MX2011007832A

MX2011007832A - Anticuerpos anti il-6 humanos, con semivida in vivo prolongada y su uso en el tratamiento de oncologia, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.

Info

Publication number: MX2011007832A
Application number: MX2011007832A
Authority: MX
Inventors: Michael Bowen; Bahija Jallal; Peter Kiener; Herren Wu; William Dall Acqua; Anthony Coyle
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2011-10-06
Also published as: JP2016019517A; BRPI1007005A2; EP2391384A1; US20170101468A1; US20140302058A1; ZA201207249B; CN104119438A; WO2010088444A1; AU2010208125A1; MX337590B; SG2014007637A; RU2650594C1; US20120034212A1; SG172354A1; CA2749200A1; JP2012516158A; HK1201847A1; RU2011135422A; EP2391384A4; AU2010208125B2

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-6 humanos con semivida in vivo prolongada. La invención se relaciona adicionalmente con composiciones farmacéuticas, composiciones terapéuticas y métodos que usan anticuerpos terapéuticos que se unen a IL-6 y que tiene semivida in vivo prolongada para el tratamiento y prevención de enfermedades y trastornos mediados por IL-6, tales como, pero sin limitarse a, enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos autoinmunes y tumores.

Description

ANTICUERPOS ANTI IL-6 HUMANOS, CON SEMIVIDA IN VIVO PROLONGADA Y SU USO EN EL TRATAMIENTO DE ONCOLOGIA, ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Campo de la invención Esta invención se refiere a molécul3as de anticuerpo anti-IL-6 que inhiben los efectos biológicos de la IL-6 y tienen una semivida in vivo prolongada. Los anticuerpos anti-IL-6 son útiles para el tratamiento de trastornos asociados con la IL-6, incluyendo trastornos inflamatorios, trastornos autoinmunes, tumores y depresión.

Antecedentes de la invención La interleucina 6 (IL-6) es una citocina proinflamatoria pleiotrópica de 26kDa producida por una variedad de tipos celulares, incluyendo fibroblastos estimulados, monocitos y células endoteliales que forman la fuente principal de IL-6 in vivo. Las células tales como células T, células B, macrófagos, queratinocitos , osteoblastos y varios otros pueden producir IL-6 si se los estimula. La IL-6 también se expresa a partir de líneas celulares tumorales y células tumorales, por ej . , células de carcinoma de pulmón, cáncer de próstata, mieloma, hipernefroma y mixoma cardíaco (Kishimoto, T. , (1989) Blood 74:1-10; Smith P.C. et al. (2001) Cytokine and Growth factor Ref.: 221428 Reviews 12:33-40) . En condiciones no inflamatorias, la IL-6 es secretada desde el tejido adiposo (Wallenius et al., (2002) Nat . Med. 8 : 75) .

Para iniciar la señalización celular, IL-6 se une con baja afinidad a un receptor transmembrana, receptor de IL-6 alfa (también llamado IL-6R , IL-6Ra, IL-6R, gp80 o CD126) para formar un complejo "IL-6 : IL-6Ra" . Este complejo se une al receptor de señal gpl30; IL-6Ro¡ y gpl30 juntos forman un sitio de unión a IL-6 de alta afinidad e inducen la formación de un hexámero compuesto por dos copias cada uno de IL-6, IL-6Ra y gpl30 (Somers, W. , et al (1997) 1.9 E BO J. 16:989-997) . Los dominios transmembrana y citoplásmico de IL-6Ra no son necesarios para la transduccion de señales, ya que IL-6Ra también existe como una forma soluble secretada (sIL-6R o sIL-6Ra) . El receptor soluble se produce ya sea por empalme diferencial del mensaje IL-6Ra o por eliminación proteolítica. sIL-6R es capaz de formar un complejo ligando-receptor con IL-6, "IL-6 : sIL-6Ra" . Este complejo se puede unir a gpl30 en células y así iniciar la señalización celular en células positivas de gpl30, incluso si esas células no expresan iL-6Ra. Por lo tanto, SIL-6R tiene el potencial de ampliar el repertorio de células que son sensibles a IL-6 y se cree que juega un papel importante en la inflamación mediada por IL-6 (Jones, S. A et al. (2001) FASEB J. 15:43-58) .

Se ha aclarado una estructura cristalina del ligando de IL-6 humana (Somers, W. , et al (1997) 1.9 EMBO J. 16:989-997) . También se han resuelto la estructura cristalina del dominio extracelular de IL-6Ra humana (Varghese et al. (2002) PNAS USA 99:15959-15964) y la estructura hexamérica del complejo IL-6/IL-6R/gpl30 (Boulanger et al (2003) Science 300:2101-2104). Estas estructuras combinadas con estudios de mutagénesis han identificado tres sitios en la superficie de IL-6 que están implicados en la actividad funcional de IL-6 en complejo con los diversos componentes del receptor. Los residuos del Sitio 1 están implicados en la interacción entre IL-6 e IL-6Ra. Los residuos del Sitio 2 están implicados en la interacción entre IL-6 y el dominio de unión a citocina gpl30. Los residuos en el Sitio 3 de IL-6 están implicados en la interacción con el dominio tipo Ig del segundo gpl30 en el complejo hexamérico. También se ha identificado un cuarto sitio en IL-6 donde IL-6 interactúa con la segunda molécula de IL-6 en el complejo hexamérico IL-6/IL-6R/gpl30 (Menziani et al (1997) Proteins: Structure Function and Genetics 29, 528) .

Se ha aislado un número de anticuerpos monoclonales anti-IL-6 del ligando. Se han desempeñado estudios de mapeo que muestran que estos se unen a diferentes sitios de unión, tal como se describe anteriormente, en la superficie de la IL-6 humana (Brakenhoff et al. (1990) J. Immunol . 145:561- 568 ; Wijdenes et al. (1991) Mol Immunol . 28:1183-1191 ; Brakenhoff et al . (1994) JBC 269:86 ; Kalai et al . (1996) Eur J Biochem 238 714-723 ; Kalai et al . (1997) Blood 89:1319-1333) .

El aumento de IL-6 ha sido implicado como una citocina clave en una variedad de indicaciones de enfermedades. Se ha mostrado que los niveles de IL-6 circulante son elevados en enfermedades tales como artritis reumatoide, enfermedad de Castleman, artritis idiopática juvenil y enfermedad de Crohn (Nishimoto N y Kishimoto T. (2004) Curr Op in Pharmacology 4:386-391) . Debido a esto, IL-6 se ha visto implicada en el manejo de la patología en estas indicaciones inflamatorias. Además, se ha mostrado que una variedad de tipos tumorales son estimulados por IL-6, incluyendo melanoma, carcinoma de célula renal, sarcoma de Kaposi, carcinoma de ovario, linfoma, leucemia, mieloma múltiple y carcinoma de próstata (Keller E.T. et al. (1996) Front Biosci. 1:340-57) . Además, se han informado niveles circulantes de IL-6 aumentados en varios cánceres. En algunas indicaciones de cáncer se han usado niveles elevados de IL-6 como indicadores de diagnóstico de la enfermedad.

Debido al rol de la IL-6 en una enfermedad, se ha desarrollado una variedad de anticuerpos monoclonales IL-6 anti-humanos murinos, quiméricos, humanizados, humanos como potenciales terapias (por e . , US5856135, WO2004/020633 , US20060257407A1, US7291721) . Se ha usado un anticuerpo anti-IL-6 humano-de ratón, quimérico cCLB8 (conocido como CNTO 328) para tratar pacientes con mieloma múltiple (van Zaanen et al. (1998) Brit. Journal. Haematology 102:783), con estabilización de la enfermedad detectada para la mayoría de los pacientes.

El efecto positivo de la inhibición de la señalización de IL-6 en cáncer y enfermedades inflamatorias se ha destacado adicionalmente por el uso del anticuerpo humanizado anti-IL-6Ra Tocilizumab (también conocido como hPM-1, MRA y Actemra) . Esta es una versión humanizada del anticuerpo anti-IL6Ra murino PM-1. El tratamiento de pacientes con este anticuerpo ha demostrado ser eficaz en una cantidad de enfermedades incluyendo artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Crohn, trastorno mieloproliferativo, enfermedad de Castleman y lupus eritematoso sistémico (SLE) (Mihara et al. (2005) Expért Opinión on Biological Therapy. 5:683-90).

Un problema importante en las terapias basadas en anticuerpos es la persistencia de inmunoglobulinas en la circulación. La tasa de depuración de inmunoglobulina afecta directamente la cantidad y frecuencia de dosificación de la inmunoglobulina. Una dosificación y frecuencia de dosificación aumentadas pueden causar efectos adversos en el paciente y también aumentar los costos médicos . En vista de la importancia farmacéutica de terapias basadas en anticuerpo anti-IL-6, existe una necesidad de desarrollar anticuerpos anti-IL-6 humanos modificados de alta afinidad que tengan una semivida in vivo aumentada.

Breve descripción de la invención La presente invención describe anticuerpos anti-IL-6 humanos de alta afinidad que se unen específicamente a la IL-6 humana y tienen una semivida in vivo prolongada. En una modalidad, la semivida in vivo de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente se encuentra entre 10 días y 40 días. En una modalidad específica, la semivida in vivo de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente se encuentra entre 25 días y 35 días. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente comprende el dominio VH y/o VL de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la publicación PCT N° WO 2008/065378. En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos relativas al dominio constante de IgG humana de tipo salvaje. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T, y T256E donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat. En otra modalidad, un anticuerpo anti- IL-6 de la invención comprende una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 10.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 humano que tiene una semivida prolongada, vectores que comprenden los ácidos nucleicos, células que comprenden los vectores y métodos para producir un anticuerpo anti-IL-6 humano que tiene una semivida prolongada.

En otros aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo anti-IL-6 humano que tiene una semivida prolongada conforme a la presente invención y métodos para preparar un anticuerpo anti-IL-6 humano que tiene una semivida prolongada, que comprenden expresar el ácido nucleico en condiciones para provocar la producción del anticuerpo anti-IL-6 humano y recuperarlo.

Un aspecto adicional proporciona una célula hospedadora que contiene o que ha sido transformada con ácido nucleico de la invención.

Aspectos adicionales de la presente invención proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-IL-6 de la invención y su uso en métodos para unir, inhibir y/o neutralizar la IL-6, incluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En una modalidad, una composición de la invención es una formulación líquida estéril. En una modalidad específica, una composición de la invención comprende al menos 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En otra modalidad, una composición de la invención es una formulación liofilizada. En aun otra modalidad, una formulación de la invención es una formulación farmacéutica.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método para el tratamiento o diagnóstico, como un método para el tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en el cuerpo humano o animal (por ej . , en un paciente humano) , que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención. Las afecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen cualquiera en la que tenga incidencia la IL-6, según se trata con más detalle en otra parte de la presente.

La presente invención también abarca métodos para neutralizar la actividad de IL-6 en el suero de un paciente humano que lo necesita, que comprende administrar al paciente humano una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. La presente invención también proporciona métodos para prevenir, manejar, tratar o mejorar una enfermedad o trastorno inflamatorio, una enfermedad o trastorno autoinmune, una enfermedad proliferativa, una enfermedad o trastorno asociado con o caracterizado por una expresión y/o actividad aberrante de IL-6, una enfermedad o trastorno asociado con o caracter zado por expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-6, o uno o más síntomas del mismo, los métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención.

Un aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo modificado aislado que se une específicamente a IL-6, donde el anticuerpo modificado comprende un dominio variable y dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con relación a un dominio constante de IgG humana de tipo salvaje, donde el anticuerpo tiene una semivida prolongada en comparación con la semivida de un anticuerpo original que comprende el dominio variable y el dominio constante de IgG humana de tipo salvaje. En una modalidad de este aspecto de la invención, la semivida del anticuerpo modificado es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces más larga que la semivida del anticuerpo de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida del anticuerpo modificado es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 20 veces más larga que la semivida del anticuerpo de tipo salvaje. En una modalidad adicional, la semivida del anticuerpo modificado es entre 2 veces y 3 veces, entre 2 veces y 5 veces, entre 2 veces y 10 veces, entre 3 veces y 5 veces o entre 3 veces y 10 veces más larga que la semivida del anticuerpo de tipo salvaje. En aun otra modalidad, la semivida del anticuerpo modificado es de al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 26 días, al menos .27 días, al menos 28 días, al menos 29 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días o al menos 50 días. En aun una modalidad adicional, la semivida del anticuerpo modificado es de 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días o 50 días. En aun una modalidad adicional, la semivida del anticuerpo modificado es de entre 10 días y 20 días, entre 10 días y 30 días, entre 10 días y 40 días, entre 10 días y 50 días, entre 20 días y 30 días, entre 20 días y 40 días, entre 20 días y 50 días, entre 25 días y 30 días, entre 25 días y 40 días, entre 25 días y 50 días, entre 30 días y 40 días, entre 30 días y 50 días o entre 40 días y 50 días. En aun otra modalidad, la semivida del anticuerpo modificado es la semivida medida en un mamífero. En otra modalidad, la semivida del anticuerpo modificado es la semivida medida en un primate no humano. En otra modalidad, la semivida del anticuerpo modificado es la semivida medida en un sujeto humano .

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo modificado aislado que se une específicamente a IL-6, donde el anticuerpo modificado comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con relación a un dominio constante de IgG humana de tipo salvaje, donde el anticuerpo tiene una tasa de depuración disminuida en comparación con la tasa de depuración de un anticuerpo de tipo salvaje que comprende el dominio constante de IgG humana de tipo salvaje. En una modalidad de este aspecto de la invención, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces más baja que la tasa de depuración del anticuerpo de tipo salvaje. En otra modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 20 veces más baja que la tasa de depuración del anticuerpo de tipo salvaje. En aun otra modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es entre 2 veces y 3 veces, entre 2 veces y 5 veces, entre 2 veces y 10 veces, entre 3 veces y 5 veces o entre 3 veces y 10 veces más baja que la tasa de depuración del anticuerpo de tipo salvaje. En otra modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es como máximo 1 mL/kg/día, como máximo 2 mL/kg/día, como máximo 3 mL/kg/día, como máximo 4 mL/kg/día, como máximo 5 mL/kg/día, como máximo 7 mL/kg/día, como máximo 10 mL/kg/día, como máximo 15 mL/kg/día o como máximo 20 mL/kg/día. En una modalidad adicional, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es 1 mL/kg/día, 2 mL/kg/día, 3 mL/kg/día, 4 mL/kg/día, 5 mL/kg/día, 7 mL/kg/día, 10 mL/kg/día, 15 mL/kg/día o 20 mL/kg/día. En aun otra modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es entre 1 mL/kg/día y 2 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 3 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 10 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 15 mL/kg/día, entre 2 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 2 mL/kg/día y 10 mL/kg/día, entre 3 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 3 mL/kg/día y 10 mL/kg/día o entre 5 mL/kg/día y 10 mL/kg/día. En aun otra modalidad adicional, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es la tasa de depuración medida en un mamífero. En otra modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es la tasa de depuración medida en un primate no humano. En una modalidad adicional, la tasa de depuración del anticuerpo modificado es la tasa de depuración medida en un sujeto humano. En aun otra modalidad, las sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: M252Y, 252F, M252W, M252T, S254T, T256S, T256R, T256Q, T256E, T256D, T256T, L309P, Q311S, H433R, H433K, H433S, H433I, H433P, H433Q, N434H, N434F, N434Y y N436H, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU como en Kabat . En otra modalidad, al menos una de las sustituciones de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: M252Y, S254T, T256E, H433K, N434F y N436H, donde los residuos de aminoácido están enumerados conforme al índice EU como en Kabat . En aun otra modalidad, el dominio constante de IgG modificada comprende las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T, y T256E donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat . En aun otra modalidad, el dominio constante de IgG modificada tiene una afinidad mayor por FcRn que el dominio constante de IgG de tipo salvaje. En una modalidad adicional, el dominio constante de IgG humana es un dominio constante de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En aun otra modalidad, la IgG es IgGl .

Otro aspecto de la invención se refiere a los anticuerpos modificados descritos anteriormente donde el dominio variable comprende: una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 1; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 2; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 3; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 4; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 5; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 6. En una modalidad, el anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el dominio variable comprende: una CDR1 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, el dominio variable comprende un dominio VH que comprende tres CDR y un dominio VL que comprende tres CDR, donde las tres CDR del dominio VH comprenden: una CDR1 VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En una modalidad adicional, el dominio variable comprende un dominio VH que comprende tres CDR y un dominio VL que comprende tres CDR, donde las tres CDR del dominio VL comprenden: una CDR1 VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En aun otra modalidad, el dominio variable comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 7 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 7 y comprende un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 8 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 8. En otra modalidad, el dominio variable comprende el dominio VH de SEQ ID NO: 7 y el dominio VL de SEQ ID NO: 8.

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica los anticuerpos modificados mencionado anteriormente. En una modalidad, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11-14.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector que comprende los ácidos nucleicos mencionado anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula aislada que comprende los vectores mencionado anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula aislada que expresa los anticuerpos modificados mencionados anteriormente .

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo modificado que comprende cultivar las células aisladas antes mencionadas en condiciones suficientes para la producción del anticuerpo y recuperar el anticuerpo del cultivo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos modificados mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para neutralizar al menos 90% de la IL-6 libre en el suero de un humano que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de los anticuerpos modificados mencionados anteriormente .

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para inhibir al menos 90% de la señalización mediada por IL-6 en el suero de un humano que lo necesita, que comprende administrar al humano una cantidad eficaz de los anticuerpos modificados mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para neutralizar al menos 90% de la IL-6 libre en el fluido sinovial de un humano que lo necesita, que comprende administrar al humano una cantidad eficaz del anticuerpo modificado .

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para inhibir al menos 90% de la señalización mediada por IL-6 en el fluido sinovial de un humano que lo necesita, que comprende administrar al humano una cantidad eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para reducir el crecimiento celular sinovial en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para reducir la inflamación sinovial en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad o trastorno autoinmune en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar una neoplasia maligna en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente .

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria intestinal en un humano que comprende administrar a un humano que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos mencionados anteriormente. En una modalidad, el método de cualquiera de las reivindicaciones 40-49, donde la cantidad terapéuticamente eficaz comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de anticuerpo modificado. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente eficaz comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 20-500 mg, alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo modificado. En aun otra modalidad, la cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo modificado se administra una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. En aun otra modalidad, la cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo modificado se administra de forma intravenosa o subcutánea. En otra modalidad, se le administra al paciente una única dosis de carga de anticuerpo modificado antes de que se le administre al menos una dosis de mantenimiento del anticuerpo modificado. En aun otra modalidad, la dosis de carga comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de anticuerpo modificado. En aun otra modalidad, la dosis de carga comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 20-500 mg, alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo modificado. En aun otra modalidad, la dosis de mantenimiento comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de anticuerpo modificado. En aun otra modalidad, la dosis de mantenimiento comprende una única dosis o dosis divididas de alrededor de 20-500 mg, alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo modificado. En otra modalidad, la dosis de mantenimiento se administra una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, 8 semanas o doce semanas después de la administración de la dosis de carga. En aun otra modalidad, las al menos dos dosis de mantenimiento se administran al paciente y las dosis de mantenimiento se administran una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas . En aun otra modalidad, la dosis de carga de anticuerpo modificado se administra de forma intravenosa o subcutánea. En otra modalidad, la dosis de mantenimiento se administra de forma intravenosa o subcutánea. En una modalidad adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo modificado se administra junto con un segundo agente terapéutico.

Otro aspecto de la invención se refiere a una formulación acuosa estable y estéril que comprende los anticuerpos mencionados anteriormente. En una modalidad de este aspecto de la invención, el anticuerpo no se sometió a liofilización. En otra modalidad, el anticuerpo se sometió a liofilización . En aun otra modalidad, la concentración del anticuerpo modificado es de al menos alrededor de 5 mg/ml, al menos alrededor de 10 mg/ml, al menos alrededor de 15 mg/ml, al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 50 mg/ml, al menos alrededor de 100 mg/ml, al menos alrededor de 120 mg/ml, al menos alrededor de 150 mg/ml, al menos alrededor de 160 mg/ml, al menos alrededor de 5160 mg/ml, al menos alrededor de 180 mg/ml, al menos alrededor de 200 mg/ml, al menos alrededor de 250 mg/ml o al menos alrededor de 300 mg/ml. En una modalidad adicional, la formulación también comprende al menos alrededor de un componente amortiguador. En otra modalidad, la formulación también comprende al menos un excipiente. En aun otra modalidad, el componente amortiguador se selecciona del grupo que consiste en histidina, citrato, fosfato, glicina y acetato. En aun otra modalidad, el componente amortiguador se encuentra en una concentración de alrededor de 1 mM a alrededor de 200 mM, de alrededor de 1 mM a alrededor de 50 mM o de alrededor de 5 mM a alrededor de 20 mM. En aun otra modalidad, el componente amortiguador se encuentra en una concentración de alrededor de 10 mM, alrededor de 15 mM, alrededor de 20 mM o alrededor de 25 mM. En una modalidad adicional, el excipiente es un sacárido. En aun otra modalidad, el sacárido es un disacárido. En aun otra modalidad, el disacárido es trehalosa o sucrosa. En una modalidad adicional, el disacárido se encuentra en una concentración de alrededor de 1% a alrededor de 40%, de alrededor de 2% a alrededor de 20% o de alrededor de 2% a alrededor de 10%. En aun otra modalidad, el disacárido se encuentra en una concentración de alrededor de 2%, alrededor de 4% o alrededor de 8%. En aun otra modalidad, el excipiente es una sal. En aun otra modalidad, la sal es cloruro de sodio. En una modalidad adicional, el cloruro de sodio se encuentra en una concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM. En otra modalidad, el cloruro de sodio se encuentra en una concentración de alrededor de 70 mM, alrededor de 75 mM, alrededor de 80 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 120 mM o alrededor de 150 mM. En una modalidad adicional, el excipiente es un tensioactivo. En una modalidad adicional, el tensioactivo es un polisorbato. En aun una modalidad adicional, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En aun otra modalidad, el tensioactivo se encuentra en una concentración de alrededor de 0.001% a alrededor de 2%. En otra modalidad, el tensioactivo se encuentra en una concentración de alrededor de 0.01%, alrededor de 0.02%, alrededor de 0.04% o alrededor de 0.08%. En aun otra modalidad, el excipiente es un aminoácido. En aun otra modalidad, el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en glicina, histidina o arginina. En aun otra modalidad, el aminoácido se encuentra en una concentración de alrededor de 10 mM a alrededor de 400 mM. En aun otra modalidad, el aminoácido se encuentra en una concentración de alrededor de 25 mM, alrededor de 50 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 150 mM, alrededor de 200 mM, alrededor de 250 mM, alrededor de 300 mM, alrededor de 350 mM o alrededor de 400 mM. En aun otra modalidad, la formulación tiene un pH de alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5. En aun otra modalidad, la formulación tiene un pH de alrededor de 6.0. En aun otra modalidad, la formulación es isotónica. En otra modalidad, la formulación es estable tras el almacenamiento a 40 °C durante al menos alrededor de 4 semanas. En aun otra modalidad, la formulación es estable tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses. En otra modalidad, la formulación es estable tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses. En aun otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 20% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 40 °C durante al menos alrededor de 4 semanas . En aun otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 20% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses. En aun otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 20% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses. En aun otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 10% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 40 °C durante al menos alrededor de 4 semanas. En otra modalidad, la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 64 a 93, donde el anticuerpo pierde como máximo 10% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses. En otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 10% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses. En otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 5% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 40 °C durante al menos alrededor de 4 semanas. En otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 5% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses. En otra modalidad, el anticuerpo pierde como máximo 5% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses. En otra modalidad, el anticuerpo es susceptible a la agregación o fragmentación. En otra modalidad, menos de alrededor de 2% del anticuerpo forma un agregado tras el almacenamiento a 40°C durante al menos alrededor de 4 semanas como se determina por HPSEC. En otra modalidad, menos de alrededor de 2% del anticuerpo forma un agregado tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses como se determina por HPSEC. En otra modalidad, menos de alrededor de 2% del anticuerpo forma un agregado tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses como se determina por HPSEC. En otra modalidad, menos de alrededor de 5% del anticuerpo se fragmenta tras el almacenamiento a 40 °C durante al menos alrededor de 4 semanas como se determina por SEC. En otra modalidad, menos de alrededor de 5% del anticuerpo se fragmenta tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 3 meses como se determina por SEC. En otra modalidad, menos de alrededor de 5% del anticuerpo se fragmenta tras el almacenamiento a 5°C durante al menos alrededor de 12 meses como se determina por SEC. En otra modalidad, la formulación es una formulación inyectable. En otra modalidad, la formulación es adecuada para la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. En otra modalidad, la formulación es adecuada para la administración en aerosol.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma de dosificación farmacéutica unitaria adecuada para la administración parenteral a un humano que comprende cualquiera de las formulaciones de anticuerpo antes mencionadas en un recipiente adecuado. En una modalidad, la formulación de anticuerpo se administra de forma intravenosa, subcutánea o intramuscular.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma de dosificación farmacéutica unitaria adecuada para la administración en aerosol a un humano que comprende cualquiera de las formulaciones de anticuerpo antes mencionadas. En una modalidad de este aspecto de la invención, la formulación de anticuerpo se administra de forma intranasal .

Otro aspecto de la invención se refiere a un recipiente sellado que contiene cualquiera de las formulaciones antes mencionadas .

Otro aspecto de la invención se refiere a una jeringa prellenada que contiene cualquiera de las formulaciones mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende cualquiera de las formulaciones antes mencionadas.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.

Terminología Es conveniente señalar que en los casos en que se use "y/o" en la presente, se debe considerar una descripción específica de cada uno de los dos rasgos o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada una se estableciera individualmente en la presente.

IL-6 y receptor de IL-6 IL-6 es interleucina 6. IL-6 también se puede denominar en la presente "el antígeno" .

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de IL-6 humana es SEQ ID NO: 15. Esta secuencia es escindida in vivo para quitar un péptido líder del N-terminal, para producir IL-6 madura. La IL-6 humana madura tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16. La secuencia madura representa la IL-6 circulante in vivo, que es el antígeno diana para las aplicaciones de diagnóstico terapéuticas e in vivo tal como se describe en la presente. Por consiguiente, la IL-6 a la que se hace referencia en la presente es normalmente IL-6 humana madura, a menos que el contexto indique lo contrario.

IL-6 se puede conjugar a una etiqueta detectable, tal como HIS FLAG, por ej . , para usarse en ensayos como se describe en la presente. Por ejemplo, se puede usar una proteína de fusión que comprende IL-6 conjugada a una secuencia HIS FLAG.

El receptor a de IL-6, IL-6Ra, es el receptor de la interleucina 6. IL-6Ra también es conocida como IL-6ROÍ , I L -6Ra, IL-6R y CD126. IL-6Ra existe in vivo en forma de transmembrana y en forma soluble. Las referencias a IL-6Ra pueden ser IL-6Ra transmembrana y/o IL-6Ra soluble a menos que el contexto indique lo contrario.

El receptor IL-6 al que se hace referencia en la presente es normalmente receptor de IL-6 humana, a menos que se indique lo contrario. Una secuencia de aminoácidos de IL-6Ra (sIL-6Ra, sIL-6R) soluble humana es SEQ ID NO: 17. Una secuencia de aminoácidos de IL-6Ra transmembrana humana es SEQ ID NO: 18.

IL-6 se une a IL-6Ra para formar un complejo, IL-6:IL-6Ra. El complejo puede ser soluble (con sIL-6Ra) o estar unido a membrana (con lL-6Ra transmembrana) . Cuando lL-6Ra es la forma soluble, el complejo se denomina IL-6 :sIL-6Ra. Las referencias a IL-6:IL-6Ra pueden incluir IL-6 en complejo con IL-6Ra transmembrana o con IL-6Ra soluble, a menos que el contexto indique lo contrario. gpl30 gpl30 es un receptor del complejo IL-6:lL-6Ra. La clonación y caracterización de gpl30 se informa en Hibi et al, Cell 63:1149-1157 (1990). Una secuencia de gpl30 humana se establece en SEQ ID NO: 19.

Miembro de unión Describe un miembro de un par de moléculas que se unen entre sí. Los miembros de un par de unión pueden derivarse naturalmente o producirse de forma sintética en su totalidad o parcialmente. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une a y por lo tanto es complementaria de una organización espacial o polar particular del otro miembro del par de moléculas . Los ejemplos de tipos de pares de unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima- sustrato. La presente invención se relaciona con las reacciones tipo antígeno-anticuerpo .

Un miembro de unión normalmente comprende una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína que no es de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno.

Un sitio de unión al antígeno se puede proporcionar por medio de arreglo de CDR de andamios de proteínas que no son anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B, etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al. (1997) Cur . O . Structural Biology, 7: 463-469), o por la aleatorización o mutación de residuos de aminoácidos de un bucle con un andamio de proteína para otorgar especificidad de unión por una diana deseada. Los andamios para diseñar sitios de unión novedosos en proteínas han sido revisados en detalle por Nygren et al. (Nygren et al. (1997) Curr. Op. Structural Biology, 7: 463-469). Los andamios de proteínas para miméticos de anticuerpos se describen en el documento WO/0034784, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad, en el cual los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado . Un andamio adecuado en el cual se puede injertar una o más CDR, por ej . , un conjunto de HCDR, se puede proporcionar por cualquier miembro del dominio de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina. El andamio puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamio de proteína que no es de anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión al antígeno en una molécula de andamio que es menor y/o más fácil de fabricar que al menos algunas de las moléculas del anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede otorgar propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad de ingresar a las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar dianas dentro de otras estructuras o de unirse dentro de cavidades de proteínas del antígeno diana. El uso de los sitios de unión al antígeno en andamios de proteína que no es anticuerpo se revisan en Wess (Wess, L. (2004) In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), Al-A7) . Son típicas las proteínas que tienen una estructura principal estable y uno o más bucles variables, donde las secuencias de aminoácidos del bucle o bucles están mutadas de forma específica o aleatoria para crear un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, transíerrina, tetranectina, fibronectina (por ej . , décimo dominio de fibronectina tipo III) , lipoclainas así como gamma cristalina y otros andamios Affilin™ (Scil Proteins) . Los ejemplos de otros enfoques incluyen "Microcuerpos" sintéticos basados en ciclótidos -pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares, microproteínas (Versabodies™, Amunix) y proteínas de repetición de ankirina (DARPins, Molecular Partners) .

Además de las secuencias de anticuerpo y/o un sitio de unión al antígeno, un miembro de unión conforme a la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ej . , que forman un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado o para otorgar a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unirse al antígeno. Los miembros de unión de la invención puede portar una etiqueta detectable o se pueden conjugar a una toxina o una porción o enzima de direccionamiento (por ej . , por medio de una unión o enlace peptidilo) . Por ejemplo, un miembro de unión puede comprenden un sitio catalítico (por ej . , en un dominio de enzima) así como un sitio de unión al antígeno, donde el sitio de unión al antígeno se une al antígeno y así dirige el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ej . , por medio de escisión.

Pese a que, tal como se destaca, las CDR pueden ser portadas por andamiajes que no son de anticuerpo, la estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR de la invención generalmente será una secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porción sustancial del mismo donde la CDR o conjunto de CDR está ubicado en un lugar que corresponde a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL de origen natural codificados por genes de inmunoglobulina arreglados nuevamente. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar con referencia a Kabat, et al. (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edición. US Department of Health and Human Services. (1987)) y actualizaciones del mismo. Una cantidad de expedientes académicos y comerciales en línea están disponibles para consultar esta base de datos. Por ejemplo, véase referencia Martin, A.C.R. (Accessing the Kabat Antibody Sequence Datábase by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996) , 130-133) y el expediente online asociado, actualmente disponible en el sitio web mundial de bioinf .org.uk/abs/simkab.html.

Por región CDR o CDR se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina tal como lo define Kabat et al. (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington o ediciones posteriores) o Chothia y Lesk (J. Mol. Biol . , 196:901-917 (1987) ) . Un anticuerpo típicamente contiene 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se usa en la presente para indicar, conforme al caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables por la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítopo que este reconoce.

Entre las seis secuencias cortas de CDR, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una variabilidad de tamaño mayor (mayor diversidad esencialmente debido a los mecanismos de arreglo de genes que la originaron) . Puede ser tan corta como 2 aminoácidos, pese a que el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de la CDR también puede variar de acuerdo con la longitud que se puede acomodar por la región flanqueante subyacente particular. Funcionalmente, HCDR3 juega un papel importante en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al., (1974) PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986) Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol . , 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature, 342:877- 883; Catón et al., (1990) J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990) PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990) J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991) J. Immunol., 147:1709-1719; Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23 (9) : 1126-1136 2005).

HCDR1 puede tener 5 aminoácidos de longitud, que consisten en los residuos 31-35 de Kabat.

HCDR2 puede tener 17 aminoácidos de longitud, que consisten en los residuos 50-65 de Kabat.

HCDR3 puede tener 11 o 12 aminoácidos de longitud, que consiste en los residuos 95-102 de Kabat, opcionalmente incluyendo el residuo 100D de Kabat.

LCDRi puede tener 11 aminoácidos de longitud, que consisten en los residuos 24-34 de Kabat.

LCDR2 puede tener 7 aminoácidos de longitud, que consisten en los residuos 50-56 de Kabat.

LCDR3 puede tener 8 o 9 aminoácidos de longitud, que consiste en los residuos 89-97 de Kabat, opcionalmente incluyendo el residuo 95 de Kabat.

Molécula de anticuerpo Describe una inmunoglobulina ya sea natural o producida toda o en parte en forma sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Se debe entender que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, que no están en su entorno natural pero que pudieron ser aislados u obtenidos por purificación a partir de fuentes naturales u obtenidos de otra forma por recombinación genética o por síntesis química y que pueden entonces contener aminoácidos no naturales como se describirá a continuación. Los fragmentos de anticuerpos que contienen un sitio de unión al antígeno del anticuerpo incluyen pero no se limitan a, molécula tales como Fab, Fab' , Fab'-SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Se han diseñado varias otras moléculas de anticuerpo incluyendo uno o más sitios de unión al antígeno del anticuerpo, incluyendo por ejemplo Fab2, Fab3 , diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. Las moléculas de anticuerpo y los métodos para su construcción y uso se describen en Holliger & Hudson (Nature Biotechnology 23 (9) :1126-1136 (2005)).

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y de otro tipo y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que unen el antígeno diana. Tales técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina o las CDR de un anticuerpo a las regiones constantes o regiones constantes más regiones flanqueantes de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, documentos EP-A- 184187, GB 2188638A o EP-A-239400 y una gran cantidad de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede estar sujeta a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos o no.

Debido a que los anticuerpos se pueden modificar de diversas formas, el término "molécula de anticuerpo" debería interpretarse como que cubre cualquier miembro de unión o sustancia que tenga un sitio de unión al antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida y/o unión al antígeno. Por lo tanto, este término cubre los fragmentos y derivados de anticuerpo incluyendo cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, ya sea que es natural o total o parcialmente sintético. Por lo tanto se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionadas a otro polipéptido (por ej . , derivadas de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo) . La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y una extensa cantidad de bibliografía posterior.

Otras técnicas disponibles en el arte de diseño de anticuerpos han posibilitado el aislamiento de anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, los hibridomas humanos se puede realizar según se describe en Kontermann & Dubel (Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545) . La expresión en fagos, otra técnica establecida para generar miembros de unión se describió en detalle en muchas publicaciones, como Kontermann & Dubel (Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545) y documento WO92/01047 (discutido más adelante) y solicitudes estadounidenses US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404.

Se pueden usar ratones transgénicos, por ej . , ratones donde los genes de anticuerpo de ratón están inactivados y son reemplazados funcionalmente con genes de anticuerpo humano, mientras se dejan intactos otros componentes del sistema inmune del ratón, para aislar anticuerpos humanos (Méndez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156). Se pueden producir anticuerpos humanizados usando técnicas conocidas en el arte tales como las descritas en, por ejemplo, WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 y WO93/17105. Además, el documento WO2004/006955 describe métodos para humanizar anticuerpos con base en la selección de secuencias flanqueantes de región variable de genes de anticuerpo humano por medio de la comparación de tipos de estructuras de CDR canónicas para las secuencias de CDR de la región variable de un anticuerpo no humano con tipos de estructuras de CDR canónicas para las CDR correspondientes de-una biblioteca de secuencias de anticuerpo humano, por ej . , segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal. Las regiones variables del anticuerpo humano que tienen tipos de estructuras de CDR canónicas similares a las CDR no humanas forman un subconjunto de secuencias de anticuerpo humano miembro de las cuales se pueden elegir secuencias flanqueantes humanas. Los miembros del subconjunto también se pueden puntuar según la similitud de aminoácidos entre las secuencias de CDR humana y no humana. En el método de WO2004/006955 , las secuencias humanas con mayor puntuación se seleccionan para proporcionar las secuencias flanqueantes para construir un anticuerpo quimérico que reemplace funcionalmente las secuencias de CDR humana con los equivalentes de CDR no humanas usando el subconjunto seleccionado de las secuencias flanqueantes humanas miembro, proporcionando asi un anticuerpo humanizado de alta afinidad y baja inmunogenicidad sin la necesidad de comparar secuencias flanqueantes entre los anticuerpos no humanos y humanos. También se describen anticuerpos quiméricos preparados conforme al método.

Las moléculas de anticuerpo sintéticas se pueden crear por medio de la expresión a partir de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y arreglados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo como se describe por Knappik et al. (Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol . 296, 57-86) o Krebs et al. (Krebs et al. (2001) J. Immunological Methods 254 67-84) .

Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden desempeñar la función de unir antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAB ( ard, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544- 546; McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) , que consiste en un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv) , donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426; Huston et al, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883) ; (viii) dímeros Fv biespecífieos de cadena simple (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos " , fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (WO94/13804 ; Holliger, P. et al, (1993) PNAS USA 90 6444-6448) . Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpos se pueden estabilizar por la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter, Y. et al, (1996) Nature Biotech, 14, 1239-1245). También se pueden realizar minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu, S. et al, (1996) Cáncer Res., 56, 3055-3061). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab' , que difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo y Fab' -SH, que es un fragmento Fab' donde el o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre.

Qui et al. (Qui et al., (2007) Nat. Biotechnol . 25:921-929) describieron moléculas de anticuerpo que contienen solo dos CDR enlazadas por una región flanqueante. La CDR3 del dominio VH o VL se enlazó al bucle CDR1 o CDR2 del otro dominio. El enlace se hizo a través del C-terminal de la CDR1 o CDR2 seleccionada al N-terminal de la CDR3 por medio de una región FR. Qui et al. seleccionaron la región FR que tenía menos parches hidrofóbicos . La mejor combinación de los anticuerpos probados se encontró que era la CDR1 VL enlazada por FR2 VH a CDR3 VH (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3 ) . A un peso molecular de alrededor de 3 kDa, estas moléculas de anticuerpo ofrecen ventajas en términos de penetración de tejido mejorada según se compara con inmunoglobulinas completas (aprox.- 150 kDa) o scFv (aprox. 28 kDa) .

Los fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de una molécula de anticuerpo original o cualquiera de las moléculas de anticuerpo 2, 3, 4, 5, 7 , 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 y 23, por métodos tales como digestión por enzimas por ej . , pepsina o papaína y/o por escisión de los puentes disulfuro por reducción química. De otra forma, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención se pueden obtener por técnicas de recombinación genética también conocidas por el experto en la técnica o de otra forma por la síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos tales como los suministrados por la compañía Applied Biosystems, etc. o por síntesis y expresión de ácido nucleico.

Los fragmentos de anticuerpo funcionales conforme a la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida se ve aumentada por una modificación química, especialmente por PEGilación, por incorporación a un liposoma por fusión a albúmina o un fragmento de la misma.

Un dAb (anticuerpo de dominio) es un fragmento de unión al antígeno monomérico pequeño de un anticuerpo, a saber la región variable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) . Los dAb VH ocurren naturalmente en camélidos (por ej . , camellos, llamas) y se pueden producir por medio de la inmunización de un camélido con un antígeno diana, aislamiento de las células B específicas de antígeno y clonación directa de los genes dAb a partir de células B individuales. Los dAb también se pueden producir en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad de temperatura los hacen particular y fisiológicamente útiles y adecuados para la selección y maduración de afinidad. Se están desarrollando dAb VH de camélido para uso terapéutico con el nombre "nanobodies™" . Un miembro de unión de la presente invención puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL sustancialmente como se muestra en la presente, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente como se muestra en la presente.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales donde dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula (Holliger and Bohlen (1999) Cáncer & Metástasis Rev. 18: 411-419). Su uso se ha demostrado tanto en el ámbito de diagnóstico como en el ámbito de terapia a partir de su capacidad de reclutar nuevas funciones de efector o de dirigirse a varias moléculas en la superficie de células tumorales . En los casos en que se deban usar anticuerpos biespecíficos , estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales que se pueden fabricar en una variedad de formas (Holliger, P. and Winter G. (1993) Curr. O . Biotech. 4, 446-449), por ej . , prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos se pueden obtener por métodos químicos (Glennie M J et al. (1987) J. Immunol . 139, 2367-2375; Repp R. et al. (1995) J. Hematother. 4: 415-21) o métodos somáticos (Staerz U. D. and Bevan M. J. (1986) PNAS USA 83: 1453-7; Suresh M. R. et al. (1986) ethod Enzymol . 121: 210-228) pero asimismo y preferentemente por medio de técnicas de diseño genético que permiten forzar la heterodimerización y así facilitar el proceso de purificación del anticuerpo buscado (Merchand et al. (1998) Nature Biotech. 16:677-681). Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen aquellos de la tecnología BiTE™ donde los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden usar y enlazar directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una cadena corta de un solo polipéptido. Se pueden construir diacuerpos y scFv sin una región de Fe, usando solo dominios variables, potencialmente reduciendo los efectos de la reacción antiidiotípica .

Los anticuerpos biespecíficos se pueden construir como IgG enteras, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacuerpos o bien como scFv biespecíficos . Además, dos anticuerpos biespecíficos se pueden enlazar usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de anticuerpos enteros biespecíficos , también pueden ser particularmente útiles debido a que se pueden construir y expresar fácilmente en E.coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos , como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión adecuadas se pueden seleccionar fácilmente usando expresión en fagos ( O94/13804) de bibliotecas . Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra IL-6 entonces se puede hacer una biblioteca donde varía el otro brazo y selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos enteros biespecífieos se pueden realizar por métodos de diseño alternativos según se describe en Ridgeway et al., (Ridgeway, J. B. B. et al (1996) Protein Eng. , 9, 616-621) .

Existen diversos métodos disponibles en la técnica para obtener anticuerpos contra IL-6. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales , especialmente de origen humano, murino, quimérico o humanizado, que se pueden obtener de acuerdo con métodos estándar bien conocidos por el experto en la técnica.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible consultar técnicas descritas en particular en el manual "Antibodies" (Harlow and Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988) o la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kóhler y Milstein (Kóhler and ilstein (1975) Nature, 256:495-497) Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener, por ejemplo, a partir de las células B de un animal inmunizado contra IL-6 o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por los anticuerpos monoclonales . En la presente se describen fragmentos y péptidos o polipéptidos adecuados que los comprenden y se pueden usar para inmunizar animales para generar anticuerpos contra IL-6. La IL-6, o uno de sus fragmentos, se puede producir especialmente conforme a los métodos de trabajo habituales, por recombinación genética comenzando con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica IL-6 o un fragmento de la misma, por síntesis de péptido comenzando desde una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia de péptidos de IL-6 y/o un fragmento de la misma.

Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, purificarse en una columna de afinidad donde IL-6 o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por los anticuerpos monoclonales, han sido inmovilizados previamente. Más particularmente, los anticuerpos monoclonales se pueden purificar por cromatografía en proteína A y/o G, seguida o no seguida por cromatografía de intercambio de iones destinada a eliminar los contaminantes de proteína residual así como el ADN y el LPS, en sí mismos, seguida o no seguida por cromatografía de exclusión en gel de Sefarosa para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. En una modalidad, la totalidad de estas técnicas se pueden usar simultánea o sucesivamente.

Sitio de unión al antígeno Describe la parte de una molécula que se une y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. En una molécula de anticuerpo se hace referencia al mismo como el sitio de unión al antígeno del anticuerpo y comprende la parte del anticuerpo que se une y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse solamente a una parte particular del antígeno, esta parte se llama epítopo. Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo se puede proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpo. Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.

WO2006/072620 describe el diseño de sitios de unión al antígeno en bucles estructurales (no de CDR) que se extienden entre las cadenas beta de dominios de inmunoglobulina . Un sitio de unión al antígeno se puede diseñar en una región de una molécula de anticuerpo separada de la ubicación natural de las CDR, por ej . , en una región flanqueante de un dominio VH o VL o en un dominio constante de anticuerpo, por ej . , CH1 y/o CH3. Un sitio de unión al antígeno diseñado en una región estructural puede ser adicional a, o estar en lugar de, un sitio de unión al antígeno formado por conjuntos de CDR de un dominio VH y VL. Cuando hay múltiples sitios de unión al antígeno presentes en una molécula de anticuerpo, se pueden unir al mismo antígeno (IL-6) , aumentando así la valencia del miembro de unión. De manera alternativa, múltiples sitios de unión al antígeno se pueden unir a diferentes antígenos (IL-6 y uno o más antígenos diferentes) y esto se puede usar para agregar funciones de efector, prolongar la semivida o mejorar la administración in vivo de la molécula de anticuerpo.

Aislado Se refiere al estado en que los miembros de unión de la invención o los ácidos nucleicos que codifican los miembros de unión, generalmente estarán de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, los miembros de unión, dominios VH y/o VL y moléculas y vectores de ácido nucleico codificante de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar en forma aislada y/o purificada, por ej . , de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen que no sea la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. Los miembros aislados y ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres del material con el cual están naturalmente asociados, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural o el ambiente en el cual se preparan (por ej . , cultivo celular) cuando tal preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y ácidos nucleicos se pueden formular con . diluyentes o adyuvantes y aun con fines prácticos se pueden aislar, por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microtitulación para uso en inmunoensayos o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se los usa en el diagnóstico o terapia. Los miembros de unión pueden estar glucosilados , ya sea naturalmente o por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ej . , células CHO o NSO (ECACC 85110503) o pueden estar (por ejemplo si se producen por expresión en una célula procariótica) no glucosilados.

Las preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo anti-IL-6 también forman parte de la invención. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que no tienen la lisina en el C-terminal, con varios grados de glicosilación y/o con aminoácidos derivados, tal como ciclización de un ácido glutámico en el N-terminal para formar un residuo de ácido piroglutámico .

Tal como se usa en la presente, la frase "sustancialmente como se establece" se refiere a una o más características de las CDR relevantes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritas en la presente idénticas o altamente similares a las regiones especificadas cuya secuencia se establece en la presente. Tal como se describe en la presente, la frase "altamente similar" con respecto a una o más regiones especificadas de uno o más dominios variables, se contempla que de 1 a alrededor de 5, por ej . , de 1 a 4, incluyendo l a 3 o l o 2 o 3 o 4 sustituciones de aminoácidos se pueden hacer dentro de la CDR y/o dominio VH o VL.

Breve descripción de las figuras Figura 1. La región de Fe del anticuerpo 18E, pero no la del Anticuerpo 18, comprende el epítopo YTE. La presencia del epítopo YTE en la región de Fe se detectó usando un anticuerpo de captura anti-YTE en un ensayo ELISA. Se muestran las curvas de titulación ELISA para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E.

Figura 2. La unión a IL-6 por el Anticuerpo 18, Anticuerpo 18E, anticuerpo IL-6 A (AB A) y anticuerpo IL-6 B (AB B) se monitoreó usando ensayos ELISA. IL-6 recombinante derivada de E. coli se usó como un reactivo de captura. El Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E mostraron actividades de unión a IL-6 sustancialmente idénticas. Las EC50 detectadas para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fueron 6.1 pM y 6.5 pM, respectivamente.

Figura 3. El Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E inhiben la proliferación de células TF-1 inducida por IL-6 con una eficacia sustancialmente idéntica. Los valores IC50 se determinaron para el Anticuerpo 18, Anticuerpo 18E, anticuerpo IL-6 A (AB A) y anticuerpo IL-6 B (AB B) . Se muestran las curvas de % máximo de inhibición como una función de la concentración del anticuerpo. Las IC50 detectadas para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fueron 4.5 pM y 5.2 pM, respectivamente.

Figura 4. El Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E inhiben la liberación de VEGF inducida por IL-6 endógena de fibroblastos sinoviales humanos con una eficacia sustancialmente idéntica. Los valores IC50 se determinaron para el Anticuerpo 18, Anticuerpo 18E, anticuerpo IL-6 A (AB A) y anticuerpo IL-6 (AB B) . Se muestran las curvas de % máximo de inhibición como una función de la concentración del anticuerpo. Las IC50 detectadas para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fueron 1.3 pM y 1.2 pM, respectivamente.

Figura 5. Perfil farmacocinético del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E. Una única dosis de 5 mg/kg del Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E se administró subcutánea o intravenosamente a monos cinomolgo. Los niveles de anticuerpo en plasma detectados luego de la administración del anticuerpo se muestran como una función de tiempo. La semivida del Anticuerpo 18 es de aproximadamente 8.5 días y 9.1 días luego de la administración intravenosa o subcutánea, respectivamente. La semivida del Anticuerpo 18E es de aproximadamente 28.4 días y 28.8 días luego de la administración intravenosa o subcutánea, respectivamente.

Figura 6. Perfil farmacocinético y farmacodinámico del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E. Se administraron 5 mg/kg del Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E de forma subcutánea a monos cinomolgo. Los niveles de anticuerpo en plasma y los niveles totales de IL-6 detectados luego de la administración del anticuerpo se muestran como una función de tiempo. Los símbolos representan los datos experimentales PK y PD y las líneas punteadas son el modelo PKPD adaptado simultáneamente a los datos PK y PD. Las semivida estimada del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E es de 9.1 días y 28.8 días, respectivamente. Las depuración estimada del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E es de 13.1 ml/día/kg y 2.8 ml/día/kg, respectivamente.

Figura 7. Simulación de niveles de IL-6 libre en plasma de pacientes con RA luego de la administración subcutánea de diversas dosis del Anticuerpo 18E. La simulación predice que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 se debería lograr por la administración subcutánea de 100 mg de Anticuerpo 18E cada 8 semanas o por adminis ración subcutánea de 50 mg de Anticuerpo 18E cada 4 semanas. Se predice que la administración subcutánea de 100 mg de Anticuerpo 18E cada 12 semanas no logra una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6.

Figura 8. Simulación de niveles de IL-6 libre en plasma de pacientes con RA luego de la administración subcutánea de Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E. La simulación predice que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 se debería lograr por la administración de una sola dosis de carga de 200 mg del Anticuerpo 18E seguido por dosis de mantenimiento de 100 mg del Anticuerpo 18E administradas una vez cada 8 semanas. La simulación predice también que la administración de 500 mg de Anticuerpo 18 cada 8 semanas no debería lograr una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6.

Figura 9. Simulación de niveles de IL-6 libre en plasma de pacientes con RA luego de la administración subcutánea de diversas dosis de Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E. La simulación muestra que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 se debería lograr por la administración de una sola dosis de carga subcutánea de 100 mg de Anticuerpo 18E seguido por dosis de mantenimiento subcutáneas mensuales de 50 mg de Anticuerpo 18E. La simulación predice además que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 se debería lograr por la administración de dosis subcutáneas dos veces por semana de 100 mg de Anticuerpo 18, pero no por la administración de dosis subcutáneas mensuales de 100 mg de Anticuerpo 18.

Figura 10. La simulación de los niveles de IL-6 libre en el plasma de un paciente con RA luego de la administración subcutánea de varias dosis del Anticuerpo 18 o el Anticuerpo 18E. La simulación predice que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 se debería lograr por la administración de una sola dosis de carga subcutánea de 200 mg de Anticuerpo 18E seguido por dosis de mantenimiento subcutáneas de 100 mg de Anticuerpo 18E cada 4 u 8 semanas. La simulación predice también que una inhibición sostenida de al menos 90% de señalización mediada por IL-6 no se puede lograr por la administración de 100 mg del Anticuerpo 18 cada 4 u 8 semanas.

Figura 11. Muestra el efecto de mAab406 sobre la hipersensibilidad al calor a 46 °C en el modelo de cola FCA de ratón .

Figura 12. Muestra el efecto de mAab406 sobre la hipersensibilidad a la presión mecánica en el modelo de cola FCA de ratón.

Figura 13. Muestra el efecto de mAab406 sobre la hipersensibilidad al calor en el modelo de FCA de ratón de 24 horas .

Figura 14. Muestra los efectos de mAab406 relacionados con la dosis sobre la hipersensibilidad al calor en el modelo de FCA de ratón de 48 horas .

Figura 15. Muestra los efectos de mAab406 relacionados con la dosis sobre la hipersensibilidad a la presión mecánica en el modelo de FCA de ratón de 24 horas.

Figura 16. Muestra los efectos de mAab406 relacionados con la dosis sobre la hipersensibilidad a la presión mecánica en el modelo de FCA de ratón de 48 horas.

Figura 17. Muestra el efecto del naproxeno de molécula pequeña sobre la hipersensibilidad al calor en el modelo de cola FCA de ratón a 48 horas.

Figura 18. Muestra el efecto del naproxeno de molécula pequeña sobre la hipersensibilidad a la presión mecánica en el modelo de cola FCA de ratón a 48 horas.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a métodos para generar anticuerpos anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. Usando los métodos de la invención, un anticuerpo anti-IL-6 original se puede modificar para generar un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. Cualquier anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente al antígeno de IL-6 humana se puede usar a los efectos de poner en práctica un método de la presente invención. En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la publicación PCT N° WO 2008/065378 se pueden modificar o usar a fines de poner en práctica un método de la presente invención. En una modalidad específica, el anticuerpo anti-IL-6 designado en la publicación PCT N° WO 2008/065378 como Anticuerpo 18 (en lo sucesivo Anticuerpo 18 o Ab 18) se puede modificar o usar a fines de poner en práctica un método de la presente invención.

La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente tiene una semivida in vivo prolongada más larga que la de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención tiene una semivida in vivo prolongada más larga que la del Anticuerpo 18.

La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. En una modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la semivida medida en un mamífero. En otra modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la semivida medida en un primate no humano (por ejemplo, pero sin limitarse a mono cinomolgo o macaco) . En una modalidad adicional, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la semivida medida en un sujeto humano.

En una modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces más larga que la semivida de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 20 veces más larga que la semivida de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En una modalidad adicional, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es entre 2 veces y 3 veces, entre 2 veces y 5 veces, entre 2 veces y 10 veces, entre 3 veces y 5 veces o entre 3 veces y 10 veces más larga que la semivida de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaj e .

En una modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 10 veces o al menos alrededor de 20 veces más larga que la semivida del anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 5 veces, alrededor de 10 veces o alrededor de 20 veces más larga que la semivida de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En una modalidad adicional, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es entre alrededor de 2 veces y alrededor de 3 veces, entre alrededor de 2 veces y alrededor de 5 veces, entre alrededor de 2 veces y alrededor de 10 veces, entre alrededor de 3 veces y alrededor de 5 veces o entre alrededor de 3 veces y alrededor de 10 veces más larga que la semivida de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje.

En una modalidad, la semivida del anticuerpo anti-lL-6 de la invención es de al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 26 días, al menos 27 días, al menos 28 días, al menos 29 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días o al menos 50 días. En otra modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es de 10 días, 15 días, 10 días, 15 días, 20 días, 25 días, 28 días, 29 días, 30 días, 35 días, 40 días, 45 días o 50 días. En una modalidad adicional, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es de entre 10 días y 20 días, entre 10 días y 30 días, entre 10 días y 40 días, entre 10 días y 50 días, entre 20 días y 30 días, entre 20 días y 40 días, entre 20 días y 50 días, entre 25 días y 30 días, entre 25 días y 40 días, entre 25 días y 50 días, entre 30 días y 40 días, entre 30 días y 50 días o entre 40 días y 50 días.

En una modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL- 6 de la invención es de al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días, al menos alrededor de 20 días, al menos alrededor de 25 días, al menos alrededor de 26 días, al menos alrededor de 27 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 29 días, al menos alrededor de 30 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 45 días o al menos alrededor de 50 días. En otra modalidad, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es de alrededor de 10 días, alrededor de 15 días, alrededor de 20 días, alrededor de 25 días, alrededor de 28 días, alrededor de 29 días, alrededor de 30 días, alrededor de 35 días, alrededor de 40 días, alrededor de 45 días o alrededor de 50 días. En una modalidad adicional, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es de entre alrededor de 10 días y alrededor de 20 días, entre alrededor de 10 días y alrededor de 30 días, entre alrededor de 10 días y alrededor de 40 días, entre alrededor de 10 días y alrededor de 50 días, entre alrededor de 20 días y alrededor de 30 días, entre alrededor de 20 días y alrededor de 40 días, entre alrededor de 20 días y alrededor de 50 días, entre alrededor de 25 días y alrededor de 30 días, entre alrededor de 25 días y alrededor de 40 días, entre alrededor de 25 días y alrededor de 50 días, entre alrededor de 30 días y alrededor de 40 días, entre alrededor de 30 días y alrededor de 50 días o entre alrededor de 40 días y alrededor de 50 días.

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-IL-6 con una tasa de depuración disminuida. Se entiende que el término depuración tal como se usa en la presente refleja el volumen de plasma desde el cual la sustancia de fármaco, es decir, el anticuerpo anti-IL-6, se elimina completamente por tiempo de unidad. En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente tiene una tasa de depuración disminuida comparada con la tasa de depuración del anticuerpo anti-IL-6 original. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención tiene una tasa de depuración disminuida comparada con la del Anticuerpo 18.

La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-6 con una tasa de depuración disminuida. En una modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la tasa de depuración medida en un mamífero. En otra modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la tasa de depuración medida en un primate no humano (por ejemplo, pero sin limitarse a, mono cinomolgo o macaco) . En una modalidad adicional, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es la tasa de depuración .medida en un sujeto humano.

En una modalidad, la tasa de depuración del anticuerpo anti-IL-6 de la invención es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En otra modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 20 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En una modalidad adicional, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es entre 2 veces y 3 veces, entre 2 veces y 5 veces, entre 2 veces y 10 veces, entre 3 veces y 5 veces o entre 3 veces y 10 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje.

En una modalidad, la tasa de -depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 10 veces o al menos alrededor de 20 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En otra modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 5 veces, alrededor de 10 veces o alrededor de 20 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaje. En una modalidad adicional, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es entre alrededor de 2 veces y alrededor de 3 veces, entre alrededor de 2 veces y alrededor de 5 veces, entre alrededor de 2 veces y alrededor de 10 veces, entre alrededor de 3 veces y alrededor de 5 veces o entre alrededor de 3 veces y alrededor de 10 veces más baja que la tasa de depuración de un anticuerpo que tiene los mismos dominios variables y dominios constantes de tipo salvaj e .

En una modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es como máximo 1 mL/kg/día, como máximo 2 mL/kg/día, como máximo 3 mL/kg/día, como máximo 4 mL/kg/día, como máximo 5 mL/kg/día, como máximo 7 mL/kg/día, como máximo 10 mL/kg/día, como máximo 15 mL/kg/día o como máximo 20 mL/kg/día. En otra modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 es 1 mL/kg/día, 2 mL/kg/día, 3 mL/kg/día, 4 mL/kg/día, 5 mL/kg/día, 7 mL/kg/día, 10 mL/kg/día, 15 mL/kg/día o 20 mL/kg/día. En una modalidad adicional, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención se encuentra entre 1 mL/kg/día y 2 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 3 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 1 mL/kg/día y 10 mL/kg/día, entre l mL/kg/día y 15 mL/kg/día, entre 2 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 2 mL/kg/día y 10 mL/kg/día, entre 3 mL/kg/día y 5 mL/kg/día, entre 3 mL/kg/día y 10 mL/kg/día o entre 5 mL/kg/día y 10 mL/kg/día.

En una modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es como máximo alrededor de 1 mL/kg/día, como máximo alrededor de 2 mL/kg/día, como máximo alrededor de 3 mL/kg/día, como máximo alrededor de 4 mL/kg/día, como máximo alrededor de 5 mL/kg/día, como máximo alrededor de 7 mL/kg/día, como máximo alrededor de 10 mL/kg/día, como máximo alrededor de 15 mL/kg/día o como máximo alrededor de 20 mL/kg/día. En otra modalidad, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención es de alrededor de 1 mL/kg/día, alrededor de 2 mL/kg/día, alrededor de 3 mL/kg/día, alrededor de 4 mL/kg/día, alrededor de 5 mL/kg/día, alrededor de 7 mL/kg/día, alrededor de 10 mL/kg/día, alrededor de 15 mL/kg/día o alrededor de 20 mL/kg/día. En una modalidad adicional, la tasa de depuración de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención se encuentra entre alrededor de 1 mL/kg/día y alrededor de 2 mL/kg/día, entre alrededor de 1 mL/kg/día y alrededor de 3 mL/kg/día, entre alrededor de alrededor de 1 mL/kg/día y alrededor de 5 mL/kg/día, entre alrededor de 1 mL/kg/día y alrededor de 10 mL/kg/día, entre alrededor de 1 mL/kg/día y alrededor de 15 mL/kg/día, entre alrededor de 2 mL/kg/día y alrededor de 5 mL/kg/día, entre alrededor de 2 mL/kg/día y alrededor de 10 mL/kg/día, entre alrededor de 3 mL/kg/día y alrededor de 5 mL/kg/día, entre alrededor de 3 mL/kg/día y alrededor de 10 mL/kg/día o entre alrededor de 5 mL/kg/día y alrededor de 10 mL/kg/día.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante . En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que tiene una afinidad alterada por una proteína de ligando Fe. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que tiene una afinidad alterada por FcRn. En una modalidad específica, FcRn puede ser una proteína FcRn de ratón, humano o primate (por ej . , cinomolgo) .

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que tiene una afinidad aumentada por una proteína de ligando Fe. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que tiene una afinidad aumentada por FcRn. En una modalidad específica, FcRn puede ser una proteína FcRn de ratón, humano o primate (por ej . , cinomolgo) .

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante cuya afinidad de unión por una proteína de ligando Fe depende del pH. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante con una afinidad de unión por FcRn dependiente del pH. En una modalidad específica, FcRn puede ser una proteína FcRn de ratón, humano o primate (por ej . , cinomolgo) .

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos relativas al dominio constante de IgG humana de tipo salvaje. En diversas modalidades, el dominio constante de IgG humana puede ser un dominio constante de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 humana. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos relativas al dominio constante de IgG humana de tipo salvaje.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: M252Y, M252F, M252 , M252T, S254T, T256S, T256R, T256Q, T256E, T256D, T256T, L309P, Q311S, H433R, H433K, H433S, H433I, H433P, H433Q, N434H, N434F, N434Y y N436H, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU como en Kabat . En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: M252Y, S254T, T256E, H433K, N434F y N436H, donde los residuos de aminoácido están enumerados conforme al índice EU como en Kabat. En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: M252Y, S254T y T256E, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU como en Kabat. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que comprende las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T y T256E donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat . En diversas modalidades, el dominio constante de IgG humana puede ser un dominio constante de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 humana. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que comprende las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T y T256E donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat.

En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-S de la invención comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o las seis CDR del Anticuerpo 18 (véase publicación PCT N° WO 2008/065378) .

Las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada del Anticuerpo 18 definidas conforme a Kabat se identifican como SEQ ID NOíl, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 respectivamente. Las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera del Anticuerpo 18 definidas conforme a Kabat se identifican como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 respectivamente .

La numeración de Kabat se basa en el trabajo seminal de Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicación N° 91-3242, publicado como un conjunto de tres volúmenes por National Institutes of Health, National Technical Information Service (en lo sucesivo "Kabat"). Kabat proporciona múltiples alineaciones de secuencias de cadenas de inmunoglobulina para numerosas especies de isotipos de anticuerpo. Las secuencias alineadas se enumeran conforme al sistema de enumeración único, el sistema de enumeración de Kabat. Las secuencias de Kabat han sido actualizadas desde la publicación de 1991 y se encuentran disponibles como una base de datos de secuencias electrónica (última versión descargable, 1997) . Cualquier secuencia de inmunoglobulina se puede enumerar de acuerdo con Kabat para desempeñar una alineación con la secuencia de referencia de Kabat. Por consiguiente, el sistema de enumeración de Kabat proporciona un sistema uniforme para enumerar cadenas de inmunoglobulina. A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina descritas en la presente se enumeran conforme al sistema de enumeración de Kabat. De manera similar, todas las posiciones de aminoácidos simples a las que se hace referencia en la presente se enumeran conforme al sistema de enumeración de Kabat.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente pueden comprender una región variable de cadena pesada, VH, que comprende una CDR que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO : 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente pueden comprender una región variable de cadena ligera, VL, que comprende al menos una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede comprender un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y también comprende un domino VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

La presente invención comprende anticuerpos que se unen a IL-6 humana, lo que comprende derivados del dominio VH, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH,. dominio VL, CDR1 VL, CDR2 VL o CDR3 VL descritos en la presente que se pueden unir a la IL-6 humana. Las técnicas estándar conocidas para los expertos en la técnica se pueden usar para introducir mutaciones (por ej . , adiciones, eliminaciones y/o sustituciones) en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que se usan de forma rutinaria para generar sustituciones de aminoácidos. En una modalidad, los derivados de CDR VH y/o VL pueden incluir menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, menos de 2 sustituciones de aminoácidos o 1 sustitución de aminoácidos con relación a las CDR VH y/o VL originales del anticuerpo anti-IL-6 Anticuerpo 18. En otra modalidad, los derivados de CDR VH y/o VL pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras (por ej . , como se mencionó anteriormente) realizadas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos (es decir, residuos de aminoácidos que no son críticos para el anticuerpo para unirse específicamente a IL-6 humana) . Las mutaciones también se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de las secuencias de codificación de CDR VH y/o VL, tal como por mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes se pueden explorar para determinar la actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad. Luego de la mutagénesis, el anticuerpo codificado se puede expresar y la actividad del anticuerpo se puede determinar.

La presente invención abarca adicionalmente anticuerpos que se unen a la IL-6 humana, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden una o más CDR donde las CDR comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al merlos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más CDR del Anticuerpo 18. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, búsquedas de proteína BLAST.

La presente invención abarca adicionalmente anticuerpos que se unen a la IL-6 humana, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio VH y/o VL donde los dominios VH y/o VL comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH y VL del Anticuerpo 18. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, búsquedas de proteína BLAST.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención se puede unir a IL-6 humana con una afinidad comparable con la del Anticuerpo 18.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención se une específicamente al mismo epítopo de IL-6 como Anticuerpo 18.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 compite específicamente con el Anticuerpo 18 para unirse a IL-6. El ensayo de competición se puede desempeñar usando un ensayo de unión conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a ensayo ELISA o radioinmunoensayo .

La invención proporciona adicionalmente polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. La invención también abarca polinucleotidos que hibridan en condiciones de hibridación restrictivas o de baja restricción, como se describe en la presente, a polinucleotidos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, un polinucleótido de la invención que codifica un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada descrita en la presente comprende una secuencia de polinucleótido optimizada. En una modalidad específica, un polinucleótido de la invención que codifica el dominio VH de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11. En una modalidad específica, un polinucleótido de la invención que codifica el dominio VL de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12. En una modalidad específica, un polinucleótido de la invención que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13. En una modalidad específica, un polinucleótido de la invención que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14.

Otra modalidad de la invención es un vector que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, un vector de la invención comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada donde la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos optimizada. En una modalidad específica, un vector de la invención comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 11-14. En una modalidad específica adicional, un vector de la invención comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti- IL-6 con semivida in vivo prolongada donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO: 11-14.

La presente invención se refiere también a una célula aislada que comprende un vector donde el vector comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. En una modalidad específica, una célula aislada de la invención comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11- 14.

Los anticuerpos anti-IL-6 de la invención incluyen aquellos de isotipo humano IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4.

La presente invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-IL-6 que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-10.

Los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente pueden tener una alta afinidad de unión por el antígeno de IL-6 humana. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente puede tener una constante de tasa de asociación o tasa kon (anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag)kon ?Ab-Ag) de al menos 2 X 105 M^s"1, al menos 5 X 105 M'V1, al menos 106 M_1s" \ al menos 5 X 106 'V1, al menos 107 M'V1, al menos 5 X 107 M'V1, o al menos 108 M'V1.

En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 puede tener una tasa koff ( (Ab-Ag) k off?anticuerpo (Ab) + antígeno (Ag) ) menor a 5x1o"1 s"1, menor a 10"1 s"1, menor a 5xl0"2 s"1, menor a 10"2 s"1, menor a 5xl0"3 s"1, menor a 10"3 s"1, menor a 5xl0~4 s"1 o menor a 10"4 s"1. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención tiene una kQff menor a 5x10~5 s"1, menor a 10"5 s"1, menor a 5xl0"6 s"1, menor a 10"6 s"1, menor a 5xl0"7 s 1, menor a 10~7 s"1, menor a 5xl0"8 s"1, menor a 10"8 s"1, menor a 5xl0"9 s"1, menor a 10"9 s"1 o menor a 10"x0 s"1.

En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 puede tener una constante de afinidad o Ka (kon/k0ff) de al menos 102 M"1, al menos 5 X 102 "1, al menos 103 M"1, al menos 5 X 103 M"1, al menos 104 "1, al menos 5 X 104 M"1, al menos 105 M"1, al menos 5 X 105 M"1, al menos 106 M"1, al menos 5 X al menos 107 M"1, al menos 5 X 107 NT1, al menos 108 menos 5 X 108 M"1, al menos 109 al menos 1010 M" 1, al menos 5 X 1010 M"1, al menos 1011 M"1, al menos 5 X 1011 M" \ al menos 1012 M"1, al menos 5 X 1012 M"1, al menos 1013 "1, al menos 5 X 1013 M 1, al menos 1014 M"1, al menos 5 X 1014 "1, al menos 1015 M"1 o al menos 5 X 1015 M"1. En aun otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 puede tener una constante de disociación o Kd (koff/kon) menor a 5xl0~2 M, menor a 10~2 M, menor a 5xl0"3 M, menor a 10~3 M, menor a 5xl0~4 M, menor a 10"4 M, menor a 5xl0"5 M, menor a 10"5 M, menor a 5xl0"6 M, menor a 10"6 M, menor a 5xl0"7 M, menor a 10"7 M, menor a 5xl0"8 M, menor a 10"8 M, menor a 5xl0"9 M, menor a 10"9 M, menor a 5x10" 10 M, menor a 10"10 M, menor a 5x1o"11 M, menor a 10"11 M, menor a 5xl0~12 M, menor a 10"12 M, menor a 5xl0~13 M, menor a 10"12 M, menor a 5xl0"14 M, menor a 10"14 M, menor a 5xl0"155 M o menor a 10"15 M.

Un anticuerpo usado de acuerdo con un método descrito en la presente puede unirse inmunoespecíficamente a IL-6 y puede tener una constante de disociación (Kd) menor a 3000 pM, menor a 2500 pM, menor a 2000 pM, menor a 1500 pM, menor a 1000 pM, menor a 750 pM, menor a 500 pM, menor a 250 pM, menor a 200 pM, menor a 150 pM, menor a 100 pM, menor a 75 pM según se evalúa usando un método descrito en la presente o conocido para un experto en la técnica (por ej . , un ensayo BIAcore, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) . En una modalidad específica, un anticuerpo usado de acuerdo con un método descrito en la presente puede unirse inmunoespecíficamente a un antígeno de IL-6 humana y puede tener una constante de disociación (Kd) entre 25 y 3400 pM, 25 y 3000 pM, 25 y 2500 pM, 25 y 2000 pM, 25 y 1500 pM, 25 y 1000 pM, 25 y 750 pM, 25 y 500 pM, 25 y 250 pM, 25 y 100 pM, 25 y 75 pM, 25 y 50 pM según se evalúa usando un método descrito en la presente o conocido para un experto en la técnica (por ej . , un ensayo BIAcore, ELISA) . En otra modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 usado de acuerdo con un método descrito en la presente puede unirse inmunoespecíficamente a IL-6 y puede tener una constante de disociación (Kd) de 500 pM, 100 pM, 75 p o 50 pM según se evalúa usando un método descrito en la presente o conocido par aun experto en la técnica (por ej . , ensayo BIAcore, ELISA) .

La invención proporciona adicionalmente polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada. La invención también abarca polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación restrictivas o de baja restricción, por ej . , tal como se describe en la presente, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo anti-IL-6 con semivida in vivo prolongada.

Las condiciones de hibridación restrictivas incluyen pero no se limitan a, hibridación a ADN unido a filtro en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45 °C seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC/0.1% SDS a alrededor de 50-65°C, condiciones de alta restricción tales como hibridación a ADN unido a filtro en 6X SSC a alrededor de 45°C seguido por uno o más lavados en 0. IX SSC/0.2% SDS a alrededor de 60°C, o cualesquiera otras condiciones de hibridación restrictivas conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds . 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol . 1, Green Publishing Associates, Inc. y John iley and Sons, Inc., NY páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3).

Los polinucleótidos se pueden obtener y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos se puede determinar, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se debe armar a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados, (por ej . , como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994) ) , lo que brevemente implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligación de esos oligonucleótidos y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

Un polinucleótido que codifica un anticuerpo también se puede generar a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo en particular no está disponible pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de una fuente adecuada (por ej . , una biblioteca de ADNc de anticuerpo o una biblioteca de ADNc generada a partir de ácido nucleico, preferentemente polyA+ARN, aislado de cualquier tejido o de células que expresan el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación de PCR usando cebadores sintéticos que se pueden hibridar a los extremos 3 ' y 51 de la secuencia o por medio de clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica para una secuencia genética particular para identificar, por ej . , un clon de ADNc a partir de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR luego se pueden clonar en vectores de clonación reproducidos usando cualquier método bien conocido en la técnica.

IL-6 se ha visto implicada en una cantidad de enfermedades y afecciones. Estas enfermedades y afecciones incluyen pero no se limitan a inflamación, dolor y cáncer. Los anticuerpos anti-IL-6 ingeniosos descritos en la presente son preferentemente capaces de, por ejemplo, neutralizar IL-6, reducir los niveles de IL-6 en el cuerpo y antagonizar la señalización de IL-6. Como tal, los anticuerpos anti-IL-6 ingeniosos son preferentemente capaces de actuar como fármacos para tratar estas enfermedades y afecciones .

