CN102307901B - 抗il-1r1结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性用于白细胞介素1受体1(IL-1R1)的结合成员、特别是抗体分子。例如，与IL-1或IL-1Ra竞争以结合IL-1R1的特异性用于分离的结合成员，且结合IL-1R1具有通过KinexaTM测量的10pM或更少的KD。结合成员尤其被用于治疗由IL-1R1介导的紊乱，包括类风湿关节炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

Description

抗IL-1R1结合成员
技术领域
本发明涉及用于白细胞介素1受体-1(IL-1R1)的结合成员，特别是抗体分子。所述结合成员被用于治疗由IL1-R1介导的紊乱，包括类风湿关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)。本发明还涉及用于制备这样结合成员的方法、使用本发明结合成员治疗由IL-1R1介导的紊乱的方法和本发明结合成员在制备治疗由IL-1R1介导的紊乱的药剂中的应用。
背景技术
白细胞介素1(IL-1)为多功能细胞因子，其在免疫介导疾病和感染过程中的炎性反应中起主要作用。IL-1产生于受到细菌产物、细胞因子或免疫复合物刺激后的各种细胞类型。IL-1对各种细胞类型显示了自分泌和旁分泌活性，促进生成炎性介质如前列腺素、一氧化氮、细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和黏着分子。阻滞IL-1生物活性有益于预防由过量产物或IL-1活性失调导致的组织损伤或正常化诸如COPD恶化期间对病原体的异常应答。
细胞因子的IL-1家族当前由11位个体成员组成，白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素1-拮抗剂(IL-1Ra)、IL1F5-10和白细胞介素-33(IL-33)。这些中的四个，即IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)已被充分鉴定与各种疾病的病理过程相关联，并且已清楚地显示分离的IL-1α、IL-1β和IL-1Ra与膜IL-1R1(1，2，3)相互作用。IL-1α和IL-1β是各自基因的产物。这些蛋白质在氨基酸水平具有亲属关系，IL-1α和IL-1β具有22％的同源性、IL-1α和IL-1Ra具有18％的同源性。IL-1β与IL-1Ra具有26％的同源性。IL-1α、IL-1β和IL-1Ra成员的基因位于人类染色体2q14(4，5)中的类似区域。
IL-1α和IL-1β被合成为31kDa的前体肽，所述前体肽被裂解以生成17kDa的成熟IL-1α和IL-1β。IL-1β由包括上皮细胞和巨噬细胞在内的多种细胞类型生成。它通过半胱氨酸蛋白酶caspase-1(IL-1β转化酶(ICE)(6))裂解之后从细胞释放出来。IL-1α通过钙蛋白酶被裂解并能保留在浆膜上从中显示出激活细胞，通过指导细胞到细胞接触(7)。Pro-IL-1α在其氨基末端含有核定位序列，其能够导致多种细胞通道(8)的激活。
IL-1Ra为天然存在的IL-1系统的抑制剂。它通过替代mRNA剪接和替代翻译起始进行衍生而被生成四种不同的亚型。IL-1Ra的17kDa分泌亚型被表达为22-25kDa(9，10)的可变异的糖基化类型，现在被称为sIL-1Ra。18kDa细胞内亚型被称为icIL-1Ra1(11)。亚型icIL-1Ra2通过来自位于icIL-1Ra1和sIL-1Ra第一外显子(12)之间的外显子的替代转录剪接而形成。第三个16kDa细胞内亚型icIL-1Ra3也已经鉴定(13)。(阿那白滞素)是重组的、非糖基化形式的可溶性人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。不同于天然人IL-1Ra在于其在它的氨基末端具有单蛋氨酸残基的添加物。由153个氨基酸组成、具有17.3kDa的分子重量。已被批准用于缓解严重活动性类风湿关节炎的治疗。
IL-1α和IL-1β通过结合跨膜受体而发挥其生物作用，IL-1R1(参考序列NM_00877)属于IL-1受体家族。IL-1受体家族(14)当前有的10个成员；IL-1受体1(IL-1R1(80kDa)、IL-1RII(68kDa)和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RacP)与IL-1α和IL-1β的信令有关；细胞膜中的IL-1R1和ILRacP复合物，以形成能够信令IL-1α或IL-1β结合的高亲和性受体。IL-1Ra结合IL-1R1，但不与IL-1RacP相互作用。IL-1α、IL-1β和IL-1Ra还结合没有细胞内信令结构域的IL-1RII。
所有三种的这些受体能够被表达为膜结合或可溶性蛋白。IL-1R类型I(IL-1R1)、IL-1RII和IL-1R辅助蛋白(IL-1RAcP)属于免疫球蛋白(Ig)基因超家族，它们的细胞外区域含有3个Ig-样结构域。IL-1R1和IL-1RAcP具有胞浆结构域(Toll样IL-1R(TIR))结构域，其与Toll样受体(TLR)超家族相关。IL-1R1被称为信令受体，一旦配体结合并复合IL-1RAcP，信号传导通过其213氨基酸残基(15)的胞浆尾被启动。当前的文献建议IL-1RII或在细胞表面仅作为“诱捕受体”或细胞外作为可溶形式(16)。
结合的IL-1β的IL-1R1的细胞外区的晶体结构已被解析至2.5A分辨率(17)。由于二硫连接子，两个N-末端Ig结构域显出刚性，且第三个结构域显示更多柔性。Il-1R1显示被IL-1β包裹环绕带有两个显著接触区。这些中的一个位于结构域1和2之间的槽中，而第二接触区是位于第三结构域上的更小的区域。有趣地是，IL-1Ra还显示出结合到IL-1R1的结构域1和2之间的槽区域，然而在IL-1R1(18)的IL-1Ra和第三Ig结构域之间没有显示任何接触。
一旦IL-1已结合到IL-1R1链，IL-1RAcP被招募到配体受体对并形成高度亲和性的受体复合物，其导致信号转导的启动。
基于诱变和抗体研究(19、20和21)，提出了IL-1RAcP与IL-1和IL-1R1相互作用的模型。这表明IL-1RAcP与IL-1和IL-1R1之间的界面相互作用。这些研究也显示AcP不能与IL-1Ra-IL-1R1对相互作用，其形成了更松散的结构。Greenfeder等人(22)已显示IL-1R1结合IL-1Ra不能招募IL-1RAcP，因此不能传递信号。ILRa通过占据用于IL-1α或IL-1β的IL-1R1上的结合位点而起作用，且另外不能形成带有IL-1RAcP的信号复合物。
IL-1R家族的其他成员为II型IL-1R(IL-1RII)。这种受体在细胞外区域的IL-1R1具有高度同源性，并能结合IL-1α或IL-1β。当前证据提示由于缺乏胞浆内结构域，而IL-1RII不能启动信令。这种受体能够从细胞表面被裂解，并与膜形成为通过作为诱捕受体(16)起作用的IL-1活性的抑制剂。IL-1RII对IL-1β具有更高的亲和性、而对IL-Ra具有更低的亲和性，这意为着IL-1RII不能阻滞IL-1Ra(23)的抑制活性。配体结合IL-1RII导致招募IL-1RAcP，然而这种复合物保持非信号传导(24)。因为，IL-1RAcP以通过IL-1RII方式被除去，并阻止IL-1RAcP结合到IL-1RI，其还能通过这种机理阻止IL-1作用，且这被称为“共受体竞争”(24)。然而，这时没有明确地否定IL-1RII能够招募另一个信令链，尽管已经显示表达高水平IL-1RII的细胞对IL-1β(25)变得无应答。
当IL-1结合IL-1R1导致招募IL-1RAcP并启动受体信令时，形成的高亲和性复合物。IL-1R1和IL-1RAcP具有胞浆结构域(Toll样IL-1R(TIR)结构域，其与Toll-样受体(TLR)超家族有关。
在信号转导期间，接头分子MyD88的TIR结构域与IL-1RAcP的TIR结构域相互作用，并导致招募含有IRAK-4和IRAK-1的受体复合物。已经提出磷酸化IRAK依次招募TRAF6到受体复合物。IRAK然后携带TRAF6到TAK1、TAB1和TAB2，其在刺激形成膜相关复合物II之前被预结合在膜上。复合物II的形成导致膜上的TAK1和TAK2通过未知的酶的磷酸化，接着TRAF6-TAK1-TAB1-TAB2(复合物III)从IRAK解离，接下来复合物III易位到胞液。复合物III的形成并与其他胞液因子相互作用导致TAK1的激活。磷酸化IRAK保留在膜上并随机地被泛素化和降解。TAK-1的激活导致IKK的激活，IkB蛋白的降解导致NF-kB激活，即激活核中的转录。还显示TAK在有丝分裂激活蛋白酶通道(MAPK)中具有作用，通过激活p38、JNK和ERK1/2，调节包括AP1(26)的转录因子的活性。由于信号转导沿着这些多通道被放大，通过配体的每细胞的受体占有百分比仅需要低至启动IL-1R表达细胞中的生物应答(或许低至每细胞10受体被占有)。
IL-1为主要的炎性细胞因子，其在许多慢性炎性疾病中具有重要作用。在多种疾病中已检测出IL-1在基因和蛋白水平的表达。已经报道，2型糖尿病(27、28、29)、HIV-1实体瘤、白血病、阿尔茨海默疾病、缺血性疾病(30)、动脉粥样硬化(31)、哮喘、COPD和OA(32)中的IL-1水平升高。通过各种体外和体内研究，已表明IL-1具有多重生物作用，其多向性作用与其对各种炎性介质的基因表达的主要功能有关，所述介质包括前列腺素、一样化氮、细胞因子、化学因子、蛋白质及黏着分子和细胞因子受体表达(32)。这些炎性介质的过量生成或表达与疾病病理和组织改变和破坏相关。因此、对于许多普通的炎性紊乱，如类风湿关节炎、骨关节炎(OA)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、2型糖尿病、缺血性疾病和动脉粥样硬化，IL-1代表关键的治疗靶向。
发明内容
本发明提供了结合IL-1R1的结合成员，并抑制IL-1α和/或IL-1β的生物活性，包括全人抗体、或其抗原结合部分。
以下国际专利申请已经公开了被导向到IL-1R1的结合成员：WO2004/022718、WO 2005/023872、WO 2007/063311、WO2007/063308和WO 2006/059108。
在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合成员，例如，抗体，特异性用于IL-1R1，其和IL-1Ra竞争以结合到IL-1R1。
在另一实施方式中，本发明提供了特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其与IL-1和IL-1Ra竞争以结合到IL1R1，且当用KinexaTM进行检测时，结合Il-1R1带有10pM或更少的KD。在一实施方式中，IL-1与IL-1α相关，在另一实施方式中，Il-1与IL-1β相关。在另一实施方式中，Il-1与IL-1α和IL-1β的相关。
阻滞IL-1和IL1Ra结合的抗体被认为是特别有效的。在缺少IL-1时，IL-1R1内化的t1/2为大约11小时，然而在存在IL-1时，受体经历更加快速的内化，以致t1/2为大约1.5小时[33，34]。相对比，IL-1Ra结合IL-1R1但不导致受体的内化作用升高[35]。当IL-1R1被内化时，其不会轻易地被回收返到膜表面[33]，所以可能的是：类似于IL-1分离地可以被轻易地内化地结合到表位的抗体可以被传送至胞内通道(endosomal pathway)作为结果，并可以通过受体介导清理机制经受更高速率的清除。更类似于IL-1RA的表位的抗体对受体内化的速率的升高不太敏感，且通过受体介导机制不会经受升高的清除，并因此可能更像具有循环清除和人IgG的典型半衰期。国际专利申请WO 2004/022718公开了一类阻滞IL-1和IL-1Ra结合IL-1R1的抗体，然而，这类抗体的效力远小于所公开的结合到Il-1R的第三结构域并阻止IL-1β结合的优选类型的抗体。相比下，本发明抗体能够阻滞Il-1和Il-Ra结合到Il-1R1，且结合Il-1R1具有高亲和性。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其具有的平均IC50，从至少6个不同的供体平均，少于1nM，以用于在30pM IL-1β存在下、在全人血中抑制IL-1β诱导IL-6的生成。在进一步实施方式中，平均IC50从至少10、15或20个不同的供体平均。在进一步实施方式中，平均IC50少于800pM、少于700pM、少于600pM、少于500pM、少于400pM、少于300pM、少于300pM、少于200pM、少于100pM、或少于50pM。
本发明的结合成员结合到IL-1R1并高效价地中和IL-1R1。中和意为抑制IL-1R1的生物活性。本发明结合成员可以中和IL-1R1的一种或多种生物活性，本发明典型的结合成员抑制IL-1α和IL-1β结合到IL-1R1。
本发明的结合成员也可以结合并中和非人IL-1R1，意为着IL-1R1同源体在除人之外的物种中天然存在。
本发明的结合成员通常为特异性地用于IL-1R1而不是其他蛋白，并因此选择性地结合IL-1R1。这种选择性在例如标准竞争分析中可以被测出或显示出。
用于测定通过本发明结合成员的IL-1R1的中和的适宜的分析包括例如配体受体生化分析法和表面等离子共振法(SPR)(如，BIACORETM)。
用于人类IL-1R1的IL-1R1-结合成员的结合动力学和亲和性(表述为平衡解离常熟KD)可以例如使用表面等离子共振(BIACORETM)进行测定。本发明结合成员通常具有用于人IL-1R1(KD)的亲和性小于约1nM，在一些实施方式中，具有的KD小于约100pM，在其他实施方式中，具有的KD小于50pM，在其他实施方式中，具有的KD小于25pM，在其他实施方式中，具有的KD小于10pM，在其他实施方式中，具有的KD小于5pM，在其他实施方式中，具有的KD小于3pM，在其他实施方式中，具有的KD小于1pM。
许多的方法可以用于测量抗体到其抗原的结合亲和性，一种这样的方法为KinExATM。动力学排除分析法(KinExATM)为常规目的免疫分析平台(本质上是流体分光光度计)其能够测量平衡解离常数，和抗原/抗体相互作用的结合和解离率常数。获得平衡之后，实施KinExATM，它是用于测量高亲和性相互作用的KD特别有利的方法，其中相互作用脱离率(off-rate)可以非常低。KinExATM的应用在该情况中是尤其适当的，其中抗原和抗体的亲和性高于通过表面等离子共振法精确预期出的。KinExATM方法可以按照Drake等人(2004)《分析生物化学》328，35-43所描述的进行。
在本发明的一个实施方式中，本发明结合成员为特异性用于如使用KinExATM方法学测量的300pM或更低KD的IL-1R。可选择地200pM或更低、100pM或更低、50pM或更低、20pM或更低、或10pM或更低、5pM或更低、3pM或更低、1pM或更低。
生物活性的抑制可以是部分或全部。结合成员可以抑制IL-1R1生物活性，如CYNOM-K1细胞中的IL-1β诱导IL-8释放或HeLa细胞中IL-1α和IL-1β诱导IL-8释放到在缺乏结合成员下的诱导最大可能活性的50％或80％的IL-1α或IL-1β浓度活性的100％，或可选择地到：至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％。
结合成员的中和效价通常表示为IC50值，以nM为单位，除非另有说明。在功能性分析中，IC50为能将生物应答降低到其最大值50％的结合成员的浓度。在配体-结合研究中，IC50为降低受体结合到最大特异性结合水平的50％的浓度。IC50可以通过绘制最大生物活性应答的百分数作为结合成员浓度的log的函数，并使用软件程序如Prism(GraphPad软件公司，La Jolla，CA，USA)，以将S函数拟合数据以生成IC50值。使用一种或多种本领域技术人员已知的和/或本文所描述或参考的分析法进行测定或测量效价。结合成员的中和效价可用表述为几何平均数(Geomean)。
通过本文所描述分析中的结合成员的IL-1R1活性的中和作用显示，结合成员结合到或中和IL-1R1。可以用于测定结合成员对IL-1R1的结合的其他方法包括ELISA、免疫印迹法、免疫沉淀法、亲和层析法、生化分析法。
与其他物种的IL1R1相比，本发明结合成员对人IL-1R1具有类似或更强的亲和性。结合成员对人IL-1R1的亲和性可以类似或为例如对食蟹猕猴IL-1R1的5或10倍以内。可选择地，结合成员对人和对食蟹猕猴IL-1R1的亲和性可以具有相似的结合亲和性。
本发明结合成员包括含有一个或多个CDR的IL-1R1结合基序，例如框架内的CDR组。CDR组包括选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一种或多种CDR。在一个实施方式中，一组CDR包括表2中的HCDR3任选地结合选自HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一种或多种CDR，例如一种或多种CDR选自表2中的HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在本发明另一个实施方式中，CDR组包括表2中的HCDR3和LCDR3任选地结合选自HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2中的一种或多种CDR，例如一种或多种CDR选自表2中的HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2。在本发明另一个实施方式中，CDR组包括表2中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。同时优选选择表2中相同抗体的一种或多种CDR，CDR可以选自表2中所列的一种或多种抗体。
在另一个实施方式中，本发明结合成员，例如抗体，包括的IL-1R1结合基序含有选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的一种或多种CDR，例如表1a和1b中所公开的，其中所述结合成员特异性结合Il-1R1。
在另一个实施方式中，本发明结合成员，例如抗体，包括的IL-1R1结合基序含有选自HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的一种或多种CDR，例如表1a和1b中所公开的，其中所述结合成员特异性结合Il-1R1并与IL-1β和IL-1Ra竞争结合到IL-1R1，且结合IL-1R1以KinexaTM检测具有10pM或更少的KD。
如本文所描述，母源抗体分子为分离地带有如表1a所示(参见抗体1)CDR组序列。通过优化工艺，我们生成了一组抗体克隆体，编号为2-3，带有衍生于母源CDR序列的CDR序列，并在表1所示的位置有修饰。这样，例如，从表1a中可以看出，抗体2具有母源HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2，并具有母源HCDR3序列，其中Kabat残基100E被T取代，Kabat残基100F被V取代，Kabat残基100G被D取代，Kabat残基100H被A取代，Kabat残基100I被A取代，Kabat残基101被V取代，Kabat残基102被D取代。
如本文所描述，第二母源抗体分子为分离地带有CDR组序列，如表1b所示(参见抗体4)。通过优化工艺，我们生成了一组抗体克隆体，编号为5-10，带有衍生于母源CDR序列的CDR序列，并在表1b所示的位置有修饰。这样，例如，从表1b中可以看出，抗体5具有母源HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2，并具有母源HCDR3序列，其中Kabat残基100A被A取代，Kabat残基100B被P取代，Kabat残基100C被P取代，Kabat残基100D被P取代，Kabat残基100E被L取代，Kabat残基100F被G取代，Kabat残基100I被G取代。还可以从表1b中可以看出，抗体6具有母源HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2，并具有母源HCDR3序列，其中Kabat残基100A被E取代，Kabat残基100B被Q取代，Kabat残基100C被Y取代，Kabat残基100D被G取代，Kabat残基100E被V取代，Kabat残基100F被V取代，Kabat残基100J被删除，Kabat残基101被F取代，Kabat残基102被V取代。
本文所描述的为含有母源组CDR的结合成员，如表1a所述(抗体1)，其中，HCDR1为SEQ ID NO：93(Kabat残基31-35)，HCDR2为SEQ IDNO：94(Kabat残基50-65)，HCDR3为SEQ ID NO：95(Kabat残基95-102)，LCDR1为SEQ ID NO：98(Kabat残基24-34)，LCDR2为SEQ ID NO：99(Kabat残基50-56)，LCDR3为SEQ ID NO：100(Kabat残基89-97)。本发明结合成员还可以为母源结合成员(抗体1)，如表1a所示，其中一种或多种的CDR具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除、和/或插入。在一些实施方式中，相对于抗体1的母源序列，结合成员包括一组具有1-12个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体1，具有1-10个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体1，具有1-5个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体1，具有1-3个的添加、取代、删除和/或插入。
在某些实施方式中，本发明结合成员的包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR3具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列，任选带有1-7个氨基酸添加、取代、删除和/或插入。其中LCDR3具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列，任选带有1-5个氨基酸添加、取代、删除和/或插入。在这样的实施方式中，HCDR1可以具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列；HCDR2可以具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列；LCDR1可以具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列；LCDR2可以具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列。可选地，相对于母源序列(抗体1)，HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2还可以全部地具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除和/或插入，如从1-10个的取代。
本文所描述的为包括母源CDR组的结合成员，如表1b所示(抗体4)，其中HCDR1为SEQ ID NO：103(Kabat残基31-35)，HCDR2为SEQ IDNO：104(Kabat残基50-65)，HCDR3为SEQ ID NO：105(Kabat残基95-102)，LCDR1为SEQ ID NO：108(Kabat残基24-34)，LCDR2为SEQ ID NO：109(Kabat残基50-56)，LCDR3为SEQ ID NO：110(Kabat残基89-97)。本发明结合成员还可以是如表1b所示的母源结合成员，其中其中一种或多种的CDR具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除、和/或插入。在一些实施方式中，相对于抗体4的母源序列，结合成员包括具有1-15个的添加、取代、删除和/或插入的CDR组。在另一实施方式中，相对于抗体4，具有1-10个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体4，具有1-5个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体4，具有1-3个的添加、取代、删除和/或插入。
在某些实施方式中，本发明结合成员的包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR3具有SEQ ID NO：105的氨基酸序列，任选带有1-9个氨基酸的添加、取代、删除和/或插入。LCDR3具有SEQ ID NO：110的氨基酸序列，任选带有1-6个氨基酸添加、取代、删除和/或插入。在这样的实施方式中，HCDR1可以具有SEQ ID NO：103的氨基酸序列；HCDR2可以具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列；LCDR1可以具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列；LCDR2可以具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列。可选地，相对于母源序列(抗体4)，HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2还可以全部地具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除和/或插入，如从1-10个的取代。
本文所描述的为包括抗体6CDR组的结合成员，如表1b所示，其中HCDR1为SEQ ID NO：63(Kabat残基31-35)，HCDR2为SEQ ID NO：64(Kabat残基50-65)，HCDR3为SEQ ID NO：65(Kabat残基95-102)，LCDR1为SEQ ID NO：68(Kabat残基24-34)，LCDR2为SEQ ID NO：69(Kabat残基50-56)，LCDR3为SEQ ID NO：70(Kabat残基89-97)。本发明结合成员还可以是如表1b所示的抗体6结合结合成员，其中一种或多种的CDR具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除、和/或插入。在一些实施方式中，相对于抗体6的母源序列，结合成员包括具有1-17个的添加、取代、删除和/或插入CDR组。在另一实施方式中，相对于抗体6，具有1-10个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体6，具有1-5个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体6，具有1-3个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体6，具有1-2个的添加、取代、删除和/或插入。在另一实施方式中，相对于抗体6，具有1个的添加、取代、删除和/或插入。
在某些实施方式中，本发明结合成员的包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR3具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列，任选带有1-11个氨基酸添加、取代、删除和/或插入；LCDR3具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列，任选带有1-6个氨基酸添加、取代、删除和/或插入。在这样的实施方式中，HCDR1可以具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列；HCDR2可以具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列；LCDR1可以具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列；LCDR2可以具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列。可选地，相对于抗体6，HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2还可以全部地具有一个或多个的氨基酸添加、取代、删除和/或插入，如从1-10个的取代。
