KR20080090484A - ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체 - Google Patents

ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하는 항체 가변 영역을 포함하는 항-IL-6 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 IL-6 길항제에 근거한 IL-6 관련 질환의 치료 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6 의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체 {ANTI-IL-6 ANTIBODIES PREVENTING THE BINDING OF IL-6 COMPLEXED WITH IL-6RALPHA TO GP130}
본 발명은 IL-6 신호 경로의 억제 및 IL-6 관련 질환의 치료에 유용한 인터루킨-6 (IL-6) 의 길항제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 차단하고, IL6-촉발 질환, 바람직하게는 암 및 자가면역 질환의 치료에 성공적으로 사용될 수 있는 항-IL-6 항체에 관한 것이다.
인터루킨-6 (IL-6) 은 암 및 자가면역 질환을 포함하는 여러 질환에 관련된다. 인터루킨-6 은 호르몬-의존성 전립선 암과 같은 많은 진행된 암에 의해 분비되며, 이러한 암에 대한 성장 인자인 것으로 여겨진다. 또한, 암 세포에 의한 IL-6 의 분비는 진행된 암의 특징적인 소모 증후군인, 카켁시아를 야기하는 것으로 여겨진다. 그러므로, IL-6 작용의 억제는 이러한 암의 치료에 유용할 것이다.
IL-6 은 또한 B 세포 발달에 중요한 역할을 담당한다. 유의한 항체 성분이 있는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염은, IL-6 의 억제에 의해 치료될 수 있을 것이다. B 세포의 증식 관련 질환, 예컨대 다발 골수종 및 B 세포 림 프종은 또한, IL-6 활성의 억제에 의해 치료될 수 있을 것이다.
또한, IL-6 은 뼈 흡수를 촉진하여 뼈 리모델링에 중요한 역할을 한다. IL-6 활성의 억제제는 뼈 흡수 감소의 효과를 가질 것이고, 골다공증 치료에 사용할 수 있을 것이다.
IL-6 이 질환 또는 장애의 일부로서 생성되는 경우, 이것은 종종 가용성 IL-6Rα 서브유닛과 복합체를 형성하고, 종종 이러한 복합체의 형태로 세포로부터 분비된다. 그 결과, 항체 또는 억제제가 미리 형성된 복합체에 아무런 영향을 줄 수 없기 때문에, IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 차단하는 항체 또는 기타 억제제로 환자를 치료하는 것이 종종 유용하지 않다. 그러므로, IL-6-매개 질환의 개선된 치료를 위한 당업계에서의 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 IL-6-매개 질환, 특히, 활성화시 IL-6 과 관련된 암 및 자가면역 질환의 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 효과적으로 차단하는 신규 IL-6 길항제, 특히, 미리 형성된 IL-6 과 IL-6Rα 복합체가 gp130 에 결합하는 것을 방해하는 IL-6 길항제를 제공한다. 또한, 본 발명은 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 차단하는 신규 IL-6 길항제의 생성 방법을 제공한다.
그러므로, 하나의 양상에서, 본 발명은 IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. 하나의 구현예에서, 단리된 IL-6 길항제는 항체 가변 영역 및 인간 항체 유래의 Fc 영역을 함유한다. 대안적인 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 영역은 마우스, 래트, 소, 개, 닭, 말, 어류, 원숭이, 또는 기타 비-인간 종으로부터 수득된 항체 유래일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 가변 영역은 결합이 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 식으로, IL-6 상의 영역에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 FX1FSX2X3WMX4 (SEQ ID NO:1) 를 함유하는 중쇄 CDR1 이 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X1, X2, X3 또는 X4 는 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, X1 은 Thr, Ser, Ala 또는 Cys 이고; X2 는 Asn 또는 Asp 이고; X3 은 Tyr 또는 Ala 이고; X4 는 Asn 또는 Asp 이다. 특히, 중쇄 CDR1 은 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유할 수 있다: FTFSNYWMN (SEQ ID NO:2), FSFSNYWMN (SEQ ID NO:3), 또는 FTFSDAWMD (SEQ ID NO:4).
일부 구현예에서, 아미노산 서열 EIRX1X2X3NX4X5AX6X7YAESVKG (SEQ ID NO:5) 를 함유하는 중쇄 CDR2 가 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X1, X2, X3, X4, X5, X6 또는 X7 은 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, X1 은 Leu 또는 Ser 이고; X2 는 Lys 또는 Thr 이고; X3 은 Ser 또는 Ala 이고; X4 는 Asn 또는 Lys 이고; X5 는 Tyr, Gly, Gln 또는 His 이고; X6 은 Thr 또는 Ile 이고; X7 은 His 또는 Tyr 이다. 특히, 항체 가변 영역에는 하 기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 중쇄 CDR2 가 포함된다: EIRLKSNNYATHYAESVKG (SEQ ID NO:6), EIRLKSNKGATHYAESVKG (SEQ ID NO:7), EIRLTSNKQAIYYAESVKG (SEQ ID NO:8), 또는 EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO:9).
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 X1X2X3X4GX5X6X7X8 (SEQ ID NO: 10) 를 함유하는 중쇄 CDR3 이 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 또는 X8 은 임의의 아미노산 또는 펩티드 결합일 수 있다. 바람직하게는, X1 은 Glu, Leu 또는 Pro 이고; X2 는 Asp, Leu, Phe 또는 Thr 이고; X3 은 Tyr 또는 Leu 이고; X4 는 Tyr 또는 Asp 이고; X5 는 Tyr 또는 Ala 이고; X6 은 Pro, Met 또는 펩티드 결합이고; X7 은 Asp 또는 Leu 이고; X8 은 Tyr 또는 His 이다. 특히, 항체 가변 영역에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 중쇄 CDR3 이 포함된다: EDYYGYPDY (SEQ ID NO:11), LLYDGYLH (SEQ ID NO:12), LFYDGYLH (SEQ ID NO:13), 또는 PTLYGAMDY (SEQ ID NO:14).
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 RASESVX1NX2GISFM (SEQ ID NO: 15) 를 함유하는 경쇄 CDR1 이 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X1 또는 X2 는 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, X1 은 Asp, Gly 또는 His 이고; X2 는 Phe 또는 Tyr 이다. 특히, 항체 가변 영역에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 경쇄 CDR1 이 포함된다: RASESVDNFGISFM (SEQ ID NO:16), RASESVGNFGISFM (SEQ ID NO:17), RASESVHNFGISFM (SEQ ID NO:18), 또는 RASESVDNYGISFM (SEQ ID NO:19).
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 XASNQGS (SEQ ID NO:20) 를 함유하는 경쇄 CDR2 가 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X 는 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, X 는 Ala, Val 또는 Thr 이다. 특히, 항체 가변 영역에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 경쇄 CDR2 가 포함된다: TASNQGS (SEQ ID NO:21), VASNQGS (SEQ ID NO:22), 또는 AASNQGS (SEQ ID NO:23).
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 서열 QQX1KEX2PX3T (SEQ ID NO:24) 를 함유하는 경쇄 CDR3 이 포함되는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다. X1, X2 또는 X3 은 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, X1 은 Ser 또는 Gly 이고; X2 는 Val 또는 Ile 이고; X3 은 Trp 또는 Tyr 이다. 특히 항체 가변 영역에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 경쇄 CDR3 이 포함된다: QQSKEVPWT (SEQ ID NO:25), QQSKEVPYT (SEQ ID NO:26), QQSKEIPWT (SEQ ID NO:27), 또는 QQGKEVPWT (SEQ ID NO:28).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 IL-6 길항제는 항체 또는 그의 조각이다.
일부 구현예에서, 항체에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 경쇄가 포함된다: SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, 또는 SEQ ID NO:32. 대 안적으로는, 항체에는 상기 확인된 서열 중 임의의 하나, 예를 들어, SEQ ID NO:31 (Mab#471) 와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 아미노산 서열을 함유하는 경쇄가 포함된다.
다른 구현예에서, 항체에는 하기 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 중쇄가 포함된다: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, 또는 SEQ ID NO:36. 대안적으로는, 항체에는 상기 확인된 서열 중 임의의 하나, 예를 들어, SEQ ID NO:35 (Mab#471) 와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 아미노산 서열을 함유하는 중쇄가 포함된다.
본 발명은 또한 상기 다양한 구현예에서 기재된 바와 같은 IL-6 길항제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 기재된 항-IL-6 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 Leu 19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 및 Trp157 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 함유하는 IL-6 상의 에피토프에, 결합이 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 식으로 결합하는 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 IL-6 길항제를 제공한다.
