KR20020073139A - 인터루킨-1 수용체 길항물질 - 유사 분자 및 이의 용도 - Google Patents

인터루킨-1 수용체 길항물질 - 유사 분자 및 이의 용도 Download PDF

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KR20020073139A
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Abstract

본 발명은 신규한 인터루킨-1 수용체 길항물질-유사(IL-1ra-L) 폴리펩티드 및 이를 코드하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 선택적 결합제, 벡터, 숙주 세포 및 IL-1ra-L 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 IL-1ra-L 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물 및 이 폴리펩티드와 관련된 질환, 장애 및 증상을 진단하거나 치료, 경감 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

인터루킨-1 수용체 길항물질 - 유사 분자 및 이의 용도 {INTERLEUKIN-1 RECEPTOR ANTAGONIST-LIKE MOLECULES AND USES THEREOF}
핵산 분자를 확인하여 클로닝하고 발현, 조작하고 인체 게놈을 해독하는 등의 기술의 발달은 새로운 치료법의 개발에 박차를 가하였다. 핵산 서열의 신속한 서열결정 방법은 전례없는 빠른 속도로 서열 정보를 알아낼 수 있게 되었으며, 컴퓨터 분석과 병행하여 폴리펩티드를 코드하는영역을 확인하고 중복 서열을 부분 및 전체 게놈으로 조립할 수 있게 되었다. 공지된 아미노산 서열의 데이터베이스 편집물에 대해 추정되는 아미노산 서열을 비교하면 앞서 확인한 서열 및/또는 구조적인 경계표의 상동성 정도를 확인할 수 있다. 핵산 분자의 폴리펩티드-코딩 영역의 클로닝 및 발현으로 구조적·기능적 분석을 위한 폴리펩티드 산물이 제조되었다. 핵산 분자 및 코드된 폴리펩티드의 조작으로 치료제로 이용하는 산물에 바람직한 특성을 부여할 수 있다.
지난 10 년간에 걸친 게놈 연구에서의 상당한 기술 발달에도 불구하고, 인체 게놈을 기초로 한 신규한 치료제 개발에 대한 가능성은 아직도 여전히 실현되지 않았다. 매우 유익한 폴리펩티드 치료제를 코드하는 다수의 유전자 또는 치료 분자에 대한 "표적"으로 작용하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자는 아직도 확인되지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 진단학적 또는 치료학적 이점을 갖는 신규한 폴리펩티드와 이를 코드하는 핵산 분자를 확인하는 것이다.
발견된 것들 중 가장 강력한 염증성 시토킨은 인터루킨-1 (IL-1) 이다. IL-1 은 다수의 질환 상태나 의학적 질환에 관계하는 것으로 여겨진다. 이것은 대식세포/단구 계통의 세포에서 생산되며 (꼭 그렇지만은 않지만), IL-1 알파 (IL-1α) 및 IL-1 베타 (IL-1β) 두 형태로 생산된다. 인터루킨-1 수용체 길항물질(IL-1ra) 은 인터루킨-1 의 천연 저해제로 작용하는 인체 단백질이다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 IL-1ra-L 핵산 분자 및 코드된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다 :
(a) SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열 ;
(b) ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열;
(c) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열 ;
(d) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(c) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
(e) (a)-(c) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다 :
(a) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드와 적어도 약 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(b) SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열의 대립형질 변이체 또는 스플라이스 변이체를 코드하는 누클레오티드 서열, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열 또는 (a) ;
(c) 적어도 약 25 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 단편을 코드하는 SEQ ID NO : 1, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물, (a) 또는 (b) 의 누클레오티드 서열 영역, 여기에서 폴리펩티드 단편은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 코드된 폴리펩티드 활성을 갖거나 항원성이다.
(d) 적어도 약 16 개의 누클레오티드로 이루어진 단편을 포함하는 SEQ ID NO : 1, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물 또는 (a)-(c) 중 어느 하나의 누클레오티드 서열 영역 ;
(e) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(d) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
(f) (a)-(d) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다 :
(a) 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(b) 적어도 하나의 아미노산 삽입을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(c) 적어도 하나의 아미노산 결실을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(d) C- 및/또는 N-말단이 절두된, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(e) 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두, N-말단 절두 중에서 선택한 적어도 하나의 변이를 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(f) 적어도 약 16 개의 누클레오티드로 이루어진 단편을 포함하는 (a)-(e) 중 어느 하나의 누클레오티드 서열 ;
(g) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(f) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
(h) (a)-(e) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
본 발명은 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다 :
(a) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열 ; 및
(b) ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물에 의해 코드되는 아미노산 서열.
본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다 :
(a) SEQ ID NO : 2 의 오르토로그에 대한 아미노산 서열 ;
(b) SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 70 % 상동인 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(c) 적어도 약 25 개의 아미노산 잔기를 포함하는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열의 단편, 여기에서 단편은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖거나 또는 항원성이다 ; 및
(d) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열의 대립형질 변이체또는 스플라이스 변이체에 대한 아미노산 서열, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물에 의해 코드되는 아미노산 서열, (a) 또는 (b).
본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다 :
(a) 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(b) 적어도 하나의 아미노산 삽입을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(c) 적어도 하나의 아미노산 결실을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
(d) C - 및/또는 N - 말단이 절두된, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ; 및
(e) 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두 및 N-말단 절두 중에서 선택한 적어도 하나의 변이를 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 IL-1ra-L 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또한 본 발명은 본원에 기술한 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 본원에 기술한 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포 및 숙주 세포를 배양하고 이렇게 생산된 폴리펩티드를 선택적으로 분리함을 포함하는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 포함하는 비-인체 형질전환 동물이 본 발명에 포함된다. IL-1ra-L 핵산 분자는 이것이 발현될 수 있도록 동물 내로 도입되어 혈중 농도를 포함한 IL-1ra-L 폴리펩티드의 농도가 증가한다. 택일적으로, IL-1ra-L 핵산 분자는 내생 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 막는 방식으로 동물 내로 도입된다(즉, IL-1ra-L 폴리펩티드 유전자 넉아웃을 갖는 형질전환 동물을 생산한다). 비-인체 형질전환 동물은 포유동물이 바람직하며, 랫이나 마우스와 같은 설치류가 더욱 바람직하다.
또한 본 발명은 IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체를 제공한다.
부가적으로, 본 발명의 IL-1ra-L 폴리펩티드와 선택적으로 결합할 수 있는 펩티드 및 항체와 같은 선택적 결합제도 제공한다. 이러한 항체와 펩티드는 작동적 또는 길항적일 수 있다.
본 발명의 누클레오티드, 폴리펩티드 또는 선택적 결합제 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 제제형을 함유하는 약학적 조성물 또한 본 발명에 포함된다. 약학적 조성물은 본 발명의 누클레오티드 또는 폴리펩티드를 치료학적 유효량으로 제공하는 데 사용한다. 본 발명은 또한 폴리펩티드, 핵산 분자 및 선택적 결합제를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 IL-1ra-L 폴리펩티드 및 핵산 분자는 본원에 언급한 질환이나 장애를 치료하거나 경감시키고 및/또는 진단하는 데 사용된다.
본 발명은 IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합하는 실험 분자를 확인하기 위해 실험 분자를 검정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 폴리펩티드에 대한 실험 분자의 결합 정도를 측정하기 위해 실험 분자와 IL-1ra-L 폴리펩티드를 접촉시킴을 포함한다. 이 방법은 또한 이러한실험 분자가 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대해 작동물질인지 길항물질인지를 결정함을 포함한다. 본 발명은 또한 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현이나 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성에 미치는 분자의 영향을 실험하는 방법을 제공한다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 조절하고 농도를 조절하는(즉, 증가시키거나 감소시키는) 방법 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 방법은 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 동물에게 투여함을 포함한다. 다른 방법에 있어서, IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 조절하는 요소를 포함하는 핵산 분자를 투여할 수 있다. 이러한 방법의 예로는 유전자 치료, 세포 치료, 본원에 기술한 것 이외의 안티-센스 치료가 포함된다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, IL-1ra-L 폴리펩티드는 그것의 수용체("IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체")를 확인하는 데 사용할 수 있다. 여러 형태의 "발현 클로닝" 은 단백질 리간드에 대한 수용체를 클로닝하는 데 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, Simonsen 및 Lodish, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15 : 437 - 41 및 Tartaglia 등의 1995, Cell 83 : 1263 - 71 을 참조하라. IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체를 분리함으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드 신호 경로의 신규한 작동물질 및 길항물질을 확인하거나 개발할 수 있게 되었다. 이러한 길항물질과 작동물질은 가용성 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체, 항 - IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체 - 선택적 결합제 (이것의 항체 및 유도체 등), 소분자 및 안티센스 올리고누클레오티드 등을 포함하며, 이들 모두는 본원에 기술한 질환이나 장애를 포함하여 하나 또는 그 이상의 질환이나 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 발명은 신규한 인터루킨-1 수용체 길항물질 - 유사(IL - 1ra - L) 폴리펩티드 및 이를 코드하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선택적 결합제, 벡터, 숙주 세포 및 IL - 1ra - L 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 IL - 1ra - L 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물과 이와 관련된 질환이나 장애 및 증상을 진단하거나 치료하고 경감시키거나/시키고 예방하는 방법에 관한 것이다.
도 1A - 1B 는 인체 IL-1ra-L 유전자의 누클레오티드 서열(SEQ ID NO : 1) 및 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드의 추정 아미노산 서열(SEQ ID NO : 2) 을 나타낸다.
도 2 는 인체 IL-1δ(IL-1-delta ; SEQ ID NO : 3), 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드(IL-1ra-L ; SEQ ID NO : 2), 인체 IL-1ε(IL-1-epsilon ; SEQ ID NO : 4), 인체 IL-1 수용체 길항물질, 분비된 폴리펩티드 (IL-1ra-sec ; SEQ ID NO : 9), 인체 IL-1β(IL-1-beta ; SEQ ID NO : 6) 및 부분적으로 유사성을 갖는 아미노산 위치(칸센서스)를 정렬시킨 아미노산 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 각 항의 제목들은 구성을 위해 기재한 것으로, 이것에 의해 기술된 발명을 제한하려는 것은 아니다. 본 출원에 언급한 모든 참고문헌은 본원에 도입되어 있다.
정의
용어 "IL-1ra-L 유전자", "IL-1ra-L 핵산 분자" 또는 "IL-1ra-L 폴리누클레오티드"는 SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열 및 본원에 기술한 핵산 분자를 포함하거나 이것으로 이루어진 핵산 분자를 말한다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 대립형질 변이체" 는 유기체의 염색체나 유기체 집단의 주어진 위치의 유전자에 일어날 수 있는 수 개의 자연발생적 변이형 중 하나를 말한다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 스플라이스 변이체" 는 핵산 분자, 보통은 RNA 를 말하는 것으로, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 IL-1ra-L 폴리펩티드 아미노산 서열의 RNA 전사물의 인트론 서열을 선택적으로 프로세싱함으로써 생산된다.
용어 "분리된 핵산 분자"는 (1) 원 세포로부터 전체 핵산을 분리할 때 자연적으로 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 다른 물질의 적어도 약 50 % 로부터 분리하거나, (2) "분리된 핵산 분자" 가 자연적으로 결합하는 폴리누클레오티드의 일부 또는 전부에 결합하지 않으며, (3) 자연적으로 결합하지 않는 폴리누클레오티드에 실행가능하게 결합하거나 또는 (4) 보다 큰 폴리누클레오티드 서열의 일부로서 자연적으로 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 말한다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 폴리펩티드 생산이나 이것의 치료학적, 진단적, 예방적 이용 또는 연구에 이용하는 데 있어서 방해가 되는, 자연 환경에서 발견되는 다른 불순한 핵산 분자나 기타 불순물이 실질적으로 함유되지 않는 것이 바람직하다.
용어 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자" 는 DNA 서열 또는 RNA 서열을 말한다. 이 용어는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리딘일-시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소-펜텐일아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜텐일아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노푸린과 같은 DNA 및 RNA 의 공지된 염기 유사체 중 하나로 부터 형성되나 이에 한정되지는 않는다.
용어 "벡터" 는 숙주 세포에 대한 코딩 정보를 전이시키는 데 사용하는 모든 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 언급하는 데 사용한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 삽입된 이형 핵산 서열의 발현을 관리하고/하거나 조절하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 말한다. 발현은 전사, 번역 및 인트론이 존재할 경우의 RNA 스플라이싱 등과 같은 과정을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용한 용어 "실행가능하게 결합" 은 플랭킹 서열의 배치를 말하는 것으로, 여기에서 기술된 플랭킹 서열은 통상적인 기능을 수행할 수 있도록 배치되거나 조립된다. 따라서, 코딩 서열에 실행가능하게 결합되는 플랭킹 서열은 코딩 서열의 복제, 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절할 수 있을 경우에 코딩 서열은 프로모터에 실행가능하게 결합한다. 플랭킹 서열은 그것이 제대로 작용하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어 전사는 되었으나 아직 번역은 되지 않은 개재 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 코딩 서열에 "실행가능하게 결합" 하는 것으로 간주할 수 있다.
용어 "숙주 세포" 는 형질전환된 세포를 일컬을 때 사용하며, 이 숙주 세포는 핵산 서열로 형질전환된 다음 선택한 목표 유전자를 발현시킬 수 있다. 이 용어는 선택한 유전자가 존재하는 한, 자손이 원래의 모세포의 구성과 형태학적으로나 유전학적으로 상동인 지에 관계없이 모세포의 자손까지 포함된다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 관련 폴리펩티드를 말한다. 관련 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드의 활성 중 적어도 하나를 갖는 IL-1ra-L 폴리펩티드 단편, IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그, IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체 및 IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체를 포함한다. IL-1ra-L 폴리펩티드는 본원에 기술한 바와 같이 성숙한 폴리펩티드이며,그것의 제조방법에 따라 아미노-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 그렇지 않을 수 있다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 단편" 은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드의 아미노-말단 절두 (리더 서열을 갖거나 그렇지 않음) 및/또는 카르복시-말단의 절두를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 단편" 은 IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그, IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 절두물을 말하거나 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 대립형질 변이체 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 스플라이스 변이체에 의해 코드되는 폴리펩티드의 아미노-말단 및/또는 카르복시 말단 절두물을 말한다. IL-1ra-L 폴리펩티드 단편은 선택적인 RNA 스플라이싱이나 생체내 프로테아제 활성에서 기인한다. IL-1ra-L 폴리펩티드의 막-결합 형태 또한 본 발명에 포함된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 절두물 및/또는 결실물은 약 10 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 75 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산 또는 약 100 개 이상의 아미노산을 포함한다. 이렇게 생산된 폴리펩티드 단편은 약 25 개의 인접한 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 75 개의 아미노산 또는 약 100 개의 아미노산 또는 약 125 개의 아미노산을 포함한다. 이러한 IL-1ra-L 폴리펩티드 단편은 아미노 - 말단 메티오닌 잔기를 임의로포함할 수 있다. 이러한 단편은 예를 들어 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하는 데 사용할 수 있을 것으로 여겨진다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그(ortholog)" 는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 IL-1ra-L 폴리펩티드 아미노산 서열에 상응하는 다른 종의 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 마우스 및 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드는 서로의 오르토로그로 간주된다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체" 는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 IL-1ra-L 폴리펩티드 아미노산 서열 (리더 서열을 갖거나 그렇지 않음) 에 비해 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열이 치환, 결실 (내부 결실 및/또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 단편 등) 및/또는 부가 (내부 부가 및/또는 IL-1ra-L 융합 폴리펩티드 등) 된 아미노산 서열을 포함하는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 말한다. 변이체는 자연발생적이거나 (예를 들어, IL-1ra-L 폴리펩티드 대립형질 변이체, IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그, IL-1ra-L 폴리펩티드 스플라이스 변이체) 또는 인공적으로 구성된다. 이러한 IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 DNA 서열에 따라 달라지는 DNA 서열을 갖는 해당 핵산 분자로부터 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 변이체는 1 내지 3 개, 1 내지 5 개, 1 내지 10 개, 1 내지 15 개, 1 내지 20 개, 1 내지 25 개,1 내지 50 개, 1 내지 75 개, 1 내지 100 개 또는 100 개 이상의 아미노산이 치환되거나 삽입, 부가 및/또는 결실된 것이며, 여기에서 치환은 보존적이거나 비-보존적 또는 이들의 조합으로 일어날 수 있다.
용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체" 는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드, IL-1ra-L 폴리펩티드 단편, IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그 또는 본원에 기술한 바와 같이 화학적으로 변이된 IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체를 말한다. 용어 "IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체" 는 또한 IL-1ra-L 폴리펩티드 대립형질 변이체 또는 본원에 기술한 바와 같이 화학적으로 변이된 IL-1ra-L 폴리펩티드 스플라이스 변이체에 의해 코드되는 폴리펩티드를 말한다.
용어 "성숙한 IL-1ra-L 폴리펩티드" 는 리더 서열이 없는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 말한다. 성숙한 IL-1ra-L 폴리펩티드는 아미노-말단 (리더 서열을 갖거나 그렇지 않음) 및/또는 카르복시-말단의 단백질가수분해적 프로세싱, 보다 큰 전구체에서 보다 작은 폴리펩티드로의 절단, N-결합 및/또는 O-결합 글리코실화 등의 기타 변이를 포함할 수 있다.
용어 "IL-1ra-L 융합 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드, IL-1ra-L 폴리펩티드 단편, IL-1ra-L 폴리펩티드 오르토로그,IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체 또는 본원에 기술한 IL-1ra-L 유도체의 아미노-말단이나 카르복시-말단의 아미노산 중 하나 또는 그 이상이 융합(이형 단백질 또는 펩티드) 됨을 말한다. 용어 "IL-1ra-L 융합 폴리펩티드는 또한 IL-1ra-L 폴리펩티드 대립형질 변이체 또는 본원에 기술한 바와 같은 IL-1ra-L 폴리펩티드 스플라이스 변이체에 의해 코드되는 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단의 아미노산 중 하나 또는 그 이상이 융합됨을 말한다.
용어 "생물학적으로 활성인 IL-1ra-L 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 특징적인 활성 중 적어도 하나를 갖는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 말한다. 또한, IL-1ra-L 폴리펩티드는 면역원으로서 활성적이다. 즉, IL-1ra-L 폴리펩티드는 항체가 생성되는 적어도 하나의 에피토프를 함유한다.
용어 "분리된 폴리펩티드" 는 (1) 원 세포로부터 분리할 때 자연적으로 발견되는 폴리누클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 그외의 물질 중 적어도 약 50 % 로부터 분리하거나, (2) "분리된 폴리펩티드" 가 자연적으로 결합하는 폴리펩티드의 일부 또는 전부에(공유 결합 또는 비공유 결합에 의해) 결합하지 않으며, (3) 그것이 자연적으로 결합하지 않는 폴리펩티드에(공유 결합 또는 비공유 결합에 의해) 실행가능하게 결합하거나 또는(4) 자연적으로 발생하지 않는 본 발명의 폴리펩티드를 말한다. 분리된 폴리펩티드는 치료학적, 진단학적, 예방적으로 이용하거나 또는 연구에 이용하는 데 방해가 되는, 자연 환경에서 발견되는 기타 불순한 폴리펩티드 또는 불순물이 실질적으로 함유되어 있지 않는 것이 바람직하다.
본 분야에 알려져 있는 용어 "상동성" 은 서열 비교에 의해 측정한, 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 또는 둘 또는 그 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 말한다. 본 분야에서 "상동성" 은 또한 둘 또는 그 이상의 누클레오티드 또는 둘 또는 그 이상의 아미노산 서열을 정렬시켜 부합되는 것을 측정한, 핵산 분자 또는 폴리펩티드 간의 서열 관계성을 말한다. "상동성"은 갭을 정렬시켜 (만약 있다면) 둘 또는 그 이상의 서열 중 작은 것의 상동인 부합 백분율을 특정한 수학적 모델이나 컴퓨터 프로그램 (즉 "알고리즘")으로 처리하여 측정한다.
용어 "유사성" 은 "상동성" 과는 대조되는 개념이지만 이와 관계가 있는 개념으로서, 동일하게 부합되는 부분과 보존적 치환 부분 둘다를 포함하는 관계성을 측정하는 것이다. 예를 들어 두 폴리펩티드 서열이 10/20 의 상동인 아미노산 서열을 갖고 나머지는 모두 비-보존적인 치환이라면, 상동성 및 유사성 백분율은 둘다 50 % 가 될 것이다. 동일한 예에서, 보존적 치환이 존재할 경우 5 개 이상의 위치에 존재한다면 상동성 백분율은 여전히 50 % 이지만 유사성 백분율은 75 % (15/20) 가 될 것이다. 따라서, 보존적 치환이 존재할 경우에 두 폴리펩티드 간의 유사성 백분율은 이들 두 폴리펩티드 간의 상동성 백분율보다 높을 것이다.
핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질에 대하여 사용하는 용어 "자연발생적인" 또는 "천연"은 자연에서 발견되는 물질로 인간에 의해 조작되지 않은 물질을 말한다. 마찬가지로, 본원에 사용한 용어 "비-자연 발생적인" 또는 "비-천연" 은 자연에서 발견되지 않고 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 말한다.
용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량" 은 각각 본원에 기술된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 또는 그 이상을 관찰할 수 있을 정도로 나타나게 하는 데 필요한 IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 IL-1ra-L 핵산 분자의 양을 말한다.
본원에 사용한 용어 "약학적으로 용인가능한 담체" 또는 "생리학적으로 용인가능한 담체" 는 IL-1ra-L 폴리펩티드, IL-1ra-L 핵산 분자 또는 IL-1ra 선택적 결합제를 약학적 조성물로 운반하거나 그것을 증가시키는 데 적합한 하나 또는 그 이상의 제제형 물질을 말한다.
용어 "항원" 은 항체 등과 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고, 그 항원의 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 말한다. 항원은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 갖는다.
용어 "선택적 결합제" 는 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대해 특이성을 갖는 분자(들)를 말한다. 본원에 사용한 용어 "특이" 및 "특이성" 은 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드에는 결합하고 입체 비-IL-1ra-L 폴리펩티드에는 결합하지 않는 선택적 결합제의 능력을 말한다. 그러나, 선택적 결합제는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드의 오르토로그에 결합하는 것으로 여겨진다. 즉, 마우스 및 랫의 IL-1ra-L 폴리펩티드와 같은 종간 이형에도 결합하는 것으로 여겨진다.
용어 "형질도입" 은 보통은 파지에 의해 한 박테리아에서 다른 박테리아로 유전자를 전이시킴을 말한다. "형질도입" 은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵 세포 서열의 획득 및 전이를 말한다.
용어 "감염" 은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA 의 흡수를 일컫는 말이며, 외인성 DNA 가 세포막 내부로 도입되었을 때 세포가 "감염" 되었다고 한다. 여러 감염 기술은 본 분야에 널리 알려져 있으며본원에 기술되어 있다. 예를 들어, Graham 등의 1973, Virology 52:456 ; Sambrook 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis 등의 Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); 및 Chu 등의 1981, Gene 13:197 을 참조하라. 이러한 기술은 하나 또는 그 이상의 외인성 DNA 부분을 적당한 숙주 세포내로 도입시키는 데 사용할 수 있다.
본원에 사용한 용어 "형질전환" 은 세포의 유전자 특성을 변화시키는 것을 말하며, 새로운 DNA 를 내포함으로써 변이되었을 때 세포가 형질전환되었다고 한다. 예를 들어, 천연 상태에서 유전적으로 변이되었을 때 세포는 형질전환된다. 감염 또는 형질도입에 이어, DNA 의 형질전환은 세포의 염색체 내로 물리적으로 도입함으로써 세포의 염색체를 재조합하거나, 복제되지 않는 에피솜 요소로 일시적으로 함유하거나 또는 플라스미드로 독립적으로 복제된다. 세포는, DNA 가 세포 분열로 복제될 때 안정하게 형질전환되는 것으로 여겨진다.
핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 관계
관련 핵산 분자는 SEQ ID NO : 1 의 핵산 분자의 대립형질 변이체 또는 스플라이스 변이체를 포함하며 상기 누클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보적인 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 관련 핵산 분자는 SEQ ID NO : 2 의 폴리펩티드에 비해 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 변형, 부가 및/또는 삽입되거나 또는 필수적으로 이러한 변이로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 관련 IL-1ra-L 폴리펩티드는 예를 들어 N - 결합 또는 O - 결합 글리코실화 부위 중 하나 또는 그 이상의 삽입 및/또는 결실을 포함하거나 시스테인 잔기 중 하나 또는 그 이상의 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
관련 핵산 분자는 또한 SEQ ID NO : 2 의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 적어도 약 25 개의 인접 아미노산 잔기, 약 50 개의 아미노산 잔기, 약 75 개의 아미노산 잔기, 약 100 개의 아미노산 잔기, 약 125 개의 아미노산 잔기 또는 125 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 IL-1ra-L 핵산 분자의 단편을 포함한다.
또한, 관련 IL-1ra-L 핵산 분자는 SEQ ID NO : 1 의 IL-1ra-L 핵산 분자, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 분자, 본원에 기술한 핵산 단편 또는 본원에 기술한 폴리펩티드를 코드하는 핵산 단편의 상보 서열과 본원에 기술한 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 완전히 혼성되는 누클레오티드 서열을 포함하는 분자도 포함한다. 혼성화 프로브는 본원에서 제공하는 IL-1ra-L 서열을 이용함으로써 제조하여 관련 서열에 대한 cDNA, 게놈 DNA 라이브러리 또는 합성 DNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열에 대해 상당한 상동성을 나타내는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 DNA 및/또는 아미노산 서열 영역은 본원에 기술한 서열 정렬 알고리즘을 이용하여 쉽게 결정할 수 있으며, 이들 영역은 스크리닝에 필요한 프로브를 제조하는데 사용할 수 있다.
용어 "매우 엄격한 조건" 은 서열이 매우 상보적인 DNA 가닥이 혼성되고 부합되지 않는 DNA 의 혼성화를 거의 배제하도록 고안한 조건을 일컫는다. 혼성화의 엄격성은 대체로 포름아미드와 같은 온도, 이온 강도, 변성제의 농도에 의해 결정된다. 혼성화와 세척에 대한 "매우 엄격한 조건" 은 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 65 - 68 ℃ 또는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 50 % 포름아미드, 42 ℃ 이다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson 등의 Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited) 를 참조하라.
보다 엄격한 조건 (예를 들어, 보다 높은 온도, 보다 낮은 이온 강도, 보다 높은 농도의 포름아미드 또는 기타 변성제) 을 이용할 수도있으나 혼성화 속도에 영향을 미칠 것이다. 비특이 혼성화 및/또는 백그라운드 혼성화를 줄이기 위해 기타 다른 시약을 혼성화 완충액과 세척 완충액에 포함시킬 수 있다. 예로서, 0.1 % 소혈청 알부민, 0.1 % 폴리비닐-피롤리돈, 0.1 % 피로인산나트륨, 0.1 % 도데실황산나트륨, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (또는 기타 비-상보적 DNA) 및 황산덱스트란 등이 있으나 적당한 다른 시약도 사용할 수 있다. 이러한 부가제의 농도와 형태는 혼성화 조건의 엄격성에는 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 변화시킬 수 있다. 혼성화 실험은 보통 pH 6.8 - 7.4 에서 실시한다. 그러나, 전형적인 이온 강도 조건에서 혼성화 속도는 pH 에 대해 거의 영향을 받지 않는다 [예를 들어, Nucleic Acid Hybridisation : A practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited) 참조].
DNA 이중체의 안정성에 영향을 미치는 인자는 염기 조성, 길이 및 염기쌍의 비부합 정도 등을 포함한다. 본 분야의 숙련자들은 이러한 변수에 적응할 수 있고 상이한 서열 관계를 갖는 DNA 들의 하이브리드를 형성할 수 있는 혼성 조건을 조절할 수 있다. 완벽하게 부합되는 DNA 이중체의 융해 온도는 다음 식으로 계산할 수 있다 :
Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.41(% G+C) - 600/N - 0.72(% 포름아미드)
여기에서 N 은 형성된 이중체의 길이이고, [Na+] 는 혼성 용액이나 세척 용액내 나트륨 이온의 몰농도이며, % G + C 는 하이브리드내 (구아닌 + 시토신) 염기의 백분율이다. 불완전하게 부합된 하이브리드의 경우, 융해 온도는 1 % 씩 비부합될 때마다 대략 1 ℃ 씩 감소한다.
용어 "온화한 조건" 은 "매우 엄격한 조건" 하에서보다 비부합되는 염기쌍을 더 많이 갖는 DNA 이중체가 형성될 수 있는 조건을 말한다. "온화한 조건" 의 전형적인 예로는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 50 - 65 ℃ 또는 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 20 % 포름아미드, 37 - 50 ℃ 이다. 이러한 예에서, 50 ℃, 0.015 M 나트륨 이온일 경우의 "온화한 조건" 하에서는 약 21 % 가 비부합될 것이다.
본 분야의 숙련자들은 "매우 엄격한 조건" 과 "온화한 조건" 간의 절대적인 차이는 없음을 인지할 것이다. 예를 들어, 0.015 M 의 나트륨 이온에서 (포름아미드는 존재하지 않음) 완전히 부합된 긴 DNA 의 융해 온도는 약 71 % 이다. 65 ℃ 에서 세척할 경우에는 약 6 % 가 비부합될 것이다. 보다 밀접하지 않은 관련 서열을 포착하기 위해 본 분야의 숙련자들은 간단히 온도를 낮추거나 이온 강도를 높일수 있다.
약 20 개의 누클레오티드까지의 올리고누클레오티드 프로브에 대하여 1 M NaCl*에서의 융해 온도를 구하는 식은 다음과 같다 :
Tm= A - T 염기쌍 당 2 ℃ + G - C 염기쌍 당 4 ℃
*6 ×시트르산나트륨염 (SSC) 내 나트륨 이온 농도는 1 M 이다. Suggs 등의 Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown 및 Fox, eds., 1981) 을 참조하라.
