明的结合元件可以在Arg207与人IL-6结合。非必要地，除了结合Phe102和/或Ser204，结合元件可以结合IL-6分子中的侧翼残基或结构性的相邻残基。按照惯例，对应于全长人IL-6(SEQ ID NO:15)给残基编号。然而，可以使用成人IL-6测定结合。用位点直接突变测定IL-6残基的结合，如下所述。
蛋白质的单独的氨基酸和区域的突变是为了与具有活性的结构相关联，这对于本领域技术人员是已知的，其被用于定义与抗体结合的蛋白质区域(Lu等,(2005)Biochemistry44:11106-14)。突变的人IL-6的结合和/或中和可以用于评估结合元件是否结合Phe102、Ser204和/或Arg207。当突变型IL-6与野生型相比没有结合或中和，或者显著降低的结合或中和，则表明结合元件结合突变的残基。
可以使用在选择的残基上突变的IL-6测定在IL-6中的残基的结合，所述选择的残基上突变在时间分辨荧光分析中抑制标记的野生型人IL-6与固定在支撑物上的结合元件结合，其中标记的野生型成人IL-6处于终浓度，相当于其与结合元件相互作用的Kd。其中，突变体IL-6并不抑制标记的野生型IL-6与结合元件结合，或者其中突变体IL-6具有大于未标记的野生型IL-6的IC50值(例如，大于10倍或者100倍)，这表明突变的残基被结合元件结合。
本发明的结合元件可以非必要地不结合和/或中和突变的人IL-6，其在残基Phe102，Ser204和/或Arg207上具有突变，例如突变Phe102Glu，Ser204Glu，Ser204Tyr和/或Arg207Glu。
本发明的结合元件可以包括抗体分子，例如人抗体分子。结合元件通常包括抗体VH和/或VL结构域。结合元件的VH和/或VL结构域作为本发明的部分提供。互补决定区(“CDR”)和构架区(“FRs”)存在于每个VH和VL结构域中。VH结构域包括一组HCDR，且VL结构域包括一组LCDR。抗体分子可以包括抗体VH结构域，其包括VH CDR1、CDR2和CDR3及构架。可选择地或同样地包括抗体VL结构域，其包括VLCDR1、CDR2和CDR3及构架。VH或VL结构域构架包括4个构架区，FR1、FR2、FR3和FR4，与CDR穿插在以下结构中：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
根据本发明的抗体VH和VL结构域以及CDR在序列表中列出，其形成了本发明的组成部分。其他的CDR在PCT公开号为WO2008/065378的申请中公开。所有的VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组以及LCDR组在PCT公开号为WO2008/065378的申请中公开，其代表了本发明的其他方面和具体实施例。如本文所述，“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此HCDR组指的是HCDR1、HCDR2和HCDR3，LCDR组指的是LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有说明，“CDR组”包括HCDR和LCDR。本发明典型的结合元件是单克隆抗体。
本发明的结合元件可以包括位于非抗体分子内的抗原结合位点，其通常由在非抗体蛋白质骨架内的一个或多个CDR提供，例如CDR组，下文将进一步讨论。
如上所述，根据本发明的结合元件调节并可以中和IL-6的生物活性。正如本文所述，本发明的IL-6-结合元件可以对中和效力进行优化。通常地，效力优化涉及使选择的结合元件的序列(通常是抗体的可变区序列)突变以产生结合元件文库，然后其用于效力测定并选出更有效的结合元件。因此，相对于从文库中产生的结合元件，选择的“效力优化的”结合元件倾向于具有高效能。然而，高效能结合元件还可以不通过优化获得，例如，高效能结合元件可以直接从最初的筛选获得，例如生物化学中和试验。“效力优化的”结合元件指的是具有优化的IL-6特殊活性或下游功能的中和效力。本发明的其他地方将对试验和效力进行更详细的描述。本发明同时提供了效力优化的和非优化的结合元件，以及用于选择的结合元件效力优化的方法。因此本发明使本领域技术人员能够生产具有高效能的结合元件。
在另一方面，本发明提供了获得一种或几种能够结合抗原的结合元件的方法，所述方法包括使根据本发明的结合元件库与所述抗原接触，并选择一种或几种能与所述抗原结合的文库中结合元件。
文库可以在颗粒复合物或分子复合物中显示，例如可复制的遗传组合件，例如酵母、细菌或者噬菌体(例如T7)颗粒、病毒、细胞或共价体、核糖体或其他体外显示系统，含有编码抗体VH可变区的核酸的颗粒复合物或分子复合物，所述VH可变区在其上显示，及非必要地，如果存在也可以显示VL结构域。在WO92/01047中和例如美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404描述了噬菌体显示，它们的全部内容通过引用并入本文。
下述的能够结合抗原的结合元件的选择，并能显示在噬菌体或其他文库颗粒复合物或分子复合物中，核酸可取自噬菌体或其他显示所述选择的结合元件的颗粒复合物或分子复合物。这样的核酸可以用于通过核酸表达产生的结合元件或抗体VH或VL可变区的随后的生产中，所述核酸选自噬菌体或其他显示所述选择的结合元件的颗粒复合物或分子复合物。
本发明的VH和VL结构域及CDR的变体，包括本文中所陈列的氨基酸，其可用于本发明的结合元件，能够通过序列改变或突变的方法获得，并筛选具有所需特征的抗原结合元件。所需特征的例子包括但不局限于：
·相对于已知的特异于抗原的抗体，具有增加的抗原亲和力
·相对于已知的特异于抗原的抗体(如果活性是已知的)，具有增加的抗原活性中和能力
·与已知抗体或配体与抗原结合的特定摩尔比，具有特异性的竞争能力
·免疫沉淀复合物的能力
·结合特异的表位的能力
o线性表位，例如使用如本文所述的肽结合扫描鉴定的肽序列，例如使用线性和/或限制构象筛选的肽。
o构象表位，由非连续的残基构成
·调节IL-6或下游分子新的生物活性的能力
在本发明中同样提供了这样的方法。
本文中公开的抗体分子的变体可以被生产并用于本发明。计算化学在多元数据分析技术的应用建立了结构/性质-活性的关系(Wold,等，Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics–Mathematics andStatistics in Chemistry(Ed.:B.Kowalski),D.Reidel Publishing Company,Dordrecht,Holland,1984(ISBN90-277-1846-6))。可以使用已知的数学技术获得抗体的定量的活性-性质关系，例如统计回归和统计分类(Norman等，Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience；3rd edition(April1998)ISBN:0471170828；Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR,(May11,1995),ISBN:0133418847；Krzanowski,Wojtek.Principles of Multivariate Analysis:A User’s Perspective(Oxford Statistical Science Series,No22(Paper))。牛津大学出版；(December2000),ISBN:0198507089；Witten,Ian H.&Frank,Eibe.Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques withJava Implementations.Morgan Kaufmann；(October11,1999),ISBN:1558605525；Denison David G.T.(Editor),Christopher C.Holmes,Bani K.Mallick,Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods for Nonlinear Classificationand Regression(Wiley Series in Probability and Statistics).John Wiley&Sons；(July2002),ISBN:0471490369；Ghose,Arup K.&Viswanadhan,Vellarkad N..Combinatorial Library Design and Evaluation Principles,Software,Tools,and Applications in Drug Discovery.ISBN:0-8247-0487-8)。抗体的性质可以从抗体序列的经验模型或者理论模型中获得(例如可能接触残基的分析或计算出的理化性质)，功能和三维结构以及这些性质可以单独考虑也可以组合考虑。
由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点通常由六个肽环形成：三个来自轻链可变区(VL)及三个来自重链可变区(VH)。已知原子结构的抗体的分析已经阐明了抗体结合位点的序列和三维结构之间的关系(Chothia C.等，(1992)J.Molecular Biology227,799-817；Al-Lazikani,等，(1997)J.Molecular Biology273(4),927-948)。这些关系暗示，除了VH结构域里的第三个区域(环)之外，结合位点环具有少数量的主链构象(正则结构)之一。已经示出了在特殊环中的正则结构由其大小和在两个环以及框架区域内在关键位点特定残基的存在决定(ChothiaC.等，(1992)J.Molecular Biology227,799-817；Al-Lazikani,等，(1997)J.Molecular Biology273(4),927-948)。
该序列-结构关系的研究可以用于预测那些已知序列抗体内的残基，但不能预测未知的三维结构，其对于维持CDR环的三维结构是必须的，从而维持结合特异性。该预测和前面优化试验的结果比对可支持该预测。在结构学中，可以使用任何免费提供或商业包装，例如WAM(Whitelegg,N.R.u.&Rees,A.R(2000).Prot.Eng.,12,815-824)来创建抗体分子的模型(Chothia,等，(1986)Science,223,755-758)。然后可以使用蛋白质可视化和分析软件包，例如Insight II(Accelrys,Inc.)或Deep View(Guex,N.and Peitsch,M.C.(1997)Electrophoresis18,2714-2723)评估在CDR每个位置中可能的取代。然后这个信息可以用于取代同样具有最小的或有益的活性影响。
该技术要求在CDR的氨基酸序列内进行取代，抗体VH或VL结构域以及结合元件是本领域常见的。变体序列可以用能够预测或不能预测的具有最小的或有益的活性影响进行取代，并测试其结合和/或中和IL-6和/或其他所需性质。
任何VH和VL结构域的可变区氨基酸序列变体可以根据本发明使用，其序列在本文中特定公开，正如所讨论的一样。
本发明的VL结构域变体和结合元件或包括它们的抗体分子，包括VL结构域，其中在Kabat残基108不存在精氨酸，其中Kabat残基108是不同的残基或者被删除。例如，抗体分子，如缺乏恒定区的抗体分子，例如scFv，可以包括具有VL结构域序列或其如本文所述的其变体的VL结构域，其中在Kabat残基108不是精氨酸或者被删除。
本发明的另一方面的包括VH结构域的抗体分子，所述VH结构域与在附加的序列表中示出的抗体18的VH结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列一致性，和/或包括VL结构域，其与在附加的序列表中示出的抗体18的VL结构域具有60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列一致性。比对可以用于计算两个氨基酸序列一致性的百分比，包括例如BLAST(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:405-410),FASTA(Pearson and Lipman(1988)PNAS USA85:2444-2448)，或Smith-Waterman比对(Smith and Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197)，例如采用默认参数。
特殊的变体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的增加、缺失、取代和/或插入)。
可以在一个或多个框架区域和/或一个或多个CDR中进行改变。正常的改变不会导致功能丧失，所以包括这样改变的氨基酸序列的结合元件保留了结合和/或中和IL-6的能力。与没有改变的结合元件相比，它保留了相同量的结合和/或中和IL-6的能力，例如，如在本文所述的试验中测定的结果。包括这样改变的氨基酸序列的结合元件具有改进的结合和/或中和IL-6的能力。
改变可以包括用非自然产生的或非标准的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非自然产生的或非标准的形式、或在序列中插入一个或多个氨基酸残基修饰成非自然产生的或非标准的氨基酸。本发明的序列中的改变的编号和位置的例子在本文其他地方进行描述。自然产生的氨基酸包括20个标准的L氨基酸，其标准的单字母代码为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括任何可以被并入到多肽骨架的残基或现有氨基酸修饰的结果。非标准氨基酸可以自然产生或非自然产生。几种自然产生的非标准氨基酸在本领域众所周知，例如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等(Voet&Voet,Biochemistry,2ndEdition,(Wiley)1995)。这些氨基酸残基在其N-α位衍生，将仅位于氨基酸序列的N端。通常地，本发明的氨基酸是L氨基酸，但其可以是D-氨基酸。因此改变可以包括L-氨基酸的修饰，或用D-氨基酸取代。氨基酸的甲基化，乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的，本发明的氨基酸可以经过这些修饰。
本发明的抗体域和结合元件的氨基酸序列可以包括上述非自然的或非标准氨基酸。在氨基酸序列合成期间，非标准氨基酸(例如D-氨基酸)可以通过氨基酸序列合成后“原始”标准氨基酸的修饰或取代并入氨基酸序列中。
非标准和/或非自然产生的氨基酸的使用增加了结构和功能多样性，从而增加本发明结合元件与所需IL-6结合的效力及中和特性。另外，与标准氨基酸相比，D-氨基酸及其类似物已经显示出具有不同的药代动力学特征，由于具有L-氨基酸的多肽施用于动物(例如人)后体内降解，意味着D-氨基酸在体内应用中具有优势。
携带有本发明CDR源序列的新型VH或VL结构域可以通过随机诱变产生，所述诱变为一个或多个选择的VH和/或VL基因诱变以在整个可变区内产生突变。这种技术已被Gram等人描述(Gram等,(1992)PNASUSA,89:3576-3580)，他使用了易错PCR。在这些实施例中，在整个可变区或CDR组中有一个或两个氨基酸取代。
另一个可使用的方法直接使VH和/或VL基因的CDR区诱变。这些技术被Barbas等人(Barbas等,(1994)PNAS USA,91:3809-3813)和Schier等人(Schier等,(1996)J.Mol.Biol.263:551-567)公开。
上述所有技术都是本领域已知的并且本领域技术人员能够使用这些技术，使用本领域的常规方法提供本发明的结合元件。
本发明的另一方面提供一种获得IL-6的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括通过在本文中列出的VH结构域的氨基酸序列中增加、删除、取代或插入一个或多个氨基酸从而提供VH结构域，其是VH结构域的氨基酸序列变体，非必要地与VH结构域组合，从而提供一个或多个VL结构域，并检测VH结构域或VH/VL组合或鉴定用于IL-6的结合元件或抗体抗原结合位点的组合物，非必要地，其具有一个或多个所需性质，例如中和IL-6活性的能力。上述VL结构域可以具有基本上在本文中列出的氨基酸序列。类似的方法可以采用，其中本发明公开的一个或多个VL结构域变体与一个或多个VH结构域变体结合。
如上所述，本文所列出的CDR氨基酸序列基本上可以作为人体抗体可变区的CDR或其部分。本文所列出的HCDR3序列基本上代表本发明的具体实施例，其中每一个可以作为人重链可变区的HCDR3或其部分。
应用于本发明的可变区可以从任何种系或重新排序的人类可变区中获得或派生，或者可以是基于已知的人类可变区的共有序列或实际序列的合成可变区。可变区可以从非人类抗体中派生。可以使用重组DNA技术将本发明的一个CDR序列(比如CDR3)引入缺乏CDR(比如CDR3)的可变区的指令表中。例如，Marks等，(Marks等(1992)Bio/Technology10:779-783)描述了制造抗体可变区的指令表的方法，其中将指向或毗邻可变区的5'端的共有序列引物与人类VH基因的第三个构架区的共有序列引物结合，以提供缺乏CDR3的VH可变区的指令表。Marks等进一步描述了怎样可以将该指令表与一个特殊抗体的CDR3结合。使用类似的技术，可以将本发明的CDR3派生的序列与缺乏CDR3的VH或VL结构域的指令表混合，而且该混合的完整的VH或VL结构域与同源VL或VH结构域结合以提供本发明的结合元件。然后可以将该指令表在合适的宿主系统中展示，比如WO92/01047的噬菌体展示系统，其全部内容通过引用并入本文，或任何后续large body of literature，包括Kay,Winter&McCafferty(Kay,B.K.,Winter,J.,and McCafferty,J.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,San Diego:Academic Press)以可以筛选合适的结合元件。指令表可以由来自104个体元件以上的任何东西组成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010元件或更多。其他合适的宿主系统包括,但不局限于酵母显示、细菌显示、T7显示、病毒显示、细胞显示、核糖体显示及其共价显示。
本发明提供了制备用于IL-6抗原的结合元件的方法，该方法包括：
(a)提供一个编码VH结构域的核酸的起始指令表，其包括将被取代的CDR3或缺乏编码区域的CDR3；
(b)将所述指令表与编码氨基酸序列的供体核酸基本上结合，如本文所述用于VH CDR3，以将所述核酸插入指令表内的CDR3区域内，从而提供编码VH结构域的核酸的产物指令表；
(c)表达所述产物指令表的核酸；
(d)筛选IL-6的结合元件；并且
(e)恢复所述结合元件或将其编码的核酸。
再一次，可以应用类似的方法，其中将本发明的VL CDR3与编码VL结构域的核酸的指令表结合，该指令表包括将被取代的CDR3或缺乏编码区域的CDR3。
同样地，可以将一个或多个，或所有三个CDR移植入VH或VL结构域的指令表中，然后筛选结合元件或IL-6的结合元件。
同样地，可以应用本文中公开的其他VH和VL结构域，CDR组和HCDR组和/或LCDR组。
免疫球蛋白可变区的实质部分可以包括至少三个CDR区域，以及它们的干扰构架区。该部分还可以包括至少约50％的第一和第四构架区的一个或两个，该50％是第一构架区的50％C端和第四构架区的50％N端。在该可变区实质部分的N端或C端的额外残基可能是那些未与自然产生的可变区正常结合的部分。例如，通过重组DNA技术形成的本发明的结合元件的构建可能导致引入由接头编码的N端或C端残基，引入该接头以方便进行克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括引入接头，以使本发明的可变区加入另外的蛋白质序列中，其包括抗体恒定区、其他可变区(例如在双抗体的制造中)或可检测/功能性标签，其更详细内容将在本文他处讨论。
尽管在本文的一些方面，结合元件包括一对VH和VL结构域，基于VH或VL结构域序列的单个结合域形成了本发明的其他方面。已知，单个免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域，能够以特殊的方式结合靶抗原。例如，参见上述dAb的讨论。
在单个结合域之一的事例中，可以将这些结构域用于筛选能够形成能够与IL-6结合的双结构域结合元件的互补域。可以使用WO92/01047(其全部内容通过引用并入本文)中公开的所谓的双层组合方式，通过噬菌体展示筛选的方法实现，其中将包含H或L链克隆的个体菌落用于感染编码其他链(L或H)的完整的克隆基因库，并根据噬菌体展示技术筛选得到的双链结合元件，比如在该文献中描述的那些元件。该技术也在Marks等，ibid.(Marks等(1992)Bio/Technology10:779-783)中公开。
本发明的结合元件还包括抗体恒定区或部分恒定区，例如人抗体恒定区或部分恒定区。例如，VH结构域可以在其C端与包括人Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定区连接。同样地，基于VH结构域的结合元件可以在其C端与分离自任何抗体同型的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如CH1域)连接，所述同型例如IgG、IgA、IgE和IgM，以及任一同型亚类中的，特别是IgG1和IgG4。IgG1是优选的，鉴于其效应物功能及易于制造。任何合成或其他包括这些性质的恒定区变体以及稳定的可变区可同样用于本发明。
本发明的结合元件可以用可检测的或功能性标签进行标记。因此，结合元件或抗体分子可以免疫交联物的形式存在，以获得可检测的和/或可量化的信号。免疫交联物可以包括本发明的抗体分子，其与可检测的或功能性标签偶联。标签可以是任何产生或能够被诱导产生信号的分子，包括但不局限于荧光增白剂、放射性同位素标记、酶、化学荧光剂或光敏剂。因此，通过检测荧光、发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测定结合。
合适的标签包括，例如，但不局限于，
-酶类，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物如辣根过氧化物酶；
-染料；
-荧光标记或荧光剂、例如荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明化合物及其衍生物、GFP(GFP指的是“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、变藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；荧光团例如稀土穴合物和螯合物，例如铕等(Perkin Elmer and Cis Biointernational)；
-化学发光标记或化学冷光物，例如异氨基苯二酰肼、氨基苯二酰一肼和二恶丁环；
-生物荧光标记，例如萤光素酶和荧光素；
-敏化剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射性同位素标记包括但不局限于溴77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氢3(氚)、铟111、铟113M、碘123M、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、铼99M、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99M、碲121M、碲122M、碲125M、铥165、铥167、铥168、钇199和其他本发明中提到的放射性同位素标记；
-颗粒，例如乳胶颗粒或碳颗粒；金溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可进一步被染料。催化剂或其他可检测的基团标记；
-分子例如生物素，地高辛或5溴脱氧尿苷；
-毒素基团，例如，选自以下基团的毒素基团：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒素片段或其突变体)、白喉毒素或其细胞毒素片段或其突变体、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、篦麻毒素或素或其细胞毒素片段、例如篦麻毒素A、相思豆毒素其细胞毒素片段、皂草素或其细胞毒素片段、商陆抗病毒毒素或其细胞毒素片段和异株腹泻毒蛋白1或其细胞毒素片段。
适合的酶和辅酶由Litman等，US4275149和Boguslaski等，US4318980公开，其通过引用完全并入本文。Litman等，US4275149还公开了合适的荧光剂和化学发光剂，其通过引用完全并入本文。标签还包括诸如生物素的化学基团，其可通过结合到一个特定同源的可检测基团上而被检测，例如标记的亲和素或抗生蛋白链菌素。可检测的标签可以通过传统的化学方法结合在抗体上。
可以通过已知的方法制备免疫交联物或其功能片段。他们可以被直接偶联到酶或者荧光标签上或者通过某些连接基团作为介质间接偶联，如聚醛，戊二醛，乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DPTA)，或存在偶联剂时，如上面所述的治疗共轭。含有荧光类型标签的共轭可以由异硫氰酸酯反应来制备。
众所周知，现有的技术方法可以直接使治疗性的放射性同位素与抗体耦合，或通过螯合剂如EDTA，上述的DTPA可用于诊断的放射性元素。它同样可以执行的氯胺T法(Hunter W.M.and Greenwood F.C.(1962)Nature194:495)或其他由Crockford等技术(US4424200，纳入本technetium99m标签在其职权与sodium125整体)或通过DTPA的附加Hnatowich描述(US4479930，这些在其申请资料中均有所体现)。
许多方法可以对标签进行信号检测，例如，通过目视检查、电磁辐射、热、化学试剂。标签也可以结合到另一个结合元件上，该元件可以结合本发明的抗体。
标签可以直接产生信号，因此，并不需要额外的组件产生信号。许多有机分子，例如荧光剂，能够吸收紫外线和可见光，光吸收的能量转移到这些分子并提升其所激发的能级。这种吸收的能量以二次波的形式发射出去。该第二次波的发射，也可将能量转移到一个被标记的分子上，然后受体分子将光散射出去。例如荧光共振能量转移(FRET)。其他标签，直接产生包括放射性同位素和染料在内的信号。
另外，标签可能需要其他组分产生信号，并且这种信号产生系统可能包括需要产生可测量信号的所有组分，其中可能包括基质、辅酶、增强剂、额外的酶、与酶产物相互作用的物质、催化剂、活化剂、辅助因子、酶抑制剂、清除剂、金属离子和与信号产生的物质结合的所需的特异性结合物质。Ullman等US5185243，可以找到一个合适的信号产生系统，并进行了详细论述，其通过引用完全并入本文中。
本发明提供了包括本文所提供的结合元件与IL-6结合的方法。如上所述，这种结合可在体内发生，例如，接下来施用结合元件、或编码结合元件的核酸，或其也可在体外发生，例如ELISA法，免疫印迹，免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层、基于生化或细胞的分析，如检测TF-1细胞增殖检测试验。
本发明还提供了直接测量抗原水平的检测方法，通过采用根据本发明的结合元件，例如在生物传感器系统中。例如，本发明包括检测和/或测量与IL-6结合，包括(i)将所述结合元件暴露于IL-6(ii)检测所述的结合元件与IL-6的结合，其中可以用任何方法或本文中描述的可检测的标签进行检测。因此，本文中描述的任何其他结合检测的方法都由执行该方法的人直接解释，例如，通过肉眼观察可检测的标签。另外，文中所述的这种方法，或任何其他的检测方法，可能产生的放射自显影形式的报告、照片、电脑打印输出，流式细胞仪检测报告、图形、图表、包含的结果试管或容器或孔的报告，或任何其他视觉或物理方法的结果表示。
可测定结合元件与IL-6的结合量。定量分析可与检测样品中抗原的量相关，其可能是目的诊断。筛选对IL–6结合和/或其定量是有用的，位点的寻找或者定量是。例如，筛选疾病或病症的患者是指涉及IL-6异常表达和/或活性的本文中和/或任何其他疾病或病症。
本发明的一个诊断方法可包括：(i)从动物体内获取一个组织或液体样品，(ii)将所述组织或液体样品暴露于一个或多个本发明的结合元件；及(iii)与对照组相比，检测与IL-6的结合，对IL-6结合力的增加可以指示出IL-6表达或者活性的异常。所检测的组织或液体样品包括血液、血清、尿液、活检材料、肿瘤或怀疑含有异常的IL-6水平的任何组织。受体异常IL-6水平或活动检测呈阳性，可能也有利于从披露后此处的治疗方法。