전형적으로는, IL-6 길항제에는 Fc 부분이 포함된다. 바람직하게는, Fc 부분은 인간 항체 유래이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 IL-6 길항제 중의 모든 불변 영역은 인간 항체 유래이다. 대안적인 구현예에서, 본 발명에 적합한 Fc 영역은 마우스, 래트, 소, 개, 닭, 말, 어류, 원숭이, 또는 기타 비-인간 종으로부터 수득된 항체 유래일 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 대상에게 상기 기재된 본 발명의 단리된 IL-6 길항제를 투여하여 대상에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 IL-6 와 결합하고, gp130 과의 상호작용을 입체적으로 차단하는 항체 V 영역을 포함하는 단백질을 투여하여 대상에서 질환 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 단백질에는 항체, 다양한 불변 영역이 결여된 항체 조각, 미니체, scFv 단백질, 항체 융합 단백질이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, IL-6 에 결합하고, gp130 과의 상호작용을 입체적으로 차단하는 항체 V 영역은 IL-6 과 IL-6 수용체 α 서브유닛 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하지 않는다. 본 발명의 방법은 특히 IL-6 이 관련된 질환, 장애 및 부작용, 예컨대, 예를 들어, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 그레이브스 질환, 하시모토 질환, 및 캐슬맨 (Castleman's) 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 자가면역 질환, 습성 및 만성 염증, 및 골다공증 및 골 질량 손실을 포함하는 기타 장애, 및 호르몬-의존성 전립선 암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암, B-세포 증식성 장애, 예컨대 B 세포 비-호지킨 림프종, 및 신장, 유방, 결장, 폐, 뇌, 및 기타 조직의 진행된 암의 치료에 유용하다.
또다른 양상에서, 본 발명은 상기 다양한 구현예에 기재된 IL-6 길항제를 발생시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 (a) 먼저 동물을 IL-6 및 IL-6Rα 를 포함하는 조성물로 면역화시켜, IL-6 과 IL-6Rα 의 복합체에 대항하는 항체를 발생시키고, (b) gp130 과 IL-6 사이의 상호작용을 억제하는 항체를 확인하여 IL-6 길항제를 발생시키는 방법을 제공한다. IL-6 및 IL-6Rα 는 IL-6/IL-6Rα 복합 체의 형성을 용이하게 하는 융합 단백질 배열로 있을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물에는 또한 항원 제시를 용이하게 하는 부가적인 부분, 예컨대 Fc 부분이 포함된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 IL-6 과 IL-6Rα 의 복합체에 특이적이고, gp130 에 대한 IL-6 결합을 방해할 수 있는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 특징, 대상 및 장점은 이하 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 본 발명의 구현예에서 표시되는 동안 상세한 설명은 제한이 아닌, 단지 예증의 방식으로 제공되는 것임이 이해되어야만 한다. 발명의 범주 내의 다양한 변경 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
요약하면, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
· 항체 가변 영역이, 결합이 질환 세포의 표면 상에서 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 방식으로 IL-6 상의 에피토프에 결합하는, 항체 가변 영역을 포함하는 상응하는 항-IL6 항체 또는 그의 조각.
· 결합이 IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하나, IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하지는 않는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 상기 IL-6 상의 에피토프가 Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 및 Trp157 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00001
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00002
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00003
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00004
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00005
· 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체:
Figure 112008054773884-PCT00006
· SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 의 중쇄 CDR1 및
SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9 의 중쇄 CDR2; 및
SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 의 중쇄 CDR3 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, 또는 SEQ ID NO:19 의 경쇄 CDR1, 및
SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 또는 SEQ ID NO:23 의 경쇄 CDR2, 및
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 의 경쇄 CDR3 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 의 중쇄 CDR1, 및
SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9 의 중쇄 CDR2; 및
SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 의 중쇄 CDR3, 및
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, 또는 SEQ ID NO:19 의 경쇄 CDR1, 및
SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 또는 SEQ ID NO:23 의 경쇄 CDR2, 및
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 의 경쇄 CDR3 을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체 불변 영역을 임의로 추가로 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· Fc 부분을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· Fc 부분이 인간인, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체가 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체가 SEQ ID NO:31 의 경쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:31 과 90% 이상 일치하는 서열을 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체가 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:36 으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 항체가 SEQ ID NO:35 의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:35 와 90% 이상 일치하는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:35 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:34 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:36 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· SEQ ID NO:33 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상응하는 항-IL6 항체.
· 상기 및 하기에 열거된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산 분자.
· 상기 및 하기에 열거된 바와 같은 항-IL6 항체를, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약물학적 유효량으로 포함하는, IL6 촉발 질환의 치료에 적합한 약학 조성물.
· 암 또는 자가면역 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 상기 및 하기에 열거된 바와 같은 항-IL6 항체의 용도.
· 질환이 IL6 또는 IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL6 에 의해 촉발되는, 상응하는 용도.
· 바람직하게는 Fc 가 비-인간 포유류, 예컨대 마우스 유래이고, IL-6Rα 및 IL6 가 인간 기원 유래인, 항체의 Fc 부분, IL6Rα 및 IL6 를 포함하는 융합 단백질.
· IL6Rα 가 Fc 부분의 C-말단에 융합되고, IL6 이 IL6Rα 의 C-말단에 융합된, 상응하는 융합 단백질.
· 스크리닝된 항체가 하기 특성을 갖는, 포유류를 열거된 바와 같은 융합 단백질로 면역화하여 수득된 항-IL6 항체의 제조를 위한 열거된 바와 같은 융합 단백질의 용도:
(i) 상기 항체의 가변 영역이 IL-6 상의 에피토프에 결합하고,
(ii) 질환 세포의 표면 상의 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하고,
(ii) IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하나, IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하지는 않는 특성.
· 스크리닝된 항체가 상기 및 하기에 열거된 바와 같은 항체인, 상응하는 용도.
도 1A 는 질환 세포 또는 IL-6 과생산을 야기하는 다른 표적 세포에 대한 gp130 의 바람직하지 않은 활성화를 묘사한다.
도 1B 는 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하고, IL-6 에 대한 그의 결합이 미리-결합된 sIL-6Rα 에 의해 영향을 받지 않는 IL-6 길항제를 묘사한다.
도 2 는 본 발명의 예시적 항체 V 영역 서열의 정렬을 나타낸다. 서열 중의 변이의 위치는 화살표로 표시된다. CDR 은 박스로 되어 있다.
도 3 은 본 발명에서 사용된 예시적 단백질 구현예의 구조도이다.
도 4 는 Fc-IL6Rα-IL6 에 대한 본 발명의 예시적 항체의 결합을 반영한 실험 결과를 나타낸다.
도 5 는 IL-6 에 대한 본 발명의 예시적 항체의 결합을 반영한 실험 결과를 나타낸다.
도 6 은 비-공유적으로 복합체를 형성한 IL-6 과 IL-6Rα 에 대한 본 발명의 예시적 항체의 결합을 반영한 실험 결과를 나타낸다.
도 7 은 IL-6Rα 단독에 대한 본 발명의 예시적 항체의 결합을 반영한 실험 결과를 나타낸다.
도 8 은 본 발명의 예시적 항체가 Fc-IL6Rα-IL6 과 gp130 사이의 상호작용을 억제하는 것을 예증하는 실험 결과를 보여준다.
도 9 는 본 발명의 예시적 항체에 의해 Fc-IL6Rα-IL6 복합체로 자극받은 HepG2 세포로부터 합토글로빈 방출을 차단하는 능력을 예증하는 실험 결과를 보여준다.
도 10A 는 Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질이 A431 인간 상피 암종 세포의 증식을 자극한다는 것을 반영하는 실험 결과를 묘사한다.
도 10B1 및 10B2 는 본 발명의 예시적 항체가 Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질에 의해 자극된 A431 인간 상피 암종 세포의 증식을 억제한다는 것을 반영하는 실험 결과를 묘사한다.
도 11 은 본 발명의 예시적 항체의 약동학적 특성을 예증한다.
도 12 는 실시예 6 에 기재된 절차를 사용하여, 본 발명의 예시적 항체에 의한 합토글로빈 분비의 생체 내 억제를 반영하는 실험 결과를 나타낸다.
도 13 은 본 발명의 예시적 항체에 의한 폐 전이의 억제를 반영하는 실험 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 효과적으로 차단하여, 미리 형성된 IL-6/IL-6Rα 복합체의 존재하에서 IL-6 신호를 억제하는 신규 IL-6 길항제를 제공한다. 상기 논의한 바와 같이, IL-6 이 질환 또는 장애의 일부로서 생성되는 경우 IL-6Rα 와 전형적으로 복합체를 형성하므로, 본 발명은 IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 차단하는 현존 항체와 비교해 더욱 양호한 치료 효과를 달성한다 (van Zaanen et al., (1996) J. Clin . Invest ., 98(6): 1441-8).