올리고누클레오티드에 대한 매우 엄격한 세척 조건은 일반적으로 6 ×SSC, 0.1 % SDS 에서 올리고누클레오티드의 Tm이 영하 0 - 5 ℃ 의 온도이다.
다른 실시형태에 있어서, 관련 핵산 분자는 SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열과 적어도 약 70 % 상동인 누클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지거나, 또는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드와 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 필수적으로 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드와 약 75 %, 약 80 %, 약 85 %, 약 90 % 또는 약 95, 96, 97, 98 또는 99 % 상동이며, 이 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 서열과 약 75 %, 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 95, 96, 97, 98 또는 99 % 상동인 폴리펩티드를 코드한다. 관련 핵산 분자는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드한다.
핵산 서열의 차이는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열과 관련한 아미노산 서열의 보존적 및/또는 비-보존적 변이에서 비롯된다.
SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열에 대한 보존적 변이 (및 코드되는 누클레오티드에 대한 해당 변이)는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 그것과 유사한 기능적·화학적 특성을 갖는 폴리펩티드를 생산할 것이다. 이와는 대조적으로, IL-1ra-L 폴리펩티드의 기능적 및/또는 화학적 특성은 (a) 예를 들어 시트나 나선 형태와 같은 치환 영역의 분자 골격 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 곁사슬의 부피를 유지하는 데에 대한 결과가 상당히 달라지는, SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열 상의 치환을 통해 상당한 변이를 이룰 수 있을 것이다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 은 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않도록 천연 아미노산 잔기를 비-천연 잔기로 치환하는 것이다. 또한, 폴리펩티드내 모든 천연 잔기는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 에 대해 기술한 바와 같이 알라닌으로 치환할 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 보통 생물계에서 합성하는 것보다 화학적으로 펩티드를 합성하여 결합시키는 비-자연발생적인 아미노산 잔기를 포함한다. 이것은 아미노산 부분의 펩티드유사체 및 기타 역형태를 포함한다.
자연발생적인 잔기는 그것의 일반적인 곁사슬 특성에 따라 다음과 같이 구분할 수 있다 :
1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;
2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;
3) 산성 : Asp, Glu ;
4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;
5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및
6) 방향성 : Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비-보존적 치환은 이들 군 중 하나의 잔기를 다른 군의 잔기로 치환하는 것을 말한다. 이렇게 치환된 잔기는 비-인체 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상동인 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드 영역 내로 도입되거나 분자의 비-상동 영역 내로 도입될 수 있다.
이러한 치환에 있어서, 아미노산의 수치료 지수를 고려할 수 있다. 각 아미노산의 소수성과 전하 특성에 따라 수치료 지수를 정하였다. 수치료 지수는 다음과 같다 : 이소로이신(+4.5) ; 발린(+4.2) ; 로이신(+3.8) ; 페닐알라닌(+2.8) ; 시스테인/시스틴(+2.5) ; 메티오닌(+1.9) ; 알라닌(+1.8) ; 글리신(-0.4) ; 트레오닌(-0.7) ; 세린(-0.8) ; 트립토판(-0.9) ; 티로신(-1.3) ; 프롤린(-1.6) ; 히스티딘(-3.2) ; 글루탐산(-3.5) ; 글루타민(-3.5) ; 아스파르트산(-3.5) ; 아스파라긴(-3.5) ; 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 대한 생물학적 상호작용을 부여하는 데 있어서 아미노산의 수치료 지수의 중요성은 일반적으로 본 분야에 잘 알려져 있다(Kyte 등의 1982, J. Mol. Biol. 157 : 105-31 참조). 아미노산은 유사한 수치료 지수 또는 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 이럴 경우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 수치료 지수를 기초로 한 치환에 있어서, ±2 이내, 더욱 바람직하게는 ±1 이내, 보다 바람직하게는 ±0.5 이내의 수치료 지수를 갖는 아미노산 치환이 바람직하다.
이러한 경우와 같이 생산된 생물학적·기능적으로 등가인 단백질 또는 펩티드를 면역학적인 실시형태에 사용하고자 할 경우, 아미노산의 친수성을 토대로 유사 아미노산으로 치환하는 것이 보다 효율적이라는 사실은 본 분야에 알려져 있다. 단백질의 친수성의 최대 국소 평균은 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되므로, 단백질의 생물학적 특성과 같은 면역원성 및 항원성과 관계가 있다.
아미노산 잔기의 친수성 값은 다음과 같다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0) ; 아스파르트산(+3.0 ±1) ; 글루탐산(+3.0 ±1) ; 세린(+0.3) ; 아스파라긴(+0.2) ; 글루타민(+0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4) ; 프롤린(-0.5 ±1) ; 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5) ; 시스테인(-1.0) ; 메티오닌(-1.3) ; 발린(-1.5) ; 로이신(-1.8) ; 이소로이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5) ; 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값을 토대로 한 치환에 있어서, ±2 이내, 더욱 바람직하게는 ±1 이내, 보다 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 친수성을 토대로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이러한 영역을 "에피토프성 코어 영역" 이라고도 한다.
현대의 본 분야의 숙련자들은 아미노산 치환에 있어서 바람직한 치환(보존적이건 비-보존적이건 간에)을 결정할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 IL-1ra-L 폴리펩티드의 중요한 잔기를 확인하거나, 본원에 기술한 IL-1ra-L 폴리펩티드의 친화성을 증가시키거나 감소시키는 데 사용할 수 있다. 아미노산 치환의 예를 표 Ⅰ 에 나타내었다.
본 분야의 기술자들은 공지된 기술을 사용하여 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드의 적절한 변이체를 결정할 것이다. 생물학적 활성도를 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적당한 부위를 확인하기 위해, 본 분야의 숙련자들은 활성도에 영향을 미치지 않는 부위를 목표로 정할것이다. 예를 들어, 동일한 종 또는 다른 종으로부터 유사한 활성을 나타내는 유사 폴리펩티드가 공지된 경우에, 본 분야의 숙련자는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상기 유사 폴리펩티드를 비교할 것이다. 이러한 비교로, 유사 폴리펩티드 사이에 보존된 분자의 부분 및 잔기를 확인할 수 있다. IL-1ra-L 분자의 영역에서의 변화는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성도 및/또는 구조에 역으로 영향을 덜 미칠것 같은 상기 유사 폴리펩티드에 관하여 보존되지 않음을 인지할 것이다. 본 분야의 숙련자는 또한 상대적으로 보존된 영역에서 조차도, 활성도를 보유하면서(보존적 아미노산 잔기 친환) 천연 발생 잔기 대신에 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환함을 인지할 것이다. 따라서, 생물학적 활성도 또는 구조에 중요한 영역은 폴리펩티드 구조에 역으로 영향을 미치지 않거나 생물학적 활성도를 파괴하지 않으면서 보존적 아미노산 치환에 영향을 받을 것이다.
부가적으로, 본 분야의 숙련자는 활성도 또는 구조에 중요한 유사 폴리펩티드에서 잔기를 확인하는 구조 - 기능 연구를 조사할 수 있다.상기 비교를 고려하여, 유사 폴리펩티드에서 활성도 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기와 상응하는 IL-1ra-L 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 상기 예측된 중요 아미노산 잔기 대신에 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 것이다.
본 분야의 숙련자는 또한 유사 폴리펩티드에서 구조와 관련된 아미노산 서열 및 3 차 구조를 분석할 수 있다. 이러한 정보를 고려하여, 본 분야의 숙련자는 폴리펩티드의 3 차 구조와 관련된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 잔기 배열을 예측할 것이다. 상기 잔기는 다른 분자들 간의 중요한 상호작용에 포함되므로, 본 분야의 숙련자는 단백질 표면 상에 존재하는 것으로 추정되는 아미노산 잔기에 대한 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 것이다. 더욱이, 본 분야의 숙련자는 각각의 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 형성할 것이다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 활성도 검정을 이용하여 변이체를 스크리닝하였다. 적절한 변이체에 대한 정보를 수집하기 위하여 상기 변이체를 사용하였다. 예를 들어, 특정한 아미노산 잔기에 대한 변화로 인해 활성도가 파괴되고, 바람직하지 않게 감소되거나 부적절한 활성도가 형성된다면, 상기 변화를 갖는 변이체를 피해야 할 것이다. 즉, 상기 일반적인 실험으로부터 수집한 정보를 바탕으로, 단독으로 또는 다른 돌연변이와 병행하여 치환을 피해야 할 경우에 본 분야의 숙련자는 쉽게 아미노산을 결정할 수 있다.
많은 과학 간행물에 2 차 구조 예측에 관해 기술되어 있다. Moult, 1996,Curr. Opin. Biotechnol.7 : 422 - 27 ; Chou 등의 1974,Biochemistry13 : 222 - 45 ; Chou 등의 1974,Biochemistry113 : 211 - 22 ; Chou 등의 1978,Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.47 : 45 - 48 ; Chou 등의 1978,Ann. Rev. Biochem.47 : 251 - 276 ; 및 Chou 등의 1979,Biophys.J. 26 : 367 - 84 참조하라. 더욱이, 컴퓨터 프로그램은 현재 2 차 구조를 추정하는데 도움이 되며 유용하다. 2 차 구조를 추정하는 한 가지 방법은 상동성 모델링에 기초를 둔다. 예를 들어, 두 개의 폴리펩티드 또는 단백질은 30 % 이상의 서열 상동성, 또는 40 % 이상의 유사성을 나타내며 종종 유사한 구조적 위상 기하학을 갖는다. 단백질 구조의 데이터베이스(PDB)의 최근 발전은 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내의 가능한 수의 접힘을 포함하여, 2 차 구조에 관한 증가된 예측을 제공한다. Holm 등의 1999, Nucleic Acids Res. 27 : 244 - 47 참조하라. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질내에 한정된 수의 접힘이 존재하며 일단 구조의 임계 수가 결정되면, 구조적 예측은 좀 더 정확해질 것이다(Brenner 등의 1997,Curr. Opin. Struct. Biol.7 : 369 - 76 참조).
2 차 구조를 추정하는 또다른 방법으로는 "스레딩(threading)"[Jones, 1997,Curr. Opin. Struct. Biol.7 : 377 - 87 ; Sippl 등의 1996,Structure4 : 15 - 19], "프로파일 분석" (Bowie 등의 1991,Science, 253 : 164 - 70 ; Gribskov 등의 1990,Methods Enzymol. 183 : 146 - 59 ; Gribskov 등의 1987,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.84 : 4355 - 58) 및 "진화적 결합(evolutionary linkage)" [Holm 등의 상기 문헌 및 Brenner 등의 상기 문헌 참조]이 포함된다.
바람직한 IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며 여기에서, 변형된 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형을 SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열과 비교하였다. 특정 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열보다 많거나 적은 수의 N-결합 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합 글리코실화 부위는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이 특징적이며, 여기에서 X 로 지정한 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기일 것이다. 이러한 서열을 만들기 위한 아미노산 잔기 치환은 N-결합 탄수화물 쇄의 첨가에 관한 신규한 가능 부위를 제공한다. 선택적으로, 이러한 서열을 제거하는 치환은 존재하는 N-결합 탄수화물 쇄를 제거할 것이다. N-결합 탄수화물 쇄의 재배열이 제공되며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위(일반적으로, 자연적으로 발생함)를 제거하고 하나 또는 그 이상의 신규한 N-결합 부위가 생성되었다. 또다른 바람직한 IL-1ra-L 변이체는 시스테인 변이체를 포함하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기는 결실되거나 SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환된다. 불용성 봉입체의 분리 후와 같은 생물학적 활성 입체구조내로 IL-1ra-L 폴리펩티드가 재접힘되는 경우에 시스테인 변이체는 유용하다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 적은 수의 시스테인 잔기를 가지며 전형적으로 짝짓지않은 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하기 위해 짝수의 시스테인 잔기를 갖는다.
다른 실시형태에서, 관련 핵산 분자는 SEQ ID NO : 2 에 기재된, 적어도 하나의 아미노산이 삽입된 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 구성되어 있으며, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 아미노산이 결실된 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열의 활성도를 가지며 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드의 활성도를 갖는다. 관련 핵산 분자 또한 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 구성되어 있으며 여기에서 폴리펩티드는 카르복시- 및/또는 아미노 - 말단이 절단되었고, SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드의 활성도를 갖는다. 관련 핵산 분자또한 다음 중에서 선택한 적어도 하나의 변형이 일어난 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열을 포함하거나 이것으로 구성되어 있다 ; 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, 카르복시 - 말단 절단 및 아미노 - 말단 절단, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재된 폴리펩티드의 활성도를 갖는다.
게다가, SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이형 이량체를 형성하기 위해 이종 폴리펩티드에 융합되고 동형 이량체를 형성하기 위해 상동 폴리펩티드에 융합될 것이다. 이종의 펩티드 및 폴리펩티드는 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : IL-1ra-L 융합 폴리펩티드의 탐지 및/또는 분리를 가능하게 하는 에피토프 ; 세포외 도메인이나 막 및 세포내 도메인과 같은 막 수용체 단백질 또는 그것의 일부 ; 막 수용체 단백질에 결합하는 리간드 또는 그것의 일부 ; 효소적 활성을 나타내는 효소 또는 그것의 일부 ; 소중합체화를 증진시키는 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 로이신 지퍼 도메인) ; 안정성을 증가시키는, 면역글로불린 불변 영역 같은 폴리펩티드 또는 펩티드 ; 및 SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와는 상이한 치료적 활성도를 갖는 폴리펩티드 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드.
SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 아미노 - 말단이나 카르복시 - 말단에서 융합이 일어날 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자 부재 또는 존재하에 융합이 일어날 것이다. 링커 또는 어댑터 분자는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며 전형적으로 약 20 내지 약 50 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 또한 융합된 성분을 분리하도록 DNA 제한 엔도누클레아제 또는 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖도록 만들어져 있다. 일단 구성되면, 본원에 기술한 방법에 따라 융합 폴리펩티드를 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, SEQ ID NO : 2 에 기재된 아미노산 서열 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 인체 IgG 의 Fc 영역 중 하나 또는 그 이상의 도메인에 융합된다. 항체는 항원과 결합하는 "Fab" 로 알려진 가변 도메인 및 보체 활성과 식세포 공격과 같은 작동 인자 기능을 함유하는 "Fc" 로 알려진 불변 도메인인 두 가지의 기능적으로 독립된 부분을 포함한다. Fc 는 긴 혈청 반감기를 가지고 있는 반면에 Fab 의 반감기는 짧다. Capon 등의 1989, Nature 337 : 525 - 31 참조하라. 치료용 단백질과 함께 구성될 경우에, Fc 도메인은 보다 긴 반감기를 제공할 수 있으며 또는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정 및 심지어는 태반 이동과 같은기능을 혼합할 수 있다. 본 분야에 공지된 특정 Fc 융합의 사용이 표 Ⅱ 에 요약되어 있다.
실시예에서, 인체 IgG 힌지, CH2 및 CH3 영역은 본 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노 - 말단이나 카르복시 - 말단에 융합될 것이다. 다른 실시예에서, 인체 IgG 힌지,CH2 및 CH3 영역은 IL-1ra-L 폴리펩티드 단편(예를 들어, IL-1ra-L 폴리펩티드의 예측되는 세포외 부분)의 아미노 - 말단이나 카르복시 - 말단에 융합될 것이다.
결과적으로 생성된 IL-1ra-L 융합 폴리펩티드는 단백질 A 친화 컬럼을 사용하여 정제될 것이다. Fc 영역에 융합된 펩티드 및 단백질은 융합되지 않은 상대물보다 생체내에서 실질적으로 긴 반감기를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, Fc 영역과의 융합은 융합 폴리펩티드의 이량체화/다량체화를 가능하게 한다. Fc 영역은 자연적으로 발생한 Fc 영역이거나 치료되는 증상, 순환 시간 또는 감소된 응집과 같은 특정 성질을 향상시키기 위해 변형시킬 수 있다.
관련 핵산 분자 및 폴리펩티드의 상동성 및 유사성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산된다. 상기 방법으로는 다음의 문헌에 기재된 방법을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다 :Computational Molecular Biology(A.M. Lesk, ed., Oxford University Press 1988) ;Biocomputing:Informatics및Genome Projects(D.W. Smith, ed., Academic Press 1993) ;Computer Analysis of Sequence Data(Part 1, A.M. Griffin 및 H.G. Griffin, eds., Humana Press 1994) ; G. von Heinle,Sequence Analysis in Molecular Biology(Academic Press 1987) ;Sequence Analysis Primer(M. Gribskov 및 J.Devereux, eds., M. Stockton Press 1991) ; 및 Carillo 등의 1988,SIAM J. Applied Math.,48 : 1073.
상동성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험하려는 서열 사이에서의 최상의 부합을 이루도록 제작되었다. 상동성 및 유사성을 측정하기 위한 방법은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 두 서열 사이에서의 상동성 및 유사성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램으로 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : GAP (Devereux 등의 1984, Nucleic Acids Res. 12 : 387 ; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul 등의 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403 - 10)를 포함하는 GCG 프로그램 패키지. BLASTX 프로그램은 내셔널 센터 포 바이오테크널러지 인포메이션(NCBI) 및 다른 원으로부터 이용가능하다[Altschul 등의 BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD) ; Altschul 등의 1990, 상기문헌 참조]. 공지된 스미스 워터만 알고리즘 또한 상동성을 측정하는데 사용되었다.
두 아미노산 서열을 배열하기 위한 특정 배열 계획으로 두 서열 중 단지 짧은 영역만이 매칭되었고 이러한 소형의 배열된 영역은 전장의 두 서열간의 유의한 관계가 없더라도 매우 높은 서열의 상동성을 나타낼것이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 선택한 배열 방법(GAP 프로그램)으로 청구된 폴리펩티드 중에서 적어도 50 개의 근접한 아미노산이 나열된 배열의 결과를 얻었다.
예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP (미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 위스콘신 대학의 제네틱스 컴퓨터 그룹에서 입수)를 사용하여 측정하려는 서열의 상동성 백분율에 대한 두 폴리펩티드를 그들 각각의 아미노산에 관한 최적의 매칭(알고리즘에 의해 측정된 "부합된 길이")을 위해 배열하였다. PAM 250 또는 BLOSUM 62 와 같은 비교 매트릭스 뿐만 아니라 갭 오프닝 패널티[3 X 평균 다이아고널(diagonal)로 계산함 ; "평균 다이아고널" 이란 사용된 비교 매트릭스의 평균 다이아고널을 나타냄 ; "다이아고널" 이란 특정한 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 부합이 되도록 지정한 점수 또는 숫자 이다) 및 갭 익스텐션 페널티(일반적으로 0.1 X 갭 오프닝 페널티로 계산함]는 알고리즘과 연합하여 사용된다. 표준 비교 매트릭스 또한 알고리즘에 의해 사용된다[Dayhoff 등의 5Atlas of Protein Sequence및Structure(Supp. 3 1978) (PAM 250 비교 매트릭스) ; Henikoff 등의 1992,Proc. Natl. Acad. Sci USA89 : 10915 - 19 (BLOSUM 62 비교 매트릭스) 참조하라].
폴리펩티드 서열 비교에 관한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다 :
알고리즘 : Needleman 및 Wunsch, 1970,J. Mol. Biol.48 : 443 - 53 ;
비교 매트릭스 : BLOSUM 62 (Henikoff 등의 상기 문헌 참조) ;
갭 페널티 : 12
갭 길이 페널티 : 4
유사성 역치 : 0
GAP 프로그램은 상기 파라미터에 유용하다. 전술한 파라미터는 GAP 알고리즘을 이용하여 폴리펩티드 비교(말단의 갭에 대한 페널티 없이)에 관한 디폴트(default) 파라미터이다.
핵산 분자 서열 비교에 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다 :
알고리즘 : Needleman 및 Wunsch, 상기 문헌 참조 ;
비교 매트릭스 : 부합 = +10, 비부합 = 0
갭 페널티 : 50
갭 길이 페널티 : 3
GAP 프로그램은 상기 파라미터에 유용하다. 전술한 파라미터는 핵산 분자 비교에 관한 디폴트 파라미터이다.
the Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997 에 기재된 것을 포함하여 다른 실험적 알고리즘, 갭 오프닝 페널티, 갭 익스텐션 페널티, 비교 매트릭스 및 유사성 역치가 사용될 것이다. 특정한 선택은 본 분야의 숙련자에게 자명할 것이며 DNA 대 DNA, 단백질 대 단백질, 단백질 대 DNA 와 같은 특정한 비교에 따라 달라질 것이며 ; 부가적으로, 비교는 정해진 서열 쌍(GAP 또는 BestFit 이 일반적으로 바람직한 경우에) 사이 또는 특정 서열과 서열의 대량 데이터베이스(FASTA 또는 BLASTA 가 바람직한 경우에) 사이의 비교를 나타낸다.
핵산 분자
IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자는 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 방법으로 쉽게 수득할 수 있다 : 화학적 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA 의 PCR 증폭.
본원에서 사용된 재조합 DNA 방법은 일반적으로 하기의 문헌에 기재된 것이다 : Sambrook 등의Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 및/또는Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 등의 eds., Green Publishers Inc. 및 Wiley 및 Sons 1994). 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자 및 이러한 분자를 수득하기 위한 방법을 제공한다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자가 특정 종으로부터 확인된 곳에서, 유전자의 전체 또는 부분은, 동일한 종으로부터의 오르토로그 또는 관련 유전자를 확인하기 위한 프로브로서 사용될 것이다. 프로브 또는 프라이머는 IL-1ra-L 폴리펩티드가 발현된다고 여겨지는 다양한 조직원으로부터 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 것이다. 더욱이, SEQ ID NO : 1 에 기재된 서열을 갖는 핵산 분자의 일부 또는 전체는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 확인하고 분리하기 위해 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 것이다. 전형적으로, 적당한 조건 또는 매우 엄격한 조건은 스크리닝으로부터 수득한 가양성의 수를 최소화하기 위해 스크리닝에 사용될 것이다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자는 발현 클로닝에 의해 확인될 것이고 이 발현 클로닝을 발현 단백질의 특성에 기초를 둔 양성 클론을 검출하는데 사용하였다. 전형적으로, 숙주 세포 표면상에 발현되고 나타난 클론된 단백질에 항체 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 수용체 또는 리간드)가 결합함으로써 핵산 라이브러리를 스크리닝하였다. 바람직한 클론을 발현시키는 세포들을 확인하기 위해 항체 또는 결합 파트너는 검출가능한 라벨로 변형된다.
하기에 설명한 기술에 따라 재조합 발현 기술로 인해 코드된 폴리펩티드를 발현하고 이러한 폴리펩티드를 생산할 수 있게 되었다. 예를 들어, 적절한 벡터내로 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 삽입함으로써, 본 분야의 숙련자들은 쉽게 바람직한 누클레오티드 서열을 대량으로 생산할 수 있게 되었다. 그리고나서 탐침 프로브 또는 증폭 프라이머를 형성하기 위해 그 서열을 사용하였다. 선택적으로, IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 폴리누클레오티드를 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 적절한 숙주내로, 발현 벡터를 도입함으로써 코드된 IL-1ra-L 폴리펩티드는 대량으로 생산될 것이다.
적절한 핵산 서열을 수득하기 위한 다른 방법은 폴리메라제 연쇄 반응법을 사용하는 것이다. 이러한 방법에서, 효소 역전사효소를 사용하여 폴리 (A) + RNA 또는 총 RNA 로부터 cDNA 를 제조하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 각각의 두 영역과 전형적으로 상보적인 두 프라이머를 Tag 폴리메라제와 같은 폴리메라제와 함께 cDNA 에 첨가하였고, 폴리메라제는 두 프라이머 사이의 cDNA 영역을 증폭시킨다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자를 제조하는 또다른 방법은, Engels 등의 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28 : 716 - 34 에 기재된 방법과 같이 숙련자에게 공지된 방법을 사용한 화학적 합성 방법이다. 이러한 방법으로는 무엇보다도 핵산 합성에 관한 인산트리에스터법, 인산라미디트법(phosphoramidite) 및 H-인산염 방법이 포함된다. 상기 화학적 합성에 관한 바람직한 방법은 표준 인산라미디트 화학을 이용한 중합체 - 지지 합성이다. 전형적으로, IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 는 길이상 수 백개의 누클레오티드일 것이다. 약 100 개의 누클레오티드보다 큰 핵산은 이러한 방법을 사용한 몇몇의 단편으로 합성할 수 있다. IL-1ra-L 유전자의 전장 누클레오티드 서열을 형성하기 위해 단편들을 함께 연결시켰다. 일반적으로, 폴리펩티드의 아미노 - 말단을 코드하는 DNA 단편은 ATG 이고 이는 메티오닌 잔기를 코드한다. 이러한 메티오닌은, 숙주 세포에서 생성된 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되는지의 여부에 따라 IL-1ra-L 폴리펩티드의 성숙한 형태로 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본 분야의 숙련자에게 공지된 다른 방법 또한 사용할 것이다.
특정 실시형태에서, 핵산 변이체는 코돈을 함유하며 이 코돈은 주어진 숙주 세포에서 IL-1ra-L 폴리펩티드의 최적의 발현을 변형시킨다. 특정한 코돈 교체는 IL-1ra-L 폴리펩티드와 발현하도록 선택한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. "코돈 최적화" 는 다양한 방법, 예를 들어, 주어진 숙주 세포에서 고도로 발현된 유전자 사용에 바람직한 코돈을 선택함으로써 시행할 수 있다. 고도로 발현된 박테리아 유전자의 선호 코돈에 대한 "Eco____high. Cod" 와 같은 코돈 빈도표에 기입된 컴퓨터 알고리즘을 사용하며 이는 위스콘신 대학의 패키지 버젼 9.0 (미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹)에 의해 제공된다. 그 밖의 다른 유용한 코돈 빈도표는 "Celegans_high. cod," "Celegans_ low.cod," "Drosophila_high.cod," "Human_high.cod," "Maize_high.cod," 및 "Yeast_high.cod" 을 포함한다.
몇몇 경우에서, IL-1ra-L 폴리펩티드 변이체를 코드하는 핵산 분자를 제조하는 것이 바람직할 것이다. 부위 특이적 돌연변이, PCR 증폭 또는 다른 적절한 방법을 이용하여 변이체를 코드하는 핵산 분자를 생산할 것이다. 여기에서 프라이머는 바람직한 점 돌연변이를 나타낸다(돌연변이유발 기술에 관한 상세한 설명에 관하여 Sambrook 등의 상기 문헌 및 Ausubel 등의 상기 문헌 참조). Engels 등의 상기 문헌에 기재된 방법을 이용한 화학 합성 또한 상기 변이체를 제조하는데 사용될 것이다. 본 분야의 기술자에게 공지된 그밖의 다른 방법 또한 사용될 것이다.
벡터 및 숙주 세포
IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자를 표준 결합 기술을 사용하여 적절한 발현 벡터내로 삽입시켰다. 전형적으로 벡터는 사용되는 특정 숙주 세포에서 기능하도록 선택된 것이다(즉, 벡터는 숙주 세포 기구와 양립가능하여 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 일어날 수 있다). IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자는 원핵, 효모, 곤충(바쿨로바이러스계) 및/또는 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현될 것이다. 번역 후에 변형되는(예를 들어, 글리코실화 및/또는 인산화)지에 따라 숙주 세포를 선택할 것이다. 효모, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직하다. 발현 벡터에 관한 리뷰로서 Meth. Enz., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed., Academic Press 1990) 참조하라.
발현 벡터는 일반적으로 숙주세포 내에서 플라스미드의 유지와 외인성 누클레오티드 서열의 클로닝 및 발현에 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 본 발명의 실시예에서 "플랭킹 서열" 로 언급되는데, 일반적으로 프로모터, 인핸서, 복제개시점, 전사 종결 서열, 공여체와 수용체 스플라이스 부위를 모두 포함하는 인트론 서열, 폴리펩티드의 분비에 필요한 리더 서열, 리보솜 결합 영역, 폴리아데닐화 서열, 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 삽입하는 데 필요한 폴리링커 영역, 선택적 마커 요소 중 적어도 한 종 이상을 포함한다. 이들 서열은 하기에서 상세히 설명된다.
선택적으로, 벡터는 "표식" - 코딩 서열을 포함하며 즉, IL-1ra-L 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 올리고누클레오티드 분자 ; 올리고누클레오티드 서열은 헥사His 와 같은 폴리His 또는 통상적으로 이용가능한 항체가 존재하는 myc, FLAG 또는 HA(헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스)와 같은 다른 "표식" 을 코드한다. 따라서, "표식" 은 폴리펩티드 발현 시에 일반적으로 폴리펩티드에 융합되고 발현된 IL-Lra-L 폴리펩티드는 숙주세포로부터 "표식" 에 대한 친화도를 이용하여 용이하게 정제할 수 있다. 친화력을 이용한 정제는 예를 들어, 표식에 대한 항체를 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해서 수행될 수 있다. 더욱이, 표식은 절단하기 위한 특정 펩티다제를 이용하여 정제된 IL-1ra-L 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다.
플랭킹 서열은 상동(즉, 숙주세포와 동일한 종 또는 변종에서 유래), 이종(즉, 숙주세포와 전혀 다른 종에서 유래), 혼성(즉, 하나 이상의 종 또는 변종에서 유래한 서열의 조합)이거나, 또는 합성에 의한 것이고, 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 정상적으로 조절하는 역할을 하는 원래의 서열에서 유래한 것이다. 플랭킹 서열의 출처에 따라원핵생물 또는 진핵생물, 척추동물 또는 무척추동물, 또는 식물에서 유래한 것이 결정되고, 이에 따라 플랭킹 서열은 숙주세포의 발현에 관련된 시스템에서 작동 가능하거나 활성화될 수 있다.