根据本发明公开的方法，本领域技术人员根据其优选和常识，能够选择合适的模式测定结合元件与抗原结合。
任何适当的方法都可以确定样品中的结合元件的反应性。放射免疫法(RIA)提供了这样一种可能性。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，并允许与结合元件相结合。结合抗原实际上从未结合抗原分离，并测定与结合元件结合的放射性抗原量。测试样品中的抗原越多，与结合元件相结合的放射性抗原就越少。竞争性结合实验也可能用于非放射性的抗原，使用与报告分子相连的抗原及其类似物。报告分子可以是荧光染料、磷光体或激光染料，其具有独立光谱的吸收或发射特性。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和得克萨斯红、和镧系元素螯合物或穴状化合物。合适的显色染料，包括二氨基联苯胺。
其他的报告分子包括大分子胶体颗粒或者颗粒材料，例如彩色、有磁性或者顺磁的乳胶球，和生物或化学活性剂，其可以直接或间接使检测信号被观察到，电子检测或以其他方式记录。这些分子可以是酶，其催化反应，所述反应建立或者改变颜色，或者例如引起电特性的改变。它们可以是分子应激的，以使能态之间的电子传递导致特征光谱吸收或发射。它们可以包括用于于生物传感器连接的化学实体。可以采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
由单独的结合元件-报告分子偶联物发出的信号可以用于推导与样品结合(正常的和对照的)的相关结合元件的定量的绝对值或相对值。
作为本发明的一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括根据本发明的其他方面或其他具体化实施例的结合元件。在该试剂盒中，结合元件可以被标记以能够检测其在样品中的反应活性(例如，如下所述)。另外的结合原件可以或可以不附着在一个固体支撑物上。试剂盒的组分通常是无菌的并且密封在小瓶或其他容器中。试剂盒可以用于诊断分析或其他结合元件有用的方法。一个试剂盒可能包含组分在方法中(例如根据本发明的方法)的使用说明。协助或能够执行这种方法的辅助材料可以包括在本发明的试剂盒中。辅助材料包括第二个不同的结合元件，其与第一结合元件结合并且偶联可检测的标记(例如荧光标记、放射性同位素或酶)。基于抗体的试剂盒也可包括用于进行免疫沉淀反应的磁珠。试剂盒的每个组分通常都位于其合适的容器中。因此，这些试剂盒通常包括适用于每个结合元件的不同的容器。此外，试剂盒可以包括用于进行试验和解释于分析通过该试验获得的数据的方法的说明书。
本发明同样提供了上述结合元件在竞争试验中用于测量抗原水平的用途，也就是说在竞争试验中，采用本发明提供的结合元件测量样品中的抗原水平。这可以不需要将结合与为结合的抗原进行物理分离。将报告分子连接到结合元件上，以使在结合上发生物理或光学改变成为可能。报告分子可以直接或间接的产生可检测的信号，其可以是定量的。报告分子的连接可以是直接地或间接地，例如通过肽键或共轭或非共轭。通过肽键的链接可能会作为融合基因编码的抗体和报告分子的重组表达的结果。
在不同的方面和不同的实施例中，本发明延伸包括与任何本文限定的结合元件(例如抗体18，例如以IgG1形式存在)竞争结合IL-6的结合元件。结合元件间的竞争可以容易地在体外检测，例如给一个结合元件贴上特异性报告分子，其可以在存在其他没有标签的结合元件存在时被检测出来，以能够鉴定出结合相同表位或重叠表位的结合元件。可以使用例如ELISA测定竞争，其中IL-6被固定在一个平板上，在该板上添加第一具有标签的或标记的结合元件以及一个或多个不具有标签的或未标记的结合元件。通过具有标签的结合元件发出的信号减弱，可以观察到具有标签的结合元件与不具有标签的结合元件竞争。
例如，本发明包括一种鉴定IL-6结合化合物的方法，其包括(i)在一支撑物上固定IL-6，(ii)是所述固定的IL-6同时或逐步接触至少一个具有标签的活标记的根据本发明的结合元件，以及一个或多个不具有标签或为标记的测试结合化合物，以及(iii)通过观察具有标签的结合元件的标签数量的下降来确定新的IL-6结合化合物。这种方法可以以使用多孔或多阵列形式的一种高通量的方式进行。这种试验也可在溶液中进行。参见，例如，美国专利U.S.5,814,468，它的全部内容通过引用并入本文。如上所述，结合的检测可以收到执行该方法的人影响，例如，通过目测观察可检测的标记，或者标记量的降低。可选地，本发明的结合方法可以以产生放射自显影形式、照片形式、电脑打印形式、流式细胞仪检测报告形式、图形形式、图表形式、包含结果的试管或容器或孔的形式，或任何其他视觉或实际表示所述方法的结果的形式。
竞争分析同样可以用于表位作图。在一个例子中，表位作图可以用于确定被IL-6结合元件结合的表位，所述结合元件非必要地可以具有优化的中和和/或调节特性。这样的表位可以是线性的或构象的。构象表位可包括至少两个不同的IL-6片段，其中，当IL-6以三级结构或四级结构折叠形成被IL-6的抑制子(例如IL-6结合元件)识别构象表位是，所述片段的位置彼此接近。可以使用抗原的肽片段的竞争性实验，尤其是包括或基本上有目的表位组成的肽。肽具有表位序列加上一个或多个位于任何可以使用的端的氨基酸。根据本发明的结合元件其与抗原的结合被具有或包括给定序列的肽抑制。
本发明还提供分离的编码本发明结合元件的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA，在一实施例中，本发明提供用于编码如本发明上述定义的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG1的核酸分子。
本发明还提供质粒、载体、转录框或表达框的构建，其包括至少一种如上所述的多核苷酸。
本发明还提供重组的宿主细胞，其包括一个或多个上述构建体。编码任何如本发明上述定义的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG1的核酸分子，其构成了本发明的一方面，如编码产品的生产方法一样，所述方法包括编码核酸的表达。表达通常可以通过在适当的条件下培养含有该核酸重组宿主细胞完成。可以使用任何合适的技术分离和/或纯化VH或VL结构域或结合元件的表达产物，然后酌情使用。
根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA，并且可全部或部分合成。提到的如本文所列出的核苷酸序列包括具有特异序列的DNA分子，并包括具有特异序列的RNA分子，其中，除非上下文另有说明，U被取代为T。
本发明的还一方面提供了抗体VH可变区的生产方法，该方法包括引起编码的核酸表达。这种方法可以包括在生产所述抗体VH可变区的条件下，培养宿主细胞。
本发明的另一些方面提供了VL可变区和包括VH和/或VL结构域的结合元件的类似的生产方法。
生产方法可以包括产物分离和/或纯化的步骤。生产方法还可以包括将产物配制成组合物，其包括至少一种其他组分，如药学上可接受的赋形剂。
在各种不同宿主细胞中多肽的克隆和表达系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母、杆状病毒系统、转基因植物和动物。本领域中原核细胞中抗体和抗体片段的表达是明确的。对于综述，参见例如Plückthun(Plückthun,A.(1991)Bio/Technology9:545-551)。常见的细菌宿主是大肠杆菌。
本领域技术人员可将培养的真核细胞中的表达作为生产结合元件的一个选择(Chadd HE和Chamow SM(2001)Current Opinion inBiotechnology12:188-194；Andersen DC和Krummen L(2002)CurrentOpinion in Biotechnology13:117；Larrick JW和Thomas DW(2001)CurrentOpinion in Biotechnology12:411-418)。本领域中可用于异源多肽表达的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0鼠骨髓瘤细胞、人类胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。
可以选择或构建合适的载体，其包含适当的调控序列，所述调控序列包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列，增强子序列，标记基因和其他适当的序列。载体可能是质粒，如噬菌粒或病毒粒，如果适当，也可以是噬菌体(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:aLaboratory Manual:3rd edition,2001,Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。Ausubel等(Ausubel等，eds.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,4th edition1999)中详细地描述了许多已知的核酸操作技术和规定，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA导入细胞中和基因表达及蛋白质分析。
本发明的另一方面提供了含有如本发明所公开的核酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以在体外培养。所述宿主细胞可以在体内。体内存在的宿主细胞可能允许作为“胞内抗体”的本发明的结合元件细胞内表达。胞内抗体可用于基因治疗。
另一方面提供了包括将本发明的核酸导入宿主细胞的方法。导入可采用任何可用技术。对于真核细胞，合适的技术可能包括磷酸钙转染、二乙氨乙基葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录酶病毒或其他病毒的转导，如牛痘病毒，对于昆虫细胞，使用杆状病毒。将核酸导入宿主细胞，尤其是真核细胞，可能使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可能被游离地保留或被合并到宿主细胞或人工染色体中。合并可以是随机地或有目的性地在一个或多个基因位点整合一个或多个复制子。对于细菌细胞，合适的技术可能包括使用噬菌体的氯化钙转化、电穿孔和转染。
导入后可引起或允许核酸表达，例如，在基因表达的条件下培养宿主细胞。可通过本领域技术人员已知的方法完成表达产物的纯化。
本发明的核酸可被整合到宿主细胞的基因组(如染色体)中。序列内含物可以促进整合，其根据标准技术促进基因组重组。
本发明还提供了包括在表达系统中使用上述构建体的方法以表达如上所述的结合元件或多肽。
这是本文中其他地方所讨论的各种疾病包含IL-6的证据。因此本发明的结合元件可用于与IL-6相关的疾病的诊断或治疗的方法。所述疾病可能是炎症性和/或自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、恶病质、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、青少年特发性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、克罗恩氏病或动脉粥样硬化。本发明的结合元件还可能用于治疗肿瘤和/或癌症。此外，本发明的结合元件还可能用于治疗和/或预防由本文中所列举的疾病和条件引起或相关的疼痛。本发明的结合元件还可能用于诊断或治疗病人、动物、器官、组织或细胞中至少一个IL-6相关疾病的方法，包括但不局限于：包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)的呼吸道阻塞性疾病；哮喘，如支气管、过敏性、内因性、外因性和尘埃性哮喘，尤其是慢性或顽固性哮喘(如晚期哮喘和呼吸道高反应；支气管炎；急性、过敏性、萎缩性鼻炎和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化脓性鼻炎、干燥性鼻炎和药物性鼻炎；膜性鼻炎，包括格鲁布性、纤维素性和假膜性鼻炎及淋巴结结核(scrofoulous)鼻炎；季节性鼻炎，包括神经性鼻炎(枯草热)和血管舒缩性鼻炎、窦炎、特发性肺纤维化(IPF)；结节病，霉尘肺及相关疾病、成人呼吸窘迫综合症、过敏性肺炎、纤维性肺和特发性间质性肺炎；类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、全身性发作青少年关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎和莱特尔氏症)、贝切特氏病、斯耶格伦氏综合症和系统性硬化症、痛风、骨质疏松症和骨关节炎；牛皮癣、异位性皮炎、接触性皮炎和其他湿疹皮肤病、过敏性接触性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔癣、硬皮病、天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹，皮肤血管炎、血管炎、红斑、皮肤嗜酸性细胞增多、葡萄膜炎、局限性脱发、过敏性结膜炎春季(vernalvemal)结膜炎；(胃肠道)胃溃疡、腹腔疾病、直肠炎、嗜酸肠胃炎、肥大细胞增多症、炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合症、与食品有关的过敏，其远离肠道产生影响，例如，偏头痛、鼻炎和湿疹；恶病质、多发性硬化、动脉粥样硬化、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、系膜增生性肾小球肾炎、肾病综合症、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液透析、尿毒症、局部或盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、卡斯尔曼氏病、淋巴瘤性甲状腺肿、重症肌无力、I型糖尿病、B型胰岛素抗药性糖尿病、镰刀状细胞贫血、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、肾病综合症、嗜酸性细胞增多筋膜炎、超IgE综合症、系统性血管炎/眶坏死性肉芽肿病、睾丸炎/输精管结扎逆转过程、瘤型麻风病、酒精性肝炎、塞扎里综合症和特发性血小板减少性紫癜；术后的粘连、肾病、全身炎症反应综合症、败血症综合症、革兰氏阳性败血症、革兰氏阴性败血症、培养阴性败血症、真菌败血症、中性粒细胞减少发热、急性胰腺炎、尿脓毒症、格雷氏病、雷诺氏病、抗体介导的细胞毒性、III型过敏反应、POEMS综合症(多发性神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合症)、混合结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性肝胆肝硬化、白癜风、心肌梗死后(心切开术)综合症，IV型过敏反应、胞内有机体引起的肉芽肿、威尔森氏症，血色素沉着症、α-I-抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病视网膜病、淋巴瘤性甲状腺肿、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、甲状腺炎、脑脊髓炎、新生儿慢性肺部疾病、家族噬红细胞淋巴组织细胞增生症、脱发、放射疗法(例如，包括但不限于乏力、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸中毒、睡眠窒息症、肥胖症、心力衰竭和脑膜炎球菌血症；急性和慢性病，例如，肾、心脏、肝、肺、胰腺、骨髓、骨骼、小肠、皮肤、软骨和角膜移植；及慢性移植物抗宿主病；白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性白血病、T细胞、B细胞、或FAB ALL、铬粒细胞白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病，骨髓增生异常综合症(MDS)、任何淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、任何恶性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、肾细胞癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞病、肿瘤伴随综合症/血钙过多恶性肿瘤、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、转移性疾病、骨吸收相关癌症、骨痛相关癌症；癌症转移的抑制；癌症恶病质的改善；囊状纤维变性、中风、心、脑、四肢等末梢器官再灌注损伤；烧伤、创伤/出血、电离辐射、慢性皮肤溃疡；生殖器官疾病(如排卵、月经和植入紊乱、早产、子痫前期(pre-eclamp sia)、子宫内膜异位症)；急性或慢性细菌性感染、急性和慢性寄生虫或感染过程，包括细菌、病毒和真菌感染，艾滋病毒感染/艾滋病毒病变，脑膜炎，肝炎(甲、乙或丙或其他病毒性肝炎等)，化脓性关节炎，腹膜炎，肺炎，会厌炎，大肠杆菌0157：H7型，溶血性尿毒症综合症/血栓性血小板减少紫癜，疟疾，登革热出血热，利什曼病，麻风病，中毒性休克综合症，链球菌肌炎，气性坏疽，结核分枝杆菌，胞内结核分枝杆菌，卡氏肺囊虫肺炎，盆腔炎，睾丸炎/附睾炎，军团菌，莱姆病，甲型流感，EB病毒，极度相关的血吞噬细胞综合症，病毒性脑炎/无菌性脑膜炎，抑郁症等。因此，本发明提供了治疗IL-6相关疾病的方法，其包括单独地或与本领域已知或本文中描述的其他合适药物以组合治疗方式对需要的病人施用有效量的一种或多种本发明的结合原件。
在一实施例中，IL-6相关疾病是抑郁症，本文中也指重度抑郁症。重度抑郁症(又称为且本文中指临床抑郁症、严重抑郁症、单极抑郁症或单极障碍)是一种精神疾病，其特征在于，完全的情绪低落，伴随着在通常的娱乐活动中的自卑并失去兴趣或乐趣。术语“重度抑郁症”由美国精神病学协会选择以在1980年版的精神疾病诊断与统计手册(DSM-III)分类中将这一症候群指定为情绪障碍，且至今广泛应用。泛称抑郁症通常用来表示这种疾病，但因为它还用于其他类型的心里抑郁症，更精确的术语优选为在临床和研究中使用的该疾病。重度抑郁症是一种致残性疾病，其对个人的家庭、工作或学校生活、睡眠和饮食习惯及一般健康状况产生不利影响。
抑郁症与包含全身性炎症的疾病高度共存。在许多抑郁症患者中观察到全身炎症反应，其反映在增加的炎症血浆生物标志物。此外，在抑郁症患者的血液和CSF(脑脊液)中检测到活化细胞因子信号转导通路。而且，细胞因子(IFN-a,IL-2)可诱导医学上无精神病史的患者产生重度忧郁症的症状。因此，本发明提供一种治疗抑郁症的方法，其包括单独地或与本领域已知的其他合适药物以组合治疗方式对需要的病人施用有效量的一种或多种本发明的结合原件，其他合适药物如抗抑郁药，如选择性血清素再摄取抑制剂(SSRIs)，如舍曲林、依他普仑、氟西汀、帕罗西汀和西酞普兰或本文中描述的。
本发明的结合元件还具有止痛特性。因此，结合元件适合用作止痛剂用于治疗和/或预防与本文所列举疾病相关的疼痛及由伤口、医疗过程、手术、外伤、创伤引起的或相关的慢性和急性疼痛。例如，结合元件可作为用作术后止痛的止痛药使用。结合元件还用于治疗或预防由强直性脊柱炎、炎性腰背痛、神经痛、疼痛神经瘤、纤维肌痛、头痛、胰腺炎、脊髓神经压迫综合症和非恶性骨骼疼痛、炎症骨关节炎疼痛、风湿关节疼痛、癌症疼痛引起的或相关的疼痛，其中头疼如慢性头痛和偏头痛，癌症疼痛如骨癌疼痛。
本发明的结合元件还可能用于治疗与几种疾病相关的肺动脉高血压症，例如，但不局限于COPD、硬皮病、系统性红斑狼疮、POEMs和特发性肺动脉高血压。据报道，在患有与这些疾病相关的肺动脉高血压症的病人中IL-6水平升高(Savale,L.等Respir.Res.(2009)10,6及其参考文献；Steiner,M.K.等Circ.Res.(2009)104(2)236-244及其参考文献)。暴露在缺氧条件下的IL-6-缺陷型小鼠与野生型小鼠相比，右心室收缩压减小并且右心室肥大减小(Savale,L.等Respir.Res.(2009)10,6及其参考文献)。此外，在缺氧条件下，IL-6-过表达的转基因小鼠与非转基因对照小鼠相比，右心室肥大增强并且右心室收缩压增加(Steiner,M.K.等Circ.Res.(2009)104(2)236-244及其参考文献)，且体外给药的IL-6加剧了暴露在慢性缺氧条件下的小鼠的肺动脉高血压症的发展(Golembeski,S.M.等Chest(2005)128(6Suppl)572S-573S)。
此外，已观察到患有稳定的COPD(慢性阻塞性肺病)的病人的IL-6的炎症因子超过健康对照组(Yanbaeva,D.G.等BMC Med Genet(2009)10,23；Savale,L.等Am.J.Respir.Crit Care Med.(2009)179(7),566-571；Eickhoff,P.等Am.J.Respir.Crit Care Med.(2008)178(12)1211-1218)。在COPD患者中增强的IL-6水平与肺功能受损有关(R.E.等Chest(2008)133(1)19-25；Thorleifesson,S.J.等Respir.Med.(2009)103(10)1548-1553)。一些研究也报道过，COPD恶化时唾液和/或血清中IL-6与恶化减弱时测量的IL-6或稳定COPD患者中测量的IL-6相比，其水平增加(Valipour,A.等Clinical Science(2008)115(7),225-232；Groenewegen,K.H.等Respir.Med.(2007)101(11)2409-2415；Perera,W.R.等Eur.Respir.J.(2007)29(3),527-534)。增强的IL-6水平与更频繁的恶化有关(Bhowmik,A.等Thorax(2000)55(2)114-120)。具有抗IL-6抗体的小鼠或缺乏IL-6的小鼠的治疗在某些动物模型中示出了减弱的肺部炎症，例如臭氧诱导的肺部炎症和博莱霉素诱导的肺部炎症及纤维变性(Saito,F.等Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(2008)38(5)566-571；Lang,J.E.等Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.(2008)294(5)L1013-L1020；Johnston,R.A.等Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.(2005)288(2)L390-L397)。较高的IL-6水平与COPD某些并发症相关，例如肺动脉高血压症(Chaouat,A.等Chest(2009)136(3)678-687；Eddahibi,S.等Proceedings of the AmericanThoracic Society(2006)3(6),475-476)。
某些其他疾病中含有IL-6的证据可被充分理解。本文和PCT公开号为WO2008/065378的申请中提出的数据进一步表明，本发明的结合元件可用于治疗这些疾病，包括预防治疗和减少疾病的严重程度。因此，本发明提供了治疗或减少本文中提到的任何疾病的至少一种症状的严重程度的方法，其包括单独地或与本领域已知的或本文中描述的其他合适药物以组合治疗方式对需要的病人施用有效量的一种或多种本发明的结合原件，以减弱任何上述疾病的至少一种症状的严重程度。
因此，本发明的结合元件用作治疗包含IL-6和/或IL-6Ra表达和/或活性的疾病的治疗药物，尤其是IL-6和/或IL-6Ra的异常表达/活性。治疗方法可能包括对有需要的病人施用有效量的本发明的结合元件，其中IL-6和/或IL-6Ra的异常表达和/或活性被减弱。治疗方法可包括(i)确定表现出异常的IL–6：IL-6Ra水平或活性的病人，例如，使用上述的诊断方法，及(ii)对病人施用有效量的本发明的结合元件，其中IL-6和/或IL-6Ra的异常表达和/或活性被减弱。根据本发明的有效量是能减少IL-6和/或IL-6Ra的异常表达和/或活性的数量，以降低或减轻正在治疗的特定疾病或病症的至少一种症状的严重程度，但不一定治愈该疾病或病症。
本发明还提供了反作用于至少一种IL-6效应的方法，其包括接触或施用有效量的本发明的一种或多种结合元件以反作用于至少一种IL-6效应。可通过本发明的方法反作用于IL-6效应，其包括IL-6与gp130相结合及这种结合引起的下游效应。
因此，本发明其他方面提供了治疗方法，该方法包括提供的结合元件的施用、包含这种结合元件的药物组合物的施用以及在制造施用的药剂中这种结合元件的用途，例如在生产药剂或药物组合物的方法中，其包括配制结合元件与药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是一种化合物或化合物组合物，其能够进入药物组合物且不引起二次反应，而且其允许如促进活性化合物的施用，增加生命周期和/或体内疗效，增加溶液中溶解度或改进其保存。这些药学上可接受的载体是已知的，本领域技术人员将用这些载体作为性质函数和选定的活性化合物的给药模式。
本发明的结合元件还通常以药物组合物的形式给药，除了结合元件其可能包括至少一种组分。因此，根据本发明的药物组合物及根据本发明使用的药物组合物，除了活性组分，可包括赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员已知的其他材料。这些材料应该是无毒的且不干扰活性组分的疗效。载体或其他材料的确切性质取决于给药途径，其可能是如下讨论的口服、吸入、气管内、局部、内水疱或注射。
本发明涉及包括本发明抗体的无菌、稳定的药物制剂。
本发明提供稳定本发明抗体的方法。
本发明还涉及生产包括本发明抗体的无菌、稳定的制剂的过程。
所有本文中描述的“本发明的制剂”、“本发明的液体制剂”、“本发明的高浓度稳定液体制剂”、“本发明的抗体液体制剂”、“本发明的重组液体制剂”或“本发明的抗体制剂”统称为本发明的抗体的制剂。
本文中使用的短语“药学上可接受的”指由联邦或州政府管理机构批准或在美国药典、欧洲药典或其他普遍公认的药典中列举，用于动物更特别是用于人类的。
在包括本发明抗体(包括抗体及其片段)的液体制剂的上下文中使用的术语“稳定性”和“稳定的”是指制剂中的抗体(包括其抗体片段)在给定的制造、制备、运输和储存条件下对聚合、降解或断裂的抗性。本发明“稳定的”制剂在给定的制造、制备、运输和储存条件下保持生物活性。所述抗体(包括抗体及其片段)的稳定性可通过聚合、降解或断裂的程度估计，通过高效体积排阻色谱(HPSEC)、反向色谱法、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外分光镜(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素伸展技术、体内色氨酸荧光、差示扫描量热法和/或ANS结合技术测定，与参考制剂相比较。例如，参考制剂可能是冷冻在-70℃的参考标准样品，其由pH为6.0-6.5的10mg/ml组氨酸抗体(包括抗体及其片段)和随意的一种或几种赋形剂组成，参考制剂通过HPSEC有规律地显示单峰(例如，≥97％的面积)。包括抗体(包括抗体及其片段)的制剂的总稳定性可通过各种免疫学检测估计，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)和使用分离抗原分子的放射免疫测定法。
本文中使用的短语“检测不到的低水平聚合”是指含有不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％及不超过约0.5％蛋白质重量聚合的样品，可通过高效体积排阻色谱(HPSEC)和静态光散射(SLS)技术测定。
本文中使用的短语“检测不到的低水平断裂”是指含有等于或大于约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％总蛋白的样品，例如通过HPSEC或反向色谱法测定的单峰，或通过缩减毛细管凝胶电泳(rCGE)测定的双峰(如重链和轻链)(或峰与亚基数相同)，表示非降解抗体或其非降解片段，且不含有其他超过约5％、超过约4％、超过约3％、超过约2％、超过约1％或超过约0.5％总蛋白的单峰。本文中使用的术语“缩减毛细管凝胶电泳”是指在缩减条件下减少抗体中二硫键的毛细管凝胶电泳。
本发明涉及稳定、高浓度的本发明抗体的制剂。在一实施例中，本发明的制剂是液体制剂。在另一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂.在另一实施例中，本发明的制剂是重组液体制剂。
在一实施例中，本发明的制剂是稳定的液体制剂。在一实施例中，本发明的液体制剂是水性制剂。在一具体实施例中，本发明的液体制剂是水性制剂，其中水介质是蒸馏水。
在一实施例中，本发明的制剂是无菌的。
在一实施例中，本发明的制剂是均质的。
在一实施例中，本发明的制剂是等渗的。