La presente invención también proporciona anticuerpos que neutralizan eficazmente la actividad de IL-6 en un sujeto durante períodos prolongados de tiempo. Sin verse limitados por un mecanismo específico de acción, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede neutralizar la IL-6 uniéndola y evitando así que la IL-6 participe en las interacciones de proteína que son necesarias para la transducción de señales mediadas por IL-6. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de reducir la concentración en plasma de IL-6 libre (es decir, no unido a ningún anticuerpo anti-IL-6). Los niveles de IL-6 libre en fluido biológico (por ej . , plasma) pueden determinarse usando bioensayos cuantitativos, por ejemplo, pero sin limitarse a bioensayos descritos en Papadopoulos et. al, Journal of Clinical Laboratory Analysis 9:234-37 (1995). En resumen, el bioensayo mide la proliferación inducida por IL-6 de células de hibridoma particulares (por ej . , células de hibridoma B9) . La concentración de IL-6 libre también se puede determinar por un inmunoensayo tipo sandwich. En resumen, la IL-6 libre en suero es capturada por un anticuerpo anti-IL-6 de captura. Este anticuerpo de captura solo se une a IL-6 en la ausencia del Anticuerpo 18E y el receptor de IL-6 soluble. La IL-6 capturada se detecta por un anticuerpo de detección que no compite con el anticuerpo de captura y está marcada con rutenio o HRP. La señal colorimétrica o electroquimioluminiscente medida es proporcional a la concentración sérica de IL-6 libre. La concentración sérica de IL-6 libre se calcula con base en una curva estándar.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de reducir la concentración sérica de IL-6 libre (es decir, no unida por anticuerpo anti-IL-6) . La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción de la concentración sérica de IL-6 libre. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La reducción de los niveles de IL-6 libre puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En otra modalidad, la administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar una reducción sostenida de al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% en la concentración sérica de IL-6 libre.

En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 4 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% en la concentración sérica de IL-6 libre. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 8 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% en la concentración sérica de IL-6 libre. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 12 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% en la concentración sérica de IL-6 libre. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de neutralizar la IL-6 en suero en un sujeto. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de neutralización de la IL-6 en suero. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La neutralización de IL-6 en suero puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En otra modalidad, la administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar una neutralización sostenida de al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de IL-6 en suero. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas . En una modalidad específica, la administración de una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 4 semanas logra una neutralización sostenida de al menos 90% de IL-6 en suero. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 8 semanas logra una neutralización sostenida de al menos 90% de IL-6 en suero. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 12 semanas logra una neutralización sostenida de al menos 90% de IL-6 en suero. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de inhibir la señalización mediada por IL-6 en un sujeto. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de inhibición de la señalización mediada por IL-6 en un sujeto. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La inhibición de la señalización mediada por IL-6 en un sujeto puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En otra modalidad, la administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar una inhibición sostenida de al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de- señalización mediada por IL-6 en un sujeto. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 4 semanas logra una inhibición sostenida de al menos 90% en la señalización mediada por IL-6 en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 8 semanas logra una inhibición sostenida de al menos 90% en la señalización mediada por IL-6 en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 12 semanas logra una inhibición sostenida de al menos 90% en la señalización mediada por IL-6 en un sujeto. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de reducir el crecimiento celular sinovial en un sujeto. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción del crecimiento celular sinovial en un sujeto. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La reducción del crecimiento celular sinovial en un sujeto puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En otra modalidad, la administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar una reducción sostenida de al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% del crecimiento celular sinovial en un sujeto. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende, la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 4 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% del crecimiento celular sinovial en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 8 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% del crecimiento celular sinovial en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 12 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% del crecimiento celular sinovial en un sujeto. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de reducir la inflamación sinovial en un sujeto. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción de la inflamación sinovial en un sujeto. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La reducción de la inflamación sinovial en un sujeto puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En otra modalidad, la administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención puede alcanzar una reducción sostenida de al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de la inflamación sinovial en un sujeto. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. Una dosis efica2 puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 4 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% de la inflamación sinovial en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 8 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% de la inflamación sinovial en un sujeto. En una modalidad específica, la administración de una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención cada 12 semanas logra una reducción sostenida de al menos 90% de la inflamación sinovial en un sujeto. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para reducir la concentración sérica de IL-6 libre, para neutralizar la IL-6 en suero de un sujeto, para inhibir la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto, para reducir el crecimiento celular sinovial en un sujeto y para reducir la inflamación sinovial en un sujeto.

En una modalidad, un método para reducir la concentración sérica de IL-6 libre (es decir, no unida por un anticuerpo anti-IL-6) en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con una semivida más prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL- 6 de la invención puede alcanzar al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción en la concentración sérica de IL-6 libre. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg , 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL- 6 descrito en la presente. La reducción de los niveles IL-6 libre puede durar por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para reducir la concentración sérica de IL-6 libre en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida más prolongada, donde la reducción de al menos 90% de la concentración sérica de IL-6 libre dura por al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para reducir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede reducir la concentración sérica de IL-6 libre en al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100%. En una modalidad, un método para mantener una concentración reducida en suero de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción en la concentración sérica de IL-6 libre. En una modalidad, un método para lograr una reducción sostenida en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida más prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti -IL-6 puede lograr al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de reducción sostenida en la concentración sérica de IL-6 libre. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad ie an icuerpo anti-IL-6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL -6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial es seguida por dosis de mantenimiento posteriores. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una. modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto en al menos un 90% comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad especifica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos un 90% en la concentración sérica de IL-6 libre en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un método para neutralizar la IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con una semivida prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de neutralización de la IL-6 en suero. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La neutralización de IL-6 en suero puede durar al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada, donde la neutralización de al menos el 90% de IL-6 en suero dura al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para neutralizar la IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de neutralización de la IL-6 en suero. En una modalidad, un método para mantener la neutralización de la IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar más de Una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener una neutralización de al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de la IL-6 en suero. En una modalidad, un método para lograr una neutralización sostenida de la IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr una neutralización sostenida de al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de la IL-6 en suero. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en suero en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un método para neutralizar la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de neutralización de la IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. La neutralización de IL-6 puede durar al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada, donde la neutralización de al menos el 90% de IL-6 dura al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para neutralizar la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de neutralización de la IL-6. En una modalidad, un método para mantener la neutralización de la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener una neutralización de al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de la IL-6. En una modalidad, un método para lograr una neutralización sostenida de la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr una neutralización sostenida de al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de la IL-6.

En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, . por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una .neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para neutralizar al menos alrededor del 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una neutralización de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una neutralización sostenida de al menos el 90% de la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un método para inhibir señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 99% o al menos alrededor de 100% de inhibición de la señalización mediada por la IL-6. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. La inhibición de la señalización mediada por la IL-6 puede durar al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada, donde la inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 dura al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para inhibir la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de inhibición de la señalización mediada por la IL-6. En una modalidad, un método para mantener la inhibición de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de inhibición de la señalización mediada por la IL-6. En una modalidad, un método para lograr una inhibición sostenida de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de inhibición sostenida de la señalización mediada por la IL-6. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para inhibir al menos alrededor del 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una inhibición de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad especifica, un método para lograr una inhibición sostenida de al menos el 90% de la señalización mediada por la IL-6 en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad, un método para disminuir el crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de disminución del crecimiento de células sinoviales. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. La disminución del crecimiento de células sinoviales puede durar al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada, donde la disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales dura al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para disminuir el crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de disminución del crecimiento de células sinoviales. En una modalidad, un método para mantener la disminución del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener en al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% la disminución del crecimiento de células sinoviales. En una modalidad, un método para lograr una disminución sostenida del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de disminución sostenida del crecimiento de células sinoviales. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener en al menos el 90% una disminución del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos del 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-lL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para disminuir el crecimiento de células sinoviales en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir el crecimiento de células sinoviales en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir el crecimiento de células sinoviales en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% del crecimiento de células sinoviales en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad, un método para disminuir la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de una dosis eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de disminución de la inflamación sinovial. Una dosis eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. La disminución de la inflamación sinovial puede durar al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis eficaz de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada, donde la disminución de al menos el 90% de la inflamación sinovial dura al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 4 días, al menos alrededor de 5 días, al menos alrededor de 6 días, al menos alrededor de 7 días, al menos alrededor de 10 días, al menos alrededor de 15 días o al menos alrededor de 20 días.

En una modalidad, un método para disminuir la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 30%, al menos alrededor de un 40%, al menos alrededor de un 50%, al menos alrededor de un 60%, al menos alrededor de un 70%, al menos alrededor de un 80%, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 99% o al menos alrededor de un 100% de disminución de la inflamación sinovial. En una modalidad, un método para mantener la disminución de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede mantener al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de disminución de la inflamación sinovial. En una modalidad, un método para lograr una disminución sostenida de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. La administración de más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 puede lograr una disminución sostenida de al menos alrededor del 20%, al menos alrededor del 30%, al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, al menos alrededor del 90%, al menos alrededor del 95%, al menos alrededor del 97%, al menos alrededor del 99% o al menos alrededor del 100% de la inflamación sinovial. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. Una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti IL-6 descrito en la presente. En otra modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. La dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa las dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez . cada ocho semanas o una vez cada doce semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano .

En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir al menos alrededor del 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener en al menos el 90% la disminución de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener en al menos el 90% la disminución de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas . En una modalidad específica, un método para mantener en al menos el 90% la disminución de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

En una modalidad específica, un método para disminuir la inflamación sinovial en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la inflamación sinovial en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-5 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para disminuir la inflamación sinovial en al menos alrededor del 90% en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para mantener una disminución de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar úna dosis de carga de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad específica, un método para lograr una disminución sostenida de al menos el 90% de la inflamación sinovial en un sujeto comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de un anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. Un sujeto puede ser un primate humano o no humano.

Aspectos adicionales de la presente invención proporcionan composiciones que contienen miembros de unión de la invención y su uso en métodos para unir, inhibir y/o neutralizar la IL-6, incluyendo métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Los miembros de unión de acuerdo con la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento o diagnóstico, como un método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en el cuerpo humano o animal (por ej . , en un paciente humano) , que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención. Las afecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen cualquiera en la que tenga incidencia la IL-6, según se trata con más detalle en otro punto de la presente.

En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE en un humano comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad específica, un método para tratar artritis reumatoide en un humano comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad específica, un método para tratar enfermedad inflamatoria intestinal o SLE en un humano comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad, una dosis terapéuticamente eficaz puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. En una modalidad, una dosis terapéuticamente eficaz puede comprender alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de anticuerpo anti-IL-6. En otra modalidad, una dosis terapéuticamente eficaz puede comprender alrededor de 20-500 mg, alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo anti-IL-6. Un anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa. En una modalidad específica, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende administrar 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad específica, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende administrar alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad específica, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende administrar alrededor de 20-500 mg, alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada.

En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE en un humano comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad específica, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o SLE en un humano comprende administrar más de una dosis de un anticuerpo anti-IL-6 con semivida prolongada. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL6. En una modalidad, una dosis única puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. En una modalidad, una dosis única puede comprender alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de anticuerpo anti-IL-6. En otra modalidad, una dosis única puede comprender alrededor de 20-500 mg alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo anti-IL-6. En una modalidad, cada una de las varias dosis comprende la misma cantidad de anticuerpo anti-IL-6. En una modalidad, una dosis de carga inicial se sigue con dosis posteriores de mantenimiento. En una modalidad, una dosis de carga inicial puede comprender dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o diez veces más del anticuerpo anti-IL-6 que las dosis de mantenimiento. En una modalidad, una dosis de carga puede comprender 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg o 500 mg de un anticuerpo anti-IL-6 descrito en la presente. En una modalidad, una dosis de carga puede comprender alrededor de 0.1-5 mg/kg, alrededor de 0.1-2 mg/kg, alrededor de 0.1-1 mg/kg, alrededor de 0.3-2 mg/kg, alrededor de 0.3-1 mg/kg, alrededor de 0.5-2 mg/kg o alrededor de 0.5-1 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-6. En otra modalidad, una dosis de carga puede comprender alrededor de 20-500 mg alrededor de 20-200 mg, alrededor de 20-100 mg, alrededor de 50-500 mg, alrededor de 50-200 mg o alrededor de 50-100 mg de anticuerpo anti-IL-6. En una modalidad, el intervalo de tiempo que separa la administración de dosis es constante. Las dosis de anticuerpo anti-IL-6 se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada doce semanas, una vez cada dieciséis semanas o una vez cada seis meses. El anticuerpo anti-IL-6 se puede administrar usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante inyección subcutánea o intravenosa.

En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar un humano que lo necesita comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas.

En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , psoriasis o SLE comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas.

En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o SLE en un humano comprende administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o SLE en un humano comprende administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal o SLE en un humano comprende administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende (a) administrar una dosis de carga de 100 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 50 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 4 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende (a) administrar una dosis de carga de 200 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 100 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 8 semanas. En una modalidad, un método para tratar artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria o SLE en un humano comprende (a) administrar una dosis de carga de 400 mg de anticuerpo anti-IL-6 y (b) administrar una dosis de 200 mg de un anticuerpo anti-IL-6 cada 12 semanas.

Anticuerpos anti-IL-6 Los miembros de unión de acuerdo con la invención han mostrado neutralizar la IL-6 con gran potencia. La neutralización significa la inhibición de una actividad biológica de la IL-6 Los miembros de unión de la invención pueden neutralizar una o más actividades de la IL-6. La actividad biológica inhibida es típicamente la unión de la IL-6 a uno o más de sus compañeros de unión. Por ejemplo, la actividad biológica inhibida puede ser la unión de IL-6 a IL-6R a transmembrana y/o soluble. Esto se puede demostrar en los siguientes ensayos, que se describen brevemente aquí y con más detalle a continuación: El ensayo de TF-1 muestra que los miembros de unión de acuerdo con la invención inhiben la unión de la IL-6 a IL-6Ra de membrana como las células TF-1 no parecen producir IL-6Ra soluble. Como tales, los miembros de unión de la invención inhiben por lo tanto la unión de la IL-6 al receptor de membrana. En el ensayo de fibroblastos sinoviales, los miembros de unión de acuerdo con la invención inhiben la unión de la IL-6 a IL-6Ra soluble, dado que es necesario agregar sIL-6Ra a este ensayo para que funcione. La IL-1 beta agregada induce la producción de IL-6 endógena que, cuando es inhibida por un miembro de unión de la presente invención, evita la producción de VEGF.

De acuerdo con la invención, se puede inhibir la unión de IL-6 a IL-6R0C de primates humanos o no humanos, por ej . , cinomolgos, por ej . , un miembro de unión puede inhibir la unión de IL-6 humana madura a IL-6Ra.

La inhibición de la actividad biológica puede ser parcial o total. Los miembros de unión pueden inhibir la actividad biológica de la IL-6 en un 100% o al menos en un 95%, al menos en un 90%, al menos en un 85%, al menos en un 80%, al menos en un 75%, al menos en un 70%, al menos en un 60% o al menos en un 50% de la actividad en ausencia del miembro de unión.

Se puede determinar la potencia de neutralización de un miembro de unión. La potencia se expresa normalmente como un valor de IC50 en nM, a menos que se exprese lo contrario. En ensayos funcionales, la IC50 es la concentración de un miembro de unión que disminuye una respuesta biológica en el 50% de su máximo. En estudios de unión al ligando, la IC50 es la concentración que disminuye la formación del complejo ligando-receptor en el 50% del nivel de unión específico máximo. La IC50 se puede calcular graficando el % de respuesta biológica máxima como una función del logaritmo de la concentración de miembros de unión y usando un programa informático, como Prism (GraphPad) u Origin (Origin Labs) para ajustar una función sigmoidal a los datos para generar valores de IC50- La potencia se puede determinar o medir usando uno o más ensayos conocidos por el experto y/o según se describe o indica en la presente.

La neutralización de la actividad de la IL-6 mediante un miembro de unión en un ensayo descrito en la presente, por ej . , el ensayo de proliferación de TF-1 u otros ensayos basados en células descritos en lo sucesivo, indica que el miembro de unión une y neutraliza la IL-6. Otros métodos que se pueden utilizar para determinar la unión de un miembro de unión a la IL-6 incluyen ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad y ensayos bioquímicos .

Los miembros de unión descritos en la presente demostraron unir y neutralizar los efectos biológicos de la IL-6 humana endógena, según se muestra en un ensayo de inhibición de la liberación de VEGF a partir de fibroblastos sinoviales humanos en respuesta a la IL-6 humana endógena, como se informa en los Ejemplos 1.7 y 2.7 en la presente. En este ensayo, los fibroblastos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide producen IL-6 en respuesta a la estimulación con IL-?ß e IL-6Ra soluble, lo que lleva a una secreción de VEGF inducida por la IL-6. La IL-6 producida por los fibroblastos sinoviales humanos representa, por lo tanto, IL-6 humana endógena. La IL-6 endógena es la diana molecular del tratamiento médico en humanos, por lo que la neutralización de la IL-6 endógena es un indicador importante del potencial terapéutico de los miembros de unión. Dado que los ensayos se realizaron con fibroblastos sinoviales obtenidos de pacientes con artritis reumatoide, los resultados son particularmente relevantes para el uso de los miembros de unión en el tratamiento de artritis reumatoide. La potencia de neutralización de moléculas de anticuerpo optimizadas analizadas en el ensayo de liberación de VEGF sobrepasó la del anticuerpo anti-IL-6 CNTO-328.

Un miembro de unión de acuerdo con la invención puede tener una IC50 menor a 50 nM, por ej . , menor a 5 nM, por ej . , menor a 1 nM en un ensayo de inhibición de la liberación de VEGF a partir de fibroblastos sinoviales humanos estimulados con 0.6 pM de IL-1 humana y 2.4 nM de IL-6Ra humano soluble.

Se sabe que la IL-6 endógena es una mezcla de formas glucosiladas y no glucosiladas . Se ha demostrado la unión de un miembro de unión de la invención a la IL-6 endógena en el ensayo de fibroblastos sinoviales, ya que este ensayo utiliza IL-6 de fibroblastos sinoviales humanos, es decir, IL-6 endógena.

Un miembro de unión de la invención puede inhibir la proliferación de células TF-1 inducida por la IL-6. TF-1 es una línea celular premieloide humana establecida a partir de un paciente con eritroleucemia (Kitamura et al 1989) . La línea celular TF-1 necesita la presencia de un factor de crecimiento para la supervivencia y la proliferación. Las células TF-1 de factores de crecimiento individuales pueden responder para incluir la IL-6, GM-CSF y oncostatina M. Un miembro de unión de la invención puede tener una IC50 menor a 100 nM, por e . , menor a 20 nM, 10 nM o 1 nM, por ej . , menor a 100 p , 70 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM o 10 p , en un ensayo de inhibición de la proliferación de células TF-1 en respuesta a 20 pM de IL-6 humana. Como se describe en la presente (ver Ejemplo 1.5), una IgG principal "CAN022D10" mostró tener una IC50 en el ensayo de proliferación de TF-1 de alrededor de 93 nM y, posteriormente, generamos variantes optimizadas de CAN022D10 con una potencia considerablemente mayor (una IC50 generalmente menor a 100 pM) , según se muestra en los Ejemplos 2.2, 2.5 y 2.6 (Tablas 3, 4 y 5, respectivamente) . Notablemente, la medición de los valores de IC5o de algunos de los clones optimizados resultó baja, como 5 pM o inferior, por ejemplo, el anticuerpo 7, el anticuerpo 17 y el anticuerpo 18 de la IgG de línea germinal que representan una potencia de neutralización de estos anticuerpos extremadamente alta.

Un miembro de unión de la invención puede inhibir la proliferación de células B9 inducida por la IL-6. Las células B9 son un subclón de la línea celular de hibridoma de célula B de murino, B13.29, seleccionado con base en su respuesta específica a la IL-6. Las células B9 necesitan la IL-6 para la supervivencia y la proliferación y responden a concentraciones muy bajas de IL-6. De esta forma, se puede evaluar la proliferación de estas células en presencia de un anticuerpo de IL-6 y se puede determinar la afinidad del anticuerpo. El Ejemplo 2.10 en la presente muestra que el Anticuerpo 18 inhibió la proliferación de células B9 en respuesta a la IL-6 y mostró alta afinidad en este ensayo.

La producción de autoanticuerpos en artritis reumatoide es mayormente de la clase de IgM. SKW6.4 es una IgM clonal que secreta a línea de células B linfoblastoide humana. Tras la estimulación con IL-6, estas células secretan IgM, por lo tanto, este ensayo se consideró relevante para la artritis reumatoide. Las células SKW6.4 se pueden utilizar en un ensayo para determinar la potencia de los miembros de unión para neutralizar la IL-6 determinando la inhibición de la secreción de IgM en respuesta a la IL-6. Un miembro de unión de la invención puede tener una IC50 menor a 10 pM, por ej . , menor a 5 pM, en un ensayo de células SKW6.4 de inhibición de la secreción de IgM en respuesta a 100 pM de IL-6 humana. El anticuerpo 18 mostró que neutralizaba los efectos de la IL-6 en este ensayo -ver el Ejemplo 2.11 (Tabla 9) .

La invención proporciona miembros de unión de gran afinidad a la IL-6 humana. También se demostró la gran afinidad a la IL-6 de mono cinomolgo. Un miembro de unión de la invención puede unir la IL-6 humana y/o la IL-6 de cinomolgo con una KD no mayor a 1 nM, por ej . , no mayor a 100 pM, 50 pM, 30 pM o 10 pM. La KD se puede determinar mediante resonancia de plasmones superficiales, por ej . , BIAcore®. Las mediciones de afinidad de BIAcore® se describen en la presente en el Ejemplo 2.9. Notablemente, se descubrió que la afinidad de los anticuerpos 7 y 18 superaba el límite medible, usando el instrumento BIAcore®, con un valor de KD inferior a 10 pM.

Como se describe en otro punto en la presente, la resonancia de plasmones superficiales implica el pasaje de un analito en fase de fluido por un ligando unido a un soporte y determinar la unión entre el analito y el ligando. Se puede realizar una resonancia de plasmones superficiales donde, por ejemplo, la IL-6 se pasa en fase de fluido a través de un miembro de unión unido a un soporte. Los datos de la resonancia de plasmones superficiales se puede ajustar a un modelo de datos de analito' monovalente. Se puede calcular una constante de afinidad Kd a partir de la relación de constantes de velocidad kd/ka determinada mediante resonancia de plasmones superficiales usando un modelo de datos de analito monovalente.

La afinidad de un miembro de unión a la IL-6 se pude calcular alternativamente mediante análisis de Schild, por ej . , con base en un ensayo de inhibición de la proliferación de células TF-1 en respuesta a diferentes concentraciones de IL-6 humana. Un miembro de unión de la invención puede tener una afinidad menor a 10 pM, por ej . , menor a 1 pM, según se calcula usando el análisis de Schild. Como se indica en el Ejemplo 2.10 en la presente, la afinidad del Anticuerpo 18 a la IL-6 humana se calculó como 0.4 pM usando el análisis de Schild.

Un miembro de unión de la invención puede opcionalmente no presentar reactividad cruzada con uno o más o todos los siguientes: factor inhibitorio de la leucemia (LIF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , IL-11 u oncostatina .

Un miembro de unión de la invención puede opcionalmente no presentar reactividad cruzada con la IL-6 de rata, IL-6 de ratón y/o IL-6 de perro.

La reactividad cruzada de miembros de unión para unir otras proteínas o IL-6 no humana se puede analizar, por ejemplo, en un ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo para determinar la inhibición de la unión de la IL-6 humana al miembro de unión inmovilizado en un soporte, como el ensayo de competición de epítopos DELFIA®, según se describe en el Ejemplo 1.6. Por ejemplo, todos o cualquiera de LIF, CNTF, IL-11, oncostatina M, IL-6 de rata, e IL-6 de ratón pueden no mostrar inhibición alguna, mostrar inhibición menor al 50 % o tener una IC50 mayor a 0.5 mM o mayor a 1 mM en el ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo para determinar la inhibición de la unión de la IL-6 humana marcada al miembro de unión inmovilizado en un soporte. Por ejemplo, todos o cualquiera deLIF, CNTF, IL-11, oncostatina M, IL-6 de rata e IL-6 de ratón pueden no mostrar inhibición alguna o pueden tener una IC50 al menos 10 o 100 veces mayor a la de la IL-6 humana no marcada en el ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo para analizar la reactividad cruzada. En este ensayo, se utilizó IL-6 humana madura de tipo salvaje marcada en una concentración final de la Kd de su interacción con el miembro de unión.

Un miembro de unión de la invención puede presentar reactividad cruzada con la IL-6 de cinomolgo. La reactividad cruzada se puede determinar como la inhibición de la unión de la IL-6 humana marcada al miembro de unión inmobilizado en un soporte en el ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo descrito anteriormente. Por ejemplo, la IL-6 de cinomolgo puede tener una IC50 menor a 5 nM, por ej . , menor a 2.5 nM, por ej . , alrededor de 1 nM, en este ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo. La IL-6 de cinomolgo puede tener una IC50 menor a 10 veces diferente, por ej . , menor a 5 veces diferente, a la ICS0 de la IL-6 humana no marcada de este ensayo.

En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 une un ep topo en la IL-6 que se conserva entre las secuencias de IL-6 humana y de cinomolgo y es diferente en la secuencia de IL-6 de ratón, rata y perro, en comparación con la secuencia humana .

En una modalidad, los miembros de unión unen la región "sitio 1" de la IL-6, que es la región que interactúa con el IL-6R0C. Los miembros de unión de la invención pueden inhibir por lo tanto de forma competitiva la unión de la IL-6 al IL-6Ra, mediante lo cual se neutralizan los efectos biológicos de la IL-6 mediados a través del lL-6R .

Un miembro de unión de la invención puede unir la IL-6 humana en Phel02 y/o Ser204. Un miembro de unión de la invención también puede unir la IL-6 humana en Arg207. Opcionalmente , un miembro de unión puede unir residuos flanqueantes o residuos estructuralmente cercanos en la molécula de IL-6, además de unir Phel02 y/o Ser 204. Por costumbre, la numeración de los residuos corresponde a la IL-6 humana de longitud completa (SEQ ID NO: 15) . No obstante, la unión se puede determinar usando IL-6 humana madura. La unión a residuos de IL-6 se produce según se determina mediante mutagénesis dirigida al sitio, como se explica a continuación.

La mutagénesis de aminoácidos y regiones de proteínas individuales para obtener una correlación entre la estructura y la actividad es muy conocida por el experto en la técnica y se ha utilizado para definir regiones de proteínas que se unen a anticuerpos (Lu et al., (2005) Biochemistry 44:11106-14) . La unión y/o la neutralización con respecto a la IL-6 humana mutante se puede utilizar para evaluar si un miembro de unión une Phel02, Ser204 y/o Arg207. La ausencia de unión o neutralización o unión o neutralización considerablemente menores, con relación a la IL-6 en comparación con el tipo salvaje, indica que un miembro de unión une el residuo mutado .

La unión a un residuo en la IL-6 se puede determinar usando IL-6 mutada en el residuo seleccionado en un ensayo de fluorescencia con resolución en el tiempo de inhibición de la unión de la IL-6 humana de tipo salvaje marcada al miembro de unión inmovilizado en un soporte, donde la IL-6 humana madura de tipo salvaje marcada se encuentra en una concentración final igual a la Kd de su interacción con el miembro de unión. Cuando la IL-6 mutante no inhibe la unión de IL-6 de tipo salvaje marcada al miembro de unión o cuando la IL-6 mutante tiene una ICS0 mayor a la de la IL-6 de tipo salvaje no marcada (por ej . , más de 10 veces o 100 veces mayor) , esto indica que el residuo mutado está unido por el miembro de unión.

Un miembro de unión de la invención puede opcionalmente no unir y/o neutralizar la IL-6 humana mutante con una mutación en el residuo Phel02, Ser204 y/o Arg207, por ej . , mutación Phel02Glu, Ser204Glu, Ser204Tyr y/o Arg207Glu.

Un miembro de unión de la invención puede comprender una molécula de anticuerpo, por ej . , una molécula de anticuerpo humano. El miembro de unión normalmente comprende un dominio VH y/o VL de anticuerpo. Los dominios VH y VL de miembros de unión también se proporcionan como parte de la invención. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL hay regiones determinantes de complementariedad, ("CDRs") y regiones flanqueantes ( " FRs" ) . Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR y un dominio VL comprende un conjunto de LCDRs. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 VH y una región flanqueante. De manera alternativa o adicional, puede comprender un dominio VL de anticuerpo que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 VL y una región flanqueante. Una región flanqueante de dominio VH o VL comprende cuatro regiones flanqueantes, FR1, FR2 , FR3 y FR4 , intercaladas con CDR en la siguiente estructura: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Los ejemplos de CDRs y dominios VH y VL de anticuerpo de acuerdo con la presente invención se listan en el listado de secuencias que forma parte de la presente descripción. CDR adicionales se describen en la Publicación PCT No. WO 2008/065378. Todas las secuencias VH y VL, las secuencias de CDR, los conjuntos de CDR y los conjuntos de HCDR y conjuntos de LCDR descritos en la presente y en la Publicación PCT No. WO 2008/065378 representan aspectos y modalidades de la invención. Como se describe en la presente, un "conjunto de CDRs" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Por consiguiente, un conjunto de HCDR hace referencia a HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y un conjunto de LCDRs hace referencia a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Salvo que se exprese lo contrario, un "conjunto de CDRs" incluye HCDRs y LCDRs. Típicamente, los miembros de unión de la invención son anticuerpos monoclonales .

Un miembro de unión de la invención puede comprender un sitio de unión al antígeno dentro de una molécula que no es de anticuerpo, normalmente proporcionado por una o más CDRs, por ej . , un conjunto de CDRs en un andamiaje de proteína que no es de anticuerpo, como se expresa con más detalle a continuación .

Como se indicó anteriormente, un miembro de unión de acuerdo con la presente invención modula y puede neutralizar una actividad biológica de la IL-6. Como se describe en la presente, los miembros de unión a la IL-6 de la presente invención se pueden optimizar para obtener mayor potencia de neutralización. Generalmente, la optimización de la potencia implica la mutación de la secuencia de un miembro de unión seleccionado (normalmente la secuencia de dominio variable de un anticuerpo) para generar una biblioteca de miembros de unión que luego se ensayan para analizar su potencia y se seleccionan los miembros de unión más potentes. Los miembros de unión "con potencia optimizada" seleccionados de tal forma tienden a poseer una mayor potencia que el miembro de unión a partir del cual se generó la biblioteca. No obstante, los miembros de unión de gran potencia también se pueden obtener sin optimización, por ejemplo, un miembro de unión de gran potencia se puede obtener directamente a partir de un análisis inicial, por ej . , un ensayo de neutralización bioquímico. Un miembro de unión "con potencia optimizada" hace referencia a un miembro de unión con potencia optimizada de neutralización de una actividad particular o función corriente abajo de la IL-6. Los ensayos y las potencias se describen con más detalle en otro punto de la presente. La presente invención proporciona miembros con potencia optimizada y no optimizada, así como métodos para optimizar la potencia a partir de un miembro de unión seleccionado. Por consiguiente, la presente invención permite al experto generar miembros de unión con gran potencia.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para obtener uno o más miembros de unión que pueden unir el antígeno. El método incluye poner en contacto una biblioteca de miembros de unión de acuerdo con la invención con el antígeno y seleccionar uno o más miembros de unión de la biblioteca que puedan unir el antígeno.

La biblioteca se puede expresar en partículas o complejos moleculares, por ej . , paquetes genéticos reproducibles, como partículas, virus o células de levadura, bacterias o bacteriófagos (por ej . , T7) o sistemas de expresión in vitro covalentes, ribosomales u otros, donde cada partícula o complejo molecular contiene ácido nucleico que codifica el dominio variable VH de anticuerpo que allí se expresa y, opcionalmente, también un dominio VL expresado, si estuviera presente. La expresión en fagos se describe en WO92/01047 y, por ej . , en las patentes estadounidenses US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Luego de la selección de miembros de unión que pueden unir el antígeno y de la expresión en bacteriófagos u otras partículas o complejos moleculares de la biblioteca, se puede tomar ácido nucleico de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que exprese el miembro de unión seleccionado. Tal ácido nucleico se puede utilizar en la producción posterior de un miembro de unión o un dominio variable VH o VL de anticuerpo mediante la expresión a partir de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que exprese el miembro de unión seleccionado.

Las variantes de los CDR y dominios VH y VL de la presente invención, incluyendo aquellos para los que se indican secuencias de aminoácidos en la presente y los que se pueden utilizar en miembros de unión de la invención se pueden obtener a través de métodos de mutación o alteración de secuencias y análisis para estudiar los miembros de unión al antígeno con características deseadas. Los ejemplos de características deseadas incluyen, pero no se limitan a: • Mayor afinidad de unión al antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno • Mayor neutralización de una actividad del antígeno con respecto a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad es conocida • Capacidad competitiva específica con un anticuerpo o ligando conocido con respecto al antígeno en una relación molar específica • Capacidad de inmunoprecipitar un complejo • Capacidad de unirse a un epítopo especificado o Epítopo lineal, por ej . , secuencia peptídica identificada usando análisis de unión al péptido como se describe en la presente, por ej . , usando péptidos analizados en conformación lineal y/o restringida o Epítopo conformacional, formado por residuos no continuos · Capacidad de modular una nueva actividad biológica de la IL-6 o molécula corriente abajo.

Tales métodos también se proporcionan en la presente. Se pueden producir variantes de las moléculas de anticuerpos descritas en la presente y utilizarlas en la presente invención. Siguiendo con los adelantos de la química computacional en la aplicación de técnicas de análisis de datos multivariante a las relaciones estructura/propiedad-actividad (Wold, et al. ultivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed. : B. Kowalski) , D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)) las relaciones cuantitativas actividad-propiedad de anticuerpos se puede derivar usando técnicas matemáticas bien conocidas, como regresión estadística y reconocimiento y clasificación de patrones (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley- Interscience; 3a edición (abril de 1998) ISBN: 0471170828; Kandel, Abraham & Backer, Eric . Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, ( 11 de mayo de 1995), ISBN: 0133418847; Krzanowski , Wojtek. Principies of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (papel)). Oxford University Press; (diciembre de 2000) , ISBN: 0198507089; Witten, Ian H. & Frank, Eibe . Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations . Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999), ISBN: 1558605525; Denison David G. T. (Editor) , Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Serie Wiley de Probabilidad y Estadística) . John Wiley & Sons,- (Julio de 2002), ISBN: 0471490369; Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N.. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8) . Las propiedades de anticuerpos se pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de posibles residuos de contacto o propiedad sicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpos, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar de forma individual y en combinación.

Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo compuesto por un dominio VH y un dominio VL se forma típicamente mediante seis bucles de polipéptidos : tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH) . El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha elucidado relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de sitios de combinación de anticuerpos (Chothia C. et al. (1992) J. Molecular Biology 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. (1997) J. Molecular Biology 273(4), 927-948). Estas relaciones implican que, salvo por la tercera región (bucle) en los dominios VH, los bucles del sitio de unión tienen una de una cantidad pequeña de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un bucle particular ha mostrado estar determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios clave tanto en el bucle como en regiones flanqueantes (Chothia C. et al. (1992) J. Molecular Biology 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. (1997) J. Molecular Biology 273(4), 927-948).

Este estudio de relación secuencia-estructura se puede utilizar para la predicción de los residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes para mantener la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y, por lo tanto, mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar mediante la comparación de las predicciones con el resultado de experimentos de optimización avanzados.

En un enfogue estructural, se puede crear un modelo de la molécula de anticuerpo (Chothia, et al. (1986) Science, 223,755-758) usando cualquier paquete disponible o comercial, como WAM (Whitelegg, N.R.u. & Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824) . Un paquete informático de análisis y visualización de proteínas, como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View (Guex, N. y Peitsch, M.C. (1997) Electrophoresis 18, 2714-2723) se puede utilizar luego para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información luego se puede utilizar para realizar sustituciones que posiblemente tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad.

Las técnicas necesarias para realizar sustituciones dentro de las secuencias de aminoácidos de CDR, dominios VH o VL de anticuerpo y miembros de unión se encuentran disponibles generalmente en la técnica. Se pueden realizar secuencias de variante con sustituciones que se puede predecir o no que tienen un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad y se pueden analizar para estudiar la capacidad de unir y/o neutralizar la IL-6 y/o cualquier otra propiedad deseada .

Las variantes de secuencias de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se describen específicamente en la presente se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, como se indica .

Las variantes de dominios VL de la invención y los miembros de unión o moléculas de anticuerpo que las comprenden incluyen dominios VL donde Arginina no está presente en el residuo Kabat 108, por ej . , donde el residuo Kabat 108 es un residuo diferente o se eliminó. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo, como una molécula de anticuerpo que carece de un dominio constante, por ej . , un scFv, puede comprender un dominio VL con una secuencia de dominio VL o variante de la misma según se describe en la presente, donde Arginina en el residuo Kabat 108 es un residuo de aminoácido diferente a Arginina o se eliminó.

Un aspecto adicional de la invención es una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene al menos 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con un dominio VH del Anticuerpo 18 mostrado en el listado de secuencias adjunto y/o que comprende un dominio VL que tiene al menos 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VL del Anticuerpo 18 mostrado en el listado de secuencias adjunto. Los algoritmos que se pueden utilizar para calcular el % de identidad de dos secuencias de aminoácidos incluyen, por ej . , BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215: 405-410), FASTA (Pearson y Lipman (1988) PNAS EUA 85: 2444-2448) o el algoritmo de Smith- aterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), por ej . , utilizando parámetros de defecto .

Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de secuencias de aminoácidos (adición, eliminación, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido) .

Las alteraciones se pueden realizar en una o más regiones flanqueantes y/o una o más CDR. Las alteraciones normalmente no dan como resultado la pérdida de función, por lo que un miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede mantener la capacidad de unir y/o neutralizar la IL-6. Puede mantener la misma capacidad cuantitativa de unión y/o neutralización que un miembro de unión en el que no se realizó la alteración, por ej . , según se mide en un ensayo descrito en la presente El miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede tener una mejor capacidad de unir y/o neutralizar la IL-6.