본 발명의 벡터에 이용할 수 있는 플랭킹 서열은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. IL-1ra-L 폴리펩티드 유전자에 연결된 플랭킹 서열외에 본 발명에서 사용할 수 있는 플랭킹 서열은 일반적으로 매핑 및/또는 제한효소의 절단에 의해서 기존에 밝혀진 것으로 적당한 제한효소를 이용하여 특정 조직에서 분리될 수 있다. 더욱이, 전체 누클레오티드 서열이 밝혀진 플랭킹 서열도 알려져 있다. 상기 플랭킹 서열은 본 발명에서 설명한 핵산 합성 또는 클로닝 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
플랭킹 서열은 서열의 전체 또는 일부가 알려져 있는 경우, PCR 사용 및/또는 적당한 올리고누클레오티드를 이용하여 게놈 라이브러리로 스크리닝하여 수득하고/하거나 숙주세포와 동일한 또는 다른 종으로부터 플랭킹 서열의 일부를 확보할 수 있다. 반면, 플랭킹 서열이 알려지지 않은 경우, 코딩 서열 또는 다른 유전자(들)을 포함하는 긴 DNA 로부터 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 단편을 분리하여 확보할 수 있다. 그러한 분리는 제한효소를 이용하여 절단하여 적당한 DNA 단편을 생성하고Qiagen?컬럼 크로마토그래피(Chatsworth, CA), 또는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 기술을 이용하여 아가로스 겔에서 분리함으로써 수행된다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 적절한 제한효소는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
복제개시점은 일반적으로 입수가능한 원핵세포 발현 벡터의 일부분이고, 개시점은 숙주세포내에서 벡터의 증폭를 돕는다. 숙주세포내에서의 벡터의 증폭정도에 따라 결정되는 복제수는, 어떤 경우에, IL-1ra-L 폴리펩티드가 최적으로 발현되는 데 중요하게 작용한다. 선택된 벡터가 복제개시점을 포함하지 않을 경우, 개시점은 공지된 서열을 기초로 하여 화학적으로 합성하여 벡터에 연결함으로써 확보할 수 있다. 예를 들어, pBR322 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, MA)에서 유래한 개시점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적당하고, 그 외 다양한 개시점[SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), HPV 또는 BPV 와 같은 파필로마 바이러스]은 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 포유동물 세포의 발현 벡터는 복제에 필요한 구성요소만을 포함하는 개시점을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 상기 SV40 개시점은 초기 프로모터를 포함하고 있기 때문에 자주 이용된다.
전사 종결 서열은 전형적으로 폴리펩티드 코딩 영역의 3' 말단에 위치하여 전사를 종결시키는 역할을 한다. 일반적으로, 원핵세포에서 전사 종결 서열은 G-C 가 풍부한 단편 다음에 폴리 - T 서열을 갖는다. 전사 종결 서열은 용이하게 라이브러리로부터 클로닝이 가능하고 또는 벡터의 일부분으로 통상적으로 입수할 수 있으며, 또한 본 발명에서 설명한 핵산 합성 등과 같은 방법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다.
선택적 마커 요소는 선택 배양 배지에서 숙주세포의 생존 및 성장에 필수적인 단백질을 코드한다. 일반적으로, 선택적 마커 요소는 (a) 숙주세포가 원핵세포인 경우 앰피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 등의 항생제 또는 그 외의 독소에 저항성을 부여할 수 있는 단백질, (b) 영양요구성 세포에 필요한 단백질, 또는 (c) 복합배지에 결핍된 생존에 중요한 영양분을 제공하는 단백질을 코드한다. 바람직한 선택적 마커는 카나마이신 저항성 유전자, 앰피실린 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자이다. 또한, 숙주세포가 원핵세포 또는 진핵세포인 경우, 네오마이신 저항성 유전자가 사용될 수 있다.
그 외 선택적 마커 유전자는 발현시키고자 하는 유전자를 증폭하는 데 이용될 수 있다. 여기서 증폭은 숙주세포의 성장에 필수적인단백질의 생산에 요구되는 유전자가 재조합 세포의 다음 세대의 염색체에 계속 남아있는 과정을 의미한다. 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)와 티미딘 키나제 등의 선택적 마커는 포유동물 세포에 유용하다. 숙주세포의 선별은 선택제(selection agent)의 농도를 다양하게 변화시킨 배양 배지에서 형질전환 세포를 배양함으로써 이루어지고, 이때 선택적 마커 유전자와 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 가 증폭된다. 그 결과, IL-1ra-L 폴리펩티드는 증폭된 DNA 로부터 다량 합성될 수 있다.
리보솜 결합 부위는 일반적으로 mRNA 의 번역개시에 필요한 서열로서, 샤인 - 달가노 서열(원핵세포), 또는 코작 서열(진핵세포)을 특징으로 한다. 이 서열은 전형적으로 프로모터의 3' 과 발현시키고자 하는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 코딩 서열의 5' 쪽에 위치한다. 샤인 - 달가노 서열은 다양한 염기서열로 구성될 수 있으나, 일반적으로 AG 함량이 높은 폴리푸린이다. 상당수의 샤인 - 달가노 서열이 밝혀져 있고, 본원에서 설명한 방법 및 원핵세포 벡터에 사용된 방법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다.
리더서열 또는 신호 서열은 IL-1ra-L 폴리펩티드를 숙주세포 밖으로 분비시키는 데 사용된다. 일반적으로, 신호서열을 코드하는 누클레오티드 서열은 IL-1ra-L 핵산 분자의 코딩 영역내에 존재하거나, IL-1ra-L폴리펩티드 코딩 영역의 5' 말단에 위치할 수 있다. 상당수의 밝혀진 신호 서열은 선택된 숙주세포내에서 실행가능하도록 IL-1ra-L 핵산에 연결될 수 있다. 따라서, 신호 서열은 IL-1ra-L 핵산과 상동성이거나 이종의 서열이다. 또한, 신호 서열은 본원에서 설명한 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 대부분의 경우, IL-1ra-L 폴리펩티드가 신호펩티드를 통해 숙주세포로부터 분비되고, 분비 후 신호펩티드는 절단되어 제거된다. 신호 서열은 벡터의 한 구성요소로 존재하거나, 벡터에 삽입될 IL-1ra-L 핵산의 일부분으로 존재할 수 있다.
IL-1ra-L 핵산의 코딩 영역에 원래 존재하는 IL-1ra-L 폴리펩티드 신호 서열을 코드하는 누클레오티드 서열 또는 이종의 신호 서열의 사용은 본 발명의 범주내에 포함된다. 선택된 이종의 신호 서열은 숙주세포내에서 신호 펩티다제와 같은 효소에 의해 인식되어 프로세싱될 수 있어야 한다. 천연의 IL-1ra-L 폴리펩티드 신호 서열을 인식할 수 없는 원핵세포가 숙주세포일 경우, 상기 신호서열은 원핵세포내에서 인식가능한 신호서열, 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 열 안정성 엔테로톡신 II 리더(heat-stable enterotoxin II leader)를 포함하는 그룹에서 선택된 신호서열로 대체된다. 숙주세포가 효모일 경우, 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 산성 포스파타제 리더가 신호서열로 이용될 수 있다. 포유동물 세포에서 단백질 발현은 천연의 IL-1ra-L 폴리펩티드 신호서열이 가장 바람직하고, 또한 다른 포유동물 신호 서열이 사용될 수도 있다.
진핵세포의 발현 시스템에서 목적하는 단백질의 당질화가 필요한 경우, 당질화의 효율을 향상시키기 위해 서열을 다양하게 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩티드의 펩티다제 절단 부위를 변화시킴으로서, 또는 당질화에 영향을 줄 수 있는 프로 - 서열(pro-sequence)을 첨가함으로써 가능하다. 최종 단백질 생성물은 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 기준으로 -1 위치에 한 개 이상의 아미노산을 부가적으로 포함할 수 있고, 여기서 부가된 아미노산은 제거되지 않은 상태로 최종 단백질에 존재한다. 예를 들어, 최종 단백질 산물은 펩티다제 절단 부위에서 발견되는 한 개 이상의 아미노산 잔기를 N-말단에서 부가적으로 포함할 수 있다. 또한, 신호 펩티드의 일부만을 절단하는 효소를 사용할 경우 N-말단에 신호 펩티드의 일부 아미노산이 연결된 형태의 최종 단백질이 생성될 수 있다.
대부분의 경우, 핵산의 전사는, 폴리펩티드가 진핵세포, 특히 포유동물 세포에서 발현될 때, 벡터에 한 개 이상의 인트론이 존재할 때 증가된다. IL-1ra-L 유전자가 전장의 게놈 서열 또는 그것의 단편이 사용될 경우, IL-1ra-L 유전자내에 원래 존재하는 천연의 인트론을 사용하는 것이 바람직하다. 반면, 대부분의 cDNA 처럼 인트론이 사용하는 유전자내에 포함되지 않을 경우, 인트론은 다른 원에서 수득될 수 있다. 인트론의 위치는 유전자와 플랭킹 서열과 관련하여 중요하게 작용하며, 이때 효과적으로 전사될 수 있도록 위치하여야 한다. 따라서, IL-1ra-L cDNA 가 전사될 때, 인트론은 전사개시점의 3' 쪽, 또는 폴리-A 전사 종결 서열의 5' 쪽에 위치하는 것이 바람직하다. 즉, 한 개 이상의 인트론이 유전자의 코딩 서열에 영향을 주지 않으면서 cDNA 의 3' 또는 5' 쪽에 위치할 수 있다. 인트론의 출처는 숙주세포가 바이러스, 원핵 생물, 또는 진핵 생물(식물 또는 동물)이냐에 따라서 적합하게 선택할 수 있다. 또한, 인트론은 합성하여 사용할 수 있으며, 한 개 이상의 인트론이 벡터에 삽입될 수 있다.
본 발명에서 유용한 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 IL-1ra-L 유전자에 실행가능하도록 연결된 숙주세포에 의해서 인식될 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구조유전자(일반적으로 100 bp 내지 1000 bp)의 상류부분, 즉 5' 방향에 위치하여 구조 유전자의 전사를 조절하는 역할을 수행하는 전사되지 않는 서열이다. 프로모터는 크게 유도성 프로모터(inducible promoter)와 구성 프로모터(constitutive promoter)로 구성된다. 유도성 프로모터는 특정 영양원의 존재여부, 온도 변화와 같은 배양조건의 변화에 반응하여 프로모터 하에 있는 유전자의전사 정도를 조절한다. 반면, 구성 프로모터는 유전자를 항상 발현시키는 역할을 수행한다. 즉, 어떤 자극에 의해 영향을 받지 않음으로써 유전자 발현을 일정하게 유지한다. 다양한 숙주세포에서 기능할 수 있는 프로모터가 상당히 알려져 있다. 목적하는 프로모터를 제한효소를 이용하여 특정 DNA 로부터 적당한 프로모터를 수득하여 벡터에 삽입시킴으로써 목적하는 프로모터를 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 분자에 실행가능하도록 연결시킬 수 있다. 천연의 IL-1ra-L 프로모터 서열은 IL-1ra-L 핵산 분자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는데 사용될 것이다. 그러나, 목적하는 단백질의 전사율을 높여 고수율로 수득하고자 하는 경우, 숙주세포의 시스템에서 기능할 수 있는 이종의 프로모터가 바람직하다.
원핵세포가 숙주세포로 사용되는 경우, 바람직한 프로모터는 베타-락타마제(beta-lactamase)와 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제 (alkaline phosphatase), 트립토판(trp) 프로모터 시스템, tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터, 그 외의 박테리아 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터의 서열은 공지되어 있으므로, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해서 목적하는 DNA 분자에 연결될 수 있고, 이때 유용한 제 한효소 인식 부위를 얻기 위해서 링커 또는 어댑터(adapter)를 사용할 수 있다.
숙주세포가 효모인 경우, 프로모터는 종래에 알려진 효모 프로모터 에서 선택될 수 있고, 이때 효모 인핸서도 함께 사용될 수 있다. 포유동물 세포의 경우, 프로모터는 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 2), 보바인 파필로마 바이러스, 아비안 사코마 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 가장 바람직하게 시미안 바이러스 40 (SV 40)과 같은 바이러스의 게놈에서 유래한 것이 바람직하고, 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 열충격(heat-shock) 프로모터, 액틴 프로모터와 같은 이종의 포유동물 프로모터가 바람직하다.
그 외, IL-1ra-L 유전자 발현을 조절할 수 있는 것으로 알려진 프로모터는 SV 40 초기 프로모터(Bernoist 및 Chambon, 1981, Nature 290 : 304 - 10), CMV 프로모터, 라우스 사코마 바이러스의 3' 쪽에 있는 말단의 긴 반복(long terminal repeat)에 있는 프로모터(Yamamoto, 등의 1980, Cell 22 : 789 - 97), 헤페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner 등의 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 : 1444 - 45), 메탈로티오닌(methalothionine) 유전자의 조절에 관련된 서열(Brinster 등의 1982, Nature 296 : 39 - 42), 베타 - 락타마제 프로모터와 같은 원핵세포의 발현 벡터(Villa-Kamaroff 등의 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75 : 3727 - 31), tac 프로모터(DeBoer 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 48580 : 21 - 25)를 포함하지만, 이에한정되는 것은 아니다. 또한 조직 특이성이 있고, 형질전환 동물에서 이용할 수 있는 동물에 특이적인 전사 조절 영역은 췌장 포상 세포에서 활성이 있는 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift 등의 1984, Cell 38 : 639 - 46; Ornitz 등의 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399 - 409 (1986); Mac Donald, 1987, Hepatology 7 : 425 - 515), 췌장 베타세포에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan, 1985, Nature 315 : 115 - 22), 임파구 세포(lymphoid cell)에서 활성이 있는 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschell 등의 1984, Cell 38 : 647 - 58 ; Adames 등의 1985, Nature 318 : 533 - 38 ; Alexander 등의 1987, Mol. Cell. Biol., 7 : 1436 - 44), 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포(mast cell)에서 활성이 있는 마우스 유선 종양 바이러스 조절 영역(Leder 등의 1986, Cell 45 : 485 - 95), 간에서 활성이 있는 알부민 유전자 조절 영역(Pinket 등의 1987, Genes 및 Devel. 1 : 268 - 76), 간에서 활성이 있는 알파 - 페토(feto) 단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf 등의 1985, Mol. Cell. Biol., 5 : 1639 - 48 ; Hammer 등의 1987, Science 235 : 53 - 58), 간에서 활성이 있는 알파 I-안티트립신 유전자 조절 영역(Kelsey 등의 1987, Genes 및 Devel. 1 : 161 - 71), 골수성(myeloid) 세포에서 활성이 있는 베타 - 글로빈 유전자 조절 영역(Mogram 등의 1985, Nature 315 : 338 - 40 ; Kolliaas 등의 1986, Cell 46 : 89 - 94), 올리고덴드로부위 세포에서 활성이 있는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead 등의 198, Cell 48 : 703 - 12), 골격근육에서 활성이 있는 미오신 경쇄 - 2 유전자 조절 영역(Sani, 1985, Nature 314 : 283 - 86), 시상하부에서 활성이 있는 생식선자극 분비 호르몬 (gonadotropic releasing hormone) 유전자 조절 영역(Mason 등의 1986, Science 234 : 1372 - 78)를 포함한다.
본 발명의 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 의 고등 진핵생물에서 전사율을 증가시키기 위해서, 인핸서 서열이 벡터에 삽입될 수 있다. 인핸서는 DNA 상에서 cis-활성 요소(cis-acting element)로서, 일반적으로 길이는 10 pb 내지 300 bp 이고, 전사율을 증가시키기 위해 프로모터상에서 기능을 수행하고, 이때 방향이나 위치에 상관없이 기능을 수행한다. 인핸서는 일반적으로 전사단위의 5' 또는 3' 쪽에서 발견된다. 몇 개의 포유동물 세포에서 유래한 인핸서의 염기서열이 알려져 있는데, 예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토 단백질, 인슐린 유전자의 인핸서가 있다. 그러나, 일반적으로 바이러스에서 유래한 인핸서가 사용된다. SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서 등이 진핵 세포의 프로모터를 활성화시키는 데 사용되는 전형적인 예이다. 인핸서는 IL-1ra-L 핵산 분자의 5' 또는 3' 쪽에 연결되도록 벡터에 삽입될 수 있고, 또한 일반적으로 프로모터의 5' 쪽에 위치하도록 삽입된다.
본 발명의 발현 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 벡터는 사용하고자 하는 모든 플랭킹 서열을 포함할 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 벡터에 포함되어 있지 않는 본 발명에서 필요로 하는 플랭킹 서열은 확보된 후 벡터에 삽입될 수 있다. 각 플랭킹 서열을 확보하는 방법은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려져 있다.
본 발명을 실행하는 데 바람직한 벡터는 숙주세포로서 사용되는 박테리아, 곤충 및 포유동물 세포와 양립가능하다. 이러한 벡터의 예는 그 중에서도 pCRⅡ, pCR 3 및 pcDNA3.1 (미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수), pBSⅡ (미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타젠에서 입수), pET15 (미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 노바겐에서 입수), pGEX (미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오테크에서 입수), pEGFP-N2 (미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 입수), pETL (BlueBacⅡ, 인비트로겐에서 입수), pDSR-alpha (PCT 공개 번호 제 WO 90/14363 호) 및 pFastBacDual (미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코비알엘에서 입수)을 포함한다.
또한, 코스미드(cosmid), 플라스미드, 변형된 바이러스가 벡터로서 사용 될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며, 이때 선택한 숙주세포에적합한 벡터 시스템이 선택되는 것은 당연하다. 그러한 벡터의 예로서, 이에 한정되지는 않지만, Bluescript?플라스미드 유도체(복제수가 높은 ColE1-기재 phagemid, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), Taq 중합효소에 의해 증폭된 PCR 생성물을 클론닝할 수 있는 PCR 클론닝 플라스미드(e.g., TOPOTMTA Cloning?Kit, PCR2.1?플라스미드 유도체, 미국 캘리포니아 칼스버드에 소재하는 인비트로겐에서 입수), 바큘로바이러스 발현 시스템과 같은 포유동물 세포의 벡터, 효모용 벡터, 또는 바이러스 벡터(pBacPAK 플라스미드 유도체, 미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 입수) 등이 있다.
벡터를 제조하고 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 벡터의 적절한 위치에 삽입한 후, 최종의 완성된 벡터는 증폭 및 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위해서 적당한 숙주세포 내로 도입될 수 있다. IL-1ra-L 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터는 트랜스팩션 (transfection), 감염, 염화칼슘 침전 방법, 일렉트로포레이션, 미세주사, 리포펙틴(lipofectin), DEAE - 덱스트란 방법 또는 그 외의 알려진 방법을 이용하여 숙주세포내로 도입될 수 있다. 이러한 도입 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있으며, 또한 Sambrook 등의 상기 문헌에 설명되어 있다.
숙주세포는 대장균(E. coli)과 같은 원핵세포이거나, 효모, 곤충 및 척추동물 세포와 같은 진핵세포일 수 있다. 숙주세포는 적당한 조건하에서 배양되면 IL-1ra-L 폴리펩티드를 합성하는 데, 이때 숙주세포의 외부로 분비될 경우 합성된 IL-1ra-L 폴리펩티드는 배양배지로부터 연속적으로 회수될 수 있고, 분비되지 않을 경우 숙주세포에서 직접 수득할 수 있다. 적합한 숙주세포는 목적하는 발현 정도, 활성을 나타내는 데 중요한 폴리펩티드의 변형(예, 당질화 또는 인산화), 생물학적으로 활성을 갖는 구조로 접힘이 용이한 환경 등을 고려하여 선택된다.
다수의 적합한 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 대부분은 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 구입할 수 있다. 숙주세포의 예는 CHO 세포(중국산 햄스터 난소 세포), CHO DHFR(-) 세포(Urlaub 등의 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 : 4216 - 20), 인체 배아 신장 HEK 293 또는 293T 세포, 3T3 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포로서의 적합한 포유동물 세포의 선택과 형질전환, 배양, 증식, 스크리닝, 단백질 생산 및 정제에 관련된 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있다. 상기의 포유동물 세포 외에 원숭이에서 유래한 COS-1 및 COS-7 세포주와 CV-1 세포주가 포유동물 세포로서 이용될 수 있다. 더욱이, 형질전환된 세포주 및 영장류와 설치류에서 유래한 세포주도 숙주세포로 이용될 수 있다. 또한, 1 차 체외 배양 및 시험관내 1 차 조직 배양에서 유래한 세포인 정상적인 배수 세포(diploid cell)가 숙주세포로 이용될 수 있다. 그 외, 숙주세포로 이용가능한 포유동물 세포의 예는 마우스 뉴로블라스토마(neuroblastoma) N2A 세포주, HeLa 세포주, 마우스 S-929 세포주, 스위스산 Balb-c 또는 NIH 마우스에서 유래한 3T3 세포주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 세포주는 단백질 발현에 관련된 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
박테리아 세포 또한 본 발명에서 적합한 숙주세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, HB101, DH5 , DH10, MC106 세포와 같은E. coli의 다양한 변종이 생명공학 분야에서 숙주세포로서 잘 알려져 있다. 또한, 비. 섭틸리스 슈도모나스속, 바실러스속, 스트렙토마이세스속 등의 변종이 숙주세포로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 효모 세포의 다양한 변종이 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 이용될 수 있고, 바람직한 효모 세포로는 사카로마이세스 세레비지에 와 피이하 패스토리스를 포함한다.
또한, 필요한 경우, 곤충 세포 시스템은 본 발명의 방법에서 숙주세포로 사용될 수 있고(Kitts 등의 1993, Biotechniques, 14 : 810 - 17 ; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4 : 564 - 72 ; Lucklow 등의 1993, J. Viro., 67 : 4566 - 79), Sf-9 와 Hi5 세포(인비트로겐에서 입수)가 바람직하다.
IL-1ra-L 폴리펩티드를 당질화 된 구조로 발현시키기 위해 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 암소, 염소와 같은 우유를 생산할 수 있는 형질전환된 동물을 이용하여 우유에서 당질화된 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 반면, IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하기 위해 식물을 사용하는 경우, 당질화 구조는 포유동물 세포에서 생성된 구조가 다르기 때문에, 인체에게 치료의 목적으로 사용하는 데는 적합지 않다.
폴리펩티드 생산
IL-1ra-L 폴리펩티드 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 배양된다. 배양배지는 일반적으로 숙주세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함한다. 예를 들어,E. coli세포의 배양에 적합한 배지는 루리아 액체 배지(Luria Broth, LB)와 테리픽 액체 배지(Terrific Broth, TB)를포함한다. 진핵세포의 배양 배지의 예는 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute Medium 1640), MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 포함하고, 이들 배지는 특정 세포주의 배양에 필요한 혈청 또는 성장인자를 포함할 수 있다. 곤충세포의 배양에 적합한 배지는 그라세(Grace) 배지이고, 필요할 경우 상기 그라세 배지는 이스트올레이트(yeastolate), 락트알부민 가수분해물 (lactalbumin hydrolysate), 및/또는 FCS(우태아 혈청) 를 포함할 수 있다.
또한, 형질전환된 세포를 선별하기 위해 항생제와 같은 선택제를 배지에 첨가할 수 있다. 이러한 화합물은 발현 벡터에 삽입된 선택적 마커 요소의 종류에 따라 결정된다. 예를 들어, 선택적 마커 요소가 카나마이신 저항성을 부여한다면, 배지에 카나마이신을 첨가하면 된다. 그 외 일반적으로 사용되는 화합물은 엠피실린, 테트라사이클린, 네오마이신 등을 포함한다.
숙주세포에서 발현된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 즉, 웨스턴 블롯 검정, SDS-아크릴아마이드 겔 전기영동, 비 - 변성 겔(non-denaturating gel)을 이용한 전기영동, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 분리, 면역침강법, DNA 결합 겔 이동 검정과 같은 활성도 검정 등의 방법을 통해서 검정할 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드가 숙주세포로부터 분비되도록 디자인된 경우, 대부분의 폴리펩티드는 세포배양 배지에 존재한다. 반면, IL-1ra-L 폴리펩티드가 숙주세포 밖으로 분비되지 않는 경우, 폴리펩티드는 세포질에 존재하고, 더욱이 진핵세포인 경우 핵에, 그람-음성 박테리아인 경우 세포질졸에 존재할 수도 있다.
발현된 IL-1ra-L 폴리펩티드가 숙주세포의 세포질, 핵(진핵세포인 경우), 또는 세포질졸(박테리아인 경우)에 존재하는 경우, 세포내 물질(그람-음성 박테리아 경우 불용성 봉입체 형태로 존재)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 숙주세포로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 숙주세포를 프렌취 프레스(French press), 균질화법 또는 초음파 처리하여 분쇄함으로써 세포내의 물질을 노출시키고 원심분리에 의해 회수할 수 있다.
발현된 IL-1ra-L 폴리펩티드가 세포질졸에서 불용성 봉입체로 존재하는 경우, 봉입체는 흔히 세포막의 내면 및/또는 외면에 결합된 형태로 존재하고, 따라서 세포분쇄 후 원심분리를 하게되면 침전물에 존재한다. 상기 침전물을 아주 높은 pH 에서 처리하거나, 알카리 pH 에서 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)과 같은 환원제 존재 하에서 또는 산성 pH 에서 트리스 카복시에틸 포스핀의 존재하에서 세정제, 구아니딘 및 이의 유도체, 요소 및 이의 유도체와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)로 처리하여 봉입체를 해체하여 용해시킬 수 있다. 용해된 IL-1ra-L 폴리펩티드는 겔 전기영동, 면역침강법 등과 같은 방법을 이용하여 검정될 수 있다. 또한 IL-1ra-L 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 방법, 예를 들어, 마스톤 등의 방법(Marston 등의 1990, Meth. Enz., 182 : 264 - 75)을 이용하여 분리 정제될 수 있다.
그러나, 분리 과정중에 IL-1ra-L 폴리펩티드는 불활성화될 수 있다. 생물학적 활성을 회복시키기 위해서, 3 차 구조 및 황결합을 다시 형성하도록 폴리펩티드의 재접힘을 유도하는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 용해된 폴리펩티드를 중성 pH 에 노출시키거나, 특정 농도의 카오트로프(chaotrope)에 노출시켜 생물학적 활성을 회복시킬 수 있다. 카오트로프는 봉입체의 용해시 사용한 것과 유사하게 선택될 수 있으나, 일반적으로 낮은 농도로 사용되며, 봉입체를 용해할 때 사용하였던 것과 동일한 것을 사용할 필요는 없다. 대부분의 경우, 재접힘/산화 용액은 환원제 또는 특정 비율로 혼합된 환원제와 산화제를 더욱 포함하여 특이적인 산화환원 전위를 생성함으로써 황결합의 재형성을 유도할 수 있다. 일반적으로 사용되는 산화환원 쌍은 시스테인/시스타민, 글루타티온(GSH)/디티오비스 GSH, 염화구리, 디티오트레이톨(DTT)/디티안 DTT, 2-2-머캅토에탄올(bME)/디티오-b(ME)를 포함한다. 또한, 보조용매 (cosolvent)가 재접힘의 효율을 증가시키기 위해서 첨가될 수 있고, 예를 들어, 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 아르기닌 등이 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현양이 작을 경우, 불용성 봉입체는 형성되지 않고, 따라서 폴리펩티드는 원심분리후 상층액에 존재하게 되고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 분리될 수 있다.
용액에 용해되어 있는 IL-1ra-L 폴리펩티드는 다양한 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 폴리펩티드가 C-말단 또는 N-말단에 헥사히스티딘(IL-1ra-L 폴리펩티드/hexaHis) 또는 FLAG(미국 코네티컷 뉴 하벤에 소재하는 이스트만 코닥 코포레이션에서 입수), myc(미국 캘리포니아 칼스버드에 소재하는 인비트로겐에서 입수)와 같은 작은 펩티드가 첨가된 형태로 발현된다면, 각 표식에 상응하는 친화성 컬럼에 폴리펩티드가 함유된 용액을 통과시킴으로써 한 단계의 과정만으로 정제될 수 있다.
예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈에 대해 높은 친화력을 가지므로 니켈에 특이적으로 결합한다. 따라서, 니켈로 구성된 친화성 컬럼(예, Qiagen?nickel column)은 IL-1ra-L 폴리펩티드/polyHis 의 정제에 사용될 수 있다. Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 참조하라(Ausubel 등의 eds., Green Publishers Inc. 및 Wiley 및 Sons 1993).
또한, IL-1ra-L 폴리펩티드는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 모노클로날항체를 이용하여 정제될 수 있다.
또한, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 이온교환수지 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, HPLC, 천연 겔 전기영동을 포함하는 전기영동 후 겔 정제, 조제적 등전점전기이동("Isoprime" machine/technique, Hoefer Scientific, San francisco, CA) 등이 정제에 이용될 수 있다. 더욱이, 순도를 높이기 위해서 두 가지 이상의 정제 방법이 적용될 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 고체상 펩티드 합성과 같이 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다(Merrifield 등의 1963, J. Am. Chem. Soc. 85 : 2149 ; Houghten 등의 1985, Proc Natl Acad. Sci. USA 82 : 5132 ; Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., 1984). 이때 폴리펩티드는N-말단에 메티오닌을 포함하여 합성될 수도 있고 포함하지 않은 형태로 합성될 수도 있다. 화학적으로 합성된 IL-1ra-L 폴리펩티드는 황결합을 재형성하기 위하여 상기의 참고문헌에 제시된 방법을 이용하여 산화될 수 있다. 화학적으로 합성된 IL-1ra-L 폴리펩티드는 재조합 방법으로 생산된 또는 천연에서 정제한 IL-1ra-L 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 나타낼 것이라고 생각되며, 따라서 재조합 또는 천연의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 일부분과 서로 교환하여 사용될 수 있다.