本发明结合成员可以包括一个或组合的如本文所描述的CDR。例如，本发明结合成员可以包括具有SEQ ID NO：93氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：94氨基酸序列的HCDR2；具有选自由SEQ ID NO：95、5或125氨基酸序列组成的组的HCDR3；具有SEQ ID NO：98氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：99氨基酸序列的LCDR2；具有选自由SEQ ID NO：100、10或130氨基酸序列组成组的LCDR3。
本发明结合成员可以包括一个或组合的如本文所描述的CDR。例如，本发明结合成员可以包括具有SEQ ID NO：103氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：104氨基酸序列的HCDR2；具有选自由SEQ ID NO：105、15、65、25、35、75、45、115、55或85氨基酸序列组成组的HCDR3；具有SEQ ID NO：108氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：109氨基酸序列的LCDR2；具有选自由SEQ ID NO：110、20、70、30、40、80、50、120、60或90氨基酸序列组成组的LCDR3。
本发明结合成员可以包括一个或组合的如本文所描述的CDR。例如，本发明结合成员可以包括具有SEQ ID NO：93氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：94氨基酸序列的HCDR2；具有选自由SEQ ID NO：95、5、125、105、15、65、25、35、75、45、115、55或85氨基酸序列组成组的HCDR3；具有SEQ ID NO：98或108氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：99或109氨基酸序列的LCDR2；具有选自由SEQ ID NO：100、10、130、110、20、70、30、40、80、50、120、60或90氨基酸序列组成组的LCDR3。
在某些实施方式中，本发明结合成员或VH结构域包括带有一种或多种以下取代或删除的抗体1HCDR3(SEQ ID NO：95)：
Kabat残基100E被T取代；
Kabat残基100F被V或L取代；
Kabat残基100G被D取代；
Kabat残基100H被A或P取代；
Kabat残基100I被A或P取代；
Kabat残基101被V或G取代；
Kabat残基102被D或V取代；
在某些实施方式中，本发明结合成员或VH结构域包括带有一种或多种以下取代或删除的抗体4HCDR3(SEQ ID NO：105)：
Kabat残基100A被A或E取代；
Kabat残基100B被P、Q或A取代；
Kabat残基100C被P、Y、S或L取代；
Kabat残基100D被P、G或A取代；
Kabat残基100E被L或V取代；
Kabat残基100F被G、V或P取代；
Kabat残基100G被V取代；
Kabat残基100H被Y取代；
Kabat残基100I被G或D取代；
Kabat残基100J被A取代或删除；
Kabat残基101被F取代；
Kabat残基102被V取代。
在一些实施方式中，本发明结合成员或其VL结构域可以包括带有一种或多种以下取代的抗体1LCDR3(SEQ ID NO：100)：
Kabat残基94被H或A取代；
Kabat残基95被A取代；
Kabat残基95A被E或R取代；
Kabat残基95B被Q或V取代；
Kabat残基97被H或L取代。
在一些实施方式中，本发明结合成员或其VL结构域可以包括带有一种或多种以下取代的抗体4LCDR3(SEQ ID NO：110)：
Kabat残基94被A、V、D、H、L或R取代；
Kabat残基95被G、R或A取代；
Kabat残基95A被G、L、A、V或D取代；
Kabat残基95B被H、R、A或D取代；
Kabat残基96被H、P或A取代；
Kabat残基97被H、V或Q取代。
在某些实施方式中，本发明结合成员或VH结构域包括带有一种或多种以下取代或添加的抗体6HCDR3(SEQ ID NO：65)：
Kabat残基100A被G或A取代；
Kabat残基100B被S、P或A取代；
Kabat残基100C被D、P、S或L取代；
Kabat残基100D被Y、P或A取代；
Kabat残基100E被T或L取代；
Kabat残基100F被T、G或P取代；
Kabat残基100G被V取代；
Kabat残基100H被Y取代；
Kabat残基100I被G或D取代；
Kabat残基100J在抗体6中被删除并被恢复为A或F；
Kabat残基101被D取代；
Kabat残基102被I取代。
在一些实施方式中，本发明结合成员或其VL结构域可以包括带有一种或多种以下取代的抗体6LCDR3(SEQ ID NO：70)：
Kabat残基94被S、A、D、H、L或R取代；
Kabat残基95被L、G或A取代；
Kabat残基95A被S、G、A、V或D取代；
Kabat残基95B被G、R、A或D取代；
Kabat残基96被S、P或A取代；
Kabat残基97被L、H或Q取代。
在一实施方案中，本发明为包括以下组CDR的结合成员具有SEQ IDNO：3氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的HCDR2；具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的HCDR3；具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的LCDR2；具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的LCDR3。
在一实施方案中，本发明为包括以下组CDR的结合成员：具有SEQ IDNO：63氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：64氨基酸序列的HCDR2；具有SEQ ID NO：65氨基酸序列的HCDR3；具有SEQ ID NO：68氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：69氨基酸序列的LCDR2；具有SEQ IDNO：70氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，本发明为包括以下组CDR的结合成员：具有SEQID NO：23氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：24氨基酸序列的HCDR2；具有SEQ ID NO：25氨基酸序列的HCDR3；具有SEQ ID NO：28氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：29氨基酸序列的LCDR2；具有SEQ ID NO：20氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，本发明为包括以下组CDR的结合成员：具有SEQID NO：113氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：114氨基酸序列的HCDR2；具有SEQ ID NO：115氨基酸序列的HCDR3；具有SEQ ID NO：118氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：119氨基酸序列的LCDR2；具有SEQ ID NO：120氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，本发明为包括以下组CDR的结合成员：具有SEQID NO：53氨基酸序列的HCDR1；具有SEQ ID NO：54氨基酸序列的HCDR2；具有SEQ ID NO：55氨基酸序列的HCDR3；具有SEQ ID NO：58氨基酸序列的LCDR1；具有SEQ ID NO：59氨基酸序列的LCDR2；具有SEQ ID NO：60氨基酸序列的LCDR3。
本发明结合成员可以是一种例如表2所公开的抗体，其竞争或交叉竞争结合到带有本文所公开任意结合成员的IL-1R1，它们都结合IL-1R1，且包括本文所公开的如VH和/或VL结构域、CDR，如HCDR3，和/或CDR组。结合成员之间的竞争可以在体外轻易地分析出，例如使用ELISA和/或将特异性报告分子标记到一种结合成员上，它能够在一种或多种其他未标记结合成员的存在下被检测到，以能够辨别结合相同表位或重叠表位的结合成员。这样的方法很易于被本领域普通技术人员所知，并在本文进行更为详细的描述。这样本发明另一方面提供了特异性用于IL-1R1的结合成员，它竞争或交叉竞争以结合到带有抗体分子的人IL-1R1，所述抗体分子包括VH和/或VL结构域、或CDR，如HCDR3，或抗体1-10中的任意的CDR组。在一实施方案中，本发明结合成员与表2中的抗体1和/或抗体3竞争或交叉竞争。
本发明的另一实施方式提供了结合到IL-1R1特定区域例如表位的结合成员。特定的相同表位或其部分被表2所列的任意一种抗体结合。
本发明另一实施方式提供了结合表位的分离的结合成员，所述表位包含在一种或多种以下的IL-1R1序列中：
(i)N123-V134；
(ii)L140-K157；和/或
(ii)K178-R180。
本发明另一实施方式提供了特异性用于权利要求16的IL-IR1的独立的结合成员，所述成员非连续地结合表位，所述表位包含在IL-1R1序列：
(i)N123-V134；
(ii)L140-K157；和
(ii)K178-R180。
本发明进一步方面提供了包括人抗体抗原结合位点的结合成员，其与抗体抗原结合位点竞争或交叉竞争以结合到人IL-1R1，其中抗体抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，其中VH和VL结构域包含母源(抗体1或抗体4)的或表2中列出的抗体2-3或5-10的任意的CDR组。
可以采用任何适宜方法以测定由结合成员结合的残基序列。例如，使用肽结合扫描，如PEPSCAN-基酶联免疫分析(ELISA)。在肽-结合扫描中，由PEPSCAN系统提供的那种，衍生于抗原的短重叠肽被系统地筛选以结合到结合成员。肽可以共价耦合到载体表面以形成肽列阵。肽可以是线型或束型结构。可以使用在肽序列每一个末端具有末端Cys残基的肽来生成束型结构。Cys残基可以直接或间接地共价耦合到载体表面，以致肽被保持在环状结构中。这样，该方法中使用的肽可以带有Cys残基，所述残基Cys被添加到对应抗原片段的肽序列的每个末端。还可以使用双环肽，其中Cys残基被另外地定位在或临近肽序列的中部。Cys残基就直接或间接地被共价耦合到载体表面以便所述肽形成双环结构，在中心Cys残基的每一侧带有一个环。肽可以合成方法生成，且Cys残基因此能够被设计到所希望的位置，尽管不是天然存在在IL-1R1序列中。任选地，线型或束型肽都可以在肽结合分析中进行筛选。肽结合扫描可以涉及鉴定(如使用ELISA)结合成员结合的肽组，其中所述肽具有对应于IL-1R1的片段(如，IL-1R1的约5，10或15连续残基的肽)的氨基酸序列，并校准肽以测定结合成员结合的残基的足迹，其中所述足迹包括与重叠肽共同的残基。
可选择地或另外地，肽结合扫描方法可以涉及鉴定结合成员结合的肽，其带有至少一个给定信号：噪音比率。用于测定结合的更详细的适于肽结合扫描方法为本领域已知。本领域熟知的、能够用于测定抗体结合的残基的，和/或确认肽结合扫描结果的其他方法包括定点导向诱变、氢/氘交换、质谱、NMR、和X-射线晶体学。
本发明结合成员可以是抗体分子或其结合片段，优选人抗体分子或人源华抗体分子或其结合片段。抗体可以是单克隆抗体、特别是人、鼠、嵌合或人源化来源，所述抗体可以根据本领域技术人员所述熟知的标准方法进行获得。
虽然如下所示提示，可以通过非抗体支架运送CDR，用于运送本发明CDR或CDR组的结构通常为抗体重链或轻链序列或其大部分，其中CDR或CDR组被定位的位置对应于被重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体变异区的CDR或CDR组。免疫球蛋白变异结构域的结构和位置可以通过参考Kabat等人1987[36]进行检测，使用任意的网络搜索引擎搜索“Kabat”名下可找到的更新。
本发明抗体通常包含抗体VH和/或VL结构域。本发明VH结构域包括HCDR组，VL结构域包括LCDR组。抗体分子可以包括含有VH CDR1、CDR2和CDR3和支架的抗体VH结构域。其可选择地或还包括含有VLCDR1、CDR2和CDR3和支架的抗体VL结构域。本发明抗体VH结构域的例子为SEQ ID NO：22，本发明抗体VL结构域的例子为SEQ ID NO：27。
本发明提供了包括表2中任意抗体的HCDR1和/或HCDR2和/或HCDR3和/或表2中任意抗体的LCDR1和/或LCDR2和/或LCDR3。结合成员可以包括VH CDR组，任选地还可以包括VL CDR组，VL CDR可以与VH CDR来自相同或不同的抗体。
通常，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，尽管如以下进一步讨论的，分离的VH或VL结构域可以被用于结合抗原。例如，抗体1VH结构域(参见表2)可以和抗体1VL结构域配对，以便形成的抗原结合位点包括抗体1VH和VL结构域。可以提供相似的实施方式用于本文所公开的其他VH和VL结构域。在其他实施方式中抗体1VH与VL结构域配对而不是抗体1。在本领域，轻链混杂性已很好地被确认。再次，本发明提供了用于本文所公开的其他VH和VL结构域的类似的实施方式。这样，表2中任意抗体的VH可以与表2中的任意相同或其他抗体的VL配对。
本发明另一方面是包括VH结构域的抗体分子，所述VH结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98、或99％的氨基酸序列与表2中所示的任意抗体的VH结构域相同，或包括表1a或1b所示的HCDR组(如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)。抗体分子可以任选地还包括VL结构域，所述VL结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98、或99％的氨基酸序列与抗体1-28的任意的VL结构域相同，或带有表1a或1b所示的LCDR组(如LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)。能够计算两个氨基酸序列一致性百分数的算法包括：如BLAST[37]、FASTA[38]，或Smith-Waterman算法，如采用默认参数。
本发明结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域在其C末端被结合到包括人CK或Cλ链的抗体轻链恒定区。类似地，VH结构域上的结合成员在其C末端可以被结合到免疫球蛋白的重链的全部或部分(如CH1结构域)，所述免疫球蛋白重链衍生于任意的同型抗体，如IgG、IgA、IgE和IgM和任意的同型子类，特别地IgG、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1是特别有利地的，原因是其易于制造且稳定，如半衰期。调节结合成员功能和/或性质的如稳定变异区域的任意合成或其他的恒定区变异体也可以用于本发明。
进一步，修饰本文所描述的氨基酸序列是本发明希望的，特别是那些人重链恒定区以改编序列到所希望的异型、如在高加索人群中发现的异型。
结合成员可以包括抗体分子、或其结合片段，并在抗体框架内具有一个或多个CDR，如CDR组。例如，抗体的一个或多个CDR或CDR组可以被接枝到框架内(如人框架)以提供抗体分子。框架区可以是人生殖系的基因序列，或非生殖系的。这样框架可以是生殖的，其中框架内的一个或多个残基可以被交换以匹配最相似人生殖系框架内的相当位置的残基。这样，本发明的结合成员可以是分离的具有在人生殖系框架内包含HCDR组的VH结构域，例如，人生殖系IgG VH框架。结合成员还可以带有包含LCDR组的VL结构域，如在人生殖系IgG VL框架内。
VH和/或VL支架残基可以如所讨论的被修饰，本文举例，如使用位点导向诱变。本发明的VH或VL结构域，或结合成员包括这样的VL结构域，优选具有表2抗体的VH和/或VL结构域的序列，并含有本发明的HCDR3。
与生殖系抗体分子相比，非生殖系抗体分子具有相同的CDR，但不同的框架。生殖系抗体可以通过用于这些抗体的本文所示的VH和VL结构域的种系框架区域而生成。
可以在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR内进行变化，所述变化通常不导致功能的丧失，所以包含这种变化氨基酸序列的结合成员应保持结合和/或中和IL-1R1的能力。它可以保持与没有进行变化的结合成员具有相同数量结合和/或中和能力，如按本文所述的分析法进行测量。包含这样变化的氨基酸序列的结合成员可以具有改善的结合和/或中和IL-1R1的能力。
变化可以包括有非天然存在的或非标准氨基酸替换一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰到非天然存在的或非标准的形式内，或将一个或多个非天然存在的或非标准的氨基酸插入该序列。本发明序列中变化的位置和数量的例子在本文别处进行描述。天然存在的氨基酸包括通过其标准单字母代码被确定为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E的20“标准”L-氨基酸。非标准氨基酸包括可以被合并入多肽骨架或来自现有氨基酸残基修饰而成的任意的其他残基。非标准氨基酸可以是天然存在或非天然存在。几个天然存在非标准氨基酸已为本领域所知，4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙基丝氨酸，等[40]。在其N-α位进行衍生的那些氨基酸残基将仅被定位在氨基酸序列的N-末端。通常本发明中的氨基酸为L-氨基酸，但可以是D-氨基酸。因此变化可以包括用L-氨基酸进行修饰或D-氨基酸替换L-氨基酸。氨基酸的甲酰化、乙酰化和/或磷酸化形式是已知的，本发明氨基酸可以进行这样的修饰。
本发明结合成员和抗体结构域中的氨基酸序列可以包含以上所描述的非天然或非标准的氨基酸。非标准氨基酸(如D-氨基酸)可以在合成过程中被并入氨基酸序列，或通过在氨基酸合成之后进行“原始”标准氨基酸的修饰或替换。
使用非标准和/或非天然存在的氨基酸提高结构和功能的多样性，并能提高潜能以实现本发明结合成员中所希望的IL-1R1结合和中和性能。另外，与标准L-氨基酸相比，D-氨基酸及类似物已显示具有更好的药代动力学特性，原因是在向动物如人施用之后，具有L-氨基酸的多肽的体内降解。
本发明带有CDR-衍生序列的新的VH或VL区域的生成可以采用一种或多钟选自VH和/或VL基因的随机诱变以生成全部变异区内的突变体。这样的技术描述在Gram等人[41]，其使用了易错PCR。在一些实施方案中，一种或多钟氨基酸替代在全部变异区或CDR组内进行。
可以使用的另一种方法为VH或VL基因的CDR区的导向诱变。这样的方法公布在Barbas等人[42]和Schier等人[43]。
以上所述描述的所有方法为本领域已知，本领域技术人员将能够使用这样的方法并采用本领域的常规方法以提供本发明的结合成员。
本发明进一步的方面提供获得用于IL-1R1的抗体抗原位点的方法，所述方法包括提供本文所描述的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的增加、删除、取代或插入，任选地结合带有一个或多个VL结构域的VH结构域，并测试VH结构域或VH/VL结合物或联合以识别结合成员或用于IL-1R1的抗体抗原结合位点，并任选地带有一种或多种所希望的性质，如中和IL-1R1活性的能力。所述VL结构域可具有本文所述的实质上相同的氨基酸序列。可以使用的类似方法为本文所公开的VL结构域的一种或多种序列变异体与一种或多种VH结构域结合。
根据本发明可以使用本文所公开的特定序列的任意VH和VL结构域的变异结构域氨基酸序列变异体，如所讨论的。特定的变异体可以包括一种或多种氨基酸序列的变化(氨基酸残基的增加、删除、取代和/或插入)。在某些实施方式中，变异体具有少于约20、少于15、少于10或少于5的这样的变化。
如以上所示，实质上如本文所述的CDR氨基酸序列可以被携带作为人抗体变异结构区或其大部分中的CDR。实质上如本文所述的HCDR3序列代表本发明的实施方式，这些中的每一个可以被携带作为人抗体变异区或其大部分中的CDR，任选地联合本发明的HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3。
本发明的结合成员还包括含有抗体抗原结合位点的抗体的片段。抗体片段的生成可以通过重组DNA技术、或通过完整抗体的酶或化学裂解。包含的抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于分子如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd和二硫稳定变异区(dsFv)。各种其他的抗体分子包括但不限于一种或多种已经设计的抗体抗原结合位点，包括例如Fab2、Fab3、双链抗体、三链抗体、四链抗体和微型抗体。抗体分子和它们的构建方法和应用描述在Holliger&Hudson(44)。
已经显示整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例子为(i)由VL、VH、恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)结构域组成的Fab片段；(ii)由VH或CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH组成的Fv片段；(iv)dAb片段[45，46，47]，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab’)2片段，包括两个相连的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子相连接，所述肽连接子使两个结构域相连接以形成抗原结合位点[48，49]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(例如如WO 1993/011161所公开的)和(ix)“双链抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(例如WO 94/13804和[50]所公开的)。Fv、scFv或双链抗体分子可以通过二硫桥连接VH和VL结构域[51]的合并进行稳定。还可以制备包含scFv被结合到CH3结构域的微抗体[52]。结合片段的其他实施例为Fab′，所述Fab′不同于在重链CH1结构域的羰基末端添加几个残基的Fab片段，其包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸、和Fab’-SH，所述Fab’-SH是恒定结构域的半胱氨酸残基带有自由的巯基的Fab’片段。
本发明抗体片段可以从母源抗体分子(抗体1或4)或任意的抗体分子2、3、5-10开始来获得，通过方法如通过诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶消化，和/或通过化学还原进行二硫桥的裂解。在另一种方式中，本发明的抗体片段的获得可以通过本领域技术人员所熟知基因重组技术；或通过肽合成的其他方法，如自动肽合成器方式，例如所述自动肽合成器由例如Applied Biosystem公司(福斯特城，加利福尼亚州，美国)提供；或通过核酸的合成和表达。
本发明功能性抗体片段包括通过诸如通过PEG化，或并入到脂质体中的化学修饰提高半衰期的任意的功能性片段。
dAb(结构域抗体)为抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链[47]的变异区。VH dAb在骆驼(如骆驼，美洲驼)中天然存在，它的生成可以通过用标靶基因免疫骆驼，分离抗原-特异性B细胞，并从个体B细胞直接克隆dAb基因。dAb还可以在细胞培养中生成。它们的小尺寸、良好溶解性和温度稳定性使其特别地在生理上使用并适于选择和亲和力成熟。骆驼VH dAb被开发用于治疗应用，其名称为“nanobodiesTM”。本发明的结合成员可以是包含实质上如本文所述的VH或VL结构域的，或包含实质上如本文所述的含有CDR组的VH或VL结构域的dAb。
本发明抗体包括双特异性抗体。双特异性或双功能性抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同变异区被结合到相同的分子中[53]。从它们的招募新效应子功能或靶向一些分子到肿瘤细胞表面上的能力，它们在诊断领域和治疗领域的应用已经被阐述。其中使用双特异性抗体时，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以种各种方式进行制造[54]，如化学制备、或来自杂交的杂交瘤，或可以是以上所提到的任意的双特异性抗体片段。这些抗体的获得可以通过化学方法[55，56]或体细胞的方法[57，58]，但同样地并优选基因工程方法，所述方法允许实施异源二聚化，这样有利于所得抗体[59]的纯化工艺。双特异性抗体的例子包括那些BiTETM方法，该方法中带有不同的特异性两个抗体的结合结构域可以被使用并直接地通过短的柔性肽连接。这在短的单个多肽链上结合两个抗体。双链抗体和scFc在没有Fc区域下被构建，仅使用变异区，潜在地降低了抗独特型反应的效果。
双特异性抗体可以被构建为全IgG，双特异性Fab′2、Fab′PEG、双链抗体或其他的双特异性scFv。进一步可以使用本领域已知常规方法两个双特异性抗体进行连接以形成四价抗体。
相对于双特异性全抗体，双特异性双链抗体也是特别有用的，因为它们能够轻易地在大肠杆菌中被构建和表达。使用噬菌体展示库(WO1994/13804，适当结合特异性的双链抗体(和许多其他的多肽，如抗体片段)能够轻易地被选择。如果双链抗体的一个臂被保持恒定，例如，带有特异性导向抗IL-1R1，然后制备库，其中其他的臂被变异，选择适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过不同的工程方法进行制备，所述方法描述在Ridgeway等人[60]或WO1996/27011，WO1998/50431和WO2006/028936。
可选择地，本发明结合成员可以包括非抗体分子内的抗原-结合位点，通常由一种或多种CDR，如非抗体蛋白质支架内的CDR组，如以下进一步的讨论。
抗原结合位点的提供可以通过非抗体蛋白支架上的CDR重排、如纤连接蛋白或细胞色素B等[61，62，63]，或通过随机化或突变蛋白支架内的环的氨基酸残基以使结合特异性赋予所希望的靶向。用于设计蛋白内的新结合位点的支架已被Nygren等人[63]进行了详细的总结。用于抗体模拟的蛋白支架公开在WO 200034784中，其通过引用的方式全部并入本文，其中发明人描述的蛋白(抗体模拟)包括具有至少一个随机环的纤连蛋白III型结构域。枝接入诸如HCDR组的一个或多个CDR的适宜的支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任意结构域成员提供。该支架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白支架的优点为在支架分子内可以提供抗原结合位点，所述支架分子比至少一些抗体分子更小和/或更易于制造。小尺寸的结合成员可以赋予有用的生理学性质，如进入细胞的能力，深度渗透到组织或达到其他结构内的标靶，或结合进标靶抗原的蛋白腔。非抗体蛋白支架内的抗原结合位点的应用在Wess，2004[64]中进行了综述。典型的是具有稳定骨架和一种或多种变异环的蛋白，其中环或多环的氨基酸序列被特异性或随机地被诱变以形成结合靶向抗原的抗原结合位点。这样的蛋白包括来自金黄色葡萄球菌、转铁蛋白、纤连蛋白(第10纤连蛋白III型结构域)、脂钙蛋白和γ结晶和其他的AffilinTM支架(Scil Proteins)的蛋白A的IgG结合结构域。其他类型的例子包括基于环肽(cyclotides)的合成“Microbodies”-具有内分子二硫键的小蛋白、微蛋白(VersabodiesTM，Amunix公司，Mountain View，加利福尼亚，USA)和锚蛋白重复蛋白(DARPins ，MolecularPartner AG，Zürich-Schlieren，Switzerland)。这样的蛋白还包括小的，设计的蛋白结构域，如，免疫结构域(参见例如美国专利公开号2003/082630和2003/157561)。免疫结构域包含至少一种抗体的互补决定区(CDR)。