La alteración puede comprender el remplazo de uno o más residuos de aminoácidos con un aminoácido que no es de origen natural o no es estándar, la modificación de uno o más residuos de aminoácidos en una forma que no es origen natural o no es estándar o la inserción de uno o más aminoácidos que no son de origen natural o no son estándar en la secuencia. Los ejemplos de cantidades y ubicaciones de alteraciones en secuencias de la invención se describen en otro punto de la presente. Aminoácidos de origen natural incluyen los 20 aminoácidos 1 "estándar" identificados como G, A, V, L, I, , P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos estándar de una sola letra. Aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que se pueda incorporar en una estructura principal de polipéptido o que pueda resultar de la modificación de un residuo de aminoácido existente. Los aminoácidos no estándar pueden ser de origen natural o no natural. En la técnica se conocen diversos aminoácidos no estándar de origen natural, como 4 -hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3 -metilhistidina, N-acetilserina, etc. (Voet & Voet, Biochemistry, 2a Edición, (Wiley) 1995). Esos residuos de aminoácidos derivados en su posición N-alfa solamente se ubicarán en el extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos. Normalmente, en la presente invención, un aminoácido es un aminoácido 1, pero puede ser un aminoácido d. Por lo tanto, la alteración puede comprender la modificación de un aminoácido 1 en un aminoácido d o su remplazo con este último. Las formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de aminoácidos también son bien conocidas y los aminoácidos en la presente invención se pueden someter a tal modificación.

Las secuencias de aminoácidos en dominios de anticuerpos y miembros de unión de la invención pueden comprender aminoácidos no naturales o no estándar descritos anteriormente. Los aminoácidos no estándar (por ej . , aminoácidos d) se pueden incorporar en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis o mediante la modificación o el remplazo de los aminoácidos estándar "originales" luego de la síntesis de la secuencia de aminoácidos.

El uso de aminoácidos no estándar y/o que no son de origen natural aumenta la diversidad estructural y funcional y puede, por lo tanto, aumentar el potencial de lograr la unión deseada a la IL-6 y neutralizar propiedades en un miembro de unión de la invención. Adicionalmente , los aminoácidos d y los análogos han mostrado tener diferentes perfiles farmacocinéticos en comparación con aminoácidos 1 estándar, debido a la degradación in vivo de polipéptidos con aminoácidos 1 luego de la administración a un animal, por ej . , un humano, lo que significa que los aminoácidos d son ventajosos para algunas aplicaciones in vivo.

Se pueden generar novedosas regiones VH o VL con secuencias derivadas de CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones en todo el dominio variable. Tal técnica es descrita por Gram et al. (Gram et al., (1992) PNAS EUA, 89:3576-3580), que usaron PCR propensa a errores. En algunas modalidades, se realizan una o dos sustituciones de aminoácidos en un dominio variable o un conjunto de CDRs .

Otro método que se puede usar es dirigir la mutagénesis a regiones de CDR de genes VH o VL. Tales técnicas son descritas por Barbas et al. (Barbas et al., (1994) PNAS EUA, 91:3809-3813) y Schier et al. (Schier et al., (1996) J. Mol. Biol . 263 : 551-567) .

Todas las técnicas antedichas son conocidas en la técnica como tales y el experto podrá utilizar tales técnicas para proporcionar miembros de unión de la invención usando metodología habitual en la técnica.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para obtener un sitio de unión al antígeno de anticuerpo para la IL-6. El método comprende proporcionar, mediante adición, eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un domino VH expresado en la presente, un domino VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH, opcionalmente combinando el domino VH que se proporciona de tal forma con uno o más dominios VL y analizando el dominio VH o la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un miembro de unión o un sitio de unión al antígeno de anticuerpo para la IL-6 y, opcionalmente, con una o más propiedades deseadas, por ej . , capacidad de neutralizar la actividad de la IL-6. El dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se expresa en la presente. Se puede utilizar un método análogo donde una o más variantes de secuencias de un dominio VL descrito en la presente se combinen con uno o más dominios VH.

Como se expresó anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se expresó en la presente se puede transportar como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano o una porción sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente como se expresan en la presente representan modalidades de la presente invención y cada una de estas se puede transportar como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada o una porción sustancial del mismo.

Los dominios variables utilizados en la invención se pueden obtener o derivar de cualquier linea germinal o dominio variable humano reorganizado o pueden ser un dominio variable sintético basado en secuencias reales o de consenso de dominios variables humanos conocidos . Un dominio variable se puede derivar de un anticuerpo no humano. Una secuencia de CDR de la invención (por ej . , CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de CDR (por ej . , CDR3) , usando tecnología de ADN recombinante . Por ejemplo, Marks et al. (Marks et al (1992) Bio/Technology 10:779-783) describen métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpos donde los cebadores de consenso dirigidos o adyacentes al extremo 5 ' del área del dominio variable se utilizan conjuntamente con cebadores de consenso para la tercera región flanqueante de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al . describen adicionalmente cómo este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención se pueden mezclar con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3 y los dominios VH o VL completos mezclados se pueden combinar con un dominio VL o VH cognado para proporcionar miembros de unión de la invención. El repertorio luego se puede expresar en un sistema hospedador adecuado, como el sistema de expresión en fagos de WO92/01047, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad o cualquiera de una gran cantidad de literatura posterior, incluyendo Kay, Winter & McCafferty (Kay, B.K., Winter, J. y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press) , de forma que se puedan seleccionar miembros de unión adecuados. Un repertorio puede consistir en cualquiera de a partir de 104 miembros individuales en adelante, por ejemplo, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 110 miembros o más. Otros sistemas hospedadores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, expresión en levadura, expresión bacteriana, expresión en T7, expresión viral, expresión celular, expresión en ribosomas y expresión covalente.

Se proporciona un método para preparar un miembro de unión para el antígeno de la IL-6, donde el método comprende: (a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH que incluye una CDR3 para su remplazo o que carece de una región que codifica una CDR3 , (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expresó en la presente para una CDR3 VH, de forma que el ácido nucleico donante se inserta en la región CDR3 en el repertorio, para proporcionar un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH, (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos , (d) seleccionar un miembro de unión a la IL-6 y (e) recuperar el miembro de unión o ácido nucleico que lo codifica.

Nuevamente, se puede utilizar un método análogo donde una CDR3 VL de la invención se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL que incluye una CDR3 para su remplazo o que carece de una región que codifica una CDR3.

De manera similar, una o más o las tres CDR se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL que luego se analizan para detectar un miembro de unión o miembros de unión para la IL-6.

De manera similar, se pueden utilizar otros dominios VH y VL, conjuntos de CDRs y conjuntos de HCDRs y/o conjuntos de LCDRs descritos en la presente.

Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones flanqueantes intermedias. La porción también puede incluir al menos alrededor de 50% de cualquiera o de ambas de la primera y la cuarta región flanqueante, donde el 50% es el 50% del extremo C-terminal de la primera región flanqueante y el 50% del extremo N-terminal de la cuarta región flanqueante. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser los que no se asocian normalmente con regiones de dominios variables de origen natural. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión de la presente invención realizada mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N o C-terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir dominios variables de la invención a secuencias de proteína adicionales que incluyen regiones constantes de anticuerpos, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o etiquetas detectables/funcionales como se expresa con más detalle en otro punto de la presente.

Si bien en algunos aspectos de la invención, los miembros de unión comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de unión individuales basados en secuencias de dominios VH o VL forman aspectos adicionales de la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente los dominios VH, pueden unir antígenos diana de forma específica. Por ejemplo, ver lo que se expresa con respecto a dAbs anteriormente .

En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, estos dominios se pueden utilizar para analizar dominios de complementariedad que puedan formar un miembro de unión con dos dominios capaz de unir la IL-6. Esto se puede lograr a través de métodos de análisis de expresión en fagos, usando el denominado enfoque combinatorio dual jerárquico, como se describe en WO92/01047, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad, donde una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L se utiliza para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de unión de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de expresión en fagos, como las descritas en la referencia. Esta técnica también se describe en Marks et al, ibid. (Marks et al (1992) Bio/Technology 10 : 779-783) .

Los miembros de unión de la presente invención también pueden comprender regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas, por ej . , regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL se puede unir en su extremo C- terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpos, incluyendo cadenas CK O ' C humanas. De manera similar, un miembro de unión basado en un dominio VH se puede unir en su extremo C-terminal a todo o parte (por ej . , un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ej . , IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipos, particularmente, IgGl y IgG4. La IgGl es ventajosa debido a su función efectora y su facilidad de fabricación. Cualquier variante de región constante sintética u otra que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también puede ser útil en la presente invención.

Los miembros de unión de la invención se pueden marcar con una etiqueta detectable o funcional. Por consiguiente, un miembro de unión o una molécula de anticuerpo puede estar presente en forma de un inmunoconjugado, para obtener una señal detectable y/o cuantificable . Un inmunoconj ugado puede comprender una molécula de anticuerpo de la invención conjugada con una etiqueta detectable o funcional. Una etiqueta puede ser cualquier molécula que produzca o que se pueda hacer que produzca una señal, incluyendo, pero sin limitarse a, fluorescer, radioetiquetas , enzimas, quimioluminiscentes o fotosensibilizantes . Por consiguiente, la unión se puede detectar y/o medir detectando la fluorescencia o la luminiscencia, la radioactividad, la actividad enzimática o la absorbancia de luz.

Etiquetas adecuadas incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, - enzimas, como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfatasa deshidrogenasa ( "G6PDH" ) , alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa, por e . , peroxidasa de rábano picante, - tintes, etiquetas fluorescentes ' o fluorescer, como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, compuestos y derivados de rodamina, GFP, (GFP por "proteína fluorescente verde"), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído y fluorescamina, fluoróforos como criptatos y quelatos de lantánidos, por ej . , Europio, etc (Perkin Elmer y Cis Biointernational) , etiquetas quimiluminiscentes o quimioluminiscentes como isoluminol, luminol y los dioxetanos, - etiquetas bioluminiscentes , como luciferasa y luciferina, - sensibilizantes, - coenzimas, - sustratos enzimáticos, - radioetiquetas, incluyendo, pero sin limitarse a, bromo77, carbonol4, cobalto57, fluoro8, galio67, galio68, hidrógeno3 (tritio) , indiolll, indioll3m, yodol23m, yodol25, yodol26, yodol31, yodol33, mercuriol07, mercurio203, fósforo32, renio99m, reniolOl, reniol05, rutenio95, rutenio97, ruteniol03, ruteniol05, escandio47, selenio75, azufre35, tecnecio99, tecnecio99m, teluriol21m, teluriol22m, teluriol25m, tuliol65, tuliol67, tuliol68, itriol99 y otras radioetiquetas mencionadas en la presente, partículas, como partículas de carbono o látex, solución coloidal metálica, cristalita, liposomas, células, etc., que se pueden marcar adicionalmente con un tinte, catalizador u otro grupo detectable, moléculas como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina, - porciones de toxinas como, por ejemplo, una porción de toxina seleccionada del grupo de exotoxina Pseudomonas (PE o un fragmento citotóxico o mutante de la misma) , toxina de la Difteria o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, una toxina de botulino A, B, C, D, E o F, un fragmento citotóxico o de ricino del mismo, por ej . , ricino A, abrín o un fragmento citotóxico del mismo, saporina o un fragmento citotóxico de la misma, toxina antiviral de fitolaca americana o un fragmento citotóxico de la misma y briodina 1 o un fragmento citotóxico de la misma.

Enzimas y coenzimas adecuadas se describen en Litman, et al., US4275149 y en Boguslaski, et al., US4318980, cada uno de los cuales se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Fluorescer y quimioluminiscentes adecuados se describen en Litman, et al., US4275149, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Las etiquetas incluyen adicionalmente porciones químicas, como biotina, que se pueden detectar a través de la unión a una porción detectable cognada específica, por ej . , avidina o estreptavidina marcada. Las etiquetas detectables se pueden unir a anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica.

Los inmunocon ugados o sus fragmentos funcionales se pueden preparar con métodos conocidos por el experto en la técnica. Se pueden acoplar a enzimas o a etiquetas fluorescentes de forma directa o por intermedio de un grupo espaciador o un grupo enlazador, como un polialdehído, como glutaraldehído, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , ácido dietilen-triaminapentaacético (DPTA) o en presencia de agentes de acoplamiento, como los mencionados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen etiquetas de tipo fluoresceína se pueden preparar mediante la reacción con un isotiocianato .

Los métodos conocidos por el experto en la técnica que existen para acoplar los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos directamente o a través de un agente quelante, como EDTA, DTPA, mencionados anteriormente, se pueden utilizar para los radioelementos que se pueden usan en el diagnóstico. Asimismo, es posible realizar una marcación con sodiol25 mediante el método de cloramina T (Hunter W. M. y Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495) o con tecnecio99m mediante la técnica de Crockford et al., (US4424200, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad) o se puede unir a través de DTPA como lo describe Hnatowich (US4479930, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad) .

Existen diversos métodos por los que una etiqueta puede producir una señal detectable a través de medios externos, por ejemplo, mediante examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. La etiqueta también se puede unir a otro miembro de unión que une el anticuerpo de la invención o a un soporte .

La etiqueta puede producir directamente una señal y, por lo tanto, no se necesitan componentes adicionales para producir una señal. Diversas moléculas orgánicas, por ejemplo, fluorescer, pueden absorber luz ultravioleta y visible, donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitada. Esta energía absorbida luego se disipa mediante emisión de luz en una segunda longitud de onda. Esta segunda emisión de longitud de onda también puede transferir energía a una molécula aceptora marcada y la energía resultante se puede disipar de la molécula aceptora mediante emisión de luz, por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . Otras etiquetas que producen directamente una señal incluyen isótopos radioactivos y tintes .

Alternativamente, la etiqueta puede necesitar otros componentes para producir una señal y el sistema que produce la señal entonces incluiría todos los componentes necesarios para producir una señal medible, que podría incluir sustratos, coenzimas, potenciadores , enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticqs, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, depuradores, iones metálicos y una sustancia de unión específica necesarios para unir sustancias que generan señales. Una descripción detallada de sistemas que producen señales adecuados se puede encontrar en Ullman, et al. US5185243, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

La presente invención proporciona un método que comprende unir un miembro de unión a la IL-6 como se estipula en la presente. Como se indica, tal unión puede tener lugar in vivo, por ej . , luego de la administración de un miembro de unión o ácido nucleico que codifica un miembro de unión o puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía por afinidad y ensayos bioquímicos o basados en células, como un ensayo de proliferación de células TF-1.

La presente invención también proporciona la medición directa de niveles de antígeno, utilizando un miembro de unión de acuerdo con la invención, por ejemplo, en un sistema de biosensor. Por ejemplo, la presente invención comprende un método para detectar y/o medir la unión a la IL-6, que comprende (i) exponer el miembro de unión a la IL-6 y (ii) detectar la unión del miembro de unión a la IL-6, donde la unión se detecta usando cualquier método o etiqueta detectable descritos en la presente. Este y cualquier otro método de detección de unión descrito en la presente puede ser interpretado directamente por la persona que realiza el método, por ejemplo, mediante observación visual de una etiqueta detectable. Alternativamente, este método o cualquier otro método de detección de unión descrito en la presente puede producir un informe en forma de una autorradiografía, una fotografía, una impresión de computadora, un informe de citometría de flujo, una gráfica, un cuadro, un tubo de ensayo, recipiente o pocilio que contiene el resultado o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.

Se puede determinar la cantidad de unión del miembro de unión a la IL-6. La cuantificación se puede relacionar con la cantidad del antígeno en una muestra de prueba que puede ser de interés diagnóstico. El análisis para estudiar la unión a la IL-6 y/o la cuantificación de la misma puede ser útil, por ejemplo, en pacientes en análisis para detectar enfermedades o trastornos referidos en la presente y/o cualquier otra enfermedad o trastorno que implique la expresión y/o actividad aberrante de la IL-6.

Un método de diagnóstico de la invención puede comprender (i) obtener una muestra de tejido o fluido de un sujeto, (ii) exponer la muestra de tejido o fluido a uno o más miembros de unión de la presente invención y (iii) detectar IL-6 unida en comparación con una muestra de referencia, donde un aumento de la cantidad de unión a la IL-6 en comparación con la referencia puede indicar un nivel aberrante de expresión o actividad de la IL-6. Las muestras de tejido o fluido para análisis incluyen sangre, suero, orina, material de biopsia, tumores u cualquier tejido que se sospeche que contiene niveles aberrantes de IL-6. Los sujetos que resultan positivos para actividad o niveles aberrantes de IL-6 también se pueden beneficiar de los métodos de tratamiento descritos posteriormente en la presente.

Los expertos en la técnica pueden elegir un modo adecuado para determinar la unión del miembro de unión a un antígeno de acuerdo con su preferencia y su conocimiento general, a la luz de los métodos descritos en la presente.

Las reactividades de miembros de unión en una muestra se pueden determinar a través de cualquier medio apropiado. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. El antígeno marcado radioactivo se mezcla con antígeno no marcado (la muestra de prueba) y se permite su unión al miembro de unión. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad de antígeno radioactivo unido al miembro de unión. Cuanto más antígeno haya en la muestra de prueba, menos antígeno radioactivo se unirá al miembro de unión. También se puede utilizar un ensayo de unión competitiva con un antígeno no radioactivo, usando antígeno o un análogo ligado a una molécula informante. La molécula informante puede ser un fluorocromo, fósforo o tinte láser con características de absorción o emisión espectralmente aisladas. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red y quelatos y criptatos de lantánidos . Tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina .

Otros informantes incluyen partículas coloidales macromoleculares o material en partículas, como perlas de látex coloreadas, magnéticas o paramagnéticas y agentes biológica o químicamente activos que pueden ocasionar directa o indirectamente que las señales detectables se observen visualmente, se detecten electrónicamente o se registren de otra forma. Estas moléculas pueden ser enzimas que, por ejemplo, catalizan reacciones que generan o cambian colores o que ocasionan cambios en propiedades eléctricas. Pueden ser molecularmente excitables, de forma que las transiciones electrónicas entre estados de energía den como resultado absorciones o emisiones espectrales características. Estas pueden incluir entidades químicas utilizadas junto con biosensores. Se pueden utilizar sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

Las señales generadas por conjugados informante-miembro de unión individuales se pueden utilizar para derivar datos absolutos o relativos cuantificables de la unión del miembro de unión relevante en muestras (normal y de prueba) .

También se proporciona un kit que comprende un miembro de unión de acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la presente invención como un aspecto de la presente invención. En el kit, el miembro de unión se puede marcar para permitir la determinación de su reactividad en una muestra, por ej . , como se describe adicionalmente a continuación. Asimismo, el miembro de unión puede o no estar unido a un soporte sólido. Los componentes de un kit son generalmente estériles y están en frascos u otros recipientes sellados. Los kits se pueden utilizar en análisis de diagnóstico u otros métodos para los que son útiles los miembros de unión. Un kit puede tener instrucciones para el uso de los componentes en un método, por ej . , un método de acuerdo con la presente invención. Los materiales auxiliares para asistir o permitir la realización de tal método pueden incluir un kit de la invención. Los materiales auxiliares incluyen un segundo miembro de unión diferente que se une al primer miembro de unión y se conjuga con una etiqueta detectable (por ej . , una enzima, isótopo radioactivo o etiqueta fluorescente) . Los kits basados en anticuerpos también pueden comprender perlas para realizar una inmunoprecipitación . Cada componente de los kits se encuentra generalmente en su propio recipiente adecuado. Por consiguiente, estos kits generalmente comprenden recipientes distintos adecuados para cada miembro de unión. Asimismo, los kits pueden comprender instrucciones para realizar el ensayo y métodos para interpretar y analizar los datos que resultan de la realización del ensayo.

La presente invención también proporciona el uso de un miembro de unión como se expresó anteriormente para medir niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir un método para medir el nivel de antígeno en una muestra utilizando un miembro de unión según se dispone en la presente invención en un ensayo de competición. Esto se puede producir cuando la separación física de antígeno unido del no unido no es necesaria. El enlace de una molécula informante al miembro de unión para que ocurra un cambio físico u óptico en la unión es una posibilidad. La molécula informante puede generar directa o indirectamente señales detectables, que se pueden cuantificar. El enlace de moléculas informantes puede realizarse de forma directa o indirecta, covalente, por ej . a través de un enlace peptídico, o no covalente. El enlace a través de un enlace peptídico puede ser un resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifica un anticuerpo y una molécula informante.

En diversos aspectos y modalidades, la presente invención se extiende a un miembro de unión que compite por unirse a la IL-6 con cualquier miembro de unión definido en la presente, por ej . , el Anticuerpo 18, por ej . , en formato de igGl. La competición entre miembros de unión se puede ensayar fácilmente in vitro, por ejemplo, marcando una molécula informante específica a un miembro de unión que se puede detectar en presencia de otro u otros miembros de unión sin. marcar, para permitir la identificación de miembros de unión que unen el mismo epítopo o un epítopo superpuesto. La competición se puede determinar, por ejemplo, usando ELISA, donde la IL-6 se inmoviliza en una placa y un primer miembro de unión marcado o etiquetado junto con uno o más miembros sin marcar o sin etiquetar se agrega a la placa. La presencia de un miembro de unión sin marcar que compite con el miembro de unión marcado se observa mediante una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado.

Por ejemplo, la presente invención incluye un método para identificar un compuesto de unión a la IL-6 que comprende (i) inmovilizar la IL-6 en un soporte, (ii) poner en contacto la IL-6 inmovilizada de forma simultánea o por etapas con al menos un miembro de unión marcado o etiquetado de acuerdo con la invención y uno o más compuestos de unión de prueba sin marcar o sin etiquetar y (iii) identificar un nuevo compuesto de unión de la IL-6 observando una disminución en la cantidad de marcador unido a partir del miembro de unión marcado. Tales métodos se pueden realizar con alto rendimiento usando un formato de matriz o multipocillo . Tales ensayos también se pueden realizar en una solución. Ver, por ejemplo, U.S. 5,814,468, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Como se describió anteriormente, la detección de la unión puede ser interpretada directamente por la persona que realiza el método, por ejemplo, observando visualmente una etiqueta detectable o una disminución en presencia de la misma. Alternativamente, estos métodos de unión de la invención pueden producir un informe en forma de una autorradiografía, una fotografía, una impresión de computadora, un informe de citometría de flujo, una gráfica, un cuadro, un tubo de ensayo, recipiente o pocilio que contiene el resultado o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.

Los ensayos de competición también se pueden utilizar en el mapeo de epítopos . En un caso, el mapeo de epítopos se puede utilizar para identificar el epítopo unido por un miembro de unión a la IL-6 que, opcionalmente , puede tener características de neutralización y/o modulación optimizadas. Tal epítopo puede ser lineal o conformacional . Un epítopo conformacional puede comprender al menos dos fragmentos diferentes de la IL-6, donde los fragmentos se colocan próximos entre sí cuando la IL-6 se pliega en su estructura terciaria o cuaternaria para formar un epítopo conformacional que se reconoce mediante un inhibidor de la IL-6, como un miembro de unión a la IL-6. En el análisis de la competición, se puede utilizar un fragmento peptídico del antígeno, especialmente un péptido que incluye o consiste esencialmente en un epítopo de interés. Se puede utilizar un péptido que tenga la secuencia de epítopo más uno o más aminoácidos en cualquier extremo . Los miembros de unión de acuerdo con la presente invención pueden ser tales que su unión al antígeno sea inhibida por un péptido con o que incluye la secuencia dada .

La presente invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En uno, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una CDR, un conjunto de CDR, dominio VH, dominio VL, sitio de unión al antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ej . , scFv o IgGl, de la invención como se definió anteriormente.

La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores o casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se indicó anteriormente.

La presente invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende una o más construcciones como se indicó anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR, conjunto de CDR, dominio VH, dominio VL, sitio de unión al antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ej . , scFv o IgGl, como se estipula, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención, como lo hace un método de producción del producto codificado, donde el método comprende la expresión de ácidos nucleicos de codificación para los mismos. La expresión puede lograrse convenientemente mediante el cultivo en condiciones adecuadas de células hospedadoras recombinantes que contienen el ácido nucleico. Luego de la producción mediante expresión, se puede aislar y/o purificar un dominio VH o VL o un miembro de unión usando cualquier técnica adecuada, que luego se usa según sea apropiado.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se indica en la presente comprende una molécula de ADN con la secuencia especificada y comprende una molécula de ARN con la secuencia especif cada, donde U está sustituido con T, salvo que el contexto indique lo contrario.

Un aspecto aun adicional proporciona un método para la producción de un dominio variable VH de anticuerpo, donde el método incluye ocasionar la expresión a partir de ácido nucleico de codificación. Tal método puede comprender el cultivo de células hospedadoras en condiciones para la producción del dominio variable VH de anticuerpo .

Métodos análogos para la producción de dominios variables VL y miembros de unión que comprenden un dominio VH y/o VL se proporcionan como aspectos adicionales de la presente invención.

Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un método ¡de producción puede comprender la formulación del producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células hospedadoras diferentes son bien conocidos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, hongos filamentosos, levadura y sistemas de baculovirus y plantas y animales transgénicos . La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas está bien establecida en la técnica. Se puede encontrar una reseña, por ejemplo, en Plückthun (Plückthun, A. (1991) Bio/Technology 9: 545-551). Un hospedador bacteriano común es E. coli .

La expresión en células eucariotas en cultivos también se encuentra disponibles para los expertos en la técnica cómo una opción para la producción de un miembro de unión (Chadd HE y Chamow SM (2001) Current Opinión in Biotechnology 12: 188-194; Andersen DC y Krummen L (2002) Current Opinión in Biotechnology 13: 117; Larrick J y Thomas DW (2001) Current Opinión in Biotechnology 12:411-418). Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO, células de mieloma de rata YB2/0, células embrionarias de riñon humano, células embrionarias de retina humana y muchas otras.

Se pueden elegir o construir vectores adecuados que contengan secuencias de regulación apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadores , genes marcadores, y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ej . , fagémidos o virales, por ej . , fagos, según sea apropiado Sambrook y Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3 a edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciamiento, intruducción de ADN en células y expresión génica, así como análisis de proteínas, se describen con detalle en Ausubel et al. (Ausubel et al. eds . , Short Protocole in Molecular Blology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4a edición 1999) .

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene ácido nucleico como se describe en la presente. Tal célula hospedadora pueden estar in vitro y puede estar en cultivo. Tal célula hospedadora puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula hospedadora puede permitir la expresión intracelular de los miembros de unión de la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares . Los intracuerpos se pueden utilizar para la terapia génica.

Un aspecto aun adicional proporciona un método que comprende la introducción de ácido nucleico de la invención en una célula hospedadora. La introducción puede utilizar cualquier técnica disponible. En células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfeccion de fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfeccion y transducción mediadas por liposomas usando retrovirus u otros virus, por ej . , vaccinia o, en células de insectos, baculovirus . La introducción de ácido nucleico en la célula hospedadora, en particular una célula eucariota, puede utilizar un sistema viral o basado en plásmidos . El sistema plásmido puede mantenerse de forma episomal o se puede incorporar en la célula hospedadora o en un cromosoma artificial. La incorporación puede realizarse mediante integración aleatoria o dirigida de una o más copias en un solo sitio o en múltiples sitios. En células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfeccion usando bacteriófagos .

Luego de la introducción se puede provocar o permitir la expresión a partir del ácido nucleico, por ej . , mediante el cultivo de células hospedadoras en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado se puede lograr a través de métodos conocidos por el experto en la técnica.

El ácido nucleico de la invención se puede integrar al genoma (por ej . cromosoma) de la célula hospedadora. La integración se puede promover por inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar.

La presente invención también proporciona un método que comprende el uso de una construcción según se establece anteriormente en un sistema de expresión para expresar un polipéptido o miembro de unión como anteriormente.

Hay evidencia de la implicancia de IL-6 en diversos trastornos, tal como se discute en otras partes en la presente. Por consiguiente, los miembros de unión de la presente invención se pueden usar en un método de diagnóstico o tratamiento de un trastorno asociado con IL-6. El trastorno puede por ejemplo ser un trastorno inflamatorio y/o autoinmune tal como por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, caquexia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , artritis idiopática juvenil, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn o ateroesclerosis . Un miembro de unión de la presente invención también puede usarse para tratar un trastorno tal como un tumor y/o cáncer. Además, un miembro de unión de la presente invención puede usarse para tratar y/o prevenir el dolor que resulta de o está asociado con las enfermedades y afecciones enumeradas en la presente. Los miembros de unión de la presente invención también pueden usarse en un método de diagnóstico o tratamiento de al menos una enfermedad relacionada con IL-6, en un paciente, animal, órgano, tejido o célula, que incluye, pero no se limita a: enfermedades obstructivas de las vías respiratorias que incluyen enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ; asma, tal como asma bronquial, alérgica, intrínseca, extrínseca y debida al polvo, particularmente asma crónica o inveterada (por ej . asma tardía e hiperreactividad de las vías respiratorias) ; bronquitis; rinitis aguda, alérgica, atrófica y rinitis crónica que incluye rinitis caseosa, rinitis hipertrófica, rinitis purulenta, rinitis seca y rinitis medicamentosa; rinitis membranosa que incluye rinitis cruposa, fibrinosa y seudomembranosa y escrofulosa; rinitis estacional que incluye rinitis nerviosa (fiebre del heno) y rinitis vasomotora, sinusitis, fibrosis pulmonar idiopática (IPF) ; sarcoidosis, pulmón de agricultor y enfermedades relacionadas, síndrome de distrés respiratorio del adulto, neumonitis por hipersensibilidad, pulmón fibroide y neumonía intersticial idiopática; artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de inicio sistémico, espondiloartropatías seronegativas (que incluye espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , enfermedad de Behcet, síndrome de Siogren y esclerosis sistémica, gota, osteoporosis y osteoartritis ; soriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto y otras dermatosis eccematosas, dermatitis alérgica por contacto, dermatitis seborreica, liquen plano, escleroderma, pénfigo, penfigoide ampolloso, epidermolisis hullosa, urticaria, angiodermas, vasculitis, eritemas, eosinofilias cutáneas, uveítis, alopecia areata, conjuntivitis alérgica y conjuntivitis primaveral; (tracto gastrointestinal) úlcera gástrica, enfermedad celíaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis , enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome antifosfolípido) ) , alergias relacionadas con los alimentos que pueden tener efectos lejos del intestino, por e . , migraña, rinitis y eczema; caquexia, esclerosis múltiple, ateroesclerosis , Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (AIDS) , glomerulonefritis proliferativa mesangial, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia reiial aguda, hemodiálisis , uremia, lupus eritematoso localizado o discoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Castleman, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, diabetes tipo I, diabetes resistente a la insulina tipo B, anemia falciforme, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, síndrome nefrítico, fascitis eosinofílica, síndrome de híper IgE, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, procedimientos para revertir la vasectomía/orquitis , lepra lepromatosa, hepatitis inducida por el alcohol, síndrome de Sezary y púrpura trombocitopénica idiopática; adhesiones posoperatorias , nefrosis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis gram positiva, sepsis gram negativa, sepsis con cultivo negativo, sepsis fúngica, fiebre neutropénica, pancreatitis aguda, urosepsis, enfermedad de Grave, enfermedad de Raynaud, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad tipo III, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios en la piel) , enfermedad mixta de los tejidos conectivos, enfermedad idiopática de Addison, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, síndrome pos-MI (cardiotomía) , hipersensibilidad tipo IV, granulomas por organismos intracelulares , enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de alfa-I-antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de Hashimoto, evaluación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal, tiroiditis, éncefalomielitis , enfermedad pulmonar crónica neonatal, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, alopecia, terapia de radiación (por ej . , que incluye pero no se limita a astenia, anemia, caquexia y similares) , intoxicación crónica por salicilatos, apnea del sueño, obesidad, insuficiencia cardíaca y meningococcemia; aguda y crónica [sic] , luego de, por ejemplo, transplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, páncreas, médula ósea, huesos, intestino delgado, piel, cartílago y córnea; y enfermedad crónica de injerto versus huésped; leucemia, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia aguda, ALL de células T, células B o FAB, leucemia mielocítica crónica (CML) , leucemia mieloide aguda (AML) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia de células vellosas, síndrome mielodisplásico (MDS) , cualquier linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cualquier linfoma maligno, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, carcinoma colorrectal, carcinoma prostático, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas , sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, reabsorción de los huesos relacionada con cáncer, dolor en los huesos relacionado con cáncer; la supresión de la metástasis del cáncer; la mejora de la caquexia cancerosa; fibrosis quística, apoplejía, lesión por reperfusión en el corazón, cerebro, miembros periféricos y otros órganos; heridas por quemaduras, traumatismo/hemorragia, exposición a la radiación ionizante, úlceras de piel crónicas; enfermedades de los órganos reproductivos (por ej . trastornos en la ovulación, menstruación e implantes, trabajo de parto prematuro, preeclampsia, endometriosis) ; infección bacteriana aguda o crónica, procesos infecciosos o parasitarios agudos o crónicos, que incluyen infecciones bacterianas, virales y fúngicas, infección por HlV/neuropatía por HIV, meningitis, hepatitis (A, B o C, u otras hepatitis virales similares) , artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0157 :h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombótica, malaria, fiebre hemorrágica del dengue, leishmaniasis , lepra, síndrome de shock tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, mycobacterium tuberculosis, mycobacterium avium intracelular, neumonía por pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis , legionella, enfermedad de Lyme, influenza A, virus Epstein-Barr, síndrome hemafagocítico asociado a vital, encefalitis viral/meningitis aséptica, depresión y similares. Por consiguiente, la invención proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con la IL-6, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención solos o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento adecuado conocido en la técnica o descrito en la presente.

En una modalidad el trastorno relacionado con la IL-6 es depresión - también referido en la presente como trastorno depresivo mayor. El trastorno depresivo mayor (también conocido y referido en la presente como depresión clínica, depresión mayor, depresión uniplar o trastorno unipolar) es un trastorno mental caracterizado por un bajo estado de ánimo que abarca todo acompañado de baja autoestima y pérdida de interés o placer en actividades normalmente disfrutables . El término "trastorno depresivo mayor" lo seleccionó la American Psychiatric Association para designar este grupo de síntomas como un trastorno del estado de ánimo en la versión de 1980 de la clasificación Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-III) , y desde entonces ha sido muy usado. El término general depresión es generalmente usado para denotar el trastorno, pero como también se puede usar en referencia a otros tipos de depresión sicológica, se prefiere terminología más precisa para el trastorno en el uso clínico y de investigación. La depresión mayor es una afección discapacitante que afecta de manera adversa la familia, vida laboral o educacional, sueño, alimentación y salud general de una persona.

La depresión está altamente asociada con enfermedades que involucran la inflamación sistémica. La inflamación sistémica se observa en muchos pacientes depresivos, y se refleja en los elevados biomarcadores de la inflamación en plasma. De manera adicional, las vías de señalización de citocina activadas se pueden detectar en la sangre y el CSF de pacientes depresivos. Además, las citocinas (IFN-a, IL-2) pueden inducir síntomas del trastorno depresivo mayor en pacientes enfermos desde el punto de vista médico sin antecedentes de enfermedades siquiátricas . Por consiguiente, la invención proporciona un método para tratar una depresión, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención solos o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento adecuado conocido en la técnica, por ej . antidepresivos, tales como inhibidores selectivos de la reabsorción de serotonina (SSRI) , tales como sertralina, escitalopram, fluoxetina, paroxetina y citalopram; o descrito en la presente.

Los miembros de unión de la invención también tienen propiedades analgésicas. Como tal, son adecuados como analgésicos para tratar y/o prevenir el dolor asociado con las enfermedades enumeradas en la presente así como también el dolor crónico y agudo que resulta de o está asociado con heridas, procedimientos médicos, cirugías, lesiones, traumatismos, etc. Por ejemplo, los miembros de unión se pueden usar como analgésicos posoperatorios . También se pueden usar para tratar o prevenir el dolor que resulta de o está asociado con espondilitis anquilosante, dolor lumbar inflamatorio, dolor neuropático, neuroma doloroso, fibromialgia, dolores de cabeza, por ej . , dolores de cabeza y migrañas crónicos, pancreatitis, síndromes de compresión del nervio espinal y dolor esquelético no maligno, dolor osteoartrítico inflamatorio, dolor artrítico reumatoide, dolor por cáncer, por ej . , dolor en los huesos por cáncer.

Los miembros de unión de la invención también se pueden usar para tratar hipertensión pulmonar asociada con diversas enfermedades tales como, pero sin limitarse a, COPD, escleroderma, lupus eritematoso sistémico, POEM así como también hipertensión pulmonar idiopática. Se han reportado niveles elevados de IL-6 en pacientes con hipertensión pulmonar asociada con varias de estas afecciones (Savale, L. et al Respir. Res. (2009) 10, 6 and references therein; Steiner, M.K. et al Circ. Res. (2009) 104 (2) 236-244 y referencias allí citadas) . Los ratones deficientes de IL-6 expuestos a hipoxia muestran presión sanguínea sistólica ventricular derecha disminuida e hipertrofia ventricular derecha disminuida al compararse con ratones WT expuestos a hipoxia (Savale, L. et al Respir. Res. (2009) 10, 6 y referencias allí citadas) . Además, los ratones transgénicos sobreexpuestos a IL-6 desarrollan hipertrofia ventricular derecha mejorada y presión sanguínea ventricular derecha mejorada en condiciones hipóxicas al compararse con controles no transgénicos (Steiner, M.K. et al Circ. Res. (2009) 104(2) 236-244 y referencias en la presente) y la IL-6 administrada de forma exógena agrava el desarrollo de la hipertensión pulmonar en ratones expuestos a hipoxia crónica [Golembeski , S.M. et al Chest (2005) 128(6 Suppl) 572S-573S) .