하나의 특정 구현예에서, 본 발명은 결합이 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 식으로 IL-6 상의 영역에 결합하는 항체 가변 영역을 함유하는 IL-6 길항제를 제공한다. "입체적으로 차단하는" 이라는 것은 제 1 단백질에 대한 제 3 단백질의 결합에 의한 제 1 및 제 2 단백질 사이의 상호작용의 차단의 의미를 의미한다. 제 1 및 제 3 단백질 사이의 결합은 제 2 단백질을 제 2 및 제 3 단백질 사이의 비호의적인 반데르발스 (van der Waals) 또는 정전기적 상호작용으로 인한 제 1 단백질에 대한 결합으로부터 방해한다.
본 발명은 또한 본 발명의 IL-6 길항제에 근거한 IL-6 이 관여되는 질환, 장 애 및 부작용의 치료용 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 양상은 하기 부차 섹션에서 더욱 상세히 기재된다. 부차 섹션의 용도는 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 각 부차 섹션은 임의의 본 발명의 양상에 적용할 수 있을 것이다. 본 출원에서, "또는" 의 사용은 다르게 언급되지 않는 한 "및/또는" 을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 용어의 변형, 예컨대 "포함하는" 및 "포함" 은 기타 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
IL -6 및 IL -6Rα 와 gp130 과의 상호작용
IL-6 신호는 IL-6 수용체 α (IL-6Rα) 서브유닛 및 gp130, IL-6 에서 STAT3 으로의 신호를 전달하는 막통과 수용체 단백질과의 상호작용에 의해 일어나고, 그 다음 이것은 다양한 유전자의 전사를 활성화시키는 것으로 이해된다. 신호 복합체의 세포외 부분의 구조는 결정되었다 (Boulanger et al., (2003), Science, 300:2101, 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨). 상기 구조는 신호 복합체가 IL-6 2 카피, IL-6Rα 서브유닛 2 카피, 및 gp130 2 카피를 함유하는 것을 나타낸다. 또한 구조 분석은 부위 I, II 및 III 으로 공지된 3 개의 보존된 에피토프를 통해 IL-6 이 gp130 수용체에 결합하는 것을 나타낸다. IL-6 은 먼저 부위 I 을 통해 IL-6Rα 와 복합체를 형성해야만 한다. 부위 II 는 IL-6 및 IL-6Rα 의 2원 복합체에 의해 형성된 복합 에피토프이고, 이것은 gp130 의 사이토킨 결합 영역 CHR 및 D2D3 과 상호작용한다. 이어서, 부위 III 은 gp130 면역글로불린-유사 활성화 도메인 (D1 또는 IGD) 과 상호작용하여 적격 (competent) 신호 6량체 복합체를 형성한다 (Boulanger et al., (2003) Science, 300:2101, 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨). IL-6 의 부위 I 결합 에피토프는 A 및 D 나선에 위치하고 IL-6Rα 와 반응한다. 6량체 중에 남아있는 4 개의 독특한 단백질-단백질 경계면은 2 개의 복합 부위, 부위 II 및 III 내로 분리될 수 있다. 6량체 복합체의 3차원 구조의 연구는 다수의 IL-6 의 잔기가 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용에 참여하고, 이에 중요하다는 것을 밝혔다. 이러한 잔기에는 Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 및 Trp157 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
그러므로, 6량체 복합체 형성의 효과는 gp130 를 이량체화하고, 그의 세포내 도메인을 병렬시켜, 신호가 세포내 수준에서 지속된다. IL-6Rα 서브유닛은 세포내 도메인을 가지지 않으며, 오직 복합체를 안정화시키는 것만 담당한다. 포유류 IL-6 은 IL-6Rα 의 부재하에서 gp130 에 결합할 수 없다. 정규의 IL-6Rα 서브유닛은 3 개의 세포외 도메인 및 IL-6Rα 서브유닛을 발현 세포의 막에 고정시키는 막통과 영역을 갖는다. "가용성 IL-6Rα" 또는 "sIL-6Rα" 는 IL-6Rα 서브유닛의 세포외 부분을 가지나, 막통과 분절은 결핍된 단백질을 의미한다. 막통과 분절이 결핍된 sIL-6Rα 변이체 단백질은 IL-6Rα 를 코딩하는 대안적으로 스플라이싱된 mRNA 의 번역에 의해, 또는 IL-6Rα 의 막-결합 형태의 단백질 가수분해 분할에 의해 발생될 수 있다.
sIL-6Rα 는 혈청에 존재하고, 또한 IL-6 을 발현하는 동일한 세포에 의해 분비될 수 있다. IL-6 은 sIL-6Rα 와 복합체를 형성한다. 일단 IL-6/sIL-6Rα 복합체가 형성되면, 이것은 상당히 안정하고, IL-6/sIL-6Rα 상호작용과 경쟁 하는 항체에 의해 결합될 수 있다. IL-6/sIL-6Rα 복합체는 IL-6 단독과 비교해 유의하게 확장된 혈청 반감기를 갖는다. 체내의 특정 세포, 예컨대 B 세포만이, IL-6Rα 및 gp130 모두를 갖는 반면, 많은 부가적인 세포는 오직 gp130 만을 갖는다. IL-6/sIL-6Rα 복합체는 오직 gp130 만을 갖는 세포에 결합할 수 있고 신호 전달을 자극할 수 있다. 그 결과, 많은 세포에 대한 gp130 의 바람직하지 않은 활성화는 IL-6 과생산을 산출할 수 있다 (도 1A). 그러므로, IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 항체 또는 기타 분자는 바람직하지 않은 IL-6 신호를 억제하는데 특히 유용할 수 있다 (도 1B 참조).
IL -6 길항제는 gp130 과의 상호작용을 입체적으로 차단함
그러므로, 도 1B 에서 제시된 바와 같이, 본 발명은 gp130 과의 상호작용을 입체적으로 차단하고 IL-6 에 대한 그의 결합이 미리 결합된 sIL-6Rα 에 의해 영향을 받지 않는, IL-6 길항제를 고려한다. 본 발명의 "IL-6 길항제" 에는 항체 또는 그의 조각; 항체의 기능적 등가물; 변형 항체, 예컨대, 단일 사슬 항체, 키메라성 항체; 또는 gp130 에 대한 결합을 입체적으로 방해하기 위해 IL-6 또는 IL-6/IL-6Rα 복합체와 결합 또는 회합할 수 있는 기타 단백질 또는 분자가 포함된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 IL-6 길항제는 IL-6 또는 IL-6/IL-6Rα 복합체 상의 영역 또는 에피토프에, 결합이 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 식으로 결합하는 항체 가변 영역을 함유한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 IL-6 길항제는 항체이다. 예를 들어, IL-6/IL-6Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용에 직접적으로 참여하는 임의의 영역 또는 에피토프에 대한 항체 가변 영역의 결합은 gp130 에 대한 결합을 입체적으로 방해하기에 충분하다. 또한, 상호작용에 직접적으로 참여하는 것들에 인접한 임의의 영역 또는 에피토프에 대한 결합은 또한 IL-6/IL-6Rα 와 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하기에 충분할 수 있다. 이러한 영역 또는 에피토프는 IL-6, IL-6Rα 상에, 또는 IL-6 과 IL-6Rα 의 복합체에 의해 오직 형성된 복합 부위로서 존재할 수 있다. 특히, 결합이 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단할 수 있기에 적합한 에피토프에는 하기 아미노산: 인간 IL-6 의 Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 및 Trp157 중 하나 이상을 포함하는 임의의 에피토프가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
항체의 발생은 IL -6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단함
그러므로, 본 발명의 하나의 중요한 특성은 IL-6/IL-6Rα 복합체에 결합하고, IL-6/gp130 상호작용을 입체적으로 차단하는 항체의 단리이다. 이러한 항체는 폴리클론 또는 단일클론일 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 항체는 하기 방법에 의해 발생될 수 있다. 제 1 단계에서, 마우스, 래트, 래빗, 또는 기타 포유류를 IL-6 및 IL-6Rα 를 포함하는 단백질 조성물로 면역화시킨다. IL-6 및 IL-6Rα 가 복합체를 형성하게 하는 것이 바람직하다. 복합체의 형성을 용이하게 하기 위해, IL-6 및 IL-6Rα 는 예를 들어, 화학적 가교 또는 폴리펩티드 연결자를 통한 연결에 의해 공유결합될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 이러한 면역화의 목표는 IL-6 의 오직 노출된 표면만이 gp130 에 결합된 표면 또는 비-중화 표면이 되는 것이다. IL-6Rα 에 의해 입체적으로 차단되는 항체가 발생되 지 않아야 한다. 특히 바람직한 면역원에는 공유 결합된 IL-6 및 가용성 IL- 6Rα 가 포함되고, 이것은 IL-6 및 IL-6Rα 시험관 내 결합시킨 다음, 표준 절차에 따른 화학적 가교제로 처리하거나, 또는 바람직하게는 예를 들어 Peters et al. (J. Immunol ., (1998) 161:3575-81, 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨) 에 기재된 바와 같은 연결자에 의해 부착된, 융합 단백질로서 IL-6 및 가용성 IL-6Rα 를 발현시켜 만들어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 전형적으로, IL-6 및 IL-6Rα 를 포함하는 면역원 융합 단백질에는 또한 항원 제시를 용이하게 하는 부가적인 부분, 예컨대 Fc 영역이 포함된다. 단백질 조성물은 또한 다양한 표준 방법 중 임의의 것에 따른 면역보강제의 유무하에서 포유류에 투여될 수 있다. 조성물은 오직 1 회 투여될 수 있으나, 바람직하게는 표준 추가접종 스케줄에 따라 1 회 초과로 투여된다.