또한, IL-1ra-L 폴리펩티드는 IL-1ra-L 폴리펩티드가 존재하는 조직 및/또는 체액과 같은 생물학적 시료로부터 정제과정을 통해 확보될 수 있고, 이러한 정제는 본 발명에서 설명한 단백질 정제방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 정제 과정중 IL-1ra-L 폴리펩티드의 존재 여부를 확인할 수 있는 데, 예를 들어, 재조합으로 합성된 IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 이의 펩티드 단편에 대한 항체를 이용하여 수행할 수 있다.
핵산 및 폴리펩티드를 생산할 수 있는 방법은 많이 알려져 있으며, 이러한 방법을 이용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드에 특이성을 갖는 폴리펩티드를 생산할 수 있다(Roberts 등의 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 : 12297 - 303 ; Roberts, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 : 268 - 73). 또한, 미국 특허 번호 제 5,824,469 호는 특이한 생물학적 기능을 수행할수 있는 올리고누클레오티드를 수득할 수 있는 방법을 소개하고 있다. 여기서, 5' 무작위 서열, 중간 영역의 선택된 서열, 3' 무작위 서열을 가지는 올리고누클레오티드로 구성된 이종의 올리고누클레오티드 풀(pool)을 생성하는 과정을 포함한다. 결과적으로 생성된 이종의 풀을 바람직한 생물학적 기능을 나타내지 않는 세포에 도입하고, 스크리닝으로 세포를 선별한 후, 최종적으로 바람직한 생물학적 기능을 갖는 올리고누클레오티드의 선별이 가능하다.
미국 특허 번호 제 5,763,192 호, 제 5,814,476 호, 제 5.723,323 호, 제 5,817.483 호에는 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 제시하고 있다. 여기서, 무작위적인 유전자들과 이들의 단편들을 생산하고, 이들을 숙주세포내로 도입하여 한 개 이상의 단백질을 발현시킨 후, 스크리닝 과정을 통해 목적하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산하는 클론을 확보할 수 있다.
또한, 아더시(Athersy) 인코포레이티드의 제 PCT/US98/20094(WO99/15650) 호에 기재된 방법으로 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. RAGE-GD(Random Activatioin of Gene Expression for Gene Discovery)으로 알려진 이 과정은 원위치 재조합 방법을 이용하여 내인성 유전자의 발현 또는 과발현을 활성화하는 단계를 포함하고 있다. 예를 들어, 비 - 상동성 또는 부적법 재조합에 의해 유전자 발현을 활성화시킬 수 있는 표적 세포내로 조절 서열을 삽입함으로써 내인성 유전자의 발현이 증가되거나 활성화될 수 있다. 표적 DNA 를 방사선으로 조사한 후 유전적 프로모터를 삽입하였다. 프로모터는 유전자 전사가 시작되는 유전자 앞부분의 절단된 부분에 위치한다. 결과적으로 바람직한 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현시킨다.
이러한 방법은 광범위한 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현 라이브러리의 제조에 이용될 수 있고, 이 라이브러리는 생화학적 검정, 세포 검정, 식물, 마우스 등의 생물체의 검정과 같은 다양한 검정에서 고효율로 이들의 표현형을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
합성
본 발명에서 설명한 핵산과 폴리펩티드는 제조합체 및 다른 방법을 이용하여 생산될 수 있으며, 이러한 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다.
선택적 결합제
상기 용어 "선택적 결합제" 는 한 개 이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 특이성을 갖는 분자를 언급한다. 적절한 선택적 결합제의 예는 항체와 이것의 유도체, 폴리펩티드, 분자량이 작은 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 선택적 결합제는 본 분야의 통상적인 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 전형적인 IL-1ra-L 폴리펩티드 선택적 결합제는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 일부분에 결합하여 이 폴리펩티드가 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체에 결합하는 것을 저해할 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체 및 항체의 단편과 같은 선택적 결합제는 본 발명의 범주에 속한다. 항체의 예는 단일특이성 폴리클로날 항체를 포함한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(MAb), 재조합체, 키메라 항체, CDR-이식항체와 같은 인체화 항체, 단일쇄 항체 및/또는 이중특이성 항체를 포함하고, 또한 이들의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 항체의 단편은 IL-1ra-L 폴리펩티드 상에 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 효소에 의한 전장 항체의 절단에 의해 생성된 Fab와 F(ab') 단편을 포함한다. 그 외 결합 단편은 항체의 가변 영역을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 발현시키는 방법과 같은 통상의 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 폴리클로날 항체는 일반적으로 토끼나 마우스와 같은 동물에 IL-1ra-L 폴리펩티드와 보조제를 여러 번 피하 또는 복강 투여함으로써 생산될 수 있다. 이때 IL-1ra-L 폴리펩티드에 캐리어 단백질을 접합시켜 면역성을 부여함으로써 투여된 동물내에서 면역반응을 유도할 수 있다. 상기 캐리어 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모사이아닌, 혈청, 알부민, 소의 티로글로불린 또는 콩 트립신 저해제를 포함한다. 또한, 항원을 백반과 같은 응집제를 침착시켜 항원을 제공하도록 하여 면역반응을 증가시키는데 이용할 수 있다. 면역화한 후에, 동물에서 혈액을 채취하여 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 항체의 역가를 조사한다.
IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 세포주를 연속적으로 배양하여 항체 분자를 생산하는 방법으로 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 적절한 방법은 하이브리도마 방법[Kohler 등의 1975, Nature 256 : 495 - 97)과 인체 B 세포 하이브리도마 방법(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; brodeur 등의 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51 - 63 (Marcel Dekker, Inc., 1987)]을 포함한다. 또한, IL-1ra-L 폴리펩티드에 반응성이 있는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 본 발명에서 제공된다.
본 발명의 모노클로날 항체는 치료제로서 사용하기 위하여 변형될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 키메라 항체의 중쇄(H) 사슬 또는 경쇄(L) 사슬의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 군 또는 아군에 속하는 항체의 상응 서열에 동일하거나 상동성이 있는반면 그 외 나머지 부분은 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 군 또는 아군에 속하는 항체의 상응 서열과 동일하거나 상동성이 있다. 또한, 항체의 단편이 목적하는 생물학적 활성을 가지고 있다면 이들 또한 상기 범주에 포함된다(참조, 미국특허 제 4,816,567 호 ; Morrison 등의 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 6851 - 55).
본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 인체화 항체로서 제공된다. 비-인체 항체를 인체화하기 위한 방법이 본 분야에 공지되어 있다(참조, 미국특허 제 5,585,089 호 및 제 5,693,762 호). 일반적으로 인체화 항체는 인체 외의 다른 종에서 유래한 한 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 본 분야에서 공지된 방법(Jones 등의 1986, Nature 321 : 522 - 25 ; Riechmann 등의 1998, Nature 332 : 323 - 27 ; Verhoeyen 등의 1988, Science 239 : 1534 - 36)을 이용하여 설치류의 상보성 - 결정 영역(CDR)의 일부분을 이에 상응하는 인체 항체의 부분으로 치환함으로써 생성될 수 있다.
또한, 본 발명에서 IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합할 수 있는 인체 항체가 제공된다. 내인성의 면역글로불린을 생성하지 않으면서 인체 항체만을 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 이용하여, IL-1ra-L 폴리펩티드 항원(즉, 일련의 6개의 아미노산으로 구성된 항원)에 의해 면역반응이 일어나 이 항원에 특이적인 인체 항체만을 생산할 수 있고, 이때 항원의 면역원성을 증진시키기 위하여 담체와 접합된 형태로 사용될 수 있다 (Jakobovits 등의 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90 : 2551 - 55 ; Jakobovits 등의 1993, Nature 362 : 255 - 58 ; Bruggermann 등의 1993, Year in Immuno. 7:33). 한 방법에서, 상기 형질전환 동물이 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 사슬을 코드하는 내인성 위치의 불능화 및 게놈내로의 인체 중쇄와 경쇄 사슬 단백질을 코드하는 위치의 삽입에 의해 준비될 수 있다. 한 동물내에서 목적하는 변형을 포함하는 모든 면역 시스템 변형을 갖기 위해 완전한 변형이 일어나지 않은, 부분적으로 변형된 동물들을 서로 교잡할 수 있다. 면역원이 투여되면, 이러한 형질전환된 동물은 상기 항원에 대한 면역특이성을 갖는 가변 영역을 포함하는 인체 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다(참조, 국제출원 번호 제 PCT/US96/05928 호, 제 PCT/US93/06926 호). 이와 관련하여 다른 방법이 미국특허 제 5,545,807 호, 국제출원 제 PCT/US91/245 호, 국제출원 제 PCT/GB89/01207 호, 유럽특허 제 546073B1 호 및 제 546073A1 호에 기술되어 있다. 또한, 인체 항체는 숙주 세포 내에서 또는본 발명에서 설명한 하이브리도마 세포에서 DNA 재조합의 발현을 통해서 생산될 수 있다.
본 발명의 대안적인 실시형태에서, 인체 항체는 파지 - 디스플레이 라이브러리로부터 생성될 수 있다(Hoogenboom 등의 1991, J. Mol. Biol. 227 : 381 ; Marks 등의 1991, J. Mol. Biol. 222:581). 이 과정은 섬유상 박테리오파지 표면에 항체 레퍼터리를 발현 및 선별 항원과 결합시켜 원하는 항체를 갖고 있는 파지의 선별을 통한 면역 선별과 비슷하다. 국제특허 출원 제 PCT/US98/17364 호에서는 이러한 접근을 통해서 MLP- 와 msk- 수용체에 대해 작동물질로 작용할 수 있는 항체를 높은 친화력을 이용하여 분리하는 방법을 제시하고 있다.
키메라 항체, CDR 이식 항체 및 인체화 항체는 전형적으로 재조합 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 즉, 본 발명에서 설명한 물질 및 방법을 이용하여 상기 항체를 코드하는 핵산을 숙주 세포로 도입하여 발현시킨다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포를 사용하여 생산할 수 있다. 모노클로날 항체(예를 들어, 인체 항체)가 본 발명에서 설명한 방법을 이용하여 재조합 DNA 를 숙주 세포 세포하이브리도마 세포에서 발현시켜 생산될 수 있다.
본 발명의 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 존재 여부와 정량적 검정을 위해서 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접적 샌드위치 검정 및 면역침전법 검정[(Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)]과 같은 종래의 검정 방법에 사용될 수 있다. 항체는 상기 분석 방법에 적절한 친화력을 가지는 IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합할 것이다.
특정한 실시형태에서, 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체는 진단용으로 사용하기 위하여 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 일부분을 가지고 표지될 수 있다. 예를 들어,3H,14C,32P,35S,125I,99Tc,111In,67Ga 와 같은 방사선동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린과 같은 형광물질 또는 화학발광 화합물; 또는 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 같은 효소로 표지할 수 있다(Bayer 등의 1990, Meth. Enz. 184:138-63).
경쟁적 결합 검정은 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체의 제한된 양의 결합에서 실험 시료(IL-1ra-L 폴리펩티드)와 경쟁하는 표지된 표준 시료(예를 들어, IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 이의 면역성이 있는 영역)의 능력에 의지한다. 실험 시료내의 IL-1ra-L 폴리펩티드 양이 항체와 결합된 표준시료의 양에 역비례한다. 결합된 표준 시료의 양의 정량을 용이하게 하기 위하여, 항체를 일반적으로 경쟁적 반응에 사용되기 전 또는 후에 불용성화시켜, 항체에 결합된 표준 시료와 실험 시료 물질이 결합되지 않은 것들과 용이하게 분리될 수 있도록 한다.
샌드위치 검정은 일반적으로 두 개의 항체를 사용하며, 여기서 각 항체는 검출 또는 정량화하고자 하는 단백질의 서로 다른 면역원성 영역 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서, 실험 시료 물질은 일반적으로 고체 지지체 위에 고정된 1 차 항체에 결합되고, 그 후 2 차 항체가 여기에 결합하여 불용성의 3 개의 유니트로 구성된 복합체가 형성된다(참조, 미국특허 제 4,376,110 호). 2 차 항체는 자체로서 검출 가능하도록 표지되어 있을 수 있고(직접 샌드위치 검정), 또는 표지에 결합된 항-면역글로불린 항체를 측정에 이용할 수 있다(간접적 샌드위치 검정). 검출에 사용할 수 있는 표지가 효소인 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)방법이 샌드위치 검정 방법의 대표적인 예이다.
항-IL-1ra-L 항체를 포함해서, 선택적 결합제는 생체내 진단에 사용될 수 있다. 검출이 가능하도록 표지된 항체를 동물에 투여하면, 혈액내 투여가 바람직하며, 동물체내에 표지된 항체의 존재여부 및 위치가검정될 수 있다. 이때 항체는 동물체내에서 검출가능한 표지로 표지될 수 있고, 핵자기공명, 방사선학, 그 외 본 분야의 통상적인 기술을 이용하여 검정이 가능하다.
항체를 포함한 본 발명의 선택적 결합제는 치료제로 사용될 수 있다. 이러한 치료제는 일반적으로 작동물질 또는 길항물질로 작용할 수 있고, 이것은 각각 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증가시키거나 감소시키는 역할을 한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 길항물질 항체는 IL-1ra-L 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고 생체내 또는 시험관내에서 IL-1ra-L 폴리펩티드의 기능적 활성을 억제 또는 제거할 수 있는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 바람직한 실시형태에서, 길항물질 항체와 같은 선택적 결합제는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 약 50 % 정도, 바람직하게는 약 80 % 정도 억제한다. 다른 실시형태에서, 선택적 결합제는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합 파트너(리간드 또는 수용체)와 상호작용할 수 있는 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체로서, 생체내 또는 시험관내에서 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 억제 또는 제거한다. 작동물질과 길항물질 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체를 포함하는 선택적 결합제는 본 분야에 널리 공지된 스크리닝 검정 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
또한, 본 발명은 항체와 같은 IL-1ra-L 선택적 결합제와 생물학적 시료에서 IL-1ra-L 폴리펩티드의 농도를 측정할 수 있는 시약으로 구성되는 키트를 제공한다. 상기 시약은 검출가능한 표지, 블로킹 혈청, 양성 및 음성 대조 시료, 검출 시약 등을 포함한다.
마이크로어레이(Microarray)
본 발명에 따라 DNA 마이크로어레이(microarray) 기술이 사용될 수 있다. DNA 마이크로어레이는 유리와 같은 고체 지지체상에 핵산이 고밀도로 배열된 축소된 형태이다. 상기 어레이는 각각의 세포 또는 요소의 단일 핵산의 많은 복제 형태를 포함하고 있으며, 이 핵산은 이와 상보적인 핵산 서열(예를 들어, mRNA)을 이용한 혼성화 반응의 표적으로서 작용한다. DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 발현 양상을 검정할 때, 먼저 특정 세포 또는 조직으로부터 mRNA 를 추출하고 이를 효소를 이용하여 형광표지된 cDNA 로 전환시킨다. 이 물질은 마이크로어레이 상에서 혼성화반응을 거친 후 결합되지 않은 cDNA 를 세척하여 제거한다. 그 후 어레이는 각 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 표지된 cDNA 의 양을 정량하여 각 유전자의 발현정도를 검정한다. 따라서, 생물학적 시료의 단일 시료의 수천 개의 유전자에 대한 발현이 높은 생산 내에서 정량될 수 있다.
이러한 막대한 발현 자료는 본 발명의 IL-1ra-L 분자와 관련된 다음을 포함하는 다양한 분야에서 응용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다 : 치료의 표적이 되는 IL-1ra-L 질병과 관련된 유전자의 검정 및 확인, IL-1ra-L 분자와 이의 억제제의 분자수준에서의 독성도, 임상치료를 위한 개체 검정 및 대리마커의 생성, 막대한 스크린상의 선별 화합물의 확인에서의 촉진에 의해 발견되는 IL-1ra-L 폴리펩티드 저분자 약물의 증대.
화학적 유도체
IL-1ra-L 폴리펩티드의 화학적으로 변형된 유도체는 본 발명에서 기술한 바와 같이, 본 분야의 숙련자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체는 원래 결합되어 있는 분자의 형태 또는 위치를 변형시킴으로써 유도할 수 있다. 상기 유도체는 원래 결합되어 있는 한 개 이상의 화학그룹이 제거되어 형성된 분자를 포함할 수 있다. SEQ ID NO : 2 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 한 개 이상의 중합체가 공유 결합되어 부착됨으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 중합체에 연결된 단백질이 생리적 환경과 같은 수용액 환경에서 침전되지 않도록 하기 위해 중합체는 일반적으로 수용성인 것이 선택된다. 적절한 중합체는 중합체의 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 최종 산물 제제를 치료에 사용하기 위해 중합체가 약학적으로 이용 가능하다.
중합체 각각의 분자량은 다양하며, 가지구조이거나 아닐 수 있다. 중합체 각각의 분자량은 전형적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다("약" 이란 용어는 수용성 중합체 제조 시, 어떤 분자의 분자량이 기재된 분자량보다 좀 더 클 수 있고 어떤 것은 좀 더 작을 수 있음을 의미). 각 중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이고, 더욱 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 40 kDa 이며, 가장 바람직하게는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa 이다.
수용성 중합체 및 이의 혼합물의 예는 N-결합 또는 O-결합 탄수화물, 당, 인산, 폴리에틸렌글리콜(PEG ; 단백질을 유도하기 위해서 사용되는 모노-C1-C10), 알콕시- 또는 아릴콕시-폴리에틸렌글리콜을 포함하는 PEG 형태도 포함), 모노메톡시-폴리에틸렌글리콜, 덱스트란(예를 들어, 6 kDa 의 저분자량 덱스트란), 셀루로스, 그 외 탄수화물-기저 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 호모중합체, 폴리프로필린 옥시드/에틸렌 옥시드 공-중합체, 폴리옥시에틸레이티드 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올 등을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 서로 공유 결합된 IL-1ra-L 폴리펩티드 다량체를 제조하는 데 사용될 수 있는 두 가지 기능이 있는 교차결합 분자가 제공된다.
일반적으로, 화학적 유도화 반응은 적절한 조건 하에서 단백질을 활성화된 중합체 분자와 반응시킴으로써 이루어진다. 폴리펩티드의 화학적 유도체를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) SEQ ID NO : 2 또는 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 한 개 이상의 중합체 분자와 결합할 수 있는 조건에서 폴리펩티드를 활성화된 중합체 분자(예를 들어, 중합체 분자의 반응성이 있는 에스테르 또는 알데히드 유도체)에 반응시키는 단계; (b) 상기 반응 산물을 수득하는 단계로 구성된다. 최적의 반응 조건은 알려진 파라미터 및 원하는 결과에 기초하여 결정된다. 예를 들면, 단백질에 대한 중합체 분자의 비율을 높일수록 단백질에 부착된 중합체 분자의 함량도 증가한다. 한 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체는 아미노-말단에 단일 중합체 분자를 갖는 구조로 제조될 수 있다(참조, 미국특허 제 5,234,784 호).
폴리펩티드의 폴리에틸렌글리콜화는 본 분야에서 공지된 기술을 이용하여 특이적으로 수행될 수 있다 (Francis 등의 1992, Focus on Growth Factors 3:4-10; 유럽특허 제 0154316 호 및 제 0401384 호 ; 미국특허 제 4,179,337 호). 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜화는 본 발명에서 설명한 반응성이 있는 폴리에틸렌글리콜 분자(또는 유사한 반응성 있는 수용성 중합체)를 사용하여 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 이루어 질 수 있다. 아실화 반응의 경우, 하나의 반응성이 있는 에스테르기를가지는 중합체가 사용되어야 하고, 환원성 알킬화 반응의 경우, 하나의 반응성이 있는 알데히드기를 가지는 중합체가 사용되어야 한다. 반응성이 있는 알데히드의 예는 물에 안정한 폴리에틸렌 글리콜 프로페온 알데히드 또는 이의 모노 C1-C10알콕시 또는 아릴옥시 유도체를 포함한다(참조, 미국특허 제 5,252,714 호).
다른 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드는 비오틴에 화학적 방법에 의하여 결합될 수 있다. 비오틴/IL-1ra-L 폴리펩티드 분자는 아비딘에 결합하여 4가의 아비딘/비오틴/IL-1ra-L 폴리펩티드 분자를 형성한다. 또한, IL-1ra-L 폴리펩티드는 디니트로페놀(DNP) 또는 트리니트로페놀(TNP)의 공유결합에 의해 연결될 수 있고, 결과적으로 생성된 접합체를 항-DNP 또는 항-TNP-IgM 과 침전하여 원자가 10 의 12 개로 구성된 접합체를 형성한다.
일반적으로, 본 발명의 IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체를 투여하여 경감되거나 완화되는 상태는 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대해 본 발명에서 설명한 상태을 포함한다. 그러나, 본 발명에서 설명한 IL-1ra-L 폴리펩티드 유도체는 다른 활성, 즉, 유도체가 아닌 분자와 비교할 때 증가된 또는 감소된 생물학적 활성, 또는 증가 또는 감소된 반감기를 가질 수있다.
유전적으로 처리된 인간을 제외한 동물
천연의 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 파괴(즉, "낙 아웃 ")함으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현 정도는 유의성있게 감소하거나 완전히 발현이 되지 않는 인간을 제외한 동물, 즉, 마우스, 랫 또는 이 외의 설치류; 토끼, 염소, 양, 이 외의 농장동물이 본 발명의 범주에 포함되고, 상기 유전적으로 처리된 동물은 미국특허 제 5,557,032 호에서 설명된 것과 같은 기술과 방법을 이용하여 수득할 수 있다.
더욱이, 본 발명은 IL-1ra-L 유전자의 천연의 형태 또는 이종의 IL-1ra-L 유전자가 과발현되는 형질전환된 동물을 포함하고, 상기 동물은 인간을 제외한 동물, 즉, 마우스, 랫, 이 외의 설치류; 토끼, 염소, 양, 이 외의 농장동물을 포함한다. 이러한 형질전환된 동물은 미국특허 제 5,487,743 호와 국제출원 공개 제 WO94/28122 호에 제시된 것과 같은 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
또한, 본 발명은 한 개이상의 천연의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현정도를 변화시키기 위해서, 본 발명의 한 개 이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 프로모터가 활성화되거나 불활성화된(예를 들어, 동종의 재조합 방법을이용) 인간을 제외한 동물을 포함한다.
이러한 인간을 제외한 동물은 치료제의 후보물질에 대한 스크리닝에 사용될 수 있고, 이때, 치료제의 후보물질 동물에게 끼치는 영향이 조사된다. 예를 들면, 치료제의 후보물질은 IL-1ra-L 유전자의 발현을 감소시키거나, 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료제의 후보물질을 동물에게 투여한 후 생성된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 양이 조사된다. 또한, 다른 실시형태에서, 치료제의 후보물질이 동물에게 끼치는 실제적인 영향이 검정된다. 예를 들면, 특정 유전자의 과발현은 질병 혹은 병리적인 상태를 유발하거나 관련될 수 있다. 이러한 경우, 치료제의 후보물질이 해당 유전자의 발현을 감소시켜 병리적인 상태를 예방하거나 억제할 수 있는 지의 여부가 조사된다. 다른 예로서, 폴리펩티드의 단편과 같은 특정 대사산물의 생성은 질병 혹은 병리적인 상태를 유발하거나 관련될 수 있다. 이러한 경우, 치료제의 후보물질이 그러한 폴리펩티드의 단편의 생성을 감소시켜 병리적인 상태를 예방하거나 억제할 수 있는 지의 여부가 조사된다.
IL-1ra-L 폴리펩티드 활성에 대한 그 외 조절인자에 대한 검정
IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 변화시킬 수 있는 작동물질 또는 길항물질과 같은 조절인자를 확인하는 것이 바람직한 경우가 있다. IL-1ra-L 폴리펩티드를 조절할 수 있는 천연 혹은 합성된 분자는 본 발명에서 설명한 한 개 이상의 스크리닝 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 분자는 생체내 또는 시험관내에서 주사, 경구투여, 주입기구 이용 등의 방법으로 투여될 수 있다.
"테스트 분자" 라는 용어는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 변화(즉, 증가 또는 감소)시킬 수 있는 능력이 향상된 분자를 언급한다. 대부분의 경우, 테스트 분자는 IL-1ra-L 유전자의 발현에 영향을 끼침으로써, IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합 파트너(예를 들어, 리간드 혹은 수용체)에 결합함으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 직접적으로 변화시킨다. 본 발명의 한 실시형태에서, 테스트 분자는 적어도 약 10-6의 친화도 상수로, 바람직하게는 약 10-8, 더욱 바람직하게는 약 10-9, 좀더 바람직하게는 약 10-10의 친화도 상수로 IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
본 발명에서 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호 작용하는 분자를 검정 확인할 수 있는 방법을 제시한다. 한 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드는 테스트 분자가 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호작용을 할 수 있는 조건 하에서 테스트 분자와 반응되고, 상호작용의 정도가 검정된다. 이때, 테스트 분자는 정제된 형태 또는 조 혼합물 형태로 스크리닝에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드의 작동물질 또는 길항물질은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호작용을 통해 이의 활성을 조절할 수 있는 저분자량의 분자를 포함한다. IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 조절할 수 있는 분자는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산과 상보적인 서열을 갖는 핵산, 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 유도하거나 조절할 수 있는 핵산과 상보적인 서열을 갖는 핵산을 포함하고, 이들 핵산은 발현에 있어서 안티-센스 조절자로서 기능을 갖는다.
테스트 분자가 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호작용을 하는 것으로 밝혀지면, 그 분자의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 증가 또는 감소시키는 능력은 좀 더 증진될 수 있다. 테스트 분자의 IL-1ra-L 폴리펩티드와의 상호작용은 세포-기저 결합 검정, 막 결합 검정, 액상 검정, 면역학적 검정 등을 이용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 테스트 분자를 일정 기간동안 IL-1ra-L 폴리펩티드와 반응시킨 후, IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성은 생물학적 활성을 측정할 수 있는 방법을 이용하여 결정된다.
또한, 테스트 분자의 IL-1ra-L 폴리펩티드와의 상호작용은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 이용한 면역학적 검정방법을 사용하여 직접적으로 측정될 수 있다. 혹은 반응 용액 및 면역학적 검정에 본 발명에서 설명한 에피토프 표식을 포함하는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 변형된 형태를 사용할 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드가 결합 파트너(예를 들어, 리간드 혹은 수용체)와의 상호작용을 통해서 생물학적 활성을 나타내는 경우, 상응하는 결합 파트너를 대체할 수 있는 물질(예를 들어, 결합제, 수용체, 리간드)을 이용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드와의 상호작용을 다양한 시험관 내 검정을 통해 검정할 수 있다. 이러한 검정방법은 IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합 파트너와의 결합률 및/또는 결합정도를 테스트 분자가 증가 또는 감소시킬 수 있는지의 여부를 검정하는 데 사용될 수 있다. 검정시에, IL-1ra-L 폴리펩티드를 미량역가 판의 각 웰(well)에 고정시킨 후, 방사선동위원소로 표지된 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너(예를 들어, 요오드화된 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너)와 테스트 분자를 각 웰에 순서에 관계없이 하나씩 넣거나 동시에 넣어 반응시킨다. 반응이 완료되면, 각 웰을 세척한 후 결합된 동위원소의 활성을 섬광계수기를 이용하여 측정하여 상기 결합 파트너의 IL-1ra-L 폴리펩티드와의 결합정도를 결정한다. 전형적으로, 분자는 다양한 농도범위에서 조사되고, 실험 분석에 있는 한개 이상의 성분이 제거된 일련의 대조군 웹으로 결과의 평가시에 정확도를 꾀한다. 또 다른 형태의 검정방법은 사용된 단백질의 위치를 바꿈으로써 가능하다. 즉, IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합 파트너를 미량역가 판의 각 웰에 고정시킨 후, 이를 IL-1ra-L 폴리펩티드와 테스트 분자로 반응시킴으로써, IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합정도를 검정한다[Current Protocols in Molecular Biology, chap. 18 (Ausubel 등의 eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995)].
동위원소로 표지된 경우, IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 이의 결합 파트너는 비오틴과 결합되어 있고, 비오틴화된 단백질의 존재는 양고추냉이 퍼옥시아제(HRP) 또는 알칼린 포스파타제(AP)와 같은 효소에 연결된 스트렙트아비딘 또는 스트렙트아비딘의 형광표식을 이용하여 검정될 수 있다. IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너에 직접 결합할 수 있는 항체는 비오틴과 결합되어 AP 또는 HRP와 연결된 효소-연결된 스트렙트아비딘과 복합체를 형성함으로써 검출에 사용할 수 있다.
또한, IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너는 아가로스 비드, 아크릭 비드 또는 그 외 불활성의 고체상 기질과 같은 다른 유형에 부착됨으로써 고정화될 수 있다. 기질-단백질 복합체는 상기 단백질과 상보적인 단백질과 테스트할 화합물을 포함하는 용액에넣고, 반응시킨 후 비드를 원심원리에 의하여 제거하고, IL-1ra-L 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합정도를 본 발명에서 설명한 방법을 이용하여 측정한다. 또한, 기질-단백질 복합체를 컬럼에 고정시킨 후 상보적인 단백질과 테스트할 화합물을 포함하는 용액을 컬럼에 통과시킨 후, IL-1ra-L 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 복합체 형성은 본 발명에서 설명한 방법(예를 들어, 방사성 동위원소로 표지, 항체 결합)을 이용한 측정 방법을 이용할 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 단백질과 이의 결합 파트너 사이의 복합체 형성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 테스트 분자를 확인할 수 있는 또 다른 시험관 내 검정방법은 BIAcore 검정 시스템(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아에서 입수)과 같은 표면 플라스몬 공명 측정시스템 (surface plasmon resonance detector system)이다. BIAcore 시스템은 제조회사에서 제공하는 방법대로 사용하면 되는데, IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 이의 결합 파트너의 측정기내에 위치한 덱스트란-코팅된 센서 칩과의 공유결합에 기초하여 검정된다. 테스트 화합물과 상보적 단백질을 동시에 또는 연속해서 센서 칩이 내장된 챔버(chamber)내로 삽입시킨 후, 결합된 상보적 단백질의 양은 센서 칩의 덱스트란-코팅 면에 물리적으로 연결된 분자의 분자량의 변화에 기초하여 측정기에 의해서 측정된 분자 총질량의 변화 값을 통해서 검정될 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 복합체 형성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 테스트 분자를 2개 이상 조사하는 것이 바람직한 경우가 있다. 이러한 경우, 상기 설명한 검정 과정중 첫번째 테스트 화합물에 또 다른 테스트 화합물을 연속적으로 혹은 동시에 첨가하여 미리 변형될 수 있으며 나머지 과정은 상기 설명한 과정과 동일하게 실행될 수 있다.