Además, se ha observado que los pacientes con COPD estable tienen mayores niveles de IL-6 en suero con respecto a controles saludables (Yanbaeva, D.G. et al BMC Med Genet (2009) 10, 23; Savale, L. et al Am. J. Respir. Crit Care Med. (2009) 119(1), 566-571; Eickhoff, P. et al Am. J. Respir. Crit Care Med. (2008) 178(12) 1211-1218) . Los niveles de IL-6 mejorados se han asociado con la función pulmonar deteriorada en pacientes con COPD (R.E. et al Chest (2008) 133(1) 19-25; Thorleifesson , S.J. et al Respir.Med. (2009) 103(10) 1548-1553) . Diversos estudios han reportado niveles aumentados de IL-6 en esputo y/o suero en el inicio de las exacerbaciones de COPD al compararse con los niveles de IL-6 medidos en la conclusión de la exacerbación o niveles de IL-6 medidos en pacientes con COPD estable [Valipour, A. et al Clinical Science (2008) 115(1), 225-232; Groenewegen, K.H. et al Respir. Med. (2001) 101 (11) 2409-2415; Perera , W.R. et al Eur. Respir. J. (2001) 29(3), 521-534). Los niveles mejorados de IL-6 también se han asociado con exacerbaciones más frecuentes (Bhowmik, A. et al Thorax (2000) 55(2) 114-120). El tratamiento de ratones con anticuerpos anti-IL-6 o ratones deficientes de IL-6 muestra inflamación pulmonar disminuida en algunos modelos de animales, por ejemplo inflamación pulmonar inducida por ozono y fibrosis e inflamación pulmonar inducidas por bleomicina (Saito, F. et al Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (2008) 38(5) 566-511; Lang, J.E. et al Am. J.Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. (2008) 294 (5) L1013-L1020; Johnston, R.A. et al Am. J.Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. (2005) 288(2) L390-L397) . Los niveles de IL-6 más altos también se han asociado con determinadas co-morbilidades de COPD, por ejemplo hipertensión pulmonar {Chaouat , A. et al Chest (2009) 136(3) 678-687; Eddahibi, S. et al Proceedings of the American Thoracic Society (2006) 3(6), 475-476).

Se tiene muy en claro la prueba de la implicancia de la IL-6 en determinadas otras enfermedades. Los datos presentados en la presente y en la publicación de PCT N° WO 2008/065378 indican adicionalmente que los miembros de unión de la invención se pueden usar para tratar los trastornos, que incluyen el tratamiento preventivo y reducción de la gravedad de los trastornos. Por consiguiente, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de al menos un síntoma de cualquiera de los trastornos mencionados en la presente, que comprende administrar a iin paciente que lo necesita una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención solos o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento adecuado conocido en la técnica o descrito en la presente para disminuir la gravedad de al menos un síntoma de cualquiera de los trastornos anteriores.

Por consiguiente, los miembros de unión de la presente invención son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades o trastornos que comprenden la expresión y/o actividad de IL-6 y/o IL-6Ra, en especial la expresión/actividad aberrante. Un método de tratamiento puede comprenden administrar una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención a un paciente que lo necesita, donde la expresión y/o actividad aberrante de IL-6 y/o IL-6Ra se ve disminuida. Un método de tratamiento puede comprender (i) identificar un paciente que demuestre actividad o niveles aberrantes de IL-6:IL-6Ra, por ejemplo al usar los métodos de diagnóstico antes descritos, y (ii) administrar una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención al paciente, donde la expresión y/o actividad aberrante de IL-6Ra y/o IL-6 se ve disminuida. Una cantidad eficaz de acuerdo con la invención es una cantidad que disminuye la expresión y/o actividad de IL-6 y/o IL-6Ra para disminuir o disminuir la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno particular que se está tratando, pero no necesariamente curar la enfermedad o trastorno.

La invención también proporciona un método para antagonizar al menos un efecto de la IL-6, que comprende entrar en contacto con o administrar una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención para que al menos el efecto de IL-6 se antagonice. Los efectos de la IL-6 que se pueden antagonizar mediante los métodos de la invención incluyen la unión de la IL-6 a gpl30 y efectos corriente abajo que surgen como consecuencia de esta unión.

Por consiguiente, aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos de tratamiento que comprenden administrar de un miembro de unión tal como se proporciona, las composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión y usar tal miembro de unión para la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo en un método de realizar un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que permiten, por ejemplo, una administración más fácil del/de los compuesto (s) activo (s), su prolongación de vida y/o su eficacia en el cuerpo, un aumento en su solubilidad en solución o una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y el experto en la técnica los adaptará como una función de la naturaleza y del modo de administración del/de los compuesto (s) activo (s) elegidos.

Los miembros de unión de la presente invención generalmente se administrarán en forma de composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del miembro de unión. Por consiguiente las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, portador, amortiguador, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica. Los materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, inhalada, intratraqueal, tópica, intravesicular o por inyección., tal como se discute a continuación.

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas estables estériles que comprenden un anticuerpo de la invención.

La presente invención proporciona métodos para estabilizar un anticuerpo de la invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a procesos para hacer una formulación estable estéril que comprende un anticuerpo de la invención.

Todas las formulaciones de anticuerpos de la invención descritas en la presente se denominan de manera colectiva. "formulaciones de la invención", "formulaciones líquidas de la invención", "formulaciones líquidas estables de alta concentración de la invención", "formulaciones líquidas de anticuerpos de la invención", "formulaciones líquidas reconstituidas de la invención" o "formulaciones de anticuerpos de la invención" .

La frase "farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en la presente significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o enlistado en farmacopea de EUA, farmacopea de Europa u otra farmacopea reconocida para usar en animales, y más particularmente en humanos.

Los términos "estabilidad" y "estable" tal como se usan en la presente en el contexto de una formulación líquida que comprende un anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) de la invención se refieren a la resistencia del anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) en la formulación para la agregación, degradación o fragmentación según las condiciones de fabricación, preparación, transporte y almacenamiento dadas. Las formulaciones "estables" de la invención retienen actividad biológica según las condiciones de fabricación, preparación, transporte y almacenamiento dadas. La estabilidad del anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) se puede evaluar por grados de agregación, degradación o fragmentación, medidos por HPSEC, cromatografía de fase inversa, diseminación de luz estática (SLS) , espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) , dicroísmo circular (CD) , técnicas de desconvolución de urea, fluorescencia intrínseca de triptofano, calorimetría de escaneo diferencial y/o técnicas de unión de ANS, en comparación a una formulación de referencia. Por ejemplo, una formulación de referencia puede ser un estándar de referencia congelado a -70°C que consiste en 10 mg/ml de un anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) de histidina, pH 6.0-6.5 y opcionalmente uno o más excipientes, cuya formulación de referencia regularmente da un único pico de monómero (por ej . , = 97% de área) por HPSEC. La estabilidad general de una formulación que comprende un anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) se puede evaluar mediante diferentes ensayos inmunológicos , por ejemplo, ELISA y radioinmunoensayo usando moléculas de antígeno aisladas.

La frase "niveles de agregación bajos a indetectables" tal como se usa en la presente se refiere a muestras que contienen no más de alrededor de 5%, no más de alrededor de 4%, no más de alrededor de 3%, no más de alrededor de 2%, no más de alrededor de 1% y no más de alrededor de 0.5% de agregación por peso de proteína según se mide con técnicas de cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) o diseminación de luz estática (SLS) .

El término "niveles de fragmentación bajos a indetectables" tal como se usa en la presente se refiere a muestras que contienen alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, alrededor de 98% o alrededor de 99% o más del total de la proteína, por ejemplo, en un único pico según lo determinó la HPSEC o cromatografía de fase inversa, o en dos picos (por ej . , cadenas pesada y ligera) (o tantos picos como subunidades haya) por electroforesis capilar en gel disminuida (rCGE) , que representa el anticuerpo no degradado o un fragmento no degradado del mismo, y que no contiene ningún otro pico con más de alrededor de 5%, más de alrededor de 4%, más de alrededor de 3%, más de alrededor de 2%, más de alrededor de 1% o más de alrededor de 0.5% el total de la proteína en cada uno. El término "electroforesis capilar en gel disminuida" tal como se usa en la presente se refiere a la electroforesis capilar en gel en condiciones reductoras suficientes como para disminuir enlaces de disulfuro en un anticuerpo.

La presente invención se refiere a formulaciones de concentración altas y estables de anticuerpos de la invención. En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación líquida. En otra modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada. En una modalidad adicional, una formulación de la invención es una formulación líquida reconstituida.

En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación líquida estable. En una modalidad, una formulación líquida de la invención es una formulación acuosa. En una modalidad específica, una formulación líquida de la invención es una formulación acuosa donde el portador acuoso es agua destilada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estéril .

En una modalidad, una formulación de la invención es homogénea .

En una modalidad, una formulación de la invención es isotónica .

La invención comprende formulaciones líquidas estables que comprenden un único anticuerpo de interés (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) , por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a la IL-6. La invención también comprende formulaciones líquidas estables que comprenden dos o más anticuerpos de interés (que incluyen el fragmento de anticuerpo de los mismos) , por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de la IL-6.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 1 mg/ml, al menos alrededor de 5 mg/ml, al menos alrededor de 10 mg/ml, al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 30 mg/ml, al menos alrededor de 40 mg/ml, al menos alrededor de 50 mg/ml, al menos alrededor de 60 mg/ml, al menos alrededor de 70 mg/ml, al menos alrededor de 80 mg/ml, al menos alrededor de 90 mg/ml, al menos alrededor de 100 mg/ml, al menos alrededor de 110 mg/ml, al menos alrededor de 120 mg/ml, al menos alrededor de 130 mg/ml, al menos alrededor de 140 mg/ml, al menos alrededor de 150 mg/ml, al menos alrededor de 160 mg/ml, al menos alrededor de 170 mg/ml, al menos alrededor de 180 mg/ml, al menos alrededor de 190 mg/ml, al menos alrededor de 200 mg/ml, al menos alrededor de 250 mg/ml o al menos alrededor de 300 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 125 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 130 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 150 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 90 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml, entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml, entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml, entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml, entre alrededor de 100 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 125 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 150 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml , entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml, entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml , entre alrededor de 100 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml, entre alrededor de 125 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml, entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 125 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 125 mg/ml, entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 125 mg/ml, entre alrededor de 100 mg/ml y alrededor de 125 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml , entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor dé 100 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 75 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 75 mg/ml o entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml de un anticuerpo anti -IL- 6 de la invención . En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 90 mg/ml y alrededor de 110 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 100 mg/ml y alrededor de 210 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad adicional, una formulación descrita en la presente comprende alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de lio mg/ml, alrededor de 120 mg/ml, alrededor de 130 mg/ml, alrededor de 140 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml, alrededor de 160 mg/ml, alrededor de 170 mg/ml, alrededor de 180 mg/ml, alrededor de 190 mg/ml, alrededor de 200 mg/ml, alrededor de 250 mg/ml o alrededor de 300 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 125 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 130 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad especifica, una formulación de la invención comprende alrededor de 150 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 200 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos 1 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 60 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 90 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 110 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 130 mg/ml, al menos 140 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 160 mg/ml, al menos 170 mg/ml, al menos 180 mg/ml, al menos 190 mg/ml, al menos 200 mg/ml, al menos 250 mg/ml o al menos 300 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos 125 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos 150 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos 175 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, ''una formulación de la invención comprende al menos 200 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre 1 mg/ml y 25 mg/ml, entre 1 mg/ml y 200 mg/ml, entre 25 mg/ml y 200 mg/ml, entre 50 mg/ml y 200 mg/ml, entre 75 mg/ml y 200 mg/ml, entre 100 mg/ml y 200 mg/ml, entre 125 mg/ml y 200 mg/ml, entre 150 mg/ml y 200 mg/ml, entre 25 mg/ml y 150 mg/ml, entre 50 mg/ml y 150 mg/ml, entre 75 mg/ml y 150 mg/ml, entre 100 mg/ml y 150 mg/ml, entre 125 mg/ml y 150 mg/ml, entre 25 mg/ml y 125 mg/ml, entre 50 mg/ml y 125 mg/ml, entre 75 mg/ml y 125 mg/ml, entre 100 mg/ml y 125 mg/ml, entre 25 mg/ml y 100 mg/ml, entre 50 mg/ml y 100 mg/ml, entre 75 mg/ml y 100 mg/ml, entre 25 mg/ml y 75 mg/ml, entre 50 mg/ml y 75 mg/ml o entre 25 mg/ml y 50 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende entre 90 mg/ml y 110 mg/ml de un anticuerpo anti-IL- 6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende entre 100 mg/ml y 210 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad adicional, una formulación descrita en la presente comprende 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 100 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 125 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 150 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 175 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 200 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención.

Opcionalmente , las formulaciones de la invención pueden comprender adicionalmente excipientes y/o aditivos comunes tales como agentes amortiguadores, sacáridos, sales y tensioactivos . De manera adicional o alternativa, las formulaciones de la invención pueden comprender adicionalmente excipientes y/o aditivos comunes, tales como, pero sin limitarse a, solubilizantes , diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, sales, solventes lipofílieos, aminoácidos, quelantes, conservantes o similares.

En algunas modalidades, el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste en histidina, citrato, fosfato, glicina y acetato. En otras modalidades, el excipiente sacárido se selecciona del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, manitol, maltosa y rafinosa. En aun otras modalidades, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 80 y Plurónico F68. En aun otras modalidades la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, KC1, MgCl2 y CaC12.

Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden comprender adicionalmente otros componentes auxiliares comunes, tales como, pero sin limitarse a, excipientes, polioles, solubilizantes, diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, solventes lipofílieos, quelantes, conservantes adecuados o similares.

Las formulaciones de la invención incluyen un agente amortiguador o que ajusta el pH para proporcionar un control del pH mejorado. En una modalidad, una formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 3.0 y alrededor de 9.0, entre alrededor de 4.0 y alrededor de 8.0, entre alrededor de 5.0 y alrededor de 8.0, entre alrededor de 5.0 y alrededor de 7.0, entre alrededor de 5.0 y alrededor de 6.5, entre alrededor de 5.5 y alrededor de 8.0, entre alrededor de 5.5 y alrededor de 7.0 o entre alrededor de 5.5 y alrededor de 6.5. En una modalidad adicional, una formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 3.0, alrededor de 3.5, alrededor de 4.0, alrededor de 4.5, alrededor de 5.0, alrededor de 5.1, alrededor de 5 -2, alrededor de 5 .3, alrededor de 5 .4, alrededor de 5 • 5, alrededor de 5 • 6, alrededor de 5 .7, alrededor de 5 • 8, alrededor de 5 • 9, alrededor de 6 .0, alrededor de 6 .1, alrededor de 6 .2, alrededor de 6 • 3, alrededor de 6 • 4, alrededor de 6 • 5, alrededor de 6 • 6, alrededor de 6 • 7, alrededor de 6 .8, alrededor de 6 • 9, alrededor de 7 • 0, alrededor de 7 .5, alrededor de 8 • 0, alrededor de 8. 5, o alrededor de 9.0. En una modalidad específica, una formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 6.0.

Las formulaciones de la invención incluyen un agent amortiguador o que ajusta el pH para proporcionar un control del pH mejorado. En una modalidad, una formulación de la invención tiene un pH de entre 3.0 y 9.0, entre 4.0 y 8.0, entre 5.0 y 8.0, entre 5.0 y 7.0, entre 5.0 y 6.5, entre 5.5 y 8.0, entre 5.5 y 7.0 o entre 5.5 y 6.5. En una modalidad adicional, una formulación de la invención tiene un pH de 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 o 9.0. En una modalidad específica, una formulación de la invención tiene un pH de 6.0. Un experto en la técnica entiende que el pH de una formulación generalmente no debería ser igual al punto isoeléctrico del anticuerpo particular (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) a usar en la formulación.

Típicamente, el agente amortiguador es una sal preparada de un ácido o base orgánicos o inorgánicos. Los agentes amortiguadores representativos incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido itálico; Tris, clorhidrato de trometamina o amortiguadores de fosfato. Además, los componentes de aminoácido pueden también funcionar como amortiguadores . Los componentes de aminoácidos representativos que se pueden utilizar en las formulaciones de la invención como agentes amortiguadores incluyen, pero no se limitan a, glicina e histidina. En algunas modalidades, el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste en histidina, citrato, fosfato, glicina y acetato. En una modalidad específica, el agente amortiguador es histidina. En otra modalidad específica, el agente amortiguador es citrato. La pureza del agente amortiguador debería ser de al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5%. Tal como se usa en la presente, el término "pureza" en el contexto de la histidina se refiere a la pureza química de la histidina tal como se conoce en la técnica, por ej . , tal como se describe en The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).

Los agentes amortiguadores se usan típicamente a concentraciones entre alrededor de 1 mM y alrededor de 200 mM o cualquier intervalo o valor de las mismas, según la fuerza iónica deseada y la capacidad amortiguadora requerida. Las concentraciones comunes de agentes amortiguadores convencionales empleados en formulaciones parenterales se pueden encontrar en: Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, Tomo 1, 2a Edición, Capítulo 5, p. 194, De Luca y Boylan, "Formulation of Small Volume Parenterals" , Tabla 5: Commonly used additives in Parenteral Products . En una modalidad, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de alrededor de 1 mM, o alrededor de 5 mM, o de alrededor de 10 mM, o de alrededor de 15 mM, o de alrededor de 20 mM, o de alrededor de 25 mM, o de alrededor de 30 mM, o de alrededor de 35 mM, o de alrededor de 40 mM, o de alrededor de 45 mM, o de alrededor de 50 mM, o de alrededor de 60 mM, o de alrededor de 70 mM, o de alrededor de 80 mM, o de alrededor de 90 mM o de alrededor de 100 mM. En una modalidad, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de 1 mM, o de 5 mM, o de 10 mM, o de 15 mM, o de 20 mM, o de 25 mM, o de 30 mM, o de 35 mM, o de 40 mM, o de 45 mM, o de 50 mM, o de 60 mM, o de 70 mM, o de 80 mM, o de 90 mM o de 100 mM. En una modalidad específica, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 50 mM. En otra modalidad específica, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de entre 5 mM y 20 mM.

En una modalidad adicional, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de 1 mM, o de 5 mM, o de 10 mM, o de 15 mM, o de 20 mM, o de 25 mM, o de 30 mM, o de 35 mM, o de 40 mM, o de 45 mM, o de 50 mM, o de 60 mM, o de 70 mM, o de 80 mM, o de 90 mM o de 100 mM. En una modalidad, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de 1 mM, o de 5 mM, o de 10 mM, o de 15 mM, o de 20 mM, o de 25 mM, o de 30 mM, o de 35 mM, o de 40 mM, o de 45 mM, o de 50 mM, o de 60 mM, o de 70 mM, o de 80 mM, o de 90 mM o de 100 mM. En una modalidad específica, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de entre 5 mM y 50 mM. En otra modalidad específica, el agente amortiguador se encuentra a una concentración de entre 5 mM y 20 mM.

En algunas modalidades, una formulación de la invención comprende un agente amortiguador. En una modalidad, el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste en histidina, citrato, fosfato, glicina y acetato. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende histidina como un agente amortiguador.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 1 mM, al menos alrededor de 5 mM, al menos alrededor de 10 mM, al menos alrededor de 20 mM, al menos alrededor de 30 mM, al menos alrededor de 40 mM, al menos alrededor de 50 mM, al menos alrededor de 75 mM, al menos alrededor de 100 mM, al menos alrededor de 150 mM o al menos alrededor de 200 mM de histidina. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 1 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 1 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 1 mM y alrededor de 100 mM, entre alrededor de 1 mM y alrededor de 75 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 75 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 50 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 40 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 30 mM, entre alrededor de 20 mM y alrededor de 75 mM, entre alrededor de 20 mM y alrededor de 50 mM, entre alrededor de 20 mM y alrededor de 40 mM o entre alrededor de 20 mM y alrededor de 30 mM de histidina. En una modalidad adicional de la invención, comprende alrededor de 1 mM, alrededor de 5 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 20 mM, alrededor de 25 mM, alrededor de 30 mM, alrededor de 35 mM, alrededor de 40 mM, alrededor de 45 mM, alrededor de 50 mM, alrededor de 60 mM, alrededor de 70 mM, alrededor de 80 mM, alrededor de 90 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 150 mM o alrededor de 200 mM de histidina. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 10 mM de histidina.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos 1 mM, al menos 5 mM, al menos 10 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM, al menos 75 mM, al menos 100 mM, al menos 150 mM o al menos 200 mM de histidina. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre 1 mM y 200 mM, entre 1 mM y 150 mM, entre 1 mM y 100 mM, entre 1 mM y 75 mM, entre 10 mM y 200 mM, entre 10 mM y 150 mM, entre 10 mM y 100 mM, entre 10 mM y 75 mM, entre 10 mM y 50 mM, entre 10 mM y 40 mM, entre 10 mM y 30 mM, entre 20 mM y 75 mM, entre 20 mM y 50 mM, entre 20 mM y 40 mM o entre 20 mM y 30 mM de histidina. En una modalidad adicional de la invención comprende 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM o 200 mM de histidina. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 10 mM de histidina.

En algunas modalidades, las formulaciones de la invención comprenden un excipiente de carbohidrato. Los excipientes de carbohidratos pueden actuar, por ej . , como agentes aumentadores de la viscosidad, estabilizantes, agentes de relleno, agentes solubilizantes y/o similares. Los excipientes de carbohidratos están generalmente presentes en entre alrededor del 1% y alrededor del 99% en peso o volumen. En una modalidad, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 0.1% y alrededor del 20%. En otra modalidad, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 0.1% y alrededor del 15%. En una modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 0.1% y alrededor del 5%, o entre alrededor del 1% y alrededor del 20%, o en entre alrededor del 5% y alrededor del 15%, o en entre alrededor del 8% y alrededor del 10%, o entre alrededor del 10% y alrededor del 15% o entre alrededor del 15% y alrededor del 20%. En otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% al 20%, o entre el 5% al 15%, o entre el 8% al 10%, o entre el 10% y el 15% o entre el 15% y el 20%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 0.1% y alrededor del 5%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 5% y alrededor del 10%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre alrededor del 15% y alrededor del 20%. En aun otras modalidades específicas, el excipiente de carbohidrato está presente el 1%, o el 1.5%, o el 2%, o el 2.5%, o el 3%, o el 4%, o el 5%, o el 10% o el 15% o el 20%.

En algunas modalidades, las formulaciones de la invención comprenden un excipiente de carbohidrato. Los excipientes de carbohidratos pueden actuar, por ej . , como agentes aumentadores de la viscosidad, estabilizantes, agentes de relleno, agentes solubilizantes y/o similares. Los excipientes de carbohidratos están generalmente presentes en entre el 1% y el 99% en peso o volumen. En una modalidad, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% y el 20%. En otra modalidad, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% y el 15%. En otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% y el 5%, o entre el 1% y el 20%, o entre el 5% y el 15%, o entre el 8% y el 10%, o entre el 10% y el 15% o entre el 15% y el 20%. En otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% y el 20%, o entre el 5% y el 15%, o entre el 8% y el 10%, o entre el 10% y el 15% o entre el 15% y el 20%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 0.1% y el 5%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 5% y el 10%. En aun otra modalidad específica, el excipiente de carbohidrato está presente en entre el 15% y el 20%. En aun otras modalidades específicas, el excipiente de carbohidrato está presente el 1%, o el 1.5%, o el 2%, o el 2.5%, o el 3%, o el 4%, o el 5%, o el 10% o el 15% o el 20%.

Los excipientes de carbohidrato adecuado para usar en formulaciones de la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos , tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas , dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y similares. En una modalidad, los excipientes de carbohidratos para usar en la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, lactosa, manitol y rafinosa. En una modalidad específica, el excipiente de carbohidrato es trehalosa. En una modalidad específica, el excipiente de carbohidrato es manitol. En una modalidad específica, el excipiente de carbohidrato es sacarosa. En una modalidad específica, el excipiente de carbohidrato, es rafinosa. La pureza del excipiente de carbohidrato debería ser de al menos 98%, o al menos 99% o al menos 99.5%.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 1%, al menos alrededor de 2%, al menos alrededor de 4%, al menos alrededor de 8%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30% o al menos alrededor de 40% de trehalosa. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 1% y alrededor de 40%, entre alrededor de 1% y alrededor de 30%, entre alrededor de 1% y alrededor de 20%, entre alrededor de 2% y alrededor de 40%, entre alrededor de 2% y alrededor de 30%, entre alrededor de 2% y alrededor de 20%, entre alrededor de 4% y alrededor de 40%, entre alrededor de 4% y alrededor de 30% o entre alrededor de 4% y alrededor de 20% de trehalosa. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende alrededor de 1%, alrededor de 2%, alrededor de 4%, alrededor de 8%, alrededor de 20%, alrededor de 30% o alrededor de 40% de trehalosa. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 4% de trehalosa.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos 1%, al menos 2%, al menos 4%, al menos 8%, al menos 20%, al menos 30% o al menos 40% de trehalosa. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre 1% y 40%, entre 1% y 30%, entre 1% y 20%, entre 2% y 40%, entre 2% y 30%, entre 2% y 20%, entre 4% y 40%, entre 4% y 30% o entre 4% y 20% de trehalosa. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende 1%, 2%, 4%, 8%, 20%, 30% o 40% de trehalosa.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un excipiente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende al menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en: azúcar, sales, tensioactivo, aminoácido, poliol, agente quelante, emulsionante y conservante. En una modalidad, una formulación de la invención comprende una sal. En una modalidad, una formulación de la invención comprende una sal que se selecciona del grupo que consiste en: NaCl, KC1, CaCl2 y MgCl2. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende NaCl.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 10 mM, al menos alrededor de 25 mM, al menos alrededor de 50 mM, al menos alrededor de 75 mM, al menos alrededor de 80 mM, al menos alrededor de 100 mM, al menos alrededor de 125 mM, al menos alrededor de 150 mM, al menos alrededor de 175 mM, al menos alrededor de 200 mM o al menos alrededor de 300 mM de cloruro de sodio. En una modalidad adicional, una formulación descrita en la presente comprende entre alrededor de 10 mM y alrededor de 300 mM( entre alrededor de 10 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 175 mM, entre alrededor de 10 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 175 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 175 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 75 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 75 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 75 mM y alrededor de 175 mM, entre alrededor de 75 mM y alrededor de 150 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 200 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 175 mM o entre alrededor de 100 mM y alrededor de 150 mM de cloruro de sodio. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende alrededor de 10 mM, alrededor de 25 mM, alrededor de 50 mM, alrededor de 75 mM, alrededor de 80 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 125 mM, alrededor de 150 mM, alrededor de 175 mM, alrededor de 200 mM o alrededor de 300 mM de cloruro de sodio.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos 10 mM, al menos 25 mM, al menos 50 mM, al menos 75 mM, al menos 80 mM, al menos 100 mM, al menos 125 mM, al menos 150 mM, al menos 175 mM, al menos 200 mM o al menos 300 mM de cloruro de sodio. En una modalidad adicional, una formulación descrita en la presente comprende entre 10 mM y 300 mM, entre 10 mM y 200 mM, entre 10 mM y 175 mM, entre 10 mM y 150 mM, entre 25 mM y 300 mM, entre 25 mM y 200 mM, entre 25 mM y 175 mM, entre 25 mM y 150 mM, entre 50 mM y 300 mM, entre 50 mM y 200 mM, entre 50 mM y 175 mM, entre 50 mM y 150 mM, entre 75 mM y 300 mM, entre 75 mM y 200 mM, entre 75 mM y 175 mM, entre 75 mM y 150 mM, entre 100 mM y 300 mM, entre 100 mM y 200 mM, entre 100 mM y 175 mM o entre 100 mM y 150 mM de cloruro de sodio. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 80 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM o 300 mM de cloruro de sodio.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un aminoácido. En una modalidad, una formulación de la invención comprende una sal de aminoácido. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en lisina, arginina e histidina. En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 25 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 50 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 100 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 150 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 200 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 250 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 300 mM de un aminoácido, al menos alrededor de 350 mM de un aminoácido o al menos alrededor de 400 mM de un aminoácido. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 25 mM y alrededor de 250 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 350 mM, entre alrededor de 25 mM y alrededor de 400 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 250 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 350 mM, entre alrededor de 50 mM y alrededor de 400 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 250 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 300 mM, entre alrededor de 100 mM y alrededor de 400 mM, entre alrededor de 150 mM y alrededor de 250 mM, entre alrededor de 150 mM y alrededor de 300 mM o entre alrededor de 150 mM y alrededor de 400 mM de un aminoácido. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende alrededor de 25 mM, alrededor de 50 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 150 mM, alrededor de 200 mM, alrededor de 250 mM, alrededor de 300 mM, alrededor de 350 mM o alrededor de 400 mM de un aminoácido. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 25 mM de un aminoácido. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 50 mM de un aminoácido. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 75 mM de un aminoácido.

En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 100 mM de un aminoácido. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 200 mM de un aminoácido.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende una trehalosa y un aminoácido. En una modalidad, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 0.1, alrededor de 0.5, alrededor de 0.75, alrededor de 1, alrededor de 5, alrededor de 10, alrededor de 20, alrededor de 30, alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, alrededor de 100, alrededor de 200 o alrededor de 300. En una modalidad, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 1.5, alrededor de 1.7, alrededor de 1.8, alrededor de 1.9, alrededor de 2, alrededor de 2.1, alrededor de 2.2, alrededor de 2.3, alrededor de 2.4, alrededor de 2.5, alrededor de 2.6, alrededor de 2.7, alrededor de 2.8, alrededor de 2.9, alrededor de 3, alrededor de 3.1, alrededor de 3.2, alrededor de 3.3, alrededor de 3.4, alrededor de 3.5 o alrededor de 4. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.1. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.2. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.4. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.5. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.6. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende trehalosa y un aminoácido en una relación molar de alrededor de 2.7.

Las formulaciones de la invención pueden comprender adicionalmente un tensioactivo . El término " tensioactivo" tal como se usa en la presente se refiere a sustancias orgánicas que tiene estructuras antipáticas ; a saber, están compuestas por grupos de tendencias opuestas de solubilidad, típicamente una cadena de hidrocarburo soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos se pueden clasificar, dependiendo de la carga de la porción tensioactiva, en tensioactivos aniónicos, catiónicos y noiónicos. Los tensioactivos se usan comúnmente como agentes humectantes, emulsificantes , solubilizantes y dispersantes para varias composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos. Los tensioactivos farmacéuticamente aceptables como polisorbatos (por ej . polisorbatos 20 u 80) ; polioxámeros (por ej . polioxámero 188); Tritón octil glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil- , cocamidopropil- , linoleamidopropil- , miristamidopropil- , palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ej . lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropil-dimetilamina; sodio metil cocoil- o disodio metil oleil-taurato; y la serie MONAQUA™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol , polipropilglicol y copolímeros de etilen y propilenglicol (por ej . Pluronics, PF68, etc) , se pueden agregar a las formulaciones de la invención para disminuir la agregación. Los tensioactivos son particularmente útiles si se usa una bomba o recipiente de plástico para administrar la formulación. La presencia de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable mitiga la propensión a la proteína a agregar. En una modalidad específica, las formulaciones de la invención comprenden un polisorbato que se encuentra en una concentración que varía de alrededor, de 0.001% a alrededor de 1%, de alrededor de 0.001% a alrededor de 0.1% o de alrededor de 0.01% a alrededor de 0.1%. En otras modalidades específicas, las formulaciones de la invención comprenden un polisorbato que se encuentra en una concentración de 0.001%, o 0.002%, o 0.003%, o 0.004%, o 0.005%, o 0.006%, o 0.007%, o 0.008%, o 0.009%, o 0.01%, o 0.015% o 0.02%. En otra modalidad específica, el polisorbato es polisorbato-80. En una modalidad específica, las formulaciones de la invención comprenden un polisorbato que se encuentra en una concentración que varía de 0.001% a 1%, de 0.001% a 0.1% o de 0.01% a 0.1%. En otras modalidades específicas, las formulaciones de la invención comprenden un polisorbato que se encuentra en una concentración de 0.001%, o 0.002%, o 0.003%, o 0.004%, o 0.005%, o 0.006%, o 0.007%, O 0.008%, o 0.009%, o 0.01%, o 0.015% o 0.02%. En otra modalidad específica, el polisorbato es polisorbato- 80.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende una tensioactivo . En una modalidad, una formulación de la invención comprende Polisorbato 20, Polisorbato 40, Polisorbato 60 o Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende Polisorbato 80.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos alrededor de 0.001%, al menos alrededor de 0.002%, al menos alrededor de 0.005%, al menos alrededor de 0.01%, al menos alrededor de 0.02%, al menos alrededor de 0.05%, al menos alrededor de 0. 1%, al menos alrededor de 0.2% o al menos alrededor de 0.5% de Polisorbato 80. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre alrededor de 0.001% y alrededor de 0.5%, entre alrededor de 0.001% y alrededor de 0.2%, entre alrededor de 0.001% y alrededor de 0.1%, entre alrededor de 0.001% y alrededor de 0.05%, entre alrededor de 0.002% y alrededor de 0.5%, entre alrededor de 0.002% y alrededor de 0.2%, entre alrededor de 0.002% y alrededor de 0.1%, entre alrededor de 0.002% y alrededor de 0.05%, entre alrededor de 0.005% y alrededor de 0.5%, entre alrededor de 0.005% y alrededor de 0.2%, entre alrededor de 0.005% y alrededor de 0.1%, entre alrededor de 0.005% y alrededor de 0.05%, entre alrededor de 0.01% y alrededor de 0.5%, entre alrededor de 0.01% y alrededor de 0.2%, entre alrededor de 0.01% y alrededor de 0.1% o entre alrededor de 0.01% y alrededor de 0.05% de Polisorbato 80. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende alrededor de 0.001%, alrededor de 0.002%, alrededor de 0.005%, alrededor de 0.01%, alrededor de 0.02%, alrededor de 0.05%, alrededor de 0.1%, alrededor de 0.2% y alrededor de 0.5% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 0.02% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 0.04% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende alrededor de 0.05% de Polisorbato 80.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende al menos 0.001%, al menos 0.002%, al menos 0.005%, al menos 0.01%, al menos 0.02%, al menos 0.05%, al menos 0. 1%, al menos 0.2% o al menos 0.5% de Polisorbato 80. En otra modalidad, una formulación de la invención comprende entre 0.001% y 0.5%, entre 0.001% y 0.2%, entre 0.001% y 0.1%, entre 0.001% y 0.05%, entre 0.002% y 0.5%, entre 0.002% y 0.2%, entre 0.002% y 0.1%, entre 0.002% y 0.05%, entre 0.005% y 0.5%, entre 0.005% y 0.2%, entre 0.005% y 0.1%, entre 0.005% y 0.05%, entre 0.01% y 0.5%, entre 0.01% y 0.2%, entre 0.01% y 0.1% o entre 0.01% y 0.05% de Polisorbato 80. En una modalidad adicional, una formulación de la invención comprende 0.001%, 0.002%, 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% y 0.5% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 0.02% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 0.04% de Polisorbato 80. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende 0.05% de Polisorbato 80.

Opcionalmente , las formulaciones de la invención pueden comprender adicionalmente otros excipientes y/o aditivos comunes que incluyen, pero no se limitan a, diluyentes, aglutinantes, estabilizantes, solventes lipofílieos, conservantes, adyuvantes o similares. Los excipientes y/o aditivos farmacéuticamente aceptables se pueden usar en las formulaciones de la invención. Los excipientes/aditivos comúnmente usados, tales como quelantes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, pero sin limitarse a, EDTA, DTPA o EGTA) se pueden agregar opcionalmente a las formulaciones de la invención para disminuir la agregación. Estos aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o recipiente de plástico para administrar la formulación.

Los conservantes, tales como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol de bencilo, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol , formaldehído, clorobutanol , cloruro de magnesio (por ejemplo, pero sin limitarse a, hexahidrato) , alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares) , cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos se pueden agregar opcionalmente a las formulaciones de la invención a cualquier concentración adecuada tal como entre alrededor de 0.001% y alrededor de 5% o cualquier intervalo o valor del mismo. La concentración del conservante usado en las formulaciones de la invención es una concentración suficiente para proporcionar un efecto microbiano. Las concentraciones dependen del conservante seleccionado y son fácilmente determinadas por el experto.

Otros excipientes/aditivos contemplados, que se pueden utilizar en las formulaciones de la invención incluyen, por ejemplo, agentes saborizantes , agentes antimicrobianos, endulzantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos tales como fosfolípidos o ácidos grasos, esteroides tales como colesterol, excipientes proteicos tales como albúmina de suero (albúmina de suero humano (HSA) , albúmina humana recombinante (rHA) ) , gelatina, caseína, contraiones que forman sales tales como sodio y similares. Estos excipientes y/o aditivos farmacéuticos conocidos adicionales adecuados para usar en las formulaciones de la invención son conocidos en la técnica, por ej . , tal como se enumera en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy" , 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), y en "Physician's Desk Reference" , 60a ed. , Medical Economics, Montvale, N.J. (2005) . Los portadores farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar de manera rutinaria como adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad de la proteína variante de Fe tal como se conoce en la técnica o tal como se describe en la presente.