本发明包括稳定的液体制剂，其包括单个的目的抗体(包括抗体及其片段)，例如，与IL-6特异性结合的抗体。本发明还包括稳定的液体制剂，其包括两个或多个的目的抗体(包括抗体及其片段)，例如，与IL-6多肽特异性结合的抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少约1mg/ml、至少约5mg/ml、至少约10mg/ml、至少约20mg/ml、至少约30mg/ml、至少约40mg/ml、至少约50mg/ml、至少约60mg/ml、至少约70mg/ml、至少约80mg/ml、至少约90mg/ml、至少约100mg/ml、至少约110mg/ml、至少约120mg/ml、至少约130mg/ml、至少约140mg/ml、至少约150mg/ml、至少约160mg/ml、至少约170mg/ml、至少约180mg/ml、至少约190mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml、或至少约300mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少约100mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少约125mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少约130mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少约150mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少约90mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的制剂包括约1mg/ml至约25mg/ml、约1mg/ml至约200mg/ml、约25mg/ml至约200mg/ml、约50mg/ml至约200mg/ml、约75mg/ml至约200mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约125mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约200mg/ml、约25mg/ml至约150mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约75mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约150mg/ml、约125mg/ml至约150mg/ml、约25mg/ml至约125mg/ml、约50mg/ml至约125mg/ml、约75mg/ml至约125mg/ml、约100mg/ml至约125mg/ml、约25mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约100mg/ml、约75mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约75mg/ml、约50mg/ml至约75mg/ml或约25mg/ml至约50mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约90mg/ml至约110mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约100mg/ml至约210mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本文中描述的制剂包括约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml或约300mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约100mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约125mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约130mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约150mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约200mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少1mg/ml、至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml、至少100mg/ml、至少110mg/ml、至少120mg/ml、至少130mg/ml、至少140mg/ml、至少150mg/ml、至少160mg/ml、至少170mg/ml、至少180mg/ml、至少190mg/ml、至少200mg/ml、至少250mg/ml或至少300mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少100mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少125mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少150mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少175mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少200mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的制剂包括1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至200mg/ml、25mg/ml至200mg/ml、50mg/ml至200mg/ml、75mg/ml至200mg/ml、100mg/ml至200mg/ml、125mg/ml至200mg/ml、150mg/ml至200mg/ml、25mg/ml至150mg/ml、50mg/ml至150mg/ml、75mg/m至150mg/ml、100mg/ml至150mg/ml、125mg/ml至150mg/ml、25mg/ml至125mg/ml、50mg/ml至125mg/ml、75mg/ml至125mg/ml、100mg/ml至125mg/ml、25mg/ml至100mg/ml、50mg/ml至100mg/ml、75mg/ml至100mg/ml、25mg/ml至75mg/ml、50mg/ml至75mg/ml或25mg/ml至50mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括90mg/ml至110mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括100mg/ml至210mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本文中描述的制剂包括20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括100mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括125mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括150mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括175mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括200mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。
非必要的，本发明的制剂可进一步包括常见赋形剂和/或添加剂如缓冲剂、糖化物、盐类和表面活性剂。此外或可选择地，本发明的制剂可进一步包括常见赋形剂和/或添加剂，例如，但不局限于，增溶剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、盐类、亲脂性溶剂、氨基酸、螯合剂、防腐剂等。
在特定实施例中，缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸、磷酸盐、甘氨酸和醋酸。在另一实施例中，糖类赋形剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖和棉子糖。在其他实施例中，表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯80和聚醚F68。在其他实施例中，盐类选自NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2。
非必要的，本发明的制剂可进一步包括其他常见的辅助组分，比如，但不局限于，合适的赋形剂、多羟基化合物、增溶剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、亲脂性溶剂、螯合剂、防腐剂等。
本发明的制剂包括缓冲剂或pH调节剂以提供更好的pH控制。在一实施例中，本发明的制剂的pH值为约3.0至约9.0、约4.0至约8.0，约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、约5.0至约6.5、约5.5至约8.0、约5.5至约7.0或约5.5至约6.5。在另一实施例中，本发明的制剂的pH值为约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、或约9.0。在一具体实施例中，本发明的制剂的pH值约为6.0。
本发明的制剂包括缓冲剂或pH调节剂以提供更好的pH控制。在一实施例中，本发明的制剂的pH为3.0至9.0、4.0至8.0、5.0至8.0、5.0至7.0、5.0至6.5、5.5至8.0、5.5至7.0或5.5至6.5。在另一实施例中，本发明的制剂的pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。在一具体实施例中，本发明的制剂的pH为6.0。本领域的技术人员理解的是制剂的pH值通常不应该等同于制剂中使用的抗体(包括抗体及其片段)等电点。
通常情况下，缓冲剂是由有机酸或无机酸或碱制备的盐类。代表性缓冲剂包括，但不限于，有机酸盐类如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或苯二甲酸盐；Tris(三氨基甲烷盐酸缓冲液)、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲液。此外，氨基酸组分可能也具有缓冲能力。使用于本发明的制剂中作为缓冲剂的代表性氨基酸组分包括，但不限于，甘氨酸和组氨酸。在特定实施例中，缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸、磷酸盐、甘氨酸和醋酸。在一具体实施例中，缓冲剂是组氨酸。在另一具体实施例中，缓冲剂是柠檬酸。缓冲剂的纯度应该至少为98％、或至少99％、或至少99.5％。本文中使用的在组氨酸背景下的术语“纯度”是指本领域理解的组氨酸的化学纯度，如The MerckIndex,13th ed.,O’Neil等，ed.(Merck&Co.,2001)中描述的。
缓冲剂通常在浓度为约1mM至约200mM或任何范围或数值内使用，其取决于所需的离子强度和所需的缓冲能力。用于注射制剂的传统缓冲剂的常见浓度可发现于：药品剂型：注射药物，第1卷，第2版，第5章，第194页，De Luca和Boylan，“小容量注射制剂”，表5“常用于注射产品的添加剂”。在一实施例中，缓冲剂的浓度为约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM。在一实施例中，缓冲剂浓度为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。在一具体实施例中，缓冲剂浓度为约5mM至约50mM。在另一具体实施例中，缓冲剂浓度为5mM至20mM。
在另一实施例中，缓冲剂浓度为1mM、或5mM、或10mM、或15mM、或20mM、或25mM、或30mM、或35mM、或40mM、或45mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM或100mM。在一实施例中，缓冲剂浓度为1mM、或5mM、或10mM、或15mM、或20mM、或25mM、或30mM、或35mM、或40mM、或45mM、或50mM、或60mM、或70mM、或80mM、或90mM或100mM。在一具体实施例中，缓冲剂浓度为5mM至50mM。在另一具体实施例中，缓冲剂浓度为5mM至20mM。
在特定实施例中，本发明的制剂包括缓冲剂。在一实施例中，所述缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸、磷酸盐、甘氨酸、和醋酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括组氨酸作为缓冲剂。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少约1mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约100mM、至少约150mM或至少约200mM组氨酸。在另一实施例中，本发明的制剂包括约1mM至约200mM、约1mM至约150mM、约1mM至约100mM、约1mM至约75mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约10mM至约75mM、约10mM至约50mM、约10mM至约40mM、约10mM至约30mM、约20mM至约75mM、约20mM至约50mM、约20mM至约40mM或约20mM至约30mM组氨酸。本发明的另一实施例包括约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约150mM或约200mM组氨酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约10mM组氨酸。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少75mM、至少100mM、至少150mM或至少200mM组氨酸。在另一实施例中，本发明的制剂包括1mM至200mM、1mM至150mM、1mM至100mM、1mM至75mM、10mM至200mM、10mM至150mM、10mM至100mM、10mM至75mM、10mM至50mM、10mM至40mM、10mM至30mM、20mM至75mM、20mM至50mM、20mM至40mM或20mM至30mM组氨酸。本发明的另一实施例包括1mM、5mM、10mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM或200mM组氨酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括10mM组氨酸。
在特定实施例中，本发明的制剂包括碳水化合物赋形剂。碳水化合物赋形剂能作为，例如粘度增强剂、稳定剂、填充剂、溶解剂等。碳水化合物赋形剂通常以质量或体积的约1％至约9％存在。在一实施例中，碳水化合物赋形剂以约0.1％至约20％存在。在另一实施例中，碳水化合物赋形剂以约0.1％至约15％存在。在一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以约0.1％至约5％、约1％至约20％、约5％至约15％、约8％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至20％、5％至15％、8％至10％、10％至15％、15％至20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以约0.1％至约5％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以约5％～10％存在。在还一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以约15％至约20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％、或20％存在。
在特定实施例中，本发明的制剂包括碳水化合物赋形剂。碳水化合物赋形剂能作为，例如粘度增强剂、稳定剂、填充剂、溶解剂等。碳水化合物赋形剂通常以质量或体积的1％至9％存在。在一实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至20％存在。在另一实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至15％存在。在一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至5％、1％至20％、5％至15％、8％至10％、10％至15％、15％至20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至20％、5％至15％、8％至10％、10％至15％、15％至20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以0.1％至5％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以5％至10％存在。在还一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以15％至20％存在。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％、或20％存在。
用于本发明制剂的合适的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、右旋糖酐、淀粉等；及糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(山梨醇)等。在一实施例中，本发明的碳水化合物赋形剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉子糖。在一具体实施例中，碳水化合物赋形剂是海藻糖。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂是甘露醇。在还一具体实施例中，碳水化合物赋形剂是蔗糖。在另一具体实施例中，碳水化合物赋形剂是棉子糖。碳水化合物赋形剂的纯度应该至少为98％、或至少为99％、或至少为99.5％。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少约1％、至少约2％、至少约4％、至少约8％、至少约20％、至少约30％、或至少约40％海藻糖。在另一实施例中，本发明的制剂包括约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约2％至约40％、约2％至约30％、约2％至约20％、约4％至约40％、约4％至约30％或约4％至约20％海藻糖。在另一实施例中，本发明的制剂包括约1％、约2％、约4％、约8％、约20％、约30％或约40％海藻糖。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约4％海藻糖。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少1％、至少2％、至少4％、至少8％、至少20％、至少30％或至少40％海藻糖。在另一实施例中，本发明的制剂包括1％至40％、1％至30％、1％至20％、2％至40％、2％至30％、2％至20％、4％至40％、4％至30％或4％至20％海藻糖。在另一实施例中，本发明的制剂包括1％、2％、4％、8％、20％、30％或40％海藻糖。
在一实施例中，本发明的制剂包括赋形剂。在一具体实施例中，本发明的制剂包括至少一种赋形剂，其选自糖、盐类、表面活性剂、氨基酸、多羟基化合物、螯合剂、乳化剂和防腐剂。在一实施例中，本发明的制剂包括盐类。在一实施例中，本发明的制剂包括盐类，其选自NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2。在一具体实施例中，本发明的制剂包括NaCl。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约100mM、至少约125mM、至少约150mM、至少约175mM、至少约200mM或至少约300mM氯化钠。在另一实施例中，本文所述制剂包括约10mM至约300mM、约10mM至约200mM、约10mM至约175mM、约10mM至约150mM、约25mM至约300mM、约25mM至约200mM、约25mM至约175mM、约25mM至约150mM、约50mM至约300mM、约50mM至约200mM、约50mM至约175mM、约50mM至约50mM、约75mM至约300mM、约75mM至约200mM、约75mM至约175mM、约75mM至约150mM、约100mM至约300mM、约100mM至约200mM、约100mM至约175mM或约100mM至约150mM氯化钠。在另一实施例中，本发明的制剂包括约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约80mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM或约300mM氯化钠。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少10mM、至少25mM、至少50mM、至少75mM、至少80mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM、至少175mM.至少200mM或至少300mM氯化钠。在另一实施例中，本文所述制剂包括10mM至300mM、10mM至200mM、10mM至175mM、10mM至150mM、25mM至300mM、25mM至200mM、25mM至175mM、25mM至150mM、50mM至300mM、50mM至200mM、50mM至175mM、50mM至150mM、75mM至300mM、75mM至200mM、75mM至175mM、75mM至150mM、100mM至300mM、100mM至200mM、100mM至175mM或100mM至150mM氯化钠。在另一实施例中，本发明的制剂包括10mM、25mM、50mM、75mM、80mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM或300mM氯化钠。
在一实施例中，本发明的制剂包括氨基酸。在一实施例中，本发明的制剂包括氨基酸盐类。在一实施例中，本发明的制剂包括氨基酸，其选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在一实施例中，本发明的制剂包括至少约25mM的氨基酸、至少约50mM的氨基酸、至少约100mM的氨基酸、至少约150mM的氨基酸、至少约200mM的氨基酸、至少约250mM的氨基酸、至少约300mM的氨基酸、至少约350mM的氨基酸或至少约400mM的氨基酸。在另一实施例中，本发明的制剂包括约25mM至约250mM、约25mM至约300mM、约25mM至约350mM、约25mM至约400mM、约50mM至约250mM、约50mM至约300mM、约50mM至约350mM、约50mM至约400mM、约100mM至约250mM、约100mM至约300mM、约100mM至约400mM、约150mM至约250mM、约150mM至约300mM或约150mM至约400mM的氨基酸。在另一实施例中，本发明的制剂包括约25mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM或约400mM的氨基酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约25mM的氨基酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约50mM的氨基酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约75mM的氨基酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约100mM的氨基酸。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约200mM的氨基酸。
在一实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸。在一实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约0.1、约0.5、约0.75、约1、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200或约300。在一实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约1.5、约1.7、约1.8、约1.9、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5或约4。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.1。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.2。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.4。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.5。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.6。在一具体实施例中，本发明的制剂包括海藻糖和氨基酸的摩尔比为约2.7。
本发明的制剂可进一步包括表面活性剂。本文中使用的术语“表面活性剂”指的是具有两亲性结构的有机物质；即，它们由非溶解性基团、通常的油溶性烃链和水溶性离子基团组成。表面活性剂可根据表面活性基团的电荷分为阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。表面活性剂通常用作各种药物组合物和生物材料制备的湿润剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。药学上可接受的表面活性剂如聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20或80)；polyoxamers(例如，泊洛沙姆188)；三硝基甲苯；辛甙钠；十二烷基-、十四烷基-、直链油烯基-或硬脂酰-磺基三甲铵乙内酯；十二烷基-、十四烷基-、直链油烯基-或硬脂酰-肌氨酸；直链油烯基-、十四烷基-或十六烷基-三甲铵乙内酯；十二烷基氨基丙基-、椰油酰基胺丙基-、直链油烯基氨基丙基-、十四烷基氨基丙基-、palmidopropyl-、或异硬脂酰氨基丙基-三甲铵乙内酯(如十二烷基氨基丙基)；十四烷基氨基丙基-、palmidopropyl-、或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基-、或油烯基甲基二钠-氨基乙磺酸盐；及MONAQUATM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙烯乙二醇、聚丙烯乙二醇、及乙烯基乙二醇和丙烯基乙二醇的共聚物(例如Pluronics,PF68等)，可随意地添加到本发明制剂中以减少聚合作用。如果施用制剂时使用泵或塑料容器，表面活性剂是特别有用的。药学上可接受的表面活性剂的存在可缓解蛋白质聚合的倾向。在一具体实施例中，本发明的制剂包括聚山梨醇酯，其浓度范围为约0.001％至约1％、或约0.001％至约0.1％、或约0.01％至约0.1％。在另一具体实施例中，本发明制剂包括聚山梨醇酯，其浓度为0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％。在另一具体实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括聚山梨醇酯，其浓度范围为0.001％至1％、或0.001％至0.1％、或0.01％至0.1％。在另一具体实施例中，本发明制剂包括聚山梨醇酯，其浓度为0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％。在另一具体实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80。