제 2 단계로서, 폴리클론 항혈청을 면역화된 포유류로부터 수확한다. 폴리클론 혈청은 직접적으로 사용될 수 있거나, 표준 방법에 따라 친화성-정제될 수 있다. 대안적으로는, 단일클론 항체의 발생 방법이 개시된다. 항체-생성 세포는 면역화된 동물로부터, 예를 들어 비장의 수술적 제거 또는 PBMC 의 회수 및 연이은 분류에 의해 제거된다. 그 다음 잠재적인 항체-생성 세포는 표준 절차에 따라 불멸화 세포주와의 융합에 의해 불멸화되고, 마이크로티터 웰 내에 클로닝하고, 면역원에 결합하는 항체의 생성에 대해 스크리닝된다.
제 2 단계로서, 또다른 구현예에서, 디스플레이 라이브러리는 비-면역화 또는 면역화 동물로부터 적합한 세포의 단리 후 항체 V 영역을 코딩하는 핵산의 단 리, V 영역-코딩 핵산의 파지, 효모, 박테리아, 또는 기타 복제가능한 유전적 디스플레이 시스템 내로의 삽입에 의해 발생된다. 그 다음 라이브러리 일원은 IL-6/IL-6Rα 복합체에 결합하는 그들의 역량에 대해 스크리닝된다.
제 3 단계로서, 일부 구현예에서, 단일클론 세포주에 의해 생성되는 항체 또는 라이브러리로부터 선택된 항체 V 영역은 임의로 하기와 같이 제 2 차 스크리닝에 적용된다. 구체적으로, 항체 클론 또는 항체 V 영역은 IL-6 단독에 결합하는 능력, IL-6Rα 단독에 결합하는 능력, IL-6/IL-6Rα 복합체 단독에 결합하는 능력, 및 IL-6/IL-6Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 이러한 시험 결과로부터, 항체 또는 항체 V 영역은 여러 군으로 분류될 수 있다: IL-6 에 결합하고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 중화 항체, IL-6Rα 에 결합하는 항체, IL-6 에 결합하는 비-중화 항체, IL-6/IL-6Rα 복합체에 결합하나 IL-6 또는 IL-6Rα 단독에 결합하지 않고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 중화 항체, 및 IL-6 에 결합하고 IL-6Rα 와의 상호작용을 차단하는 중화 항체. 마지막을 제외한 각 계열의 항체가 예상된다. 이러한 결합 및 신호 검정법은 단백질 생화학 및 신호 전달 분야에서 잘 공지되어 있으며, 특정 구현예가 실시예에서 추가로 상세화된다.
항체의 동정은 IL - 6 의 혈청 반감기를 유의하게 확장하지 않음
항-IL-6 항체의 하나의 바람직하지 않은 효과는 이들이 종종 IL-6 의 혈청 반감기를 연장한다는 것이다. IL-6 의 분자량은 약 25,000 달톤이고, 이것은 50,000 달톤의 콩팥 제거율 역치의 상당히 미만인 반면, 항체-IL-6 복합체의 분자 량은 150,000 달톤 초과이다. 항-IL-6 항체/항원 복합체의 형성은 복합체의 분자량이 콩팥 제거율 역치보다 훨씬 더 크기 때문에 일반적으로 IL-6 의 혈청 반감기를 연장하는 효과를 갖는다. 그러므로, 본 발명은 또한 IL-6 또는 IL-6/IL-6Rα 복합체에 결합하나 IL-6 의 혈청 반감기를 유의하게 확장하지 않는 항체를 확인하는 방법을 제공한다.
제 1 단계로서, 방법에는 항-IL-6 항체의 패널 단리가 포함된다. 제 2 단계로서, 그 다음 항체를 예를 들어 하기와 같이, IL-6 혈청 반감기에 대한 효과에 대해 시험한다. IL-6 을 설치류와 같은 동물에게 투여한다. 방사능 IL-6 과 같은, 표지된 형태의 IL-6 을 사용하는 것이 편리하다. 시험되는 항체는 또한 바람직하게는 상이한 경로의 투여에 의해, 동일한 동물에게 투여된다. 음성 대조군으로서, PBS 는 항체 또는 IL-6 대신에 투여된다. 혈청 샘플을 단백질 투여 후 다양한 시간에 수득하고, 표준 기술에 따라 IL-6 및 항체 수준에 대해 시험하였다. 예를 들어, 방사능표지, 요오드화된 IL-6 은 방사능 계수기를 사용하여 정량화될 수 있고, 항체는 IL-6 포획에 근거한 ELISA 법에 의해 검출될 수 있다.
일부 항체는 다른 것과 비교해 확장된 약동학적 프로파일을 가지며, 일부 항체는 IL-6 의 약동학을 향상시키는 반면, 다른 항체는 적당한 확장 또는 본질적으로 전혀 확장시키지 않는다는 것으로 고려된다. 특정 적용에 따라, 본 발명의 바람직한 항체의 하나의 계열은 호의적인 약동학적 프로파일을 가지나, IL-6 의 약동학적 프로파일을 유의하게 확장하지 않는 것들이다.
항체 가변 영역의 서열
상기 기재된 방법에 따라 확인된 항체 V 영역의 서열은 당업계에 공지된 표준 서열분석 방법을 사용하여 특징화된다. 예시적 방법은 실시예 4 에 상세히 기재되어 있다. IL-6 에 결합하고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 항체 중쇄 및 경쇄 V 영역의 예시적 서열은 도 2 에 제시된다. 도 2 는 또한 본 발명의 방법에 따라 확인된 항체 V 영역 서열의 정렬을 예증한다. 서열 중의 위치 변화는 화살표로 표시된다. CDR 영역은 박스로 되어 있다.
본 발명의 V 영역은 인간 불변 영역과 배열되어 키메라성 항체를 형성할 수 있다. 예시적 키메라성 항체에는 도 2 에 기재된 VH 및 VL 영역 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, 또는 IgM 유래의 불변 영역이 포함될 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 항체는 PCT 공개 WO 02/072605 (이의 개시는 본원에 참조로서 인용됨) 에 기재된 바와 같이, 잡종 동종형 불변 영역과 함께 발현될 수 있다. 본 발명의 V 영역은 또한 Fab 부분, CH2 도메인이 결핍된 "미니체" 로서, 또는 단일-사슬 Fv 부분으로서 배열될 수 있다. 상기 후자의 배열은 전체 항체보다 작고, 향상된 확산 특성을 가지며, 이것은 효과적인 조직 침투가 필요한 상황, 예컨대 IL-6 을 분비하는 종양의 치료에 유용할 수 있다.
발현
본 발명의 항체 가변 영역을 함유하는 항체 및 단백질은 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 NS/0 세포, CHO 세포, SP2/0 세포, BHK 세포, 또는 기타 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 세포 중의 항체의 발현은 단백질 공학 분야에서 잘 알려져 있다. 항체는 또한 식물 세포, 예컨대 옥수수 또는 담배, 곤충 세포, 예컨대 배큘로바이러스 벡터를 통해, 진균 세포, 예컨대 S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 또는 더 작은 배열, 예컨대 단일-사슬 Fv 분자를 발현하는데 가장 유용한 박테리아 세포에서 발현될 수 있다.