本发明结合成员可以包括其他氨基酸如形成肽或多肽，如折叠区、或传授给分子除结合抗原能力之外的另一项功能特性。本发明结合成员可以携带可检测标记，或可以被共轭到毒素或靶向部分或酶(如，通过肽基键或连接子)。例如，结合成员可以包括催化位点(如，在酶结构域中)和抗原结合位点，其中，抗原结合位点结合到抗原，并因此靶向催化位点到抗原。催化位点可以如通过裂解抑制抗原的生物功能。
本发明还包括结合成员，所述成员被修饰以改变，即增加、降低或消除结合成员的生物作用功能，例如带有修饰Fc区域的抗体。在一些实施方式中，本文所公开结合成员或抗体可以被修饰以提高它们的结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方式中，结合成员或抗体可以被修饰以提高它们的激活效应细胞并参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。还在其他实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体可以被修饰以提高它们的激活效应细胞和参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)并提高其结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
在一些实施方式中，本文所公开结合成员或抗体可以被修饰以降低它们的结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方式中，结合成员或抗体可以被修饰以降低它们的激活效应细胞并参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。还在其他实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体可以被修饰以降低它们的激活效应细胞和参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)并提高其结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
在某些实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体的和本发明组合物的半衰期为至少约4-7天。在某些实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体的和本发明组合物的平均半衰期为至少约2-5天、3-6天、4-7天、5-8天、6-9天、7-10天、8-11天、8-12天、9-13天、10-14天、11-15天、12-16天、13-17天、14-18天、15-19天、16-20天。在其他实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体的和本发明组合物的平均半衰期为至少约17-21天、18-22天、19-23天、20-24天、21-25天、22-26天、23-27天、24-28天、25-29天、或26-30天。还在进一步的实施方式中，本文所公开的结合成员或抗体和本发明组合物的半衰期为上至约50天。在某些实施方式中，本发明抗体和组合物的半衰期可以通过本领域已知的方法进行延长。这样的延长可以依次降低抗体组合物的剂量的数量和/或频率。提高体内半衰期的抗体和用于制备它们的方法公开在美国专利号6,277,375；和国际公开号：WO 1998/23289和WO 1997/3461。
在另一实施方式中，本发明提供包括容器的制造品的物品。所述容器包括含有本文所公开的结合成员或抗体的药物组合物，和包装嵌入物或显示用于治疗与IL-1R1相关的紊乱的药物组合物的标签。
在其他实施方式中，本发明提供包括含有本文所公开的结合成员或抗体的组合物和用于向需要治疗的受试者施用该组合物的指示的药剂盒。
本发明提供了包含变异Fc区域的蛋白质的配方。这样，非天然存在的Fc区域，例如包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基的Fc区域。本发明变异Fc区所包括的是含有氨基酸删除、增加和/或修饰的Fc区域。
可以通过提高Fc区域对FcRn的结合亲和性来提高包含Fc区域的蛋白质的血浆半衰期。在一实施方式中，相对于可对比的分子，Fc变异蛋白具有提高的血浆半衰期。
在另一实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239、330和332组成组的位置上。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239D、330L和332E组成组的位置上。任选地，Fc区可以进一步包括另外的非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252、254和256组成组的位置上。在特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239D、330L和332E组成组的非天然存在的氨基酸和至少一种非天然存在的氨基酸在至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252Y、254T和256E组成组的一个或多个位置上。
在另一实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234、235和331组成组的一个或多个位置上。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235F、235Y和331S组成组。在进一步特定的实施方式中，本发明所述Fc变异体包括Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235F和331S非天然存在的氨基酸残基。在另一特定的实施方式中，本发明所述Fc变异体包括Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235Y和331S非天然存在的氨基酸残基。在另一特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235E和331S组成组的非天然存在的氨基酸。在另一特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235E和331S组成的非天然存在的氨基酸。任选地，Fc区可以进一步包括另外的非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252、254和256组成组的位置上。在特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235F、235Y和331S组成组的非天然存在的氨基酸；和至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252Y、254T和256E组成组的一种或多种位置上。
在另一实施方式中，本发明提供了Fc变异体蛋白配方，其中其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239、330和332组成组的位置上。在特定的实施方案中，本发明提供Fc变异蛋白配方，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239D、330L和332E组成组的非天然存在的氨基酸。任选地，Fc区域可以进一步包括另外的非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252、254和256组成组的至少一个或多个位置上。在特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体蛋白配方，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的239D、330L和332E组成组的非天然存在的氨基酸和至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252Y、254T和256E组成组的一个或多个位置上。
在另一实施方式中，本发明提供了Fc变异体蛋白配方，其中其中所述Fc区包括至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234、235和331组成组的位置上。在特定的实施方式中，本发明提供Fc变异蛋白配方，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235F、235Y和331S组成的组的非天然存在的氨基酸。任选地，Fc区可以进一步包括另外的非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252、254和256组成组的一个或多个位置上。在特定的实施方式中，本发明提供Fc变异体蛋白配方，其中所述Fc区包括至少一种选自由Kabat中所述的按EU索引编号的234F、235F、235D和331S组成组的非天然存在的氨基酸；和至少一种非天然存在的氨基酸位于选自由Kabat中所述的按EU索引编号的252Y、254T和256E组成组的一个或多个位置上。
用于生成非天然存在的Fc区域的方法为本领域已知的。例如，氨基酸取代和/或删除可以通过诱变的方法生成，包括但不限于位点导向诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985))，PCR诱变(Higuchi，在“PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications”，AcademicPress，San Diego，pp.177-183(1990))，盒式诱变(Wells等人，Gene 34：315-323(1985))。优选地，位点导向诱变通过重叠延伸PCR的方法进行(Higuchi，在“PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification″，Stockton Press，New York，pp.61-70(1989))。重叠延伸PCR的技术(Higuchi，ibid)还能被用于将任何所希望的突变体引入靶向序列(开始DNA)。例如的重叠延伸方法中的第一轮PCR涉及用外部引物(引物1)和内部诱变引物(引物3)，并分别用第二外部引物(引物4)和内部引物(引物2)扩增标靶序列，得到两个PCR片段(片段A和B)。内部诱变引物(引物3)被设计控制错配到特异化所希望的突变体的标靶序列。在PCR的第二轮中，PCR的第一轮的产品(片段A和B)使用两个外部引物(引物1和4)通过PCR进行扩增。所得全长PCR片段(片段C)用限制性内切酶消化，所得限制性片段被克隆到适当的载体。诱变的第一步，起始DNA(如编码Fc融合蛋白、抗体或简单的Fc区域)被可操作地克隆到诱变载体中。引物被设计以反映所希望的氨基酸取代物。用于生成变体Fc区的其他方法以为本领域所知(参见如美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、6,821,505、6,277,375、美国专利公开号2004/0002587和PCT公开号WO 94/29351、WO 99/58572、WO00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351、WO06/23403)。
在本发明的一些实施方式中，本文所提供抗体的糖基化模式为被修饰以提高ADCC和CDC效应子功能。参见Shields RL等人(2002)JBC.2777：26733；Jshinkawa T等人，(2003)JBC.278：3466和Okazaki A等人，(2004)J.Mol.Biol.，336：1239。在一些实施方式中，Fc变异蛋白包括一种或多种设计的糖型，如碳水化合物组合物被共价结合到含有Fc区的分子上。设计的糖型可以用于不同的目的，包括但不限于提高或降低效应子功能。设计的糖模型可以通过本领域技术人员已知的方法生成，例如通过使用设计的或变异表达株；通过用一种或多种酶共表达，例如DI N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶III(GnTI11)；通过在不同有机体或不同组织的细胞系中表达含有Fc区的分子；或通过在含有Fc区的分子被表达之后修饰碳水化合物。用于生成设计糖型的方法为本领域已知，包括但不限于Umana等人1999，Nat.Biotechnol 17：176-180，Davies等人，20017 Biotechnol Bioeng74：288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)美国专利第6,602,684号；美国系列号第10/277,370号；美国系列号第10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCTWO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1、PCT WO 02/30954A1中描述的那些、PotillegenTM技术(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(Glycart Biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。参见如WO00/061739；EA 01229125、US 20030115614、Okazaki等人，2004，JMB，336：1239-49。
本领域已知Fc区域的糖基化能被修饰以提高或降低效应子功能(参见例如，Umana等人，1999，Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies等人，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等人，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等人2003，J Biol Chem 278：3466-3473)、美国专利号6,602,684；美国序列号第10/277,370；美国序列号第10/113,929；PCT WO00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO02/30954A1；PotillegenTM技术(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(Glycart Biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。因此，在一实施方案中，本发明抗体的Fc区域包括氨基酸残基的变化糖基化。在另一实施方案中，氨基酸残基的变化糖基化形成低的效应子功能。在另一个实施方式中，氨基酸残基的变化糖基化形成提高的效应子功能。在特定实施方案中，Fc区域具有降低的岩藻糖基化。在另一实施方式中，Fc区域为岩藻糖基化(afucosylate)(参见，例如美国专利公开号2005/0026867)。在另一实施方案中，Fc区被唾液酸化，如其中至少一个半乳糖基通过α2，6键被连接到各自的末端唾液酸基团(参见例如：国际专利申请公开号WO2009079382)。
所述结合成员用于治疗和/或预防由IL-1R1介导的紊乱，特别是炎性紊乱如类风湿关节炎、骨关节炎(OA)哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。结合成员还可用于治疗和/或预防由IL-1R1介导的紊乱，如HIV-1、实体瘤、白血病、阿尔海默茨病和缺血性疾病。
本发明进一步的方面提供含有本发明结合成员的组合物，及其在抑制和/或中和IL-1R1方法中的应用，包括治疗受治疗人或动物身体的方法。
例如，本发明结合成员可以用于治疗和/或预防，或用于诊断，人或动物身体内(如人类患者中)或体外的生物反应、疾病、紊乱或状况的方法中。
治疗和/或预放的方法包括向所述患者施用足够量的本发明受体以可测量地中和IL-1R1。本发明可治疗的状况包括任何IL-1R1起作用的，如COPD和哮喘。
本发明结合成员可以被用于诊断或治疗人或动物受试者，特别是人类的方法中。本发明结合成员可以用于制备药剂以用于诊断或治疗人或动物受试者，特别是人类的方法中。本发明进一步提供了本发明结合成员用于诊断或治疗人或动物，特别是人类的应用。治疗包括以IL-1R1介导的生物作用为特征的紊乱，特别是炎性紊乱如类风湿关节炎、骨关节炎(OA)哮喘和COPD。
因此，本发明提供用于治疗炎性紊乱的方法，如哺乳动物的类风湿关节炎、骨关节炎、哮喘和COPD，其包括向所述哺乳动物施用本发明结合成员。在另一实施方式中，本发明提供了本发明结合成员在制备用于治疗炎性紊乱，如哺乳动物的类风湿关节炎、骨关节炎、哮喘和COPD的药剂的应用。在另一个实施方式中，本发明提供了本发明结合成员用于治疗炎性紊乱的应用，如哺乳动物的类风关节炎、骨关节炎、哮喘和COPD。在一实施方案中，哺乳动物为人类，在另一实施方案中，哺乳动物为非人类动物。在一实施方案中结合成员为以足够的数量以中和IL-1R1的本发明的抗体，VH结构域、或VL结构域。
相应地，本发明提供用于抑制嗜中性粒细胞招募和趋化进入哺乳动物肺的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用本发明结合成员。在另一实施方式中，本发明提供了本发明结合成员在制备用于抑制嗜中性粒细胞招募和趋化进入哺乳动物肺的药剂的应用。在另一实施方式中，本发明提供了本发明成员用于抑制嗜中性粒细吧招募和趋化进入哺乳动物肺的应用。在一实施方式中，所述哺乳动物为人，在另一实施方式中，哺乳动物为非人动物。在一实施方案中，结合成员为以足够量以中和1-1R1的本发明抗体、VH结构域、或VL结构域。
因此，本发明提供用于治疗选自哺乳动物的HIV、实体瘤、白血病、阿尔海默茨病、II型糖尿病、缺血性疾病、和动脉粥样硬化的紊乱的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用本发明结合成员。在另一实施方式中，本发明提供本发明结合成员在制备用于治疗选自哺乳动物的HIV、实体瘤、白血病、阿尔海默茨病、II型糖尿病、缺血性疾病、和动脉粥样硬化的紊乱的药剂的应用。在另一个实施方式中，本发明提供了本发明结合成员用于治疗紊乱的应用，所述紊乱选自哺乳动物的HIV、实体瘤、白血病、阿尔海默茨病、II型糖尿病、缺血性疾病、和动脉粥样硬化。在一实施方式中，哺乳动物为人类、在另一实施方案中，哺乳动物为非人动物。在一实施方案中，结合成员为以足够的量以中和IL-1R1的本发明抗体，VH结构域、或VL结构域。
当测试细胞与本发明结合成员在体外接触时，对照细胞也可以被用于作阳性对照(如不含结合成员的反应)和/或阴性对照(如不含IL-1R1和/或抗体的反应)。
当细胞通过体内与结合成员接触时，例如，通过向哺乳动物施用本发明结合成员显示了IL-1α-和/或IL-1β-介导生物反应，施用足够量的本发明结合成员以中和IL-1R1。
还进一步，本发明提供了用于降低哺乳动物如人类的IL-1R1介导活性的方法，所述方法包括施用本发明结合成员，如本发明抗体、VH结构域、或VL结构域。在另一实施方式中，本发明提供了本发明结合成员的在制备用于降低哺乳动物IL-1R1介导活性的药剂的应用。在另一实施方式中，本发明提供了本发明结合成员用于降低哺乳动物IL-1R1介导活性的应用。在一实施方式中，哺乳动物为人类，在另一实施方式中，哺乳动物为非人动物。在一实施方案中，结合成员为本发明的以足够量中和IL-1R1并降低IL1R1介导活性的抗体、VH结构域、或VL结构域。
可以使用本发明结合成员的疾病或紊乱包括但不限于：
1.呼吸道：气道的阻塞性疾病包括；哮喘，包括支气管的，过敏性的，内在的，外在的，运动诱发的，药物诱发的(包括阿司匹林和非淄体抗炎药诱发的)和灰尘诱发的哮喘，包括所有严重性的间歇性和持续性的哮喘，和其他的气道高反应性的原因；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；支气管炎，包括传染性的和嗜酸性粒细胞支气管炎；肺气肿，支气管扩张症；囊胞性纤维化；结节病；农夫肺和相关疾病；过敏性肺炎；肺纤维化，包括隐源性致纤维性肺泡炎，特发性间质性肺炎，纤维化并发的抗肿瘤疗法和慢性感染，包括肺结核和曲霉(菌)病和其他的真菌感染；肺移植的并发症；肺脉管系统的脉管炎性和血栓性紊乱，和肺动脉高血压症；镇咳剂的活性包括与炎性相关的慢性咳嗽和气道的促分泌状况，和原发性的咳嗽的治疗；急性和慢性鼻炎包括药物性鼻炎，和血管收缩性鼻炎；永久性的和季节性的过敏性鼻炎包括神经性鼻炎(草热粉)；鼻息肉病；急性病毒感染包括普通的感冒，和由于呼吸道合胞病毒的感染，流行性感冒，冠状病毒(包括SARS)，腺病毒，和ARDS和ALI；
2.骨骼和关节：包括骨关节炎/骨关节病在内或与其相关的关节炎，包括原发性的和继发性的，例如，先天性髋关节发育不良；颈部和腰部的脊椎炎，和腰痛和颈痛；类风湿病的关节炎和斯提尔病；血清阴性脊柱关节病包括关节强硬性脊椎炎，牛皮癣关节炎，反应性关节炎和未分化脊柱关节病；化脓性关节炎和其他感染相关的关节痛和骨骼障碍例如肺结核，包括脊椎结核病和蓬塞氏病；急性和慢性的结晶性滑膜炎包括尿酸盐痛风，焦磷酸钙沉积疾病，和与腱、囊和滑液炎性相关联的钙磷灰石；白塞氏病；原发性和继发性干燥综合症；系统性硬化和局限性硬皮病；系统性红斑狼疮，混合性结缔组织疾病，和未分化结缔组织病；炎症性肌病包括皮肌炎和多肌炎；风湿性多肌痛，青少年类关节炎包括先天性炎性关节炎无论是关节分布还是联合征候，和风湿症的发热和它的全身系统并发症；血管炎包括巨细胞性动脉炎，高安氏动脉炎，变应性肉芽肿性脉管炎，结节性多动脉炎，镜下多动脉炎，和与病毒性感染，过敏性反应，冷球蛋白，和异常蛋白相关联的血管炎；腰痛；家族性地中海热，穆-韦二氏综合征，和家族性爱尔兰热，川畸病，菊池病；药物引起的关节痛，腱炎，和肌病；
3.因为伤害造成的肌骨失常引起的痛和结缔组织改变，例如运动伤害，或疾病：关节炎(例如风湿性关节炎，骨关节炎，痛风或者结晶性关节痛)，其他的关节疾病(像椎间盘退变或颞下颌关节退化)，骨再造疾病(像骨质疏松症，畸形性骨炎或骨坏死)，多软骨炎，硬皮病，混合结缔组织紊乱，强直性脊柱炎或牙周病(像牙周炎)；
4.皮肤：牛皮癣，类牛皮癣，特应性皮炎，接触性皮炎或其他的湿疹皮肤病，和迟缓型过敏反应；植物-日光皮炎，脂溢性皮炎，疱疹样皮炎，扁平苔癣，萎缩硬化苔癣，(拉)坏疸性脓皮症，皮肤肉瘤，盘状红斑狼疮，天疱疮，类天疱疮，大疱性表皮松解，覃状真菌病，风疹，血管性水肿，血管炎，中毒性红斑，影响皮肤的嗜酸粒细胞症，斑形脱发，男性型秃(发)、急性发热性嗜中性皮肤病，复发性发热性结节性-非化脓性脂膜炎，多形性红斑，蜂窝织炎，包括易传染和非易传染，脂膜炎；皮肤淋巴细胞瘤，非黑色素皮肤癌和其他的发育不良的损伤；药物引起的紊乱包括固定性药疹；
5眼：眼睑炎；结膜炎，包括永久性和春天过敏性的结膜炎；虹膜炎；前部和后部葡萄膜炎；脉络膜炎；自身免疫，退化性和炎性的紊乱影响视网膜；眼炎包括交感性眼炎；肉状瘤病；感染包括病毒的，真菌的，细菌的；
6胃肠道：舌炎，龈炎，牙周炎；食管炎，包括逆流；嗜酸细胞性胃肠炎，肥大细胞增多症，节段性回肠炎，结肠炎如溃疡性结肠炎，未定型结肠炎，直肠炎，镜下结肠炎，肛门瘙痒症；乳糜泄，过敏性肠综合症，过敏性肠紊乱，非肠炎性腹泻和食物相关性过敏其可能影响距离内脏远的部位(例如偏头痛，鼻炎，或湿疹)；
7.腹部：肝炎，包括自身免疫性的，酒精性和病毒性的；肝纤维和肝硬化；胆囊炎；胰腺炎，包括急性和慢性；
8.泌尿生殖器的：肾炎包括间质性肾炎和肾小球性肾炎；肾病综合症；膀胱炎包括急性和慢性(间质性的)膀胱炎和杭纳氏溃疡；急性和慢性的尿道炎，前列腺炎，附睾炎，卵巢炎和输卵管炎；女阴阴道炎；纤维性海棉体炎；勃起功能障碍(包括男性和女性)；
9.同种异体移植排斥：以下急性和慢性的例如，肾，心，肝脏，肺，骨髓，皮肤的移植或角膜或以下输血；或急性和慢性移植物抗宿主病；
10.中枢神经系统：阿耳茨海默氏病和其他的痴呆包括克雅氏病和新型克雅氏病；淀粉样变性病；多发性硬化和脱髓鞘证候；脑动脉粥样硬化和脉管炎；颞动脉炎；重症肌无力；急性和慢性疼痛(严重，间歇或持续，源自中枢或周围末梢的)包括内脏痛，头痛，偏头痛，三叉神经痛，不典型面痛，关节和骨头痛，来自于肿瘤和肿块发病产生的疼痛，神经痛的证侯包括糖尿病，疱疹后神经痛和HIV相关联的神经病；热带痉挛性下肢轻瘫，神经类肉瘤病；恶性的，传染的或自身免疫的过程产生的中枢和周围神经系统的并发症。
11.其他的自身免疫状态和过敏性疾病(包括与过敏症治疗相结合的方法)包括淋巴瘤(样)甲状腺肿，突眼性甲状腺肿，爱迪生氏病，糖尿病，特发性血小板减少性紫癜，嗜酸粒细胞性筋膜炎，高IGE综合症，抗磷脂综合征，早产。
12.其他的由炎症或免疫部分造成的紊乱；包括艾滋病(AIDS)，麻风症，塞扎莱综合征，和肿瘤伴随综合征。
13.心脏血管：动脉硬化，作用于冠状动脉和外围的循环；心包炎；心肌炎；炎症和自身免疫状态的心肌症包括心肌肉瘤；缺血性再灌注损害；心内膜炎，心瓣炎，和主动脉炎包括传染性的(例如梅毒病)；血管炎；身体中枢和周边静脉的紊乱包括静脉炎和血栓症，包括深部静脉血栓症和静脉曲张的并发症；和
14.肿瘤学：普通肿瘤的治疗包括前列腺，乳房，肺，卵巢，胰脏，肠和结肠，胃，皮肤和脑的肿瘤和恶性的作用于骨髓(包括白血病)和淋巴组织增生系统的肿瘤，像何杰金(氏)淋巴瘤和非何杰金(金)淋巴瘤；包括预防和治疗(肿瘤)转移性疾病和肿瘤再生，和肿瘤伴随综合征。
本发明显示的关于结合和中和IL-1R1的数据从而显示本发明的结合成员可以被用于治疗或预防这样的紊乱，包括降低紊乱的严重性。因此本发明提供了治疗或降低本文所述任意紊乱的至少一种症状的严重性的方法，所述方法包括向需要的患者施用分离的或以与另外一种适当药剂的联合治疗方案的形式的有效量的一种或多种本发明结合成员，所述另外一种适当药剂为本领域所已知的或本文所描述的降低任意上述紊乱的至少一种症状严重性的药剂。
本发明结合成员可以被用于疾病的适当的动物或动物模型中，特别是猴子。
这样本发明结合成员被用于作为治疗与IL-1R1相关的如IL-1R1生成、表达和/或活性、特别是异常生成、表达、或活性的疾病或紊乱的治疗剂。治疗方法包括向需要的患者施用有效量的本发明结合成员，因此降低IL-1R1的生成、表达和/或活性。治疗方法包括(i)例如使用以上所述的诊断方法，确认患者显示IL-1R1或IL-1水平或其活性的升高，(ii)向患者施用有效量的本发明结合成员，其中，升高的IL-1R1的生成、表达和/或活性被降低了。可选择的治疗方法包括(i)确认IL-1R1介导活性没有显著增加，但其被认为是受益于施用本发明结合成员的患者，和(ii)向患者施用有效量的本发明结合成员。本发明有效量为降低升高的IL-1R1的生成、表达和/或活性以降低或减少被治疗特定疾病或紊乱的严重性、但不一定治愈该疾病或紊乱的量。
本发明还提供拮抗IL-1R1的至少一种作用的方法，所述方法包括接触或施用有效量的一种或多种本发明结合成员，使得所述IL-1R1的至少一种作用被拮抗。通过本发明方法拮抗的IL-1R1的作用包括IL-1α和/或IL-1β介导的生物应答，和出现的作为这些结合反应结果的任意的下游作用。
因此、本发明的进一步方面提供了分离的结合成员如抗体、VH结构域或VL结构域在制造用于治疗与本文所讨论的IL-1R1有关的或IL-1R1介导的紊乱的药剂的应用。这样的药剂或药物组合物的应用或其制备方法包括将结合成员与药学可接受的赋形剂进行配制。
药学可接受的赋形剂可以是形成药物组合物的化合物或化合物的联合，所述组合物不会导致二次反应、并允许例如有助于施用活性化合物，提高其在体内的寿命和/或功效，提高其在溶液中的溶解性或其他的储存方面的改善。这些药物可接受的赋形剂为熟知的、且被本领域技术人员认知作为所选择活性化合物的施用模式和属性的功能。
本发明结合成员将经常以药物组合物的形式被施用，所述药物组合物可以包含除结合成员以外的至少一种组分。本发明这样的药物组合物，和根据本发明的应用，可以包含除活性成分之外的药物可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他本领域所述知的材料。这样材料应是无毒的，且应不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切的属性将取决于施药路线，其可以是口服的、吸入的、气管内的、局部的、囊内或通过注射，如以下所讨论的。
口服给药的药物组合物，例如单结构域抗体分子(如“nanobodiesTM”)等也被设计在本发明中。这样的口服配方可以是片、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片可以包含固体载体、如凝胶或助剂。液体药物组合物通常包含液体载体、如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液、葡萄糖、或其他糖类溶液或乙二醇，如可以包括乙稀乙二醇、丙烯乙二醇或聚乙烯二醇。