在一实施例中，本发明的制剂包括表面活性剂。在一实施例中，本发明的制剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括聚山梨醇酯80。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少约0.001％、至少约0.002％、至少约0.005％、至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.2％或至少约0.5％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，本发明的制剂包括约0.001％至约0.5％、约0.001％至约0.2％、约0.001％至约0.1％、约0.001％至约0.05％、约0.002％至约0.5％、约0.002％至约0.2％、约0.002％至约0.1％、约0.002％至约0.05％、约0.005％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约0.005％至约0.1％、约0.005％至约0.05％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.1％或约0.01％至约0.05％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，本发明的制剂包括约0.001％、约0.002％、约0.005％、约0.01％、约0.02％、约0.05％、约0.1％、约0.2％和约0.5％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约0.02％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约0.04％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括约0.05％聚山梨醇酯80。
在一实施例中，本发明的制剂包括至少0.001％、至少0.002％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.02％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％或至少0.5％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，本发明的制剂包括0.001％至0.5％、0.001％至0.2％、0.001％至0.1％、0.001％至0.05％、0.002％至0.5％、0.002％至0.2％、0.002％至0.1％、0.002％至0.05％、0.005％至0.5％、0.005％至0.2％、0.005％至0.1％、0.005％至0.05％、0.01％至0.5％、0.01％至0.2％、0.01％至0.1％或0.01％至0.05％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，本发明的制剂包括0.001％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括0.02％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括0.04％聚山梨醇酯80。在一具体实施例中，本发明的制剂包括0.05％聚山梨醇酯80。
非必要的，本发明的制剂可进一步包括其他常见的赋形剂和/或添加剂，其包括，但不限于，稀释剂、粘合剂、稳定剂、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。药学上可接受的赋形剂和/或添加剂可用于本发明的制剂。常用的赋形剂/添加剂，如药学上可接受的螯合剂(例如，但不限于，EDTA、DTPA或EGTA)可随意地添加到本发明的制剂以减少聚合作用。如果施用制剂时使用泵或塑料容器，这些添加剂是特别有用的。
非必要地，可将防腐剂以任意合适的浓度如约0.001％至约5％或任何范围或数值内添加到本发明制剂中，所述防腐剂如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、苯基亚硝酸盐、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如，但不局限于，六水合物)、烷基对羟苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、脱氢醋酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠或其混合物。本发明的制剂中使用的防腐剂浓度是指足以产生微生物作用的浓度。这种浓度取决于选择的防腐剂，其容易被技术人员测定。
其他可能用于本发明制剂的赋形剂/添加剂包括，例如，调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂类如磷脂或脂肪酸、类固醇如胆固醇、蛋白质赋形剂如血清白蛋白(人血清白蛋白(HAS)、重组人血清白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白、盐形成抗衡离子如钠等。适合用于本发明制剂的这些和其他已知的药物赋形剂和/或添加剂在本领域是已知的，如“Remington:The Science&Practice of Pharmacy”,21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,(2005)和“Physician's Desk Reference”,60thed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(2005)所列举的。药学上可接受的载体通常选择适合于本领域众所周知的或本文中描述的Fc异体蛋白的给药方式、溶解性和/或稳定性。
本领域的技术人员应当理解的是本发明的制剂可与人体血液是等渗的，即本发明的制剂的渗透压与人体血液的渗透压基本上相同。这种等渗制剂的渗透压通常为约250mOSm至约350mOSm。等渗性可被测定，例如，通过使用蒸汽压力或冰冻式渗压计。通过使用渗涨度调节剂调节制剂的渗涨度。“渗涨度调节剂”是那些药学上可接受的惰性物质，其被添加到制剂中以提供制剂的等渗度。适合于本发明的渗涨度调节剂包括，但不局限于，糖类、盐类和氨基酸。
在特定实施例中，本发明的制剂的渗透压为约100mOSm至约1200mOSM、或约200mOSm至约1000mOSM、或约200mOSm至约800mOSM、或约200mOSm至约600mOSM、或约250mOSm至约500mOSM、或约250mOSm至约400mOSM、或约250mOSm至约350mOSm。
在特定实施例中，本发明的制剂的渗透压为100mOSm至1200mOSM、或200mOSm至1000mOSM、或200mOSm至800mOSM、或200mOSm至600mOSM、或250mOSm至500mOSM、或250mOSm至400mOSM、或250mOSm至350mOSm。
调节本发明的制剂的各种组分的任何一个或任何组合物的浓度以达到最终制剂所需要的渗涨度。例如，可根据本领域已知的方法调节碳水化合物赋形剂与抗体的比例(例如美国专利No.6,685,940)。在特定实施例中，碳水化合物赋形剂与抗体的摩尔比可能为约100至约1000摩尔的碳水化合物赋形剂比约1摩尔的抗体，或约200至约6000摩尔的碳水化合物赋形剂比约1摩尔的抗体，或约100至约510摩尔的碳水化合物赋形剂比约1摩尔的抗体，或约100至约600摩尔的碳水化合物赋形剂比约1摩尔的抗体。
调节本发明的制剂的各种组分的任何一个或任何组合物的浓度以达到最终制剂所需要的渗涨度。例如，可根据本领域已知的方法调节碳水化合物赋形剂与抗体的比例(例如美国专利No.6,685,940)。在特定实施例中，碳水化合物赋形剂与抗体的摩尔比可能为100至1000摩尔的碳水化合物赋形剂比1摩尔的抗体，或200至6000摩尔的碳水化合物赋形剂比1摩尔的抗体，或100至510摩尔的碳水化合物赋形剂比1摩尔的抗体，或100至600摩尔的碳水化合物赋形剂比1摩尔的抗体。
还可通过调节制剂的盐浓度以达到最终制剂所需要的渗涨度。适合于本发明的作为渗涨度调节剂的药学上可接受的盐类包括，但不局限于，氯化钠、琥珀酸钠、硫酸钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙。在具体实施例中，本发明的制剂包括NaCl、MgCl2和/或CaCl2。在一实施例中，NaCl浓度为是约75mM至约150mM。在另一实施例中，MgCl2浓度为约1mM至约100mM。适合于本发明的作为渗涨度调节剂的药学上可接受的氨基酸包括，但不局限于，脯氨酸、丙氨酸、L-精氨酸、天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和组氨酸。
在一实施例中，本发明的制剂是无热源制剂，其基本上没有内毒素类和/或相关致热物质。内毒素类包括局限于微生物内且只有当微生物分解或死亡时才被释放的毒素。致热物质还包括细菌和其他微生物外膜的热诱导、耐高温物质(糖蛋白)。如果将这些物质施用于人类，它们都能引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使是低量的毒素也必须从静脉注射给药的药物溶液中移除。美国食品与药物管理局(“FDA”)已建立了静脉注射药物每小时每千克体重的剂量上限为5个肉毒素单位(EU)(The United States Pharmacopeial Convention,PharmacopeialForum26(1):223(2000))。当治疗性蛋白质以每千克体重几百或几千毫克的数量给药时，其能与抗体作用，即使微量的有害和危险的内毒素必须移除。在特定具体实施例中，组合物中肉毒素和致热物水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。
当用于体内给药时，本发明的制剂应该是无菌的。本发明的制剂可通过各种灭菌方法进行灭菌，包括过滤除菌、辐射等。在一实施例中，抗体制剂通过预灭菌的0.22μm过滤器过滤灭菌。根据传统药物实验如“Remington:The Science&Practice of Pharmacy”,21st ed.,LippincottWilliams&Wilkins,(2005)中所述，可配制用于注射的无菌组合物。制剂包括如本文中所述的那些抗体，其通常以冻干形式或在溶液中保存。预期包括抗体的无菌组合物被置于具有无菌进入孔的容器，例如，具有接管的输液袋或瓶，接管允许制剂的回流，如通过皮下注射针的穿孔塞。在一实施例中，本发明的组合物提供为预充注射器。
在一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂。术语"冻干的"或“冷冻干燥的”包括经过干燥过程(如冷冻干燥法)的物质状态，其中去除至少50％的湿度。
短语“填充剂”包括药学上可接受的并添加到溶解层的化合物。本领域已知的填充剂包括，例如，糖类，其包括简单糖如葡萄糖、核糖、果糖等，糖醇如甘露醇、肌醇和山梨醇，二糖包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然聚合物如淀粉、右旋糖酐、壳聚糖、透明质酸、蛋白质(如明胶和血清白蛋白)、糖原、合成单体及聚合物。
“冻干保护剂”是一个分子，其与目的蛋白结合时，显著防止或减少在冻干和随后保存时蛋白的化学和/或物理的不稳定性。冻干保护剂包括，但不局限于，糖类及其相应的糖醇；氨基酸如谷氨酸钠或组氨酸；甲胺如三甲铵乙内酯；易溶盐如硫酸镁；多羟基化合物如含三个羟基或高分子量糖醇，例如，甘油、葡聚糖、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇，山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙烯乙二醇；PluronicsTM.；及其组合物。还原糖的例子包括，但不局限于，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和半乳糖苷果糖。非还原糖例子包括，但不局限于，多羟基化合物的非还原苷类，选自糖醇和其他直链多元醇。糖醇的例子包括，但不局限于，单苷、通过还原二糖获得的化合物如乳糖、麦芽糖、果糖和麦芽酮糖。糖苷基团可以是葡糖苷或糖苷的。糖醇的其他例子包括，但不局限于，山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇与异麦芽酮糖。在具体实施例中，海藻糖或蔗糖用作冻干保护剂。
将冻干保护剂以“冻干保护数量”添加到预先冻干的制剂中，这表示存在冻干保护数量的冻干保护剂时冷冻干燥蛋白质，该蛋白质经冷冻干燥和保存基本上保留了其物理和化学稳定性及完整性。
在一实施例中，冻干保护剂(如海藻糖)与本发明制剂的抗IL-6抗体分子的摩尔比为至少约10、至少约50、至少约100、至少约200或至少约300。在另一实施例中，冻干保护剂(如海藻糖)与本发明制剂的抗IL-6抗体分子的摩尔比为约1、约2、约5、约10、约50、约100、约200或约300。
“重组的”制剂通过将冻干抗体制剂溶解于稀释剂中而制备，以使抗体分散在重组制剂中。重组制剂适合于给使用目的蛋白治疗的患者施用(如肠胃外给药)，在本发明特定实施例中，可能适用于静脉给药。
本文中目的“稀释剂”是药学上可接受的(对人给药时安全且无毒)且用于液体制剂制备的稀释剂，如冷到干燥后的重组制剂。在一些实施例中，稀释剂包括，但不局限于，无菌水、用于注射的抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(如，磷酸盐缓冲液)、无菌生理盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。在另一实施例中，稀释剂可包括盐类和/或缓冲剂的水溶液。
在一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，其包括本发明的IL-6抗体，以每分钟振动400次的速度摇晃所述药水瓶4小时，其中所述药水瓶装有一半体积的所述试剂，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体可从药水瓶中回收。在另一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，所述制剂经过3个冷冻/解冻循环，其包括本发明的IL-6抗体，其中所述药水瓶装有一半体积的所述试剂，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体可从药水瓶中回收。在另一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，其包括本发明的IL-6抗体，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体通过重组所述制剂产生的冻干层可从药水瓶中回收。
在一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，其包括本发明的IL-6抗体，以每分钟振动400次的速度摇晃所述药水瓶4小时，其中所述药水瓶装有一半体积的所述试剂，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体可从药水瓶中回收。在另一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，其包括本发明的IL-6抗体，所述制剂经过3个冷冻/解冻循环，其中所述药水瓶装有一半体积的所述试剂，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体可从药水瓶中回收。在另一实施例中，本发明的制剂是冻干制剂，其包括本发明的IL-6抗体，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体通过重组所述制剂产生的冻干层可从药水瓶中回收。
在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体保存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周后通过重组所述冻干制剂被回收。在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体保存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月后通过重组所述冻干制剂被回收。
在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月后通过重组所述冻干制剂被回收。在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年或至少约5年后通过重组所述冻干制剂被回收。
在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约40℃下约1周、约2周、约3周、约4周、约5周或约6周后通过重组所述冻干制剂被回收。在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月后通过重组所述冻干制剂被回收。
在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月后通过重组所述冻干制剂被回收。在一实施例中，本发明的冻干制剂包括本发明的抗IL-6抗体分子，其中至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述抗体储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后通过重组所述冻干制剂被回收。
在一实施例中，本发明的制剂是重组制剂。在特定实施例中，本发明的重组液体制剂通过本文描述的冻干制剂制备。
在一实施例中，本发明的重组液体制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其浓度与预冻干的液体制剂的浓度相同。
在一实施例中，本发明的重组液体制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其浓度高于预冻干的液体制剂的浓度。在具体实施例中，本发明的重组液体制剂包括的本发明的抗IL-6抗体的浓度比预冻干的液体制剂的浓度高约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍。
在一实施例中，本发明的重组液体制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其浓度低于预冻干的液体制剂的浓度。在具体实施例中，本发明的重组液体制剂包括的本发明的抗IL-6抗体的浓度比预冻干的液体制剂的浓度低约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍。
在一实施例中，本发明的重组液体制剂是水性制剂。在一具体实施例中，本发明的重组液体制剂是水性制剂，其中水介质是蒸馏水。
在一实施例中，本发明的重组制剂是无菌的。
在一实施例中，本发明的重组制剂是均质的。
在一实施例中，本发明的重组制剂是等渗的。在一实施例中，本发明的重组制剂是低渗的。在一实施例中，本发明的重组制剂是高渗的。
在特定实施例中，本发明的重组制剂包括(或作为总分数组成)少于约3.4E+5颗粒/ml的直径为2至4μm的颗粒、少于约4.0E+4颗粒/ml的直径为4至10μm的颗粒、少于约4.2E+3颗粒/ml的直径为10至20μm的颗粒、少于约5.0E+2颗粒/ml的直径为20至30μm的颗粒、少于约7.5E+1颗粒/ml的直径为30至40的颗粒、少于约9.4颗粒/ml的直径为40至60μm的颗粒，其颗粒直径通过颗粒计数仪测定。在特定实施例中，本发明的重组制剂包括粒径大于40μm或大于30μm的不可检测颗粒。
在特定实施例中，在保存约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约12小时、约15小时、约18小时或约24小时后，本发明的重组制剂包括(或作为总分数组成)少于约3.4E+5颗粒/ml的直径为2至4μm的颗粒、少于约4.0E+4颗粒/ml的直径为4至10μm的颗粒、少于约4.2E+3颗粒/ml的直径为10至20μm的颗粒、少于约5.0E+2颗粒/ml的直径为20至30μm的颗粒、少于约7.5E+1颗粒/ml的直径为30至40的颗粒、少于约9.4颗粒/ml的直径为40至60μm的颗粒，其颗粒直径通过颗粒计数仪测定。在特定实施例中，本发明的液体制剂包括粒径大于40μm或大于30μm的不可检测颗粒。
在具体实施例中，药物组合物包括，但不局限于：
(a)无菌液体制剂，其包括100mg/ml抗体、25mM组氨酸、1.6mM甘氨酸，pH值为6.0；
(b)无菌液体制剂，其包括100mg/ml抗体和25mM组氨酸，pH值为6.0；
(c)无菌液体制剂，其包括5mg/ml抗体、20mM柠檬酸、100mMNACl、1.5％甘露醇、50l DTPA和0.02％PS80，pH值为6.0；
(d)无菌液体制剂，其包括100mg/ml抗体、25mM组氨酸、8％海藻糖和0.02％PS80，pH值为6.0；
(e)无菌液体制剂，其包括20mg/ml抗体、10mM组氨酸、2.35％(w/v)赖氨酸-HCl和0.02％PS-80(w/v)，pH值为6.0；
(f)无菌液体制剂，其包括5mg/ml抗体、10mM柠檬酸钠缓冲液、NaCl(0.15M)和吐温80(0.02％)，pH值为6.0；
(g)无菌液体制剂，其包括100mg/ml抗体、10mM组氨酸和150mM NaCl，pH值为6.0。
在一实施例中，本发明的制剂使本发明的抗IL-6抗体稳定。在一实施例中，本发明的制剂防止本发明的抗IL-6抗体的聚集作用。在另一实施例中，本发明的制剂防止本发明的抗IL-6抗体的断裂作用。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周、或至少约4周是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下约1周、约2周、约3周或约4周是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下约1周、约2周、约3周或约4周是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月是稳定的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年是稳定的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中是稳定的。
本发明提供包括本发明抗IL-6抗体的稳定制剂。所述抗体的稳定性可通过聚集作用、降解作用和断裂作用的程度评估，通过HPSEC、反向色谱法、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外分光镜(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素伸展技术、体内色氨酸荧光、差示扫描量热法和/或ANS结合技术测定，与包括参考抗体的参考制剂相比较。例如，参考制剂可能是冷冻在-70℃的参考标准样品，其包括10mM组氨酸(pH6.0)中的10mg/ml参考抗体(包括抗体及其片段)(例如，但不局限于，包括16C4可变区域和Fc区域的抗体，其具有复杂的N-糖苷-连接糖链，在糖链中岩藻糖不与还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖相结合)，组氨酸中包括75mMNaCl和4％海藻糖，其中参考制剂通过HPSEC有规律地显示单峰(例如，≥97％的面积)。在特定实施例中，参考制剂与检测稳定性的制剂相同；参考制剂在检测稳定性期间可能保存冷冻在-70℃以保存参考制剂的原初状态。例如，用于评估任何储存在40℃下的制剂中IL-6抗体结合活性损失的参考标准样品可能与储存在-70℃下30天的制剂相同。包括抗体(包括抗体及其片段)的制剂的总稳定性可通过各种免疫学检测估计，例如，ELISA(酶联免疫吸附测定)和使用分离抗原分子的放射免疫测定法。此外，包括抗体的制剂的稳定性可能还使用各种用于测量抗体功能特点的试验估计，例如，用于测量抗原亲和力、体外ADCC活性、体内消耗作用、体外CDC活性、抑制试验、细胞增殖试验等。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约40℃下约1周、约2周、约3周或约4周。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的参考抗体的IL-6结合活性，其中所述制剂储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约25℃下约1周、约2周、约3周或约4周。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，其中所述制剂储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，所述抗体的IL-6结合活性为参考抗体的IL-6结合活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的参考抗体的IL-6结合活性，其中所述制剂储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。本文中使用的术语“至多”和“不超过”具有相同含义。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、或至少约12个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下约1周、约2周、约3周或约4周期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在25℃下约1周、约2周、约3周或约4周期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述抗体在制剂储存在5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年期间，其IL-6结合活性损失至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周、或至少约4周，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、或至少约6个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年、或至少约12年，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、或约6个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、或约6个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、或约12个月，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、或约12年，通过HPSEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体形成聚合体。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、或至少约6个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、或至少约6个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年，通过RP-HPLC或SEC测定其中少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于7％或少于10％的所述抗体断裂。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下至少约1周、至少约2周、至少约3周或至少约4周，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或至少约6个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约11年或至少约12年，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约40℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、或约6个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下约1周、约2周、约3周或约4周，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约25℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一实施例中，本发明的制剂储存在约5℃下约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年或约12年，通过目视检查确定所述制剂是清澈无色的。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在特定实施例中，本发明的制剂储存后维持改善的聚合特性，如室温或4℃下的延长的周期(比如，但不局限于1周、1个月、6个月、1年、2年、3年或5年)或高温如38℃至42℃下延长的周期(比如，但不局限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月)。在特定实施例中，当制剂在各种湿度条件(包括，但不局限于高达10％、或高达20％、或高达30％、或高达40％、或高达50％、或高达60％、或高达70％、或高达80％、或高达90％、或高达100％)暴露在光线下或储存在黑暗中时，其储存后维持改善的聚合特性。本领域中应当理解的是术语“环境的”条件通常指温度约为20℃，相对湿度为10％至60％，并暴露在光线下。类似地，温度为约2℃至8℃，相对湿度小于10％，统称为“4℃”或“5℃”，温度为约23℃至27℃，相对湿度为约60％，统称为“23℃”，温度为约38℃至42℃，相对湿度为约75％，统称为“40℃”。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。