투여
본 발명의 IL-6 길항제는 IL-6 의 발현이 관여되는 다양한 질환 및 장애의 치료에 사용된다. 이러한 질환 및 장애에는 암, 예컨대 호르몬-비의존적 전립선 암, B-세포 증식성 장애, 예컨대 B 세포 비-호지킨 림프종, 및 신장, 유방, 결장, 폐, 뇌, 및 기타 조직의 진행된 암; 항체-유래 자가면역 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 중증근육 무력증, 전신 홍반 루프스, 및 기타 자가면역 질환; 또는 골다공증이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 분자는 또한 종종 종양에 의한 IL-6 및 IL-6Rα 의 과생산을 산출하는, 암환자에서의 카켁시아를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 길항제는 면역억제의 표적-관련 부작용, 특히 항체 형성의 억제를 야기할 수 있다. 환자가 본 발명의 항체를 수여받는 경우, 종종 예방 항-감염제로의 치료를 보충하는 것이 유용하다. 이러한 예방 치료는 면역억제 환자 치료의 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 길항제는 전형적으로 주입에 의해 투여되나, 또한 피하, 피내, 근육내, 또는 복막내 주사, 흡입, 또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 70 ㎏ 성인에 대해, 투여량은 약 50 내지 2000 ㎎ 범위가 바람직하고, 100 내지 800 ㎎ 의 범위의 투여량이 더욱 바람직하고, 약 300 내지 600 ㎎ 의 투여량이 가장 바람직하다.
정확한 투여량은 개별 환자에 근거해서 조정될 것이다. 예를 들어, 고체 종양 환자를 치료하는 경우, 제시된 투여량의 유효성은 하기와 같이 평가될 수 있다. 본 발명의 항체 투여 후 다양한 지점에서, 종양의 생검을 채취하여, 예를 들어 적합한 항-포스포티로신 항체로 면역염색하여 gp130 활성화를 시험한다. 목표는 종양 중의 gp130 활성화의 지속적인, 본질적으로 완전한 억제를 갖는 것이다. gp130 활성화의 억제가 완전하지 않은 경우, 투여량이 증가될 수 있거나, 투여 빈도가 증가될 수 있다.
상기 기재된 구현예 및 하기 실시예가 제한이 아닌, 예증의 방식으로 제시된 것임을 이해해야만 한다. 본 발명의 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 본 기재로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
실시예 1. 항원으로 사용하기 위한 IL -6/ IL -6Rα 복합체의 발현
IL-6 의 표면에 결합하고 gp130 에 대한 결합을 방해하고 IL-6/IL-6Rα 복합체에 접근하기 쉬운 항체를 생성하기 위해, Fc 도메인, IL-6Rα 의 세포외 도메인, 및 IL-6 을 포함하는 융합 단백질을 pdCs-Fc-IL6Rα-IL6 이라고 불리는 플라스미드로부터 발현시켰다. 이제부터 융합 단백질을 Fc-IL6Rα-IL6 이라고 부른다. Fc 도메인은 마우스 IgGγ2a 유래였고, IL-6Rα 및 IL-6 은 인간 서열에 기초하였다. 상기 단백질의 서열 및 상기 단백질을 코딩하는 DNA 는 하기 제시된다.
Fc - IL6R α- IL6 의 단백질 서열 ( SEQ ID NO :37):
Figure 112008054773884-PCT00007
밑줄쳐진 서열: 쥣과 Fc IgGγ
소문자: 엔테로키아나제 분할 부위를 함유하는 연결자
굵은 글씨체 서열: 인간 IL6Rα
밑줄쳐진 소문자 서열: 연결자
이태리체 서열: 인간 IL6
성숙 Fc - IL6R α- IL6 을 코딩하는 DNA 서열 ( SEQ ID NO :38):
Figure 112008054773884-PCT00008
Figure 112008054773884-PCT00009
Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질 생성물을 특징화하기 위한 단백질 발현의 신속한 분석을 위해, 플라스미드 pdCs-Fc-IL6Rα-IL6 을 리포펙타민 (Invitrogen) 을 사용하는 일시적 트랜스펙션에 의해 인간 배아 신장 HEK 293 세포 (ATCC# CRL-1573) 내에 도입하였다.
Fc-IL6Rα-IL6 을 발현하는 안정하게 트랜스펙션된 클론을 수득하기 위해, 적합한 플라스미드 DNA 를 전기천공에 의해 마우스 골수종 NS/0 세포 내로 도입하였다. NS/0 세포를 10% 열-불활성화 우태혈청, 2 mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 에서 성장시켰다. 약 5x106 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 0.5 ml PBS 에 재현탁하였다. 그 다음 10 μg 의 선형화된 플라스미드 DNA 를 빙상에서 10 분 동안 Gene Pulser® Cuvette (0.4 cm 전극 갭, BioRad) 중에서 세포와 인큐베이션시켰다. 0.25 V 및 500 μF 의 설정으로 Gene Pulser® (BioRad, Hercules, CA) 을 사용하여 전기천공을 수행하였다. 세포를 빙상에서 10 분 동안 회복시키고, 그 후 이들을 성장 배지에 재현탁하고, 2 개의 96 웰 플레이트 상에 깔았다. 트랜스펙션-후 2 일에 성장 배지에 첨가된 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재하에서의 성장에 의해 안정하게 트랜스펙션된 클론을 선별하였다. 세포에 매 3 일 2 내지 3 회 이상 영양공급하고, MTX-저항성 클론은 2 내지 3 주에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 항-Fc ELISA 로 검정하여 고 생산자를 확인하였다. 고 생상 클론을 단리하고, 100 nM MTX 를 함유하는 성장 배지에서 증식시켰다. 전형적으로 사용된 성장 배지는 H-SFM 또는 CD 배지 (Life Technologies) 였다.
그 다음 Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질을 추가 분석을 위해 매질로부터 포획하였다. 젤 전기영동에 의한 정규적 특징화를 위해, 배지 내로 분비된 Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질을 단백질 A Sepharose® 비이드 (Repligen, Cambridge, MA) 에 포획한 다음, β-메르캅토에탄올과 같은 환원제의 유무하에서, 단백질 샘플 완충액에서 샘플을 끓여 용리하였다. 샘플을 SDS-PAGE 로 분석하고, 단백질 밴드를 코마시 (Coomassie) 염색으로 가시화하였다.
다양한 단백질 중 임의의 것이 상기 기재된 Fc-IL6Rα-IL6 단백질에 대한 대안으로 사용될 수 있을 것임이 당업자에게 인지될 것이다. 예를 들어, IL-6Rα 및 IL-6 의 다른 배열이 사용될 수 있다, 예컨대 IL-6Rα-IL-6-Fc, 알부민-IL-6Rα-IL-6, 사이토카인-IL-6Rα-IL-6, 여기서 사이토카인은 IL-6/IL-6Rα 복합체에 대항해 면역 반응을 자극하기 위해 선택된다. 사이토카인, Fc 부분, 및 IL-6Rα/IL-6 복합체를 포함하는 단백질이 또한 예를 들어, Gillies et al. 의 방법에 따라 사용될 수 있다 (WO01/07081, 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨). 마지막으로, IL-6 및 IL-6Rα 는 개별적으로 생성되고, 화학적으로 가교되고, 항원으로 사용될 수 있다. Fc 부분 및/또는 2 차 사이토카인 부분이 사용되는 경우, 동물로부터의 이러한 부분이 면역화되는 것이 일반적으로 유리하다 (예컨대 마우스).
하기 기재된 항체의 특징화를 위한 제조시, Fc-IL6 및 Fc-IL6Rα 를 코딩하는 DNA 는 상기 기재된 바와 유사하게 구축되었다. 해당하는 단백질을 상기 기재된 바와 유사하게 정제하였다. 또한, 인간 IL-6, 인간 IL-6Rα, 및 인간 gp130-Fc 는 하기 특정 실험에서 사용하기 위해 R&D Systems, Inc. 에서 구입하였다. 실험에서 사용된 상기 단백질의 도식이 도 3 에 제시된다. 단백질 및 관련 구조물의 DNA 서열은 하기 제시된다.
성숙 Fc - IL6R α ( SEQ ID NO :39)
Figure 112008054773884-PCT00010
성숙 Fc - IL6R α 를 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :40)
Figure 112008054773884-PCT00011
성숙 Fc - IL6 ( SEQ ID NO :41)
Figure 112008054773884-PCT00012
Figure 112008054773884-PCT00013
성숙 Fc - IL6 을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :42)
Figure 112008054773884-PCT00014
실시예 2. IL -6/ IL -6Rα 복합체로의 면역화.