对于静脉注射或在痛苦的部位注射，活性成分将是胃肠道外可接受的水溶液的形式，所述溶液为无热源和适宜的pH、等渗和稳定。这些本领域相关的技巧能够很好地制备适宜的溶液，使用例如等渗载体、如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧剂和/或根据需要可以使用的其他添加剂包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他的有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯氨、苄索氯铵、苯酚、丁基或苄基醇、烷基对羟基苯甲酸甲酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸甲酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3’-戊醇、和m-甲酚)；低分子重量多肽；蛋白，如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露醇或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反粒子、如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM、或聚乙烯乙二醇(PEG)。
本发明结合成员可以被配制成液体、半固体或固体形似，这取决于分子的理化性质和运载途径。配方可以包括赋形剂，或赋形剂的组合物，例如糖、氨基酸和表面活性剂。液体配方可以包括宽范围的抗体浓度和pH。固体配方可以通过例如冻干、喷雾干燥或超临界流体技术干燥生成。抗-IL-1R1的配方将取决于预订的运载途径：例如，适于肺运载的配方可以由具有一旦吸入确保渗透入深部肺的物理性质的颗粒组成。局部用的配方(如用于伤痕的治疗，如皮肤疤痕)可以包括粘度改性剂，所述粘度改性剂可以延长药物在作用部位的停留时间。可以用保护抗体成员不快速释放的载体制备结合成员，如控释配方，包括植入体、透皮帖、和徼囊运载系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样配方的方法已为本领域技术人员所知[65]。
抗IL-1R1治疗可以口服(例如单结构域抗体分子(如“nanobodiesTM”)、注射(例如皮下、关节内、静脉内、腹腔内、动脉内或肌肉内)、吸入、气管内、微囊内途径(滴注进膀胱)，或局部(例如，眼睛内、鼻内、直肠、进入伤口、皮肤上)。所述治疗可以通过脉冲灌注、特别地用降低剂量的结合成员。施药途径取决于治疗的理化特征，用于疾病的特定考虑或优化功效或最小化副作用的需要。一个特别的施药途径为静脉内。本发明施用药物组合物的另一个途径为皮下。设想抗IL-1R1的治疗不受限地用于临床。因此，施用无针设备的皮下注射也是有利的。
静脉配方的离子包括：
25mM组氨酸；
120mM氯化钠；
pH 6.0。
用于IL-1R1结合成员或含有用于IL-1R1结合成员的组合物可以用作与其他药物组分的联合治疗的一部分。联合治疗可以被用于提供显著协同效应，特别是抗IL-1R1结合成员与一种或多种其他药物的联合。用于IL-1R1的结合成员可以同时或先后或作为与另一种治疗剂或治疗剂类的联合制剂被施用，以用于治疗本文所列的一种或多种的状况。
本发明结合成员可以被配制和/或与其他可用的IL-1R1介导疾病的治疗联合使用，所述疾病如气道阻塞性疾病、哮喘、和过敏紊乱，或涉及IL-1R1介导作用的其他紊乱。
本发明结合成员可以被提供用于分离地治疗或联合或加入以下一种或多种药剂：
-细胞因子或细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如作用于细胞因子信令通道的药剂，例如SOCS系统的调节剂)，例如α-、β-或γ-干扰素；胰岛素样生长因子I型(IGF-1)，其受体和相关的结合蛋白类；白细胞介素(IL)，例如一个或多个的IF-2到-33和/或白细胞介素拮抗剂或抑制剂，例如阿那白滞素；白细胞介素家族成员受体的抑制剂或这种受体的特异性亚单元的抑制剂，肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂，例如抗TNF抗体单克隆抗体(例如英夫利昔单抗，阿达木单抗或CDP-870)和/或TNF受体的拮抗体，例如免疫球蛋白分子(像依那西普)和/或低分子量药剂，例如乙酮可可碱；
-B细胞的调节器，例如单克隆抗体靶向B-淋巴细胞(如CD20(利妥昔)或MRA-AIL16R)或T-淋巴细胞(例如CTLA4-IG、HuMax I1-15或阿巴西普)；
-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如，抗RANKL的抗体；
-趋化因子或趋化因子受体运行的调节剂，像CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11(C-C家族)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5和CXCR6(C-X-C家族)和C-X3-C家族的CX3CR1；
-基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂，如一个或多个基质溶解素类，胶原酶类和明胶酶类和聚蛋白多糖酶，特别是胶原酶-1(MMP-1)，胶原酶-2(MMP-8)，胶原酶-3(MMP-13)，基质溶解素-1(MMP-3)，基质溶解素-2(MMP-10)，基质溶解素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12例如药剂像强力霉素；
-白三烯生物合成抑制剂，5-脂氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂，例如弃白通；ABT-761；芬留顿；替泊沙林；阿伯特-79175；阿伯特-85761；N-(5-取代)-噻酚-2-烷基磺酰胺类；2，6-二叔丁基苯腙；甲氧基四氢吡喃例如泽尼卡ZD-2138；化合物SB-210661；吡啶基-代替的2-萘甲腈化合物，例如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，例如L-746,530；哚吲和/或喹啉化合物，例如MK-591，MK-886和/或BAYx1005；
-白三烯的受体拮抗剂(LT)B4、LTC4、LTC4、和LTE4，选自由以下组成的组：吩噻嗉-3-1例如L-651,392；脒基化合物，例如CGS-25019c；benzoxalamines，例如昂唑司特；苯甲脒例如BIIL284/260；和化合物，例如扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、RO-245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYx7195；
-磷酸二脂酶(PDE)抑制剂，例如甲基黄嘌呤，如茶碱和/或氨茶碱；和/或选择PDE同功酶的抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或亚型PDE4D的抑制剂和/或PDE5的抑制剂。
-组胺类型1受体的拮抗剂，例如西替立嗪，氯雷他定，地氯雷他定，非索非那定，阿伐西汀，特非那定，阿司咪唑，氮卓斯汀，左卡巴司汀，氯屈米，普鲁米近，苯甲嗪，和/或米唑斯汀(通常口服、局部或非胃肠道施用)；
-质子泵抑制剂(例如奥美拉唑)或胃肠道保护组胺类型2受体拮抗剂；
-组胺类型4受体拮抗剂；
-α-1/α-2肾上腺素受体激动剂血管收缩的拟交感神经的药剂，例如六氢脱氧麻黄碱，苯肾上腺素，苯丙醇胺，麻黄碱，伪麻黄碱，盐酸萘唑啉，盐酸氧甲唑啉，盐酸四氢唑啉，盐酸塞洛唑啉，盐酸萘胺唑啉和盐酸乙基去甲肾上腺素；
-抗胆碱能药，例如毒覃碱性受体(M1、M2和M3)拮抗剂，例如阿托品，东莨菪碱，吡咯糖，异丙托溴铵，噻托溴铵，氧托溴铵，哌仑西平和替仑折平；
-β-肾上腺素能受体激动剂(包括β受体亚型1-4)，例如异丙(氢)肾上腺素，舒喘宁，福莫特罗，沙美特罗，间羟叔汀，间羟异丙，双甲苯喘定甲磺酸盐和吡布特罗，如其手性对映体；
-色酮，例如咳乐钠和/或奈多罗米钠；
-糖(肾上腺)皮质激素，例如氟尼缩松，曲安奈德，二丙酸倍氯米松，布地缩松，丙酸氟替卡松，环索奈德，和/或莫米松糠酸酯；
-调节核激素受体的药剂，例如PPAR；
-免疫球蛋白(Ig)或Ig制剂或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，例如能够结合相同或不同表位的抗-IL-1R1如本发明结合成员；
-其他的全身或局部施用抗炎剂，例如镇静剂或其衍生物，类维生素A，蒽三酚和/或钙泊三醇；
-氨基水杨酸和磺胺嘧啶的组合，例如硫氮磺胺吡啶，5-氨基水杨酸，巴沙拉嗪，和偶氮水杨酸；和免疫调节剂，例如巯嘌呤；和皮质甾类，例如布地缩松；
-抗菌剂例如青霉素衍生物，四环素(类)，大环内酯，β-内酰胺，和氟喹诺酮，甲硝哒唑和/或吸入的氨基糖苷类；和/或抗病原体剂，例如阿昔洛韦，泛西洛维，缬昔洛韦，更昔洛韦，西多福韦，金刚(烷)胺，金刚烷乙胺，三(氮)唑核苷；扎那米韦和/或奥塞米韦；蛋白酶抑制剂，例如印地那韦，那非那韦，利托那韦和/或沙奎那韦；核苷类逆转录酶抑制剂，例如地达诺新，拉夫定，司他夫定，扎西他宾，齐多呋定；非核苷类逆转录酶抑制剂，例如奈韦拉平，依法韦仑；
-心血管剂，例如
1)抗脂代谢紊乱剂例如，HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀类药物)；PPARa激动剂(贝特类，例如二甲苯氧庚酸)；胆酸螯合剂(消胆胺)；胆固醇吸收抑制剂(植物甾烷醇，合成抑制剂)；胆汁酸吸收抑制剂(IBATi)和烟酸和类似物(烟酸和缓释制剂)；
2)抗高血压剂例如，β阻断剂(氨酰心安，心得安)；ACE抑制剂(例如赖诺普剂)；钙拮抗剂(例如硝苯吡啶)；血管紧张素受体拮抗剂(例如坎地沙坦)，拮抗剂和利尿剂(例如利尿磺胺，苄噻嗪)；
3)止血法调节剂例如，抗血栓药，纤维蛋白溶解的活化剂和抗凝剂；凝血酵素拮抗剂；Xa因子抑制剂；因子VII抑制剂；抗凝剂(例如阿司匹林，氯吡格雷)；抗凝[血]剂(肝磷酯和低分子量类似物，水蛭素)和杀鼠灵；
4)拮抗胰高血糖作用的药剂；和
5)抗炎剂，例如非甾体的抗炎药(例如阿司匹林)和甾体抗炎药(例如可的松)；
6)血细胞形态学的调节剂，例如己酮可可碱；
-抗糖尿病剂例如；
1)胰岛素和胰岛素类似物；
2)胰岛素促分泌的包括磺脲(例如格列本脲，格列甲嗪)，膳食葡萄糖的调节剂(包括瑞格列奈，那格列奈)；
3)改良肠促胰岛素的药剂(例如二肽基肽酶IV抑制剂如沙格列汀，西他列汀或维格列汀或阿洛利汀和GLP-激动剂)；
4)胰岛素增敏剂包括PPARγ激动剂(例如匹格列酮和罗西格列酮)，和PPARα和γ活性联合的药剂；
5)调整肝脏葡萄糖平衡的药剂(例如甲福明二甲双胍，果糖1，6二磷酸酶抑制剂，肝糖磷酸化酶抑制剂，肝糖合成酶激酸抑制剂)；
6)设计为减少从肠道吸收葡萄糖的药剂(例如阿卡波糖)；
7)防止通过肾葡萄糖重吸收的药剂(SGLT抑制剂)；
8)设计治疗持久性高血糖并发症的药剂(例如醛糖还原酶抑制剂)；
-减肥药剂，例如去甲肾上腺素/血清素非选择性再摄取的抑制剂。
-中枢神经系统的药剂，例如抗抑郁剂(例如舍曲林)，抗帕金森氏病(例如苄甲炔烷，L-左旋多巴，平罗尼咯，普拉克索；MAOB抑制剂，例如selegine和雷沙吉兰；comp抑制剂，例如托卡朋；A-2抑制剂，多巴胺再摄取抑制剂，NMDA拮抗剂，尼古丁激动剂，多巴胺激动剂和/或神经元型一氧化氮合酶抑制剂)和抗老年痴呆病，例如多奈哌齐，利凡斯的明，塔克林，COX-2抑制剂，丙戊茶碱或美曲磷酯；
-治疗急慢性疼痛的药剂，例如中枢神经和周边神经产生影响的镇痛剂，例如类鸦片类似物或衍生物，酰胺咪嗪，苯妥英，丙戊酸钠，阿米替林或其他的抗抑郁剂，扑热息痛，或非甾体抗炎剂；
-肠道外给药或局部施用(包括吸入的)局部麻醉剂药物，例如利多卡因或其类似物；
-抗骨质疏松剂，例如激素类的药物，例如雷洛昔芬，或双磷酸酯，如阿伦磷酸盐；
-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗剂；(iii)白细胞介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶的抑制剂(例如Btk、Itk、Jak3MAP抑制剂的例子可以包括吉非替尼，甲磺酸伊马替尼)，丝氨酸/蛋白(质)丝氨酸激酶(例如MAP激酶的抑制剂，例如p38、JNK、蛋白激酶A、B和C和IKK)，或涉及细胞周期调节的激酶(例如周期素依赖性激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽B1和/或B2受体拮抗剂；(x)抗痛风剂药物例如秋水仙碱；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌呤醇；(xii)促尿酸尿剂，例如丙磺舒，苯磺唑酮，和/或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子(TGFβ)；(xv)血小板衍生的生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞成长因子(bFGF)；(xvii)粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒辣素软膏；(xix)速激肽NK1和/或NK3受体拮抗剂，例如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或(xxiii)被表达在TH2细胞上的化学引诱物受体同源分子(例如CRTH2拮抗剂)(xxiv)调节Toll样受体(TLR)功能的P38(xxv)药物的抑制剂和(xxvi)调节嘌呤受体活性的药剂，例如P2X7；(xxvii)转录因子激活的抑制剂，例如NFKB，API，和/或STATS.
本发明合作成员还提供分离治疗或与常规外科手术或放射治疗或肿瘤化疗剂联合的治疗。这样的肿瘤化疗剂可以包括以下类的一种或多种抗肿瘤剂：
(i)其他的抗增殖/抗肿瘤药和其联合，被使用在内科肿瘤学上，像烷化剂(例如顺铂，奥沙利铂，卡铂，环磷酰胺，氮芥，(左旋)苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，二甲磺酸丁酯，替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如吉西他滨和拮抗剂例如氟嘧啶如5氟脲嘧啶和喃氟啶，雷替曲赛，甲氨蝶呤，阿糖胞甙，和羟基脲)；抗肿瘤的抗生素(例如蒽环霉素如阿霉素，博来霉素，阿霉素，道诺霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，丝裂霉素C，更生霉素和米拉霉素)；抗有丝分裂剂(举例长春花生物碱如长春新碱，长春碱，去乙酰长春酰胺和长春瑞滨和紫杉化合物如紫杉酚和素索帝polokinase抑制剂)；和拓扑异构酶抑制剂(举例表鬼臼毒素如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和表鬼臼毒噻吩糖苷，安丫啶，托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂例如抗雌激素(作用)药(例如三苯氧胺，氟维司群，托瑞米芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬和碘昔芬)，抗雄激素(如比卡鲁胺，氟他米特，尼鲁米特和环丙氯地孕酮)，LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(如戈舍瑞林，亮丙瑞林和乙基酰胺)，孕激素类(如甲地孕酮)，芳香酶抑制剂(如阿纳托(司)唑，来曲唑，伏氯唑和依西美坦)和5α-还原酶例如非那司提；
(iii)抗侵染剂[例如c-Src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2，3-二氧甲叉基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基二氧喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO 01/94341)、N-(2-氯-6-甲苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基)噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼(dasatinib)，BMS-354825；J.Med.Chem，2004，47，6658-6661)和伯舒替尼(bosutinib)(SKI-606)，和金属蛋白酶抑制剂如马马司他，尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能抑制剂或类肝素酶的抗体；
(□)增长因子功能抑制剂：例如这样的抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体的抗体(例如抗-erbB2抗体曲妥单抗[HerceptinTM]，抗-EGFR抗体潘尼单抗，抗-erbB1抗体西妥昔单抗[爱必妥，C225]和Stern等人Critical reviews in oncology/haematology，2005，Vol.54，pp11-29所公开的任意生长因子或生长因子受体抗体；这样的抑制剂都包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄罗替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033)，erbB2酪氨酸激酶抑制剂例如拉帕替尼)；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；血小板衍生生长因子家族的抑制剂例如伊马替尼和/或尼罗替尼(AMN107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂，(例如Ras/Raf信令抑制剂例如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(BAY 43-9006)，替吡法尼(tipifarnib)(R115777)和洛那法尼(lonafarnib)(SCH66336))，细胞信令传导的抑制剂穿过MEK和/或AKT激酶，c-kit抑制剂，abl激酶抑制剂，PI3激酶抑制剂，P1t3激酶抑制剂，CSF-1R激酶抑制剂，IGF受体(胰岛素样生长因子)激酶抑制剂；极光激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和周期蛋白依赖激酶抑制剂例如CDK2和/或CDK4抑制剂；
(□)抗血管增生剂例如那些对血管内皮增生因子有抑制作用的[例如抗血管内皮细胞增长因子抗体贝伐单抗(AvastinTM)和例如VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂例如凡德他尼(ZD6474)，瓦拉他尼(PTK787)，舒尼替尼(SU11248)，阿西替尼(AG013736)，帕唑替尼(GW786034)和4-(4-氟-2-甲基哚吲-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212中的实施例240)，例如在国际专利申请WO97/22596，WO97/30035，WO97/32856和WO98/13354所公开的那些化合物和通过其他机理起作用的化合物(例如利诺胺，整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管增生抑制素)]
(□)血管损伤剂例如考布他汀A4和在国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213所公开的化合物；
(□)内皮素受体拮抗剂，例如zibotentan(ZD4054)或阿曲生坦；
(□)反义疗法，例如那些被导向以上所列靶向的如ISIS 2503、反义原癌基因抗体(anti-ras antisense)；
(□)基因治疗方法，包括例如替换异常基因的方法，例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2、GDEPT(基因导向酶前体药物治疗)方法，如使用胞嘧啶脱氧酶，胸苷激酶或细菌的硝基还原酶的那些方法和提高病人忍受化学疗法或放射线疗法的方法，例如多药耐药的基因疗法；
(□)免疫疗法的方法，包括例如提高肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，例如细胞因子转染例如白细胞介素2，白细胞介素4或粒-巨噬细胞集落刺激因子，降低T-细胞无反应力的方法，使用转染免疫细胞的方法例如细胞因子转树状突细胞，使用细胞因子转染肿瘤细胞系的方法和使用抗独特型抗体。
抑制剂可以是特异性的或者混合的抑制剂，例如抑制剂的靶向以上所提到的一种以上的分子或(例如受体)分子类。
结合成员还能被用于与化学治疗剂联合，如酪氨酸激酶抑制剂共施用或以免疫耦联物的形式。所述抗体的片段还能被用于通过重组机制或生化耦合获得的双特异性抗体，然后联合以上所描述的带有其他抗体的特异性的抗体的特异性，以能识别涉及用于与IL-1R1相关的活性的其他分子。
炎性疾病的治疗，例如风湿性关节炎，骨关节炎，哮喘，过敏性鼻炎，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，或牛皮癣，本发明的结合成员可以联合一种或多种药物，例如非类固醇抗炎剂(下文中的NSAID)包括能够全身或局部施用的非选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂，例如吡罗昔康，双氯高灭酸，丙酸，例如甲氧萘丙酸，氟联苯丙酸，非诺洛芬，苯酮苯丙酸，和异丁苯丙酸，灭酸(的)酯类，例如甲灭酸，消炎痛，舒林酸，阿扎丙酮，吡唑啉酮，例如苯基丁氮酮，水杨酸盐，例如阿斯匹林)；选择性的COX-2抑制剂(例如美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumarocoxib、帕瑞考昔和艾托考昔)；环加氧酶一氧化氮供体(CINOD)；糖皮质激素(通过局部，口服，肌肉内，或静脉内或关节内途径施用)；甲氨蝶呤，来氟米特，羟化氯喹，D-青霉胺，金诺芬或其他的肠胃外或口服金制剂；镇痛药，双醋瑞因；关节内治疗，例如透明质酸的衍生物；和营养补充物，例如葡(萄)糖胺。
本发明的结合成员与一种或多种的上述另外的药物组分用于药剂的制造中。所述药剂可以分离地或联合地向个体施用，并以此可以包含结合成员和另外的组分作为联合制剂或分离的制剂。使用分离的制剂以促进单独地和按顺序地或同时地施用，并允许以不同的途径的施用组分，如口服和胃肠外施用。
根据本发明，所提供的组合物可以被用于向哺乳动物施用。施用通常是以“治疗有效量”的方式，这足以对患者显示益处。这样的益处可以是至少改善至少一种症状。实际施用的量、比率和时程将取决于被治疗的性质和严重性，特别是被治疗的哺乳动物、个体患者的临床情况、紊乱的原因、组合物运载的部位，结合成员的类型、施用方法、施用的日程和医生所知道的其他因素。治疗的处方，如剂量的决定、由全科医生和其他医生负责，并取决于症状的严重性和/或所治疗疾病的等级。抗体的适当剂量为本领域已知[66，67]。可以使用本文中或适于所施用药物的类型的医生案头手册(2003)中显示的具体剂量。通过动物模型中体外活性和体内活性的对比可以决定本发明结合成员的治疗有效量或合适剂量。由小鼠或其他测试动物的有效剂量推算到人的方法是已知的。精确剂量将取决于多种因素，包括抗体是否是用于诊断、预防或用于治疗，被治疗区域的大小和位置，抗体的确切属性(如整个抗体、片段或双链抗体)和任意可检测标记或结合到抗体的其他分子的性质。通常全身应用的典型的抗体剂量将在100μg-1g的范围内，局部应用的为1μg-1mg。可以施用开始时的更高负载剂量、接下来可以施用一种或多种更低的剂量。通常抗体将是整个抗体，如IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、或IgG4同型。这是单一治疗成人患者的剂量，对于儿童和幼儿可以按比例调整，对于其他抗体格式按分子重量的比例调整。在医生的判断下，所述治疗可以按天、每周两次、周或月的间隔重复。治疗可以使每2-4周皮下施用、每4-8周静脉内施用。治疗可以是周期的，施药之间的周期为约两周或更多，如约三周或更多、约4周或更多，或约一月一次。可以在手术前和/或手术后给予治疗，和/或直接在外科手术治疗的解剖部位进行施药或应用。
本发明结合成员还具有诊断的用途，例如用于检测诸如气道阻塞性疾病或其他与IL-1R1有关的炎性紊乱的样本患者中的IL-1R1的存在或数量。这样的诊断用途可以涉及本发明的标记结合成员。
本发明结合成员可以用可检测的或功能性的标记进行标记。这样结合成员或抗体分子以免疫耦联物的形式存在以获得可检测和/或量化信号。免疫耦联物可以包括与可检测的或功能性的标记耦联的本发明抗体分子。标记可以是产生或被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光剂、放射标记、酶、化学发光体、或光敏剂。这样，结合物可以通过检测荧光或发光、放射活性、酶活性或光的吸收而被检测和/或测量。
适宜的标记包括，以举例的方式而不受到限制：
-酶，如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化酶如辣根过氧化酶；
-染料
-荧光标记或荧光剂，如荧光素及其衍生物、荧光燃料、罗丹名化合物及其衍生物、GFP(GFP用于“绿色荧光蛋白”)、丹黄酰、伞形花内酯、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝素、邻苯二甲醛、和荧光胺、荧光团如镧穴状化合物(cryptates)和螯合剂，如铕等(Perkin Elmer和CisBiointernational)；
-化学发光标记或化学发光剂，如异鲁米诺、鲁米诺、和二氧丁环；
-生物发光剂、荧光素酶和荧光素；
-感光剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射标记包括但不限于溴77、碳14、钴57、氟8、镓68、氢3(氚)、铟111、铟113、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、贡107、贡203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、钇199和本文所提到的其他放射性标记；
-颗粒，如乳胶或碳颗粒、金属溶胶、结晶、脂质体、细胞等、其中进一步被燃料、催化剂或其他可检测的基团的标记；
-分子如微生素、地高辛、或5-溴去氧尿苷；
-毒素基，如例如选自由以下组成组的毒素基：绿脓杆菌外毒素(PE或细胞毒素的片段或其变异体)、白喉毒素或细胞毒素片段或其变异体，肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒素或其细胞毒素片段，如毒素A或其细胞毒素片段、肥皂草毒素(saporin)或其细胞毒素片段、商路抗病毒毒素或其细胞毒素片段和异根泻根毒蛋白-1(bryodin 1)或其细胞毒素片段。
适宜的酶和辅酶为Litman等人US 4,275,149所公开的；和Boguslaki，等人US4318980，它们中的每个通过引用的方式全部并入本文。适宜的荧光剂和化学发光剂被公开在Litman等人，US4275149，其通过引用的方式全部并入本文。标记进一步包括化学基团，如维生素可以通过结合到特异性同源可检测基团而被检测，如标记的抗生物素蛋白或链霉亲合素。使用本领域已知的常规的化学法将可检测的标记可以结合到本发明抗体。
免疫耦合或其功能性片段可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。它们被直接地或通过间隔基团或连接基团的中间物，如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺戊乙酸(DPTA)、或在耦合剂存在下，如以上所提到的用于治疗耦合的那些，而结合到酶或荧光标记。包含荧光剂类型的耦合物通过与异硫氰酸酯反应而被制备。
存在用于结合治疗放射性同位素直接地或通过以上所提到的诸如EDTA、DTPA的螯合剂结合到抗体的本领域技术人员已知的方法可以用于放射性元素，所述放射性元素可以被用于诊断。同样是可能的，通过氯胺T方法[68]用钠125进行标记、或其他的通过Crockford等人(US4424200，其通过引用的方式全部并入本文)的技术用锝进行标记、或通过Hnatowich(US4,479,930，其通过引用的方式全部并入本文)公开的通过DTPA的结合。