在特定实施例中，储存在4℃下至少一个月后，本发明的制剂包括(或作为总分数组成)少于约3.4E+5颗粒/ml的直径为2至4μm的颗粒、少于约4.0E+4颗粒/ml的直径为4至10μm的颗粒、少于约4.2E+3颗粒/ml的直径为10至20μm的颗粒、少于约5.0E+2颗粒/ml的直径为20～30μm的颗粒、少于约7.5E+1颗粒/ml的直径为30至40μm的颗粒、少于约9.4颗粒/ml的直径为40至60μm的颗粒，其颗粒直径通过颗粒计数仪测定。在特定实施例中，本发明的液体制剂包括粒径大于40μm或大于30μm的不可检测颗粒。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。
用于测定聚集作用程度和/或蛋白质制剂(如，本发明的抗体制剂)中存在的聚集体的类型和/或大小的多种方法在本领域中是已知的，所述方法包括，但不局限于，体积排阻色谱法(SEC)、高效体积排阻色谱(HPSEC)、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外分光镜(FTIR)、圆二色性(CD)、尿素伸展技术、体内色氨酸荧光、差示扫描量热法和1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)蛋白质结合技术。例如，体积排阻色谱法(SEC)可基于分子大小进行分离分子，通过使分子经过填充了合适树脂的柱，大分子(如聚集体)将在小分子(如单体)之前洗脱。分子一般通过280nm的紫外吸收检测，并收集用于进一步鉴定。高压液相色谱柱通常用于SEC分析(HP-SEC)。具体的SEC方法在以下名为“实施例”的章节具体介绍。可选地，可使用分析超速离心(AUC)。AUC是正交技术，其测定液体样品中大分子的沉降系数(Svedberg,S中报导)。如同SEC，AUC能够分离并检测单体中的抗体片段/聚集体，并能够进一步提供分子质量的信息。制剂中的蛋白聚集还可通过使用库尔特计数器的颗粒计数分析或通过使用浊度计的浊度测量表征。浊度是数量的度量单位，溶液中的颗粒散射光，且因此可作为蛋白聚集的通用指标。此外，非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或毛细管凝胶电泳(CGE)可以用来表征本发明制剂中的抗体或其片段的聚集和/或断裂状态。
在一实施例中，本发明的制剂用于肠胃外给药。在一实施例中，本发明的制剂是注射剂型。在具体实施例中，本发明的制剂适合于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮层内、腹腔内、神经周围、经气管的、皮下、表皮下的、关节内、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和输液。在一实施例中，本发明的制剂用于静脉、皮下或肌肉给药。在一具体实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述制剂用于皮下注射。在一具体实施例中，本发明的制剂包括本发明的抗IL-6抗体，其中所述制剂用于静脉注射。在一具体实施例中，本发明的制剂储存在预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂用于静脉给药，其中所述制剂包括约1mg/ml至约60mg/ml、约1mg/ml至约50mg/ml、约1mg/ml至约40mg/ml、约10mg/ml至约60mg/ml、约10mg/ml至约50mg/ml、约10mg/ml至约40mg/ml、约20mg/ml至约60mg/ml、约20mg/ml至约50mg/ml、约20mg/ml至约40mg/ml、约30mg/ml至约60mg/ml、约30mg/ml至约50mg/ml或约30mg/ml至约40mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂用于神经周的或鞘内给药，其中所述制剂包括约0.01g/ml至约50g/ml、约0.05g/ml至约45mg/ml、约0.1g/ml至约30g/ml、约0.15g/ml至约25g/ml、约0.2g/ml至约20g/ml、约0.25g/ml至约17.5g/ml、约0.5g/ml至约15g/ml、约0.75g/ml至约12.5g/ml、约0.6g/ml至约10g/ml、约1.0g/ml至约8g/ml、约1.25g/ml至约7.5g/ml或约1.5g/ml至约6g/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂用于皮下给药，其中所述制剂包括约1mg/ml至约100mg/ml、约1mg/ml至约150mg/ml、约1mg/ml至约200mg/ml、约25mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约150mg/ml、约25mg/ml至约200mg/ml、约50mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约50mg/ml至约00mg/ml、约75mg/ml至约100mg/ml、约75mg/ml至约150mg/ml或约75mg/ml至约200mg/ml的本发明的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的制剂提供于预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂用于气溶胶给药。
本发明还提供了适合肠胃外施用于人类的药物的单位剂型，其在一合适的容器中包括本发明的抗IL-6抗体制剂。在一实施例中，本发明的药物的单位剂量包括静脉、皮下或肌肉递送本发明制剂的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的药物的单位剂量包括气溶胶递送本发明制剂的抗IL-6抗体。在一具体实施例中，本发明的药物的单位剂量包括皮下递送本发明制剂的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的药物的单位剂量包括气溶胶递送本发明制剂的抗IL-6抗体。在另一实施例中，本发明的药物的单位剂量包括鼻内给药本发明制剂的抗IL-6抗体。在一实施例中，合适的容器是预充注射器。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
在一实施例中，本发明的制剂提供于密封容器中。在一具体实施例中，本发明的制剂提供于预充注射器中。在一具体实施例中，本发明的制剂包括具有延长的体内半衰期的本发明的抗IL-6抗体。
本发明还提供了包括本发明制剂的本发明抗IL-6抗体的试剂盒。本发明提供了药物组合件或试剂盒，其包括一个或多个装有本发明液体制剂或冻干制剂的容器。在一实施例中，装有本发明液体制剂的容器是预充注射器。在一具体实施例中，本发明的制剂包括与另一个基团重组融合或化学偶联的抗体(包括其抗体片段)，另一个基团包括但不局限于，异源蛋白质、异源多肽、异源肽、大分子、小分子、标记序列、诊断或检测剂、治疗性基团、药物基团、放射性金属离子、二级抗体和载体。在一具体实施例中，本发明的制剂制定成无菌液体在单剂量小瓶中。本发明的制剂可能提供与目的体积1.2ml的3cc USP I型硼硅琥珀色小瓶(West Pharmaceutical Serices-Part No.6800-0675)。非必要的与这种容器相关可以调控药品或生物制品制造、使用或销售的政府机关规定的形式通知，该通知反应了制造、使用或销售部门对于人类给药的认可。在另一实施例中，本发明的制剂可提供于预充注射器中。
在一实施例中，装有本发明液体制剂的容器是预充注射器。本领域技术人员已知的任何预充注射器可能用于本发明液体制剂的结合。可能使用的预充注射器在下列申请中被描述，例如，但不局限于，PCT公开号为WO05032627、WO08094984、WO9945985、WO03077976的申请，美国专利US6792743、US5607400、US5893842、US7081107、US7041087、US5989227、US6807797、US6142976、US5899889、美国专利公开号为US20070161961A1、US20050075611A1、US20070092487A1、US20040267194A1、US20060129108A1的申请。预充注射器可以由各种材料制成。在一实施例中，预充注射器是玻璃注射器。在另一实施例中，预充注射器是塑胶注射器。本领域技术人员应当理解的是用于制造注射器的材料的性质和/或质量可能影响储存在注射器中的蛋白质制剂的稳定性。例如，不用说，沉积在注射室内表面的硅润滑剂可能影响蛋白质制剂中的颗粒形成。在一实施例中，预充注射器包括硅润滑剂。在另一实施例中，预充注射器不含有硅润滑剂。本领域技术人员理解的是从注射器管、注射器尖帽、柱塞或瓶塞浸入制剂的少量污染成分也可能影响制剂的稳定性。例如，不用说，在制造过程中引入的钨可能对制剂的稳定性产生不利影响。在一实施例中，预充注射器可能包括高于500ppb的钨。在另一实施例中，预充注射器是低钨注射器。在另一实施例中，预充注射器可能包括约500ppb至约10ppb、约400ppb至约10ppb、约300ppb至约10ppb、约200ppb至约10ppb、约100ppb至约10ppb、约50ppb至约10ppb、约25ppb至约10ppb的钨。
制造的产品
本发明还包括完成包装和标签的药剂产品。这种制造产品包括合适的导管或容器(如密封的玻璃小瓶、预充注射器或其他容器)中适当的单位剂型。在一实施例中，单位剂型提供为非溶液的无菌颗粒，其包括适合于肠胃外给药的抗IL-6抗体。在另一实施例中，单位剂型提供为无菌冻干粉末，其包括适合于重组的抗IL-6抗体。
在一实施例中，单位剂型适合于静脉、肌肉、鼻内、口服、外用或皮下递送。因此，本发明包括适合于各种递送途径的无菌溶液。本发明还包括适合于重组的无菌冻干粉末。
对于任何药剂产品，包装材料和容器被设计为保护产品保存和运输期间的稳定性。此外，本发明的产品还包括使用说明书或其他信息材料说明，其建议医生、技术人员或患者怎样适当地预防或治疗所述疾病或病症。换言之，制造产品包括说明方法，其指出或建议给药方案，包括，但不局限于，实际剂量、监测程序和其他监测信息。
具体地，本发明提供了制造的产品，其包括包装材料，如盒、瓶、管、小瓶、容器、预充注射器、喷雾器、吹药器、静脉注射(i.v.)袋、包封等；和至少一个包含在所述包装材料中的药剂单位剂型，其中所述药剂包括含有抗体的液体制剂。包装材料包括说明方法，其指出如何使用所述抗体以预防、治疗和/或处理与疾病或病症相关的一个或多个症状。
用于口服给药的药物组合物，如单域抗体分子(如“纳米抗体TM”)等也都在本发明中设想。这种口服制剂可能是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可能包括固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或在痛苦部位注射，活性成分将以肠胃外可接受的水溶液形式存在，其为无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够使用如等渗介质制备合适的溶液，等渗介质如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸钠林格氏注射液。防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂可根据需要使用，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲基醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成反离子，如钠；金属配合物(如锌蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明的结合元件可根据分子的物理化学性质和递送途径被制成液体、半固体或固体形式。制剂可包括赋形剂，或赋形剂组合物，如糖类、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可能包括各种抗体浓度和pH。固体制剂可能通过低压冻干法、喷雾干燥或超临界流体技术干燥生成的。结合元件的制剂将取决于预期的递送途径，例如，用于肺部递送的制剂可能由具有物理性能的颗粒组成，其保证通过吸入渗透到肺部深处；外用制剂(例如，用于治疗伤疤，如皮肤伤疤)可能包括粘度修饰剂，其延长药物处于作用部位的时间。可制备带有载体的结合元件，所述载体将阻止结合元件快速释放，如可控缓释剂，包括移植物、经皮肤贴剂和微胶囊递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。对于本领域技术人员来说制备这种制剂的许多方法是已知的(Robinson,J.R.ed.,(1978)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York)。
可口服地(例如，单域抗体分子(如“纳米抗体TM”))，通过注射(例如，皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内)，通过吸入、气管内，通过囊泡内途径(滴注如膀胱内)，或局部地(例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上)进行治疗。可通过脉冲输液施用治疗，尤其是用于结合组件的下降剂量。给药途径可通过治疗的物理化学特性、通过疾病的特殊条件或通过优化疗效或使副作用最小化的需要确定。一种特定的给药途径是静脉注射。另一种本发明药物组合物的给药途径是皮下注射。据设想，治疗不只限制于在临床使用。因此，使用无针设备的皮下注射是优选的。
组合物可能单独地或与其他疗法相结合施用，同时施用或按顺序施用取决于要治疗的情况。
本发明的结合元件可作为组合疗法的一部分，与另外的药用成分相结合。联合治疗可用于提供显著的协同效应，特别是本发明的结合元件与一种或几种其他药物的组合。本发明的结合元件可同时地或按顺序地或与另一个治疗剂联合给药，用于治疗一种或几种本文所列举的情况。
本发明的结合元件可用作化学感光剂，其能够增加细胞毒性药物的治疗功效，且因此被提供为与一种或多种细胞毒性药物同时地或按顺序地组合给药。结合元件还可用作放射线感光剂，其能改善放射线的疗效，且因此被提供为与放射线相同时地或按顺序地组合给药。
根据本发明的结合元件可能被提供为与一种或几种以下制剂相结合或添加一种或几种以下制剂：
-细胞因子或细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如，作用于细胞因子信号转导通路的药剂，如SOCS系统的调节剂)，如α-、β-和/或γ-干扰素；I型胰岛素样生长因子(IGF-1)，其受体和相关结合蛋白；白细胞介素类(IL)，例如，一种或多种IL-1至IL-33和/或白介素拮抗剂或抑制剂，如阿那白滞素；白介素家族成员的受体抑制剂或这类受体的特定亚基抑制剂，α-肿瘤坏死因子(TNF-α)抑制剂，如抗TNF单克隆抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗和/或CDP-870)和/或TNF受体拮抗剂，例如，免疫球蛋白分子(如依那西普)和/或低分子量药剂，如己酮可可碱；
-B细胞调节剂，例如靶向B淋巴细胞(如CD20(利妥昔)或MRA-aILl6R)或T淋巴细胞(例如，CTLA4-Ig、HuMax Il-15或Abatacept)的单克隆抗体；
-抑制破骨细胞活性的调节剂，如RANKL抗体；
-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，如CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11的拮抗剂(用于C-C家族)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CXCR6拮抗剂(用于C-X-C家族)；用于C-X3-C家族的CX3CR1拮抗剂；
-基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，即一种或多种间质溶解素、胶原酶类和明胶酶类及聚蛋白多糖酶，尤其是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、基质溶素-1(MMP-3)、基质溶素-2(MMP-10)和/或基质溶素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如，药剂如强力霉素；
-白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂，如积璐琛；ABT-761；芬留顿；替泊沙林；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-取代)-噻吩-2-烷基磺酰胺类；2,6-二叔丁基苯酚腙；甲氧基四氢吡喃如泽尼卡ZD-2138；化合物SB-210661；吡啶取代2-萘甲腈化合物，如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，如L-746,530；吲哚和/或喹啉化合物，如MK-591、MK-886和/或BAY x1005；
-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4受体拮抗剂，选自吩噻嗪-3-1s，如L-651,392；脒基化合物，如CGS-25019c；benzoxalamines，如昂唑司特；benzenecarboximidamides，如BIIL284/260；和化合物，如扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAY x7195；
-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如甲基黄嘌呤，例如，茶碱和/或氨茶碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如，PDE4抑制剂和/或同工型PDE4D抑制剂和/或PDE5抑制剂；
-1型组胺受体拮抗剂，如西替立嗪、氯雷他定、地氯雷他定(抗过敏性鼻炎的新药)、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴司汀、氯曲米通、异丙嗪、苯甲嗪和/或咪唑拉汀(通常口服、局部地或肠道外使用)；
-质子泵抑制剂(如奥美拉唑)或2型保护胃的(gastroprotective)组胺受体拮抗剂；
-4型组胺受体拮抗剂；
-α1/α2肾上腺素能受体激动剂血管收缩剂拟交感神经剂，如六氢脱氧麻黄碱、苯肾上腺素、苯丙醇胺、麻黄碱、假麻黄碱、盐酸萘唑啉、盐酸羟甲唑啉、盐酸四氢萘咪唑啉、盐酸丁苄唑啉、盐酸萘胺唑啉和盐酸丁肾素；
-抗胆碱能剂，例如蕈毒碱受体(M1、M2和M3)拮抗剂，如阿托品、东莨菪碱、格隆铵、异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平和替伦折平；
-β-肾上腺素能受体激动剂(包括β-受体亚型1-4)，如异丙基肾上腺素、舒喘宁、福莫特罗、沙美特罗、间羟叔丁肾上腺素、间羟异丙肾上腺素、双甲苯喘定甲磺酸盐和/或吡布特罗，例如其手性异构体；
-色酮，例如咳乐钠和/或奈多罗米钠；
-糖皮质激素，如氟尼缩松、氟羟脱氢皮质甾醇丙酮化合物、二丙酸倍氯米松、布地缩松、氟替卡松丙酸盐、环索奈德和/或糠酸莫米他松；
-调节核激素受体的药剂，如PPAR；
-免疫球蛋白(Ig)或Ig制剂或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，如抗IgE(例如，奥马佐单抗)；
-其他系统或局部使用的抗炎症药剂，例如，酞咪哌啶酮或其衍生物，类维生素A、蒽三酚和/或卡泊三醇；
-氨基水杨酸盐和磺胺嘧啶的组合物，如水扬酸偶氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸、巴柳氮和偶氮水杨酸；及免疫调节剂，如thiopurines；及皮质甾类，如布地缩松；
-抗菌剂，例如，青霉素衍生物、四环素、大环内酯物、β-内酰胺、氟喹诺酮、甲硝哒唑和/或吸入氨基糖苷类；和/或抗病毒剂，例如，阿昔洛韦、泛昔洛韦、瓦拉西洛维、更昔洛韦、西多福韦；氨基三环癸烷、金刚烷乙胺；病毒唑和/或沙喹那韦；核苷逆转录酶抑制剂，如地达诺新、拉米夫定、脱氧胸苷、扎西他滨、叠氮胸腺；非核苷逆转录酶抑制剂，如奈韦拉平、依法韦仑；
-心血管剂，如钙通道阻滞剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张肽-2受体拮抗剂；降脂药物，如抑制素和/或非诺贝特；血细胞形态调节剂，如己酮可可碱；溶解血栓剂和/或抗凝血剂，例如血小板聚集抑制剂；
-CNS药剂，如抗抑郁剂(如舍曲林)、抗帕金森药物(如苄甲炔胺、左旋多巴、罗平尼咯、普拉克索；MAOB抑制剂，如司来吉兰和雷沙吉兰；comP抑制剂，如托卡朋；A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂；NMDA拮抗剂、尼古丁拮抗剂、多巴胺拮抗剂和/或神经型一氧化氮合酶抑制剂)和抗老年痴呆症的药物，如多奈哌齐、利凡斯的明、塔克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲膦脂；
-用于治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如，中心或外周作用的镇痛剂，如类鸦片类似物或衍生物、酰胺咪嗪、苯妥英、丙戊酸钠、阿米替林或其他抗抑郁剂、扑热息痛、或非甾体抗炎症药剂；
-肠胃外或局部使用(包括吸入)的局部麻醉剂，如利多卡因或其类似物；
-抗骨质疏松剂，例如，激素药物、如雷洛昔芬、或双磷酸脂，如二膦酸盐；
-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗剂；(iii)白介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘着分子抑制剂包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，如酪氨酸激酶抑制剂(如Btk、Itk、Jak3MAP抑制剂可包括吉非替尼、伊马替尼、甲磺酸盐)，丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，MAP激酶抑制剂，如p38、JNK、蛋白激酶A、B、C和IKK)，或细胞周期调控中涉及的激酶(例如，细胞周期蛋白依赖激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽-B1和/或B2-受体拮抗剂；(x)抗痛风剂，例如，秋水仙素；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如，别嘌呤醇；(xii)促尿酸尿剂，例如，羧苯磺丙胺、苯磺唑酮和/或苯溴香豆酮；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生子因子(TGFβ)；(xv)血小板衍生生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒素霜；(xix)速激肽NK1和/或NK3受体拮抗剂，如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如，UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转换酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抑制剂或(xxiii)TH2细胞表达的趋化因子受体的同源分子(如CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38抑制剂；(xxv)Toll样受体(TLR)功能调节剂和(xxvi)调节嘌呤受体活性的药剂，如P2X7；(xxvii)转录因子激活抑制剂，如NFkB、API和/或STATS。
抑制剂可以是特定的或混合的抑制剂，例如，靶向多个上述提到的分子(例如受体)或分子种类的抑制剂。
结合元件还可用作与化疗剂或其他酪氨酸激酶抑制剂结合联合给药或以免疫偶联物的形式存在。所述抗体的片段还可用于通过重组机制或生化耦合获得的双特异性抗体，然后使上述抗体的特异性与其他抗体的特异性相关联，其他抗体能够识别其他涉及IL-6相关活性的分子。
用于治疗炎症性疾病，本发明的结合元件可以与一种或多种药剂结合，如非甾体抗炎药物(下文中为NSAID)，其包括非选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂，可局部地或全身地使用，如吡罗昔康、双氯高灭酸、丙酸，如甲氧萘丙酸、氟联苯丙酸、苯氧苯丙酸、苯酮苯丙酸和异丁苯丙酸、灭酸酯类，如甲灭酸、茚甲新、阿扎丙酮、吡唑啉酮，如苯基丁氮酮、水杨酸盐，如阿斯匹林；选择性COX-2抑制剂(如美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、罗美昔布(lumarocoxib)、帕瑞考昔和艾托考昔)；环加氧酶抑制一氧化氮供体(CINOD)；糖皮质激素(通过局部地、口服、肌肉内、静脉内或关节内途径给药)；甲氨蝶呤、来氟米特；羟化氯喹、D-青霉胺、金诺芬或其他注射或口服金色制剂；镇痛剂；双醋瑞因；关节内治疗，如透明质酸衍生物；和营养补充剂，如葡糖胺。
本发明的结合元件还可与用于癌症治疗的现有治疗剂相联合使用。用于联合的合适药剂包括：
(i)用于内科肿瘤学的抗增殖/抗肿瘤药及其组合物，如Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如抗叶酸物，如氟尿嘧啶，比如5-氟尿嘧啶和喃氟啶、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲、吉西他滨和紫杉酚)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类，如阿霉素、博来霉素、链霉素、道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、丝裂霉素C、放线菌素D和光神霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞滨，及紫杉化合物，比如烷类紫杉酚和泰索帝)；及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，比如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和表鬼臼毒噻吩糖苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱衍生物)；