본 발명에서 설명한 것과 같은 시험관 내 검정방법은 IL-1ra-L 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 복합체 형성에 영향을 줄 수 있는 다량의 테스트 분자를 스크리닝할 수 있는 장점이 있다. 이러한 검정방법은 파지-디스플레이, 합성 펩티드, 화학적 합성 라이브러리에서 생성된 화합물을 스크리닝 하기 위하여 자동화될 수 있다.
또한, IL-1ra-L 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 복합체 형성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 화합물은 IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 이의 결합 파트너를 발현하는 세포와 세포주의 세포배양을 통해 스크리닝될 수 있다. 세포와 세포주는 포유동물에서 유래한 것이고, 바람직하게는 인간 또는 그 외의 영장류, 개과 동물, 설치류에서 유래한 것이다. 테스트 분자의 존재여부를 조사하여 IL-1ra-L 폴리펩티드가 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너를 발현하는 세포의 표면에 결합하는 지의 여부를 조사할 수 있고, 이때 결합 정도는 IL-1ra-L 폴리펩티드 결합 파트너에 대한 항체로서 비오틴화된 항체를 사용하는 유식세포 계측기(flow cytometry)를 이용하여 검정될 수 있다. 이러한 세포 배양 검정방법은 상기 단백질 결합 검정에서 양성반응을 보인 화합물을 좀 더 확실하게 확인할 수 있는 장점이 있다.
또한, 세포 배양은 치료제 후보물질이 끼치는 영향을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료제 후보물질은 IL-1ra-L 유전자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포에 치료제 후보물질을 처리한 후, IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 단편의 생성량을 측정한다. 다른 실시형태에서, 치료제 후보물질의 세포 배양에 끼치는 영향이 조사된다. 예를 들면, 특정 유전자의 과발현은 세포에 특이한 영향을 줄 수 있다. 이러한 경우, 치료제 후보물질이 유전자의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있는 능력 또는 특정 유전자의 과발현에 의해 세포배양에 야기되는 특이한 영향을 증가 또는 감소시킬 수 있는 능력을 가지고 있는 지의 여부가 검정된다. 다른 예로서, 폴리펩티드의 단편과 같은 특정 대사산물의 생성은 질병 또는 병리학적 상태를 유발하거나 관련될 수 있다. 이러한 경우, 치료제 후보물질이 세포배양에서 그러한 대사산물의 생성을 감소시킬 수 있는 지의 여부가 조사될 수 있다.
세포내로 도입되는 단백질 (Internalinzing Protein)
HIV 에서 유래한 tat 단백질 서열은 단백질을 세포 내로 삽입시키는 데 사용될 수 있다(Falwell 등의 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:664-68). 예를 들면, HIV tat 단백질(단백질 전이 도메인 또는 TAT PTD)인 11 개의 아미노산 서열(Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R ; SEQ ID NO : 7)은 세포막을 통과하여 핵의 내부로 단백질을 전달하는 매개역할을 수행한다 (Schwarze 등의 1999, Science 285:1569-72; Nagahara 등의 1998, Nat. Med. 4:1449-52). 이러한 도메인에 FITC 가 결합된 펩타티드 (FITC-표시된 G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SEQ ID NO : 8)를 제조할 수 있고, 이 펩티드를 복강내에 투여하여 조직 내로 도입할 수 있으며, 세포에 결합된 펩티드는 형광-활성-세포(FACS) 검정을 통해서 검정될 수 있다. tat-β-gal 융합 단백질로 세포를 처리한 경우 β-gal 활성을 측정하게 된다. 주입 후, 이러한 펩티드의 발현은 간, 신장, 폐, 심장, 뇌를 포함하는 많은 조직에서 관찰된다. 이때, 이러한 펩티드는 세포내로 삽입되는 과정에서 접힘이 약간 풀린 형태로 삽입되고 그 후 다시 접힘되는 것으로 생각된다.
따라서, tat 단백질 서열은 목적하는 폴리펩티드를 세포내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, tat 단백질 서열을 이용하여, IL-1ra-L 작동물질(예를 들어, 항-IL-1ra-L 선택적 결합제, 분자량이 작은분자, 수용성 수용체, 안티센스 올리고누클레오티드)를 세포내로 도입하여 IL-1ra-L 분자의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "IL-1ra-L 분자" 라는 용어는 IL-1ra-L 핵산 분자와 IL-1ra-L 폴리펩티드를 모두 의미한다. 필요한 경우, IL-1ra-L 단백질 자체가 상기 방법을 이용하여 세포내로 투여될 수 있다(Straus, 1999, Science 285:1466-67).
IL-1ra-L 폴리펩티드를 이용한 세포원 확인
본 발명의 특정 실시형태에 따라, IL-1ra-L 폴리펩티드와 관련하여 특정 세포 유형의 원을 결정하는데 유용할 것이다. 예를 들어, 적절한 치료를 선택하는데 있어 도움이 되는, 병리학적 증상이나 질환의 근원을 결정하는데 유용할 것이다. 특정 실시형태에서, IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산은 상기 프로브로 세포의 핵산을 스크리닝함으로써 본원에 기재된 세포를 확인하기 위해 프로브로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포내의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 존재를 시험하기 위해 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체를 사용할 수 있으며, 만일 상기 세포가 본원에 기재된 유형이라면 측정해도 될 것이다.
IL-1ra-L 폴리펩티드 조성물 및 투여
치료용 조성물은 본 발명의 범주내에 포함된다. 상기 IL-1RA-L 폴리펩티드 약학적 조성물을 투여하기에 적합하도록 선택한 약학적또는 생리학적으로 용인가능한 제제형과 혼합하여 치료학적 유효량의 IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 IL-1ra-L 핵산 분자를 포함할 것이다. 약학적 조성물은 투여하기에 적합하도록 선택한 약학적 또는 생리학적으로 용인가능한 제제형과 혼합하여 하나 또는 그이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드 선택 결합제의 치료학적 유효량을 포함할 것이다.
용인가능한 제제형 물질은 사용하려는 투약량 및 농도에서 수취인에게 비독성인 것이 바람직하다.
약학적 조성물은 예를 들어, pH, 삼투몰농도, 점성도, 정화도, 색채, 등장도, 향, 무균상태, 안정성, 용해속도 또는 방출속도, 조성물의 흡수 또는 통과를 변형시키고, 유지하거나 보존하기 위한 제제형 물질을 함유할 것이다. 적당한 제제형 물질은 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항균제, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산 수소 나트륨), 완충용액(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산), 부피 조정제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제[예를 들어, 테트라아세트산 에틸렌디아민(EDTA)], 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타 - 시클로덱스트린 또는 히드록시프로필 - 베타 - 시클로덱스트린), 첨가제, 단당류, 다당류 및 그밖의 다른 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 향미료 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈), 저분자량의 폴리펩티드, 염 - 형성 반대이온(예를 들어, 나트륨), 방부제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 치메로살, 펜에틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매(예를 들어, 글리신, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예를 들어, 만니톨, 소르비톨), 현탁화제, 계면활성제 또는 침윤제(예를 들어, 플루로닉 ; PEG ; 소르비탄 에스테르 ; 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 과 같은 폴리소르베이트류 ; 트리톤 ; 트로메타민 ; 레시틴 ; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증강제(예를 들어, 수크로스 또는 소르비톨), 삼투성 증강제(예를 들어, 알칼리 금속 할로겐화물 - 바람직하게 염화나트륨 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨, 소르비톨), 수송 부형제, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보조약.Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)를 참조하라.
예를 들어, 투여하려는 경로, 수송형 및 바람직한 투약량에 따라 본 분야의 숙련자들은 최적의 약학적 조성물을 결정할 것이다. 예를 들어, 상기 문헌의 Remington's pharmaceutical Science 를 참조하라.상기 조성물은 물리적 상태, 안정성, 생체내에서의 방출속도 및 생체내에서의 IL-1ra-L 분자의 청소율에 영향을 미칠것이다.
약학적 조성물내에 함유된 1 차 부형제 또는 담체는 본질적으로 수성 또는 비 - 수성일 것이다. 예를 들어, 주사하기 적당한 부형제 또는 담체는 물, 생리식염수 용액 또는 인공의 뇌척수액 형태일 것이고 가능하다면 비경구 투여하기에 적합한 조성물내에 일상적인 다른 물질로 보충된 것이다. 혈청 알부민과 혼합한 중성 완충 식염수 또는 식염수는 또한 다른 실험 부형제이다. 그밖의 다른 실험의 약학적 조성물은 약 pH 7.0 - 8.5 의 트리스 완충용액 또는 약 pH 4.0 - 5.5 의 아세테이트 완충용액을 포함하며, 이들은 소르비톨이나 적절한 치환을 더 포함할 것이다. 본 발명의 실시형태에서, 저장하기 위해 바람직한 정도의 순도를 갖는 선택 조성물과 동결건조된 덩어리 형태 또는 용액 형태의 임의의 제제형(Remington's pharmaceutical Sciences, 상기 문헌 참조)을 혼합함으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드 조성물을 제조할 것이다. 또한, 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물 형태로 제형화할 것이다.
비경구 수송용으로 IL-1ra-L 폴리펩티드 약학적 조성물을 선택할 수 있다. 선택적으로, 경구 투여와 같은 소화관을 통한 수송 또는흡입용으로 조성물을 선택할 것이다. 상기 약학적으로 용인가능한 조성물의 제조는 본 분야의 기술내에 포함된다.
투여 부위에 대한 적합한 농도에서 제제형 성분이 존재한다. 예를 들어, 생리학적 pH 또는 그보다 약간 낮은 pH, 전형적으로 pH 범위가 약 5 내지 8 의 범위에서 조성물을 유지하기 위해 완충용액을 사용하였다.
비경구 투여를 고려해 볼때, 본 발명에 사용하는 치료용 조성물은 약학적으로 용인가능한 담체내에 바람직한 IL-1ra-L 분자를 포함하는, 발열물질이 없으며 비경구적으로 용인가능한 수용액 형태일 것이다. 특별하게 비경구 주사에 적합한 담체는 멸균 증류수이며, 여기에 IL-1ra-L 분자는 멸균의 등장용액 형태로서 적절하게 보존되도록 제형화된다. 또다른 제제는 주사가능한 중심체, 생분해가능한 입자, 중합체 화합물(폴리락트산 또는 폴리글리콜산 같은), 비드 또는 리포솜과 같은 제제와 함께 바람직한 분자의 제제형을 포함하며 이들은 주사 부위의 저장부를 통하여 수송될 수 있는 산물의 조절된 방출이나 서방성을 제공한다. 히알루론산 또한 사용할 수 있고 이는 순환하는 동안에 서방성을 증가시키는 효과를 가지고 있다. 바람직한 분자를 도입시키기 위한 다른 적절한 방법으로는 이식가능한 약물 수송 장치가 있다.
실시형태에서, 흡입용 약학적 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, IL-1ra-L 폴리펩티드를 흡입용 건조 분말 형태로 제형화할 것이다. IL-1ra-L 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 흡입 용액 또한 에어로솔 수송을 위해 추진제와 함께 제형화할 것이다. 또다른 실시형태에서, 용액을 분무할 것이다. 폐 투여에 관해서는 PCT 공개 번호 제 WO 94/20069 호에 기재되어 있으며, 여기에는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 수송에 관해 기술되어 있다.
경구 투여할 수 있는 특정 제제형도 생각할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 이러한 방법으로 투여한 IL-1ra-L 폴리펩티드는 정제 및 캡슐과 같은 고형의 약학적 제형을 혼합하는데 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 이들 없이 제형화할 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체내이용효율이 최대화되고 전 - 전신성 분해가 최소화될 때의 소화관 지점에서 제제형의 활성 부분이 방출되도록 제조하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드의 흡수를 용이하게 하는 또다른 제제를 포함할 수 있다. 희석제, 향미료, 저융해 왁스, 식물성 기름, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제 또한 사용할 것이다.
또다른 약학적 조성물은 정제 제조에 유용한 비 - 독성 부형제와 함께 유효량의 IL-1ra-L 폴리펩티드를 함유할 것이다. 멸균수 또는다른 적당한 부형제에 정제를 용해시킴으로써 용액은 단위 - 투여 형태로 제조할 수 있다. 적당한 부형제는 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : 불활성 희석제(예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산염, 락토스 또는 인산칼슘) ; 또는 결합제(예를 들어, 전분, 겔라틴 또는 아카시아) ; 또는 윤활제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석).
서방성 제제형 또는 제어 - 수송 제제형내에 IL-1ra-L 폴리펩티드를 함유하는 제제형을 포함한 다른 IL-1ra-L 폴리펩티드 약학적 조성물도 본 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 리포솜 담체, 생 - 침식가능한 미세입자 또는 다공성 비드 및 저장부 주사 같은 다양한 서방성 제제형이나 제어 - 수송 제제형을 제형화하는 기술 또한 본 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 약학적 조성물의 수송을 위한 다공성 중합체 미세입자의 조절된 방출에 관해 기술하고 있는 제 PCT/US93/00829 호를 참조하라.
서방성 제제의 또다른 예로는, 약품 형태(예를 들어, 막 또는 마이크로캡슐)의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 다음을 포함한다 : 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(미국 특허 번호 제 3,773,919 호 및 유럽 특허 번호 제 058481 호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트로 이루어진 공중합체(Sidman 등의 1983, Biopolymers 22 : 547 - 56 참조), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer 등의 1981,J. Biomed. Mater. Res.15 : 167 - 277 및 Langer, 1982,Chem. Tech.12 : 98 - 105), 아세트산 에틸렌비닐(Langer 등의 상기 문헌 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 번호 제 133988 호). 서방성 조성물은 또한 리포솜을 포함할 것이고, 본 분야에 공지된 모든 여러가지 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, Eppstein 등의 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3688 - 92 ; 및 유럽 특허 번호 제 036676 호, 제 088046 호 및 제 143949 호를 참조하라.
일반적으로 생체내 투여에 사용하기 위한 IL-1ra-L 약학적 조성물은 멸균된 상태여야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과로 시행하였다. 조성물을 동결건조시킨 경우에, 이러한 방법을 이용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전이나 후에 시행될 것이다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 저장하거나 용액에 저장할 것이다. 게다가, 비경구 조성물은 일반적으로, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통할 수 있는 스토퍼를 함유하는 정맥내 용액이 함유된 백 또는 작은병과 같은 무균에 가까운 포트를 가진 용기에 보관한다.
일단 약학적 조성물이 제형화되면, 이 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고형물 형태 또는 탈수된 분말이나 동결건조된 분말형태로 멸균 유리병에 저장할 것이다. 이러한 제제형은 투여하기 전에 재구성을 필요로하는 형태(예를 들어, 동결건조된 상태) 또는 바로 사용가능한 형태로 저장할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 단일 - 투여량 단위가 명시된 키트에 관한 것이다. 키트는 건조된 단백질을 함유하는 첫 번째 용기와 수용성 제제형을 함유하는 두 번째 용기를 각각 함유한다. 단일 및 다중 - 챔버를 갖춘 전 - 충진된 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지)를 함유한 키트 또한 본 발명의 범주내에 포함된다.
치료학적으로 사용하려는 IL-1ra-L 약학적 조성물의 유효량은, 예를 들어, 치료 배경 및 목적에 따라 달라질 것이다. 부분적으로 수송된 분자, 사용하려는 IL-1ra-L 분자, 투여 경로 및 환자의 크기(체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및 상태(연령 및 일반적 건강상태)에 따라 치료하기 위한 적절한 투여량 수준이 다양해짐을 본 분야의 숙련자들은 인지할 것이다. 따라서, 임상의들은 최상의 치료 효과를 얻기 위해 적정 투여량 및 투여 경로를 변경시킬 것이다. 전형적인 투여량 범위는, 상기 언급한 요소에 따라, 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상일 것이다. 다른 실시형태에서, 투여량 범위는 다음과 같다 : 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 까지 ; 또는 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 까지 ; 또는 5 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 까지.
투여 빈도는 사용하는 제제형내의 IL-1ra-L 분자의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 바람직한 효과를 얻을 수 있는 투여량에 도달할 때까지 임상의들은 조성물을 투여할 것이다. 조성물은 일정 시간에 걸쳐 1 회 투여량, 2 회 또는 그이상의 투여량 형태(바람직한 분자의 동일한 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음) 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입의 형태로 투여될 것이다. 적절한 투여량의 세분화는 일반적으로 본 분야의 숙련자들에 의해 행해지며 그들에 의해 일상적으로 시행된 범위내에 존재한다. 적절한 투여량은 적절한 투여 - 반응 데이터 사용을 통하여 확인할 수 있다.
공지된 방법에 따라 약학적 조성물의 투여 경로는, 예를 들어 다음과 같다 : 경구적 ; 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌내심실, 근육내, 안내, 동맥내, 간문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통하여 ; 서방성 시스템에 의해 ; 또는 이식 장치에 의해. 바람직하다면, 식괴 주사나 연속적 주입 또는 이식 장치에 의해 조성물을 투여할 것이다.
선택적 또는 부가적으로, 조성물은 흡수되거나 캡슐화된 바람직한 분자 상에 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통하여 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치를 사용하는 경우에, 장치는 모든 적당한 조직이나 기관으로 이식되고 바람직한 분자의 수송은 확산, 지효성 식괴 또는 연속적 투여를 통해 이루어질 것이다.
몇몇 경우에서, 생체외에서는 IL-1ra-L 폴리펩티드 약학적 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 예에서, 환자로부터 제거한 세포, 조직 또는 기관을 IL-1ra-L 폴리펩티드 약학적 조성물에 노출시킨 후에 바로 이 세포, 조직 또는 기관을 다시 환자에게 이식하였다.
다른 경우에서, IL-1ra-L 폴리펩티드를 발현시키고 분비하도록 본원에 기재된 방법을 사용하여, 유전자 조작한 특정 세포를 이식함으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드를 수송할 수 있다. 이러한 세포는 동물이나 인체 세포이며 동일 생물에서 유래하고, 이형 또는 이종의 형태일 것이다. 임의로, 세포는 영속성을 나타낸다. 면역 반응의 가능성을 감소시키기 위해, 조직 주변의 침투를 회피하도록 세포를 캡슐화하였다. 캡슐화 물질은 일반적으로 단백질 산물의 방출을 허용하는, 생체적합하고 반 - 투과성의 중합체 봉입물 또는 막이며 이 물질은 환자의 면역계 또는 그 밖의 다른 주변 조직으로부터의 유해한 요소에 의한 세포의 파괴를예방한다.
본원에 논의된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드로 분리한 세포 집단(예를 들어, 간세포, 림프구, 적혈구 세포, 연골 세포, 뉴런 등)을 치료하는 것이 바람직하다. 이것은 세포막을 통과할 수 있는 형태인 경우에 분리한 세포를 폴리펩티드에 직접 노출시킴으로써 시행할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태는 치료용 펩티드의 시험관내 생산과 유전자 치료 또는 세포 치료에 의해 치료용 폴리펩티드의 생산 및 수송에 관한 방법(예를 들어, 상동성 재조합 및/또는 다른 재조합 생산 방법) 및 세포에 관한 것이다. 일반적으로, 전사적으로 잠재성을 나타내는 IL-1ra-L 유전자 또는 발현이 미비한 유전자를 함유한 세포를 변형시키기 위해 상동성 및 다른 재조합 방법을 사용하였으며 이로 인해 치료학적 유효량의 IL-1ra-L 폴리펩티드를 발현하는 세포를 생성하였다.
상동성 재조합은 처음에는 전사적으로 활성인 유전자에서 돌연변이를 유발하거나 정정하기 위해 표적 유전자에 대해 개발된 기술이었다. Nucherlapati, 1989, Prog.in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol.36 : 301. 기본 기술은, 불완전한 유전자내의 특이적 돌연변이를 정정하기위해(Doetschman'등의 1987,Nature330 : 576 - 78) 또는 특이적 돌연변이를 포유동물 게놈의 특이적 영역내로 도입하기 위한 방법(Thomas 등의 1986,Cell44 : 419 - 28 ; Thomas 및 Capecchi, 1987,Cell51 : 503 - 12 ; Doetschman 등의 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85 : 8583 - 87)으로 개발되었다.
상동성 재조합을 통해서, 게놈내로 삽입하고자 하는 DNA 서열은 표적 DNA 에 상기 DNA 서열을 결합시킴으로써 목적 유전자의 특이적 영역을 지배할 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 영역과 상보적인(상동적인) 누클레오티드 서열이다. DNA 복제 과정 동안에 게놈의 특이적 영역과 상보적인 표적 DNA 의 작은 조각을 모가닥(parental strand)과 접촉시켰다. 혼성화하기 위해 DNA 의 일반적 특성을 세포내로 삽입하여 상동성 공유 영역을 통하여 내인성 DNA 의 다른 조각과 결합하였다. 만일 이러한 상보 가닥이 돌연변이 또는 상이한 서열이나 다른 누클레오티드를 함유하는 올리고누클레오티드와 결합하게 되면, 재조합의 결과로서 신규하게 합성된 가닥내로 혼입된다. 교정 기능의 결과로, DNA 의 신규한 서열이 주형으로서의 역할을 하는 것이 가능하게 된다. 따라서, 전이된 DNA 를 게놈내로 결합시켰다.
표적 DNA 의 이러한 조각에 결합하는 DNA 영역은 IL-1ra-L 폴리펩티드(예를 들어, 플랭킹 서열)의 발현을 제어하거나 상호작용할 것이다. 예를 들어, 프로모터/인핸서 요소, 서프레서 또는 외인성 전사 조절 요소를, 바람직한 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 전사에 영향을 미치는데 충분한 근접한 방향의 의도된 숙주 세포의 게놈내로 삽입하였다. DNA 일부를 제어하는 조절 요소는 숙주 세포 게놈에 존재한다. 따라서, 바람직한 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현은 IL-1ra-L 유전자 자체를 코드하는 DNA 의 감염에 의해서가 아니라 오히려 IL-1ra-L 유전자를 전사시키기 위한 인식가능한 신호가 내재되어 있는 내인성 유전자 서열을 제공하는 DNA 조절 세그먼트와 연결된 표적 DNA(내인성의 목적 유전자와 상동적인 영역 함유) 의 사용에 의한 것이다.
전형적인 방법에서, 세포내의 바람직한 표적 유전자(즉, 바람직한 내인성 세포 유전자)의 발현은 상동성 재조합을 거쳐 적어도 조절 서열, 엑손 및 스플라이스 공여 부위를 포함하는 DNA 도입에 의해 미리 선택한 부위에서 세포성 게놈으로 변형된다. 이러한 성분은 염색체(게놈) DNA 내로 삽입되었고, 사실상, 이러한 방법으로 신규한 전사 단위(DNA 구성물에 존재하는 조절 서열, 엑손 및 스플라이스 공여 부위는 내인성 유전자에 작동적으로 결합된다)가 생성된다. 염색체 DNA 내로의 이러한 성분 도입의 결과로 바람직한 내인성 유전자의 발현이 변형된다.
본원에 기재된 바와 같이, 변형된 유전자는 수득한 세포에서 생리학적으로 유의한 수준에서 발현되지 않은 유전자의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 수득한 세포에서 일반적으로 잠재성을 나타내는(발현되지 않는) 유전자 활성(또는 발현 유발)을 포함한다. 실시형태는 또한 조절 또는 유도의 패턴 변화를 포함하며 이는 수득한 세포에서 발현되는 유전자 발현을 감소시키고(제거도 포함) 수득한 세포에서 일어나는 조절 또는 유도의 패턴과는 상이하다.
세포의 내인성 게놈 IL-1ra-L 폴리펩티드 코딩 영역(즉 5' 방향)의 상류 부분에 존재하는 부위 - 특이적 재조합 시스템(예를 들어, Cre/loxP, FLP/FRT)(Sauer, 1994,Curr. Opin. Biotechnol.,5 : 521 - 27 ; Sauer, 1993,Methods Enzymol.,225 : 890 - 900) 으로 부터 재조합 서열을 배열하기 위해 상동성 재조합의 첫 사용을 포함하는 세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자로부터 IL-1ra-L 폴리펩티드 생성을 증가시키거나 유발하는데 상동성 재조합에 의한 방법을 사용할 수 있다. 게놈 IL-1ra-L 폴리펩티드 코딩 영역의 상류 부분에만 위치하는 부위와 상동적인 재조합 부위를 함유하는 플라스미드를 적절한 리콤비나제와 함께 변형된 세포주내로 도입시켰다. 이러한 리콤비나제는, 플라스미드의 재조합 부위를 통해서, 플라스미드가 세포주 내의 게놈 IL-1ra-L 폴리펩티드 코딩 영역의 상류 부분에만 위치하는 재조합 부위내로 삽입되도록 한다(Baubonis 및 Sauer, 1993,NucleicAcids Res.21 : 2025 - 29 ; O'Gorman 등의 1991,Science251 : 1351 - 55). 이러한 플라스미드에 적절하게 위치한다면, 전사를 증가시키는 것으로 공지된 모든 플랭킹 서열(예를 들어, 인핸서/프로모터, 인트론, 번역 인핸서)을 신규하거나 변형된 전사 단위를 생성하도록 상기 방법을 사용하여 삽입하여 세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자로부터 신규하거나 증가된 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하게 되었다.
세포의 내인성 게놈 IL-1ra-L 폴리펩티드 코딩 영역의 상류 부분에만 위치하는 부위 특이적 재조합 서열에서 세포주를 사용하는 다른 방법으로는 세포주의 게놈에서 그밖의 다른 두 번째 재조합 부위를 도입하도록 상동성 재조합을 사용하는 것이다. 그리고나서 적절한 리콤비나제는, 신규하거나 변형된 전사 단위를 형성하여 세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자로부터 신규하거나 증가된 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생성하는 재조합(결실, 역위 및 전이)(Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5 : 521 - 27 ; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225 : 890 - 900)을 야기하는 두 - 재조합 - 부위 세포주내로 도입된다.
세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자로부터 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 유발하거나 증가시키기 위한 다른 연구는 유전자나 유전자들(예를 들어, 전사요소)의 발현 증가 또는 유발 및/또는 유전자나 유전자들(예를 들어,전사 억제인자)의 발현을 감소시킴으로 인해 세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자로부터 신규하거나 증가된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생성을 포함한다. 이러한 방법은 세포에 비 - 자연 발생적 폴리펩티드(예를 들어, 전사요소 도메인에 융합된 부위 특이적 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드)의 도입으로 세포의 내인성 IL-1ra-L 유전자 결과물로부터의 신규하거나 증가된 IL-1ra-L 폴리펩티드 생성을 포함한다.
본 발명은 또한 표적 유전자의 발현을 변형시키는 방법에 유용한 DNA 구성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 전형적인 DNA 구성물은 (a) 하나 또는 그 이상의 표적 서열, (b) 조절 서열, (c) 엑손 및 (d) 짝짓지 않은 스플라이스 공여 부위를 포함한다. DNA 구성물에서의 표적 서열은 세포에서 표적 유전자에 요소 (a) - (d) 의 삽입으로 요소 (b) - (d) 가 내인성 표적 유전자의 서열에 작동적으로 결합하게 된다. 다른 실시형태에서, DNA 구성물은 (a) 하나 또는 그 이상의 표적 서열, (b) 조절 서열, (c) 엑손, (d) 스플라이스 - 공여 부위, (e) 인트론 및 (f) 스플라이스 - 수용 부위를 포함하며, 여기에서 표적 서열은 요소 (a) - (f) 의 삽입으로 요소 (b) - (f) 가 내인성 유전자에 작동적으로 결합하게 한다. 표적 서열은 상동성 재조합이 발생하는 세포성 염색체 DNA 의 이미 선택한 부위와 상동적이다. 구성물에서, 엑손은 일반적으로 조절 서열의 3' 방향이고 스플라이스 - 공여 부위는 엑손의3' 방향이다.
특정 유전자의 서열이 공지되었다면, 본원에 나타나있는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 핵산 서열과 같은 DNA 조각이 예를 들어, 목적의 특이적 인식 부위의 결합 영역에서 천연 DNA 의 적절한 제한에 의해 수득되었거나 합성된, 유전자의 선택 영역과 상보적이다. 세포내로 삽입할 경우에 이러한 조각은 표적 서열로 사용하며 게놈내로 그것의 상동성 영역을 혼성화시킬 것이다. DNA 복제 과정 동안에 이러한 혼성화가 발생한다면, 이러한 DNA 조각 및 그것에 부착된 모든 다른 서열은 오카자키 단편으로 작용할 것이고 DNA 의 합성된 신규한 딸 가닥으로 혼입될 것이다. 그러므로, 본 발명은 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드를 포함하며 이러한 누클레오티드는 표적 서열로 사용될 것이다.
IL-1ra-L 폴리펩티드를 생성하는 세포 이식과 같은 IL-1ra-L 폴리펩티드 세포 치료를 생각할 수 있다. 이러한 실시형태는 생물학적 활성 형태의 IL-1ra-L 폴리펩티드를 합성하고 분비할 수 있는 세포 이식을 포함한다. 상기 IL-1ra-L 폴리펩티드 - 생성 세포는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 천연 생산자인 세포 또는 바람직한 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 유전자로 형질전환시킨 것에 의해 증가된 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하는 능력의재조합 세포일 것이다. 유전자의 발현 및 분비를 증진시킬 뿐만 아니라 유전자를 수송하기에 적합한 벡터에 의해 상기 변형이 이루어질 것이다. IL-1ra-L 폴리펩티드를 투여한 환자에게서 잠재하는, 이종의 폴리펩티드 투여로 발생하는 면역반응을 최소화하기 위해서는 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하고 인체원이 되는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하는 천연 세포가 바람직하다. 마찬가지로, 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시킨 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생산하는 재조합 세포가 바람직하다.