通过外手段检测能够产生信号的标记的方法有很多，如通过目视检查、目视检查、电磁辐射、加热和化学试剂。标记还可以被结合到另一种结合成员上，所述结合成员结合到本发明抗体或到载体上。
标记能够直接产生信号，并因此，另外的组分不需要产生信号。大量的有机分子，如荧光剂能够吸收紫外光或可视光，其中光吸收转移能量到这些分子，并将它们提升到激发能量状态。这种所吸收的能量通过在第二波长的光释放然后被分散。第二波长发射还可以转移能量到所标记的受体分子，通过如荧光共振能量转移(FRET)的光发射方式，所得的能量从受体分子发散。直接产生信号的其他标记包括放射性同位素和染料。
可选择地，标记可以需要其他组分以产生信号，且信号产生系统将包括需要产生可测量信号的所有组分，其中可以包括底物、辅酶、增效剂、另外的酶、能与酶产物反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子，和需要结合信号生成物质的特异性结合物质。适宜的信号产生系统的详细讨论可以被发现在通过引用的方式全部并入本文的Ullman等人US 5,185,243中。
本发明提供了包括致使或允许本文所提供的结合成员结合到IL-1R1的方法。正如指出的，这样的结合可以在体内发生、如在施用结合成员或编码核酸到人或动物(如哺乳动物)之后，或可以发生在体外，例如在ELISA，免疫印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀反应、亲和层析、和生化或细胞基的分析中。
通常，本发明结合成员和IL-1R1之间的结合物的检测可通过尤其是酶联免疫法、放射分析法、免疫沉淀法、荧光免疫分析法、化学发光分析法、免疫印迹分析法、侧流分析法、凝聚分析法和离子基础分析法。
本发明还提供了通过使用本发明结合成员在例如生物传感器系统中直接测量抗体的水平。例如，本发明包括检测和/或测量结合到IL-1R1的方法，所述方法包括(i)暴露所述结合成员到IL-1R1和(ii)检测所述受体成员到IL-1R1的结合，其中使用任何的本文所述的任意方法或可检测标记来检测结合。这种方法和本文所描述的任意其他结合检测方法可以通过操作该方法的人员进行直接地解读，例如，通过可视地观察可检测标记。可选择地，该方法，或本文所描述的任意其他的结合检测方法，可以生成报告的形式为自动放射成像，照片、计算机打印输出、流体细胞计量报告、图、表、含有结果的试管或容器或孔，或该方法结果的任意其他的可视的或物理的表示。
可以检测结合成员到IL-1R1的结合量。该量可以是相对于测试样品中抗原的量，其为诊断目标。筛选IL-1R1结合和/或其量可以用于例如筛选本文所指疾病或紊乱的和/或与异常的IL-1R1生成、表达和/或激活相关的任意其他疾病或紊乱的患者。
本发明诊断方法可以包含(i)获得受试者的组织或液体样品，(ii)暴露所述组织或液体样品到本发明的一种或多种结合成员；和(iii)检测结合的IL-1R1与对照样品进行对比，其中与对照进行对比的IL-1R1结合量的增加显示IL-1R1的生成、表达或激活的异常水平。被检测的组织或液体样品包括血液、血清、尿、活检材料、肿瘤或怀疑含有异常IL-1R1水平的任意组织。测试为异常IL-1R1水平或活性的阳性的受试者还可以受益于本文以后公开的治疗方法。
本发明诊断方法可以进一步包括通过固定化抗原捕获结合成员与IL-1R1的复合物。例如，抗原可以被固定在侧试条试样上(lateral stripassay)用于捕获相关样品中的抗原特异性IL-1R1。
在本文所公开方法的启示下，根据他们的喜好和常识，本领域技术人员能够选择测定结合成员到抗原的结合的适宜模型。
样品中结合成员的反应可以通过任意适当的方式进行测定。放射免疫检测法(RIA)是一种可能。放射活性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)进行混合，并使之结合到结合成员。将结合抗原从非结合抗原中物理地分离，检测结合到结合成员的放射性抗原的量。测试样品中存在的抗原越多，结合到结合成员的放射活性抗原将越少。竞争性结合分析法还可以使用非放射抗原、使用链接报告分子的抗原或类似物。报告分子可以是荧光染料、磷或带有光谱的单独地吸收或散射特征的激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹名、藻红蛋白和Texas Red、和镧螯合剂或穴状化合物。适宜的显色染料料包括二氨联苯铵。
其他的报告体包括大分子胶体颗粒或颗粒材料，如彩色的、磁性的或顺磁的乳胶球、能够直接或间接使可检测信号被可视地观察、电子检测或其他被记录的生物或化学的活性成分。这些分子可以是酶，例如其催化反应以形成或改变颜色或导致电子性质的变化。它们是分子地易激发的，以致能量状态间的电子迁移形成特征光谱吸收或发射。它们可以包括用于与生物传感器结合的化学实体。可以使用微生素/抗生素蛋白或维生素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。
由个体结合成员-报告体生成的信号可以被用于衍生样品中(正常和测试)相关结合成员的结合的可量化的绝对或相对数据。
本发明的一个方面还提供包含根据本发明任意方面或实施方案的结合成员的药剂盒。在药剂盒中，结合成员可以被标记以使其在样品中的反应以被检测，如以下更详细的描述。进一步，结合成员可以附加到或不附加到固体载体。药剂盒的组分通常是灭菌的并在密封的小瓶或其他容器中。试剂盒可以被用于诊断分析或使用结合成员的其他方法。药剂盒可以含有在方法中使用组分的指示，如本发明的方法。辅助或能够实施这样方法的辅料可以被包括在本发明试剂盒中。辅料包括与第一种结合成员结合的，并被共轭到可检测标记(荧光标记、放射活性同位素或酶)上的第二种不同的结合成员。抗体基的药剂盒还可以包括用于进行免疫沉淀的小球。药剂盒的每种组分通常在其自己适合的容器内。这样，这些药剂盒通常包括适于每种结合成员的不同的容器。进一步，该药剂盒可以包含进行分析的指示和用于解释和分析实施分析所得数据的方法。
本发明还提供了以上结合成员的用途，用于测量竞争分析中抗原的水平，就是说，在竞争分析中，通过使用本发明所提供的结合成员来测量样品中抗原水平的方法。这可以是不需要结合抗原从非结合抗原中的物理性分离。连接报告分子到结合成员以便结合上发生物理或光学变化是一种可能。报告分子可以直接或间接产生可检测信号，其可以是可量化的。报告分子的连接可以直接的或间接地、共价的，如通过肽键或非共价键地。通过肽键的连接可以作为基因融合编码抗体和报告分子的重组表达的结果。
在一实施方案中，本发明包括鉴定IL-1R1结合化合物的方法，所述方法包括(i)固定IL-1R1到载体，(ii)用至少一种被标签或标记的本发明结合成员和一种或多种未被标签或标记的测试结合化合物同时或逐步地接触所述固定的IL-1R1，和(iii)通过观察被标签结合成员的结合标签的数量的降低方式来鉴定新的IL-1R1结合化合物。这样的方法可以使用多井或阵列格式以高通量的方式进行。这样的分析可以在溶液中进行。参见，例如US5,814,468，其通过引用方式全部并入本文。如以上所述，结合的检测可以通过人员实施该方法进行直接地说明，例如，通过可视地观察可检测标记，或其存在的降低。可替换地，本发明结合成员可以生成的报告形式为自动放射成像，照片、计算机打印输出、流式细胞计量报告、图、表、含有结果的试管或容器或孔，或该方法结果的任意其他的可视的或物理的表示。
本发明进一步提供了编码本发明结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一实施方式中，本发明提供了编码用于本发明CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子如scFv或IgG1的核酸。
进一步方面，本发明提供了分离的核酸，所述核酸包含编码本发明结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列。例如本发明的SEQ ID NOS：92、2、122、102、12、62、22、32、72、42、112、52和82编码示例VH结构域，和本发明的SEQ ID NOS：97、7、127、107、17、67、27、37、77、47、117、57和87编码示例VL结构域。
本发明还提供质粒、载体、转录或表达框式形式的构建，其包含至少一种如上所述的核酸。
本发明还提供包含一种或多种以上构建的重组宿主细胞，并提供编码产物的生产方法，所述方法包括从所述编码构建的表达。表达可以通过在适当条件下培养含有构建的重组细胞而方便地实现。接下来通过表达VH或VL结构域或结合成员的进行生产，使用任意适当的技术可以分离和/或纯化结合成员，然后适当地被使用。
本发明核酸可以包含DNA或RNA并可以全部或部分地合成。参考以下所列出的核苷序列用特定的序列包裹DNA分子，用U取代T的特定序列包括RNA分子，除非内容有其他要求。
还是进一步的方面提供了生成抗体或VH变异结构域的方法，所述方法包括使编码核苷酸表达。这样的方法可以包括在所述抗体VH变异结构域生成的条件下培养宿主细胞。
用于生成VL变异结构域和结合成员如抗体的类似方法包括提供VH和/或VL结构域作为本发明的另一方面。
生成方法可以包括产物的分离和/或纯化的步骤。生成方法可以包括将产物配制成组合物，所述组合物包括至少一种其他成分，如药学可接受的赋形剂。
用于在各种不同宿主细胞克隆或表达多肽的系统是熟知的。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母、杆状病毒系统和转基因植物和动物。在现有技术中，原核细胞中抗体和抗体片段的表达已被很好地建立。作为回顾，参见例如Plückthum[69]。普通的细菌宿主为大肠杆菌。
培养的真核细胞中的表达还适于本领域技术人员作为生成结合受体的生成的选项[70、71、72]。用于异源肽表达的本领域适用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HELA细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞、和其他的许多。
适宜的载体可以被选择或构建包含适宜的调节序列、包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列，如果适当。载体可以质粒，如噬菌粒、或病毒如噬菌体(‘phage)[73]，如果适当。用于核酸操作的许多已知的技术和方案，例如核酸构建的制备、诱变、定序、DNA进入细胞的引入和基因表达、和蛋白分析，在Ausutal等人[74]中有详细的描述。
本发明另一方面提供了本文所公开的含有核酸的宿主细胞。这样的宿主细胞可以在体外并可以被培养。这样的宿主细胞可以在体内。体内存在的宿主细胞可以允许本发明结合成员的细胞内表达作为“内抗体”或细胞内抗体。内抗体可以用于基因治疗。
本发明还包括制备本发明结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，其包括在引起所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域生成的条件下表达所述核酸，并通过分离或纯化获取所述结合成员。
还进一步的方面提供包含将本发明核酸引入宿主细胞的方法。所述引入可以使用任何适宜的技术。对于真核细胞，适宜的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-糖苷、电穿孔法、脂质介导转染和逆转录酶病毒或其他病毒如牛痘、或用于昆虫细胞，杆状病毒进行的转导。将核酸引入宿主细胞特别是真核细胞可以使用病毒或质粒基系统。质粒系统可以被保持游离地或被并入宿主细胞或人工染色体。并入可以通过在单个或多个位点的一个或多个复制的随机或靶向的整合。对于细菌细胞，适宜的技术可以包括氯化钙转化，使用噬菌体电穿孔或转染。
引入可以按照促使或允许核酸的表达来进行，如在基因表达的条件下培养宿主细胞。表达产品的纯化可以通过本领域已知的方法实现。
本发明的核酸可以被整合入宿主细胞的基因组(如染色体)。根据标准技术，可以通过序列的包含促进整合，所述序列促进与基因重组。
本发明还提供了包括在表达系统中使用以上所述的构建以表达以上结合成员或多肽的方法。
通常，为了制备特别是鼠源的单克隆抗体或其功能片段，可能参考特别在抗体手册中描述的技术[75]或参考Kohler和Milstein[76]中所描述的从杂交瘤制备的技术。
单克隆抗体的获得可以来自，例如从动物免疫抗IL-1R1获得的细胞，或一种其含有被上述单克隆抗体识别的表位的片段。包括它们的适宜片段或多肽可以被用于免疫动物以生成抗IL-1R1的抗体。所述IL-1R1、或其片段的一种能够特异性地被形成是根据通常的工作方法、通过利用编码IL-1R1或其片段的含核酸序列的cDNA序列开始基因重组通过从IL-1R1和/或其片段的含有氨基酸序列的多肽序列开始合成肽。
单克隆体能够例如在亲和性柱上被纯化，在该柱上含有被所述单克隆抗体识别表位的IL-1R1或其一种片段预先已被固定。更特别地，单克隆抗体可以通过蛋白A和/或蛋白G的色谱进行纯化，接着使用或不使用旨在消除残余蛋白污染物和DNA和脂多糖(LPS)的离子交换色谱、其本身而言，接下来使用或不使用消除源于二聚物或其他多聚物的可能凝聚的SepharoseTM凝胶排阻色谱。在一实施方式中，整个的这些技术可以同时或先后使用。
可能采取单克隆或其他抗体，并使用重组DNA技术以生成结合靶向抗原的其他抗体或嵌合分子。这样的技术可以涉及导入DNA编码抗体的免疫球蛋白变异区或抗体的CDR到不同免疫球蛋白的恒定区域，或恒定区加框架区。参见例如EP-A-184187，GB2188638A，或EP-A-239400，和大量随后的文献。生成抗体的杂交瘤细胞或其他细胞可经受基因突变或其他变化，其可以改变或不改变所生成抗体的特异性。
抗体工程的本领域适用的进一步的技术已经使分离人和人源化抗体成为可能。例如，如Kontermann&Dubel[77]所描述的制备人杂交瘤细胞。噬菌体显示，另一已建立的用生成结合成员的技术已被详细地描述在许多公开物中，如Kontermann&Dubel[77]和WO92/01047(以下进一步讨论)，和美国专利US 5,969,108、US 5,565,332、US 5,733,743、US 5,858,657、US 5,871,907、US 5,872,215、US 5,885,793、US 5,962,255、US 6,140,471、US 6,172,197、US 6,225,447、US 6,291,650、US 6,492,160和US 6,521,404。
转基因小鼠可以被用于分离人抗体[78]，所述转基因小鼠的鼠抗体基因被灭活且被人抗体基因功能性地替换，并完整保留小鼠免疫系统的其他组分。可以使用本领域已知的技术生成人源化抗体，如WO 91/09967、US5,585,089、EP 592106、US 5,565,332和WO 93/17105所公开的。进一步，WO 2004/006955描述了人源化抗体的方法，所基于的从人抗体基因选择变异区框架序列是通过将非人抗体的变异区的CDR序列的规范CDR结构类型与来自人抗体序列库的诸如生殖抗体基因片段的对应CDR的规范CDR结构类型进行对比。具有与非人CDR相似的规范CDR结构类型的人抗体变异区形成从中选择人框架序列的亚组成员人抗体序列。亚组成员可以通过人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性进行进一步的排序。在WO2004/006955的方法中，选择排名顶部的人序列以提供用于构建用非人CDR对应物功能性地替换人CDR序列的嵌合抗体的框架序列，其使用的是所选择的亚组成员人框架，并因此提供了具有高亲和性与低免疫源性而无需对比非人和人抗体之间的框架序列的人源化抗体。根据该方法制成的嵌合抗体也已被公开。
可以通过被合成并被装配到适宜表达载体内的核苷酸生成的基因表达来创建合成抗体分子，例如Knappik等人[79]或Krebs等人[80]所描述的。
如上所述，本发明结合成员调节并可以中和IL-1R1的生物活性。如本文所描述的，本发明的IL-1R1结合成员可以被优化以中和效价。通常，效价优化涉及突变所选择结合成员的序列(通常抗体的变异结构域序列)以生成结合成员库，然后进行效价分析，并选择更高效力的结合成员。与来自库中生成的结合成员相比，这样所选择的“效价优化”结合成员趋于具有更高效价。然而，无需优化也可以获得高效价结合成员，例如从初始筛选例如生化中和分析中可以直接获得高效价结合成员。“效价优化”结合成员指带有中和特定活性或下游功能的优化效价的结合成员。分析和效价已在本文别处进行了更为详细的描述。本发明提供了效价优化和非优化的结合成员，和所选择结合成员中的效价优化的方法。这样本发明使技术人员生成具有高效价的结合成员。
虽然效价优化可以被用于从所给定的结合成员中生成更高效价的结合成员。它还提示了无需效价优化也可获得高效价结合成员。
在进一步的方面，本发明提供了获得能够结合抗原的一种或多种结合成员的方法，所述方法包括将本发明结合成员库与所述抗原形成接触，并选择能够结合抗原的一种或多种结合成员。
所述库可以显示在颗粒或分子复合物，如可复制基因包、如酵母、细菌、噬菌体(如T7)颗粒、病毒、细胞或共价的，核糖体，或其他体外可显示的系统，能在其上显示的包含编码抗体VH变异结构域的核酸的每种颗粒或分子复合物。如果存在，任选地还显示VL结构域。噬菌体显示描述在WO 92/010147和如美国专利US 5,969,108、US 5,565,332、US5,733,743、US 5,858,657、US 5,871,907、US 5,872,215、US 5,885,793、US5,962,255、US 6,140,471、US 6,172,197，US6,225,447、US 6,291,650、US6,492,160和US 6,521,404，通过引用方式将它们么一个全部引入本文。
接下来选择能够结合抗原并在噬菌体或其他库颗粒或分子复合物上显示的结合成员，从显示所选择结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物中取核酸。这样核酸可以被用于随后生成结合成员或抗体VH或VL变异结构域，通过从显示所选择结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物中所取的核酸序列进行核酸表达。
可以以分离形式提供带有所选择结合成员的抗体VH变异结构域的氨基酸序列的抗体VH变异结构域，如含有这种VH结构域的结合成员。
可以进一步测试结合IL-1R1的能力，或与母源抗体分子(抗体1或4)或抗体分子2、3、5-10(如，scFv格式和/或IgG格式，如IgG1)竞争结合IL-1R1的能力。可以测试中和IL-1R1的能力，如本文别处进一步讨论。
本发明结合成员可以结合母源(抗体1或4)或其他抗体分子如，scFv，或抗体分子2、3、5-10中的一种，如IgG1的亲和性，或结合具有更好亲和性的。
本发明结合成员可以中和带有母源(抗体1或4)或其他抗体分子、抗体分子2、3、5-10中的一种、如scFv或IgG1的效价的，或具有带有更高效价的IL-1R1的生物活性。
不同结合成员的结合亲和性与中和效价可在适当的条件下进行对比。
包括氨基酸序列位于其中的那些且可以被用于IL-1R1的结合成员的本发明VH和VL结构域和CDR的变异体能够通过序列替换或突变并筛选带有所希望特性的抗原结合成员的方法来获得。所希望特性的例子包括但不限于：
·相对于特异性用于抗原的已知抗体，提高的用于抗原的结合亲和性。
·相对于活性已知的特异性用于抗原的已知抗体，提高的抗原活性的中和性。
·在特定摩尔比下，与抗原的已知抗体或配体的特异性竞争能力。
·免疫沉淀复合物的能力。
·结合到特定表位的能力
о线性表位，如本文所描述的使用肽结合扫描识别的肽序列，如在线性和/或束构型中使用所筛选的肽。
о构型的表位，由非连续残基形成。
·调整IL-1R1或下游分子的新的生物活性的能力。本文也提供了这样的方法。
本文所公开的各种抗体分子可以被生成并被用于本发明。按照计算机化学引导将多变量数据分析技术用于结构/性质-活性关系[81]，抗体的定量活性-特性关系的获得可以使用所熟知的数学方法，如统计回归、模型识别和分类[82、83、84、85、86、87]。抗体的特性的获得可以来自抗体序列、功能性和三维结构的实验和理论模型(例如，分析可能的接触残基或计算理化性质)，且可以分离地或联合地考虑这些性质。
由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点通常由多肽的六个环形成：三个来自轻链变异结构域(VL)，三个来自重链变异结构域(VH)。已知原子结构的抗体分析已解释了抗体结合位点[88、89]的序列和三维结构之间的关系。这些关系提示，除了VH结构域中的第三区(环)，结合位点环具有一个小数目的主链构型：规范结构。已显示特定环中形成的规范结构通过其尺寸与环和框架区域[88，99]内的关键位点上存在的某些残基进行确定。
序列-结构关系的研究可以被用于预测已知序列的抗体中的那些残基，而不是未知的三维结构，其在保持其CDR环的三维结构中式重要的，并因此保持结合特异性。通过对比先导优化实验结果的预测，这些预测可以得到支持。在结构的方法中，使用任意免费或商业包，如WAM[91]，可以创建抗体分子的模型[90]。蛋白可视化和分析软件包，如Insight II(Accelrys公司，San Diego，USA)或Deep View[92]可以被用于评价CDR中每个位置上的可能的取代。这种信息然后被用于制造取代以可能地对活性具有极小的或有益效果。
CDR、抗体VH或VL结构域的氨基酸内制造取代所需的技术通常在本领域是可用的。用可能或不可能被预测具有对活性极小或有益效果的取代制备变异氨基酸，并测试结合和/或中和IL-1R1的能力和/或任意其他所希望的性质。
本发明所用的变异结构域可以被获得或衍生于任意的生殖或重排人变异结构域，或可以是基于已知人变异结构域的共有或实际序列的合成的变异结构域。变异结构域可以衍生于非人抗体。使用重组DNA技术，本发明CDR序列(如HCDR3)可以被引入缺乏CDR(如CDR3)的变异结构域的谱中。例如，Marks等人[93]描述了生成抗体变异结构域的谱的方法，其中被导向或毗邻抗体变异结构域的5’末端的通用引物被用于与人VH基因的第三框架区的通用引物相连接，以提供缺乏CDR2的VH变异结构域的谱。Marks等人进一步描述了这种谱是如何与特异抗体的CDR2结合。使用类似的方法，本发明CDR2衍生序列可以被缺乏CDR2的VH或VL结构域的谱打乱。打乱的完整的VH或VL结构域与同源VL或VH结构域结合以提供本发明的结合成员。所述谱然后被显示在适宜的宿主系统中，如通过引用的方式完全并入本发明中的WO 92/01047的噬菌体显示系统，或任意的随后的大量的库，包括Kay、Winter&McCafferty[94]，以致选择适宜的结合成员。谱可以由任意的104个体成员到上至例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、或至少1010或更多的成员组成。其他的适宜的宿主系统包括、但不限于酵母显示、细菌显示、T7显示、病毒显示、细胞显示、核糖体显示和共价显示。
提供了制备IL-1R1结合成员的方法，所述方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始谱，所述VH结构域包括CDR2被替换或缺乏CDR2编码区；
(b)将所述谱结合用于VH CDR2的如本文所述的实质上编码氨基酸的供体核酸，以便供体核酸被嵌入谱中的CDR2区域，以提供编码VH结构域的核酸的产品谱；
(c)表达所述产品谱的核酸；
(d)收集IL-1R1的结合受体；和
(d)回收所述结合成员或编码其的核酸。
再次，类似的方法可以用于本发明VH或VL CDR3与编码VH或VL结构域的核酸的谱相结合，所述H或VL结构域包括CDR3被替换或缺乏CDR3编码区。
类似地，一种或多种，或所有的三种CDR被接枝人VH或VL结构域的谱中，所述VH或VL结构域然后被筛选用于结合成员或IL-1R1结合成员。
类似地，可以使用本文所公开的其他VH或VL结构域、CDR组合HCDR组和/或LCDR组。
实质部分的免疫球蛋白变异结构域可以包含至少三个CDR区和其介入框架区。这部分还可以包括至少约50％的第一和第四框架区中之一或两者、50％为C-末端50％的第一框架区和N-末端50％的第四框架区。变异结构域的实质部分的N-末端或C-末端的其他残基可以是哪些通常与天然存在的变异结构域区不相关的。例如，通过重组DNA技术进行的本发明结合成员的构建可以导致引入由连接子编码的N-或C-末端残基，所述连接子被引入有利于克隆和其他操作步骤。其他操作步骤包括将加入到本发明的变异结构域的连接子引入到其他的蛋白序列，所述但序列包括抗体恒定区、其他变异区(例如双链抗体的产物)或本文别处进一步详细讨论的可检测的/功能性的标记。
虽然在本发明的一些方面，结合成员包括VH和VL结构域对，基于VH或VL结构域序列的单结合结构域形成了本发明的进一步的方面。已知的单免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域、能够以特异方式结合标靶抗原。例如参见所讨论的dAbs。
在单结合结构域之一的情况下，这些结构域可以被用于筛选能够形成能结合IL-1R1的双结构域结合成员的互补结构域。这可以通过噬菌体显示而实现，使用通过引用方式全文并入本文的WO 92/01047所公开的所谓的分级双组合法，其中包含H或L链克隆的个体群体被用于感染编码其他链(L或H)的所有克隆库，根据噬菌体显示法收集所得的双链结合成员，如参考中所描述的那些。这种方法还被Marks等人所公开，同上。
本文所用的，二十标准“氨基酸”和其缩写为方便使用。参见Immunology-A Synthesis((2ndEdition，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用方式全文并入本文。二十常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、和其他非常规氨基酸也适于本发明多肽的组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸、γ-羰基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨酸(如，4-羟基脯氨酸)。根据标准用法和习惯，在本文使用的多肽标记中，左手方向的为氨基酸末端方向、右手方向为羧基末端方向。
本文所用术语“异型”是被用于关于由抗体基因的等位基因形式决定的抗基因决定簇。异型表示不同个体的重链或轻链的氨基酸序列有轻微不同，且为亚类的等位基因之间的序列不同，凭此抗血清仅识别等位基因的不同。最重要的类型为Gm(重链)和Km(轻链)。Gm多态性的确定是通过IGHG1、IGHG2和IGHG3基因，其具有编码异型抗基因决定簇的同位基因，所述决定簇被称为G1m、G2m、G3m异型以用于标记人IgG1、IgG2和IgG3分子。现在，已知18种Gm异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)或G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g、l、c5、u、v、g5)(Lefranc等人，The human IgG subclasses：molecular analysis of structure，function and regulation.Pergamon，Oxford，pp.43-78(1990)；Lefranc，G等人，1979，Hum.Genet.：50，199-211，它们通过引用的方式全部并入本文)。
人免疫球蛋白的同位基因形式已被清楚界定(WHO Reviewof thenotation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins.JImmunogen 1976，3：357-362；WHO Review of the notaion for the allotypicand related markers of human mmunoglobulins.1976，Eur.J.Immunol.6，599-601；E.van Loghem，1986，Allotypic markers，Monogr Allergy 19：40-51，它们所有通过引用方式全部并入本文)。另外，其他的多形态已经被界定(Kim等人，2001，J.Mol.Evol.54：1-9，通过引用方式全部并入本文)。
本文所用术语“抗体”指寡克隆、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-枝接抗体、多特异型抗体、双特异性抗体、催化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或抗独特型抗体和能在溶解被标记的抗体或结合形式和片段，变异体或其衍生物、或分离或与已知技术提供的其他氨基酸序列联合。抗体可以来自任意物种。术语抗体还包括本发明抗体的结合片段；示例性的片段包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、单链抗体(svFC)、二聚体变异区域(Diabody)、三链抗体、四链抗体、徼抗体、二硫稳定变异区(dsFv)。