El experto en la técnica entenderá que las formulaciones de la invención pueden ser isotónicas con sangre humana, es decir, las formulaciones de la invención tienen esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Tales formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de alrededor de 250 mOSm a alrededor de 350 mOSm. La isotonicidad se puede medir, por ejemplo, utilizando un osmómetro de presión de vapor o crioscópico. La tonicidad de una formulación se ajusta por el uso de modificadores de tonicidad. Los "modificadores de tonicidad" son aquellas sustancias inertes farmacéuticamente aceptables que se pueden agregar a la formulación para proporcionar una isotonicidad de la formulación. Los modificadores de tonicidad adecuados para esta invención incluyen, pero no se limitan a, sacáridos, sales y aminoácidos.

En algunas modalidades, las formulaciones de la presente invención tienen una presión osmótica de alrededor de 100 mOSm a alrededor de 1200 mOSm, o de alrededor de 200 mOSm a alrededor de 1000 mOSm, o de alrededor de 200 mOSm a alrededor de 800 mOSm, o de alrededor de 200 mOSm a alrededor de 600 mOSm, o de alrededor de 250 mOSm a alrededor de 500 mOSm, o de alrededor de 250 mOSm a alrededor de 400 mOSm o de alrededor de 250 mOSm a alrededor de 350 mOSm.

En algunas modalidades, las formulaciones de la presente invención tienen una presión osmótica de 100 mOSm a 1200 mOSm, o de 200 mOSm a 1000 mOSm, o de 200 mOSm a 800 mOSm, o de 200 mOSm a 600 mOSm, o de 250 mOSm a 500 mOSm, o de 250 mOSm a 400 mOSm o de 250 mOSm a 350 mOSm.

La concentración de cualquier combinación de varios componentes de las formulaciones de la invención se ajusta para lograr la tonicidad deseada de la formulación final. Por ejemplo, la relación del excipiente de carbohidrato con el anticuerpo se puede ajustar de acuerdo- con métodos conocidos en la técnica (por ej . patente estadounidense N° 6,685,940). En algunas modalidades, la relación molar del excipiente de carbohidrato al anticuerpo puede ser de alrededor de 100 moles a alrededor de 1000 moles de excipiente de carbohidrato a alrededor de 1 mol de anticuerpo, o de alrededor de 200 moles a alrededor de 6000 moles de excipiente de carbohidrato a alrededor de 1 mol de anticuerpo, o de alrededor de 100 moles a alrededor de 510 moles de excipiente de carbohidrato a alrededor de 1 mol de anticuerpo o de alrededor de 100 moles a alrededor de 600 moles de excipiente de carbohidrato a alrededor de 1 mol de anticuerpo.

La concentración de cualquier combinación de varios componentes de las formulaciones de la invención se ajusta para lograr la tonicidad deseada de la formulación final. Por ejemplo, la relación del excipiente de carbohidrato al anticuerpo se puede ajustar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (por ej . patente estadounidense N° 6,685,940) . En algunas modalidades, la relación molar del excipiente de carbohidrato al anticuerpo puede ser de 100 moles a 1000 moles de excipiente de carbohidrato a 1 mol de anticuerpo, o de 200 moles a 6000 moles de excipiente de carbohidrato con 1 mol de anticuerpo, o de 100 moles a 510 moles de excipiente de carbohidrato a 1 mol de anticuerpo, o de 100 moles a 600 moles de excipiente de carbohidrato a 1 mol de anticuerpo.

La isotonicidad deseada de la formulación final también se puede lograr ajustando la concentración de sal de las formulaciones. Las sales que son farmacéuticamente aceptables y adecuadas para esta invención como modificadoras de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, succinato de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y cloruro de calcio. En modalidades específicas, las formulaciones de las invenciones comprenden NaCl, MgCl2, y/o CaCl2. En una modalidad, la concentración de NaCl se encuentra entre alrededor de 75 mM y alrededor de 150 mM. En otra modalidad, la concentración de MgCl2 se encuentra entre alrededor de 1 mM y alrededor de 100 mM. Los aminoácidos que son farmacéuticamente aceptables y adecuados para esta invención como modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, prolina, alanina, L-arginina, aspargina, ácido L-aspártico, glicina, serina, lisina e histidina.

En una modalidad las formulaciones de la invención son formulaciones sin pirógenos que no tienen prácticamente endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan solamente cuando los microorganismos se descomponen o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables que inducen fiebre (glucoproteínas) de la membrana exterior de las bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y shock si se administran a humanos. Debido a los potenciales efectos dañinos, se deben eliminar cantidades inclusive bajas de endotoxinas de las soluciones de fármacos farmacéuticos administradas de forma intravenosa. La Food & Drug Administration ("FDA") estableció un límite de 5 unidades de endotoxinas (EU) por dosis por kilogramo de peso corporal en un período de una hora para aplicaciones intravenosas de fármacos (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000) ) . Cuando las proteínas terapéuticas se administran en cantidades de varios cientos o miles de miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede ser el caso con los anticuerpos, se deben eliminar cantidades inclusive pequeñas de endotoxinas peligrosas y dañinas . En algunas modalidades específicas, los niveles de endotoxinas y pirógenos en la composición son menores de 10 EU/mg, o menores de 5 EU/mg, o menores de 1 EU/mg, o menores de 0.1 EU/mg, o menores de 0.01 EU/mg o menores de 0.001 EU/mg.

Al usarse para la administración in vivo, las formulaciones de la invención deberían ser estériles. Las formulaciones de la invención pueden esterilizarse por varios métodos de esterilización, que incluyen filtración, radiación estéril, etc. En una modalidad, la formulación del anticuerpo se esteriliza por filtrado con un filtro preesterilizado de 0.22-micrones . Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de acuerdo con prácticas farmacéuticas convencionales tal como se describe en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21a ed. , Lippincott Williams & Wilkins, (2005) . Las formulaciones que comprenden anticuerpos, tales como aquellas descritas en la presente, se almacenarán generalmente en forma liofilizada o en solución. Se contempla que las composiciones estériles que comprenden anticuerpos se ubican en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. En una modalidad específica, una composición de la invención se proporciona como una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada. El término "liofilizado" o "secado por congelamiento" incluye un estado de una sustancia que se ha sometido a un procedimiento de secado tal como liofilización, donde al menos se ha eliminado 50% de la humedad .

La frase "agente de relleno" incluye un compuesto que es farmacéuticamente aceptable y que agrega relleno a una torta lio. Los agentes de relleno conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, carbohidratos, que incluyen azúcares simples tales como dextrosa, ribosa, fructosa y similares, azúcares de alcohol tales como manitol, inositol y sorbitol, disacáridos que incluyen trehalosa, sacarosa y lactosa, polímeros naturales tales como almidón, dextranos, quitosano, hialuronato, proteínas (por ej . gelatina y suero de albúmina), glucógeno y monómeros y polímeros sintéticos.

Un " lioprotector" es una molécula que, al combinarse con una proteína de interés, evita o reduce de manera significativa la inestabilidad química y/o física de la proteína luego de la liofilización y el posterior almacenamiento. Los lioprotectores incluyen, pero no se limitan a, azúcares y sus correspondientes alcoholes de azúcar; un aminoácido tal como histidina o glutamato de monosodio; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar trihídrico o de peso molecular más alto, por ej . , glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol ; polietilenglicol ; Pluronics™ . ; y combinaciones de los mismos. Los ejemplos adicionales de lioprotectores incluyen, pero no se limitan a, glicerina y gelatina y los azúcares melibiosa, melezitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de azúcares reductores incluyen, pero no se limitan a, glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, isomaltulosa y lactulosa. Los ejemplos de azúcares no reductores incluyen, pero no se limitan a, glucósidos no reductores de compuestos polihidroxi que se seleccionan de alcoholes de azúcar y otros polialcoholes de cadena recta. Los ejemplos de de alcoholes de azúcar incluyen, pero no se limitan a, monoglucósidos , compuestos obtenidos por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glucosídico puede ser glucosídico o galactosídico . Los ejemplos adicionales de alcoholes de azúcar incluyen, pero no se limitan a, glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulosa . En modalidades específicas, la trehalosa o sacarosa se usa como un lioprotector.

El lioprotector se agrega a la formulación preliofilizada en una "cantidad lioprotectora" que significa que, luego de la liofilización de la proteína en presencia de la cantidad lioprotectora del lioprotector, la proteína retiene esencialmente su estabilidad e integridad física y química luego de la liofilización y el almacenamiento.

En una modalidad, la relación molar de un lioprotector (por ej . , trehalosa) y moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de una formulación de la invención es al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200 o al menos alrededor de 300. En otra modalidad, la relación molar de un lioprotector (por ej . trehalosa) y moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de una formulación de la invención es alrededor de 1, es alrededor de 2, es alrededor de 5, es alrededor de 10, alrededor de 50, alrededor de 100, alrededor de 200 o alrededor de 300.

Una formulación "reconstituida" es una que se preparó disolviendo una formulación de anticuerpo liofilizado en un diluyente para que el anticuerpo se disperse en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para la administración (por ej . administración parenteral) a un paciente a tratar con una proteína de interés y, en algunas modalidades de la invención, puede ser una que sea adecuada para administración intravenosa.

El "diluyente" de interés en la presente es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración a un humano) y útil para la preparación de una formulación líquida, como una formulación reconstituida luego de la liofilización. En algunas modalidades, los diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, agua bacterioestática para inyección (BWFI) , una solución amortiguadora de pH (por ej . solución salina amortiguada con fosfato) , solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. En una modalidad alternativa, los diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o amortiguadores .

En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar de un frasco luego de agitar el frasco durante 4 horas a una velocidad de 400 sacudidas por minuto donde el frasco se llena hasta la mitad de su volumen con la formulación. En otra modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar de un frasco luego de someter la formulación a tres ciclos de congelamiento/descongelamiento donde el frasco se llena hasta la mitad de su volumen con la formulación. En una modalidad adicional, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar mediante la reconstitución de una torta liofilizada generada a partir de la formulación.

En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar de un frasco luego de agitar el frasco durante 4 horas a una velocidad de 400 sacudidas por minuto donde el frasco se llena hasta la mitad de su volumen con la formulación. En otra modalidad, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar de un frasco luego de someter la formulación a tres ciclos de congelamiento/descongelamiento donde el frasco se llena hasta la mitad de su volumen con la formulación. En una modalidad adicional, una formulación de la invención es una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se puede recuperar mediante la reconstitución de una torta liofilizada generada a partir de la formulación.

En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-lL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas, al menos alrededor de 4 semanas , al menos alrededor de 5 semanas o al menos alrededor de 6 semanas. En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses .

En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años o al menos alrededor de 5 años .

En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas, alrededor de 4 semanas , alrededor de 5 semanas o alrededor de 6 semanas. En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses.

En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación liofilizada de la invención comprende moléculas de anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde al menos alrededor de 90% , al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98% o al menos alrededor de 99% del anticuerpo se recupera mediante la reconstitución de la formulación liofilizada luego de almacenarla a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años o alrededor de 5 años .

En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación reconstituida. En algunas modalidades, una formulación líquida reconstituida de la invención se prepara a partir de una formulación liofilizada descrita en la presente .

En una modalidad, una formulación líquida reconstituida de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención a la misma concentración que la formulación líquida preliofilizada.

En una modalidad, una formulación líquida reconstituida de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención a una concentración más alta que la formulación líquida preliofilizada. En modalidades específicas, una formulación líquida reconstituida de la invención comprende concentración alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 5 veces, alrededor de 6 veces, alrededor de 7 veces, alrededor de 8 veces, alrededor de 9 veces, alrededor de 10 veces, alrededor de 15 veces, alrededor de 20 veces, alrededor de 30 veces, alrededor de 40 veces más alta de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que la formulación líquida preliofilizada .

En una modalidad, una formulación líquida reconstituida de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención a una concentración más baja que la formulación líquida preliofilizada . En modalidades específicas, una formulación líquida reconstituida de la invención comprende concentración alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 5 veces, alrededor de 6 veces, alrededor de 7 veces, alrededor de 8 veces, alrededor de 9 veces, alrededor de 10 veces, alrededor de 15 veces, alrededor de 20 veces, alrededor de 30 veces, alrededor de 40 veces más baja de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que la formulación líquida preliofilizada .

En una modalidad, una formulación líquida reconstituida de la invención es una formulación acuosa. En una modalidad específica, una formulación líquida reconstituida de la invención es una formulación acuosa donde el portador acuoso es agua destilada.

En una modalidad, una formulación reconstituida de la invención es estéril.

En una modalidad, una formulación reconstituida de la invención es homogénea.

En una modalidad, una formulación reconstituida de la invención es isotónica. En una modalidad, una formulación reconstituida de la invención es hipotónica. En una modalidad, una formulación reconstituida de la invención es hipertónica .

En algunas modalidades, las formulaciones reconstituidas de la invención comprenden (o consisten en la fracción de agregados) un perfil de partícula de menos de alrededor de 3.4 E +5 partículas/ml de diámetro 2-4 µ??, menos de alrededor de 4.0 E +4 partículas/ml de diámetro 4-10 pm, menos de alrededor de 4.2 E +3 partículas/ml de diámetro 10-20 pm, menos de alrededor de 5.0 E +2 partículas/ml de diámetro 20-30 pm, menos de alrededor de 7.5 E +1 partículas/ml de diámetro 30-40 pm, y menos de alrededor de 9.4 partículas/ml de diámetro 40-60 pm según lo determina un medidor de tamaños de partículas. En algunas modalidades, las formulaciones reconstituidas de la invención no contienen partículas detectables mayores a 40 pm o mayores a 30 pm.

En algunas modalidades, luego del almacenamiento durante alrededor de 1 hora, alrededor de 2 horas, alrededor de 3 horas, alrededor de 4 horas, alrededor de 5 horas, alrededor de 6 horas, alrededor de 7 horas, alrededor de 8 horas, alrededor de 9 horas, alrededor de 12 horas, alrededor de 15 horas, alrededor de 18 horas o alrededor de 24 horas, las formulaciones líquidas reconstituidas de la invención comprenden (o consisten en la fracción de agregados) un perfil de partícula de menos de alrededor de 3.4 E +5 partículas/ml de diámetro 2-4 pm, menos de alrededor de 4.0 E +4 partículas/ml de diámetro 4-10 pm, menos de alrededor de 4.2 E +3 partículas/ml de diámetro 10-20 pm, menos de alrededor de 5.0 E +2 partículas/ml de diámetro 20-30 pm, menos de alrededor de 7.5 E +1 partículas/ml de diámetro 30-40 pm, y menos de alrededor de 9.4 partículas/ml de diámetro 40-60 pm según lo determina un medidor de tamaños de partículas. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas de la invención no contienen partículas detectables mayores a 40 µp\ o mayores a 30 µ?? .

En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a: (a) una formulación líquida estéril que consiste en 100 mg/ml de anticuerpo, 25 mM de histidina, 1.6 mM de glicina a pH 6.0; (b) una formulación líquida estéril que consiste en 100 mg/ml de anticuerpo y 25 mM de histidina a pH 6.0; (c) una formulación líquida estéril que consiste en 5mg/ml de anticuerpo, 20mM de ácido cítrico, 100 mM de NACI, 1.5% de manitol, 50 1 de DTPA y 0.02% de PS80 a pH 6.0; (d) una formulación líquida estéril que consiste en 100 mg/ml de anticuerpo, 25 mM de histidina, 8% de trehalosa y 0.02% de PS80 a pH 6.0; (e) una formulación líquida estéril que consiste en 20 mg/ml de anticuerpo, 10 mM de His, 2.35 % (p/v) de Lisina-HCl y 0.02 % de PS-80 (p/v) a pH 6.0; (f) una formulación líquida estéril que consiste en 5 mg/ml de anticuerpo, lOmM de amortiguador citrato de sodio, NaCl (0.15M) y Tween 80 (0.02%) a pH 6.0; (g) una formulación líquida estéril que consiste en 100 mg/ml de anticuerpo, 10 mM de histidina y 150 mM de NaCl a pH 6.0.

En una modalidad, una formulación de la invención estabiliza un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad, una formulación de la invención evita la agregación de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad, una formulación de la invención evita la fragmentación de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable luego del almacenamiento a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 40 °C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable luego del almacenamiento a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 25% durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable luego del almacenamiento a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 40 °C durante alrededor de l mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable luego del almacenamiento a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 25 °C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención es estable al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor- de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención es estable al almacenarse en una jeringa previamente rellenada.

La presente invención proporciona formulaciones estables que comprenden un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. La estabilidad del anticuerpo se puede evaluar por grados de agregación, degradación o fragmentación, medidos por HPSEC, cromatografía de fase inversa, diseminación de luz estática (SLS) , espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) , dicroísmo circular (CD) , técnicas de desconvolución de urea, fluorescencia intrínseca de triptófano, calorimetría de escaneo diferencial y/o técnicas de unión de ANS, en comparación con una formulación de referencia que comprende un anticuerpo de referencia. Por ejemplo, una formulación de referencia puede ser un estándar de referencia congelado a -70°C que consiste en 10 mg/ml de un anticuerpo de referencia (que incluye un fragmento de anticuerpo del mismo) (por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo que comprende la región variable 16C4 y una región de Fe que tiene cadenas complejas de azúcar unidas a N- glucósidos en los que la fucosa no está enlazada a N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar) en 10 mM de histidina (pH 6.0) que contiene 75 mM de NaCl y 4% de trehalosa, cuya formulación de referencia da regularmente un único pico de monómero (por ej . , = 95% de área) por HPSEC. En algunas modalidades, una formulación de referencia es idéntica a la formulación cuya estabilidad se prueba; la formulación de referencia se puede almacenar congelada a -70°C durante la prueba de estabilidad para preservar la formulación de referencia en su condición original. Por ejemplo, el estándar de referencia para evaluar cualquier pérdida de una actividad de unión al antígeno IL-6 en una formulación almacenada a 40°C puede ser la misma formulación almacenada a -70°C durante 30 días. La estabilidad general de una formulación que comprende un anticuerpo (que incluye el fragmento de anticuerpo del mismo) también se puede evaluar mediante diferentes ensayos inmunológicos , por ejemplo, ELISA y radioinmunoensayo usando moléculas de antígeno aisladas. Además, la estabilidad de la formulación que comprende un anticuerpo también se puede evaluar usando ensayos diseñados para medir una característica funcional del anticuerpo, por ejemplo, ensayos diseñados para medir la afinidad de unión al antígeno, actividad ADCC in vitro, actividad de reducción in vivo, actividad CDC in vitro, ensayos de inhibición, ensayos de proliferación celular, etc.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses . En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a- IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de l mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada .

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una actividad de unión a IL-6 que es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de unión a IL-6 de un anticuerpo de referencia, donde la formulación se almacenó a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-lL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada. Tal como se usan en la presente, los términos "como máximo" y "no más de" tienen el mismo significado".

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máxime 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 25 °C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad; una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 25 °C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor, de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años . En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde el anticuerpo pierde como máximo 50%, como máximo 40%, como máximo 30%, como máximo 20%, como máximo 10%, como máximo 5% o como máximo 1% de su actividad de unión a IL-6 durante el almacenamiento de la formulación a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas , al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de '3 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 25 °C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7%, menos de 5% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo forma un agregado según lo determina HPSEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%-,-=^menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad especifica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 40 °C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 25 °C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7%, menos de 5% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención, donde menos de 1%, menos de 2%, menos de 3%, menos de 4%, menos de 5%, menos de 7% o menos de 10% del anticuerpo se fragmenta según lo determina RP-HPLC o SEC al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 40°C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al .menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas . En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 40 °C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 25 °C durante al menos alrededor de 1 semana, al menos alrededor de 2 semanas, al menos alrededor de 3 semanas o al menos alrededor de 4 semanas . En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 25 °C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses o al menos alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de 7 meses, al menos alrededor de 8 meses, al menos alrededor de 9 meses, al menos alrededor de 10 meses, al menos alrededor de 11 meses o al menos alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 5°C durante al menos alrededor de 1 año, al menos alrededor de 2 años, al menos alrededor de 3 años, al menos alrededor de 4 años, al menos alrededor de 5 años, al menos alrededor de 6 años, al menos alrededor de 7 años, al menos alrededor de 8 años, al menos alrededor de 9 años, al menos alrededor de 10 años, al menos alrededor de 11 años o al menos alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 40°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 40 °C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 25°C durante alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas o alrededor de 4 semanas. En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 25 °C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses o alrededor de 6 meses. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 4 meses, alrededor de 5 meses, alrededor de 6 meses, alrededor de 7 meses, alrededor de 8 meses, alrededor de 9 meses, alrededor de 10 meses, alrededor de 11 meses o alrededor de 12 meses. En una modalidad, una formulación de la invención es transparente e incolora según lo determina la revisión visual al almacenarse a alrededor de 5°C durante alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 6 años, alrededor de 7 años, alrededor de 8 años, alrededor de 9 años, alrededor de 10 años, alrededor de 11 años o alrededor de 12 años. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En algunas modalidades, las formulaciones de la invención mantienen perfiles de agregación mejorados al almacenarse, por ejemplo, durante períodos prolongados (por ejemplo, pero sin limitarse a, 1 semana, 1 mes, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años o 5 años) a temperatura ambiente o 4°C o durante períodos (tales como, pero sin limitarse a 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o 6 meses) a temperaturas elevadas tales como 38°C-42°C. En algunas modalidades, las formulaciones mantienen perfiles de agregación mejorados al almacenarse mientras se exponen a la luz o se almacenan en la oscuridad en diversas condiciones de humedad que incluyen pero no se limitan a una humedad relativa de hasta 10%, o hasta 20%, o hasta 30%, o hasta 40%, o hasta 50%, o hasta 60%, o hasta 70%, o hasta 80%, o hasta 90% o hasta 100%. El experto en la técnica entenderá que el término condiciones "ambiente" generalmente se refiere a temperaturas de alrededor de 20 °C a una humedad relativa de entre 10% y 60% con exposición a la luz. De manera similar, las temperaturas entre alrededor de 2 °C y alrededor de 8 °C a una humedad relativa de menos de aproximadamente 10% se denominan de manera colectiva "4 °C" o "5 °C", temperaturas entre alrededor de 23 °C y alrededor de 27 °C a una humedad relativa de alrededor de 60% se denominan de manera colectiva "25 °C" y las temperaturas entre alrededor de 38 °C y alrededor de 42 °C a una humedad relativa de alrededor de 75% se denominan de manera colectiva como "40 °C." En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente.

En algunas modalidades, luego del almacenamiento a 4°C durante al menos un mes, las formulaciones de la invención comprenden (o consisten en la fracción de agregados) un perfil de partícula de menos de alrededor de 3.4 E +5 partículas/ml de diámetro 2-4 ym, menos de alrededor de 4.0 E +4 partículas/ml de diámetro 4-10 µp?, menos de alrededor de 4.2 E +3 partículas/ml de diámetro 10-20 m, menos de alrededor de 5.0 E +2 partículas/ml de diámetro 20-30 µp\, menos de alrededor de 7.5 E +1 partículas/ml de diámetro 30-40 µp?, y menos de alrededor de 9.4 partículas/ml de diámetro 40-60 µp\ según lo determina un medidor de tamaños de partículas. En algunas modalidades, las formulaciones de la invención no contienen partículas detectables mayores a 40 µ??? o mayores a 30 µp?. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente .

En la técnica se conocen numerosos métodos útiles para determinar el grado de agregación y/o tipos y/o tamaños de agregados presentes en una formulación de proteína (por ej . , formulación de anticuerpo de la invención) , que incluyen pero no se limitan a técnicas de unión de proteínas de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento (HPSEC) , diseminación de luz estática (SLS) , espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) , dicroísmo circular (CD) , técnicas de desconvolución de proteínas inducidas por urea, fluorescencia intrínseca de triptófano, calorimetría de escaneo diferencial y ácido l-anilino-8-naftalenosulfónico (ANS) . Por ejemplo, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) se puede llevar a cabo para separar moléculas, según tu tamaño, al pasar las moléculas sobre una columna cargada con la resina adecuada, las moléculas más grandes (por ej . agregados) eluirán antes que las moléculas pequeñas (por ej . monómeros) . Las moléculas se detectan generalmente por absorbancia UV a 280 nm y se pueden recolectar para caracterización adicional. Las columnas de cromatografía líquida de alta presión se utilizan en general para análisis SEC (HP-SEC) . Los métodos SEC específicos se detallan en la sección denominada "Ejemplos" a continuación. De manera alternativa, se puede utilizar la ultracentrifugación analítica (AUC) . La AUC es una técnica ortogonal que determina los coeficientes de sedimentación (reportados en Svedberg, S) de macromoléculas en una muestra líquida. Como SEC, la AUC es capaz de separar y detectar fragmentos/agregados de anticuerpo de monómeros y además puede proporcionar información acerca de la masa molecular. La agregación de proteínas en las formulaciones también se puede caracterizar por análisis por contador de partículas usando un contador coulter o por mediciones de turbiedad usando un turbidímetro . La turbiedad es una medida de la cantidad por la cual las partículas de una solución dispersan la luz y, por consiguiente, se puede usar como un indicador general de agregación de proteínas. Además, la electroforesis en gel de poliacrilamida no disminuida (PAGE) o electroforesis capilar en gel (CGE) se pueden usar para caracterizar el estado de agregación y/o fragmentación de anticuerpos o fragmento de los mismos en una formulación de la invención.

En una modalidad, una formulación de la invención es para administración parenteral. En una modalidad, una formulación de la invención es una formulación inyectable. En modalidades específicas, la formulación de la invención es adecuada para inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, perineural, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraesternal . En una modalidad, una formulación de la invención es para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención donde la formulación es para inyección subcutánea. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención donde la formulación es para inyección intravenosa. En una modalidad específica, una formulación de la invención se almacena en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es para administración intravenosa donde la formulación comprende entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 60 mg/ml, entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml, entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 40 mg/ml, entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 60 mg/ml, entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml, entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 40 mg/ml, entre alrededor de 20 mg/ml y alrededor de 60 mg/ml, entre alrededor de 20 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml , entre alrededor de 20 mg/ml y alrededor de 40 mg/ml, entre alrededor de 30 mg/ml y alrededor de 60 mg/ml, entre alrededor de 30 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml o entre alrededor de 30 mg/ml y alrededor de 40 mg/ml de un anticuerpo anti -IL- 6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es para administración perineural o intratecal <donde la formulación comprende entre alrededor de C 01 g/ml y alrededor de 50 yg/mi, entre alrededor de 0.05 ug/ml y alrededor de 45 mg/ml , entre alrededor de 0.1 pg/ml y alrededor de 30 g/ml, entre alrededor de 0.15 pg/ml y alrededor de 25 ug/mi, entre alrededor de 0.2 g/ml y alrededor de 20 pg/ml, entre alrededor de 0.25 ug/ml y alrededor de 17. 5 g/ml, entre alrededor de 0.5 ug/mi y alrededor de 15 µg/ml, entre alrededor de 0.75 g/ml y alrededor de 12. 5 ug/ml, entre alrededor de 0.6 g/ml y alrededor de 10 pg/ml, entre alrededor de 1.0 pg/ml y alrededor de 8 g/ml, entre alrededor de 1.25 pg/ml y alrededor de 7.5 pg/ml o entre alrededor de 1.5 pg/ml y alrededor de 6 pg/ml de un anticuerpo anti-lL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida ín vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es para administración subcutánea donde la formulación comprende entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml, entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml , entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml, entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml, entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml , entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml, entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 150 mg/ml o entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml de un anticuerpo anti-IL-6 de la invención. En una modalidad específica, una formulación de la invención se proporciona en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

En una modalidad, una formulación de la invención es para administración en aerosol.

La presente invención también proporciona una forma de dosificación unitaria farmacéutica adecuada para la administración parenteral a un humano que comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención en un recipiente adecuado. En una modalidad, una dosificación unitaria farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención administrado de forma intravenosa, subcutánea o intramuscular. En otra modalidad, una dosificación unitaria farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención administrado en forma de aerosol. En una modalidad específica, una dosificación unitaria farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención administrado de forma subcutánea. En otra modalidad, una dosificación unitaria farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención administrado en forma de aerosol. En una modalidad adicional, una dosificación unitaria farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención administrado de forma intranasal . En una modalidad, un recipiente adecuado es una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada .

En una modalidad, una formulación de la invención se proporciona en un recipiente sellado. En una modalidad específica, una formulación de la invención se proporciona en una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, una formulación de la invención comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la invención que tiene una semivida in vivo prolongada.

La presente invención proporciona adicionalmente un kit que comprende un anticuerpo anti-IL-6 de la formulación de la invención. La invención proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con una formulación líquida o formulación liofilizada de la invención. En una modalidad, un recipiente llenado con una formulación líquida de la invención es una jeringa rellenada previamente. En una modalidad específica, las formulaciones de la invención comprenden anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo del mismo) fusionados recombinantemente o conjugados químicamente a otra porción, incluyendo pero sin limitarse a, una proteína heteróloga, un polipéptido heterólogo, un péptido heterólogo, una molécula grande, una molécula pequeña, una secuencia marcadora, un agente de diagnóstico o detectable, una porción terapéutica, una porción de fármaco, un ion metálico radioactivo, un segundo anticuerpo y un soporte sólido. En una modalidad específica, las formulaciones de la invención se formulan en frascos de dosis única como un líquido estéril. Las formulaciones de la invención se pueden proporcionar en frascos de ámbar de borosilicato Tipo I USP de 3 ce (West Pharmaceutical Services Parte No. 6800-0675) con un volumen diana de 1.2 mL. Opcionalmente asociado con el (los) contenedor (es) puede haber un aviso de la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte del organismo de la fabricación, uso o venta para administración en humanos. En otra modalidad, una formulación de la invención se puede proporcionar en una jeringa rellenada previamente.

En una modalidad, un recipiente llenado con una formulación líquida de la invención es una jeringa rellenada previamente. Cualquier jeringa rellenada previamente conocida por un experto en la técnica se puede usar en combinación con una formulación líquida de la invención. Las jeringas rellenada previamente que se pueden usar según se describe en, por ejemplo, pero sin limitarse a, publicaciones PCT WO05032627, WO08094984, W09945985, WO03077976, patentes estadounidenses US6792743, US5607400, US5893842, US7081107, US7041087, US5989227, US6807797, US6142976, US5899889, publicaciones de patente estadounidense US20070161961A1, US20050075611A1, US20070092487A1 , US20040267194A1 , US20060129108A1. Las jeringas rellenada previamente se pueden hacer de varios materiales. En una modalidad, una jeringa rellenada previamente es una jeringa de vidrio. En otra modalidad, una jeringa rellenada previamente es una jeringa de plástico. Un experto en la técnica entiende que la naturaleza y/o calidad de los materiales usados para la fabricación de la jeringa pueden influir en la estabilidad de una formulación de proteína almacenada en la jeringa. Por ejemplo, se entiende que los lubricantes basados en silicio depositados en la superficie interna de la cámara de la jeringa pueden afectar la formación de partículas en la formulación de proteína. En una modalidad, una jeringa rellenada previamente comprende un lubricante basado en silicona. En una modalidad, una jeringa rellenada previamente comprende basado [sic] en silicona. En una modalidad, una jeringa rellenada previamente está libre de lubricantes basados en silicona. Un experto en la técnica también entiende que las pequeñas cantidades de elementos contaminantes que se filtran hacia la formulación desde el tambor de la jeringa, tapa de la punta de la jeringa, émbolo o tapón también pueden influir en la estabilidad de la formulación. Por ejemplo, se entiende que el tungsteno introducido durante el proceso de fabricación puede perjudicar la estabilidad de la formulación. En una modalidad, una jeringa rellenada previamente puede comprender tungsteno en un nivel por encima de los 500 ppb. En otra modalidad, una jeringa rellenada previamente es una jeringa de bajo tungsteno. En otra modalidad, una jeringa rellenada previamente puede comprender tungsteno en un nivel de entre alrededor de 500 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 400 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 300 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 200 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 100 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 50 ppb y alrededor de 10 ppb, entre alrededor de 25 ppb y alrededor de 10 ppb.

Artículos de fabricación La presente invención también abarca un paquete terminado y un producto farmacéutico con etiqueta. Este articulo de fabricación incluye la forma de dosificación unitaria apropiada en un recipiente o contenedor apropiado tal como un frasco de vidrio, jeringa rellenada previamente u otro recipiente que esté herméticamente sellado. En una modalidad, la forma de dosificación unitaria se proporciona como un solución estéril libre de partículas que comprende un anticuerpo anti-IL-6 que es adecuada para la administración parenteral . En otra modalidad, la forma de dosificación unitaria se proporciona como un polvo estéril liofilizado que comprende un anticuerpo anti-IL-6 que es adecuado para la reconstitución .

En una modalidad, la forma de dosificación unitaria es adecuada para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, tópica o subcutánea. Por lo tanto, la invención comprende soluciones estériles adecuadas para cada vía de administración. La invención comprende además polvos liofilizados estériles que son adecuados para la reconstitución .

Como sucede con cualquier producto farmacéutico, el material de embalaje y recipiente están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y embarque. Adicionalmente, los productos de la invención incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseje al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar de forma apropiada la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucción que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, pero sin limitarse a, dosis reales, procedimientos de control y otra información de control .

Específicamente, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un material de embalaje, tal como una caja, botella, tubo, recipiente, contenedor, jeringa rellenada previamente, rociador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y similar y al menos una forma de dosificación unitaria de un agente farmacéutico contenida dentro del material de embalaje, donde el agente farmacéutico comprende una formulación líquida que contiene un anticuerpo. El material de embalaje incluye medios de instrucción que indican cómo el anticuerpo se puede usar para prevenir, tratar y/o manejar uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como por ejemplo moléculas de anticuerpo de dominio simple (por ejemplo, "nanobodies™" ) etc. también se prevén en la presente invención. Tales formulaciones orales pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Un comprimido puede comprender un portador sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tal como etilenglicol , propilenglicol o polietilenglicol .

Para inyección intravenosa o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados . Los expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Se pueden usar conservantes, estabilizantes, amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos según se requiera incluyendo amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3'-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ej . , complejos de proteína Zn) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

Los miembros de unión de la presente invención se pueden formular en formas líquidas, semisólidas o sólidas dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y la vía de administración. Las formulaciones pueden incluir excipientes o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y tensioactivos . Las formulaciones líquidas pueden incluir una amplia gama de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones sólidas se pueden producir por liofilización, secado por atomización o secado por tecnología de fluido supercrítico, por ejemplo. Las formulaciones de los miembros de unión dependerán de la vía de administración pretendida: por ejemplo, las formulaciones para la administración pulmonar pueden consistir en partículas con propiedades físicas que aseguran la penetración en el pulmón profundo luego de la inhalación, formulaciones tópicas (por ej . , para el tratamiento de cicatrización, por ej . , cicatrización dérmica) puede incluir agentes modificadores de viscosidad que prolongan el tiempo que el fármaco permanece en el sitio de acción. Un miembro de unión se puede preparar con un portador que protegerá al miembro de unión de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados . Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles , tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica (Robinson, J. R. ed. , (1978) Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc. , Nueva York) .

El tratamiento se puede administrar oralmente (tal como por ejemplo moléculas de anticuerpo de dominio simple (por ej . , "nanobodies™" ) ) por inyección (por ejemplo, de forma subcutánea, intraarticular, intravenosa, intraperitoneal , intraarterial o intramuscular) , por inhalación, intratraqueal, por la vía intravesicular (implante en la vejiga urinaria) o tópicamente (por ejemplo, de forma intraocular, intranasal, rectal, en heridas, sobre la piel) . El tratamiento se puede administrar por infusión pulsada, particularmente con dosis cada vez menores del miembro de unión. La vía de administración se puede determinar por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requisito de optimizar la eficacia o de minimizar los efectos secundarios. Una vía de administración particular es la intravenosa. Otra vía para administrar composiciones farmacéuticas de la presente invención es la subcutánea. Se prevé que el tratamiento no estará restringido al uso en el consultorio. Por lo tanto, la inyección subcutánea usando un dispositivo sin aguja también es ventajosa.

Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente, dependiendo de la afección a ser tratada.

Un miembro de unión de la invención se puede usar como parte de una terapia de combinación junto con un componente médico adicional . Los tratamientos de combinación se pueden usar para proporcionar efectos sinergísticos significativos, particularmente la combinación de un miembro de unión de la invención con uno o más fármacos adicionales . Un miembro de unión de la invención se puede administrar simultánea o secuencialmente o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las afecciones enumeradas en la presente.

Un miembro de unión de la invención se puede usar como un quimiosensibilizante por el cual puede aumentar la eficacia terapéutica de los agentes citotóxicos y por lo tanto se puede proporcionar para la administración en combinación con uno o más agentes citotóxicos, ya sea simultánea o secuencialmente. El miembro de unión también se puede usar como un radiosensibilizante por el cual se puede mejorar la eficacia de la radiación y por lo tanto se puede proporcionar para la administración en combinación con radiación ya sea simultánea o secuencialmente.