(ii)抑制细胞生长剂，如抗雌激素药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)，雌激素受体负调节剂(例如氟维司群)，抗雄激素物质(例如比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特和环丙氯地孕酮)，LHRH(促黄体激素-释放激素)拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和乙基酰胺)，孕激素类(例如醋酸甲地孕酮)，芳香化酶抑制剂(例如阿纳托唑、来曲唑、伏氯唑和依西美坦)及5α-还原酶抑制剂，如非那司提；
(iii)抑制癌症细胞侵染的药剂(例如金属蛋白酶抑制剂，比如马马司他和尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如这种抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥单抗和抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))，例如血小板衍生生长因子家族抑制剂和例如肝细胞生长因子家族抑制剂；
(v)抗血管生成剂，如那些抑制血管内皮生长因子作用的药剂(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗，如国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856和WO98/13354中公开的化合物，它们的全部内容通过引用并入本文)和通过其他机制作用的化合物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能抑制剂和厄洛替尼)；
(vi)血管损伤剂，如考布他汀A4和国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物(它们的全部内容通过引用并入本文)；
(vii)反义疗法，例如直接作用于上面列举靶标的那些，如ISIS2503、抗ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如替换异常基因的方法，如异常p53或异常BRCA1或BRCA2、GDEPT(基因定向的酶前药治疗)方法，如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法及增加患者对化疗或放疗耐受力的方法，如多药耐药基因疗法；及
(ix)免疫疗法，例如提高患者肿瘤细胞免疫原性的体外和体内方法，如细胞因子转染，如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，减少T-细胞无反应性的方法，使用转染免疫细胞的方法，如细胞因子-转染的树突状细胞，使用细胞因子转染肿瘤细胞株的方法和使用抗个体遗传型抗体的方法。
本发明结合元件和一个或多个以上其他药用成分可用于药剂的生产。药剂可能单独或联合地施用于个体，且因此可以包括结合元件和其他成分作为组合的制剂或独立的制剂。独立的制剂可用于促进单独的和顺序的或同时的给药，并允许成分通过不同途径给药，例如口服或肠胃外给药。
根据本发明，提供的组合物可以施用于哺乳动物。通常以“治疗上有效量”施用，这足以说明对患者有利。这种益处可以是改善至少一种症状。实际给药量和给药速度及时间过程将取决于治疗的疾病的性质和严重程度、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床情况、疾病起因、组合物递送的位置、结合元件的类型、给药方法、给药进度和医师知道的其他因素。治疗处方，如剂量等决定，是全科医生和其他医生负责的，且取决于治疗的疾病的症状和/或进展的严重程度。适当剂量的抗体在本领域是众所周知的(Ledermann J.A.等.(1991)Int.J.Cancer47:659-664；Bagshawe K.D.等.(1991)Antibody,Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals4:915-922)。还可使用对于施用药剂类型合适的本文中指出的或Physician's Desk Reference(2003)中的具体剂量。通过比较动物模型体外活性和体内活性确定本发明的结合元件的治疗上有效量或合适剂量。通过小鼠和其他试验动物的有效剂量推测人类的有效剂量的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括抗体是用于诊断、预防或治疗、治理区域的大小和位置、抗体(例如，整个抗体、片段或双特异抗体)的确切性质及任何可检测标记及其他附着抗体的分子的性质。全身性应用的典型的抗体剂量为100μg至1g，局部性应用的典型的抗体剂量为1μg至1mg。可施用初始的高负荷剂量，后面是一个或多个低剂量。通常地，抗体是整个抗体，例如，IgG1同型。这是成年患者的有效治疗剂量，用于儿童或婴儿时可成比例地调整，且还可以分子量比例调整其他抗体形式。根据医生的决定，治疗可每日重复、每周两次、每周或每月一次。治疗可以是每2至4周皮下注射给药和每4至8周静脉注射给药。治疗可以是周期性的，且给药周期约为2周或更长时间，例如约3周或更长时间、约4周或更长时间、或约一个月一次。治疗可在外科手术之前和/或之后进行，和/或直接在外科手术治疗解剖部位给药时应用。
与sIL-6Ra抗体相比较，本发明的IL-6结合元件就剂量和给药需求而言可能具有优势。如本文中其他地方所述，疾病中IL-6的循环水平明显低于sIL-6Ra的循环水平。因此，IL-6结合元件的使用，与抗IL-6R结合元件相反，其在生产的药物数量方面具有明显优势，用于患者的剂量可能更低。而且如果抗IL6治疗剂剂量较低，其在低剂量促进皮下注射及静脉注射方面有明显优势。本领域技术人员众所周知的是，皮下给药可受限于结合元件数量，如抗体分子，需要的每次剂量。这是由于皮下注射受限于能够注入皮肤一个位点的量。通常使用的皮下注射量为1.2ml或更少。由于可能增加制成用于皮下注射的浓度大于50mg/ml的结合元件的难度，通过这种途径的大于100mg的剂量通常需要多次注射及患者的多次不适感。
进行低剂量抗IL-6治疗可能还需要较低“负荷”剂量的抗体以抑制所有全身的IL-6相比较于较高浓度的全身的sIL-6Ra。
另外的优点可能与目标IL-6而不是IL-6受体相关，表现出本发明的结合原件与用于IL-6Ra的结合元件相比较的其他优势。
例如，有文献报道示出疾病中IL-6的循环水平明显低于sIL-6Ra的循环水平(Desgeorges等，(1997)J.Rheumatol24:1510；Yokota等，(2005)Arth&Rheum52(3):818-25)。由于sIL-6R的水平明显高于IL-6的水平，相比较于中和IL-6所需要的抗IL-6结合元件的数量，可能需要更多的抗sIL-6R结合元件中和sIL-6Ra。因此，如果使用抗受体组合元件，可能需要低剂量的抗配体组合元件。
靶向IL-6配体而不是IL-6受体可减少疾病中IL-6的水平，但仍然允许感染期间增加IL-6的水平，其中IL-6上调作为免疫应答的一部分。
Kawano等(Nature(1988)332:83)示出了IL-6是有效的生长因子并示出了从患者新分离的骨髓瘤细胞产生IL–6并表达其受体。而且，抗IL-6抗体抑制骨髓瘤细胞的体外生长。这是自分泌环作用于人体骨髓瘤诱发肿瘤形成的直接证据。在这个研究之后，Van Zaanen等(J.Clin.Invest.(1996)98:1441-1448)证明当用抗IL-6配体抗体治疗时，多发性骨髓瘤患者中IL-6的产生量下降。
大量的进一步研究示出了IL-6包含于其他细胞类型的自分泌反馈环中，如平滑肌细胞(SMC)(Klouche等,(1999)J.Immunol.163(8)4583-9)、U373-MG星形神经胶质瘤细胞(Oh等,(2001)J.Immunol.166:2695-704)、3T3脂肪细胞(Fasshauer等,(2003)Horm.Metab.Res.35(3)147-52)、神经细胞(Marz等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci USA95(6)3251-6)、内皮细胞(Modur等,(1997)J.Clin.Invest.100(1)2752-6)和卡波西氏肉瘤细胞(Murakami-Morl等,(1996)Cell Growth Differ.7(12)1697-703)。因此，在疾病中使用抗IL6结合组件的IL-6抑制作用可导致IL–6在基础疾病中的产生量下降。
此外，抗IL-6结合元件在体循环中与IL-6结合，相反地结合元件与IL-6受体结合，IL-6受体需要穿透组织以使受体位于细胞表面，该细胞涉及将治疗疾病的病理。
IL-6结合元件可以在体循环中与IL-6形成平衡，跨越屏障(例如滑膜)引起梯度效应，其具有从连接处去除活性IL–6并与结合元件形成非活性复合物的净效应。因此，相比较于IL-6R结合元件，IL-6结合元件可能更快地开始，且给药方案可能不同并更易于优化。
IL-6信号通过IL-6与IL-6R结合调节，且该复合物与gp130结合。考虑到IL-6与IL-6Ra结合是纳摩尔浓度的亲和性(约5nM)，IL6:IL6R复合物与gp130结合是皮摩尔浓度的亲和性，靶向IL-6的结合元件面对低量的用于IL-6结合的竞争物，所以可抑制较大比例的IL-6信号转导。虽然这也可应用于靶向溶解性IL-6Ra的结合元件并阻止IL-6:IL-6Ra复合物形成，但如果IL-6Ra与膜结合，由于空间限制，其可能更难与抗IL-6Ra结合并抑制存在于膜上的IL-6Ra。
本发明提供了预防、治疗和/或处理疾病的方法，例如，与IL-6异常表达和/或活性相关的疾病或以此为特征的疾病，与IL-6受体异常表达和/或活性相关的疾病，自身免疫性疾病、炎症疾病、增生性疾病、感染及通过向受体施用有效量本发明组合物的一个或多个症状。各种递送系统是已知的且能够用于施用本发明的组合物或预防剂或治疗剂。施用本发明组合物或治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)的方法包括，但不局限于肠胃外给药(如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉周围神经和皮下)、硬膜外给药、局部给药和粘膜给药(例如，但不局限于，鼻内和口服给药)。在一具体实施例中，本发明的组合物是肌肉、静脉或皮下给药的。在一实施例中，本发明的组合物是皮下给药的。制剂可通过任何方便的途径给药，例如通过输液或大剂量注射，通过上皮或粘膜吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可能是全身性的或局部的。
本发明还提供了将本发明的组合物封装在一个密封的密闭容器中，如标示抗体(包括抗体及其片段)数量的安瓿瓶或sachette。在一实施例中，本发明的组合在标示抗体(包括抗体及其片段)数量和浓度的密封的密闭容器中。在一实施例中在密封的密闭容器中提供本发明的组合物，并包括约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml或约300mg/ml的抗体(包括抗体及其片段)，该抗体与IL-6特异性结合，数量为约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml,6约ml、约7ml、约8ml、约9ml、约10ml、约15ml或约20ml。在本发明一具体实施例中，在密封的密闭容器中提供本发明的组合物，并包括至少约15mg/ml、至少约20mg/ml、至少约25mg/ml、至少约50mg/ml、至少约100mg/ml、至少约150mg/ml、至少约175mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml或至少约300mg/ml的抗体(包括抗体及其片段)，该抗体与用于静脉注射的IL-6(例如，但不局限于，抗体18E)特异性结合，和至少约15mg/ml、至少约20mg/ml、至少约50mg/ml、至少约80mg/ml、至少约100mg/ml、至少约150mg/ml、至少约175mg/ml、至少约200mg/ml、至少约250mg/ml或至少约300mg/ml的抗体(包括抗体及其片段)，该抗体与用于重复皮下给药的IL-6(例如，但不局限于，抗体18E)特异性结合。
本发明组合物在预防、治疗和/或处理与IL-6异常表达和/或活性相关的疾病或以此为特征的疾病、与IL-6受体或其一个或多个亚基的异常表达和/或活性相关或以此为特征的疾病、自身免疫性疾病、移植排异、移植物抗宿主病，或其一种或多种症状的有效数量通过本领域众所周知的或本文中描述的标准临床技术确定。使用的组合物的精确剂量还取决于给药途径、炎症疾病或自身免疫性疾病的严重程度，而且还应该根据医生的判断和每个患者的情况决定。有效剂量可通过源于体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推测。
因为本发明包括抗体组合物，施用于患者的剂量可使用患者体重(kg)乘以将施用的剂量(mg/kg)计算。然后通过用所需的剂量(mg)除以抗体制剂的浓度确定所需的体积(ml)。通过将对于用注射器施用本发明的抗体制剂必要的多个小瓶的内容物合并获得最终计算的所需的体积。可在每个位点注射最大体积为2.0ml的抗体制剂。使用以下公式计算剂量(ml)：剂量(mL)＝[志愿者体重](kg)x[剂量]mg/kg÷100mg/mL抗体制剂。本发明的抗体在人体内具有延长的半衰期。因此，低剂量的本发明抗体和低频率给药通常是可能的。此外，可以通过增加组合物中抗体的浓度、增加抗体的亲和性和/或亲抗原性而降低本发明组合物的剂量、给药体积和给药频率。
在一具体实施例中，施用于患者的剂量可使用患者体重(kg)乘以将施用的剂量(mg/kg)计算。然后通过用所需的剂量(mg)除以制剂中(100mg/mL)抗体(包括抗体及其片段)的浓度确定所需的体积(ml)。通过将对于用注射器施用药物必要的多个小瓶的内容物合并获得最终计算的所需的体积。可在每个位点注射最大体积为2.0ml的制剂中的抗体(包括抗体及其片段)。
在一具体实施例中，将本发明的组合物中IL-6(例如，但不局限于，1抗体18E)与IL-6特异性结合的0.1～20mg/kg/周、1～15mg/kg/周、2～8mg/周、3～7mg/kg/周、或4～6mg/kg/周的抗体(包括抗体及其片段)施用于患有炎症疾病或自身性免疫疾病的患者。在另一实施例中，将一倍或多倍剂量的本发明组合物预防上或治疗上的有效量施用于患者，其中预防上或治疗上有效量对于每个剂量是不同的。
在一实施例中，本发明的组合物以以下给药方案施用，所述给药方案使IL-6特异性抗体的血浆浓度维持在理想水平(例如，约0.1～100μg/ml)，其连续阻断IL-6活性。在一具体实施例中，抗体的血浆浓度维持在约0.2μg/ml、约0.5μg/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约15μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约30μg/ml、约35μg/ml、约40μg/ml、约45μg/ml或约50μg/ml。患者的理想血浆浓度将根据许多因素变化，包括但不局限于，疾病或病症的性质、疾病或病症的严重程度和患者的情况。这种给药方案对于慢性疾病或病症的预防、治疗和/或处理是特别有益的。
在具体实施例中，间接施用特异于IL-6且包括共轭抗体(包括抗体及其片段)的本发明组合物。本文中使用的“共轭抗体或抗体片段”是指与另一个基团共轭或融合的抗体(包括抗体及其片段)，另一个基团包括但不局限于，异源肽、多肽、另一个抗体(包括抗体及其片段)、标记序列、诊断剂、聚合物、蛋白素和载体。
在另一实施例中，将一倍或多倍剂量的抗体的预防上或治疗上的有效量施用于人类患者，该抗体与本发明组合物中IL-6(例如，但不局限于，抗体18E)特异性结合，其中施用于所述患者的本发明组合物中抗体的预防上或治疗上有效剂量在治疗过程中是逐渐增加的，如约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.06μg/kg、约0.08μg/kg、约0.1μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.5μg/kg、约0.75μg/kg、约1μg/kg、约1.5μg/kg、约2μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约10μg/kg、约15μg/kg、约20μg/kg、约25μg/kg、约30μg/kg、约35μg/kg、约40μg/kg、约45μg/kg、约50μg/kg、约55μg/kg、约60μg/kg、约65μg/kg、约70μg/kg、约75μg/kg、约80μg/kg、约85μg/kg、约90μg/kg、约95μg/kg、约100μg/kg或约125μg/kg。
在另一实施例中，将一倍或多倍剂量的抗体的预防上或治疗上的有效量施用于受体(如人类)，该抗体与本发明组合物中IL-6(例如，但不局限于，抗体18E)特异性结合，其中施用于所述对象的本发明组合物中抗体的预防上或治疗上有效剂量在治疗过程中是逐渐减少的，如约0.01μg/kg、约0.02μg/kg、约0.04μg/kg、约0.05μg/kg、约0.06μg/kg、约0.08μg/kg、约0.1μg/kg、约0.2μg/kg、约0.25μg/kg、约0.5μg/kg、约0.75μg/kg、约1μg/kg、约1.5μg/kg、约2μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约10μg/kg、约15μg/kg、约20μg/kg、约25μg/kg、约30μg/kg、约35μg/kg、约40μg/kg、约45μg/kg、约50μg/kg、约55μg/kg、约60μg/kg、约65μg/kg、约70μg/kg、约75μg/kg、约80μg/kg、约85μg/kg、约90μg/kg、约95μg/kg、约100μg/kg或约125μg/kg。
抗体半衰期
在特定实施例中，本发明组合物和方法的抗IL-6抗体的半衰期至少约10天。在特定实施例中，本发明组合物和方法的抗IL-6抗体的平均半衰期至少约20至40天、25至40天、26至40天、20至30天、25至30天、26至30天或26至29天。在另一个实施例中，本发明组合物和方法的抗ICOS抗体的半衰期能达到约50天。在特定实施例中，本发明组合物和方法的抗体的半衰期能通过本领域已知方法延长。这种延长能转而减少抗体组合物给药的量和/或次数。改善体内半衰期的抗体和制备他们的方法在美国专利号6,277,375及国际公开号WO98/23289和WO97/3461的申请中公开。
通过使惰性聚合物分子(如高分子量聚乙二醇(PEG))附加到带有或不带有多功能连接子的抗体上，通过PEG与抗体的N-末端或C-末端位点特异性共轭，或通过存在于赖氨酰残基上的氨基，可以延长体内抗IL-6抗体的血清循环。将使用引起生物活性最少损失的直链或支链聚合物衍生物。可通过SDS-PAGE和质谱准确监测共轭程度以保证PEG分子与抗体的适当的共轭。可通过尺寸排阻和离子交换层析将未反应的PEG从抗体-PEG共轭物中分离。可使用本领域技术人员已知的方法(例如本文所述的免疫测定法)，测定PEG-衍生抗体的结合活性及体内疗效。
此外，本发明组合物和方法的抗体可与白蛋白共轭，以得到更稳定或更长的体内半衰期的抗体。这些技术在本领域是众所周知的，例如，参见国际公开号WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137；及欧洲专利号EP413,622的申请，它们的全部内容通过引用并入本文。
另外，变种Fc区域能赋予抗体延长的体内半衰期已被描述(见美国专利号US2003/0190311A1)。设想使用具有延长的体内半衰期的Fc区域与本发明的组合物和方法相结合。在一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括具有延长的体内半衰期的Fc区域。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括Fc区域，其包括至少一个氨基酸残基取代，所述氨基酸残基选自残基252、254和256，其中氨基酸残基的位置根据EU惯例确定。在一具体实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括Fc区域，其包括至少一个氨基酸残基取代，所述氨基酸残基选自M252Y、S254T和T256E，其中氨基酸残基位置根据EU惯例确定。在另一实施例中，本发明的抗IL-6抗体包括Fc区域，其包括至少一个氨基酸残基，氨基酸残基选自252位处的Y、254位处的T和256位处的E，其中氨基酸残基位置根据EU惯例确定。
Fc变体
本发明提供包括变体Fc区域的抗IL-6抗体。即为非自然产生的Fc区域，例如包括一个或多个非自然产生的氨基酸残基的Fc区域。本发明变体Fc区域还包括那些包括氨基酸缺失、添加和/或修饰的Fc区域。
应当理解的是，本文中使用的Fc区域包括多肽，其包括抗体的恒定区域但排除第一恒定区域免疫球蛋白结构域。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区域免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区域免疫球蛋白结构域，及这些结构域的柔性铰链N-末端。对于IgA和IgM，Fc可能包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2and Cγ3)及Cgamma1(Cγ1)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区域的边界可能改变，但人类IgG重链Fc区域通常确定为其羧基末端包括C226或P230残基，其中编号是依据EU索引如Kabat等(1991,NIH Publication91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)。“Kabat中列出的EU索引”是指如上文Kabat等中描述的人类IgG1EU抗体的残基编号。Fc可指单独的这个区域，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白背景下的这个区域。Fc变体蛋白可以是抗体、Fc融合或包括Fc区域的任何蛋白或蛋白结构域，其包括，但不局限于，包括变种Fc区域的蛋白，其为非自然产生的Fc变体。(注：在大量Fc位置观察到多态现象，该位置包括，但不局限于Kabat270、272、312、315、356和358。因此在当前序列与之前领域中的序列之间可能存在微小差异。)
本发明包括Fc变体蛋白，相对于可比分子(具有相同的氨基酸序列但不具有野生型Fc区域的蛋白质)，具有关于Fc配体(例如，Fc受体，C1q)的改变的结合性质。结合性质的例子包括，但不局限于，结合特异性、平衡解离常数(KD)、离解率和结合率(各自的koff和kon)，结合亲和性和/或亲抗原性。通常认为具有低KD的结合分子(例如，Fc变体蛋白如抗体)可能优选具有高KD的结合分子。然而，在某些情况下，kon或koff值可能比KD值更相关。本领域技术人员能够确定对于给定抗体哪个动力学参数是最重要的。
Fc结构域对于其配体的亲和性和结合属性可能通过许多在本领域已知的用于确定Fc-FcγR反应的体外试验方法(生物化学或免疫学试验)确定，例如，Fc区域与FcγR的特异性结合，包括但不局限于，平衡方法(例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫法(RIA))、或动力学(例如分析)和其他方法如间接结合试验、竞争性抑制实验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些和其他的方法可使用标记一个或多个待检验的组分和/或使用多种检测方法，包括但不局限于，显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和性和动力学的详细描述可在基础免疫学(Paul,W.E.,ed.,Fundamental Immunology,4th Ed.,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999))中找到，其侧重于抗体-免疫原相互作用。
在一实施例中，相对于可比分子，Fc变体蛋白增强了与一个或多个Fc配体的结合。在另一实施例中，Fc变体蛋白与Fc配体的亲和性大于Fc变体蛋白与可比分子的亲和性至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、说至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍或至少200倍。在一具体实施例中，Fc变体蛋白增强了与Fc受体FcRn的结合。
可通过增加Fc区域与FcRn的结合亲和性而增加包括Fc区域的蛋白质的血清半衰期。在一实施例中，相对于可比分子，Fc变体蛋白具有延长的血清半衰期。
在一实施例中，本发明提供了这样的组合物，其中Fc区域包括一个或多个位置上的非自然产生的氨基酸残基，所述位置选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265,266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443。非必要的，Fc区域可能包括在本领域技术人员已知的其他和/或备选位置上的非自然产生的氨基酸残基(参见美国专利5,624,821、6,277,375、6,737,056；PCT专利公开号WO01/58957、WO02/06919、WO04/016750、WO04/029207、WO04/035752、WO04/074455、WO04/099249、WO04/063351、WO05/070963、WO05/040217、WO05/092925和WO06/020114)。
在一具体实施例中，本发明提供了Fc变体蛋白组合物，其中Fc区域包括至少一种非自然产生的氨基酸残基，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R.243W、243L243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y和434W。非必要的，Fc区域可能包括本领域技术人员已知的其他和/或备的非自然产生的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821、6,277,375、6,737,056；PCT专利公开号WO01/58957、WO02/06919、WO04/016750、WO04/029207、WO04/035752和WO05/040217)。
在另一实施例中，本发明提供了Fc变体蛋白组合物，其中Fc区域包括至少一个非自然产生的氨基酸残基，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的239、330和332。在一具体实施例中，本发明提供了Fc变体蛋白组合物，其中Fc区域包括至少一个非自然产生的氨基酸残基，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的239D、330L和332E。非必要的，Fc区域还包括在一个或多个位置上的另外的非自然产生的氨基酸，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的252、254和256。在一具体实施例中，本发明提供了Fc变体蛋白组合物，其中Fc区域包括至少一个非自然产生的氨基酸，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的239D、330L和332E；及在一个或多个位置上的至少一种非自然产生的氨基酸，其选自如Kabat中列出的通过EU索引编号的252Y、254T和256E。