주변 조직으로의 침투를 방지하기 위해 이식된 세포를 캡슐화하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드 방출을 가능하게 하며 환자의 면역 시스템이나 주변 조직으로부터의 다른 유해한 요소에 의한 세포의 파괴를 예방하는 생체적합하고, 반투과성의 중합체 동봉물 또는 막 형태의 인체 또는 비 - 인체 동물 세포를 이식할 것이다. 선택적으로, 생체외 IL-1ra-L 폴리펩티드를 생성하도록 형질전환시킨, 환자 자신의 세포를 캡슐화하지 않고 환자에게 직접 이식할 수 있다.
살아있는 세포를 캡슐화하는 기술이 본 분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 캡슐화된 세포의 제조 및 환자에서의 세포 이식이 이루어질 것이다. 예를 들어, Baetge 등의 PCT 공개 번호 제 WO 95/05452 호및 제 PCT/US94/09299 호에는 생물학적 활성 분자의 효과적인 수송을 위해 유전적으로 조작된 세포를 함유하는 막 캡슐에 관해 기재되어 있다. 그 캡슐은 생체적합하고 용이하게 회수할 수 있다. 포유동물 숙주에 이식할 경우에, 캡슐은 생체내 하향 - 조절에 영향을 받지 않는 프로모터에 작동적으로 결합하는 생물학적 활성 분자를 코드하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로 감염시킨 세포를 캡슐에 넣은 것이다. 장치는 수용자내의 특이 부위에 살아있는 세포로부터의 분자 수송을 제공한다. 미국 특허 번호 제 4,892,538 호 ; 제 5,011,472 호 ; 및 제 5,106,627 호를 또한 참조하라. PCT 공개 번호 제 WO 91/10425 호(Aebischer 등의)에는 살아있는 세포를 캡슐화하는 시스템이 기재되어 있다. PCT 공개 번호 제 WO 91/10470 호(Aebischer 등의) ; Winn 등의 1991,Exper. Neurol.113 : 322 - 29 ; Aebischer 등의 1991,Exper. Neurol.111 : 269 - 75 ; 및 Tresco 등의 1992,ASAIO38 : 17 - 23 또한 참조하라.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 생체내 및 시험관내 유전자 치료 수송 또한 계획할 수 있다. 유전자 치료 기술의 예는 "유전자 치료 DNA 구성물" 을 형성하기 위해 구성 또는 유도 프로모터에 실행가능하도록 결합할 수 있는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 IL-1ra-L 유전자(게놈 DNA, cDNA 및/또는 합성 DNA)를 사용하는 것이다. 프로모터가 구성물이삽입되는 세포 또는 조직 유형에서 활성화되면, 프로모터는 내인성 IL-1ra-L 유전자와 상동적이거나 이종적일 것이다. 유전자 치료 DNA 구성물의 다른 성분은 임의적으로 다음을 포함한다 : 부위 - 특이적 삽입되도록 설계된 DNA 분자(예를 들어, 상동성 재조합에 유용한 내인성 서열), 조직 - 특이적 프로모터, 인핸서 또는 사일렌서(Silencer), 모세포 보다 선택적 이점을 제공할 수 있는 DNA 분자, 형질전환된 세포를 확인하기 위해 표지로서 유용한 DNA 분자, 음성 선별 시스템, 세포 특이적 결합제(예를 들어, 세포 표적에 관한), 세포 - 특이적 감입 요소, 벡터로부터 발현을 증가시키는 전사 요소 및 벡터 생산을 가능하게 하는 요소.
바이러스 또는 비 - 바이러스 벡터를 이용하여 유전자 치료 DNA 구성물을 세포(생체외 또는 생체내)내로 도입시켰다. 본원에 기재된 바이러스 벡터에 의해 유전자 치료 DNA 구성물을 도입시켰다. 레트로바이러스 벡터와 같은 특정 벡터는 세포의 염색체 DNA 에 DNA 구성물을 수송할 것이며 이 유전자는 염색체 DNA 내로 삽입될 것이다. 다른 벡터는 에피솜으로 작용할 것이며 유전자 치료 DNA 구성물은 세포질내에 남아있을 것이다.
다른 실시형태에서, 조절 요소는 표적 세포내에 IL-1ra-L 유전자의 발현을 조절하기 위해 포함될 수 있다. 상기 요소들은 적절한 작동 인자에 대응하여 작동된다. 이러한 방식에서, 바람직하다면 치료용 폴리펩티드가 발현될 수 있다. 하나의 일반적인 조절 방법으로는 DNA - 결합 단백질 또는 전사 활성 단백질과 같은 생물학적 과정을 개시할 수 있는 도메인 및 소형 분자 - 결합 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 이량체화하기 위해 소형 분자 이량체화제 또는 라팔로그(rapalog)의 사용을 포함한다(PCT 공개 번호 제 WO 96/41865 호, 제 WO 97/31898 호 및 제 WO 97/31899 호를 참조하라). 트랜스 유전자의 전사를 개시하기 위해 단백질의 이량체화 반응이 사용되었다.
선택적 조절 기술은 응집체 또는 클러스터 형태로 세포내 목적 유전자로부터 발현되는 단백질의 저장 방법을 사용한다. 융합 단백질 형태로 발현되는 목적 유전자는 조건 응집 도메인을 포함하며 결과적으로 소포체내에 집합 단백질이 보존되어 있다. 세포내에 저장된 단백질은 안정하며 비활성상태이다. 조건적 응집 도메인을 제거하는 약물(예를 들어, 소형 분자 리간드)을 투여함으로써 단백질이 방출될 수 있으며 그로 인해 특이적으로 응집체 또는 클러스터가 파괴되어 단백질이 세포로부터 분비될 것이다. Aridor 등의 2000, Science 287 : 816 - 17 및 Rivera 등의 2000, Science 287 : 826 - 30 참조하라.
다른 적절한 조절 방법이나 유전자 스위치는 본원에 기재된 시스템을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 미페프리스톤 (Mifepristone)(RU 486)은 프로게스테론 길항물질로 사용된다. 프로게스테론 길항물질에 변형된 프로게스테론 수용체 리간드 - 결합 도메인의 결합은 두 전사 요소의 이량체 형성에 의해 전사를 활성화시키고나서 DNA 에 결합하기 위해 핵으로 이동한다. 천연 리간드에 결합하는 수용체 능력을 제거하기 위해 리간드 - 결합 도메인을 변형시켰다. 변형된 스테로이드 호르몬 수용체 시스템에 관해서는 미국 특허 번호 제 5,364,791 호 및 PCT 공개 번호 제 WO 96/40911 호와 제 WO 97/10337 호에 기재되어 있다.
또다른 제어 시스템은 엑디손 수용체(세포질 수용체)와 결합하고 이 수용체를 활성화시키는 엑디손(초파리 스테로이드 호르몬)을 사용한다. 그리고나서 이 수용체는 특이적 DNA 반응 요소(엑디손 - 반응 유전자로부터의 프로모터)에 결합하기 위해 핵으로 이동한다. 엑디손 수용체는 트랜스활성 도메인, DNA - 결합 도메인 및 전사를 개시하는 리간드 - 결합 도메인을 포함한다. 엑디손 시스템은 미국 특허 번호 제 5,514,578 호 및 PCT 공개 번호 제 WO97/38117 호, 제 WO96/37609 호 및 제 WO93/03162 호에 기재되어 있다.
다른 제어 방법으로 양성 테트라사이클린 - 제어 트랜스 활성제 (transactivator)를 사용한다. 이러한 시스템은 전사를 활성화시키는 폴리펩티드와 결합하는 돌연변이된 tet 리프레서 단백질 DNA - 결합 도메인(돌연변이된 tet R-4 아미노산 변화로 역 테트라사이클린 - 조절 트랜스활성제 단백질이 생성되었고, 즉 테트라사이클린 존재하에 tet 작동인자와 결합하게 된다)을 포함한다. 이러한 시스템은 미국 특허 번호 제 5,464,758 호, 제 5,650,298 호 및 제 5,654,168 호에 기재되어 있다.
다른 발현 제어 시스템 및 핵산 구성물은 출원인이 인노비르 라보라토리스 인코포레이티드인 미국 특허 번호 제 5,741,679 호 및 제 5,834,186 호에 기재되어 있다.
IL-1ra-L 핵산 분자의 국부 주사를 통하거나 다른 적절한 바이러스 또는 비 - 바이러스 수송 벡터에 의해 세포내로 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입함으로써 생체내 유전자 치료를 수행하였다. Hefti, 1994, Neurobiology 25 : 1418 - 35. 예를 들어, IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자는 표적 세포로의 수송을 위해 아테노 - 관련 바이러스(AAV) 벡터에 함유되어 있다(예를 들어, Johnson, PCT 공개 번호 제 WO95/34670 호 ; PCT 출원 번호 제 PCT/US95/07178 호를 참조하라). 재조합 AAV 게놈은 전형적으로 기능적 프로모터와 폴리아데닐화 서열에 실행가능하게 결합하는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열 플랭킹에 위치한 AAV 말단의 역반복 배열을 함유한다.
선택적으로 적당한 바이러스 벡터는 다음을 포함하지만 이것으로 한정하는 것은 아니다 : 레트로바이러스, 아테노바이러스, 단순 허피스바이러스, 렌티바이러스, 간염 바이러스, 파르보바이러스, 파보바바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스 및 유두종바이러스 벡터. 미국 특허 번호 제 5,672,344 호에는 재조합 신경영양성 HSV-1 벡터를 함유한 생체내 바이러스 - 매개 유전자 전이 시스템에 관해 기재되어 있다. 미국 특허 번호 제 5,399,346 호에는 치료용 단백질을 코드하는 DNA 세그먼트를 생체내로 삽입하여 치료한 인체 세포의 수송에 의해 치료용 단백질을 환자에게 제공하기 위한 과정의 예가 기재되어 있다. 유전자 치료 기술을 실행하기 위한 다른 방법 및 물질은 미국 특허 번호 제 5,631,236 호(아데노바이러스 벡터 함유), 제 5,672,510 호(레트로바이러스 벡터 포함), 제 5,635,399 호(시토킨을 발현하는 레트로바이러스 벡터 포함)에 기재되어 있다.
비바이러스 수송 방법으로는 다음을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다 : 리포솜 - 매개 전이, 막으로 쌓여 있지 않은 DNA 수송(직접적인 주사), 수용체 - 매개 전이(리간드 - DNA 복합체), 일렉트로포레이션,인산칼슘 침전법 및 미세입자 충격(예를 들어, 유전자 총). 유전자 치료 물질 및 방법은 또한 다음을 포함한다 : 유도 프로모터, 조직 - 특이적 증강제 - 프로모터, 부위 - 특이적 삽입되도록 지정된 DNA 서열, 모세포에 비해 선택적 이점을 제공할 수 있는 DNA 서열, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 표지, 음성 선별 시스템과 발현 제어 시스템(안정 측정법), 세포 - 특이적 결합제(세포 표적에 관해서), 세포 - 특이적 내면화 요소 및 벡터 제조 방법 뿐만 아니라 벡터에 의해 발현을 증가시키는 전사 요소. 유전자 치료 기술을 실행하기 위한 상기 다른 방법 및 물질은 하기의 특허 문헌에 기재되어 있다 : 미국 특허 번호 제 4,970,154 호(일렉트로포레이션 기술 포함), 제 5,679,559 호(유전자 수송을 위한 리포단백질 - 함유 시스템에 관해 기술되어 있음), 제 5,676,954 호(리포솜 담체 포함), 제 5,593,875 호(인산 칼슘 감염 방법에 관해 기술되어 있음) 및 제 4,945,050 호(생물학적 활성 입자가 일정 속도로 세포에 나아감으로써 그 입자가 세포 표면을 통과하여 세포 내부로 혼입되는 과정을 기술하고 있음) 및 PCT 공개 번호 제 WO96/40958 호(핵 리간드 포함).
IL-1ra-L 유전자 치료 또는 세포 치료에 동일하거나 상이한 세포에서 하나 또는 그이상의 다른 폴리펩티드의 수송이 포함됨을 생각할 수 있다. 상기 세포들을 각각 환자에게 삽입시킬 수 있으며, 이 세포는 상기에서 언급한 캡슐화 막과 같은 이식가능한 단일 장치에 함유되어 있거나 바이러스 벡터에 의해 각각 변형될 수 있다.
유전자 치료를 통하여 세포에서 내인성 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 증가시키는 방법은 IL-1ra-L 폴리펩티드 프로모터 내로 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소를 삽입시키는 것이고 여기에서, 인핸서 요소는 IL-1ra-L 유전자의 전사 활성을 증가시키는 역할을 한다. 사용되는 인핸서 요소는 조직을 기초로 하여 선택할 것이며 여기에서, 선택하려는 조직에서 프로모터에 활성을 부여하는 것으로 공지된 유전자 - 인핸서 요소가 활성화된다. 예를 들어, T-세포에서 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 "작동" 된다면, lck 프로모터 인핸서 요소를 사용할 것이다. 여기에, 첨가하려는 전사 요소의 기능적 부분을 표준 클로닝 기술을 사용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드 프로모터를 함유하는 DNA 단편내로 삽입하였다(선택적으로, 벡터 및/또는 5' 및/또는 3' 플랭킹 서열내로 삽입하였다). "상동성 재조합 구성물" 로 공지된 이러한 구성물을 생체외 또는 생체내에서 바람직한 세포내로 삽입할 수 있다.
유전자 치료는 또한 내인성 프로모터의 누클레오티드 서열을 변형시킴으로써 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 상기 변형은 전형적으로 상동성 재조합 방법을 통하여 이루어진다. 예를 들어, 비활성에 대하여 선택한 IL-1ra-L 유전자의 프로모터 전체 또는 일부를 함유한 DNA 분자는 전사를 조절하는 프로모터 조각을 제거하고/하거나 치환하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 프로모터의 전사 활성화 인자의 TATA 박스 및/또는 결합 부위를 결실시킬 수 있으며 ; 상기 결실은 프로모터 활성을 저해할 수 있으며 이로 인해 상응 IL-1ra-L 유전자의 전사를 나타낸다. IL-1ra-L 폴리펩티드 프로모터(제어하려는 IL-1ra-L 유전자와 동일하거나 관련 종으로부터) 전체 또는 관련 부분을 포함하는 DNA 구성물을 형성함으로써 프로모터에서 TATA 박스 또는 전사 활성화 인자 결합 부위의 결실이 이루어지며, 여기에서 TATA 박스 및/또는 전사 활성화 인자 결합 부위 누클레오티드 중 하나 또는 그이상은 하나 또는 그 이상의 누클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입을 통해 돌연변이된다. 결과적으로, TATA 박스 및/또는 활성화 인자 결합 부위는 활성도가 감소되거나 완전히 비활성화된다. 변형된 프로모터 세그먼트에 근접한 자생(내인성)의 5' 및 3' DNA 서열과 상응하는 DNA 의 약 500 개의 염기를 일반적으로 포함하는 이러한 구성물을 본원에 기재한 바이러스 벡터를 통하거나 직접적으로 적절한 세포내로 도입시킬 것이다. 일반적으로, 상동성 재조합을 통하여 세포의 게놈 DNA 내로 구성물을 삽입하였으며, 프로모터 구성물에서 5' 및 3' DNA 서열은 내인성 염색체 DNA 와의 혼성화를 통하여 변형된 프로모터 영역으로 삽입하는데 도움이 된다.
치료 용도
IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 그것의 작동물질과 길항물질은 본원에 인용되어 있는 것을 포함하여 다수의 질환, 장애 또는 증상을 치료, 진단, 개선 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
IL-1ra-L 폴리펩티드 작동물질 및 길항물질은 IL-1ra-L 폴리펩티드 활성을 제어하고 IL-1ra-L 폴리펩티드의 성숙 형태의 적어도 하나의 활성도를 증가시키거나 감소시키는 분자를 포함한다. 작동물질 또는 길항물질은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소분자량의 분자와 같은 보조 인자이며 이들은 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호작용하여 그것의 활성도를 제어한다. 잠재적 폴리펩티드 작동물질 또는 길항물질은 가용성이거나 막 - 결합 형태의 IL-1ra-L 폴리펩티드와 상호작용하는 항체를 포함하며 이 폴리펩티드는 상기 단백질의 세포외 도메인 일부 또는 전체를 포함한다. IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 제어하는 분자는 전형적으로 발현의 안티센스 제어 인자로서 작용하는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질은 면역계의 기능부전을 포함한 질환, 장애 또는 증상을 치료, 진단, 개선 또는 예방하는데 사용된다. 상기 질환의 예로는다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 염증성 관절염, 골관절염, 염증성 관절 질환, 자가면역 질환(자가면역 맥관염 포함), 다발성 경화증, 루프스, 당뇨병(예를 들어, 인슐린 당뇨병), 염증성 장 질환, 이식 거부, 대숙주성이식편 질환 및 과다운동, 염좌, 연골손상, 외상, 정형외과 수술, 감염 또는 그밖의 다른 질환 과정에 의한 염증성 증상. 면역계의 기능부전에 의해 영향을 받는 다른 질환들도 본 발명의 범주내에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 감염에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 나병, 바이러스 감염(예를 들어 간염이나 HIV), 박테리아 감염(예를 들어 클로스트리듐-관련 설사를 포함하는 클로스트리듐-관련 질환), 폐결핵, 급성 열병, 열병, 간의 급성기 반응, 패혈증 또는 패혈 쇼크를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 감염에 관련된 다른 질환들이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 체중장애에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 비만증, 식욕부진, 악액질(AIDS - 유도 악액질 포함), 근증(예를 들어 패혈증과 같은 근육단백질 대사), 저혈당증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 체중장애에 관련된 다른 질환들이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 신경원 기능부전에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 알츠하이머병, 파킨스병, 신경독성(예를 들어 HIV 에 의해 유도), ALS, 뇌손상, 스트레스, 우울증, 외상수용 및 그 외의 통증(암-관련 통증), 통각과민, 간질, 학습장애와 기억장애, 수면장애 및 말초 및 중추 신경독성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 신경계 장애는 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 폐에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 및 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 급성 또는 만성 폐손상(간질성 폐 질환 포함), 호흡장애증후군, 폐고혈압증, 폐기종, 낭포성 섬유증, 폐섬유증 및 천식을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 폐 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 피부에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 및 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 건선, 습진 및 창상치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 피부 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 신장에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 및 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 급성 및 만성 사구체신염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 신장 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 뼈에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 및 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 골다공증, 골화석증, 골형성부전증, 파젯병, 치주염, 측두골 악관절질환 및 고칼슘혈증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 뼈에 관련된 다른 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 혈관계에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 출혈 또는 발작, 출혈성 쇼크, 국소빈혈(심장허혈 및 대뇌허혈을 포함, 예를 들어 신경퇴화를 일으킬 수 있는 각각 외상, 간질, 출혈 또는 발작), 동맥경화, 울혈성심부전증, 재협착, 재관류 손상 및 혈관신생을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 혈관계 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 종양세포에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 림프종, 골육종, 만성 및 급성 골수성 백혈병(CML 및 AML)과 다른 백혈병, 다발성골수종, 폐암, 유방암, 종양 전이 및 방사선 치료에 의한 부작용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 종양 세포에 관련된 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 생식계에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 불임,유산, 조기분만과 분만 및 자궁내막증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생식계에 관련된 다른 질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 눈에 관련된 질병, 장애 또는 신체이상을 치료, 진단, 회복 또는 예방하는데에 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예는 염증성 눈병(예를 들어 각막 이식에 관련되었을 것임), 망막변성, 실명, 황반변성, 녹내장, 포도막염 및 망막신경병증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 눈질환이 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 본 발명의 IL-1ra-L 핵산 분자, 폴리펩티드 및 작동물질과 길항물질을 급성 췌장염, 만성피로 증후군, 섬유근통 및 가와사끼병(MLNS)과 같은 질병의 치료에 사용할 수 있다.
어떤 단백질을 포함하는 IL-1 저해제는 IL-1 로의 세포내 수용체의 활성을 특이적으로 저해할 수 있으며, 이는 많은 메카니즘의 결과일 것이다. 이러한 메카니즘은 다운 - 레귤레이션 IL-1 생산, 유리 IL-1 결합, 수용체에 결합한 IL-1 방해, IL-1 수용체 복합체 구성의 방해(즉, IL-1 수용체 보조 단백질과 IL-1 수용체의 결합) 및 수용체 결합 후 IL-1 신호의 변형을 방해함을 포함한다. 이러한 인터루킨-1 저해제는 다음을 포함한다 : 여기에서 기술한 바와 같이, IL-1ra-L 과 같은 인터루킨-1 수용체 길항물질, 항-IL-1 수용체 모노클로날 항체(예를 들어 유럽특허 번호 제 623674 호), 수용성 IL-1 수용체와 같은 IL-1 결합 단백질(예를 들어 미국특허 번호 제 5,492,888 호, 제 5,488,032 호, 제 5,464,937 호, 제 5,319,071 호 및 제 5,180,812 호), 항-IL-1 모노클로날 항체(예를 들어 PCT 공개 번호 제 WO 95/01997 호, 제 WO 94/02627 호, 제 WO 90/06371 호 ; 미국특허 번호 제 4,935,343 호 ; 및 유럽특허 번호 제 364778 호, 제 267611 호, 제 220063 호), IL-1 수용체 보조 단백질 및 항체(예를 들어 PCT 공개 번호 제 WO 96/23067 호) ; IL-1β 생산 및 분비의 저해에 사용될 수 있는 인터루킨-1β 전환 효소(ICE) 또는 카스파제 I 의 저해제, 인터루킨-1β 프로테아제 저해제 및 IL-1 의 생체내 합성 또는 세포외 방출을 저해하는 다른 화합물 및 단백질.
전형적인 IL-1 저해제가 미국특허 번호 제 5,747,444 호, 제 5,359,032 호, 제 5,608,035 호, 제 5,843,905 호, 제 5,359,032 호, 제 5,866,576 호, 제 5,869,660 호, 제 5,869,315 호, 제 5,872,095 호, 제 5,955,480 호, ; PCT 공개 번호 제 WO 98/21957 호, 제 WO 96/09323 호, 제 WO 91/17184 호, 제 WO 96/40907 호, 제 WO 98/32733 호, 제 WO 98/42325 호, 제 WO 98/44940 호, 제 WO 98/47892 호, 제 WO 98/56377 호, 제 WO 99/03837 호, 제 WO 99/06426 호, 제 WO 99/06042 호, 제 WO 91/17249 호, 제 WO98/32733 호, 제 WO 98/17661 호, 제 WO 97/08174 호, 제 WO 95/34326 호, 제 WO 99/36426 호 및 제 WO 99/36415 호 ; 유럽특허 번호 제 534978 호 및 제 894795 호 ; 및 프랑스특허 출원 제 FR 2762514 호 에 기술되어 있다.
인터루킨-1 수용체 길항물질(IL-1ra)은 천연의 인터루킨-1 저해제로서 작용하는 인체 단백질이다. 바람직한 수용체 길항물질(IL-1ra 및 변이체 및 그것의 유도체를 포함)뿐만 아니라 그것의 제조방법 및 사용방법이 미국특허 번호 제 5,075,222 호 ; PCT 공개 번호 제 WO 91/08285 호, 제 WO 91/17184 호, 제 WO 92/16221 호, 제 WO 93/21946 호, 제 WO 94/06457 호, 제 WO 94/21275 호, 제 WO 94/21235 호, 제 WO 94/20517 호, 제 WO 96/22793 호, 제 WO 97/28828 호 및 제 WO 99/36541 호 ; 오스트리아특허 번호 제 AU 9173636 호 ; 프랑스특허 제 FR 2706772 호 ; 및 독일특허 번호 제 DE 4219626 호에 기술되어 있다. 이러한 단백질은 비-글리코실화 IL-1 수용체 길항물질 뿐만 아니라 글리코실화 IL-1 수용체 길항물질도 포함한다.
특이적으로, 세가지의 전형적인 IL-1ra 구성 및 그것의 변이체가 제 5,075,222 호 특허에 발표되고 기술되었다. 이들 중 첫번째는 "IL-1i" 로 명명되며 pH 7.6 인 트리스 완충용액에 용해된 약 52 mM NaCl 로 MonoQ FPLC 컬럼에서 용출된 대략 4.8 의 등전점을 가지는 SDS-PAGE 상의22-23 kD 분자로서 특성화된다. 두번째 IL-1raβ 는 48 mM NaCl 로 MonoQ 컬럼에서 용출된 22-23 kD 단백질로서 특성화된다. IL-1raα 및 IL-1raβ 둘다 글리코실화되었다. 세번째 IL-1raχ 는 48 mM NaCl 로 MonoQ 컬럼에서 용출된 20 kD 단백질로서 특성화되었으며, 글리코실화되지 않았다. 미국특허 번호 제 5,075,222 호에서 저해제를 코드하는 유전자를 분리하여, 적절한 벡터 및 세포 유형의 유전자를 코드하고, 저해제를 생성하는 유전자를 발현시키는 방법이 발표되었다.
IL-1ra-L 의 아미노산 서열내에서 이루어지며, 생물학적 활성을 가지는 분자가 제공될 수 있는(예를 들어 여기에 열거된 것처럼 하나 또는 그 이상의 질병 및 장애에 영향을 미치는 활성을 유지한다), 결실, 삽입 및 치환의 많은 조합(각각 혹은 총괄하여 "변이체" 라 함)이 본 분야의 숙련자들에 의해 인식될 것이다.
본 발명에 의해 예상된 바로는, IL-1ra-L 폴리펩티드는 다른 치료에 보조약으로서 투여될 것이며 또한 치료에 적용하기에 적절한 다른 약학적 조성물과 함께 치료될 것이다. IL-1ra-L 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 부가적인 치료 또는 약학적 제제형중 어떤 것을 개별적으로, 연속하여 또는 동시에 투여될 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 여기에 열거된 질병 및 장애의 치료 또는 예방용 하나 또는 그 이상의 TNF 저해제중 어떤 것과의 조합(전-치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다.
이러한 TNF 저해제는 TNF 의 생체내 합성 또는 세포외 방출을 저해하는 화합물 및 단백질을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하기의 하나 또는 그 이상의 TNF 저해제중 어떤 것과의 조합(전-치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다 : TNF 결합 단백질[수용성 TNF 수용체 제 1 형 및 TNF 수용체 제 2 형("sTNFRs"), 여기에 기술된 바와 같음], 항-TNF 항체, 과립구 콜로니 자극인자, 살리도마이드, BN 50730, 테니뎁, E5531, 티아파판트 PCA 4248, 니메술리드, 파나비르, 로리프램, RP 73401, 펩티드 T, MDL 201, 449A, (1R, 3S)-시스-1-[9-(2, 6 - 디아미노푸리닐)]-3-히드록시-4-시클로펜텐 하이드로클로라이드, (1R, 3R)-트랜스-1-[9-(2, 6-디아미노)퓨린]-3-아세톡시시클로펜탄, (1R, 3R)-트랜스-1-(9-(아데닐)-3-아지도시클로펜탄 하이드로클로라이드 및 (1R, 3R)-트랜스-1-(6-히드록시-퓨린-9-일)-3-아지도시클로-펜탄. TNF 결합 단백질은 본 분야에 발표되어 있다(미국특허 번호 제 5,136,021 호 ; 유럽특허 번호 제 308378 호, 제 422339 호, 제 393438 호, 제 398327 호, 제 412486 호, 제 418014 호, 제 433900 호, 제 464533 호, 제 512528 호, 제526905 호, 제 568928 호, 제 417563 호, ; PCT 공개 번호 제 WO 90/13575 호, 제 WO 91/03553 호, 제 WO 92/01002 호, 제 WO 92/13095 호, 제 WO 92/16221 호, 제 WO 93/07863 호, 제 WO 93/21946 호, 제 WO 93/19777 호, 제 WO 94/06476 호, PCT 출원 번호 제 PCT/US97/12244 호 ; 영국특허 번호 제 GB 2218101 호 및 제 2246569 호 ; 및 일본특허 출원 번호 제 JP 127,800/1991 호).
예를 들어 유럽특허 번호 제 393438 호 및 제 422339 호에서 총괄하여 "sTNFRs" 라 명명된, 수용성 TNF 수용체 제 1 형(또한 "sTNFR-I" 또는 "30kDa TNF 저해제" 로 알려짐) 및 수용성 TNF 수용체 제 2 형(또한 "sTNFR-Ⅱ" 또는 "40 kDa TNF 저해제" 로 알려짐)의 아미노산 및 핵산 서열 뿐만 아니라 그것의 변형된 형태(단편, 기능성 유도체 및 변이체)가 나타나있다. 유럽특허 번호 제 393438 호 및 제 422339 호에서 또한 저해제를 코드하는 유전자의 분리, 적절한 벡터 및 세포 유형 유전자의 클로닝 및 저해제를 생산하는 유전자의 발현 방법이 발표되었다. 게다가, sTNFR-I 및 sTNFR-Ⅱ 의 다가체(즉, 하나의 활성 반분 이상을 포함하는 분자) 또한 발표되었다. 어떤 실시형태에서, 다가체는 적어도 하나의 TNF 저해제 및 임상학적으로 용인가능한 링커, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PCT 공개 번호 제 WO 92/16221 호 및 제 WO 95/34326 호)를 가지는 다른 일부분의 화학적 결합에 의해 구성될 것이며, 펩티드링커(Neve 등의 1996, Cytokine, 8 : 365-70)에 의한 비오틴의 화학적 결합 후 아비딘을 결합시키고(PCT 공개 번호 제 WO 91/03553 호) 최종적으로 키메라 항체 분자(미국특허 번호 제 5,116,964 호 ; PCT 공개 번호 제 WO 89/09622 호 및 제 WO 91/16437 호 ; 및 유럽특허 번호 제 315062 호)에 결합시켜 구성될 것이다.