抗体通常有四聚物形式，包括两个相同对的多肽链，每对具有一个“轻”和一个“重”链。每个轻/重链对的变异区域形成抗体结合位点。抗体指或天然或部分或全部合成形成的抗体。必须理解的是，本发明与天然形式的抗体不相关，也就是说，它们不处在天然环境中，而是通过纯化从天然来源中被分离出或被获得，或其他的通过基因重组或化学合成获得，包括用非天然氨基酸修饰。
可以理解，除“双特异性”或“双功能”抗体外的抗体具有每一个都相同的结合位点。抗体实质上抑制了配体结合到受体，当抗体过量时，减少了配体结合到受体的量到至少约20％、40％、60％、或80％，通常更大于约85％(如体外竞争结合分析所所测量的)。
本所用的术语“抗原结合位点”为结合或互补到靶向抗原的所有或部分的分子的一部分。在抗原分子中，它指抗体抗原结合位点，并包含结合到并互补到所有或部分的标靶的抗体的部分。其中抗原是大的，结合成员可以仅结合到抗原的特定部分，该部分命名为表位。可以通过一种或多种抗体变异结构域提供抗体抗原结合位点。抗体的抗原结合位点通常由变异重(VH)和轻(VL)免疫球蛋白结构域形成，带有由六个多肽环形成的抗原结合界面，被称为互补决定区(CDR)。在每种VH(HCDR1、HCDR1、HCDR3)中和每种VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中有三种CDR，并带有框架区(FR)。
本文所用的术语“结合成员”指包括至少一个抗原结合位点的多肽或多肽组，所述抗原结合位点由具有三维结合空间并带有表面形状的多肽链折叠而成，并负责互补到抗原的抗原决定簇的特性的分配。在一实施方式中，结合成员特异性地用于仅一个靶向位点。在其他实施方式中，结合成员特异性用于多个靶向位点。在一实施方式中，结合成员为抗体，例如单克隆抗体。
本文所用术语“嵌合抗体”指含有抗体抗原结合位点或等同物的分子，其被融合到另一个多肽(如衍生于另一个物种或属于另一个抗体类或亚类)因此而被包括。嵌合抗体的克隆和表达描述在EP-A-0120694和EP-A-0125023和大量的以后的文献中。
本文所使用的术语“竞争”显示结合成员竞争结合带有抗体1-10任意一个的IL-1R1，即竞争为单向的。
本文所使用的术语“交叉竞争”显示结合成员竞争结合带有抗体1-10任意一个的IL-1R1，反过来也一样，即竞争为双向的。
本文所使用的术语“互补决定区”(CDR)旨在显示如Kabat等人1991[95]和后来编写的所定义的免疫球蛋白的重链或轻链的高变异区域。抗体通常包含3个重量CDR和3个轻链CDR。此处所用术语CDR为了显示，根据该情况，这些区域的一个或这些区域的几个或甚至全部含有主要的氨基酸残基，所述残基负责通过用于其识别的抗原或表位的抗体亲和性的结合。
在六个短CDR序列中，重链(HCDR3)的第三CDR具有更大尺寸的变异(更大的多样性本质上是由于基因引起的基因重排机制)。虽然已知最长尺寸的为26个，但短的可以是2个氨基酸。CDR长度也可以根据由特定基础框架调节的长度而发生变化。功能性地，HCDR3在抗体的特异性的决定部分中发挥作用[参见引文96、97、98、99、100、101、102、103]。
本文所用的术语“表位”包括能够特性结合结合成员的蛋白决定簇，例如免疫球蛋白或T-细胞受体。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，可以但不总是具有三维结构特征和特异的电荷特性。当解离常数为≤1μM、优选≤100nM和最优选≤10nM时，抗体被认为特异地结合抗原。
本文所用的术语“框架”指原子的任意联合，例如氨基酸，在结合IL-1R1的构型中可以容纳一个或多个CDR。
本文所用的术语“Fv”指保留抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。
本所文所用的术语“Fab”之包括轻链的固定结构域和重链的CH1结构域的抗体的片段。
本所文所用的术语“huIL”指人白细胞介素。
本所文所用的术语“IL-1R1”指白细胞介素1受体1。IL-1R1的氨基酸序列为公开可用的(RefSeq NM-00877)。在一些实施方案中，IL-1R1可以是人或食蟹猴IL-1R1。如本文别处所描述，IL-1R1可以是重组的和/或糖基化或非糖基化的。
本文所使用的术语“Geomean”(也称为几何平均)，指数据组的对数值的平均值，其被转换回10进制。这要求至少2次测量，如至少2次，优选至少5，更优选至少10次重复。本领域技术人员可以理解，重复的次数越多，将越稳健几何平均值。重复次数的选择将留给本领域技术人员决定。
本文所使用的术语“分离的”指本发明结合成员或编码这种结合成员的核酸所处的状态，这通常与本发明是一致的。这样，本发明结合成员、VH和/或VL结构域，和编码核酸分子和载体可以以分离或纯化的形式被提供，例如从它们的自然环境中，是以实质上纯的或均质形式，或在核酸的情况下，为游离或实质上游离的核酸或不同于编码带有所需功能的多肽的序列的基因源。分离的成员或分离的核酸将是游离或完全游离于与其天然相关的例如在其所在天然环境中发现的其他多肽或核酸材料，或当通过在体外或体内实施重组DNA技术制备时的制备其的环境(如细胞培养)。所述成员和核酸可以用稀释剂和辅助剂进行配制，并还能用于其分离时的实际目的-例如在免疫分析中使用以用于包裹微量滴定板时，该成员通常与凝胶或其他载体混合；或当用于诊断或治疗时，可以与药物可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以是糖基化的，或天然的或通过异源真核细胞(如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)合成的，或它们可以使非糖基化的(例如通过在原核细胞中表达而生成)。
包括抗-IL-1R1抗体分子的非均相制备也构成了本发明的部分。例如，这样的制备可以带有全长重链和缺乏C-末端赖氨酸的重链的抗体的混合物，并带有各种程度糖基化和/或衍生的氨基酸，如谷氨酸的N-末端谷氨酸的环化以形成焦谷氨酸残基。
本文所使用的术语“单克隆抗体”指来自实质上同质总体的抗体，所述抗体特异性结合相同的表位。术语“mAb”指单克隆抗体。
本文所使用的术语“实质上如所述”指本文所描述的结合成员的VH或VL结构域的相关CDR的特性是相同地或高度相似地到本文所述序列的特定区域。本文所使用的，关于一种或多种变异结构域的特定区的术语“高度相似地”，可以理解的是，在CDR和/或VH或VL结构域中可以形成从1-约6，如1-5、包括1-3、或1或2或3或4个氨基酸的取代。
此处顺便指出本文所用的“和/或”指采用的为两个特定特征或组分中的每一个的特定公开，所述组分带有或不带有其他。例如“A和/或B”为采用的特定公开每一个(i)A、(i)B和(iii)A和B，正像每一个都被分离地陈述。
表和图的简要说明
表1a列出了抗体1-3每个的重链和轻链CDR的氨基酸序列。
表1b列出了抗体4-10每个的重链和轻链CDR的氨基酸序列。
表2显示了附加序列表中所示的本发明示例性结合成员的序列，其中SEQ ID编号对应表3中所显示的。
表3显示了人受体-配体IL-1β结合分析中的先导scFv效价的例子。
表4显示了在人IL-1β诱导IL-8释放分析中的先导IgG1效价的例子。
表5显示了HeLa细胞中用于抑制IL-α-或IL-1β-诱导IL-8释放的优化IgG1和GL IgG2的效价。
表6显示了人IL-1R结合优化IgG分析中IL-1R家族成员和不同IL-1R物种的效价。
表7显示了受体-配体(IL-1Ra)结合分析中的优化IgG的抑制。
表8表示了从表达内源性食蟹IL-1R的CYNOM-K1细胞中释出的IL-1β诱导的IL-8的优化IgG的抑制。
表9显示了用于在人全血中抑制IL-1β诱导IL-6生成的IC50值。
表10显示了抗IL-1R1Fab对可溶性人IL-1R1和可溶性食蟹IL-1R1的亲和性测量的结果。
表11显示了抗体6和AMG108结合到可溶性人IL-1R1的亲和性测量的结果。
表12显示了嵌合IL-1R1分子与人IL-1R1竞争结合抗体的IC50(nM)。
图1显示了食蟹猴IL-1R1细胞外结构域cDNA的序列[SEQ ID NO：131]。
图2显示了食蟹猴IL-1R1细胞外结构域氨基酸序列的序列[SEQ IDNO：132]。
图3显示了人IL1R1Fc cDNA核苷酸序列[SEQ ID NO：133]。
图4显示了人IL1R1Fc蛋白序列[SEQ ID NO：134]。
图5显示了食蟹猴IL1R1Fc cDNA核苷酸序列[SEQ ID NO：135]。
图6显示了食蟹猴IL1R1Fc蛋白序列[SEQ ID NO：136]。
图7显示了人IL-1R1细胞外序列[SEQ ID NO：137]。
图8显示了人IL-1R1cDNA序列[SEQ ID NO：138]。
图9显示了食蟹猴IL-1R1细胞外序列(残基1-337)[SEQ ID NO：139]。
图10显示了食蟹猴IL-1R1cDNA细胞外序列[SEQ ID NO：140]。
图11显示了成人HIS-FLAG-IL-1ra的序列[SEQ ID NO：141]。
图12显示了成人HIS-FLAG-IL-1β的序列[SEQ ID NO：142]。
图13显示了用于抗体6IgG2(实施例2.7)的在人全血中IL-1β诱导IL-6生成的抑制。X轴表示抗体6的浓度(Log摩尔)，y轴为IL6生成的抑制百分比。
图14显示了SDCAT-CG引物，它在核糖体显示构建和Vh3-DP-47(3-23)家族修复中使Glu转化成Gln。
实施例
将天然人单链Fv(scFv)噬菌体显示库克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌体载体以被用于筛选[104，105]
使用重组人IL-1R1上的系列筛选环将抗-IL-1R1特异性scFc抗体从噬菌体展示库中分离出来。
所筛选的scFc抗体被优化以用于结合人IL-1R1和/或用于效价，并被重建作为IgG抗体。
序列
本发明示例性结合成员的序列显示在所附的序列表中，其中SEQ IDNO对应以下表2中所显示的，其中：
i)其中抗体编号后接着GL，例如，11GL指一种或多种残基被突变回生殖构型(germline configuration)，通常GL被用于所有的非生殖残基(non-germline residues)所述残基可被突变回生殖系而没有生成可预见的活性损失。注意的是，在说明中，任意一个或所有的抗体1-10是指还包括表2中列出的任意生殖变异体。且CDR显示在表1a和1b中。
表2
  抗体   SEQ ID No.   说明
  1   91   VH/DNA
  1   92   VH/氨基酸
  1   93   HCDR1
  1   94   HCDR2
  1   95   HCDR3
  1   96   VL/DNA
  1   97   VL/氨基酸
  1   98   LCDR1
  1   99   LCDR2
  1   100   LCDR3
  2   1   VH/DNA
  2   2   VH/氨基酸
  2   3   HCDR1
  2   4   HCDR2
  2   5   HCDR3
  2   6   VL/DNA
  2   7   VL/氨基酸
  2   8   LCDR1
  2   9   LCDR2
  2   10   LCDR3
  3   121   VH/DNA
  3   122   VH/氨基酸
  3   123   HCDR1
  3   124   HCDR2
  3   125   HCDR3
  抗体   SEQ ID No.   说明
  3   126   VL/DNA
  3   127   VL/氨基酸
  3   128   LCDR1
  3   129   LCDR2
  3   130   LCDR3
  4   101   VH/DNA
  4   102   VH/氨基酸
  4   103   HCDR1
  4   104   HCDR2
  4   105   HCDR3
  4   106   VL/DNA
  4   107   VL/氨基酸
  4   108   LCDR1
  4   109   LCDR2
  4   110   LCDR3
  5   11   VH/DNA
  5   12   VH/氨基酸
  5   13   HCDR1
  5   14   HCDR2
  5   15   HCDR3
  5   16   VL/DNA
  5   17   VL/氨基酸
  5   18   LCDR1
  5   19   LCDR2
  5   20   LCDR3
  6   61   VH/DNA
  6   62   VH/氨基酸
  抗体   SEQ ID No.   说明
  6   63   HCDR1
  6   64   HCDR2
  6   65   HCDR3
  6   66   VL/DNA
  6   67   VL/氨基酸
  6   68   LCDR1
  6   69   LCDR2
  6   70   LCDR3
  6GL   21   VH/DNA
  6GL   22   VH/氨基酸
  6GL   23   HCDR1
  6GL   24   HCDR2
  6GL   25   HCDR3
  6GL   26   VL/DNA
  6GL   27   VL/氨基酸
  6GL   28   LCDR1
  6GL   29   LCDR2
  6GL   30   LCDR3
  7   31   VH/DNA
  7   32   VH/氨基酸
  7   33   HCDR1
  7   34   HCDR2
  7   35   HCDR3
  7   36   VL/DNA
  7   37   VL/氨基酸
  7   38   LCDR1
  7   39   LCDR2
  抗体   SEQ ID No.   说明
  7   40   LCDR3
  8   71   VH/DNA
  8   72   VH/氨基酸
  8   73   HCDR1
  8   74   HCDR2
  8   75   HCDR3
  8   76   VL/DNA
  8   77   VL/氨基酸
  8   78   LCDR1
  8   79   LCDR2
  8   80   LCDR3
  8GL   41   VH/DNA
  8GL   42   VH/氨基酸
  8GL   43   HCDR1
  8GL   44   HCDR2
  8GL   45   HCDR3
  8GL   46   VL/DNA
  8GL   47   VL/氨基酸
  8GL   48   LCDR1
  8GL   49   LCDR2
  8GL   50   LCDR3
  9   111   VH/DNA
  9   112   VH/氨基酸
  9   113   HCDR1
  9   114   HCDR2
  9   115   HCDR3
  9   116   VL/DNA
  抗体   SEQ ID No.   说明
  9   117   VL/氨基酸
  9   118   LCDR1
  9   119   LCDR2
  9   120   LCDR3
  9GL   51   VH/DNA
  9GL   52   VH/氨基酸
  9GL   53   HCDR1
  9GL   54   HCDR2
  9GL   55   HCDR3
  9GL   56   VL/DNA
  9GL   57   VL/氨基酸
  9GL   58   LCDR1
  9GL   59   LCDR2
  9GL   60   LCDR3
  10GL   81   VH/DNA
  10GL   82   VH/氨基酸
  10GL   83   HCDR1
  10GL   84   HCDR2
  10GL   85   HCDR3
  10GL   86   VL/DNA
  10GL   87   VL/氨基酸
  10GL   88   LCDR1
  10GL   89   LCDR2
  10GL   90   LCDR3
本发明现在通过以下非限定性实施例进行举例说明
实施例1抗体先导分离
1.1筛选
基于丝状噬菌体M13的被克隆进噬菌体载体的大单链Fv(scFv)人抗体库被用于筛选(106，107)。使用实质上如以上所描述(108)生物素化的重组人IL-1R-Fc上的系列选择环将抗-IL-1R特异性scFv抗体从噬菌体展示库中分离出来。简而言之，用溶液(材料和方法中所描述的huIL-1R1-Fc和内在生物化)中100nM重组生物素化的人IL-1R-Fc融合蛋白培养scFv-噬菌体颗粒。按照制造商的说明，然后将结合抗原的ScFv-噬菌体捕获在链霉亲合素包衣的顺磁小球上(M-280)。然后按以上方法(109)援救所收集的scFv噬菌体颗粒，重复筛选工艺用于第二轮。
来自第二轮筛选的代表数量的个体克隆在96-孔板中长大。ScFv被表达在细菌周质，并被筛选用于其在人受体-配体(IL-1β)结合HTRF分析中的抑制活性，如材料和方法中所描述。该分析中显示显著抑制效果的ScFv作为粗周质提取物经受DNA定序(106、109)。唯一的scFv被再次表达进细菌，并通过亲和性色谱(110)纯化，并通过在相同的配体-受体结合分析中测试纯化scFv的稀释液系列以测定IC50值。
1.2受体-配体(IL-1β)结合分析中通过scFv的抑制。
收集结果在受体-配体结合(均相时间分辨荧光法)分析法格式中进行筛选，所述分析法格式用于抑制HIS FLAG标签人IL-1β(在内部，大肠肝菌被表达；HIS FLAG IL-1β)结合到人组氨酸标签(HIS)IL 1RFc融合蛋白(在内部)。
更详细的分析方法和材料表达方法被提供在材料和方法部分。
从结合分析中所获得的先导scFv效价的实施例被显示在表3中。
表3HTRF人受体-配体IL1β结合分析中先导scFv效价的实施例
IC＝不完全抑制曲线，IC50值为估值。
数据来自代表了几个独立试验的单个实验。
1.3scFv到IgG1的重建
通过将VH和VL结构域亚克隆到分别表达整个抗体重链和轻链的载体上，在受体-配体HTRF结合分析中被确定为抑制的克隆被从scFv转化到IgG1格式。VH结构域被克隆到含有人重链恒定结构域和在哺乳动物细胞中表达整个IgG重链的调节元件的载体(pEU15.1)中。类似地，VL结构域被克隆到含有人轻链(λ)恒定结构域和在哺乳动物细胞中表达整个IgG轻链的调节元件的载体(Peu4.4)中。用于表达重链和轻链的载体是基于引文(111)中所初始描述的那些。通过引入OriP元件对我们的载体进行简单的设计。为了获得IgG，表达载体的重链和轻链IgG被转染到EBNA-HEK293哺乳动物细胞中。IgG被表达并被嵌入媒介。在纯化前合并收获物并过滤，然后使用蛋白A色谱纯化IgG。培养上清液被装载到陶瓷蛋白A(BioSepa)的适宜尺寸的柱上，并用50mM的Tris-HCl、pH5.0、250mM的NaCl洗涤。使用0.1M的柠檬酸钠(pH3.0)从柱上洗脱结合IgG，并加入Tris-HCl(pH9.0)中和。被洗脱材料为使用Nap 10柱(Amershan#17-0854-02)将其交换进PBS的缓冲液，使用基于IgG(112)氨基酸序列的消光系数，分光光度计地测量IgG的浓度。使用SEC-HPLC并通过SDA-PAGE，分析纯的IgG以用于凝聚和降解。
1.4母源KENB026和KENB061的生殖
在生物活性分析中具有抑制作用的母源抗体1和抗体4的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据(113)中已知的人生殖序列是一致的，通过序列相似性确定最相似的生殖系。不考虑Vernier残基(114)，其被保留下来没改变，VH和VL结构域的框架区内的变化被恢复到最接近的生殖系列以相同地匹配人抗体，其使用的是带有适当诱变引物的标准位点导向诱变技术。这些诱变方法在用于母源的IgG载体中进行。
1.5生殖先导抗体作为IgG2
母源抗体4(IgG1格式中)被用作诱变模板以用于生殖先导抗体。使用带有适当诱变引物的标准位点导向诱变技术，先导的个体VH和VLCDR3序列被引入IgG1载体中生殖母源以生成生殖先导。
使用标准的克隆方法进行IgG10到IgG2的转化。IgG1VH先导质粒被分离，而生殖VH被移去用于克隆进IgG2VH载体。
种系信息
抗体1：VH Vh3_DP_47(3-23)，Vl Vlambda1_DPL3_(1g)
抗体4：VH Vh3_DP-47_(3-23)，Vl Vlambda1_DPL8_(1e)
1这是因为当使用引物SDCATCG(参见用于核糖体显示库构建和反转的引物和Vh3DP-47(3-23)框架序列线-图14)时的从GAA(Glu)到CAA(Gln)碱基变化。在种系过程中由于人工的引入，这些残基(通过游标尺)被反转到谷氨酸(Glu)。使用SDCATCG，抗体6也被扩增，但在IgG1转化过程中，位置1被改正到Glu。
2在核糖体显示转化和选择过程中，可能发生这种删除。核糖体显示是基于PCR和使用易出错的聚合酶。
1.6抑制IL-1-诱导IL-8从HeLa细胞中释放
为了测定IL-1R抑制剂的生物活性，受体-配体结合分析的scFv抑制剂面板被转化到IgG，并通过测量IL-1β-和IL-1α诱导IL-8释放的剂量-依赖抑制作用以评价它们在HeLa细胞分析法中的活性。更为详细的分析方法，见材料和方法部分。
在该分析中，被测定的抗-IL-1R IgG面板的抑制活性对应于人IL-1β-和IL-1α的EC50浓度(被定义为在分析中给出一半最大应答的IL-1的浓度；该例子中约2pM)。显示任何IL-1-诱导应答的显著抑制的抗体被带入先导隔离面板且实施例为表4所示的。抗体1和抗体4的种系IgG变异体在该分析中显示有活性。
表4人IL-1β诱导IL-8释放分析中先导IgG1效价的实施例
IC50表示从2-5独立实验几何平均值。
实施例2：抗体优化
2.1亲和性成熟
使用亲和性基噬菌体和核糖体展示筛选优化抗体4和抗体1。
衍生于先导克隆的大scFv噬菌体库的建成是采用(115)所描述的标准分子生物技术通过变异重链(VH)和轻链(VL)补充确定区3(CDR3)的寡糖核酸导向诱变。库经过亲和基噬菌体显示筛选以选择具有人IL-1R-Fc高亲和性的变异体。在结果中，希望这些显示提高的人IL-1β结合IL-1R1的抑制活性。筛选的实施本质上如以前(108)所描述。简而言之，scFv-噬菌体颗粒用溶液中的重组生物素化的人IL-1R-Fc进行培养。然后，按照生产商的说明，ScFv噬菌体结合抗原被捕获在链霉亲合素包衣的顺磁小球(M-280)。然后用以上(109)所描述的援救所筛选的scFv-噬菌体颗粒，在生物素化的人IL-1R-1的浓度(超过3轮，50nM降到0.05nM)降低的情况下重复筛选工艺。
粗的含scFv的周质提取物由来自变异重链(VH)和变异轻链(VL)筛选结果的代表数量的个体克隆制备而成，并在受体-配体结合(均相时间分辨荧光法)分析法格式中进行筛选，所述分析法格式用于抑制HISFLAG标签人IL-1β(在内部，大肠肝菌被表达；HIS FLAG IL-1β)结合到人组氨酸标签(HIS)IL 1RFc融合蛋白(在内部)。筛选命中，即scFv变异体，当与它们各自的母源抗体相比，显示了显著改善的抑制效果，所述scFc变异体经过DNA定序，来自可变异重链和可变异轻链库结果的唯一变异体被生产为纯的scFv以用于进一步鉴定。然后收集一些scFv，并将其转化到IgG1并在此测试以尽力实现另外的效价增益。
包括带有抑制人IL-1β结合到人IL-1RI的能力的大量scFv变异体的变异重链(VH)和变异轻链(VL)筛选结果被重组以形成噬菌体显示格式中的单库，在所述格式中克隆包含在随机配对的个体随机化的VH和VL序列中。然后在生物素化的人IL-1R-Fc的浓度降低(超过进一步的3轮后，由0.1nM到5pM)的情况下，如以前所描述的继续进行噬菌体筛选。
可选择地，核糖体展示方法被用于重组筛选结果。对于核糖体展示，包括带有抑制人IL-1β结合到人IL-1RI的能力的大量scFv变异体的变异重链(VH)和变异轻链(VL)筛选结果通过聚合酶链反应(PCR)被重组以形成单库，并适于基本地如引文(116)所描述的核糖体展示格式。在重组库上进行核糖体展示亲和性基础的筛选，且在生物素化的人IL-1RI的浓度降低(超过3轮后，由1nM到5pM)的情况下，重复进行筛选方法。然后展示结果被克隆到噬菌体显示载体用于进一步的鉴定，基本如引文(117)所描述。
粗的含scFv的周质提取物由来自噬菌体展示和核糖体展示结果的代表数量的个体克隆制备而成，并筛选它们的抑制人生物人Il-1β到人Il-1I受体的结合能力。筛选命中，即scFv变异体，当与它们各自的母源抗体相比，显示了显著改善的抑制效果，并先导生成预重组，所述scFv变异体经过DNA定序，唯一重组变异体被生产为纯的scFv以用于进一步鉴定。
分析中最有活性的scFv被转化到如该实施例1.3和1.5所描述的非种系IgG1和/或种系IgG2，并被测试在竞争ELISA格式、受体-配体IL-1Ra HTRF和HeLa IL-1β和α诱导IL-8释放分析中的特异性，该抗体还被用于测试到食蟹IL-1R1的交叉反应性。
2.3通过优化IgG的IL-1β和α诱导IL-8从HeLa细胞释放的抑制
克隆的生物活性的改进、接着先导优化和重建到IgG，使用huIL-1β和huIL-1α(R&D Systems)在EC80浓度下(双方均为5pM)在HeLa IL-8释放分析中进行评估，如材料和方法部分所述描述。结果见表5。
表5用于抑制IL-α或IL-1β诱导HeLa细胞中的IL-8释放的优化IgG1和GL-IgG2效价。
IC50表示所显示实验的数值的几何平均值
与母源相比效价提高的亚组克隆接下来被用于在另外的分析法中进行分析，所述分析法包括使用CYNOM-K1细胞的食蟹IL-1R分析法(以下章节中描述的与材料和方法部分中的方法)。优化的抗体与IL-1Ra进行对比(Amgen，由药房商业提供和AMG108序列来自2004年4月15日公开的US 2004/071702)。
2.4优化抗体在表位竞争分析中的选择性和物种交叉反应。
使用表位竞争分析建立了先导抗体对IL-1R家族成员的选择性和物种交叉反应。
分析测量了生物素化人HIS-IL1RFc(内表达和内生物素华)结合每种优化抗-IL1R抗体的抑制。
在每种分析中测试非生物素化人重组IL1sRII(R&D Systems)、人重组IL-1R6/IL1R rp2/Fc(R&D Systems)、人重组IL-18Rα/IL1R5/Fc(R&DSystems)、人重组IL-1R4(ST2)/Fc(R&D Systems)的滴定以建立每种结构相关性家族成员的效价，如分析中测量的IC50值。
在每种分析中测试滴定的IL-1R物种包括人HIS-IL1R Fc(内部)、食蟹HIS-IL1R Fc(内部)、大鼠IL-1R Fc(内部)以建立优化抗体的物种交叉反应。
实验结果汇总在表6中，结果显示先导优化抗体被筛选用于人IL-1R并相似地结合食蟹IL-1R，不能识别结构相关性蛋白。任何优化抗体不能识别大鼠IL-1R-Fc。
表6人IL-1R结合优化IgG分析中不同IL-1R物种和IL家族成员的效价
IC50表示所显示三个独立实验的数值的几何平均值
NI：观察到没有huIL-1RFc的抑制
2.5在受体-配体(IL-1Ra)结合分析中优化IgG的抑制
在受体-配体结合(均相时间分辨荧光法)分析法格式中评价先导抗体抑制IL-1Ra到IL-1R1的能力，所述分析格式用于抑制HIS FLAG标签人IL-Ra(在内部，大肠肝菌被表达；HIS FLAG IL-1Ra)结合到人组氨酸标签(HIS)IL 1RFc融合蛋白(在内部)，如材料和方法部分所描述的。
这将确定是否获得了特别有益的表位，其中抗体被竞争用于IL-1Ra结合到到IL-1R1，还有IL-1-β和IL-1-α。在体内，这将解放受体结合IL-1Ra，因此并允许其结合到另一个受体，这被认为是有利的。IL-1Ra或许能够进入组织，否则几乎不能接触IgG，且它还能比IgG更快的从循环渗透到组织末梢。专利中已经声明AMG 108Amgen(US 2004/0097712)和Hoffmann-LaRoche AG(WO 2005/023872)这些现有技术中的抗体不直接与IL-1Ra竞争结合IL-1R1。AMG 108Amgen的专利(US 2004/0097712)讨论了与IL-1竞争而不和IL-1Ra竞争的抗体在分析中显示了抑制IL-1-介导效果的较高的效价，所述分析被设计为对不和IL-1和IL-1ra竞争的那些显示了抑制IL-1-介导效果，并因此代表了优良的表位。我们惊讶地发现抑制IL-1ra和IL-1的抗体与US 2004/0097712专利中所描述的结合到抗体的IL-1活性的抑制分析中的效价是相似的，而该专利不是。