20 마리 마우스 (Balb/C) 를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조된 Fc-IL6Rα-IL6 단백질로 면역화하고, 상기 단백질에 대한 단일클론 항체를 Kohler and Milstein 법 (1975) (Nature, 256:495-7) 의 변형에 따라 제조하였다. 구체적으로, 1 ㎍ 의 Fc-IL6Rα-IL6 을 100 ㎕ 의 완전 프로인트 (Freund's) 면역보강제 로 피하 주사하였다. 100 ㎕ 의 불완전 프로인트 면역보강제로 복막내 주사된 1 ㎍ 의 단백질을 사용하여, 주사를 14 일 후에 반복하였다. 첫번째 주사 24 일 후, 마우스를 100 ㎕ 의 PBS 중에 1 ㎍ 의 Fc-IL6Rα-IL6 단백질로 정맥내 추가접종하였다. 3 일 후 마우스를 희생시키고, 비장을 절개하고, 비장 세포를 표준 절차에 따라 배양하였다. 강한 폴리클론 항-IL6Rα/IL6 반응을 보이는 2 마리 마우스로부터의 435 ×106 비장 세포를 175 ×106 NS/0 세포와 2.4 비장 세포 대 1 NS/0 세포의 비율로 융합하였다. 불멸화된 B 세포/NS/0 세포 잡종을 표준 절차에 따라 제조한 다음, 하이브리도마를 ELISA 기술을 사용하는 Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질에 대한 항체의 제조에 대해 스크리닝하였다.
실시예 3. IL -6/ IL -6Rα 복합체와 qp130 사이의 상호작용을 차단하는 항체의 스크리닝
결합
실시예 2 로부터의 양성 클론을 하기와 같이 추가로 시험하였다. 항체의 동종형을 결정하고, IgM-기재 클론은 추가로 특징화하지 않았다. IgG-기재 단일클론 항체를 표준 절차에 따라 면역화된 Fc-IL6 및 Fc-IL6Rα 를 사용하여 IL-6 또는 IL-6Rα 에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 일부 클론은 IL-6 에 결합되고, 일부는 IL-6Rα 에 결합되고, 일부는 어느 단백질에도 결합되지 않는 것은, 단일클론이 연결자의 일부분을 인지할 수 있거나, IL-6 및 IL-6Rα 부분으로 모두 이루어진 복합체 에피토프를 인지할 수 있을 것임을 암시된다.
본 발명의 전형적인 항체의 결합 특성의 예시적 결과는 도 4 (Fc-IL6Rα-IL6 에 대한 결합), 도 5 (IL-6 에 대한 결합), 도 6 (비-공유적으로 복합체를 형성한 IL-6 및 IL-6Rα 에 대한 결합), 및 도 7 (IL-6Rα 단독) 에 제시된다. 결과는, 상기 세트의 항체에 대해, IL-6 및 공유 결합된 IL-6 및 IL-6Rα 에 대한 결합이 유사하고, 비-공유 IL-6/IL-6Rα 복합체에 대한 결과는 덜 강한 신호를 제공하고 (가능하게는 세정 단계 중의 IL-6R 로부터의 IL-6 의 해리때문), IL-6Rα 단독에 대한 결합이 검출될 수 없었다는 것을 나타낸다.
경쟁 시험
IL-6 을 인지하는 항체를 더욱 특징화하기 위해, 하기 경쟁 시험을 수행하였다. 첫번째로, Fc-IL6Rα-IL6 과 gp130-Fc 사이의 상호작용을 억제하기 위한 단일클론 항체의 능력을 시험하였다. 억제 검정법을 [Scheller et al. J. Immuno. Methods, 291:93-100 (2004), 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨] 에 기재된 방법에 근거해 수행하였다. Mab#195, Mab#309, Mab#471, 및 Mab#476 으로 명명된 4 개의 항체는 상기 상호작용을 차단한 것으로 확인되었다. 두번째로, 항체에 의한 Fc-IL6 과 Fc-IL6Rα 사이의 상호작용의 억제를 시험하였다. 항체 중 어느 것도 상기 상호작용을 억제하는 것으로 발견되지 않았으며, 이것은 항체가 Fc-IL6Rα-IL6 으로의 면역화로부터 유래하고, Fc-IL6Rα-IL6 에 대한 결합에 대한 초기 스크리닝을 한다는 사실에 근거해 예상되었다.
Fc-IL6Rα-IL6 과 gp130-Fc 사이의 상호작용의 억제를 예증하는 전형적인 결과는 도 8 에 제시된다.
세포-기재 검정법
항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471, 및 Mab#476 을 Fc-IL6Rα-IL6 복합체로 자극받은 HepG2 세포로부터의 합토글로빈 방출을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 합토글로빈은 염증 상태 동안 간 세포에 의해 분비되는 단백질이다. HepG2 세포는 간 세포주이다. HepG2 세포로부터의 합토글로빈의 방출은 IL-6Rα/IL-6 복합체의 활성에 대한 편리한 생물학적 검정법을 제공한다.
검정법을 하기와 같이 수행하였다. HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 0.1 x 106 세포로 깔고, 10% 우태 혈청 (FBS) 이 보충된 DMEM 배지에서 밤새 성장시켰다. 그 다음 세포를 PBS 로 세정하고, 단식 배지 (starving medium), FBS 가 없는 DMEM 에서 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 세포를 8 ng/ml Fc-IL6Rα-IL6 복합체의 존재하의 자극 배지, DMEM (FBS 없음) 에서 인큐베이션시키고, 다양한 농도의 시험 항체를 22 시간 동안 보충하였다. 상청액을 제거하고, 합토글로빈의 수준을 합토글로빈 검출을 위해 ELISA 에 의해 측정하였다. 포획을 위해 염소 항-인간 합토글로빈 항체 (Sigma #H5015), 마우스 항-인간 합토글로빈 항체 (US Biological #H1820-05) 를 1 차 항체로서, 항-마우스 IgG-HRP 항체 (Promega #W402B) 를 2차 항체로서 사용하여, 표준 ELISA 절차를 뒤따라 수행하였다. 전형적인 결과를 도 9 에 제시한다.
Biacore 분석
IL-6 에 대한 항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471, 및 Mab#476 의 결합을 Biacore 기계를 사용하여 정량적으로 특징화하였다. 항체를 칩에 고정하고; IL-6 단백질을 칩에 통과시키고, 온-비율 및 오프-비율을 측정하였다. 하기 결과를 수득하였다.
Figure 112008054773884-PCT00015
암 세포주의 증식의 억제.
본 발명의 항체를 A431 세포 및 LP-1 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. LP-1 세포의 증식의 억제는 실시예 8 에 기재되어 있다. A431 의 증식의 억제는 하기와 같이 측정되었다. 세포를 96-웰 플레이트에 10% FBS 함유 DMEM 중 25,000 세포/웰로, 웰 당 200 ㎕ 로 깔았다. 제 3 일에, 세포를 200 ㎕ 의 PBS 로 1 회 세정하였다. 세포를 37 ℃ 에서 100 ㎕ 의 DMEM 중 1 시간 동안 단식시켰다.
제 3 일에, 항-IL-6 항체의 희석액을 IL6Rα-IL6-His6 함유 DMEM (33 ng/ml) 중 96 U-바닥 플레이트에서 제조하였고, 모든 단백질은 후에 세포를 함유하는 플레이트에 옮기기 때문에 2X 희석액으로 제조하였다. 대조군에는 DMEM, DMEM-1 % FBS, 및 0% FBS 중 IL6Rα-IL6-His6 이 포함되었다. 플레이트를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 단백질의 희석액으로 인큐베이션하고, 그 후 100 ㎕ 의 단백질 혼합물을 단식된 세포로 옮겼다.
제 5 일에, 각 웰 중의 세포를 200 ㎕ 의 PBS 로 2 회 그 다음, 산 포스파타아제를 측정하기 위한 100 ㎕ 의 용액으로 세정한다. 용액은 0.1 M 나트륨 아세테이트 pH 5.5, 0.1 % Triton X-100, 2.5 mg/ml 파라니트로페닐포스페이트였다. 플레이트를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 반응을 100 ㎕ 의 0.1 N NaOH 로 중지시키고, 플레이트를 410 nm 에서 판독하였다.
전형적인 결과를 도 10A, 10B1 및 10B2 에 예증하였다. 도 10B-1 및 10B-2 에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질에 의한 자극으로 나타나는 A431 인간 상피 암종 세포의 증식을 억제한다. IL-6/IL-6Rα 융합 단백질에 의해 자극된 A431 세포의 증식의 전형적인 결과는 도 10A 에 제시된다.
실시예 4. IL -6 에 결합하고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 항체의 V 영역 서열.