항-TNF 항체는 MAK 195F Fab 항체 (Holler 등의 1993, 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation 147), CDP 571 항-TNF 모노클로날 항체 (Rankin 등의 1995, Br. J. Rheumatol., 34 : 334 - 42), BAY X 1351 쥐 항-종양 괴사인자 모노클로날 항체(Kieft 등의 1995, 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 9) ; CenTNF cA2 항-종양 모노클로날 항체(Elliott 등의 1994, Lancet, 344 : 1125 - 27 ; Elliott 등의 1994, Lancet, 344 : 1105 - 10)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 분비되거나 수용성인 인체 fas 항원 또는 그것의 재조합 변형(PCT 공개 번호 제 WO 96/20206 호 ; Mountz 등의 1995, J. Jmmunol., 155 : 4829 - 37 ; 및 유럽특허 번호 제 510691 호)과의 조합에서 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. PCT 공개 번호 제 WO 96/20206 호에 분비되는 인체 fas 항원(Ig 융합 단백질을 포함하는 천연 및 재조합), 수용성 재조합 인체 fas 항원을 코드하는 유전자를 분리하는 방법, 적절한 벡터 및 세포 유형의 유전자를 클로닝하는 방법 및 저해제를 생산하는 유전자를 발현하는 방법이 발표되어 있다. 유럽특허 번호 제 510691 호에 인체 fas 항원을 코드하는 핵산, 수용성 fas 항원, 상기 핵산을 발현시키는 벡터 및 벡터가 감염된 형질전환체 나타나있다. 비경구적으로 투여했을 때, 분비 또는 수용성 fas 항체 융합 단백질의 투여량은 각각 일반적으로 약 1㎍/㎏ 내지 약 100 ㎍/㎏ 이다.
류마티스 질환과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 여기에 언급된 질환 및 장애의 현재 치료는 보통 통증 및 염증의 제어를 위한 제 1 선 약물의 사용을 포함한다 ; 이 약물은 비-스테로이드성, 항-염증 약물(NSAID)로 분류된다. 두번째 치료는 코스티코스테론, 낮은 활성의 항류마티스성 약물(SAARD) 또는 질환 변형(DM) 약물을 포함한다. 하기 화합물에 관한 정보는 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(16 판, 1992 년) 및 Pharmaprojects(피제이비 퍼블리케이션스 리미티드)에서 찾을 수 있다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 류마티스 질환 및 대숙주성이식편병과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 여기에 언급된 질병 및 장애의 치료에서 하나 또는 그 이상의 NSAID 중 어떤 것과 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. NSAID 는 프로스타글란딘 합성을 저해하는, 적어도 일부분인, 항-염증 작용을 한다[Goodman 및 Gilman 의, The Pharmacological Basis of Therapeutics(7판, 1985 년)]. NSAID 는 적어도 9 개의 그룹으로 특성화할 수 있다 ; (1) 살리실산 유도체, (2) 프로피온산 유도체, (3) 아세트산 유도체, (4) 페남산 유도체, (5) 카르복시산 유도체, (6) 부티르산 유도체, (7) 옥시캄, (8) 피라졸 및 (9) 피라졸론.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 살리실산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 이러한 살리실산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 아세트아미노살롤, 알록시프린, 아스피린, 베놀, 브로모살리제닌, 아세틸살리실산 칼슘, 트리살리실산 마그네슘 콜린, 살리실산 마그네슘, 살리실산 콜린, 디플루시날, 에테르살레이트, 펜도잘, 겐티스산, 살리실산 글리콜, 살리실산 이미다졸, 아세틸살리실산 리신, 메살라민, 살리실산 모르폴린, 1-나프틸 살리실레이트, 올살라진, 파살미드, 아세틸살리실산 페닐, 살리실산 페닐, 살아세트아미드, 살리실아미드 O-아세트산, 살사레이트, 살리실산 나트륨 및 술파살라진. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 살리실산 유도체가 또한 이 그룹에 의해 포함됨을 의미한다.
부가적인 특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 프로피온산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 프로피온산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 알미노프로펜, 베녹사프로펜, 부클록시산, 카프로펜, 덱신도프로펜, 페노프로펜, 플루녹사프로펜, 플루프로펜, 플루르비프로펜, 푸클로프로펜, 이부프로펜, 알루미늄 이부프로펜, 이부프록삼, 인도프로펜, 아이소프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜, 미로프로펜, 나프록센, 나트륨 나프록센, 옥사프로진, 피케토프로펜, 피메프로펜, 피르프로펜, 프라노프로펜, 프로티진산, 피리독시프로펜, 수프로펜, 티아프로펜산 및 티옥사프로펜. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 프로피온산 유도체가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아세트산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 아세트산 유도체, 약물전구체 에스테르및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 아세메타신, 알클로페낙, 암페낙, 부펙사막, 신메타신, 클로피락, 델메타신, 디클로페낙 칼륨, 디클로페낙 나트륨, 에토도락, 펠비낙, 펜클로페낙, 펜클로락, 펜클로산, 펜티아작, 푸로페낙, 글루카메타신, 이부페낙, 인도메타신, 아이소페졸락, 아이소세팍, 로나졸락, 메티아, 옥사메타신, 옥스피낙, 피메타신, 프로글루메타신, 술린닥, 탈메타신, 티아라미드, 티오피낙, 톨메틴, 톨메틴 나트륨, 지도메타신 및 조메피락. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 아세트산 유도체가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 페남산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 페남산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 엔페남산, 에토페나메이트, 플루페남산, 아이소닉신, 메클로페남산, 메클로페나메이트 나트륨, 메도페남산, 메페남산, 니플룸산, 탈니플루메이트, 테로페나메이트, 톨페남산 및 우페나메이트. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 페남산 유도체가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
부가적인 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 카르복시산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 카르복시산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 클리다낙, 디플루니살, 플루페니살, 이노리딘, 케토롤락 및 티노리딘. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 카르복시산 유도체가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 부티르산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 부티르산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 부마디존, 부티부펜, 펜부펜, 및 젠부신. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 부티르산 유도체가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 옥시캄, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의용도를 나타낸다. 옥시캄, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 드록시캄, 에놀리캄, 아이소시캄, 피록시캄, 수독시캄, 테녹시캄 및 4-히드록실-1,2-벤조티아진 1,1-디옥시드 4-(N-페닐)-카르복스아미드. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 옥시캄이 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 사용할 수 있는 피라졸, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 디페나미졸 및 에피리졸. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 피라졸이 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸론, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 사용할 수 있는 피라졸론, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 아파존, 아자프로파존, 벤즈피페릴온, 페프라존, 모페부타존, 모라존, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피페부존, 프로필페나존, 라미페나존, 숙시부존 및 티아졸리노부타존. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 피라졸론이 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 하나 또는 그 이상의 어떤 것과의 조합(전치료, 후치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다 ; NSAID ; ε-아세트아미도카프로산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-하이드록시부티르산, 아미센트린, 아니트라자펜, 안트라페닌, 벤다작, 벤다작 리시네이트, 벤지드아민, 베프로린, 브로페라몰, 부콜롬, 부페졸락, 시프로퀴아존, 클록시메이트, 다지다민, 데복사메트, 데토미딘, 디펜피아미드, 디펜피르아미드, 디피살아민, 디타졸, 에모르파존, 파네티졸, 메실레이트, 펜플루미졸, 플로크타페닌, 플루미졸, 플루닉신, 플루프로퀴아존, 포피르톨린, 포스포잘, 구아이메잘, 구아이아졸렌, 아이소니지른, 레페타민 HCl, 레플루노미드, 로페미졸, 로티파촐, 리신 클로닉시네이트, 네세클라존, 나부에톤, 니크틴돌, 니메술리드, 오르고테인, 오르파녹신, 옥사세프롤, 옥사파돌, 파라닐린, 페리소잘, 페리소잘 시트레이트, 피폭심, 피프로젠, 피라졸락, 피르페니돈, 프로퀴아존, 프록사졸, 티엘라빈 B, 티메가딘, 톨렉틴, 톨파돌, 트립타미드이며 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508,F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPA510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901(4-벤조일-1-인단카르복시산), TVX2706, U60257, UR2301 및 WY41770 과 같은 회사 코드 번호로 나타난다. NSAID 와 유사한 진통성 및 항-경련성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 NSAID 가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 여기에 언급된 류마티스 질환, 대숙주성이식편병 및 다발성 경화증과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는 질환 및 장애의 치료용 하나 또는 그 이상의 코르티코스테로이드, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 코스티코스테로이드, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 하이드로코르티손 및 다음과 같은 하이드로코르티손에서 유도된 화합물을 포함한다 ; 21-에세트옥시프레그네놀론, 알클로메라손, 알제스톤, 암시노니드, 베클로프레드니손, 베타메타손, 베타메타손 발레레이트, 부데소니드, 클로로프레드니손, 클로베타솔, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로베타손, 클로베타손 부티레이트, 클로코르톨온, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자콘, 데조니드, 데소시메라손, 덱사메타손, 디플로라손, 디플루코르톨온, 디플루프레드네이트, 엔옥솔온, 플루아자코트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루메타손 피발레이트, 플루시놀온 아세토니드, 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루오로시놀온 아세토니드, 플루오코르틴 부틸, 플루오코르톨온, 플루오르톨온 헥사노에이트, 디플루코르톨온 발레레이트, 플루오로메톨온, 플루페로온 아세테이트, 플루프레드니덴 아세테이트, 플루프레드니솔온, 플루란데놀리드, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로메타손, 할로프레드온 아세테이트, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 부틸레이트, 히드로코르티손 포스페이트, 히드로코르티손 21-나트륨 숙시네이트, 히드로코르티손 테부테이트, 마지프레드온, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔온, 모메타손 프로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔온, 프레드니솔온 21-디에드리아미노아세테이트, 프레드니솔온 나트륨 포스페이트, 프레드니솔온 나트륨 숙시네이트, 프레드니솔온 나트륨 21-m-술포벤조에이트, 프레드니솔온 나트륨 21-스테아로글리콜레이트, 프레드니솔온 테부테이트, 프레드니솔온 21-트리메틸아세테이트, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 프레드닐리덴 21-디에틸아미노아세테이트, 틱소코르톨, 트리암시놀온, 트리암시놀온 아세토니드, 트리암시놀온 베네토니드 및 트리암시놀온 헥스아세토니드. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 코르티코스테로이드가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 여기에 언급된 류마티스 질환, 대숙주성이식편병 및 다발성 경화증과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는 질환 및 장애의 치료용 하나 또는 그 이상의 느린-활성 항류마티스성 약물(SAARD) 또는 질환 변형 항류마티스성 약물(DMARD), 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. SAARD 또는 DMARD, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 ; 알로쿠프레이드 나트륨, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아우로티오글리카니드, 아자티오프린, 브레퀴나르 나트륨, 부실아민, 칼슘 3-아우로티오-2-프로판올-1-술포네이트, 클로르암부실, 클로로퀸, 클로부자리트, 쿠프르옥솔린, 시클로포스프아미드, 시클로스포린, 다프손, 15-데옥시스페르구아린, 디아세레인, 글루코스아민, 금염(예를 들어, 시클로퀸 금염, 티오말레산 나트륨 금, 티오황산 나트륨 금), 히드록시클로로퀸, 황산 히드록시클로로퀸, 히드록시우레아, 케부존, 레바미졸, 로벤즈아리트, 멜리틴, 6-메르카프토퓨린, 메토트렉사트, 미조리빈, 미코페놀레이트 모페틸, 미오랄, 머스타드 질소, D-페니실아민, SKNF 86002 및 SB203580 과 같은 피리디놀 이미다졸, 라파마이신, 티올, 티모포이에틴 및 빈크리스틴. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 SAARD 또는 DMARD 가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 여기에서 언급한 급성 및 만성 염증을 포함하는 질병 및 장애의 치료용 하나 또는 그 이상의 COX2 저해제, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. COX2 저해제, 약물전구체 에스테르 및 그것의 약학적으로 용인가능한 염의 예는, 셀레콕시브를 포함한다. 유사한 진통성 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 COX2 저해제가 또한 이 그룹에 포함됨을 의미한다.
다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 여기에서 언급한 급성 및 만성 염증을 포함하는 질병 및 장애의 치료용 하나 또는 그 이상의 항균제, 약물전구체 에스테르 또는 그것의 약학적으로 용인가능한 염중 어떤 것과의 조합(전치료, 후-치료 또는 동시치료)에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 용도를 나타낸다. 항균제는 예를 들어, 페니실린, 세팔로스포린 및 다른 베타-락탐, 아미노글리코시드, 아졸, 퀴놀론, 마크로리드, 리파마이신, 테트라사이클린, 술폰아미드, 린코사미드 및 폴리믹신의 광범주한 부류를 포함한다. 페니실린은 다음을 포함하며, 이에 한정되지 않는다 ; 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 암피실린, 암피실린/술박탐, 아목시실린, 아목시실린/클라불라네이트, 헤타실린, 시클로실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 카르베니실린 인다닐, 티카르실린, 티카르실린/클라불라네이트, 아즐로실린, 메즐로실린, 페페라실린 및 메실리남. 세팔로스포린과 다른 베타-락탐은 다음을 포함하며, 이에 한정되지 않는다 ; 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세프라딘, 세파졸린, 세파드록실, 세파클로르, 세파만돌, 세포테탄, 세폭시틴, 세루록심, 세포니시드, 세포라딘, 세픽심, 세포탁심, 모살락탐, 세프티조심, 세트리아손, 세포페라존, 세프트아지딤, 이미페넴 및 아즈트레오남. 아미노글리코시드는 다음을 포함하며, 이에 한정되지 않는다 ; 스트렙토마이신, 젠타미신, 토브라마이신, 아미카신, 네틸미신, 카나마이신 및 네오마이신. 아졸은 플루코나졸을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 퀴놀론은 다음을 포함하며, 이에 한정되지 않는다 ; 날리딕스산, 노르플록사신, 에녹사신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신 및 테마플록사신. 마크로리드는 에리토마이신, 스피라마이신 및 아지트로마이신을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 리파마이신은 리팜핀을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 테트라사이클린은 다음을 포함하며, 이에 한정되지 않는다 ; 스피사이클린, 클로르테트라사이클린, 데모사이클린, 데옥시사이클린, 구아메사이클린, 리메사이클린, 메클로사이클린, 메타시이클린, 미모사이클린, 옥시테트라사이클린, 페니메피사이클린, 피파사이클린, 롤리테트라사이클린, 산사이클린, 세노시클린 및 테트라사이클린. 술폰아미드는 술파닐아미드, 술파메톡스아졸, 술프아세트아미드, 술파디아진, 술프아이속아졸 및 공-트리목아졸(트리메톡스아졸/술파메톡스아졸)을 포함하며,이에 한정되지 않는다. 린코사미드는 클린다마이신 및 린코마이신을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 폴리믹신(폴리펩티드)는 폴리믹신 B 및 콜리스틴을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
IL-1ra-L 폴리펩티드의 작동물질 및 길항물질의 기능은 치료 상황에 적절한 하나 또는 그 이상의 사이토킨, 성장인자, 항생물질, 항-염증제 및/또는 화학요법제와의 조합에(동시에 또는 연속적으로) 사용될 것이다.
하나 또는 그 이상의 IL-1, IL-1ra 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 바람직하지 않은 수준 때문에 발생하거나 매개된 다른 질병이 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직하지 않은 수준은 IL-1, IL-1ra 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 과도한 수준 및 IL-1, IL-1ra 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 표준 이하의 수준을 말한다.
IL-1ra-L 핵산 및 폴리펩티드의 용도
본 발명의 핵산 분자(스스로 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코드할 수 없는 분자를 포함)가 염색체상의 IL-1ra-L 유전자 및 관련 유전자의 위치를 맵핑하는데 이용될 것이다. 맵핑은 PCR 증폭 및 원위치 혼성화와 같은 본 분야에 공지된 기술로 이루어질 것이다.
IL-1ra-L 핵산 분자(스스로 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코드할 수 없는 분자를 포함)는 포유동물의 조직이나 체액 시료내의 IL-1ra-L 핵산 분자의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 시험하기 위한 진단 검정시 혼성화 프로브로 유용할 것이다.
또한 하나 또는 그 이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 활성을 저해하는데에 바람직한 다른 방법이 사용될 것이다. 이러한 저해는 조절 서열(삼중 헬릭스 구성)의 발현 또는 IL-1ra-L mRNA 에 상보적이며 혼성화되는 핵산 분자에 의해 이루어질 것이다. 예를 들어, IL-1ra-L 유전자의 적어도 일부분과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 DNA 또는 RNA 가 세포에서 유도될 수 있다. 안티센스 프로브는 여기에 언급된 IL-1ra-L 의 서열을 사용한 적절한 기술에 의해 나타날 것이다. 일반적으로 각각의 안티센스 분자는 각각 선별된 IL-1ra-L 유전자의 시작 부위(5' 말단)에 상보적인 것이다. 그 다음에 안티센스 분자가 상응하는 IL-1ra-L mRAN 에 혼성화될 때, mRNA 의 번역이 이루어지지 않거나 감소한다. 안티센스 저해제는 세포나 조직의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 감소나 결여에 관련된 정보를 제공한다.
대안적으로, 유전자 치료는 하나 또는 그 이상의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 우성-음성 저해제를 생성하여 사용할 것이다. 이러한 경우에,각각 선택된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 돌연변이 폴리펩티드를 코드하는 DNA 가 여기에 기술된 바와 같이 바이러스성 또는 비-바이러스성 방법으로 환자의 세포에서 준비되고 유도될 수 있다. 이러한 각각의 돌연변이가 그것의 생물학적 규칙으로 내생 폴리펩티드에 필적하여 나타난다.
게다가, 생물학적으로 활성이든 아니든지 간에, IL-1ra-L 폴리펩티드가 면역원으로 사용될 것이며, 이것은 항체를 일으키는 적어도 하나의 에피토프를 가지는 폴리펩티드이다. IL-1ra-L 폴리펩티드(여기에 기술됨)에 결합하는 선택적 결합제는 체액이나 세포 시료내의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 존재를 검출하는 표지된 형태로의 용도를 포함하는 시험관내 및 생체내생체내시험관내이용되며, 이에 한정하지 않는다.
항체는 또한 여기에 언급된 질병 및 장애를 포함하는 많은 질병 및 장애의 예방, 치료 또는 진단에 이용될 것이다. 항체는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성 특성이 감소하거나 봉쇄되도록 IL-1ra-L 폴리펩티드에 결합하거나 IL-1ra-L 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성 특성이 증가하도록(IL-1ra-L 폴리펩티드의 약동력학의 증가를 포함함) 결합할 것이다.
본 발명의 IL-1ra-L 폴리펩티드는 발현 클로닝 전략을 사용하여 클론 IL-1ra-L 폴리펩티드에 사용할 수 있다. 방사선표지된(125I) IL-1ra-L 폴리펩티드나 친화성/활성-표지된 IL-1ra-L 폴리펩티드(Fc 융합 또는 염화칼륨 융합과 같은)를 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체를 발현하는 세포 유형이나 세포주 또는 조직을 확인하기 위한 결합 검정에 사용할 수 있다. 이러한 세포나 조직에서 분리된 RNA 를 cDNA 로 변환시키고, 포유동물의 발현 벡터로 클론화하여 발현 라이브러리를 생성하기 위해 포유동물 세포(COS나 293 세포와 같은)에 감염시킬 수 있다. 그런 다음 방사선표지되거나 표식된 IL-1ra-L 폴리펩티드를 세포 표면의 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체를 발현할 수 있는 세포의 아집단의 라이브러리를 확인하고 분리하기 위한 친화성 리간드로서 사용할 수 있다. 그런 다음 이 세포로부터 DNA 를 분리하였으며 최초 라이브러리에서보다 많이 접히는 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체를 발현하는 세포 단편에서의 두 번째 발현 라이브러리를 생성하기 위해 포유동물 세포로 감염시켰다. 이 강화 과정을 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체를 포함하는 단일 재조합 클론을 분리할 때까지 반복하여 되풀이하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체의 분리는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 신호 경로의 확인하거나 발현하는 향상된 신규한 작동물질 및 길항물질에 유용하다. 이러한 작동물질 및 길항물질은 수용성 IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체, 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 수용체항체, 소분자 또는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함하여, 여기에 기술된 하나 또는 그 이상의 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 진단하는데 이용된다.
pGEM-T 로 서브클론되었으며 E. coli 균주 DH10B 로 감염시킨, 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 cDNA 를 미국 버지니아 20110 - 2209 메나사스 10801 유니버시티 불레바드에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 2000 년 1 월 20 일에 기탁 번호 제 PTA-1215 호로 기탁하였다.
다음의 실시예는 오직 설명을 목적으로 하며, 어떤식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 : 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드 유전자의 클로닝
일반적으로, Sambrook 등의 문헌에 기술된 물질과 방법을 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 클론화하고 분석하는데 사용하였다.
인체 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 분리하기 위해, 인간 게놈 데이타베이스의 상동성-기저 BLAST 탐색을 실행하였다.이러한 방법으로 확인된 477 bp 서열(GA_9383287_422_240)이 인체 IL-1ra 와 서열 상동성을 공유함을 발견하였다. 이 서열을 다양한 PCR 전략을 이용하여 cDNA 원천의 상동성 증명 및 cDNA 의 클론의 생성시에 유전자에 특이적인 올리고누클레오티드를 나타내는데에 사용한다.
많은 cDNA 라이브러리를 10 ng 의 cDNA 라이브러리 주형 DNA, 암플리머(amplimer) 2362 - 94(5'-C-A-T-G-G-A-C-C-T-G-T-A-T-G-T-G-G-A-G-A-A-G-A-3' ; SEQ ID NO : 9) 및 2362 - 95(5'-G-C-C-A-G-G-G-T-A-A-G-A-G-A-C-T-G-A-C-T-G-A-A-3' ; SEQ ID NO : 10) 각각 5 pmol 및 래디-투-고 PCR 비드(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 아메르삼-파마시아 ; 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아에서 입수)를 포함하는 증폭 반응에서 분석하였으며, 총 반응 부피는 25 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 5 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 95 ℃ 에서 15 초, 68 ℃ 에서 15 초 및 72 ℃ 에서 1 분 동안 29 사이클에서 실행하였다 ; 72 ℃ 에서 10 분 동안 한 사이클에서 실행하였으며 95 ℃ 에서 15 초, 68 ℃ 에서 15 초 및 72 ℃ 에서 1 분 동안 10 사이클에서 실행하였다. 예상하는 크기(100 bp)의 PCR 산물이 림프종 세포주(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 신장(올리고-dt 및 무작위 개시), 성인 T-세포(올리고-dt 개시), 유방암종(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 폐(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 눈(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 두피(올리고-dt 및 무작위 개시)에서 유도된 라이브러리를 포함하는, 많은 cDNA 라이브러리와 동일하였다. 태아의 두피 cDNA 라이브러리를 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 전장 cDNA 서열을 분리하는 위한 추가 증폭 실험을 위해 선별하였다.
태아의 두피 cDNA 라이브러리를 다음과 같이 제조하였다. 표준 RNA 추출 방법을 사용하여 인간 태아의 두피에서 전체 RNA 를 추출하였으며 폴리-A+RNA 를 표준 방법을 사용하여 전체 RNA 에서 선별하였다. 상기 폴리-A+에서 무작위 개시 또는 올리고-dt 개시 cDNA 를 합성하였다. 제작자의 지침서 또는 다른 적절한 실험순서에 따라, cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝 키트(기브코-비알엘에서 입수)로 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(Superscript Plasmid System)을 사용하여 폴리-A+RNA 에서 합성하였다. 합성된 cDNA 를 적절한 제한 효소로 절단한 후 pSPORT-1(캘리포니아 칼스바드에 소재하는 인비트로겐에서 입수) 또는 다른 적절한 클로닝 벡터에 결합시켰다. 결합시킨 산물을 표준 방법을 사용하여 E. coli 에 형질전환시켰으며, 박테리아 형질전환체를 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜 중 어느 하나를 함유하는 배지에 배양하였다. cDNA 라이브러리가 이 형질전환체 모두 또는 일부분으로 구성되었다.
5'-RACE 및 3'RACE 반응 둘다를 IL-1ra-L 폴리펩티드에서 전장 cDNA 서열을 생성하기 위해 실행하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드에서 cDNA 서열의 5' 말단에 상응하는 cDNA 서열을 분리하기위해, pSPORT1 상의 무작위-개시된 인간 태아 두피 cDNA 라이브러리 10 ng, 프라이머 870-02(5'-A-G-C-G-G-A-T-A-A-C-A-A-T-T-T-C-A-C-A-C-A-G-G-3' ; SEQ ID NO : 11) 및 2366-21(5'-G-C-C-T-A-G-G-C-T-G-G-A-T-T-T-A-T-T-C-C-A-C-A-G-3' : SEQ ID NO : 12) 각각 5 pmol 을 사용하여 5'RACE 를 실행하였으며, 총 반응 부피는 25 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 1 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 80 ℃ 에서 0.5 ㎕ 어드벤테이지 cDNA 혼합물(클론텍에서 입수)을 첨가해 유지시켰다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 64 ℃ 에서 5 초 및 68 ℃ 에서 3 분 동안 35 사이클에서 실행하였다 ; 68 ℃ 에서 3 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 네스트 PCR(Nested PCR)을 5'RACE 증폭 산물(1/50 으로 희석) 10 μl 및 프라이머 1019-06(5'-G-C-T-C-T-A-A-T-A-C-G-A-C-TC-A-C-T-A-T-A-G-G-G-3' ; SEQ ID NO : 13) 및 2362-98(5'-C-T-G-A-T-G-T-G-G-T-G-G-A-GG-T-G-G-C-TA-T-3' ; SEQ ID NO : 14)를 사용하여 실행하였으며, 총 반응 부피는 100 ㎕ 이다. 네스트 PCR 반응을 95 ℃ 에서 1 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 80 ℃ 에서 어드벤테이지 cDNA 중합효소 혼합물을 첨가해 유지시켰다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 64 ℃ 에서 5 초 및 68 ℃ 에서 3 분 동안 25 사이클에서 실행하였다 ; 68 ℃ 에서 3 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 다음의 네스트 PCR 에서 수득한 증폭 산물을 분리하여직접적으로 서열결정하였다.
IL-1ra-L 폴리펩티드에서의 cDNA 서열의 3' 말단에 상응하는 cDNA 서열을 분리하기 위해, 3' RACE 를 pSPORT1 내의 올리고-dt 개시된 인간 태아 두피 cDNA 라이브러리 10 ng 및 프라이머 1340-35(5'-C-C-C-A-G-T-C-A-C-G-A-C-G-T-T-G-T-A-A-A-A-C-G-3' ; SEQ ID NO : 15) 및 2362-94 를 사용하여 실행하였으며, 총 반응 부피는 25 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 1 분간 한 사이클에서 실행하였다 ; 80 ℃ 에서 어드벤테이지 cDNA 중합효소 혼합물을 첨가하여 유지시켰다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 64 ℃ 에서 5 초 및 68 ℃ 에서 3 분간 35 사이클에서 수행하였다 ; 68 ℃ 에서 3 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 네스트 PCR 을 3'RACE 증폭 산물(1/50 으로 희석) 10 ㎕ 및 프라이머 1019-05(5'-T-G-A-A-T-T-T-A-G-G-T-G-A-C-A-C-T-A-T-A-G-A-A-G-A-G-3 ; SEQ ID NO : 16) 및 2362-94 를 사용하여 실행하였으며, 총 반응 부피는 100 ㎕ 이다. 네스트 PCR 반응을 95 ℃ 에서 1 분간 한 사이클에서 실행하였다 ; 80 ℃ 에서 어드벤테이지 cDNA 중합효소 혼합물(클론텍에서 입수)을 0.5 ㎕ 첨가하여 유지시켰다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 64 ℃ 에서 5 초 및 68 ℃ 에서 3 분 동안 25 사이클에서 실행하였다 ; 68 ℃ 에서 3 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 다음의 네스트 PCR 에서 수득한 증폭 산물을 분리하여 직접적으로 서열결정하였다.
IL-1ra-L 유전자에서 전장 전사 해독 프레임을 포함함을 나타내는 연속 서열의 5' 및 3' RACE 에 의해 서열을 생성하였다. IL-1ra-L 에서의 전장 cDNA 서열을 5' 및 3' RACE 에 의해 결정된 IL-1ra-L 의 5' 및 3' 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭으로 분리시켰다. PCR 을 올리고-dt 개시된 인간 태아 두피 cDNA 라이브러리 100 ng 및 암플리머 2379-15(5'-G-T-C-C-T-C-C-A-G-A-G-C-C-T-C-A-A-G-A-G-A-T-C-3' ; SEQ ID NO : 17) 및 2375-10(5'-T-T-A-G-G-A-T-T-A-G-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-A-A-A-C-C-3' ; SEQ ID NO : 18) 각각 10 pmole 을 사용하여 실행하였으며, 총 반응 부피는 50 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 1 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 80 ℃ 에서 어드벤테이지 cDNA 중합효소 혼합물 1 ㎕ 를 첨가하여 유지하였다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 68 ℃ 에서 3 분 동안 5 사이클에서 실행하였다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 66 ℃ 에서 5 초 및 66 ℃ 에서 3 분 동안 25 사이클에서 실행하였다. 이러한 방법으로 생산한 PCR 산물을 분리하고 클론화하여 서열결정하였다.