实施例的结果显示在以下的表7中，确证现有技术抗体不能完全与IL-1Ra竞争结合到IL-1R1，但我们的先导抗体完全抑制了这种作用，并显示了IC50。
表7：受体-配体(IL1Ra)结合分析中优化IgG的抑制
  克隆   IC50(nM)   克隆   IC50(nM)
  抗体2IgG1   0.256   抗体6GLIgG2   0.181
  抗体3IgG1   0.469   抗体8GLIgG2   0.363
  抗体5IgG1   0.186   抗体9GL IgG2   0.208
  抗体6IgG1   0.100   抗体10GLIgG2   0.323
  抗体7IgG1   0.168   AMG108IgG2   NI
  抗体8IgG1   0.156   DEI5-8IgG4   NI
  抗体9IgG1   0.156   Kineret   0.323
IC50表示所显示独立实验的数值的几何平均值
NI：观察到IL-1Ra没有显著抑制
GL：种系
2.6通过优化的IgG对huIL-1β诱导IL-8从CYNOM-K1细胞释放的抑制。
为了建立先导抗体在IL-1β信令至内源性表达食蟹IL-1R1的抑制活性中是否有效，测量先导IgG抑制huIL-1β诱导IL-8从CYNOM-K1细胞释放的能力。先导抗体清楚地并完全地抑制IL-1β作用至食蟹IL-1R1，与到IL-1Ra具有相等的活性，而AMG 108IgG不抑制这种作用。用于人IL-8的商业可用的ELISA已显示还能测定细胞上清液中的食蟹IL-8并能用于测量对CYNOM-K1的IL-1诱导效果。
表8通过优化的IgG对huIL-1β诱导IL-8从表达内源性食蟹IL-1R的CYNOM-K1细胞释放的抑制。
  克隆名称 IC50(nM)(n＝2)
  抗体6GLIgG2 0.8，0.6
  抗体8GLIgG2 4.2，2.5
  抗体9GLIgG2 1.2，1.1
  抗体10GLIgG2 0.9，0.7
  AMG108IgG2 NI，NI
  同型对照IgG2 NI，NI
  Kineret 0.2，0.8
所报告的IC50为两个独立实验中每个的IC50
NI：观察到没有抑制IL-1β诱导IL-8释放
2.7在人全血中IL-1β诱导IL-6生成的抑制
从正常志愿者(6个供体)采集全血到肝素钠monovette容器中。全血(80μl)被分装进96孔板的含有10μl的抗IL-1RI-单克隆Ab抗体6Gl IgG2在分析缓冲溶液(1％BSA在PBS中)中的孔中。IL-1β被加入30分钟后得出30pM(EC50)的最终浓度。18小时后收取上清液，使用ELISA(R&DSystems IL-6ELISA)测量上清液中IL-6的水平。图13中显示了抗-IL-1RI抗体阻滞的IL-1活性。表9显示了人全血中IL-1β诱导IL-6生成的抑制的IC50值范围。6个供体的平均IC50为229pM。
表9：人全血中IL-1β诱导IL-6生成的抑制的IC50值
实施例4提供了带有不同Fc格式的抗体6的相当的数据，抗体6IgG1TM(Triple Mutant234F、235E和331S)
分析材料和方法
受体-配体(IL1-β)结合 分析
将筛选结果在受体-配体(均相时间分辨荧光法，Cis-Bio，Bedford，MA，USA)分析法格式中进行筛选，所述分析法格式用于抑制HIS FLAG标签人IL-1β(在内部，大肠肝菌表达；HIS FLAG IL-1β)结合到人组氨酸标签(HIS)IL 1RFc融合蛋白(在内部HEK EBNA表达，如以下所述)。更详细的分析可以在Mathis(1995)Clinical Chemistry41(9)，1391-1397中找到。
先导分离过程中的结果不稀释进行筛选，含周质提取物的粗scFv被制备进200mM的pH7.4的HEPES缓冲液，0.5mM EDTA和0.5M蔗糖中。5μl的粗scFc样品被加到384孔低体积分析板(Costar 3676)。然后加2nM人HISIL 1RFc到20μl体积。然后密封分析板并在室温黑暗下培养1小时。
分析板经过预培养之后，加入5μl的4nM HIS FLAG IL-1β。接下来是5μl的20nM标记有XL665(CIS Bio international 61FG2XLB)的抗-FLAG IgG、和5μl的3.2nM标记有穴状化合物的抗-人Fc IgG(CIS Bio international61HFCKLB)。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％的BSA(分析缓冲液)磷酸缓冲溶液(PBS)中进行。
分析板在室温黑暗下培养3小时，之后使用En Vision板读取器(PerkinElmer)在620nm和665放射波长处读取时间分辨荧光。
通过分别按照方程式1和方程式2计算σF值百分比和每种样品的特异性结合的百分比进行分析数据。
还可以使用如下的可选择地FLAG IL1β(Alexis ALX-552-056)进行受体-配体分析。5μl的含周质提取物的粗scFc被制备进200mM的pH7.4的HEPES缓冲液，0.5mM EDTA和0.5M蔗糖并被加到384孔低体积分析板中(Costar 3676)。然后加8nM人HIS IL 1RFc到20μl体积。然后密封分析板并在室温黑暗下培养1小时。
分析板经过预培养之后，加入5μl的80nM的FLAG IL-1β(AlexisALX-522-056)。接下来是5μl的40nM标记有XL665(CIS Bio international61FG2XLB)的抗-FLAG IgG、5μl的3.2nM标记有穴状化合物的抗-人Fc IgG(CIS Bio international 61HFCKLB)。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％的BSA(分析缓冲液)磷酸缓冲溶液(PBS)中进行。
分析板在室温黑暗下培养3小时，之后使用En Vision板读取器(PerkinElmer)在620nm和665放射波长处读取时间分辨荧光。
通过分别按照方程式1和方程式2计算σF值百分比和每种样品的特异性结合的百分比进行分析数据。
方程式1：
σF％值接下来被用于计算结合特异性％，如方程式2中所描述。
方程式2：
来自筛选确认出的阳性克隆的纯scFv在上述之一的受体-配体分析中进行测试以用于人HIS FLAG标签的IL1β结合到人HIS IL1RFc的抑制。本领域技术人员能够修改测试IgG或其他抑制剂格式的分析。使用scFv浓度的滴定以建立分析中按IC50测量的克隆效价。所有的稀释在分析缓冲液中进行。5μl的滴定的纯的scFv样品被加入到384孔低体积分析板(Costar3676)。然后接下来加入2nM人HIS IL1RFc(当内部使用HIS IL1β)或8nMHIS IL1RFc(当使用Alexis源IL1β)至20μl的体积。然后密封分析板并在室温黑暗下培养1小时。接下来进行加入步骤，确切地如含有周质提取物的粗scFv的所描述的。
分析板在室温黑暗下培养3小时，之后使用En Vision板读取器(PerkinElmer)在620nm和665放射波长处读取时间分辨荧光。
通过分别按照方程式1和方程式2计算σF值百分比和每种样品的特异性结合的百分比进行分析数据。使用四参数对数方程(方程式3)通过曲线拟合并使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
方程式3：
Y＝底部+(顶部-底部)/1+10^(Log EC50-X)*希尔常数))
X为浓度的对数，Y为特异性结合，
Y在底部开始并到顶部具有S型。
参照的小鼠抗人IL1R1mAb(Fitzgerald 10-173)和IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(AMGEN商业药房)都被包括在所有纯的scFv滴定分析内作为阳性对照。
先导优化粗scFv被稀释在分析缓冲液中，5μl稀释的粗scFv样品被加到384孔低体积分析板中(Costar 3676)。然后加2nM人HIS IL 1RFc到20μl体积。然后密封分析板并在室温黑暗下培养1小时。
分析板经过预培养之后，加入5μl的40nM的FLAG IL-1β(内部大肠杆菌被表达)。接下来是5μl的40nM标记有XL665(CIS Bio international61FG2XLB)的抗-FLAG IgG、5μl的3.2nM标记有穴状化合物的抗-人Fc IgG(CIS Bio international 61HFCKLB)。所有稀释在含有0.4M氟化钾和0.1％的BSA(分析缓冲液)磷酸缓冲溶液(PBS)中进行。
分析板在室温黑暗下培养3小时，之后使用En Vision板读取器(PerkinElmer)在620nm和665nm放射波长处读取时间分辨荧光。
关于先导分离，分别按照方程式1和方程式2所描述的计算σF和特异性结合。
受体-配体(IL1受体拮抗剂)结合 分析
筛选确认出的阳性克隆的纯scFv在受体-配体拮抗剂(IL-1ra)结合分析中进行试验。IgG也在该分析格式中进行试验。
使用抑制剂的滴定以建立分析中按IC50测量的克隆效价。所有的稀释在分析缓冲液中进行以用于以上的配体结合分析。5μl的滴定的抑制剂被加入到384孔低体积分析板(Costar 3676)。然后接下来加入0.4nM的穴状化合物标记的HIS IL1RFc。然后密封分析板并在室温黑暗下培养1小时。接下来进行加入步骤。
预培养之后，加入5μl的0.6nM FLAG HIS IL-1ra(内部大肠杆菌被表达)。立即接下来5μl的40nM标记有XL665(CIS Bio international61FG2XLB)的抗-FLAG IgG。
分析板在室温黑暗下培养3小时，之后使用En Vision板读取器(PerkinElmer)在620nm和665放射波长处读取时间分辨荧光。
通过分别按照方程式1和方程式2计算σF值百分比和每种样品的特异性结合的百分比进行分析数据。使用四参数对数方程(方程式3)通过曲线拟合并使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
竞争结合分析中的抗体的选择性和物种交叉反应性。
纯IgG被吸收到96孔Maxisorp microtitre板上一定浓度的PBS中，所述浓度为当在用于特定IgG的大概预计KD下加入生物素化人HIS IL1RFc时，会给出显著的信号的浓度。用PBS-Tween(0.1％v/v)洗涤去过量的IgG，用PBS(3％w/v)中非脂肪干牛奶阻塞孔约1小时。稀释系列的每种以下竞争体被制备在3％非脂肪干牛奶中，并在生物素化的人IL 1RFc和各自的IgG之间相互作用的KD值的约400倍的浓度下开始：食蟹猴(Macacafascicularis)HIS IL 1RFc(内部HEK EBNA被表达，如以下描述)、大鼠HISIL 1RFc(内部HEK EBNA被表达)、重组人IL1sRI(R&D系统269-1R/CF)、人IL-1R6/IL-1R rp2/Fc(R&D系统872-RP)、重组人IL-18Rα(IL-1R5)/Fc(R&D系统816-LR)、重组人IL-1R4(ST2)/Fc(R&D系统523-ST)。非生物素化人HIS IL 1RFc被包括进来做为阳性对照。25μl的稀释系列被加到阻滞的IgG分析板。
25μl的1.4nM生物素化的人HIS IL 1RFc被加到分析板。然后密封分析板并在室温培养2小时。通过用PBS-Tween(0.1％v/v)洗涤除去未结合的抗原，而通过链霉亲合素-铕3+共轭(检测，PerkinElmer)测量剩余的生物素化人IL1RFc。在En Vision板读取器(Perkin Elmer)上620nm处测量时间分辨荧光。按铕计数绘制荧光数据。使用四参数对数方程(方程式3)通过曲线拟合并使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
重组人和食蟹猴IL-1R1Fc融合蛋白的生成
使用基于人IL-1R1cDNA序列(RefSeq NM-00877)的引物通过PCR从人肝cDNA序列扩增人IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-336NP-000868)的cDNA编码序列。使用相同的用于人PCR扩增的引物从食蟹猴肝cDNA序列扩增cDNA编码食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-336)序列。使用标准二脱氧荧光终止子定序法通过PCR产物分析确定食蟹猴序列。所得DNA序列为图1所示且预测氨基酸序列如图2所述。按照制造商的说明，所得cDNA被亚克隆入pENTR/D-TOPO(Invitrogen)。
编码IL-1R1细胞外结构域的cDNA片段然后通过LR反应(Invitrogen)被转染到哺乳动物表达载体p DEST12.2(Invitrogen)。pDEST12.2载体已被修饰含有人IgG1Fc编码区在框架中，并带有兴趣嵌入基因，还通过p CEP4载体(Invitrogen)的复制的oriP源的嵌入，一旦转染进入细胞系表达EBNA-1基因产物(如HEK293-EBNA细胞)，允许附加质粒复制。所得人IL-1R1Fc的核苷酸和预测氨基酸序列分别为图3和图4所示，食蟹猴IL-1R1Fc的分别为图5和图6所示。
使用蛋白G色谱、接着通过体积排阻色谱从调整培养基中纯化蛋白。
重组人和食蟹大鼠IL-1R-Fc融合蛋白的生成
通过相似的方法制备鼠IL-1R-Fc以生成如上所描述的重组人和食蟹猴IL-1R-Fc融合蛋白的生成。
HeLa IL-1αβ和IL-1诱导IL-8的释放分析
HeLa细胞(欧洲细胞培养保藏中心，ECACC登记分类号No：93021013，黑人子宫颈上皮癌细胞系(Cancer Res 1952；12：264；Proc Soc Exp Biol Med1954；87：480)保持在MEN+10％胚胎牛血清+1％非必需氨基酸；细胞从100％的总和被分成1∶4和1∶12用于常规培养)以1.5×104细胞/孔的100μl的培养基体积/孔(Dulbecco’s Modified Eagle Medium(Invitrogen))带有10％(v/v)热灭活胚胎牛血清(Invitrogen)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen))被种植在96孔平底组织培养分析板中(Costar)，然后在37□和5％CO2、增湿环境下培养细胞过夜(16-18小时)。
纯的scFv/IgG的滴定被制备在培养基中，50μl/孔的稀释系列被加到HeLa细胞中而无需除去过夜培养基，并用HeLa细胞在37□预培养30-60分钟。接下来加入50μl/孔的ILα/IL-1β，并在37□和5％CO2、增湿环境下培养4-5小时。所用配体的浓度为EC50或以上，这取决于所测试的scFv/IgG的效价，其中EC50为在分析(以方程式3类似的方式计算)中对配体产生一半最大应答的配体的浓度。
参照的小鼠抗人IL1R1mAb(Fitzgerald 10-173)和IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(药房商业供应)都被包括在滴定分析内作为阳性对照。
收获上清液(调整培养基)并在-20□储存直到分析IL-8(通常小于1周)。
使用人IL-8Duoset ELISA试剂盒(R&D Systems)测定上清液中IL-8水平。IL-8捕获抗体(4μg/ml被稀释在PBS，50μL/孔)被吸附到96孔低自动荧光、高蛋白结合板(FluoroNunc Maxisorb板)在4□过夜。用PBS-Tween洗涤去过量的IgG，用PBS中的1％牛血清蛋白(BSA)阻塞孔于室温下约1小时，之后用以上所述洗涤板。80μl的PBS中的0.1％牛血清蛋白(BSA)被加入到每个孔中，然后添加将20μl/孔的调整培养基至调整培养基1∶5稀释。IL-8标准(从1000pg/ml，1∶2稀释)也被加到ELISA板上作为ELISA对照，其所述板在室温被培养2小时。
培养之后，像以前洗涤板以除去未结合蛋白。生物素化IL-8检测Ab(20ng/ml在试剂中稀释的(0.1BSA/PBS)；50μl/孔)然后被加入板中并在室温培养1小时。用PBS-Tween(0.1％v/v)洗涤除去未结合检测抗体，而通过链霉亲合素-铕3+共轭(检测，PerkinElmer)测量剩余的生物素化抗体。在En Vision板读取器(Perkin Elmer)上615nm处测量时间分辨荧光。按铕计数绘制荧光数据。
使用铕计数缺乏抑制剂对照(最大对照)和无IL-1对照(溶媒对照)的IL-1刺激，将抑制剂数据归一化到最大IL-8释放的百分比，如方程式4。
方程式4：
使用四参数对数方程(方程式3)通过曲线拟合并使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
CYNOMK1-1β-诱导IL-8释放分析
使用0.25胰岛素/EDTA收获CYNOM-K1细胞(食蟹-衍生成纤细胞系；欧洲细胞培养保藏中心，ECACC参考号90071809；根据供应商指示保持)，并以8×103细胞/孔在100μl的培养基体积/孔(Minimum Essential MediumMEM(Invitrogen)带有20％(v/v)非热灭活胚胎牛血清(Invitrogen)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen))被种植在96孔平底组织培养分析板中(Costar)，然后在37□和5％CO2、增湿环境下培养细胞过夜(16-18小时)。
纯的scFv/IgG的滴定被制备在培养基中，50μl/孔的稀释系列被加到CYNOM-K1细胞中而无需除去过夜培养基，并用CYNOM-K1细胞在37□预培养30-60分钟。接下来加入50μl/孔的ILα/IL-1β，并在37□和5％CO2、增湿环境下培养4-5小时。所用配体的浓度为EC80，其中EC80为在分析(以方程式3类似的方式计算)中对配体产生80％最大应答的配体的浓度。
IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(药房商业供应)被包括在滴定分析内作为阳性对照。
收获上清液(调整培养基)并在-20□储存直到分析IL-8(通常小于1周)。
使用人IL-8Duoset ELISA试剂盒(R&D Systems)测定上清液中IL-8水平。IL-8捕获抗体(4μg/ml被稀释在PBS，50μL/孔)被吸附到96孔低自动荧光、高蛋白结合板(FluoroNunc Maxisorb板)在4□过夜。用PBS-Tween洗涤去过量的IgG，用PBS中的1％牛血清蛋白(BSA)阻塞孔于室温下约1小时，之后用以上所述洗涤板。80μl的PBS中的0.1％牛血清蛋白(BSA)被加入到每个孔中，然后添加将20μl/孔的调整培养基至调整培养基1∶5稀释。IL-8标准(从1000pg/ml，1∶2稀释)也被加到ELISA板上作为ELISA对照，其所述板在室温被培养2小时。
培养之后，像以前洗涤板以除去未结合蛋白。生物素化IL-8检测Ab(20ng/ml在试剂中稀释的(0.1BSA/PBS)；50μl/孔)然后被加入板中并在室温培养1小时。用PBS-Tween(0.1％v/v)洗涤除去未结合检测抗体，而而通过链霉亲合素-铕3+共轭(检测，PerkinElmer)测量剩余的生物素化抗体。
在En Vision板读取器(Perkin Elmer)上615nm处测量时间分辨荧光。按铕计数绘制荧光数据。
使用铕计数缺乏抑制剂对照(最大对照)和无IL-1对照(溶媒对照)的IL-1刺激，将抑制剂数据归一化到最大IL-8释放的百分比，如方式式4：
方程式4：
使用四参数对数方程(方程式3)通过曲线拟合并使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
克隆人IL1R1-细胞外结构域
序列RefSq NM00877被用于作为人IL-1R1参考序列。使用人肝cDNA作为模板通过PCR扩增细胞外结构域(残基1-336)。所用的引物为NC268(5′-CACCATGAAAGTGTTACTCAGAC)和NC269(5′-CTTCTGGAAATTAGTGACTGG)。按照制造商的说明，扩增PCR产物被克隆进来自Invitrogen的pENTR-D-TOPO。几个克隆被获得和被定序。克隆4与参考序列相同并，并被保留用于亚序列的应用。
使用人Pentr-D-拓扑IL-1R1克隆4中的相关GCA密码子到GGA的标准位点导向诱变生成人多型A124G。
克隆食蟹猴IL-1R1细胞外结构域
编码IL-1R1的食蟹猴cDNA的序列，可用于EMBL数据库(EMBLAY497008)。这种序列与人序列高度相同，然而与人IL-1R1相比，它缺少编码序列的第一5’27bp。使用食蟹猴肝cDNA作为模板通过PCR扩增编码食蟹猴IL-1R1(残基1-336)的可溶性细胞外结构域的cDNA。所用的引物为如上的NC268，其为人IL-1R15’-引物，且NC270(5′-CTTCTGGAATTTAGTGACTGG)作为反义引物。扩增的PCR产物被克隆入来此Invitrogen的pENTR-D-TOPO。
几个克隆被定序，且所用的翻译参考序列发生了变化(EMBLAY497008)。
变化为：
1.S17F：所有克隆(信号序列)内的公开序列TTT中的TCT
2.V661：所有克隆内的公开序列ATA中的GTA
3.H173N：所有其他克隆内AAC、克隆5中的和公开序列中的CAC。
为了检测这些序列变化与已公开序列的合法性，直接使用标准二多样荧光终止子定序法直接定序编码细胞外结构域的扩增cDNA。在扩增PCR产物中存在存在S17F变化，并显示为来自公共序列的真变化。V661变化也出现在扩增PCR产物中，并显示为来自公共序列的真变化。当CAC和AAC密码子相同强度地出现在相同位置时，H173N变化显示为真多态性。PCR产物的直接定序确认了进一步的多态性E300K。在这种情况下，定序反应清楚地显示相等量的CAA和AAA密码子。
克隆大鼠IL-1R1细胞外结构域
鼠cDNA编码IL-1R1的序列从EMBL数据库(EMBL ID RNIL1R)中获得并用作参考序列。使用鼠肝cDNA作为模板通过PCR扩增细胞外结构域(残基1-336)。所用引物为NC288(5’-CACCATGCTGCCGAGGCTTG)和NC289(5′-ATTCTTGAAGTCAGGAACTGGGT)。根据制造商的说明，将扩增PCR产物被克隆入来自Invitrogen的pENTR-D-TOPO。几个克隆被获得并被定序。克隆1与参考序列相同，并保留以用于亚序列。
人HIS FLAG IL-1Ra的克隆表达和纯化
人IL-1Ra的序列从RefSeq数据库(NM-173842)中获得，并被用作参考序列。从人肺cDNA通过PCR扩增编码人IL-1Ra(残基26-177)的成熟序列的cDNA。所用的引物为ILlRaF(5′-CCTCATATGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTCGACCCTCTGGGAGAAA)和ILlRaR(5′-ATATCTCGAGCTACTCGTCCTCCTGGAAG)。引物IL1 RaF的设计为烟草蚀刻镶嵌病毒蛋白酶(TEV)裂解为点立即邻近成熟IL-1Ra的N-末端精氨酸残基。根据制造商的说明，将扩增的PCR产物克隆入来自Invitrogen的pCR4blunt-topo。
获得几个克隆并生成它们的序列。与参考序列相比具有纠正编码序列的克隆被选择用于进一步的操作。接下来使用带有N-末端(HIS)6-FLAG标签的框架的NdeI位点将内嵌DNA亚克隆入pT7大肠杆菌表达载体。
为了表达可溶性HIS-FLAG标签蛋白，表达质粒被转化入来自Invitrogen的化学感应态BL21(DE3)星细胞。含有表达质粒的细胞在Lysogeny Broth(LB，含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，5g/LNaCl)中37□培养至0.5的OD600。然后将IPTG加到从1M储料到50μM的最终浓度。在37□培养细胞3小时。6000rpm离心10分钟收集细胞，小球在-80□储存。细胞被溶解并被悬浮在5mM Tris，pH8.0、10％甘油、0.3MNaCl、10mM咪唑(缓冲液A)+竞争性蛋白酶抑制剂(Roche)中。使用Heatsystems-Ultrasonics公司的超声粉碎仪通过3×30秒的超声在冰上裂解细胞。在4□以100,000g离心裂解物30分钟。使用Ni-NTA Spuerflow(Qiagen)使上清液经过亲和性色谱。用含有0.3M咪唑的缓冲剂A洗脱结合性材料。合并含有IL-1Ra的馏分，使用Hiprep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲剂交换到PBS中。使用SDS-凝胶电泳测试样品的纯度。通过凝胶过滤色谱分析蛋白，发现为单体。
使用多黏菌素B琼脂(Sigma Prod.P1411)从5ml(14mg)的纯IL-1Ra中除去LPS。ε多黏菌素琼脂用不含LPS的PBS(Sigma D8537)洗涤三次、并被施加到空的BioRad Polyprep柱上，可以在重力下处理小球。用10ml的不含LPS的PBS洗涤1ml的包裹小球。将IL-1ra样品施加到柱上，并可以在重力下通过树脂。样品进一步通过1ml多黏菌素柱。使用Pyrochrome LAL分析法(Associate of Cape Cod Inc.C0180)测定多黏菌素处理前后的IL-1Ra中的LPS水平。
使用Q-ToF质谱通过完整样品质量分析法测量不含LPS的蛋白的分子质量。所测量的质量为在没有N-末端蛋氨酸的His-Flag-Tev-IL-1ra的计算质量(20325.67Da)的1Da之内。
克隆人HIS FLAG IL-1β的克隆、表达和纯化
人IL-1β的序列从RefSeq数据库(NM-000576)中获得，并被用作参考序列。从人肺cDNA通过PCR扩增编码人IL-1β(残基177-269)的成熟序列的cDNA。所用的引物为IL 1b F(5′-CCTCATATGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGCACCTGTACGATCACTG)和ILlRaR(5′-ATATCTCGAGTTAGGAAGACACAAATTGCATGG)。引物IL1bF的设计为烟草蚀刻镶嵌病毒蛋白酶(TEV)裂解为点立即邻近成熟IL-1β的N-末端精氨酸残基。根据制造商的说明，将扩增的PCR产物克隆入来自Invitrogen的pCR4blunt-topo。获得几个克隆并生成它们的序列。与参考序列相比具有纠正编码序列的克隆被选择用于进一步的操作。接下来使用带有N-末端(HIS)6-FLAG标签的框架的NdeI位点将内嵌DNA亚克隆入pT7大肠杆菌表达载体。
为了表达可溶性HIS-FLAG标签的IL-1β蛋白，表达质粒被转化入来自Invitrogen的化学感应态BL21(DE3)星细胞。含有表达质粒的细胞在LB(Lysogeny Broth)中37□培养至0.5的OD600。然后将IPTG加到从1M储料到50μM的最终浓度。在37□培养细胞再3小时。6000rpm离心10分钟收集细胞，小球在-80□储存。细胞被溶解并被悬浮在5mM Tris，pH8.0、10％甘油、0.3MNaCl、10mM咪唑(缓冲液A)+CompleteTM蛋白酶抑制剂(Roche)中。使用Heatsystems-Ultrasonics公司的超声粉碎仪通过3×30秒的超声在冰上裂解细胞。在4□以100,000g离心裂解物30分钟。使用Ni-NTA Spuerflow(Qiagen)使上清液经过亲和性色谱。用含有0.3M咪唑的缓冲剂A洗脱结合性材料。合并含有IL-1β的馏分，使用Hiprep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲剂交换到PBS中。使用SDS-凝胶电泳测试样品的纯度。通过凝胶过滤色谱分析蛋白，发现为单体。
使用多黏菌素B琼脂(Sigma Prod.P1411)以以上所述实质相同的方法从纯的IL-1β中除去LPS。
使用Q-ToF质谱通过完整样品质量分析法测量不含LPS的蛋白的分子质量。所测量的质量为在没有N-末端蛋氨酸的His-Flag-Tev-IL-1β的计算质量(20576.10Da)的1Da之内。
实施例3：抗体6和AMG108的亲和性测量
使用KinExATM技术(118)在两天内测量抗体到本发明IL-1R1的亲和性。KinExaTM(动力排阻分析)是基于流体荧光光谱的技术，其能被由于精确地定量高亲和性相互反应，包括亚兆摩尔范围的那些(119)。