Un miembro de unión de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar en combinación o además de uno o más de los siguientes agentes : - una citocina o agonista o antagonista de la función de citocina (por ej . , un agente que actúa sobre las sendas de señalización de citocina, tales como un modulador del sistema SOCS ) , tal como un interferón alfa, beta y/o gama; factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-1) , sus receptores y proteínas de unión asociadas; interleucinas (IL) , por ej . , una o más de IL-1 a -33, y/o un antagonista o inhibidor de interleucina, tal como anakinra; inhibidores de receptores de los miembros de la familia de interleucina o inhibidores de subunidades específicas de tales receptores, un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-oc) , tal como anticuerpos monoclonales anti-TNF (por ejemplo infliximab, adalimumab y/o CDP-870) y/o un antagonista del receptor de TNF, por ej . , una molécula de inmunoglobulina (tal como etanercept) y/o un agente de bajo peso molecular, tal como pentoxifilina; - un modulador de células B, por ej . , un anticuerpo monoclonal que se dirige a linfocitos B (tal como CD20 (rituximab) o MRA-aILl6R) o linfocitos T (por ej . , CTLA4-Ig, HuMax 11-15 o Abatacept) ; - un modulador que inhibe la actividad de osteoclastos, por ejemplo un anticuerpo para RANKL; - un modulador de quimiocina o de la función del receptor de quimiocina, tal como un antagonista de CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3 , CCR4 , CCR5 , CCR6 , CCR7 , CCR8 , CCR9 , CCR10 y CCR11 (para la familia C-C) ; CXCR1, CXCR2 , CXCR3 , CXCR4 y CXCR5 y CXCR6 (para la familia C-X-C) y CX3CR1 para la familia C-X3-C; - un inhibidor de las metaloproteasas de matriz (MMP) , es decir una o más de las estromelisinas, las colagenasas y las gelatinasas así como agrecanasa, especialmente colagenasa-1 (MMP-1) , colagenasa-2 (MMP-8), colagenasa-3 (MMP-13), estromelisina-1 (MMP-3) , estromelisina-2 (MMP-10) y/o estromelisina-3 (MMP-11) y/o MMP-9 y/o MMP-12, por ejemplo, un agente tal como doxiciclina; un inhibidor de la biosíntesis del leucotrieno, inhibidor de 5-lipoxigenasa (5-LO) o antagonista de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) , tal como; zileuton; ABT-761; fenleuton; tepoxalin; Abbott-79175 ; Abbott-85761 ; N- (5- sustituida) -tiofen-2 -alquilsulfonamidas ; 2 , 6-di-terc-butilfenolhidrazonas; metoxitetrahidropiranos tal como Zeneca ZD-2138; el compuesto SB-210661; un compuesto 2-cianonaftaleno sustituido por piridinilo tal como L-739,010; un compuesto de 2-cianoquinolina tal como L-746,530; o un compuesto de indol y/o quinolina tal como MK-591, MK-886 y/o BAY x 1005, - un antagonista del receptor de leucotrienos (LT) B4 , LTC4 , LTD4 y LTE4 seleccionado del grupo que consiste en fenotiazin-3-ls tal como L-651,392; compuestos de amidino tales como CGS-25019c; benzoxalaminas tales como ontazolast; bencenocarboximidamidas tales como BUL 284/260 y compuestos tales como zafirlukast, ablukast, montelukast, pranlukast, verlukast (MK-679) , RG-12525, Ro-245913, iralukast (CGP 45715A) y BAY x 7195, - un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE) , tal como una metilxantanina, por ej . , teofilina y/o aminofilina y/o un inhibidor de isoenzima PDE selectivo, por ej . , un inhibidor de PDE4 y/o inhibidor de la isoforma PDE4D y/o un inhibidor de PDE5 ,- - un antagonista del receptor de histamina tipo 1, tal como cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, acrivastina, terfenadina, astemizol, azelastina, levocabastina, clorfeniramina, prometazina, ciclizina, y/o mizolastina (generalmente aplicado de forma oral, tópica o parenteral) ; - un inhibidor de la bomba de protones (tal como omeprazol) o antagonista del receptor gastroprotector de histamina tipo 2 ; - un antagonista del receptor de histamina tipo 4; un agente simpatomimético vasoconstrictor del agonista del adrenoceptor alfa-l/alfa-2 , tal como propilhexedrina, fenilefrina, fenilpropanolamina, efedrina, seudoefedrina, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, clorhidrato de tetrahidrozolina, clorhidrato de xilometazolina, clorhidrato de tramazolina y clorhidrato etilnorepinefriña; - un agente anticolinérgico, por ej , un antagonista del receptor muscarínico (MI, M2 y M3), tal como atropina, hioscina, glucopirrrolato, bromuro de ipratropio, bromuro de tiotropio, bromuro de oxitropio, pirenzepina y telenzepina; un agonista del adrenoceptor beta (incluyendo subtipos 1-4 del receptor beta) , tal como isoprenalina, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, orciprenalina, mesilato de bitolterol y/o pirbuterol, por ej . , un enantiomero quiral del mismo; - una cromona, por ej . , cromoglicato de sodio y/o nedocromil sodio; - un glucocorticoide , tal como flunisolida, acetonida de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, budesonida, propionato de fluticasona, ciclesonida y/o furoato de mometasona; un agente que modula los receptores de hormona nuclear, tal como un PPAR; - una inmunoglobulina (Ig) o preparación de Ig o un antagonista o anticuerpo que modula la función de Ig, tal como anti-IgE (por ej . , omalizumab) ; otro agente antiinflamatorio sistémico o aplicado tópicamente, por ej . , talidomida o un derivado del mismo, un retinoide, ditranol y/o calcipotriol; - combinaciones de aminosalicilatos y sulfapiridina, tal como sulfasalazina, mesalazina, balsalazida y olsalazina y agentes inmunomoduladores , tales como tiopurinas y corticosteroides , tales como budesonida; - un agente antibacteriano tal como un derivado de penicilina, una tetraciclina, un macrólido, una beta-lactama, una fluoroquinolona, metronidazol y/o un aminoglicósido inhalado y/o un agente antiviral, por ej . aciclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, cidofovir, amantadina, rimantadina, ribavirina, zanamavir y/o oseltamavir; un inhibidor de proteasa tal como indinavir, nelfinavir, ritonavir y/o saquinavir; un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa tal como didanosina, lamivudina, estavudina, zalcitabina, zidovudina; o un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa tal como nevirapina o efavirenz ; - un agente cardiovascular, tal como un bloqueador del canal de calcio, bloqueador del adrenoceptor beta, inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) , antagonista del receptor de angiotensina 2; agente reductor de lípidos, tal como una estatina y/o fibrato; un modulador de la morfología de la célula sanguínea, tal como pentoxifilina; un trombolítico y/o un anticoagulante, por ej . , un inhibidor de la agregación de plaquetas; - un agente del SNC tal como un antidepresivo (tal como sertralina) , un fármaco anti-Parkinsoniano (tal como deprenil, L-dopa, ropinirol, pramipexol, un inhibidor de MAOB tal como selegina y rasagilina, un inhibidor de comP tal como tasmar, un inhibidor de A-2, un inhibidor de la reabsorción de dopamina, un antagonista de NMDA, un agonista de nicotina, un agonista de dopamina y/o un inhibidor de la sintasa del óxido nítrico neuronal) , o un fármaco contra el Alzheimer tal como donepezil, rivastigmina, tacrina, un inhibidor de COX-2, propentofilina o metrifonato, un agente para el tratamiento de dolor agudo o crónico, por ej . , un analgésico de acción central o periférica, tal como un análogo o derivado de opioide, carbamazepina, fenitoína, valproato de sodio, amitriptilina u otro agente antidepresivo, paracetamol o agente antiinflamatorio no esteroideo,- un agente anestésico local aplicado de forma parenteral o tópica (incluyendo por inhalación) , tal como lignocaína o un análogo de la misma; - un agente antiosteoporosis, por ej . , un agente hormonal, tal como raloxifeno o bifosfonato, tal como alendronato; - (i) un inhibidor de triptasa; (ii) un antagonista del factor activador de plaquetas (PAF) : (iii) un inhibidor de la enzima convertidora de interleucina (ICE) ; (iv) un inhibidor de IMPDH; (v) inhibidores de la molécula de adhesión incluyendo el antagonista de VLA-4; (vi) una catepsina; (vii) un inhibidor de cinasa, por ej . un inhibidor de tirosinas cinasas (tal como MAP Btk, Itk, Jak3 , los ejemplos de inhibidores pueden incluir gefitinib o mesilato de imatinib) , una cinasa de serina/treonina (por ej . , un inhibidor de cinasa MAP tal como p38, JNK, proteína cinasa A, B y C e IKK) , o una cinasa implicada en la regulación del ciclo celular (por ej . , una cinasa dependiente de ciclina) ; (viii) un inhibidor de la glucosa- 6 fosfato deshidrogenasa; (ix) un antagonista del receptor de quinina Bi y/o B2 ; (x) un agente anti-gota, por ej . , colchicina; (xi) un inhibidor de xantina oxidasa, por ej . , alopurinol; (xii) un agente uricosúrico, por ejemplo, probenecid, sulfinpirazona y/o benzbromarona; (xiii) un secretagogo de la hormona de crecimiento; (xiv) factor de crecimiento de transformación (TGFP) ; (xv) factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; (xvi) factor de crecimiento de fibroblastos por ej . factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) ; (xvii) factor de estimulación de la colonia de granulocitos macrófagos (GM-CSF) ; (xviii) crema capsaicina; (xix) un antagonista del receptor de taquiquinina NKX y/o NK3 tal como NKP-608C, SB-233412 (talnetant) y/o D-4418; (xx) un inhibidor de elastasa por ej . UT-77 y/o ZD-0892; (xxi) un inhibidor de la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE) ; (xxii) inhibidor de la sintasa de óxido nítrico inducida (iNOS) o (xxiii) molécula homologa al receptor quimioatrayente expresada en células TH2, (tales como un antagonista de CRTH2) ; (xxiv) un inhibidor de p38; (xxv) agente que modula la función de los receptores tipo Toll (TLR) ; (xxvi) un agente que modula la actividad de receptores purinérgicos tal como P2X7; (xxvii) un inhibidor de la activación del factor de transcripción tal como NFkB, API y/o STATS.

Un inhibidor puede ser específico o puede ser un inhibidor mixto, por ej . , un inhibidor que se dirige a más de una de las moléculas (por ej . , receptores) o clases moleculares mencionadas anteriormente .

El miembro de unión también se podría usar en asociación con un agente quimioterapéutico u otro inhibidor de la tirosina cinasa en co-administración o en forma de un inmunoconjugado. Los fragmentos del anticuerpo también se podrían usar en anticuerpos biespecífieos obtenidos por mecanismos recombinantes o acoplamiento bioquímico y luego asociar la especificidad del anticuerpo mencionado anteriormente con la especificidad de otros anticuerpos capaces de reconocer otras moléculas implicadas en la actividad con la cual la IL-6 está asociada.

Para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, un miembro de unión de la invención se puede combinar con uno o más agentes, tales como agentes antiinflamatorios no esteroideos (en lo sucesivo NSAID) , incluyendo inhibidores de la ciclooxigenasa COX-l/COX-2 no selectivos, ya sea aplicados tópica o sistémicamente (tales como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiónicos tales como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, azapropazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina) ; inhibidores de COX-2 selectivos (tales como meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, lumarocoxib, parecoxib y etoricoxib) ; donadores de óxido nítrico inhibidores de ciclooxigenasa (CINOD) ; glucocorticosteroides (ya sea administrados por vías tópica, oral, intramuscular, intravenosa o intraarticular) ; metotrexato leflunomida; hidroxicloroquina; d-penicilamina; auranofina u otras preparaciones de oro parenterales u orales; analgésicos; diacereína; terapias intraarticulares tales como derivados de ácido hialurónico y suplementos nutricionales tales como glucosamina .

También puede utilizarse un miembro de unión de la invención en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de cáncer. Los agentes adecuados a ser usados en combinación incluyen: (i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, tal como se usa en oncología médica, como Gleevec (mesilato de imatinib) , agentes alquilantes (por ejemplo cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalán, clorambucil, busulfán y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo antifolatos tales como fluoropirimidinas , que incluyen 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosida, hidroxiurea, gemcitabina y paclitaxel) antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas tales como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides de la vinca tales como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides tales como taxol y taxotere) ; e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas tales como etoposida y teniposida, amsacrina, topotecan y camptotecina) , (ii) agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e yodoxifeno) , reguladores descendentes del receptor de estrógeno (por ejemplo fulvestrant) , antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona) , antagonistas LHRH o agonistas LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina) , progestógenos (por ejemplo acetato de megestrol) , inhibidores de aromatasa (por ejemplo anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5oc-reductasa tales como finasterida; (iii) Agentes que inhiben la invasión de células cancerígenas (por ejemplo inhibidores de metaloproteinasa tales como marimastat e inhibidores de función del receptor activador del plasminógeno tipo urocinasa) ; (iv) inhibidores de la función del factor de crecimiento, por ejemplo tales inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-erbb2 trastuzumab, o el anticuerpo anti-erbbl cetuximab [C225] ) , inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de la tirosina cinasa e inhibidores de la cinasa serina/treonina, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, inhibidores de la tirosina cinasa de la familia EGFR tal como N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazolin-4 -amina (gefitinib, AZD1839) , N- (3 -etinilfenil) -6 , 7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin- -amina (erlotinib, OSI774) y 6-acrilamido-N- (3-cloro-4-fluorofenil) -7- (3-morfolinopropoxi) quinazolin- -amina (CI 1033)), por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos; (v) agentes antiangiogénicos tales como aquellos que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo el anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial antivascular bevacizumab, compuestos tales como aquellos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 97/225¾6, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad) y compuestos que funcionan por medio de otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función integrina a?ß3 y angiostatina) ; (vi) agentes perjudiciales vasculares tales como combretastatina A4 y compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213 (cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad) ; (vii) terapias antisentido, por ejemplo, aquellas que se dirigen a los objetivos listados anteriormente, tales como ISIS 2503, un antisentido antirrás; (viii) enfoques de terapia genética, que incluyen por ejemplo enfoques para el reemplazo de genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrante, enfoques de GDEPT (terapia enzimática profármaco genética dirigida) tales como aquellos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitrorreductasa bacterial y enfoques para el aumento de la tolerancia del paciente a la quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de resistencia a múltiples fármacos y (ix) enfoques inmunoterapéuticos , incluyendo por ejemplo enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales de los pacientes, tales como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor de estimulación de la colonia de granulocitos macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de células T, enfoques que utilizan células inmunes transíectadas tales como células dendríticas transíectadas con citocina, enfoques que utilizan líneas celulares tumorales transíectadas con citocina y enfoques que utilizan anticuerpos anti-idiotípicos .

Un miembro de unión de la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales mencionados anteriormente se pueden usar en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para administración separada o combinada a un individuo y por consiguiente puede comprender el miembro de unión y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas . Las preparaciones separadas se pueden usar para facilitar la administración separada y consecutiva o simultánea y permitir la administración de los componentes por vías diferentes, por ej . , administración oral o parenteral .

De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a mamíferos. La administración es normalmente en una "cantidad terapéuticamente eficaz" que es suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Tal beneficio puede ser al menos mejoría de al menos un síntoma. La cantidad realmente administrada y la velocidad y transcurso de tiempo de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando, el mamífero particular que está siendo tratado, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de la composición, el tipo de miembro de unión, el método de administración, la organización de la administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos. La prescripción del tratamiento, por ej . , decisiones sobre la dosificación, etc. forma parte de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o el progreso de la enfermedad que está siendo tratada. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica (Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cáncer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunocon úgates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922) . Se pueden usar las dosificaciones específicas indicadas en la presente o en Physician's Desk Reference (2003) como apropiadas para el tipo de medicamento que se está administrando. Una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis adecuada de un miembro de unión de la invención se pueden determinar por la comparación de su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Los métodos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de prueba a humanos son conocidos. La dosis exacta dependerá de una cantidad de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o para el tratamiento, el tamaño y ubicación del área a ser tratada, la naturaleza exacta del anticuerpo (por ej . , anticuerpo entero, fragmento o diacuerpo) y la naturaleza de cualquier etiqueta detectable u otra molécula adjunta al anticuerpo. Una dosis típica de anticuerpo estará en el intervalo de 100 pg a lg para aplicaciones sistémicas y l g a 1 mg para aplicaciones tópicas. Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor seguida por una o más dosis menores. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, por ej . , el isotipo IgGl . Esta es una dosis para un tratamiento eficaz de un paciente adulto, que puede ajustarse de forma proporcional a niños y bebés y también ajustarse a otros formatos de anticuerpos en proporción al peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir en intervalos diarios, cada dos semanas, semanales o mensuales, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y cada cuatro a ocho semanas para administración intravenosa. El tratamiento puede ser periódico y el período entre las administraciones es de alrededor de dos semanas o más, por ej . , alrededor de tres semanas o más, alrededor de cuatro semanas o más o alrededor de una vez por mes . El tratamiento se puede proporcionar antes y/o después de la cirugía y/o se puede administrar o aplicar directamente al sitio anatómico de tratamiento quirúrgico .

Los miembros de unión a la IL-6 de la invención pueden ofrecer ventajas en términos de dosificación y requerimientos de administración, en comparación con anticuerpos contra el sIL-6Ra. Como se destaca en otra parte en la presente, los niveles circulantes de IL-6 son significativamente más bajos que los niveles circulantes de sIL-6Ra en una enfermedad. Por consiguiente, el uso de un miembro de unión a la IL-6, a diferencia de un miembro de unión al anti-IL-6R, tiene ventajas significativas en que la cantidad de fármaco a ser fabricado para cada dosis a los pacientes puede ser más baja. Además, si la dosis de un agente terapéutico anti-IL6 es más baja puede haber ventajas significativas en que la dosis baja facilita las inyecciones subcutáneas así como las inyecciones intravenosas (i.v.). Los expertos en la técnica saben bien que la dosificación subcutánea puede verse limitada por la cantidad de miembro de unión, por ej . , molécula de anticuerpo, requerida por dosis. Esto se debe a que las inyecciones subcutáneas están limitadas por el volumen que se puede inyectar en un sitio en la piel. Típicamente se usan volúmenes de inyección subcutánea de 1.2 mi o menos. Debido a que se puede volver cada vez más difícil formular un miembro de unión para inyección subcutánea a concentraciones mayores de 50 mg/ml, las dosis mayores a 100 mg por medio de esta vía generalmente requieren múltiples inyecciones y más malestar por parte del paciente.

Al tener una dosis más baja, un agente terapéutico anti-IL-6 también puede necesitar una dosis "de carga" más baja de anticuerpo para inhibir todas las IL-6 sistémicas en comparación con el sIL-6Ra sistémico ya que este está en concentraciones más altas.

Los beneficios adicionales se pueden asociar con el direccionamiento a IL-6 más que al receptor de IL-6, lo que representa ventajas adicionales de miembros de unión de la invención según se compara con miembros de unión para el IL-6Ra.

Por ejemplo, existen informes en la bibliografía que muestran que los niveles circulantes de IL-6 son significativamente más bajos que los niveles circulantes de sIL-6Ra en la enfermedad (Desgeorges et al. (1997) J. Rheumatol 24:1510; Yokota et al. (2005) Arth & Rheum 52(3): 818-25) . Debido a que los niveles de SIL-6R son significativamente más altos que los niveles de IL-6, se pueden necesitar más miembros de unión anti-sIL-6R para neutralizar el sIL-6Ra, en comparación con la cantidad de un miembro de unión anti-IL-6 necesario para neutralizar la IL-6. Por lo tanto, se puede necesitar una dosis más baja de un miembro de unión anti-ligando, en comparación con los casos donde se usa un miembro de unión anti -receptor.

El direccionamiento al ligando de IL-6 en vez del receptor de IL-6 puede disminuir los niveles de IL-6 en la enfermedad pero que aún permiten que los niveles de IL-6 aumenten durante la infección, donde IL-6 es sobrerregulada como parte de la respuesta inmune.

Kawano et al. {Nature (1988) 332:83) mostraron que la IL-6 era un factor de crecimiento potente y mostraron que las células de mieloma recién aisladas de los pacientes produjo IL-6 y expresa sus receptores. Además, el anticuerpo anti-IL-6 inhibe el crecimiento in vitro de las células de mieloma. Esto es evidencia directa de que un bucle autócrino opera en la oncogénesis de mielomas humanos. Luego de ese estudio, Van Zaanen et al. (J. Clin . Invest . (1996) 98:1441-1448) demostraron que la producción de IL-6 en pacientes con mieloma múltiple disminuye cuando se los trata con un anticuerpo de ligando anti -IL-6.

Una cantidad de estudios adicionales muestran que la IL-6 está implicada en un bucle de retroalimentación autócrina en otros tipos celulares, por ej . , células de músculo liso (SMC) (Klouche et al., (1999) J. Immunol . 163(8) 4583-9), células de astroglioma U373-MG (Oh et al., (2001) J. Immunol. 166: 2695-704), adipocitos 3T3 (Fasshauer et al., (2003) Horm. Metab. Res. 35(3) 147-52), neuronas ( arz et al., (1998) Proc . Nati. Acad. Sci EUA 95(6) 3251-6), células endoteliales (Modur et al . , (1997) J. Clin. Invest. 100(1) 2752-6) y células de sarcoma de Kaposi (Murakami-Morl et al., (1996) Cell Growth Differ. 7(12) 1697-703). La inhibición de la IL-6 usando un miembro de unión anti-IL-6 en una enfermedad puede entonces llevar a una disminución en la producción basal de enfermedad de IL-6.

Además, los miembros de unión anti-IL-6 se unen a la IL-6 en la circulación sistémica, a diferencia de los miembros de unión al receptor de IL-6 que necesitan penetrar en el tejido para poder ocupar el receptor en la superficie de las células implicadas en la patología de la enfermedad a ser tratada.

Los miembros de unión a la IL-6 pueden formar un equilibrio con IL-6 en la circulación sistémica, lo que causa gradientes a través de barreras, por ej . , la membrana sinovial, que tiene el efecto neto de eliminar la IL-6 activa de la articulación y formar un complejo inactivo con el miembro de unión. La consecuencia de esto es que un miembro de unión a la IL-6 puede tener un inicio más rápido y el régimen de dosificación puede ser diferente y potencialmente más fácil de optimizar, en comparación con un miembro de unión al IL-6R.

La señalización de la IL-6 está mediada por la unión de IL-6 a IL-6R y la unión de ese complejo a gpl30. Debido a que la unión de IL-6 e IL-6Ra es de afinidad nanomolar (alrededor de 5 nM) y que el complejo IL6:IL6R y la unión a gpl30 es de afinidad picomolar, un miembro de unión que se dirige a la IL-6 se enfrenta a una cantidad menor de competición por unión a la IL-6 y por lo tanto puede suprimir una proporción mayor de señalización de la IL-6. Pese a que esto también se puede aplicar a un miembro de unión que se dirige al IL-6Ra soluble y prevenir la formación del complejo IL6:IL6Ra, si el IL-6Ra está unido a una membrana entonces, debido a restricciones estéricas, puede ser más difícil que un anti-IL-6Ra se una e inhiba el IL-6Ra presentado en la membrana.

La invención proporciona métodos de prevención, tratamiento y/o manejo de un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado con o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de IL-6, un trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-6, un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, un trastorno proliferativo, una infección o uno o más síntomas del mismo por medio de la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de composiciones de la invención. Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar una composición de la presente invención o un agente profiláctico o terapéutico. Los métodos para administrar las composiciones de la presente invención o una terapia (por ej . , un agente profiláctico o terapéutico) incluyen pero no se limitan a, administración parenteral (por e , intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, perineural y subcutánea), administración epidural, administración tópica y administración mucosa (por ejemplo, pero sin limitarse a, vías intranasales y orales) . En una modalidad específica, las composiciones de la presente invención se administran de forma intramuscular, intravenosa o subcutánea. En una modalidad, las composiciones de la invención se administran de forma subcutánea. Las formulaciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ej . , mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

La invención también proporciona que una composición de la presente invención se envase en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de anticuerpo (incluyendo el fragmento de anticuerpo del mismo) . En una modalidad, una composición de la presente invención es un recipiente herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración del anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo del mismo) . En una modalidad, una composición de la presente invención se suministra en un recipiente herméticamente sellado y comprende alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 15 mg/ml, alrededor de 20 mg/ml, ' alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml, alrededor de 175 mg/ml, alrededor de 200 mg/ml, alrededor de 250 mg/ml, o alrededor de 300 mg/ml de un anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo del mismo) que se une específicamente a la IL-6 en una cantidad de alrededor de 1 mi, alrededor de 2 mi, alrededor de 3 mi, alrededor de 4 mi, alrededor de 5 mi, alrededor de 6 mi, alrededor de 7 mi, alrededor de 8 mi, alrededor de 9 mi, alrededor de 10 mi, alrededor de 15 mi o alrededor de 20 mi. En una modalidad especifica de la invención, una composición de la invención se suministra en un recipiente herméticamente sellado y comprende al menos alrededor de 15 mg/ml, al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 25 mg/ml, al menos alrededor de 50 mg/ml, al menos alrededor de 100 mg/ml, al menos alrededor de 150 mg/ml, al menos alrededor de 175 mg/ml, al menos alrededor de 200 mg/ml, al menos alrededor de 250 mg/ml o al menos alrededor de 300 mg/ml de un anticuerpo (incluyendo fragmentos de anticuerpo del mismo) que se une específicamente a la IL-6 (por ejemplo, pero sin limitarse a, Anticuerpo 18E) para inyecciones intravenosas y al menos alrededor de 15 mg/ml, al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 50 mg/ml, al menos alrededor de 80 mg/ml, al menos alrededor de 100 mg/ml, al menos alrededor de 150 mg/ml, al menos alrededor de 175 mg/ml, al menos alrededor de 200 mg/ml, al menos alrededor de 250 mg/ml o al menos alrededor de 300 mg/ml de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-6 (por ejemplo, pero sin limitarse a, Anticuerpo 18E) para administración subcutánea repetida.

La cantidad de una composición de la presente invención que será eficaz en la prevención, tratamiento y/o manejo de una enfermedad o trastorno asociado con o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de la IL-6, una enfermedad o trastorno asociado con o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante del receptor de IL-6 o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad autoinmune, rechazo a trasplante, enfermedad de injerto contra huésped o uno o más síntomas del mismo se pueden determinar por técnicas clínicas estándar bien conocidas en la técnica o descritas en la presente. La dosis exacta a ser empleada en la composición también dependerá de la vía de administración y la gravedad del trastorno inflamatorio o trastorno autoinmune y se deberá decidir de acuerdo con el juicio del practicante y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o animales .

Para las composiciones de los anticuerpos abarcados por la invención, la dosificación administrada a un paciente se puede calcular usando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a ser administrada en mg/kg. El volumen requerido (en mL) a ser proporcionado se determina entonces tomando la dosis requerida en mg dividida por la concentración de la formulación del anticuerpo. El volumen requerido final calculado se obtendrá por la agrupación de los contenidos de tantos frascos como sea necesario en una o más jeringas para administrar la formulación del anticuerpo de la invención. El volumen requerido final calculado se obtendrá por la agrupación de los contenidos de tantos frascos como sea necesario en una o más jeringas para administrar el fármaco. Se puede inyectar un volumen máximo de 2.0 mL de la formulación del anticuerpo por sitio. La dosis (en mL) se puede calcular usando la siguiente fórmula: Dosis (mL) = [peso del voluntario] (kg) x [dosis] mg/kg ÷ 100 mg/mL de la formulación del anticuerpo. Los anticuerpos de la invención tienen una semivida prolongada dentro del cuerpo humano. Por lo tanto, a menudo son posibles dosificaciones más bajas de anticuerpos de la invención y una administración menos frecuente. Además, la dosificación, volumen y frecuencia de administración de las composiciones de la presente invención se pueden disminuir por medio del aumento de la concentración de un anticuerpo en las composiciones, aumentando la afinidad y/o avidez del anticuerpo.

En una modalidad específica, la dosificación administrada a un paciente se calculará usando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a ser administrada en mg/kg. El volumen requerido (en mL) a ser proporcionado se determina entonces tomando la dosis requerida en mg dividida por la concentración del anticuerpo (incluyendo cualquier fragmento de anticuerpo del mismo) en las formulaciones (100 mg/mL) . El volumen requerido final calculado se obtendrá por la agrupación de los contenidos de tantos frascos como sea necesario en una o más jeringas para administrar el fármaco. Se puede inyectar un volumen máximo de 2.0 mL de anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo del mismo) por sitio en las formulaciones.

En una modalidad específica, 0.1 a 20 mg/kg/semana, 1 a 15 mg/kg/semana, 2 a 8 mg/semana, 3 a 7 mg/kg/semana o 4 a 6 mg/kg/semana de un anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo del mismo) que se une específicamente a la IL-6 (por ejemplo, pero sin limitarse a, Anticuerpo 18E) en una composición de la invención se administra a un sujeto con un trastorno inflamatorio o un trastorno autoinmune. En otra modalidad, a un sujeto se le administra una o más dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una composición de la invención, donde la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz no es la misma para cada dosis.

En una modalidad, una composición de la invención se administra en un régimen de dosificación que mantiene la concentración en plasma del anticuerpo específico para la IL-6 en un nivel deseable (por ej . , de alrededor de 0.1 a alrededor de 100 pg/ml) , que continuamente bloquea la actividad de IL-6. En una modalidad específica, la concentración en plasma del anticuerpo se mantiene a alrededor de 0.2 pg/ml, alrededor de 0.5 pg/ml, alrededor de 1 pg/ml, alrededor de 2 µg ml, alrededor de 3 µg/ml, alrededor de 4 g/ml, alrededor de 5 pg/ml, alrededor de 6 yg/ml, alrededor de 7 yg/ml, alrededor de 8 g/ml, alrededor de 9 µg/ml, alrededor de 10 pg/ml, alrededor de 15 g/ml, alrededor de 20 yg/ml, alrededor de 25 µg/ml, alrededor de 30 µg/ml, alrededor de 35 g/ml, alrededor de 40 µ9/?t?1/ alrededor de 45 o alrededor de 50 La concentración en plasma que es deseable en un sujeto variará dependiendo de varios factores, incluyendo pero sin limitarse a la naturaleza de la enfermedad o trastorno, la gravedad de la enfermedad o trastorno y la condición del sujeto. Tales regímenes de dosificación son especialmente beneficiosos en la prevención, tratamiento y/o manejo de una enfermedad o trastorno crónico.

En modalidades específicas, una composición de la invención que comprende un anticuerpo conjugado (incluyendo un fragmento de anticuerpo del mismo) específico para la IL-6 se administra intermitentemente. Tal como se usa en la presente, "un anticuerpo conjugado o fragmento de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo del mismo) que se conjuga o fusiona a otra porción, incluyendo pero sin limitarse a, péptido heterólogo, polipéptido, otro anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo del mismo) , una secuencia de marcador, un agente de diagnóstico, un polímero, albúmina y un soporte sólido.

En otra modalidad, a un sujeto humano se le administra una o más dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-6 (por ejemplo, pero sin limitarse a, Anticuerpo 18E) en una composición de la invención, donde la dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del anticuerpo en la composición de la invención administrada al sujeto aumenta en, por ej . , alrededor de 0.01 pg/kg, alrededor de 0.02 pg/kg, alrededor de 0.04 pg/kg, alrededor de 0.05 pg/kg, alrededor de 0.06 µq/kq, alrededor de 0.08 pg/kg, alrededor de 0.1 pg/kg, alrededor de 0.2 pg/kg, alrededor de 0.25 pg/kg, alrededor de 0.5 pg/kg, alrededor de 0.75 pg/kg, alrededor de 1 pg/kg, alrededor de 1.5 pg/kg, alrededor de 2 pg/kg, alrededor de 4 pg/kg, alrededor de 5 pg/kg, alrededor de 10 pg/kg, alrededor de 15 pg/kg, alrededor de 20 pg/kg, alrededor de 25 pg/kg, alrededor de 30 pg/kg, alrededor de 35 pg/kg, alrededor de 40 pg/kg, alrededor de 45 µ?/kg, alrededor de 50 pg/kg, alrededor de 55 µg/kg alrededor de 60 g/kg, alrededor de 65 g/kg, alrededor de 70 µg/kg, alrededor de 75 µg/kg, alrededor de 80 µg/kg, alrededor de 85 µg/kg, alrededor de 90 µg/kg, alrededor de 95 µg/kg, alrededor de 100 µg/kg o alrededor de 125 µg/kg, a medida que el tratamiento avanza.

En otra modalidad, a un sujeto (por ej . , un humano) se le administra una o más dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a la IL- 6 (por ejemplo, pero sin limitarse a, Anticuerpo 18E) en una composición de la invención, donde la dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del anticuerpo en la composición de la invención administrada al sujeto se disminuye en, por ej . , alrededor de 0.01 µg/kg, alrededor de 0.02 µg/kg, alrededor de 0.04 g/kg, alrededor de 0.05 µ?/kg, alrededor de 0.06 µg/kg, alrededor de 0.08 µg/kg/ alrededor de 0.1 µg/kg, alrededor de 0.2 µg/kg, alrededor de 0.25 µg/kg, alrededor de 0 . 5 µg/kg, alrededor de 0.75 µg/kg, alrededor de 1 µg/kg, alrededor de 1.5 µg/kg, alrededor de 2 µg/kg, alrededor de 4 µg/kg, alrededor de 5 µg/kg, alrededor de 10 µg/kg, alrededor de 15 µg/kg, alrededor de 20 µg/kg, alrededor de 25 µg/kg alrededor de 30 µg/kg, alrededor de 35 µg/kg, alrededor de 40 µg/kg, alrededor de 45 µg/kg, alrededor de 50 µg/kg, alrededor de 55 µg/kg, alrededor de 60 µg/kg, alrededor de 65 µg/kg, alrededor de 70 pg/kg, alrededor de 75 pg/kg, alrededor de 80 pg/kg, alrededor de 85 pg/kg, alrededor de 90 pg/kg, alrededor de 95 pg/kg, alrededor de 100 pg/kg o alrededor de 125 pg/kg, a medida que el tratamiento avanza.

Semivida del anticuerpo En algunas modalidades, la semivida de un anticuerpo anti-IL-6 de las composiciones y métodos de la invención es de al menos alrededor de 10 días. En algunas modalidades, la semivida media de un anticuerpo anti-IL-6 de composiciones y métodos de la invención es de al menos alrededor de 20 a 40 días, 25 a 40 días, 26 a 40 días, 20 a 30 días, 25 a 30 días, 26 a 30 días o 26 a 29 días. En otras modalidades adicionales, la semivida de un anticuerpo anti-ICOS de las composiciones y métodos de la invención puede ser de hasta 50 días. En algunas modalidades, las semividas de los anticuerpos de las composiciones y métodos de la invención se pueden prolongar por métodos conocidos en la técnica. Tal prolongación puede a su vez disminuir la cantidad y/o frecuencia de dosificación de las composiciones de anticuerpo. Los anticuerpos con semividas in vivo mejoradas y métodos para prepararlos se describen en la patente estadounidense N° 6,277,375 y en las Publicaciones Internacionales N° WO 98/23289 y WO 97/3461.

La circulación en suero de anticuerpos anti-IL-6 in vivo también se puede prolongar por medio de la unión de moléculas de polímero inertes tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular a los anticuerpos con o sin un enlazador multifuncional ya sea por la conjugación específica del sitio del PEG al N-terminal o C de los anticuerpos o por miedo de grupos ipsilonamino presentes en residuos de lisilo. Se usará derivación de polímero lineal o ramificado que da cómo resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se puede monitorear de cerca por SDSPAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación adecuada de las moléculas PEG a los anticuerpos. PEG sin reaccionar se puede separar de conjugados de PEG-anticuerpo por cromatografía de exclusión de tamaño o por intercambio de iones. Los anticuerpos derivados de PEG se pueden probar para determinar la actividad de unión así como la eficacia in vivo usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por inmunoensayos descritos en la presente.

Además, los anticuerpos de composiciones y métodos de la invención se pueden conjugar a albúmina para hacer que el anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una semivida in vivo más larga. Las técnicas son bien conocidas en el arte, véase, por ej . , Solicitudes internacionales N° O 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137 y Patente Europea N° EP 413, 622, todas ellas incorporadas a la presente a modo de referencia.

De manera adicional, se han descrito las regiones de Fe variantes que otorgan semivida in vivo aumentada a los anticuerpos (véase, publicación de patente estadounidense n° : US2003/0190311 Al) . Se contempla el uso de las variantes de Fe con semivida in vivo prolongada en combinación con las composiciones y métodos de la presente invención. En una modalidad, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante con semivida in vivo aumentada . En una modalidad adicional, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: residuo 252, 254 y 256, donde las posiciones del residuo de aminoácidos se determinan de acuerdo con la convención EU. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: M252Y, S254T y T256E; donde las posiciones del residuo de aminoácidos se determinan conforme a la convención EU. En una modalidad adicional, un anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una región de Fe variante que comprende al menos un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: Y en la posición 252, T en la posición 254 y E en la posición 256, donde las posiciones del residuo de aminoácidos se determinan de acuerdo con la convención EU.

Variantes de Fe La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-6 que comprenden una región de Fe variante. Es decir, una región de Fe de origen no natural, por ejemplo una región de Fe que comprende uno o más residuos de aminoácidos de origen no natural. Las regiones de Fe variantes de la presente invención también abarcan las regiones de Fe que comprenden eliminaciones, adiciones y/o modificaciones de aminoácidos.

Se entenderá que la región de Fe tal como se usa en la presente incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Por lo tanto Fe se refiere a las dos últimas regiones constantes de dominios de inmunoglobulina de IgA, IgD e IgG y los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM y el N-terminal bisagra flexible a estos dominios. Para IgA e IgM, Fe puede incluir la cadena J. Para la IgG, Fe comprende dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgammal (Cyl) y Cgamma2 (Cy2). Pese a que los límites de la región de Fe pueden variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es generalmente definida para comprender los residuos C226 o P230 en sus extremos carboxilo, donde la enumeración es conforme al índice EU como en Kabat et al. (1991, Publicación NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA) . El "índice EU como se establece en Kabat" se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo EU IgGl humano como se describe en Kabat et al. descrito anteriormente. Fe se puede referir a esta región por sí sola o a esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fe. Una proteína variante de Fe puede ser un anticuerpo, fusión de Fe o cualquier proteína o dominio de proteína que comprenda una región de Fe que incluye, pero sin limitarse a proteínas que comprenden regiones Fe variantes que no son variantes de un Fe de origen natural. Nota: Se han observado polimorfismos en una cantidad de posiciones de Fe, incluyendo pero sin limitarse a Kabat 270, 272, 312, 315, 356 y 358, y por lo tanto pueden existir leves diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias en la técnica previa.