단일클론 항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471, 및 Mab#476 의 V 영역 서열을 표준 절차에 따라 측정하였다. 각 하이브리도마 클론의 mRNA 를 제조사의 지침에 따라 Dynabeads Direct mRNA 키트 (Dynal) 를 사용하여 정제하였다. 역-전사 PCR (RT-PCR) 을 수행하여 제조사의 매뉴얼에 따라 BD SMART™ cDNA 합성 키트 (BD Clontech) 를 사용하여 cDNA 를 수득하였다. 주형으로 cDNA, 포개진 올리고뉴클레오티드 및 제조사에 의해 지시된 폴리머라아제 KOD (EMD Biosciences) 를 사용하여 2 회의 연속 PCR 을 수행하였다. 3' 올리고뉴클레오티드는 마우스 IgGγ1 항체의 VH 및 Vk 를 증폭하기에 특이적인 반면, 5' 올리고뉴클레오티드는 BD SMART ™ cDNA 합성 키트 (RT-PCR 동안 5' 에 첨가된 서열) 로부터 포개진 올리고뉴클레오티드였다.
예를 들어, 중쇄 및 경쇄 V 영역은 올리고뉴클레오티드 서열을 가진 불변 영역 프라이머 및 V 영역 프라이머 및 하기 지시된 조건을 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득되었다.
VH 증폭:
Figure 112008054773884-PCT00016
Vk 증폭:
Figure 112008054773884-PCT00017
PCR 생성물을 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN) 를 사용하여 아가로오스 젤로 부터 정제하고, 서열분석을 위해 TOPO 블런트 pCR4 벡터 (Invitrogen) 내로 서브클로닝하였다. 서열을 프라이머 T7 및 T3 및 표준 서열분석 절차를 사용하여 수득하였다.
Mab#195, Mab#309, Mab#471, 및 Mab#476 의 V 영역 서열을 포함하는 경쇄 및 중쇄 서열을 하기에 제시한다.
MAb #195 VH 성숙 영역 ( SEQ ID NO :33)
Figure 112008054773884-PCT00018
MAb #195 VK 성숙 영역 ( SEQ ID NO :29)
Figure 112008054773884-PCT00019
MAb #309 VH 성숙 영역 ( SEQ ID NO :34)
Figure 112008054773884-PCT00020
MAb #309 VK 성숙 영역 ( SEQ ID NO :30)
Figure 112008054773884-PCT00021
MAb #471 VH 성숙 영역 ( SEQ ID NO :35)
Figure 112008054773884-PCT00022
MAb #471 VK 성숙 영역 ( SEQ ID NO :31)
Figure 112008054773884-PCT00023
MAb #476 VH 성숙 영역 ( SEQ ID NO :36)
Figure 112008054773884-PCT00024
MAb #476 VK 성숙 영역 ( SEQ ID NO :32)
Figure 112008054773884-PCT00025
mAb #195 VH 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :51)
Figure 112008054773884-PCT00026
mAb #195 VK 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :52)
Figure 112008054773884-PCT00027
mAb #309 VH 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :53)
Figure 112008054773884-PCT00028
mAb #309 VK 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :54)
Figure 112008054773884-PCT00029
mAb #471 VH 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :55)
Figure 112008054773884-PCT00030
mAb #471 VK 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :56)
Figure 112008054773884-PCT00031
mAb #476 VH 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :57)
Figure 112008054773884-PCT00032
Figure 112008054773884-PCT00033
mAb #476 VK 성숙 영역을 코딩하는 DNA ( SEQ ID NO :58)
Figure 112008054773884-PCT00034
V 영역의 서열을 도 2 에 제시된 바와 같이 정렬하였다. 서열 중의 위치 변화는 화살표로 표시한다. CDR 영역은 박스로 되어 있다. 정렬에 근거해서, 각 항체는 독립된 단리물로 표현되고, 항체는 서로 유사한 것으로 나타난다. 항체 309 및 471 은 가깝게 관련되어 있고, 경쇄 중에 오직 하나의 치환, 위치 98 에서 Ile/Val 치환; 및 중쇄 중에 오직 6 개의 치환이 있다. 이러한 항체는 체세포 돌연변이를 통해 변화되어, 진정으로 독립적일 수 없는 기원 IgM 클론으로부터 유래될 수 있다.
항체 195 및 476 은 항체 309 및 471 보다 서로 더욱 유사하다. 항체 195 및 476 은 경쇄 중의 5 위치 및 중쇄 중의 18 위치가 상이하다. 항체 195 및 476 의 중쇄 중의 CDR3 의 분석은 이러한 사슬이 독립적인 V-D-J 연결화 사건에 의해 형성되어, 독립적인 IgM 부모로부터 유래된 항체를 나타낸다는 것을 암시하였다. 그러므로, 도 2 중의 항체 서열은 인간 IL-6 에 결합하고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 항체의 3 개 이상의 독립적인 선별을 나타낸다.
실시예 5. IL -6 에 결합하고 gp130 과의 상호작용을 차단하는 항체의 약동학적 특성.
마우스의 항체 195 및 476 의 혈청 반감기를 측정하였다. 항체 195 및 476 을 표준 절차에 따라 125I 로 표지하였다. 약 25 ㎍ 의 표지된 항체 단백질을 Balb/C 마우스에 정맥 주사하고, 주사 후 12, 24, 48, 및 72 시간을 포함하는 다양한 시간에 혈액 샘플을 채취하였다. 총 혈액 샘플 중의 방서능활성의 수준을 측정하였다. 상기 분석에 근거하여, 반감기의 제거는 각 항체에 대해 약 5 일이었다. 예시적 데이터를 도 11 에 제시한다.
실시예 6. 합토글로빈 분비의 생체 내 억제
본 발명의 항체를 수용체 서브유닛 gp130 에 대한 IL-6 의 결합을 억제하는 능력에 대해 특이적으로 선별하였다. 상기 실험에서, 가용성 IL-6Rα/IL-6 복합체의 투여에 의해 유도된 합토글로빈 분비를 측정하는 검정법을 사용하여, gp130-의존적 경로의 활성화를 생체 내 차단하는 시판 항 IL-6 항체 및 항체 Mab#471 의 능력을 비교하였다.
제 0 일에, 9주령 암컷 Balb/C 마우스 (치료군 당 n=3) 에 항체 Mab#471 또는 R&D Systems 로부터의 항-IL-6 시판 항체 (R&D Systems MAb #206) 100 μg 을 200 μl 부피로 복막내 주사하였다. 양성 및 음성 대조군의 마우스에 200 μl PBS 를 수여하였다. 24 시간 후, 실험군 및 양성 대조군의 마우스에 4 μg muFc-IL6Rα-IL6 을 200 μl 부피로 복막내 투여하여 합토글로빈 분비를 유도하고, 음성 대조군의 마우스에 200 μl PBS 를 투여하였다. 처리 후 0, 8, 및 24 시간에, 대략 100 μl 의 혈액을 각 마우스로부터 후와 (retro-orbital) 출혈에 의해 수득하고, 혈장 분획을 단리하였다. 혈장 분획 중의 합토글로빈 농도를 제조자의 지침에 따라, 쥣과 합토글로빈 ELISA 키트 (Immunology Consultants Laboratory, Inc., Newberg, OR, Cat # E90HPT) 를 사용하여 측정하였다.
도 12 에서 제시되는 바와 같이, 항체 Mab#471-처리된 마우스 중의 합토글로빈 수준은 유의하게 더 적은, 24 시간에 양성 대조군에서 나타난 수준의 약 30% 이었고, 또한 시판 항체 MAb #206 으로 처리된 마우스에서보다 유의하게 낮았다. 음성 대조군의 마우스에서 나타난 합토글로빈의 증가된 수준은 반복된 후와 출혈 절차에 의해 야기된 자극 때문인 것 같다. 그러므로, Fc-IL6Rα-IL6 에 의해 유의하게 야기된 합토글로빈 분비의 실제 억제는 대조군 마우스에서 나타난 합토글로빈 분비의 배경을 뺐을 때, 심지어 70% 초과이다. 상기 결과는 IL-6 에 결합하고, gp130 수용체 서브유닛과의 그의 상호작용을 차단하는 본 발명의 항체, 예를 들어, 항체 #471 가, 미리 형성된 IL-6Rα/IL-6 복합체에 의해 활성화될 수 있는 gp130-의존적 신호 경로를 억제하는데 유효하다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 생체 내 항-종양 활성.