首先或用sIL-1R1-Fc(溶解性sIL-1R1-Fc)平衡单聚体FAb，或用sIL-1R1(未标签的)平衡IgG。然后使用KinExaTM3200技术分析这些相互作用的分子的平衡溶液。简而言之，对于每种平衡样品，KinExaTM3200装置自动装配微球共轭sIL-1R1的新柱。含有抗体(或Fab片段)、抗原、和Ab/抗原(或Fab/抗原)复合物(在Dulbecco’s PBS、1mgL-1牛血清蛋白、0.02％(w/v)叠氮化钠)的样品快速地(0.25mL/min)流过柱以保持样品与抗原小球的接触时间非常短。这种快速接触时间确保，高亲和性(慢解离)的相互作用，在这种段接触时间内，复合物的解离非常轻微。没有抗体结合到IL-1R1-小球。Cy5TM(青蓝)荧光低标记第二抗体，小鼠抗人IgG(重链和轻链特异性)然后通过柱。结合抗体的标记的第二抗体结合到柱上。缓冲剂洗涤除去的过量标签，与原始样品中自由受体的量直接成比例的荧光信号保留在球柱上。通过进行抗体和sIL-1R1的不同浓度的范围的滴定，并在每种的这些情况之后测量自由的抗体，估算结合到受体的抗体的KD(最小二乘法拟合，使用所提供KinExATM中的1∶1反义生物分子相互作用模型，Pro软件)。虽然使用BIAcore技术(Surface Plasma Resonance)的亲和性的估算是可比较的，非常慢的解离率意为着KinExATM评估在KD值＜10pM处给出了更可信赖的亲和性测量。抗IL-1R1FAb对溶解性人IL-1R1和溶解性食蟹猴IL-1R1的亲和性测量结果在以下表10中给出。结果显示这种抗体结合到人和食蟹猴IL-1R1具有相等的高亲和性，尽管在表位上与IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)竞争都是可能的，但对于受体的亲和性是非常高的。对比对人sIL-1R1的亲和性以用于实施例抗体，如IgG1TM格式对AMG108IgG2。AMG108IgG2不结合食蟹猴IL-1R1-Fc，且AMG108为IgG2不易于形成单聚和稳定的同质FAb片段。这样仅对比整个IgG之间是可能的。表11中的结果表明，在实施例抗体和AMG108之间对比对人sIL-1R1的亲和性。在当前的公开(国际专利申请号No：WO2004/002718)中，公开了与IL-1ra竞争的抗体，然而，这些(被指定为确认为第二类的抗体)具有地的亲和性和效价。相比下，我们证明了与IL-1ra竞争的抗体还具有对IL-1R1的非常高的亲和性。抗体6的FAb和IgG1TM的结果是相似的。
表10
  抗体   KD人IL1-R1-Fc   KD食蟹猴IL1-R1-Fc
  抗体6FAb   2.5pM   2.8pM
表11
  抗体   KD人sIL-1R1
  抗体6IgG1TM   3.05pM
  AMG108IgG2   4.12pM
方法
FAb单体化
使用激活木瓜蛋白酶将抗体6IgG1TM(三陪突变体，234F、235E和331S)消化在溶液中。通过溶解入620μl的Dulbeccos PBS(D-PBS)中木瓜蛋白酶(SIGMA)(6.2mgs)被激活，并在62μl 100mM D-PBS中的L-Cys中，接下来于10μl 1M D-PBS中NaHCO3中进行培养。然后该溶液在D-PBS平衡的Sephadex G25(PD-10)柱上进行脱盐，收集2.75-3.85ml馏分。这清除了不想要的残基L-Cys和抑制性低分子量的木瓜蛋白酶自溶产物。将带有25μl的D-PBS(升高pH到8-8.5)中的NaHCO3的250μl抗体6IgG1TM(9.32mg/ml)与50μl L-Cys激活的木瓜蛋白酶PD-10洗脱液(如以上所描述)进行混合，在室温反应进程中培养的反应，接下来注射50μl样品到Superdex 75体积排阻色谱分析柱，所述柱已用0.5mL/min的D-PBS平衡。所有剩余的消化液被加入到0.43g(湿重)蛋白G Sepharose 4Fast Flow。收集对应FAb片段的峰，并使用Amicon Ultra 410,000M WCO离心浓缩器(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩至105μl。然后将其再注射到Superdex75柱上，收集对应FAb的峰。来自最后Superdex 75纯化步骤的21.0-21.8分钟的馏分被用作纯抗体6Fab的来源。在4□保存3天之后，FAb在uperdex 75柱再分析，且测量多聚体小于0.4％，说明单体FAb制备物用于亲和性分析是足够稳定的。使用还原或非还原的SDA-PAGE、还原和非还原MALDI-TOF质谱分析再次确认单体Fab的纯度。
KinExA TM 分析
IL-1R-Fcs，或人(SEQ ID NO：134；所希望的质量为65,036.92Da的肽系列作为全还原单体；133,039.8Da作为-Fc二聚体；11,071nM的作为单体浓度)或食蟹猴(SEQ ID NO：136；所希望的质量为65213.14Da的肽系列作为全还原，Swiss Prot；130,392.3Da作为-Fc二聚体；7,9741nM的作为单体浓度)被用作抗原以利用抗体6Fab(用人和食蟹猴IL-1Rs的亲和性直接对比)测量亲和性。人sIL-1R1(R&D Systems，所希望的49,503Da质量的肽序列)被用作实验中的抗原以测量AMG108和抗体6作为IgG的亲和性(用AMG108和抗体6IgG的亲和性直接对比)。
由于长的平衡时间，KinExATM中使用的所有缓冲剂为0.2μm灭菌过滤器。对于柱(普通的FAb和IgG基础测量)，人IL-1R1(R&D Systems)被用于并共价地结合到3ml的50mM、pH8.4的碳酸钠中的100mg(1μg IL-1R1/每克球)的吖内酯UltraLink Biosupport球(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)并在室温固定搅拌50分钟。用1M Tris pH8.7(1ml单次清洗、接着对球离心、2ml室温下25rpm搅拌1.5小时，再次离心)中的10mg/ml的BSA实现清洗和阻滞。最后将沉淀小球再次转移2mls新鲜BSA缓冲剂中，在4□保存直到使用。最后将这些小球悬浮体加到60ml D-PBS+0.02％叠氮化钠中，并被连接到设备球处理系统。鼠抗人IgG(H+L)Cy5共轭被配制成1.4mg/ml在0.01M磷酸钠、带有15mg/mlBSA的0.25M NaCl(pH7.6)和0.05％叠氮化钠中。其在4□保存直至需要时。Fabs和IgGs被稀释到50nM或250pM或100pM或10pM。FcR以2倍稀释系列进行稀释，所述系列合并带有从25或5nM到0.1525pM(在Dulbecoo’s PBS，1mg/ml牛血清蛋白，0.02％(w/v)叠氮化钠)的抗体6Fab或抗体6Ab/AMG108Ab。复合物18□(室温)平衡12-16天，然后流过柱接下来信号测试。使用50μl的Cy5标记第二抗体测试非结合抗体。使用KinExATM，Pro(v 2.0.0.17)软件进行数据的处理和分析。
实施例4：全血分析
在全血分析中分析抗体的效价，其中IL-1β(GIBCO、冻干、无载体)培养导致IL-6的释放。简而言之，抗体被稀释到15μg/ml的含有1％BSA的PBS中，然后按1∶3稀释被连续滴定到PBS/1％BSA中。抗体的10μl的每个浓度、或BS/1％BSA对照用80μl的全血室温培养30分钟。PBS/1％BSA或PBS/BSA中的10μl IL-1β被分离地加入得到30pM的最终分析浓度，并在37□加湿5％CO2的培养器中培养22±2小时。100μl的PBS被加入到孔中300g转动10分钟，除去上清液，分析IL-6含量，采用商业可用的huIL-6ELISA试剂盒(R&D Systems Duoset如所说明)。
分析中抗体6IgG1TM的效价为311pM(83pM-1.2nM)(平均IC50；95％CI)。
实施例5使用嵌合人/鼠IL-1R1细胞外结构域的抗体6相互作用的表位定位
5.1整个结构域交换嵌合IL-1R1分子
抗体6结合人IL-1R1而不结合小鼠IL-1R1。利用这种性质，嵌合IL-1R1分子被生成用于表位定位。通过用相应的小鼠IL-1R1序列替换人IL-1R1胞外结构域的结构域1(D1)(M1-Y122)、结构域2(D2)(N123-V227)或结构域3(D3)(I228-K336)生成全结构域定位嵌合体。通过用相应的小鼠IL-1R1区域替换人IL-1R1已知的与IL1β[120]和IL1ra[121相互作用的已知区域以生成亚结构域定位嵌合体。HTRF(均相时间分辨荧光)竞争分析被用于测定抗体。在分析中，标记有Eu3+穴状化合物的抗体与标记为生物素的人IL-1R1的相互作用。通过Eu3+穴状化合物和标记链霉亲合素[122]的XLent！之间的FRET(荧光共振能量转移)信号测定该相互作用。
5.1.1材料和方法-嵌合体的克隆、表达和纯化
通过引物延伸PCR克隆合成人IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-336NP-000868)和小鼠IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-338NP-032388)的cDNA分子编码嵌合体，并将其克隆入pDONR221(InvitragenCat.No.12536-017)。根据制造商的说明(Invitragen Cat.No.12538-120)，使用IL Gateway Clonase II酶，编码IL-1R1细胞外结构域嵌合体的cDNA片段然后被转移到哺乳动物表达载体pDEST12.2(Invitrogen)。p DEST12.2载体已被修饰含有人IgG1Fc片段和6xhis标签(SEQ ID N：134)在框架中，并带有兴趣嵌入基因，还通过来自p CEP4载体(Invitrogen cat.no.V044-50)的复制的oriP源的嵌入，一旦转染进入细胞系表达EBNA-1基因产物(如CHO被转染带有EBNA-1基因[CHO-EBNA])细胞)时，允许附加质粒复制。使用蛋白G亲和性色谱(HiTrap蛋白G HP柱(GE HealthcareCat.No.17-0404-03))、接着通过体积排阻色谱(Superdex 200柱(GEHealthcare Cat.No.17-1069-01))纯化CHO-EBNA基因的上清液中的被表达的蛋白。人IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-336NP-000868)、载体编码序列、人IgG1Fc和6xhis标签被公开在SEQ ID：134中。小鼠IL-1R1细胞外结构域(氨基酸残基1-338NP-032388)、载体编码序列。
5.1.2抗体到IL-1R1嵌合体的结合
根据制造商的说明的穴状化合物标记试剂盒，(CisBio InternationalCat.No.62EUPEA)抗体为Eu3+标记的穴状化合物；根据制造商的说明，IL-1R1/Fc(SEQ ID No：134，参见材料和方法)为EZ Link Sulfo-NHS-生物素标记的生物素(Perbio Cat No.21335)。分析条件为在384孔浅孔Costar板(3676)中的总体积为20μl的0.25nM穴状化合物标记的抗体、0.3nM生物素标记的IL-1R1/Fc、2.5nM的1×DBS中的链霉亲合素XLent！(CisBioInternational Cat.No.611SAXLB)、0.1％BSA、0.4M氟化钾。向分析稀释系列(从最大100nM到0.0017nM)加入测试蛋白，并室温培养3小时。使用PerkinElmer Envision板读取器和320nm激发滤波器和620nm和665nm发射滤波片测量FRET信号。从665/620的比率计算的结果作为特异性结合的百分比(没有竞争抗原的信号)。使用S型剂量应答模型用Prism(GraphPadSoftware)分析结果。
5.2结果
在HTRF(均相时间分辨荧光法)竞争分析中测试嵌合分子的抗体结合。在相同补位结合抗体的分子如人IL-1R1抑制结合相作用，导致信号降低。从抑制曲线计算(见表12)人IL-1R1、小鼠IL-1R1、嵌合分子的IC50值。如果分子不能完全的抑制结合，计算最高浓度看到的抑制百分比。与自然人IL-1R1相似IC50值的嵌合体还包含了表位。没有完全抑制IL-1R1结合到抗体或显示了降低了IC50值的嵌合体不包含全表位。这样的数据使抗体表位定位化。
表12：嵌合IL-1R1分子的IC50(nM)与人IL-1R1竞争结合到抗体。测试由人(NP-000868)和小鼠(NP-032388)IL-1R1的氨基酸序列组成的嵌合体与人IL-1R1竞争结合抗体的能力。获得完全竞争曲线计算IC50值。*嵌合体不能竞争抑制人IL-1R1竞争结合抗体，显示了嵌合体最高浓度的抑制百分率。
嵌合人/鼠IL-1R1嵌合体的结合能够使结合抗体的人-1R1表位定位。全结构域交换嵌合体将表位定位在人IL1R1(残基N123-V227)的D2，含有IL-1R1的小鼠D2结构域替换人D2IL-1R1(MoIL-1R1、MoD1-D2HuD3IL1R1、MoD2HuD1HuD3IL1R1、MoD2-D3HuD1)的所有嵌合体不能完全抑制人IL1R1，其中含有D2人IL1R1(HuIL、MoD3D1-D2)的那些能够完全和人IL-1R1竞争(表12)。
人IL-1R1含有7β链和4环区，扩张三个结构域，所述结构域在晶体结构中[123]靠近IL1β。同样在晶体结构中(Schreuder等人，Nature 386：194-200，1997)含有3β链和7环区的人IL-1R1靠近IL1ra。β链和环交换嵌合体能够将将人IL-1R1表位定位到结构域2的主要组分，结构域2包含β链a2(残基N123-V134)和环b2-c2中(残基L140-K157)(Vigers等人，Nature 386：190-194，1997)次级组分和环d2-e2(残基K178-R180)(Schreuder等人，Nature 386：194-200，1997)。没有人β链a2的嵌合体比人IL-1R1结合抗体的IC50高26倍，而没有环b2-c2或d2-e2的嵌合体比人IL-1R1(表x)的IC50大于3倍以上。符合结构域交换数据β链a2、环b2-c2和d2-e2被定位在结构域2中(Vigers等人，Nature 386：190-194，1997)。
来自人IL1R1的三个区域N123-V134、L140-K157和K178-R180中的33氨基酸的不连续表位中的抗体结合氨基酸的这些数据。
生物保藏
已经在布达佩斯条约下的以下机构进行了前十大肠杆菌的生物保藏：
NCIMB Limited；
Ferguson Building；
Craibstone Estate；
Bucksbum；
Aberdeen；
AB219YA；
Scotland；
UK。
所述保藏代表本发明的另外的实施方案
参考文献
该说明书中任何地方引用的所有的引文，包括以上任何地方所引述的那些，通过通过引用的方式全部并入本文，并用于其目的。
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Claims (29)

1.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：93；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：94；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：95；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：98；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：99；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：100。
2.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：8；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：9；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
3.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：123；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：124；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：125；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：128；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：129；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：130所示。
4.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：103；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：104；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：105；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：108；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：109；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：110。
5.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：13；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：14；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：15；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：18；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：19；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：20。
6.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：23；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：24；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：25；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：28；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：29；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：30。
7.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：33；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：34；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：35；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：38；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：39；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：40。
8.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：73；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：74；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：75；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：78；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：79；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：80。
9.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：43；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：44；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：45；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：48；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：49；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：50。
10.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：113；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：114；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：115；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：118；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：119；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：120。
11.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：53；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：54；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：55；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：58；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：59；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：60。
12.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：83；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：84；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：85；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：88；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：89；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：90。
13.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中所述成员包括CDR组：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：63；
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：64；
HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：65；
LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：68；
LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：69；
LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：70。
14.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中该结合成员的VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示，其VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示。
15.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中该结合成员的VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:102所示，其VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:107所示。
16.特异性用于IL-1R1的分离的结合成员，其中该结合成员的VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示，其VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员为单克隆抗体。
18.如权利要求1－16中任一项所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员还含有选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人IgM恒定结构域；
(b)人IgG1恒定结构域；
(c)人IgG2恒定结构域；
(d)人IgG3恒定结构域；
(e)人IgG4恒定结构域；和
(f)人IgA恒定结构域。
19.如权利要求17所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员还含有选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人IgM恒定结构域；
(b)人IgG1恒定结构域；
(c)人IgG2恒定结构域；
(d)人IgG3恒定结构域；
(e)人IgG4恒定结构域；和
(f)人IgA恒定结构域。
20.如权利要求1－16中任一项所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员还含有选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人Igκ恒定结构域；和
(b)人Igλ恒定结构域。
21.如权利要求17所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员还含有选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人Igκ恒定结构域；和
(b)人Igλ恒定结构域。
22.如权利要求18所述的分离的结合成员，其中，所述结合成员还含有选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人Igκ恒定结构域；和
(b)人Igλ恒定结构域。
23.分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-22中任一项所述的分离的结合成员。
24.用权利要求23所述的核酸分子转化的宿主细胞。
25.生成权利要求1-22中任一项所述的抗体或分离的结合成员的方法，包括在生成所述抗体或结合成员的条件下培养根据权利要求24所述的宿主细胞。
26.包括权利要求1-22中任一所述结合成员和药学可接受的赋形剂的药物组合物。
27.权利要求1－22中任一项所述的结合成员在制备用于治疗与IL-1R1相关的紊乱的药剂中的应用。
28.权利要求26的组合物在制备用于治疗与IL-1R1相关的紊乱的药剂中的应用。
29.根据权利要求27或28的应用，其中，所述紊乱为一种或多种类风湿关节炎、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、HIV、实体瘤、白血病、阿尔茨海默疾病、II型糖尿病、缺血性疾病和动脉硬化症。
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