인체 IL-1ra-L 폴리펩티드에서의 예상된 cDNA 서열의 서열 분석은 157 아미노산 단백질을 코딩하는 471 bp 의 전사 해독 프레임(도 1A - 1B)을 포함하는 유전자를 나타낸다. 도 2 는 인체 IL-1δ(IL-1_데이타 ; SEQ ID NO : 3), 인체 IL-1ra-L 폴리펩티드(IL-1ra-L ; SEQ ID NO : 2), 인체 IL-1ε(IL-1_엡실론 ; SEQ ID NO : 4), 인체 IL-1 수용체 길항물질, 선별한 폴리펩티드(IL-1ra_sec ; SEQ ID NO : 9) 인체 IL-1β(IL-1_베타 ; SEQ ID NO : 6) 및 칸센서스 서열(칸센서스)의 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
실시예 2 : IL-1ra-L mRNA 의 발현
PCR 분석을 다양한 cDNA 라이브러리에서 IL-1ra-L mRNA 발현을 검사하기 위해 사용하였다. 일련의 증폭에서, 반응은 cDNA 라이브러리 주형 DNA 10 ng, 암플리머 2362-94 및 2362-98 각각 5 pmol 및 레디-투-고 PCR 비드를 포함하며, 총 반응 부피는 25 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 5 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 95 ℃ 에서 15 초, 68 ℃ 에서 15 초 및 72 ℃ 에서 1 분 동안 29 사이클에서 실행하였다 ; 72 ℃ 에서 10 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 예상 크기(100 bp)의 PCR 산물이 하기에서 유도된 라이브러리를 포함하는 많은 cDNA 라이브러리와 동일하였다 ; 림프종 세포주(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 신장(올리고-dt 및 무작위 개시), 성인의 T-세포(올리고-dt 개시), 유방암종(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 폐(올리고-dt 및 무작위 개시), 태아의 눈(올리고-dt 및 무작위 개시) 및 태아의 두피(올리고-dt 및 무작위 개시).
다른 일련의 증폭에서, 반응은 Marathon™ cDNA(클론텍에서 입수). 10 ng, 암플리머 2362-94 및 2362-98 각각 5 pmol 및 어드벤테이지 cDNA중합효소 혼합물 0.5 ㎕ 를 포함하며, 총 반응 부피는 25 ㎕ 이다. 반응을 95 ℃ 에서 1 분 동안 한 사이클에서 실행하였다 ; 95 ℃ 에서 5 초, 64 ℃ 에서 5 초 및 68 ℃ 에서 1 분 동안 35 사이클에서 실행하였다 ; 68 ℃ 에서 1 분 동안 한 사이클에서 실행하였다. 예상 크기(100 bp)의 PCR 산물이 인간 성인의 간, 폐, 태반 및 비장을 포함하는 많은 cDNA 근원과 동일하였다.
IL-1ra-L mRNA 의 발현은 노턴 블롯 분석으로 검사할 수 있다. 다중 인체 조직 노턴 블롯(클론텍에서 입수)을 IL-1ra-L 폴리펩티드 cDNA 클론에서 분리한 적절한 제한 절편을 가지고 탐침하였다. 프로브는 표준 기술을 사용하여32P-dCTP 로 표지하였다.
노턴 블롯을 혼성화 용액(5X SSC, 50 % 탈이온화된 포름아미드, 5X 덴하르드트 용액, 0.5 % SDS 및 변성된 연어 정액 DNA 100 mg/ml)에서 42 ℃, 2 시간 동안 선혼성화한 후 표지된 프로브 5 ng/ml 를 포함하는 새로운 혼성화 용액에 42 ℃ 에서 밤새도록 혼성화하였다. 하기의 혼성화에서, 필터를 2X SSC 및 0.1 % SDS 로 실온에서 10 분 동안 두 번 세척한 후 0.1X SSC 및 0.1 % SDS 로 65 ℃ 에서 30 분 동안 두 번 세척하였다. 그런 다음 블롯을 자동방사선사진법에 노출시켰다.
IL-1ra-L mRNA 의 발현을 원위치 혼성화에 의해 위치시켰다. 보통 태아 및 성인 쥐 조직의 패널을 4 % 파라포름알데하이드에 고정시켜, 파라핀 속에 파묻고 5 ㎛ 로 세분하였다. 세분화된 조직을 0.2 M HCl 에서 투과시켜 프로테이나아제 K 로 절단하여 트리에탄올아민과 아세트산 무수물로 아세틸화하였다. 절편을 혼성화 용액(300 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 1X 덴하르드트 용액, 0.2 % SDS, 10 mM DTT, 0.25 mg/ml tRNA, 25 ㎍/ml 폴리 A, 25 ㎍/ml 폴리 C 및 50 % 포름아미드)에서 60 ℃, 1 시간 동안 선혼성화한 후 10 % 텍스트란 및 인체 IL-1ra-L 유전자에 상보적인 P33-표지된 안티센스 리보프로브 (riboprobe) 2 × 104cpm/μl 를 포함하는 상기 용액에 60 ℃ 에서 밤새 혼성화시켰다. 리보프로브를 표준 기술을 사용하여 인체 IL-1ra-L cDNA 서열을 포함하는 클론의 시험관내시험관내의해 수득하였다.
다음의 혼성화에서, 절편을 혼성화 용액으로 세척하고, RN아제 A 로 처리하여 비혼성화된 프로브를 절단한 후 55 ℃ 에서 30 분 동안 0.1X SSC 로 세척하였다. 그런 다음 절편을 NTB-2 에멀젼(뉴저지 로체스터에 소재하는 코닥에서 입수)에 담가 4 ℃ 에서 3 주 동안 노출시키고 헤마톡시린과 에오신으로 대조염색하였다. 조직 형태학 및 혼성화 신호를 뇌(하나의 시상 및 두 개의 관측 절편), 위장관(식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 근위결장 및 원위결장), 뇌하수체, 간, 폐, 심장, 비장, 흉선, 림프절, 신장, 부신, 방광, 췌장, 침샘, 수컷 및 암컷의 생식 기관(암컷의 난소, 수란관 및 자궁 ; 수컷의 정소, 부정소, 전립선, 정낭 및 정관), BAT 및 WAT(피하 및 신장주위), 뼈(대퇴골), 피부, 유방 및 골격근에서 암시야 및 표준 조명법으로 동시에 분석하였다.
실시예 3 : IL-1ra-L 폴리펩티드의 생산
A. 박테리아의 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현
PCR 을 서열의 5' 및 3' 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코딩하는 주형 DNA 서열을 증폭시키기 위해 사용하였다. 증폭시킨 DNA 산물을 발현 벡터내로 삽입하기 위해 제한 효소 위치를 함유하도록 변형시킬 것이다. PCR 산물을 겔 정제하고 표준 재조합 DNA 계통적 분류법을 사용하여 발현 벡터내로 삽입하였다. 1ux 프로모터 및 카나마이신 저항을 코딩하는 유전자를 포함하는 pAMG21(ATCC 번호 제 98113 호)와 같은 적절한 벡터를 삽입 DNA 의 방향 클로닝을 위해 Bam HI 및 Nde I 으로 절단하였다. 결합시킨 혼합체를 일렉트로포레이션으로 E. coli 숙주 세포내로 형질전환시켜 형질전환체가 카나마이신 저항을 나타내게하였다. 선별한 콜로니의 플라스미드 DNA 를 분리해 DNA 서열결정하여 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
형질전환시킨 숙주 세포를 유발 전에 카나마이신 30 ㎍/ml 를 포함하는 2X YT 배지에서 30 ℃ 로 배양하였다. 유전자 발현을 6 시간 동안 30 ℃ 나 37 ℃ 로 배양한 30 ng/mL 의 최종 농도로 N-(3-옥소헥사노일)-d1-호모세린 락톤을 첨가하여 유도하였다. 배양액을 원심분리하여 재현탁하고 박테리아 펠렛을 용균시켜 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 숙주 세포 단백질 분리하여 IL-1ra-L 폴리펩티드의 발현을 확인하였다.
IL-1ra-L 폴리펩티드를 포함하는 봉입체를 하기와 같이 정제시켰다. 박테리아 세포를 원심분리하여 펠렛을 물에 재현탁하였다 세포 현탁액을 초음파처리하고 5 내지 10 분 동안 195,000 xg 에서 원심분리하여 펠렛을 생성하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 세척하여 균질기로 옮겼다. 펠렛이 균일하게 현탁될 때까지 페르콜 용액(75 % 수성 페르콜 및 0.15 M NaCl) 5 mL 로 균질화하고 희석하여 21,600 xg 에서 30 분 동안 원심분리하였다. 봉입체를 포함하는 구배 분획을 발견하여 선별하였다. 분리시킨 봉입체를 SDS-PAGE 로 분석하였다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔상의 E.coli-생산 IL-1ra-L 폴리펩티드에 상응하는 단일 밴드를 겔에서 절단하여 Matsudaira 등의 1987, J. Biol. Chem. 262 : 10 - 35 의 문헌에 기술된 바에 기초해 N-말단 아미노산 서열을 검출하였다.
B. 포유동물 세포의 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현
서열의 5' 및 3' 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코딩하는 주형 DNA 서열을 PCR 로 증폭시켰다. 증폭시킨 DNA 산물을 발현 벡터에 삽입하기 위해 제한 효소 위치를 포함하도록 변형시킬 것이다. PCR 산물을 겔 정제하여 표준 재조합 DNA 계통적 분류법을 이용하여 발현 벡터에 삽입하였다. 엡스타인-바 바이러스의 복제 개시점을 포함하는, pCEP4(인비트로겐에서 입수)와 같은 적절한 발현 벡터를 293-EBNA-1 세포(인비트로겐에서 입수)의 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현에 사용할 것이다. 증폭시키고 겔 정제한 PCR 산물을 pCEP4 벡터에 결합시켜 리포펙션(lipofection)으로 293-EBNA 세포(인비트로겐에서 입수)로 삽입하였다. 감염시킨 세포를 히그로마이신 100 ㎍/mL 로 선별하여 약물-저항 배양액에서 융합을 위해 성장시켰다. 그런 다음 세포를 72 시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 조정배지를 제거하고 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
IL-1ra-L 폴리펩티드 발현을 은 염색으로 검출할 것이다. 대안적으로, IL-1ra-L 폴리펩티드를 IgG 절대 영역 또는 FLAG 에피토프와 같은 에피토프 표식을 가지는 융합 단백질로 생성하였으며, 펩티드 표식에대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 검출할 것이다.
IL-1ra-L 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 절단하거나 IL-1ra-L 융합 단백질을 에피토프 표식에 대한 친화성 크로마토그래피로 정제하여 여기에 기술된 바와 같이 N-말단 아미노산 서열 분석을 실행하였다.
C. 포유동물 세포의 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현 및 정제
IL-1ra-L 폴리펩티드 발현 구성을 리포펙션이나 인산칼슘 방법으로 293 EBNA 나 CHO 세포(ATCC 제 CCL 61 호)에 삽입하였다.
생성된 IL-1ra-L 폴리펩티드의 기능 연구를 수행하기 위해, 많은 양의 조정배지를 293 EBNA 클론을 선별하는 히그로마이신의 풀에서 생성하였다. 세포를 배지에서 회수하기에 앞서 한 주 동안 무혈청 배지로 전환하기 전에 80 % 융합까지 500 ㎝ 인 넝크사의 트리플 플라스크(Nunc Triple Flask)에서 배양하였다. 조정배지를 회수하여 정제할 때까지 -20 ℃ 에서 냉동시켰다.
조정배지를 하기에 기술한 바와 같이 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 배지를 녹인다음 0.2 ㎛ 의 필터에 통과시켰다. 단백질 G 를 pH 7.0 에서 PBS 로 균질화시킨 후 여과된 배지에 로드시켰다.컬럼을 A280흡착이 기준선에 이를 때까지 PBS 로 세척하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드를 pH 2.7 에서 0.1 M 글리신-HCl 로 컬럼에서 용출시키고 pH 8.5 에서 1 M 트리스-HCl 로 즉시 중화시켰다. IL-1ra-L 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아서 PBS 에 투석시킨 후 -70 ℃ 에서 보관하였다.
인체 IL-1ra-L 폴리펩티드-Fc 융합 폴리펩티드의 인자 Xa 절단에 있어서, 친화성 크로마토그래피로 정제시킨 단백질을 pH 8.0 에서 50 mM 트리스 -HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2에 투석하였다. 제한 프로테아제 인자 Xa 를 1/100(w/w)으로 투석시킨 단백질에 첨가하고 그 시료를 실온에서 밤새도록 절단하였다.
실시예 4 : 항-IL-1ra-L 폴리펩티드 항체의 생산
IL-1ra-L 폴리펩티드의 항체를 정제된 단백질 또는 생물학적 또는 화학적 합성으로 생산된 IL-1ra-L 펩티드로 면역화하여 수득하였다. 항체를 생성하는 적절한 방법이 Hudson 및 Bay 의 Practical Immunology(2 판, 블렉웰 사이언티픽 퍼블리케이션)에 나와있다.
항체를 생산하는 방법에서, 동물(일반적으로 마우스 또는 토끼)에게 IL-1ra-L 항원(IL-1ra-L 폴리펩티드와 같은)을 주입하여 ELISA 로 검출되는충분한 혈청 역가 수준을 나타내는 동물이 혼성세포 생산을 위해 선별되었다. 면역화된 동물의 비장을 수집하여 비세포가 발견되는 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 마우스 골수종 세포[Sp2/0-Ag14 세포(ATCC 제 CRL 1581 호)]와 융합된 비세포를 페니실린 200 U/mL, 황산 스트렙토마이신 200 ㎍/mL 및 글루타민 4 mM 을 함유하는 DMEM 에 처음으로 배양한 후 HAT 선별배지(히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘)에 배양하였다. 선별 후에, 조직 배양 현탁액을 각각의 융합원에서 수득하여 ELISA 로 항-IL-1ra-L 항체 생산을 조사하였다.
인체 항체를 생산하는 인체 Ig 부위를 가지는 형질전환시킨 마우스의 면역화 및 항체 가변 도메인의 돌연변이에 의해 생성되는 합성 항체 라이브러리의 스크리닝에서와 같은 항-IL-1ra-L 항체를 수득하는 대안 방법 또한 사용할 수 있다.
실시예 5 : 형질전환시킨 마우스에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드 발현
IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 간에 특이적인 ApoE 프로모터의 제어하에서 IL-1ra-L 폴리펩티드/Fc 단백질을 코딩하는 구성을 제조하였다. 이러한 구성의 방출이 IL-1ra-L 폴리펩티드의 기능에 대한 정보를 제공하는 병리학적 변화를 유발할것이라고 예상된다. 유사하게, 베타 엑틴 프로모터의 제어하에서 전장 IL-1ra-L 폴리펩티드를포함하는 구성을 준비하였다. 구성의 방출이 편재하는 발현을 유발할것이라고 예상된다.
이러한 구성을 생성하기 위해, 바람직한 서열의 5' 및 3' 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코딩하는 주형 DNA 서열을 증폭하기 위해 PCR 을 사용하였으며 발현 벡터내로 증폭시킨 산물을 삽입하기 위해 제한 효소 부위에 결합시켰다. 하기의 증폭에서, PCR 산물을 겔 정제하고, 적절한 제한 효소로 절단하여 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현 벡터내로 결합시켰다. 예를 들어, 증폭시킨 IL-1ra-L 폴리펩티드 서열을 Graharn 등의 1997, Nature Genetics, 17 : 272 - 74 및 Ray 등의 1991, Genes Dev. 5 : 2265 - 73 에 기술된 바와 같이 인체 β-액틴 프로모터의 제어하에서 발현 벡터내로 클론화할 수 있다.
하기의 결합에서, 반응 혼합물을 일랙트로포레이션에 의해 E.coli 숙주세포로 형질전환시키는데 사용하며 형질전환체를 약물-저항으로 선별하였다. 콜로니에서 선별된 플라스미드 DNA 를 분리하여 돌연변이의 적절한 삽입 및 결여의 존재여부를 확인하기 위해 DNA 서열을 결정하였다. IL-1ra-L 폴리펩티드 발현 벡터를 두 차례의 CsCl 밀도 구배 원심분리하여 정제하였으며 적절한 제한 효소로 절단하고, IL-1ra-L 폴리펩티드 트랜스유전자를 포함하는 직선화된 단편을 겔 전기영동으로 정제하였다. 정제시킨 단편을 2 mg/mL 의 농도로 pH 7.4 인 트리스 5 mM 및 EDTA 0.2 mM 에 재현탁하였다.
BDF1 × BDF1 임신한 마우스의 단일세포 배아를 기술한 바와 같이(PCT 공개 번호 제 WO 97/23614) 주입하였다. 배아를 CO2항온기에서 밤새도록 배양하여 15 - 20 두-세포 배아를 가임신한 CD1 암컷 마우스의 수란관에 착상시켰다. 미세주입한 배아의 이식 결과를 하기와 같은 게놈 DNA 시료상의 통합 트랜스유전자의 PCR 증폭으로 스크리닝하였다. 귀 조각을 55 ℃ 에서 귀에 대한 완충용액 20 mL(20 mM 트리스, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.5 % SDS 및 500 mg/mL 프로테이나아제 K)에서 밤새도록 절단하였다. 그런 다음 시료를 TE 200 mL 로 희석하여 귀 시료 2 mL 를 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 사용하였다.
8 주된 형질전환이 나타난 동물 및 대조군 동물을 부검 및 병리학적 분석을 위해 희생시켰다. 비장의 일부분을 제거하고 총 세포내 RNA 를 총 RNA 추출 키트(퀴아젠에서 입수)를 사용하여 비장에서 분리시켰다. 비장에서 발견된 RNA 는 SuperScript™ 선증폭 시스템(기브코-비알엘에서 입수)을 사용하여 하기와 같이 전환시켰다. 발현 벡터서열 및 IL-1ra-L 폴리펩티드 트랜스유전자로의 3' 에 위치하는 적절한 프라이머를 트랜스유전자 전사에서 cDNA 합성을 개시하는데 사용하였다. 형질전환이 나타난 동물 및 대조군 동물에서의 10 mg 의 총 비장 RNA 를 70 ℃ 에서 10 분 동안 1 mM 프라이머와 함께 배양한 뒤 얼음위에서 식혔다. 그런 다음 반응에 10 mM 트리스-HCl, pH 8.3 인 50 mM KCl, 25 mM MgCl2 및 각각 10 mM 인 dNTP, 0.1 mM DTT 및 200 U SuperScript Ⅱ 역전사효소를 보충하였다. 42 ℃ 에서 50 분 동안 배양한 후, 72 ℃ 에서 15 분간 가열하여 반응을 멈추었고 37 ℃ 에서 20 분 동안 RN아제 H 2U 로 절단하였다. 그런 다음 시료를 IL-1ra-L 폴리펩티드에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 로 증폭시켰다.
실시예 6 : 형질전환시킨 마우스의 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성
안락사시키기 전에, 형질전환시킨 동물의 몸무게를 측정하고 아이소플루오란으로 마취시켰으며 심장의 상처로 인해 혈압이 하강하였다. 시료에 혈액학 및 혈청 화학 분석을 실시하였다. 최종 방혈후에 라디오그래피를 실행하였다. 총체적인 해부에서, 주요 내장기관을 중량 분석하였다.
다음의 총체적인 해부에서, 조직(즉, 비장, 췌장, 이, 위장관 전체, 신장, 생식 기관, 피부 및 유선, 뼈, 뇌, 심장, 폐, 흉선, 호흡관, 식도, 갑상선, 부신, 방광, 림프절 및 골격근)을 제거하여 조직학적 검사를 위해 10 % 완충 Zn-포르말린에 고정시켰다. 고정한 후에, 조직을 파라핀 블록으로 처리하여 3 mm 의 절편을 수득하였다. 모든 절편을 헤마톡실린과 엑소신으로 염색한 후 조직학적 분석을 실행하였다.
형질전환시킨 마우스 및 대조군 마우스의 비장, 림프절 및 파이어판 모두에 하기에서와 같이 B 세포 및 T 세포 특이 항체로 면역조직학적 분석을 실행하였다. 포르말린으로 고정된 파라핀이 끼어넣어진 절편을 증류수로 파라핀을 제거하고 수화시켰다. 절편을 3 % 과산화수소로 제어하고 단백질 블록(펜실베이니아 피츠버그에 소재하는 립쇼에서 입수)으로 억제시키고, 랫 단일클론 항-마우스 B220 및 CD3(인디애나 인디아나폴리스에 소재하는 하를란에서 입수)로 배양하였다. 항체 결합을 비오틴을 붙인 토끼 항-랫 면역글로불린 및 스트렙타비딘이 결합된 퍼옥시다아제(캘리포니아 라몬에 소재하는 바이오지넥스에서 입수)로 검출하였다.절편을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
부검한 후에, 형질전환시킨 동물 및 대조군 동복자의 비장 및 흉선의 MLN 및 절편을 제거했다. 단일세포 현탁액을 100 mm 나일론세포 스트레이너(strainer)(캘리포니아 바바라에 소재하는 바이오테크에서 입수)의 바닥에 주입기의 평평한 부분으로 조직을 서서히 분쇄하여 준비하였다. 세포를 두 번 세척하여 수를 계산한 후, 각 조직에서 1x 106개의 세포를 20 ㎕ 부피에서 CD16/32(Fcγ Ⅲ/Ⅱ)Fc 블록 0.5 ㎍ 으로 10 분 동안 배양하였다. 그런 다음 시료를 2 - 8 ℃ 에서 30 분 동안 PBS 100 μL, 0.1 % 소혈청 알부민 및 0.01 % 아지드화 나트륨과 FITC 의 항체 및 CD90.2(Thy-1.2), CD45R(B220), CD11b(Mac-1), Gr-1, CD4 또는 CD8(캘리포니아 샌디에고에 소재하는 파민젠에서 입수)에 대한 PE-접합 모노클로날 항체와 함께 염색하였다. 하기의 항체 결합에서, 세포를 세척한 후 FACS칸(벡톤 디킨손에서 입수)상의 유동세포분석법으로 분석하였다.
본 발명은 바람직한 실시형태로 기술되었지만, 본 분야의 기술자들에 의해 변이 및 변형이 일어날 수 있음이 인지되어야 한다. 따라서, 첨부된 청구항이 청구된 본 발명의 범주에 상응하는 모든 변이를 포함함이 인지되어야 한다.

Claims (54)

  1. 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열 :
    (a) SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열 ;
    (b) ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열;
    (c) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열 ;
    (d) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(c) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
    (e) (a)-(c) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
  2. 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 :
    (a) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드와 적어도 약 70 % 상동인 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (b) SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 누클레오티드 서열의 대립형질 변이체 또는 스플라이스 변이체를 코드하는 누클레오티드 서열, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열 또는 (a) ;
    (c) 적어도 약 25 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 단편을 코드하는 SEQ ID NO : 1, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물, (a) 또는 (b) 의 누클레오티드 서열 영역, 여기에서 폴리펩티드 단편은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 코드된 폴리펩티드 활성을 갖거나 항원성이다.
    (d) 적어도 약 16 개의 누클레오티드로 이루어진 단편을 포함하는 SEQ ID NO : 1, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물 또는 (a)-(c) 중 어느 하나의 누클레오티드 서열 영역 ;
    (e) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(d) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
    (f) (a)-(d) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
  3. 다음 중에서 선택한 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자 :
    (a) 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (b) 적어도 하나의 아미노산 삽입을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (c) 적어도 하나의 아미노산 결실을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (d) C- 및/또는 N-말단이 절두된, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (e) 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두, N-말단 절두 중에서 선택한 적어도 하나의 변이를 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드를 코드하는 누클레오티드 서열, 여기에서 코드된 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (f) 적어도 약 16 개의 누클레오티드로 이루어진 단편을 포함하는 (a)-(e) 중 어느 하나의 누클레오티드 서열 ;
    (g) 온화한 또는 매우 엄격한 조건하에서 (a)-(f) 중 어느 하나의 상보 서열에 혼성되는 누클레오티드 서열 ; 및
    (h) (a)-(e) 중 어느 하나에 상보적인 누클레오티드 서열.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  5. 제 4 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  6. 제 5 항에 있어서, 진핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제 5 항에 있어서, 원핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 폴리펩티드를 발현하기에 적당한 조건하에서 제 5 항의 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 배양액으로부터 이 폴리펩티드를 분리함을 포함하는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  9. 제 8 항의 방법으로 제조한 폴리펩티드.
  10. 제 8 항에 있어서, 핵산 분자는 IL-1ra-L 폴리펩티드를 코드하는 DNA 에 작동적으로 결합하는 천연 IL-1ra-L 폴리펩티드에 대한 프로모터 DNA 이외에 다른 프로모터 DNA 를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상동성 백분율은 GAP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit 및 스미스-워터맨 알고리즘 중에서 선택한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 측정함을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  12. 제 5 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 세포를 화합물에 노출시키고, 상기 세포에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드 생산 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 활성을 측정함을 포함하는, IL-1ra-L 폴리펩티드 활성 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 생산을 화합물이 저해하는 지를 결정하는 방법.
  13. 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 :
    (a) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열 ; 및
    (b) ATCC 기탁 번호 제 PTA - 1215 호의 DNA 삽입물에 의해 코드되는 아미노산 서열.
  14. 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 :
    (a) SEQ ID NO : 2 의 오르토로그에 대한 아미노산 서열 ;
    (b) SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열과 적어도 약 70 % 상동인 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (c) 적어도 약 25 개의 아미노산 잔기를 포함하는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열의 단편, 여기에서 단편은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖거나 또는 항원성이다 ; 및
    (d) SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열의 대립형질 변이체또는 스플라이스 변이체에 대한 아미노산 서열, ATCC 기탁 번호 제 PTA-1215 호의 DNA 삽입물에 의해 코드되는 아미노산 서열, (a) 또는 (b).
  15. 다음 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 :
    (a) 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (b) 적어도 하나의 아미노산 삽입을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (c) 적어도 하나의 아미노산 결실을 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ;
    (d) C - 및/또는 N - 말단이 절두된, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다 ; 및
    (e) 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두 및 N-말단 절두 중에서 선택한 적어도 하나의 변이를 갖는, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열, 여기에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는다.
  16. SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 폴리펩티드 활성을 갖는, 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코드되는 분리된 폴리펩티드.
  17. 제 14 항에 있어서, 상동성 백분율은 GAP, BLASTP, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit 및 스미스-워터맨 알고리즘 중에서 선택한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 측정함을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  18. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 선택적 결합제 또는 이의 단편.
  19. 제 18 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편과 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 선택적 결합제 또는 이의 단편.
  20. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  21. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 인체화 항체임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  22. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 인체 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  23. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 폴리클로날 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  24. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 모노클로날 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  25. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 키메라 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  26. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 CDR - 이식 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  27. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 항유전형 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  28. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 가변 영역 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  29. 제 28 항에 있어서, 가변 영역 단편은 Fab 또는 Fab' 단편임을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  30. SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 특이성을 갖는, 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하는 선택적 결합제 또는 이의 단편.
  31. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 검출가능한 표지에 결합함을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  32. 제 18 항에 있어서, 선택적 결합제는 IL-1ra-L 폴리펩티드의 생물학적 활성을 길항함을 특징으로 하는 선택적 결합제.
  33. 제 18 항의 선택적 결합제의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는 IL-1ra-L 폴리펩티드 - 관련 질환이나 증상, 장애를 치료하거나 예방 또는 경감시키는 방법.
  34. SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 동물을 면역시켜 생산한 선택적 결합제.
  35. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 선택적 결합제를 생산하는 하이브리도마.
  36. 제 18 항의 항-IL-1ra-L 항체 또는 단편을 이용하여 IL-1ra-L 폴리펩티드의 양을 정량하거나 검출하는 방법.
  37. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 약학적으로 용인가능한 제제형을 함유하는 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 약학적으로 용인가능한 제제형은 담체, 보조제, 가용화제, 안정화제 또는 항산화제임을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  40. 제 39 항에 있어서, 수용성 중합체로 공유결합에 의해 변이시킴을특징으로 하는 폴리펩티드.
  41. 제 40 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리비닐 알콜 중에서 선택함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  42. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자 및 약학적으로 용인가능한 제제형을 함유하는 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 핵산 분자는 바이러스 벡터 내에 포함됨을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터.
  45. 이종 아미노산 서열에 융합시킨 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  46. 제 45 항에 있어서, 이종 아미노산 서열은 IgG 불변 도메인 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  47. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산에 의해 코드되는 폴리펩티드를 환자에게 투여함을 포함하는 의학 질환을 치료하거나 예방 또는 경감시키는 방법.
  48. 다음 단계를 포함하는, 피실험자의 병리학적 질환에 대한 민감성 또는 병리학적 질환을 진단하는 방법 :
    (a) 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코드되는 폴리펩티드의 시료내 발현 여부 또는 그 양을 측정하는 단계 ; 및
    (b) 폴리펩티드의 발현 여부 또는 그 양을 기초로 병리학적 질환에 대한 민감성 또는 병리학적 질환을 진단하는 단계.
  49. 이식에 적합한 막 및 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 단백질을 분비하는, 상기 막 내부에서 캡슐화된 세포를 포함하며, 이 막은 상기 단백질은 투과시키지만 세포에 유해한 물질은 투과시키지 않는기구.
  50. 다음 단계를 포함하는, IL-1ra-L 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 확인하는 방법 :
    (a) 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 화합물을 접촉시키는 단계 ;
    (b) 이 화합물과 IL-1ra-L 폴리펩티드의 결합 정도를 측정하는 단계.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 화합물과 결합할 때 폴리펩티드의 활성도를 측정하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에게서 폴리펩티드의 농도를 조절하는 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 비 - 인체 형질전환 포유동물.
  54. 제 53 항의 형질전환 포유동물을 화합물에 노출시키고, 이 포유동물에서의 IL-1ra-L 폴리펩티드 활성 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 생산을 측정함을 포함하는, IL-1ra-L 폴리펩티드 활성 또는 IL-1ra-L 폴리펩티드 생산을 이 화합물이 저해하는 지를 결정하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5075222A (en) * 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US5945310A (en) * 1997-05-19 1999-08-31 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding members of the IL-1 family, IL-1 delta

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