La presente invención abarca proteínas variantes de Fe que tienen propiedades alteradas de unión a un ligando Fe (por ej . , un receptor de Fe, Clq) con relación a una molécula comparable (por ej . , una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos con la excepción de que tiene una región de Fe de tipo salvaje) . Los ejemplos de propiedades de unión incluyen pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación de equilibrio (KD) , tasas de disociación y asociación (koff y kon respectivamente) , afinidad de unión y/o avidez. Generalmente se entiende que una molécula de unión (por ej . , una proteína variante de Fe tal como un anticuerpo) con una KD baja puede preferirse antes que a una molécula de unión con una KD alta. Sin embargo, en algunas instancias el valor de la kon o koff puede ser más relevante que el valor de KD. Un experto en la técnica puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación de anticuerpo en particular.

Las afinidades y propiedades de unión de un dominio de Fe con respecto a su ligando se puede determinar por una variedad de métodos de ensayo in vitro (ensayos basados en bioquímica o inmunología) conocidos en la técnica para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, unión específica de una región de Fe a un FcyR incluyendo pero sin limitarse a, métodos de equilibrio (por ej . , ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA) ) , o cinética (por ej . , análisis BIACORE®) y otros métodos tal como ensayos de unión indirectos, ensayos de inhibición competitivos, transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) , cromatografía y electroforesis en gel (por ej . , filtración de gel) . Estos y otros métodos puede utilizar una etiqueta en uno o más de los componentes que se están analizando y/o emplear una variedad de métodos de detección incluyendo pero sin limitarse a etiquetas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes o isotópicas. Una descripción detallada de afinidades de unión y cinética se pueden encontrar en Paul, W.E., ed. , Fundamental Immunology, 4a Ed. , Lippincott-Raven, Filadelfia (1999), que se centra en interacciones anticuerpo- inmunógeno .

En una modalidad, la proteína variante de Fe tiene unión mejorada a uno o más ligandos de Fe con relación a una molécula comparable. En otra modalidad, la proteína variante de Fe tiene una afinidad por un ligando de Fe que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces mayor que la de la molécula comparable. En una modalidad específica, la proteína variante de Fe tiene una unión mejorada a un receptor de Fe. En una modalidad específica, la proteína variante de Fe tiene una unión mejorada al receptor de Fe FcRn.

La semivida en suero de las proteínas que comprenden las regiones de Fe se puede aumentar elevando la afinidad de unión de la región de Fe por FcRn. En una modalidad, la proteína variante de Fe tiene semivida en suero mejorada con relación a la molécula comparable.

En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones, donde la región de Fe comprende un residuo de aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 y 443 tal como se enumeran por el índice EU que se establece en Kabat . opcionalmente, la región de Fe puede comprender un residuo de aminoácido de origen no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por el experto en la técnica (véase, por ej . , patentes estadounidenses 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; publicaciones de patente PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114) .

En una modalidad específica, la presente invención proporciona una composición de proteína variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un residuo de aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R..243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 2621, 262A, 262T, 262E, 2631, 263A, 263T, 263M, 264L, 2641, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 2651, 265L, 265H, 265T, 2661, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 2961, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 2981, 298T, 298F, 2991, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 3051, 313F, 316D, 325Q, 325L, 3251, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 3281, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 3301, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332 , 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y y 434 enumerados según el índice EU establecido en Kaba .

Opcionalmente , la región de Fe puede : comprender residuos de aminoácidos adicionales y/o alternativos de origen no natural conocidos por un experto en la técnica (véase, por ej . , patentes estadounidenses 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; publicaciones de patentes PCT WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752 y WO 05/040217) .

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición de proteína variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 239, 330 y 332, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe, donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat . Opcionalmente, la región de Fe puede comprender además aminoácidos adicionales de origen no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256, enumeradas según el índice EU establecido en Kabat. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una formulación de proteína variante de Fe donde la región de Fe comprende al menos un aminoácido de origen no natural seleccionado del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E, enumerado según el índice EU como se establece en Kabat y al menos un aminoácido de origen no natural en una o más posiciones seleccionado del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, enumerado según el índice EU establecido en Kabat.

En una modalidad, las variantes de Fe de la presente invención se pueden combinar con otras variantes de Fe conocidas tales como las descritas en Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Nati. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett . 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol C em 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al . , 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); patentes estadounidenses N° . 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; publicación de patente estadounidense n° . 2004/0002587 y publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351. La presente invención también abarca regiones Fe que comprenden eliminaciones, adiciones y/o modificaciones. Aun otras modificaciones/sus ituciones/adiciones/eliminaciones del dominio de Fe serán fácilmente aparentes para un experto en la técnica.

Los métodos para generar regiones de Fe de origen no natural son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos se pueden generar por métodos de mutagénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 82:488-492 (1985) ), mutagénesis por PCR (Higuchi, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), y mutagénesis de cassette (Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)). Preferentemente, la mutagénesis dirigida al sitio se lleva a cabo por el método PCR de solapamiento-extensión (Higuchi, en "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification ' 1 , Stockton Press, Nueva York, pp. 61-70 (1989)). La técnica de PCR de extensión por solapamiento (Higuchi, ibid.) también se puede usar para introducir cualesquiera mutaciones deseadas en una secuencia diana (el ADN de partida) . Por ejemplo, la primera ronda de PCR en el método extensión por solapamiento implica la amplificación de la secuencia diana con un cebador externo (cebador 1) y un cebador de mutagénesis interno (cebador 3) y de forma separada con un segundo cebador externo (cebador 4) y un cebador interno (cebador 2) proporcionando dos segmentos de PCR (segmentos A y B) . El cebador interno de mutagénesis (cebador 3) se diseña para contener incompatibilidades con la secuencia diana que especifican la o las mutaciones deseadas. En la segunda ronda de PCR, los productos de la primera ronda de PCR (segmentos A y B) están amplificados por PCR usando los dos cebadores externos (cebadores 1 y 4) . El segmento de PCR de longitud completa resultante (segmento C) se digiere con enzimas de restricción y el fragmento de restricción resultante se clona en un vector apropiado. Como el primer paso de la mutagénesis, el ADN de partida (por ej . , que codifica una proteína de fusión de Fe, un anticuerpo o simplemente una región de Fe) se clona de forma operativa a un vector de mutagénesis. Los cebadores se diseñan para reflejar la sustitución de aminoácidos deseados. Otros métodos útiles para la generación de regiones de Fe variantes son conocidos en la técnica (véase, por ej . , patentes estadounidenses n° 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; publicación de patente n° 2004/0002587 y publicaciones PCT WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351) .

En algunas modalidades, una proteína variante de Fe comprende una o más glucoformas diseñadas, es decir, una composición de carbohidrato que está covalentemente unida a la molécula que comprende una región de Fe . Las glucoformas modificadas pueden ser útiles con varios fines, incluyendo pero sin limitarse a mejora o disminución de función efectora. Las glucoformas modificadas se pueden generar por cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo usando cepas de ingeniería o expresión variante, por coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) , por medio de la expresión de una molécula que comprende una región de Fe en diversos organismos o líneas celulares de varios organismos o por medio de la modificación de uno o más carbohidratos luego de que se ha expresado la molécula que comprende la región de Fe. Los métodos para generar glucoformas modificadas son conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente estadounidense No. 6,602,684; n° de serie estadounidense 10/277,370; n° de serie estadounidense 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1 ; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación de glucosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza). Véase, por ej . , WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

Ejemplos La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan a los efectos de ilustración solamente y la invención no debería interpretarse de ninguna forma como limitada a estos ejemplos, sino que debería interpretarse que comprende toda y cualquier variación que sea evidente como resultado de las enseñanzas proporcionadas en la presente .

Ejemplo 1 Aislamiento de anticuerpos anti-IL-6 Una descripción detallada del aislamiento del Anticuerpo 18 y otros anticuerpos anti-IL-6 que se pueden utilizar para practicar las invenciones descritas en la presente se proporciona en la Publicación PCT No. WO 2008/065378. Brevemente, se aisló un precursor del Anticuerpo 18 a través de una biblioteca de expresión en fagos analizada usando IL-6 humana recombinante como diana. El precursor se sometió a optimización de afinidad para generar diversos anticuerpos anti-IL-6 humanos de alta afinidad. La caracterización de estos anticuerpos se describe en la Publicación PCT No. WO 2008/065378. El Anticuerpo 18 puede bloquear la unión de la IL-6 al IL-6R. El Anticuerpo 18 se une a la IL-6 de humano y de cinomolgo, pero no se une a la IL-6 derivada de murino, rata o perro. El Anticuerpo 18 se une a la IL-6 humana con una afinidad mayor al nivel de detección de 10 pM del ensayo BIAcore . La afinidad del Anticuerpo 18 a la IL-6 humana se calculó en 0.40 pM (CI 95% 0.12 a 0.69 pM) usando el ensayo de proliferación de células TF-1.

Ejemplo 2 Anticuerpo anti-IL-6 con mayor semivida 2.1 Generación de un anticuerpo IgGl anti-IL-6 variante que comprende una región de Fe con las sustituciones M252Y, S254T y T256E El vector de expresión que codifica el Anticuerpo 18 se modificó usando métodos estándar de laboratorio para introducir las sustituciones M252Y, S254T y T256E en la región de Fe. El Anticuerpo 18 modificado que comprende las sustituciones 252Y, S254T y T256E se refiere en la presente como el Anticuerpo 18E o Anticuerpo 18E.

Los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-IL-6 se pueden someter a optimización de secuencia de ácido nucleico. La meta final del proceso de optimización de secuencia es crear una región de codificación que se transcriba y traduzca con la mayor eficacia posible. La optimización de secuencia se logra mediante una combinación de: (i) optimización del uso del codón, (ii) adaptación del contenido G/C, (iii) eliminación de los sitios de corte y empalme internos y sitios de poliadenilación prematura, (iv) alteración de estructuras secundarias de ARN estables, (v) eliminación de secuencias de repetición directa, (vi) eliminación de secuencias que pueden formar ARNdc estable con transcripciones de células hospedadoras , (vii) eliminar secuencias a las que se dirigen los ARN de microcélulas hospedadoras y (viii) introducción de estabilización de ARN y señales de translocación de ARN. Los métodos de optimización de secuencias detallados se describen en WO2004059556A2, WO2006015789A2 , Bradel-Tretheway et al., J. Virol. Métodos 111:145-56 (2003), Valencik & McDonald, Transgenic Res. 3:269-75 (2001). De manera alternativa, una secuencia puede ser optimizada por un proveedor comercial (por ej . , GENEART Inc.).

Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera, VH y VL, del Anticuerpo 18E se optimizaron siguiendo los métodos descritos en la presente. Las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican lá cadena pesada y la cadena ligera, VH y VL, de 18E se describen como las SEQ ID NOs : 11-14, respectivamente.

El Anticuerpo 18E se expresó en un conjunto de células CHO-K1 establemente transfectadas con un vector de expresión que comprende la región de codificación del anticuerpo 18E de longitud completa. El anticuerpo 18E se purificó a partir del sobrenadante usando técnicas estándar de laboratorio. 2.2 Caracterización in vitro de un anticuerpo IgGl anti-IL-6 variante que comprende una región de Fe con las sustituciones M252Y, S254T y T256E El Anticuerpo 18E comprende una región de Fe que tiene las sustituciones M252Y, S254T y T256E. La presencia de las sustituciones M252Y, S254T y T256E en la región de Fe del Anticuerpo 18E se confirmó usando un ensayo ELISA. El ensayo utilizó como reactivos de captura dos anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido de Fe que comprende las sustituciones M252Y, S254T y T256E, pero no al polipéptido de Fe de tipo salvaje correspondiente. Se realizaron ensayos ELISA de acuerdo con protocolos estándar.

La curva de titulación de ELISA obtenida con uno de los anticuerpos monoclonales específicos de la sustitución se muestra en la Figura 1. El Anticuerpo 18E fue capturado en un ensayo ELISA por un anticuerpo específico para las sustituciones de la región de Fe M252Y, S254T y T256E, pero no así el anticuerpo 18. Por lo tanto, el anticuerpo 18 comprende una región de Fe que tiene las sustituciones M252Y, S254T y T256E.

Los polipéptidos de Fe que comprenden las sustituciones 252Y, S254T y T256E tienen una mayor afinidad de unión a FcRn a un pH de 6, en comparación con la del polipéptido de Fe de tipo salvaje. La afinidad de unión del Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E purificados a FcRn se determinó usando un ensayo BIAcore . El ensayo se realizó siguiendo protocolos estándar. El Anticuerpo 18E une tanto FcRn de humano como de ciño a un pH de 6, con una afinidad considerablemente mayor que la del anticuerpo 18. Los valores de Kd según se determinaron en BIAcore se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Afinidad de unión del Anticuerpo 18 y 18E a FcRn Anticuerpo KD de FcRn de KD de FcRn de humano (nM) ciño (nM) 18 2610 1160 18E 226 365 El Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E se unen a la IL-6 con una afinidad considerablemente igual. La afinidad de unión del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E a la IL-6 se determinó mediante ensayos ELISA. Se usó una preparación de IL-6 humana recombinante expresada en E. coli (rhuIL-6) como reactivo de captura. Se realizaron ensayos ELISA de acuerdo con protocolos estándar. Además del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E, también se incluyeron en el ensayo dos anticuerpos anti-IL-6 competidores (AB A y AB B) como controles positivos. Un ejemplo de los datos obtenidos se muestra en la Figura 2. El valor de EC50 del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fue de 6.1 pM y 6.5 pM, respectivamente.

El Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E inhiben la proliferación de células TF-1 inducida por la IL-6 con una eficacia sustancialmente idéntica. El ensayo de proliferación de células TF-1 inducida por la IL-6 se realizó sustancialmente como se describe en la presente. Además del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E, también se incluyeron en el ensayo dos anticuerpos anti-IL-6 competidores (AB A y AB B) como controles positivos. Los datos representativos se muestran en la Figura 3. Las IC50 calculadas para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fueron de 4.5 pM y 5.2 pM, respectivamente .

El Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E inhiben la liberación de VEGF inducida por la IL-6 endógena a partir de fibroblastos sinoviales humanos con una eficacia sustancialmente idéntica. El ensayo se realizó sustancialmente como se describe en la presente. Además del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E, también se incluyeron en el ensayo dos anticuerpos anti-IL-6 competidores (AB A y AB B) como controles positivos. Los datos representativos se muestran en la Figura 4. Las IC50 calculadas para el Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E fueron de 1.3 pM y 1.2 pM, respectivamente. 2.3 Caracterización in vivo de un anticuerpo IgGl anti-IL-6 variante que comprende una región de Fe con las sustituciones M252Y, S254T y T256E Se realizó un estudio farmacodinámico farmacocinético de dosis única en monos cinomolgos para determinar la semivida en suero y la depuración del Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E. El diseño del estudio se resume en la Tabla 2. Tabla 2 Diseño del estudio para el experimento farmacocinético de dosis única Grupo Tratamiento Dosis Vía de la Cantidad (mg/kg) dosis 1 18 5 IV 3 machos 2 18 5 SC 3 machos 3 18E 5 IV 3 machos 4 18E 5 SC 3 machos 5 18E 50 SC 3 machos Ensayo PK de captura del antígeno de la IL-6 (ECL) para la cuantificación del Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E en plasma de mono cinomolgo: Se recubrieron placas de 96 pocilios MA2400 (MSD) con 2.5 g/ml de IL-6 humana recombinante (R&D Systems) durante la noche a 2-8 °C, se lavaron con PBS con 0.05% de Tween 20 y se bloquearon durante 1-2 horas a temperatura ambiente con Amortiguador de Bloqueo I (Tropix) . Se prepararon diluciones de muestras de prueba, control de calidad (QC) y curvas estándar de Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E en 1% de plasma de mono cinomolgo y se agregaron a placas de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron como se indicó anteriormente y se incubaron durante 1 hora adicional con 1 microg/ml de anticuerpo de detección adsorbido de mono IgG anti-humano de oveja etiquetado con (rutenio) MSD-TAG (H+L) (el sitio de unión) . El anticuerpo de detección no unido se eliminó mediante lavado y se agregaron 150 microl de Amortiguador de Lectura T IX (MSD) a los pocilios de la placa. Las placas se leyeron inmediatamente con un Sector Imager 2400 de MSD y se cuantificaron las concentraciones de Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E en diluciones de muestra de prueba y QC en cada placa usando la curva estándar para esa placa. Todos ios análisis se realizaron graficando las concentraciones de la curva estándar contra la señal de ECL en un ajuste de curva log-log en un software de Softmax Pro GxP (Molecular Devices) . El intervalo del ensayo para la cuantificación del Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E es de 10,000 a 13.7 ng/ml (10 a 0.0137 microg/ml) en 100% de plasma.

Análisis de datos PK: Se realizó un análisis toxicocinético no compartimental en datos PK individuales de todos los animales usando Win onlin Professional (versión 5.2, Pharsight Corp., Mountain View, CA) , de acuerdo con el procedimiento de funcionamiento estándar de Medlmmune .

Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 muestra la concentración de Anticuerpo 18 y Anticuerpo 18E en suero en el tiempo luego de la administración subcutánea o intravenosa de una sola dosis de 5 mg/ml de anticuerpo. Tanto el Anticuerpo 18 como el Anticuerpo 18E presentaron un perfil PK lineal . La semivida en suero del Anticuerpo 18 es de aproximadamente 8.5 días y 9.1 días luego de la administración intravenosa y subcutánea, respectivamente. La semivida en suero del Anticuerpo 18E es de aproximadamente 28.4 días y 28.8 días luego de la administración intravenosa y subcutánea, respectivamente. La depuración del Anticuerpo 18 es de aproximadamente 12.1 ml/día/kg y 13.1 ml/día/kg luego de la administración intravenosa o subcutánea, respectivamente. La depuración del Anticuerpo 18E es de aproximadamente 2.8 ml/día/kg y 3.0 ml/día/kg luego de la administración intravenosa o subcutánea, respectivamente. La biodisponibilidad del Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E administrados subcutáneamente fue de 94% y 96%, respectivamente.

La Figura 6 muestra la concentración sérica del Anticuerpo 18 y el Anticuerpo 18E en el tiempo luego de la administración subcutánea de una sola dosis de 5 mg/kg de anticuerpo. La Figura 6 muestra adicionalmente la concentración de IL-6 en suero total detectada en los animales luego de la administración subcutánea de una sola dosis de 5 mg/kg del Anticuerpo 18 o el Anticuerpo 18E. Los niveles totales de IL-6 aumentaron aproximadamente tres logaritmos por encima de la línea de base. Se observó una mayor acumulación de IL-6 total con el Anticuerpo 18E. La disminución en los niveles de IL-6 total fueron aproximadamente paralelos a la disminución en la PK. 2.3 Modelo de neutralización porcentual de IL-6 libre en plasma mediante la administración subcutánea de anticuerpo anti-IL-6 Las concentraciones de IL-6 libre son muy bajas en la línea de base en animales sanos. Habría sido difícil, por lo tanto, evaluar directamente la neutralización porcentual diana luego de la administración de anticuerpo anti-IL-6 midiendo los niveles de IL-6 libre. Desarrollamos un modelo PK/PD en el paquete de software SAAM II, para predecir la cinética de la neutralización de IL-6 libre en relación con la PK del anticuerpo usando la IL-6 total como marcador de PD. El modelo de PK/PD describe la cinética del anticuerpo, la IL-6 libre, el complejo de IL-6 y anticuerpo, el receptor soluble y el complejo de IL-6 y el receptor soluble. El modelo desarrollado describió de manera adecuada la PK del anticuerpo y la cinética de la IL-6 total generada a partir del estudio de monos y se utilizó para simular los perfiles de tiempo de PK/PD en pacientes humanos con RA luego de diferentes regímenes de dosificación usando el supuesto de la escala alométrica estándar. Se fijó un nivel de inhibición del 90% del nivel de IL-6 libre en plasma con base en las concentraciones de IL-6 libre en suero detectadas en pacientes con artritis reumatoide (Uson et. al., J. of Rheumatology (1997) 24(11)2069-75). ' Los resultados de la realización del modelo de PD se muestran en las Figuras 7-10 y en la Tabla 3. El modelo predice que una inhibición sostenida de al menos el 90% de la IL-6 libre (es decir, no unida al SIL-6R o al IL-6R) se puede lograr administrando Anticuerpo 18E de acuerdo con cualquiera de los siguientes regímenes de dosificación: · 100 mg de Anticuerpo 18E suministrados se cada 8 semanas , • 50 mg de Anticuerpo 18E suministrados se cada 4 semanas, • una única dosis de carga de 200 mg de Anticuerpo 18E suministrados se, seguida por 100 mg de Anticuerpo 18E suministrados se cada 8 semanas y • una única dosis de carga de 100 mg de Anticuerpo 18E suministrados se, seguida por 50 mg de Anticuerpo 18E suministrados se cada 4 semanas .

El modelo predice adicionalmente que un nivel similar de inhibición continua de la IL-6 libre en suero requeriría dosis más frecuentes y/o mayores de Anticuerpo 18. Por ejemplo, una inhibición continua de al menos el 90% de la IL-6 libre (es decir, no unida al SIL-6R o al IL-6R) se puede lograr administrando subcutáneamente 100 mg de Anticuerpo 18 cada 2 semanas .

Tabla 3 Resumen de los resultados del modelo de neutralización de IL-6 libre en plasma Intervalo de Dosis de Anticuerpo Dosis de Anticuerpo dosificación 18 18E 2 semanas -100 mg SC -inhibición de IL-6 = 90% 4 semanas -100 mg SC -dosis de carga de -inhibición de IL-6 50 mg SC o 2x + = 90% dosis de mantenimiento de 50 mg SC -inhibición de IL-6 = 90% Intervalo de Dosis de Anticuerpo Dosis de Anticuerpo dosificación 18 18E 8 semanas -500 mg SC -dosis de carga de -inhibición de IL-6 100 mg SC o 2x + < 90% dosis de mantenimiento de 100 mg SC -inhibición de IL-6 = 90% 12 semanas -100 mg SC -inhibición de IL-6 = 90% Estos resultados demuestran la capacidad de un anticuerpo anti-IL-6 de inhibir los efectos sistémicos de la IL-6 in vivo. Mientras que se han descrito modalidades particulares de la invención a los efectos de realizar la descripción, los expertos en la técnica entenderán que se pueden realizar diversas variaciones de los detalles sin desviarse de la invención como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 3. Eficacia en el modelo de dolor inflamatorio inducido por FCA en ratón Se analizó mAb406 (IL-6 anti-ratón, purificada a partir de IgGl monoclonal, clon MP5-20F3, lote AHV100904A, R&D Systems) para determinar su capacidad de eliminar el dolor inflamatorio inducido por una administración subcutánea local de adyuvante completo de Freund ("FCA") (20 microlitros) en la cola del ratón (3 cm desde la punta distal de la cola) . Esta sustancia produce una respuesta inflamatoria local que aumenta con el tiempo y que alcanza un nivel estable entre las 24 h y 48 h luego de la administración. La inflamación resultante produce una hipersensibilidad a la estimulación térmica o mecánica de la cola. La hiperalgesia térmica se evalúa registrando la latencia de retiro de la cola de un estímulo térmico (agua tibia, 46°C) , mientras que la hiperalgesia mecánica se evalúa a través del umbral de retiro de la cola de una presión en aumento constante generada por un analgesímetro (aparato Randall Selitto) . El control del isotipo de IgGl (mAb005, purificado a partir de IgGl monoclonal de rata, clon 43414, lote CA 04904A, adquirido de R&D Systems) y mAb406 se administraron intraperitonealmente (ip) 6 h después del tratamiento con FCA. Las pruebas que sugieren que ya se ha iniciado plenamente la respuesta inflamatoria incluyen niveles elevados de citocina, producción de óxido nítrico e hipersensibilidad a estímulos levemente nocivos. El estudio inicial evaluó una única dosis (20 mg/kg) de mAb406. Esta dosis produjo una E-max del 50 % en el ensayo de hiperalgesia por calor tanto a las 24 como a las 48 h (ver la Figura 11) y una eliminación del 40% de la hiperalgesia mecánica a las 24 y las 48 h (ver la Figura 12) .

El establecimiento de perfiles in vitro de los niveles sistémicos de IL-6 en plasma en estos animales indicó que todas las IL-6 se habían neutralizado. Posteriormente, se evaluaron diversas dosis de mAb406 (y una dosis alta de control de IgGl) para caracterizar la eficacia y la neutralización de la IL-6 con respecto a la inhibición del dolor y la eliminación de la hiperalgesia . Usando el mismo paradigma experimental, se analizaron dosis en el intervalo de 1 a 20 mg/kg, ip, para determinar la hiperalgesia mecánica y por calor tanto a las 24 h como a las 48 h. La Figura 13 muestra que el tratamiento anti-IL-6 eliminó la hiperalgesia por calor de manera dependiente de la dosis a las 24 h; se obtuvieron resultados similares a las 48 h (ver la Figura 14) . La E-máx. en este segundo estudio presentó una eliminación del 64%, que es ligeramente mayor pero similar a la eliminación obtenida anteriormente. La Figura 15 y la Figura 16 muestran los resultados de la hiperalgesia mecánica a las 24h y las 48h, respectivamente. Nuevamente, se observó una eliminación dependiente de la dosis que alcanzó una E-máx. del 91 % a las 48 h, que es mayor a la eliminación obtenida en el primer estudio. No se observaron efectos secundarios en ninguna de las dosis de prueba y en ninguno de los estudios. En general, las eficacias in vivo de mAb406 fueron comparables o mayores al compuesto de molécula pequeña de referencia naproxeno en el mismo modelo (ver la Figura 17 para encontrar un análisis del naproxeno en la hipersensibilidad al calor y la Figura 18 para encontrar un análisis del naproxeno en la hipersensibilidad a la presión mecánica) .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionados en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente a modo de referencia en la memoria descriptiva en la misma medida que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se hubiera indicado individualmente como incorporada a la presente a modo de referencia .

Materiales y métodos Inhibición de la proliferación de células TF-1 inducida por la IL-6 mediante scFv e IgG purificadas Las células TF-1 fueron un regalo de R&D Systems y se mantuvieron de acuerdo con los protocolos proporcionados. Los medios del ensayo comprendieron RPMI-1640 con GLUTAMAX I (Invitrogen) que contenía 5% de suero bovino fetal (JRH) y 1% de piruvato de sodio (Sigma) . Antes de cada ensayo, las células TF-1 se sedimentaron mediante centrifugación a 300xg durante 5 mins, los medios se eliminaron mediante aspiración y las células se volvieron a suspender en medios de ensayo. Este proceso se repitió dos veces con células resuspendidas a una concentración final de 5xl05 células/ml en medios de ensayo. Las células se colocaron en placas usando 100 µ?/pocillo en una placa de ensayo de 96 pocilios. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C y 5% de C02 para privar las células de GM-CSF. Las soluciones de prueba de scFv o IgG purificados (en duplicado) se diluyeron hasta la concentración deseada en medios de ensayo. Se usó un anticuerpo irrelevante no dirigido a la IL-6 como control negativo. Se agregó IL-6 de humano (R&D) y de cinomolgo (de fabricación propia) recombinantes , derivados por bacterias, hasta una concentración final de 20 pM (IL-6 humana) o 100 pM (de cinomolgo) al mezclarse con anticuerpo de prueba apropiado en un volumen total de 100 µ?/pocillo. La concentración de IL-6 utilizada en el ensayo se seleccionó como la dosis que, en una concentración de ensayo final, proporcionó aproximadamente un 80% de respuesta proliferativa máxima. Todas las muestras se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se agregaron 100 µ? de IL-6 y mezcla de anticuerpo a 100 µ? de las células para proporcionar un volumen de ensayo total de 200 µ?/pocillo. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C y 5% de C02. Luego se agregaron 20 µ? de timidina tritiada (5 µ??/p??) a cada punto del ensayo y las placas se volvieron a colocar en el incubador durante 24 horas adicionales. Las células se cultivaron en placas de filtro de fibra de vidrio (Perkin Elmer) , usando un cultivador de células. La incorporación de timidina se determinó usando un contador de centelleo líquido en microplacas TopCount de Packard. Los datos luego se analizaron usando el software Graphpad Prism.

Inhibición de la liberación de VEGF inducida por la IL-6 endógena a partir de fibroblastos sinoviales humanos mediante IgG purificada Se obtuvieron muestras de rodillas con artritis reumatoide a partir de la cirugía de remplazo de articulaciones en antibióticos que contienen DMEM. El sinovio bañado en medios se disecó a partir de la articulación y se cortó finamente. El tejido sinovial se lavó con medios complementados con 10% de FCS . La suspensión celular se incubó en una solución de colagenasa durante 2 horas en un incubador de C02 a 37 °C. La suspensión de células sinoviales digeridas se alteró mediante aspiración repetida a través de una pipeta de 10 mi, las células se filtraron y centrifugaron a 400 g a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células se volvieron a suspender en DMEM con 10% de FCS, se pasaron a través de un tamiz celular, se ajustaron hasta 1 x 106 células por mi y se incubaron en un incubador con C02 a 37 °C en frascos de cultivo celular de 225-cm2 (3001, Costar Corning Inc.). Luego de la adhesión, la mayoría del medio se descartó, se remplazó con medio fresco y se volvió a colocar en el incubador para incubación a largo plazo. Las células se examinaron semanalmente y se pasaron en confluencia mediante tripsinización a una velocidad de paso de 1 en 3.

Los fibroblastos (P3-5) en confluencia se eliminaron de los frascos mediante incubación con 10 mL de solución de EDTA- tripsina al 0.1% (25300-054, Gibco Life Sciences) por frasco durante 5 a 10 minutos a 37°C. Se agregó a las células un volumen igual de medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS, las que luego se sedimentaron mediante centrifugación a 330 g durante 5 minutos a RT. Luego de una etapa de lavado con medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS, se agregó la suspensión celular (1 xlO5 células por mL) (150 pL por pocilio) a pocilios de placas estériles de poliestireno de fondo plano del grupo de cultivo celular de 96 pocilios (3598, Corning Costar) a 1.5xl04 células por pocilio. Se agregaron más medios de cultivo basados en DMEM complementados con 10% de FCS a cada pocilio ( 100 por pocilio) para proporcionar un volumen total de 250 \?1· por pocilio. Las células se incubaron a 37 °C durante la noche para permitir la adhesión y la latencia.

Las placas de 96 pocilios se inspeccionaron para asegurarse de que las células fueran confluentes y estuvieran en buenas condiciones (por ej . , libres de contaminación) . Luego se aspiró el medio de los pocilios y se agregaron inmediatamente 100 µL de medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS. Para esto, se agregaron a los pocilios 50 µ?? de medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS que contenía IgG de muestra o medio solo (diluidos 1 en 5 en el ensayo) .

Esto fue seguido por la adición de 50 µ]-? por pocilio de medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS que contenía (rhs) IL-6Ra (500 ng por mL; 12 nM) y rhILip humanos recombinantes solubles (50 pg por mL; 2.95 pM, diluidos 1 en 5 en el ensayo) .

En pocilios separados, se agregaron 50 µ].· de medio de cultivo basado en DMEM complementado con 10% de FCS que contenía rh-IL-6 (0, 100 ng por mL; 21.5 nM) , SIL-6ROÍ (500 ng por mL; 12 nM) , rhIL-?ß (50 pg por mL; 2.95 pM) o medio solo (diluidos 1 en 5 en el ensayo) . El volumen final en cada pocilio fue de 250 µL.

Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Las incubaciones se realizaron en pocilios en duplicado o triplicado según la descripción en el formato de la placa. Las placas se centrifugaron a 330 g durante 5 minutos a RT y los medios sobrenadantes se removieron y se almacenaron a -40°C en placas de fondo plano de microtitulación (611F96, Sterilin) . > Se midió el VEGF usando un ELISA (DY293B, R&D Systems) , siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Brevemente, las placas del ELISA se recubrieron con un anticuerpo del VEGF anti-humano de ratón durante la noche a 4°C y se bloquearon con 1% de BSA/PBS. Las placas se lavaron con 0.05% de Tween 20/PBS y se incubaron con sobrenadantes del cultivo de fibroblastos derivados sinoviales humanos y un anticuerpo del VEGF anti-humano de cabra biotinilado durante la noche a temperatura ambiente. Luego del lavado, se detectó el VEGF usando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Las placas se desarrollaron usando 1:1 de H202 : tetrametilbenzidina. La reacción se detuvo con H2S04 2 M y las densidades ópticas se determinaron a 450 nm con la longitud de onda de corrección establecida a 540 nm.

Medición de los niveles de IL-6 en plasma total La IL-6 total se midió usando el kit Milliplex™ MAP ( PXHCYTO60K) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todos los reactivos necesarios se proporcionan en el kit del ensayo. Brevemente, se hidrata una placa de filtro del ensayo con 200 pL de amortiguador de ensayo y el líquido se elimina mediante vacío. Cada uno de los siguientes reactivos se agrega a la placa a 25 L/pocillo: (a) amortiguador del ensayo (b) muestras de plasma, estándar o QC y (c) perlas conjugadas con un anticuerpo de captura anti-IL-6 en matriz de ensayo. El volumen final del ensayo es de 75 µ? y la matriz del ensayo final es 133.3 g/ml de candidato de fármaco (Anticuerpo 18 o Anticuerpo 18E) en 25% de plasma con EDTA de ciño normal sin IL-6. La placa se sella e incuba durante la noche a 4°C. Luego de 2 lavados con amortiguador de lavado, se agregaron 25 µ?/pocillo de anticuerpo de detección anti-IL6 biotinilado. Luego de 30 minutos de incubación, se agregaron 25 pL/pocillo de SA-PE a las placas y la placa se incuba durante 30 minutos adicionales. La placa se lava dos veces y las perlas se vuelven a suspender con 150 µ?/pocillo de fluido Luminex Sheath. La intensidad de fluorescencia asociada con las perlas se midió con un lector de placa Luminex200. Dado que el anticuerpo anti-IL-6 de captura y el de detección pueden unirse a la IL-6 en presencia del Anticuerpo 18 o el Anticuerpo 18E, la intensidad fluorescente es proporcional a la concentración de IL-6 total en la muestra. La concentración de IL-6 se extrapola desde una curva estándar graficada con el software BeadView (Upstate Cell Signaling Solutions) . El intervalo de detección de la IL-6 es de 1.8 pg/ml a 5769 pg/ml en 100% de plasma de ciño.

Todas las referencias citadas en cualquier punto en esta memoria descriptiva, incluyendo las citadas en cualquier punto precedente, se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REI INDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-6, caracterizado porque comprende un dominio variable y dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con relación a un dominio constante de IgG humana de tipo salvaje, donde el anticuerpo tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de un anticuerpo que comprende el dominio variable y el dominio constante de IgG humana de tipo salvaje.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: M252Y, M252F, M252W, M252T, S254T, T256S, T256R, T256Q, T256E, T256D, T255T, L309P, Q311S, H433R, H433K, H433S, H433I, H433P, H433Q, N434H, N434F, N434Y y N436H o combinaciones de los mismos, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU como en Kabat .

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque al menos una sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: M252Y, S254T, T256E, H433K, N434F y N436H o combinaciones de los mismos, donde los residuos de aminoácido están enumerados conforme al índice EU como en Kabat .

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio constante de IgG modificada comprende las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T y T256E, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat .

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque IgG es IgGl.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable comprende: (a) una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 2 ; (c) una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 3 ,- (d) una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 4 ; (e) una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 5 y (f) una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 6.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 7 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 7 y comprende un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 8 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 8.

8. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica la secuencia de aminoácidos del dominio VH y/o el dominio VL de conformidad con la reivindicación 7.

9. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8.

10. Una célula aislada caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 9.

11. Una línea de células aisladas caracterizada porque expresan el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7.

12. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 en un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un método para tratar y/o prevenir el dolor en un humano caracterizado porque comprende administrar a un humano que lo necesita, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IL-6, donde el anticuerpo anti-IL-6 comprende un dominio variable que comprende: (a) una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 1; (b) una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 2; (c) una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 3 ; (d) una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 4; (e) una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 5; y (f) una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 6.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dominio variable comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 7 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 7 y comprende un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de residuos de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 8.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos con relación a un dominio constante de IgG humana de tipo salvaje, donde el anticuerpo tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de un anticuerpo que comprende el dominio variable y el dominio constante de IgG humana de tipo salvaje.

16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el dominio constante de IgG modificada comprende las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T y T256E, donde los residuos de aminoácidos están enumerados conforme al índice EU tal como en Kabat .

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dolor se asocia con o es el resultado de un trastorno inflamatorio y/o autoinmune.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el trastorno inflamatorio y/o autoinmune se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, caquexia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , artritis idiopática juvenil, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y ateroesclerosis .

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el trastorno inflamatorio y/o autoinmune es lupus eritematoso sistémico, osteoartritis o artritis reumatoide .

20. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dolor se asocia con o resulta de una afección relacionada con niveles elevados de IL-6.

21. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dolor se asocia con o resulta de espondilitis anquilosante, dolor lumbar inflamatorio, neuropatía, gota, neuroma, fibromialgia, dolores de cabeza agudos y/o crónicos, migrañas, pancreatitis, compresión del nervio espinal, dolor esquelético no maligno o cáncer.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque se neutraliza al menos 90% de la IL-6 libre en el suero.

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque al menos 90% de la señalización mediada de IL-6 en un tejido afectado se inhibe en un tejido diana.