在一实施例中，本发明的Fc变体可能与其他已知的F变体相结合，其他Fc变体如在以下文章中公开的那些：Ghetie等,1997,Nat Biotech.15:637-40；Duncan等,1988,Nature332:563-564；Lund等,1991,J.Immunol147:2657-2662；Lund等,1992,Mol Immunol29:53-59；Alegre等,1994,Transplantation57:1537-1543；Hutchins等,1995,Proc Natl.Acad Sci U S A92:11980-11984；Jefferis等,1995,Immunol Lett.44:111-117；Lund等,1995,Faseb J9:115-119；Jefferis等,1996,Immunol Lett54:101-104；Lund等,1996,J Immunol157:4963-4969；Armour等,1999,Eur J Immunol29:2613-2624；Idusogie等,2000,J Immunol164:4178-4184；Reddy等,2000,JImmunol164:1925-1933；Xu等,2000,Cell Immunol200:16-26；Idusogie等,2001,J Immunol166:2571-2575；Shields等,2001,J Biol Chem276:6591-6604；Jefferis等,2002,Immunol Lett82:57-65；Presta等,2002,BiochemSoc Trans30:487-490)；美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375；美国专利公开号2004/0002587和PCT公开号WO94/29351、WO99/58572、WO00/42072、WO02/060919、WO04/029207、WO04/099249、WO04/063351。本发明还包括含有缺失、添加和/或修饰的Fc区域。对于本领域技术人员，其他的Fc区域的修饰/置换/缺失是显而易见的。
产生非自然发生的Fc区域的方法在本领域是已知的。例如，可通过诱变方法产生氨基酸取代和/或缺失，包括但不局限于，定点诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985))、PCR诱变(Higuchi,in"PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications",Academic Press,San Diego,pp.177-183(1990))和盒式诱变(Wells等,Gene34:315-323(1985))。优选地，通过重叠-延伸PCR方法进行定点诱变(Higuchi,in"PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification'',Stockton Press,NewYork,pp.61-70(1989))。重叠-延伸PCR技术(Higuchi,ibid.)也可用于将任何所需突变引入目标序列(起始DNA)。例如，重叠-延伸方法的第一轮PCR涉及使用外引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)的目标序列的扩增，并分别使用第二外引物(引物4)和内引物(引物2)，产生两个PCR片段(片段A和B)。内部诱变引物(引物3)被设计为包含与目标序列的错配，特异于所需的突变。在第二轮PCR中，第一轮PCR的产物(片段A和B)使用两个外引物(引物1和4)通过PCR被扩增。用限制性内切酶消化产生的全长的PCR片段(C段)并将得到的限制性片段克隆到一个合适的载体上。作为诱变的第一步骤，将起始DNA(例如，编码Fc融合蛋白、抗体或仅Fc区域)可操作的克隆到诱变载体中。引物被设计为反应所需的氨基酸取代。其他用于产生变体Fc区域的方法在本领域是已知的(参见，例如，美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745；6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375；美国专利公开号2004/0002587和PCT公开号WO94/29351、WO99/58572、WO00/42072、WO02/060919、WO04/029207、WO04/099249、WO04/063351)。
在一些实施例中，Fc变体蛋白包括一个或多个工程糖链异质体(glycoforms)，例如，与包括Fc区域的分子共价连接的碳水化合物组合物。工程糖链异质体可用于多种目的，包括但不局限于，提高或降低效应物功能。可通过本领域技术人员已知的任何方法产生工程糖链异质体，例如通过使用工程的或变异表达的菌株，通过与一种或多种酶的共表达，例如DI N-乙酰氦基葡萄糖转移酶III(GnTI11)，通过在各种生物体或各种生物的细胞株中表达包括Fc区域的分子，或通过在包括Fc区域的分子被表达后使碳水化合物修饰。用于产生工程糖链异质体的方法在本领域是已知的，其包括但不局限于在下列文章中描述的，Umana等,1999,Nat.Biotechnol17:176-180；Davies等,20017Biotechnol Bioeng74:288-294；Shields等,2002,J Biol Chem277:26733-26740；Shinkawa等,2003,JBiol Chem278:3466-3473)；U.S.Pat.No.6,602,684；U.S.Ser.No.10/277,370；U.S.Ser.No.10/113,929；PCT WO00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO02/311140A1；PCT WO02/30954A1；PotillegentTM技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。参见，例如，WO00061739；EA01229125；US20030115614；Okazaki等,2004,JMB,336:1239-49。
实施例
本发明参考以下实施例进行说明。这些实施例仅用于说明且本发明绝不应局限于这些实施例解释，而应包括解释为包括任何和所有变化，其成为本文中提供的研究结果的证据。
实施例1：抗IL-6抗体分离
在PCT公开号WO2008/065378的申请中提供了抗体18和其他本文中描述的可以用于本发明的抗IL-6抗体的分离的详细描述。简言之，使用重组人IL-6作为目标通过噬菌体展示库筛选将抗体18的前体分离。使前体经过亲和性优化以产生几种高亲和性人抗IL-6抗体。在PCT公开号WO2008/065378的申请中描述了这些抗体的特征。抗体18能够阻断IL-6与IL-6R结合。抗体18与人和猕猴IL-6结合，但不与源于鼠的(大鼠)或狗的IL-6结合。抗体18与人IL-6的亲和性高于BIAcore检测的10pM检测水平。使用TF-1细胞增殖试验估计抗体18与人IL-6的亲和性为0.40pM(95％CI0.12pM–0.69pM)。
实施例2：具有延长的半衰期的抗IL-6抗体
2.1包括具有M252Y、S254T和T256E取代的Fc区域的变体抗IL-6IgG1抗体的产生
使用标准实验方法将编码抗体18的表达载体修饰以将M252Y、S254T和T256E取代引入到Fc区域。包括M252Y、S254T和T256E取代的修饰抗体18以下简称为抗体18E或18E。
编码抗IL6抗体重链和轻链的多核苷酸可能经过核酸序列优化。序列优化过程的最终目标是创建编码区，其能尽可能高效率地转录和翻译。序列优化通过以下步骤的组合完成：(i)优化密码子选择；(ii)适配G/C含量；(iii)去除内部的剪接位点和过早的聚腺苷酸化位点；(iv)破坏稳定的RNA二级结构；(v)去除同向重复序列；(vi)去除可能形成具有宿主细胞转录物的稳定双链RNA的序列；(vii)去除宿主细胞微RNA靶向的序列；(viii)引入RNA稳定信号和RNA易位信号。详细的序列优化方法在WO2004059556A2、WO2006015789A2和Bradel-Tretheway等,J.Virol.Methods111:145-56(2003),Valencik&McDonald,Transgenic Res.3:269-75(2001)中描述。可选地，可通过商业供应商(例如，GENEART公司)优化序列。
编码抗体18E的VH、VL、重链和轻链的核苷酸序列通过以下本文所述方法进行优化。优化的编码抗体18E的VH、VL、重链和轻链的核苷酸序列分别公开为SEQ ID NO:11-14。
抗体18E被包括全长18E抗体的编码区域的表达载体转染，在CHO-K1细胞中稳定表达。使用标准实验方法将抗体18E从上清液中纯化。
2.2包括具有M252Y、S254T和T256E取代的Fc区域的变体抗IL-6IgG1抗体的体外表征
抗体18E包括具有M252Y、S254T和T256E取代的Fc区域。使用ELISA检测确定抗体18E的Fc区域存在M252Y、S254T和T256E取代。该试验用作捕获试剂两个单克隆抗体，其与包括M252Y、S254T和T256E取代的Fc多肽特异性结合，但不与相应的野生型多肽结合。根据标准规定进行ELISA检测。图1示出了得到的特异性单克隆抗体取代的ELISA滴定曲线。在ELISA检测中通过特异于M252Y、S254T和T256EFc区域取代的抗体获取抗体18E，而不是抗体18。因此，抗体18包括具有M252Y、S254T和T256E取代的Fc区域。
包括M252Y、S254T和T256E取代的Fc多肽相比较于野生型Fc多肽，在pH值为6时，具有与FcRn增加的亲合力。使用BIAcore检测测定纯化的抗体18和抗体18E的FcRn亲合力。根据标准规定进行该检测。相比于抗体18，抗体18E在pH值为6时以明显更高的亲合力与人和猕猴FcRn结合。表1示出了通过BIAcore测定的Kd值。
表1抗体18和18E的FcRn亲合力
抗体 KD人FcRn(nM) KD猕猴FcRn(nM)
18 2610 1160
18E 226 365
抗体18和18E以基本上相同的亲和性与IL-6结合。通过ELISA检测确定抗体18和18E的IL-6亲合力。大肠杆菌表达的重组人IL-6制剂被用作捕获试剂。根据标准规定进行ELISA检测。除了抗体18和18E，在该检测中还包括两个竞争剂抗IL-6抗体(AB A和AB B)作为阳性对照。图2示出了所获得的实施例数据。抗体18和18E的EC50值分别为6.1pM和6.5pM。
抗体18和18E抑制IL-6诱导的TF-1细胞以基本上相同的功效扩增。大体上如本文所述进行IL-6诱导的TF-1细胞增殖试验。除了抗体18和18E，在该试验中还包括两个竞争剂抗IL-6抗体(AB A和AB B)作为阳性对照。图3中示出了代表性数据。计算的抗体18和18E的IC50分别为4.5pM和5.2pM。
抗体18和18E抑制内源性IL-6诱导的VEGF以基本上相同的功效从人类滑膜成纤维细胞中释放。大体上如本文所述进行该试验。除了抗体18和18E，在该试验中还包括两个竞争剂抗IL-6抗体(AB A和AB B)作为阳性对照。图4中示出了代表性数据。计算的抗体18和18E的IC50分别为1.3pM和1.2pM。
2.3包括具有M252Y、S254T和T256E取代的Fc区域的变体抗IL-6IgG1抗体的体内表征
在猕猴中进行单剂量药物动力学药效学研究，以确定抗体18和18E的血清半衰期和清除率。表2中概述了研究设计。
表2单剂量药物动力学实验的研究设计
组 治疗 剂量(mg/kg) 给药途径 数量
1 18 5 静脉注射 3个雄性动物
2 18 5 皮下给药 3个雄性动物
3 18E 5 静脉注射 3个雄性动物
4 18E 5 皮下给药 3个雄性动物
5 18E 50 皮下给药 3个雄性动物
用于猕猴血浆中抗体18或抗体18E定量的IL-6抗原捕获PK试验(ECL)：将MA240096孔板涂有2.5g/ml重组人IL-6(R&D系统)，在2至8℃下过夜，用含有0.05％吐温20的PBS洗涤，并在室温下使用I-模块缓冲区(Tropix)封闭1至2小时。在1％猕猴血浆中制备抗体18和抗体18E标准曲线、质量控制(QC)和测试样品稀释液并在室温下添加到封锁板1小时。如上洗涤板并在1μg/ml MSD-TAG(钌)-标记的-羊抗人类IgG(H+L)侯吸附检测抗体(结合位点)下再培养一个小时。通过洗涤去除未结合的检测抗体并将150ml1X Read Buffer T(MSD)添加到板孔。MSD扇形成像仪2400将板立即读数，且使用该板的标准曲线定量每孔中QC和检测样品稀释液的抗体18和抗体18E浓度。通过绘制标准曲线和Softmax Pro GxP软件(Molecular Devices)下合适的两坐标轴对数曲线的ECL信号进行所有分析。抗体18和抗体18E定量的测定范围是100％血浆中10,000至13.7ng/ml(10至0.0137μg/ml)。
PK数据分析：根据MedImmune标准操作程序，使用WinNonlin专业版(version5.2,Pharsight Corp.,Mountain View,CA)对源于所有动物的个体PK数据进行非间隔毒理动力学分析。
图5和图6示出了所获得的结果。图5示出了皮下或静脉给药单独的5mg/ml抗体剂量后随时间变化的抗体18和18E的血药浓度。抗体18和18E都显示线性PK分布图。在皮下或静脉给药后抗体18的血清半衰期分别约为8.5天至9.1天。在皮下或静脉给药后抗体18E的血清半衰期分别约为28.4天至28.8天。在皮下或静脉给药后抗体18的清除率分别约为12.1ml/天/kg和13.1ml/天/kg。在皮下或静脉给药后抗体18E的清除率分别约为2.8ml/天/kg和3.0ml/天/kg。皮下给药抗体18和18E的生物利用率分别为94％和96％。
图6示出了皮下给药单独的5mg/ml抗体剂量后随时间变化的抗体18和18E的血药浓度。图6还示出了皮下给药单独的5mg/ml剂量的抗体18或18E后动物中检测的总的血清IL-6浓度。IL-6总水平上升约基线3倍对数。使用抗体18E观察到总IL-6更多的累积。总IL-6水平的下降大约平行于PK的下降。
2.3通过皮下给药抗IL-6抗体血浆游离IL-6中和作用的模型
在健康动物中游离IL-6浓度很低处于基线。因此将更难通过游离IL-6水平，估计给药抗IL-6抗体后目标中和作用。我们开发了SAAM II软件包中的PK/PD模型，使用总IL-6作为PD标记预测关于抗体PK的游离IL-6中和作用的动力学。PK/PD模型描述了抗体、游离IL-6、IL-6和抗体组合物、可溶性受体及IL-6与可溶性受体组合物的动力学。开发的模型充分地描述了产生于猴子研究的抗体PK和总IL-6动力学，并用于模拟使用标准异速所发假设的不同治疗方案后人类RA患者的PK/PD时间分布图。基于类风湿性关节炎患者中检测的血清游离IL-6浓度确定人血浆中游离IL-6水平的90％抑制水平(Uson等,J.of Rheumatology(1997)24(11)2069-75)。
图7-10和表3示出了PD模型的结果。该模型预测游离IL-6(例如，不与sIL-6R或IL-6R结合)持续的至少90％抑制作用可能根据一些给药方案通过给药抗体18E实现：
每8周皮下给药100mg抗体18E；
每4周皮下给药50mg抗体18E；
递送单负荷剂量的200mg抗体18E后每8周皮下给药100mg抗体18E；并且
递送单负荷剂量的100mg抗体18E后每4周皮下给药50mg抗体18E。
该模型进一步预测类似水平的游离血清IL-6的持续抑制作用将需要更频繁和/或更大剂量的抗体18。例如，游离IL-6(例如，不与sIL-6R或IL-6R结合)的持续的至少90％抑制作用可能通过每2周皮下给药100mg抗体18实现。
表3血浆游离IL-6中和作用模型的结果概括
这些结果表明了抗IL-6抗体抑制体内IL-6的全身效应的能力。然而，上述的本发明的特定实施例仅用于说明，本领域技术人员将会理解的是，在不脱离如附属权利要求中所述的本发明的范围内，可以实现多种变化。
实施例3：小鼠FCA诱导的炎症痛模型中的疗效
在小鼠尾部(尾巴末端3cm处)，检测mAb406(抗小鼠IL-6,纯化于单克隆IgG1,克隆MP5-20F3,lot AHV100904A,R&D系统)的逆转炎症痛的能力，所述炎症痛是由局部皮下给药Freund完全佐剂(“FCA”)(20μl)诱导的。该物质产生了随着时间的推移的局部炎症反应，并在给药后24小时和48小时之间达到平衡。引发的炎症使尾巴产生对热或机械刺激的过敏性。通过记录在热刺激下(温水，46℃)尾巴的撤出延迟估计热痛觉过敏，而通过测痛仪(analgesymeter)(Randall Selitto apparatus)产生的稳定增加压力下尾巴的撤出临界估计机械性痛觉过敏。在FCA治疗后6小时腹腔内给药(ip)IgG1同型对照(mAb005,纯化于小鼠单克隆IgG1,克隆43414,lot CAN04904A,购买于R&D系统)和mAb406。引出了表面炎症反应的证据，其包括增加的细胞因子水平、一氧化氮产生和对轻度伤害性刺激的过敏性。起始研究估计了mAb406的单剂量(20mg/kg)。此剂量在热痛觉过敏试验中的24和48小时产生了50％E-max(见图11)，并在机械性痛觉过敏中的24和48小时产生了40％逆转(见图12)。这些动物中IL-6全身血浆水平的体外分布图说明所有的IL-6已被中和。随后，估计不同剂量的mAb406(和高剂量IgG1对照)以表征关于疼痛抑制和痛觉过敏逆转的疗效和IL-6中和作用。使用相同实验示例剂量(范围为1至20mg/kg)，在24小时和48小时检测热和机械性痛觉过敏的ip。图13示出了热痛觉过敏是剂量依赖型的，在24小时抗IL6的治疗使其逆转，且在48小时得到相似结果。在第二次研究中E-max是64％逆转的，其略高于上面得到的逆转。图15和图16分别示出了在24小时和48小时机械性痛觉过敏的结果。在48小时观察的再次剂量依赖型逆转，达到91％E-max，其高于第一次研究中得到的逆转。在任何检测剂量和任何研究中都未观察到副作用。总体而言，mAb406的体内疗效和相同模型中的基准测试小分子化合物甲氧萘丙酸相当或比其高(见图17甲氧萘丙酸的热过敏性和图18甲氧萘丙酸的机械压力过敏性)。
在本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请的内容在相同程度上通过引用并入本说明书，如每个个体公开、专利和专利申请是特定并单独说明通过引用并入本文。
材料与方法
通过纯化的scFv和IgG抑制IL-6诱导的TF-1细胞增殖
TF-1细胞是从R&D系统获得的并根据供应规定保存。试验介质包括RPMI-1640和GLUTAMAX I(Invitrogen)，其含有5％胎牛血清(JRH)和1％丙酮酸钠(Sigma)。在每个试验之前，TF-1细胞在300xg离心沉淀5分钟，通过抽吸和在试验介质中的细胞重新悬浮去除介质。这个过程和细胞重新悬浮重复两次，在试验介质中的最终浓度为5x105细胞/ml。将细胞以100μl/孔接种于96孔检测板。平板在37℃和5％CO2下培养24小时使GM-CSF细胞缺失。将纯化的scFv或IgG检测溶液(一式两份)稀释到试验介质所需浓度。使用不直接作用于IL-6的无关抗体作为阴性对照。将重组细菌衍生的人类(R&D)和猕猴(本身的)IL-6添加到最终浓度20pM(人IL-6)或100pM(猕猴)，与适当的检测抗体混合，总体积为100μl/孔。选择本试验中使用的IL-6浓度作为约80％最大增殖反应的最终试验浓度的记录。所有样品在室温下培养30分钟。然后将100μlIL-6和抗体混合物添加到100μl细胞中以得到200μl/孔的总试验体积。平板在37℃和5％CO2下培养24小时，然后想每个检测点中添加20μl氚标记胸腺嘧啶核苷(5μCi/ml)，并将板再培养24小时。使用细胞采集装置在玻璃纤维过滤板(Perkin Elmer)上收集细胞。使用Packard TopCount微孔板液体闪烁计数器测定氚标记胸腺嘧啶核苷。然后使用Graphpad Prism软件分析数据。
通过纯化的scFv和IgG抑制内源性IL-6诱导的VEGF从人滑膜成纤维细胞释放
在含有抗生素的DMEM中获取源于全关节置换手术的类风湿关节炎的膝盖样品。将浸透在介质中的滑膜从关节分离并细致地切割。用添加10％FCS的介质洗涤滑膜组织。细胞悬浮液在37℃的二氧化碳培养箱中在胶原酶溶液中培养2小时。通过10ml移液管的重复抽吸、室温下400g细胞过滤和离心5分钟使消化的滑膜细胞悬液断裂。在含有10％FCS的DMEM中重新悬浮细胞，并通过细胞滤网，调整到1x106细胞/ml，并在37℃的二氧化碳培养箱中在225cm2细胞培养瓶中培养(3001,CoStarCorning Inc.)。在吸附后，多数介质被丢弃，替换为新鲜的介质并恢复到培养箱中拥有长期培养。每周一次的基础上检测细胞并在1到3代通过胰蛋白酶化作用传代合流。
通过37℃下每个烧瓶用10mL0.1％胰酶-EDTA溶液(25300-054,Gibco Life Sciences)培养5至10分钟将融合的成纤维细胞(P3-5)从烧瓶中移除。将等体积添加10％FCS的DMEM培养基添加到细胞中，然后在室温下330g离心沉淀5分钟。在用添加10％FCS的DMEM培养基的洗涤步骤后，将细胞悬浮液(1x105细胞/mL)添加到(每孔150μL)无菌96孔细胞培养集群平底聚苯乙烯板(3598,Corning CoStar)的孔中1.5x104细胞/孔。将额外的添加10％FCS的DMEM培养基添加到每个孔中(每孔100μL)以达到每孔的总体积250μL。37℃下过夜培养细胞以允许粘附并静止。
检查96孔板以确保细胞融合并状况良好(例如，无污染)。然后从孔中吸出介质并立即添加100μL添加10％FCS的DMEM培养基。对此，将50μL含有样品IgG或只有介质的添加10％FCS的DMEM培养基添加到孔中(检测中从1稀释到5)。
其次，每孔加入50μL含有重组人可溶性(rhs)IL-6Rα(500ng/mL；12nM)和rhIL-1β(50pg/mL；2.95pM、检测中从1稀释到5)的添加10％FCS的DMEM培养基。
在各别的孔中，加入50μL含有rh-IL-6(0,100ng/mL；21.5nM)、sIL-6Rα(500ng/mL；12nM)、rhIL-1β(50pg/mL；2.95pM)、或只有介质的添加10％FCS的DMEM培养基(检测中从1稀释到5)。每个孔的最终体积为250μL。
平板在37℃下培养48小时。在两个或三个孔中进行培养。在室温下330g离心板5分钟，并去除悬浮介质，在–40℃微量平底板(611F96，Sterilin)中冷冻。
根据制造说明使用ELISA(DY293B,R&D Systems)测量VEGF。简言之，涂有小鼠抗人类VEGF抗体的酶标板在4℃过夜并用BSA/PBS封闭。用0.05％吐温20/PBS洗涤板并与人关节滑膜成纤维细胞和生物素化山羊抗人VEGF抗体的培养悬浮物在室温下过夜培养。在清洗后，使用链霉亲和素辣根过氧化物酶检测VEGF。使用1:1的过氧化氢：四甲基联苯胺使板显影。2M H2SO4停止反应，并用540nm校正波长在450nm测定光密度。
总血浆IL-6水平的测定
根据制造商的建议使用MilliplexTM MAP试剂盒(MPXHCYTO60K)测定总IL-6。检测试剂盒提供了所有必需的试剂。简言之，试验过滤板是200μL试验缓冲液且通过真空去除液体。将以下各种试剂加入25μL/孔的板中：(a)试验缓冲液；(b)血浆样品、标准或QC；(c)与检测基质中抗IL-6捕获抗体共轭的微珠。最终检测体积为75μl且最终检测基质为25％IL-6的耗尽的正常猕猴EDTA血浆中的133.3μg/ml候选药物(抗体18或抗体18E)。将板密封并在4℃过夜培养。在使用洗涤缓冲液洗涤两次后，加入25μl/孔的生物素化抗IL-6检测抗体。培养30分钟后，将25μl/孔的SA-PE加入孔中并使板额外培养30分种。洗涤板两次且微珠重新悬浮于150μl/孔的Luminex Sheath Fluid。通过Luminex200酶标仪测定微珠荧光强度。因为存在抗体18或抗体18E时，捕获和检测抗IL-6抗体能与IL-6结合，荧光强度与样品中的总IL-6浓度成正比。通过使用BeadView软件(Upstate Cell Signaling Solutions)绘制的标准曲线推测IL-6浓度。在100％猕猴血浆中IL-6的检测范围是1.8pg/ml至5769pg/ml。
本说明书任何地方引用的所有参考文献，包括以上任何地方引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。
序列表
SEQ ID NO:1；Ab18VH CDR1
SNYMI
SEQ ID NO:2；Ab18VH CDR2
DLYYYAGDTYYADSVKG
SEQ ID NO:3；Ab18VH CDR3
WADDHPPWIDL
SEQ ID NO:4；Ab18VL CDR1
RASQGISSWLA
SEQ ID NO:5Ab18VL CDR2
KASTLES
SEQ ID NO:6Ab18VL CDR3.
QQSWLGGS
SEQ ID NO:7Ab18VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSNYMIWVRQAPGKGLEWVSDLYYYAGDTYYADSVKGRFTMSRDISKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARWADDHPPWIDLWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO:8Ab18VL
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKVLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSWLGGSFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:9Ab18E HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSNYMIWVRQAPGKGLEWVSDLYYYAGDTYYADSVKGRFTMSRDISKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARWADDHPPWIDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10Ab18E LC
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKVLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSWLGGSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:11Ab18优化的VH
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGCGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCATCTCCTCCAACTACATGATTTGGGTCCGCCAGGCACCTGGCAAGGGGCTCGAGTGGGTGTCCGACCTGTACTACTACGCCGGCGACACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATGTCCAGGGACATCTCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATGGGCCGACGACCACCCTCCTTGGATCGACCTGTGGGGCAGGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCC
SEQ ID NO:12Ab18优化的VL
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCAGCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCTCCCAGGGCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACAAGGCCAGCACCCTGGAGTCCGGCGTGCCTTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTGGCTGGGCGGCTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:13Ab18E优化的HC
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGCGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCATCTCCTCCAACTACATGATTTGGGTCCGCCAGGCACCTGGCAAGGGGCTCGAGTGGGTGTCCGACCTGTACTACTACGCCGGCGACACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATGTCCAGGGACATCTCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATGGGCCGACGACCACCCTCCTTGGATCGACCTGTGGGGCAGGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCTCCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGTACATCACCAGGGAGCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAG
SEQ ID NO:14Ab18E优化的LC
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCAGCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCTCCCAGGGCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACAAGGCCAGCACCCTGGAGTCCGGCGTGCCTTCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTGGCTGGGCGGCTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO:15人IL-6
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
SEQ ID NO:16成人IL-6
VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
SEQ ID NO:17sIL-6Ra
MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQD
SEQ ID NO:18IL-6Ra的跨膜结构域
MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR
SEQ ID NO:19Gp130
MLTLQTWLVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNFTDVSVVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ

Claims (20)

1.一种与IL-6特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含SEQID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
2.编码权利要求1的氨基酸序列的分离的核酸。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸含有SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的核酸。
5.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求4所述的载体。
6.一种分离的细胞系，其特征在于，所述细胞系表达权利要求1所述的抗体。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有在药学上可接受的载体中的权利要求1的抗体。
8.抗-IL6-抗体在制备治疗和/或预防人的疼痛用的药物中的用途，其中，所述抗-IL6-抗体含有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
9.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述疼痛与炎症和/或自身免疫性疾病有关，或由炎症和/或自身免疫性疾病引发。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述炎症和/或自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、骨性关节炎，恶病质，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、幼年特发性关节炎，哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠道疾病、克罗恩病，溃疡性结肠炎和动脉粥样硬化。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述炎症和/或自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮、骨关节炎或类风湿性关节炎。
12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疼痛与升高的IL-6水平有关或由其引发。
13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疼痛与以下疾病有关或由其引发：关节强硬性脊椎柱炎、炎性腰背部疼痛，神经病变，痛风，神经瘤，纤维肌痛，急性和/或慢性头痛，偏头痛，胰腺炎，脊神经受压，非恶性骨骼疼痛或癌症。
14.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疼痛与伤口、医疗过程、手术、外伤或创伤相关或由其引起。
15.如权利要求8所述的用途，其特征在于，在所述人接受伤口、医疗过程、手术、外伤或创伤前给予所述抗体。
16.如权利要求8所述的用途，其特征在于，血清中至少90％的游离IL-6被中和。
17.如权利要求8所述的用途，其特征在于，在靶组织中至少90％的IL-6介导的信号转导被抑制。
18.抗-IL6-抗体在制备治疗或预防人的抑郁症用的药物中的用途，其中，所述抗-IL6-抗体含有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述抑郁症是重度抑郁症。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述抗体与抗抑郁药药一同给予。
CN201410349897.9A 2009-01-29 2010-01-29 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用 Pending CN104119438A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14810609P 2009-01-29 2009-01-29
US61/148,106 2009-01-29
US18418209P 2009-06-04 2009-06-04
US61/184,182 2009-06-04

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800103915A Division CN102387814A (zh) 2009-01-29 2010-01-29 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104119438A true CN104119438A (zh) 2014-10-29

Family

ID=42396023

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800103915A Pending CN102387814A (zh) 2009-01-29 2010-01-29 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用
CN201410349897.9A Pending CN104119438A (zh) 2009-01-29 2010-01-29 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800103915A Pending CN102387814A (zh) 2009-01-29 2010-01-29 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用

Country Status (14)

Country Link
US (3) US20120034212A1 (zh)
EP (1) EP2391384A4 (zh)
JP (3) JP2012516158A (zh)
KR (1) KR20110108398A (zh)
CN (2) CN102387814A (zh)
AU (1) AU2010208125B2 (zh)
BR (1) BRPI1007005A2 (zh)
CA (1) CA2749200A1 (zh)
HK (1) HK1201847A1 (zh)
MX (1) MX337590B (zh)
RU (2) RU2650594C1 (zh)
SG (3) SG10201704214VA (zh)
WO (1) WO2010088444A1 (zh)
ZA (2) ZA201104796B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057152A (zh) * 2019-12-11 2020-04-24 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-6Ra单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200831528A (en) 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
BRPI1007005A2 (pt) * 2009-01-29 2016-03-22 Medimmune Llc anticorpo isolado , ácido nucleico isolado n vetor, célula isolada , linhagem de célula isolada , composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo anti-il-6
US9265834B2 (en) 2009-03-05 2016-02-23 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
WO2010100135A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
PT2473528E (pt) * 2009-09-03 2015-03-04 Ablynx Nv Formulações estáveis de polipéptidos e seus usos
EP2640745B1 (en) * 2010-09-10 2018-11-07 MedImmune Limited Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
WO2012083370A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
MY190604A (en) 2011-02-10 2022-04-27 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
WO2012118813A2 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Apexigen, Inc. Anti-il-6 receptor antibodies and methods of use
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA2850322C (en) * 2011-09-30 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
WO2013047752A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 抗原の消失を促進する抗原結合分子
TWI617577B (zh) 2012-02-24 2018-03-11 中外製藥股份有限公司 經ＦｃγＲＩＩＢ促進抗原消失之抗原結合分子
WO2013175276A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
EP2722341B1 (en) * 2012-10-22 2017-12-06 Fountain Biopharma Inc. Antibodies to interleukin-6 and uses thereof
WO2014066468A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Medimmune, Llc Stable, low viscosity antibody formulation
US10772940B1 (en) * 2012-12-11 2020-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Cocaine hydrolase-FC fusion proteins for cocaine and methods for utilizing the same
EP2931749B1 (fr) * 2012-12-17 2019-04-24 Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Societe Anonyme Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
FR2999431B1 (fr) * 2012-12-17 2016-03-18 Lfb Biotechnologies Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
KR102101987B1 (ko) * 2013-10-31 2020-04-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 중화 항체를 검출하기 위한 경합 리간드 결합 분석
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
JP6594438B2 (ja) 2014-11-07 2019-10-23 セセン バイオ， インコーポレイテッド 改善されたｉｌ−６抗体
WO2017023699A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Medimmune Limited Methods for treating hepcidin-mediated disorders
BR112018017031A2 (pt) 2016-02-23 2019-01-22 Sesen Bio Inc formulações de antagonista de il-6 e usos das mesmas
EP3440108A4 (en) * 2016-04-07 2020-01-08 Janssen Biotech, Inc. TREATMENT OF DEPRESSION USING AGENTS THAT BLOCK THE LINKAGE OF IL-6 TO THE IL-6 RECEPTOR
WO2018144773A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Yale University Treatment of diuretic resistance
AU2019205936B2 (en) * 2018-01-05 2022-09-15 Novo Nordisk A/S Methods for treating IL-6 mediated inflammation without immunosuppression
WO2020023644A2 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Medimmune, Llc Antibody directed against s. aureus clumping factor a (clfa)
TW202035443A (zh) 2018-10-09 2020-10-01 美商麥迪紐有限責任公司 抗金黃色葡萄球菌抗體的組合
WO2020076790A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 Medimmune, Llc Antibodies directed against staphylococcus aureus leukotoxins
WO2020185986A1 (en) 2019-03-13 2020-09-17 Medimmune, Llc Decreasing staphylococcus aureus infections in colonized patients
JP2022531331A (ja) 2019-05-01 2022-07-06 ノヴォ ノルディスク アー／エス 抗ｉｌ－６抗体製剤
WO2021136841A2 (fr) * 2019-12-31 2021-07-08 Peptinov Composition pharmaceutique pour la prevention ou le traitement des douleurs post-operatoires
WO2021186398A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Medimmune Limited Anti-klebsiella pneumoniae antibodies and uses thereof
MX2022014422A (es) 2020-05-17 2022-12-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticuerpos contra el sars-cov-2 y metodos de seleccion y uso de los mismos.
AR122933A1 (es) 2020-07-10 2022-10-19 Novo Nordisk As Métodos para tratar la enfermedad cardiovascular
BR112023002234A2 (pt) 2020-08-10 2023-03-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticorpos sars-cov-2 para tratamento e prevenção de covid-19
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
TW202342510A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
WO2024073718A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Sonnet BioTherapeutics, Inc. Low dose il-6 formulations and methods of use thereof

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE383875T1 (de) * 1998-03-17 2008-02-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Prophylaktische oder therapeutische mittel gegen entzündliche erkrankungen des verdauungstraktes enthaltend antagonistische il-6 rezeptor antikörper
ATE489395T1 (de) * 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US7658921B2 (en) * 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7291721B2 (en) * 2001-11-14 2007-11-06 Centocor, Inc. Anti-IL-6 antibodies, compositions, methods and uses
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
PL1610820T5 (pl) * 2003-04-04 2014-01-31 Genentech Inc Preparaty zawierające wysokoskoncentrowane przeciwciała i białka
US20060115485A1 (en) * 2004-10-29 2006-06-01 Medimmune, Inc. Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions
PE20061324A1 (es) * 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
WO2006130834A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
CA2614181A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Medimmune, Inc. An integrated approach for generating multidomain protein therapeutics
JP2009525986A (ja) * 2006-02-03 2009-07-16 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
JP2009529339A (ja) * 2006-03-13 2009-08-20 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６を標的とするアミノ酸配列およびそれを含みｉｌ−６介在シグナル伝達に関連する疾患および疾病を治療するポリペプチド
TW200831528A (en) * 2006-11-30 2008-08-01 Astrazeneca Ab Compounds
JP5419709B2 (ja) * 2007-01-09 2014-02-19 ワイス・エルエルシー 抗ｉｌ−１３抗体製剤およびその使用
CN101861168B (zh) * 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
MX2009012492A (es) * 2007-05-21 2010-01-20 Alder Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos para il-6 y sus usos.
US7951368B2 (en) * 2007-06-25 2011-05-31 Amgen Inc. Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor
CN101687919A (zh) * 2007-06-26 2010-03-31 米迪缪尼有限公司 治疗rsv感染和相关病症的方法
BRPI1007005A2 (pt) * 2009-01-29 2016-03-22 Medimmune Llc anticorpo isolado , ácido nucleico isolado n vetor, célula isolada , linhagem de célula isolada , composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo anti-il-6

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057152A (zh) * 2019-12-11 2020-04-24 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-6Ra单克隆抗体及其应用
CN111057152B (zh) * 2019-12-11 2022-03-11 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-6Ra单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2749200A1 (en) 2010-08-05
BRPI1007005A2 (pt) 2016-03-22
SG172354A1 (en) 2011-07-28
WO2010088444A1 (en) 2010-08-05
HK1201847A1 (zh) 2015-09-11
MX2011007832A (es) 2011-10-06
KR20110108398A (ko) 2011-10-05
JP2012516158A (ja) 2012-07-19
JP2017206519A (ja) 2017-11-24
SG10201704214VA (en) 2017-06-29
AU2010208125A1 (en) 2011-07-21
AU2010208125B2 (en) 2015-02-12
RU2650594C1 (ru) 2018-04-17
RU2011135422A (ru) 2013-03-10
SG2014007637A (en) 2014-03-28
EP2391384A4 (en) 2012-12-26
US20140302058A1 (en) 2014-10-09
ZA201207249B (en) 2013-08-28
ZA201104796B (en) 2018-11-28
JP2016019517A (ja) 2016-02-04
US20120034212A1 (en) 2012-02-09
EP2391384A1 (en) 2011-12-07
CN102387814A (zh) 2012-03-21
US20170101468A1 (en) 2017-04-13
MX337590B (es) 2016-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104119438A (zh) 延长体内半衰期的人抗il-6抗体及其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和炎症性疾病中的应用
JP7030689B2 (ja) 抗ｉｌ－２抗体ならびにその組成物及び使用
US10287365B2 (en) Anti-GD2 antibodies
AU2014203248B2 (en) BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-4 RECEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
ES2618550T3 (es) Anticuerpos anti-IL-6 humana
RU2555532C2 (ru) Члены связывания против il-1r1
US10167341B2 (en) High affinity anti-GD2 antibodies
JP2014523745A (ja) 抗ｃｘｃｒ４抗体及び使用方法
AU2009329348A1 (en) Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Ra) - 836
AU2015202502A1 (en) Human anti-il-6 antibodies with extended in vivo half-life and their use in treatment of oncology, autoimmune diseases and inflammatory diseases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1201847

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20141029

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1201847

Country of ref document: HK