항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471 및 Mab#476 을 생체 내 항-종양 활성에 대 해 시험하였다. IL-6 을 분비하고, IL-6 가 성장 인자인 PC3-MM2 세포를 사용하여 SCID 마우스에서 폐 전이 모델을 설정하였다. 약 2.0 x 106 PC3-MM2 세포를 각 마우스에 i.v. 주사하였다. 11 일 후, 마우스를 단일클론 항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471 및 Mab#476 의 5 μg/ml 의 5 회 1 일 투여량으로 처리하였다. 전형적인 결과를 도 13 에 제시한다. 도 13 에 예증된 바와 같이, 항체 Mab#195, Mab#309, Mab#471 및 Mab#476 은 마우스에서 폐 전이를 억제한다.
또다른 실험을 통상 10 일 대신, 후 세포 주사 오직 5 일 후에 항체 처리를 사용하여 수행하였다. 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 8. 인간 불변 영역을 가진 항- IL -6 항체의 구축.
항체 Mab#471 로부터의 V 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 IL-6 에 대항하는 키메라성 항체를 미국 특허 제 6,969,517 호 (Gillies et al., 이의 교시는 본원에 참조로서 인용됨) 에 기재된 기술에 의해 구축하였다. Mab#471 의 V 영역을 코딩하는 DNA 서열을 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭에 의해 수득하였다. 소문자 영역은 어댑터에, 대문자 영역은 V 영역에 특이적이다.
Figure 112008054773884-PCT00035
수득된 마우스-유래 서열을 미국 특허 제 6,969,517 호, 실시예 3 에 기재된 바와 같이 항체 발현 벡터에 삽입하여, 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1 중쇄를 갖는 키메라성 항체를 코딩하는 발현 플라스미드를 발생시켰다.
안정하게 트랜스펙션된 인간 세포 클론을 수득하기 위해, 플라스미드 DNA 를 하기 기재되는 바와 같이 전기천공에 의해 마우스 골수종 NS/0 세포 내에 도입하였다. NS/0 세포를 10% 우태 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 성장시켰다. 약 5x106 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 0.5 ml 인산염 완충용액 (PBS) 에 재현탁하였다. 그 다음 10 μg 의 선형화 플라스미드 DNA 를 빙상에서 10 분 동안 Gene Pulser® Cuvette (0.4 cm 전극 갭, BioRad) 중에서 세포와 인큐베이션하였다. 0.25 V 로 설정된 Gene Pulser® (BioRad) 를 사용해서 전기천공을 수행하고, 500 μF 세포를 빙상에서 10 분 동안 회복시키고, 그 후 이들을 성장 배지에 재현탁시킨 다음 2 개의 96-웰 플레이트에 깔았다. 안정하게 트랜스펙션된 클론을 트랜스펙션-후 2 일에 도입된, 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재하의 성장에 의해 선별하였다. 세포에 매 3 일 동안 2 내지 3 회 이상으로 영양을 공급하고, MTX-저항성 클론은 2 내지 3 주에 나타났다. 클론으로부터의 상청액을 항-인간 Fc ELISA 로 검정하여, 고 생산자를 확인하였다 (Gillies et al. (1989) J. Immunol . Methods, 125:191). 고 생산 클론을 단리하고, 100 nM MTX 함유 성장 배지에서 증식시켰다.
키메라성 471 항체가 원하는 특성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 상기 분 자를 상기 실시예 6 에 기재된 바와 같이, 시험관 내 합토글로빈 생성 억제에 대해; LP-1 골수종 세포의 증식 억제에 대해; 및 상기 실시예 6 에 기재된 바와 같이, 생체 내 합토글로빈 생성 억제에 대해 시험하였다. 대조군으로, 항-IL-6 항체 Mab 206 (R&D Systems; Minneapolis, Minnesota) 및 CNTO-328 (Zaki M. H. et al., Int . J. Cancer, (2004) 111:592-5) 을 사용하였다.
안정하게 트랜스펙션된 세포주로부터 생성된 키메라성 471 항체 (Ch 항 IL-6 #471) 의 합토글로빈 분비에 대한 효과는 하기 표에 나타난다. 일시적으로 트랜스펙션된 세포로부터 생성된 키메라성 471 항체에서 유사한 결과가 수득되었다.
Figure 112008054773884-PCT00036
결과는 키메라성 항체 471 이 IL-6 및 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질 모두의 작용을 억제하는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 대조적으로, Mab#206 은 IL-6 또는 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질에 의해 자극받은 합토글로빈 분비를 억제하는데 비교적 효과가 없고, CNTO-328 은 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질에 의해 자극받은 합토글로빈의 억제에 큰 부족함을 보인다.
키메라성 항체 471 은 또한 LP-1 골수종 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. LP-1 은 증식이 IL-6 에 의해 자극될 수 있는 인간 골수종 세포주이다.
LP-1 세포 증식 검정법을 하기와 같이 수행하였다. LP-1 세포를 DSMZ (cat # ACC 41) (Georgii-Hemming P. et al. Blood (1996) 88:2250) 로부터 구입하였다. 세포를 20% FBS 에 배양한 다음, 증식 검정법 전에 1% FBS 배지에서 3 일 동안 단식시켰다. 단식 후, 세포를 3 회 세정하고, 0.5% FBS 함유 배지 내로 희석시켰다. 항-IL-6 항체를 희석하고 37 ℃ 5% CO2 에서 1 시간 동안 0.005 ng/ml IL-6 또는 0.05 ng/ml Fc-IL6Rα-IL6 융합 단백질 자극으로 플레이트에서 인큐베이션시켰다. 그 다음 100μl 중의 약 100,000 세포를 100 μl 의 희석된 단백질 및 자극으로 96 웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 56 시간 동안 인큐베이션한 다음, 3H 티미딘을 마지막 16 시간 동안 첨가하였다. 그 다음 세포를 유리 미세섬유 필터 플레이트 위에서 물로 웰로부터 수확하고, 방사능활성을 액체 섬광 계수기에 의해 측정하였다.
하기 표는 안정적으로 트랜스펙션된 세포주로부터 생성된 키메라성 471 항체로의 전형적인 결과를 보여준다. 일시적으로 트랜스펙션된 세포로부터 생성된 키메라성 471 항체로부터 유사한 결과가 수득된다.
Figure 112008054773884-PCT00037
결과는 키메라성 471 항체가 IL-6 및 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질 모두에 의해 자극된 LP-1 증식을 억제하는데 유효하다는 것을 나타낸다. 대조적으로, Mab#206 은 IL-6 에 의해 자극된 LP-1 증식을 억제하는데에는 효과가 없고, CNTO-328 은 IL-6/IL-6Rα 융합 단백질에 의해 자극된 LP-1 증식의 억제에 큰 부족함을 보인다.
키메라성 471 항체 및 다양한 대조 항체의 생체 내 합토글로빈 분비에 대한 억제 효과를 또한 실시예 6 에 기재된 바와 같이 시험하였다.
하기 결과가 수득되었다.
Figure 112008054773884-PCT00038
상기 결과는 키메라성 471 항체 (상기 표에서 Ch 471 로 언급됨) 가 IL-6/IL-Rα 복합체에 의해 자극된 합토글로빈 분비를 강하게 차단하는 반면, Mab#206 및 CNTO-328 와 같은 대조 항체는 합토글로빈 분비의 억제가 덜 유효하거나 효과가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 9. 본 발명의 항체 및 방법으로의 인간 환자의 치료
본 발명의 항-IL-6 항체는 인간 질환 및 장애를 치료하기 위해 하기와 같이 사용된다. 일반적으로, 바람직한 투여 방법은 i.v. 주입 또는 i.v. 주사이나, 피하 주사, 흡입, 경구 전달, 및 기타 방법이 또한 가능하다. 매 2, 3 또는 4 주에 약 1 회 투여가 사용되나, 투여 빈도는 환자의 필요에 따라 달라질 수 있다. 전형적인 투여량은 성인에 대해 약 100 내지 800 mg 이다. 치료된 환자는 면역억제로부터 야기될 수 있는 감염 징후에 대해 모니터된다.
예를 들어, 캐슬맨 질환 환자를 본 발명의 키메라성 471 항체로 매 2 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다.
류마티스 관절염 환자를 키메라성 471 항체로 매 4 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다. 관절 파괴 진행은 심지어 질환-변형 항-류마티스성 약물과 비교시에도, 단일요법 (monotherapy) 에 의해 유의하게 억제되는 것으로 밝혀졌다.
크론 질환 환자를 본 발명의 키메라성 471 항체로 매 4 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다.
다발성 골수종 환자를 키메라성 471 항체로 매 3 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다. 키메라성 471 로의 치료는 의사가 환자에 적합한 것으로 결정한대로 다발성 골수종에 대한 표준-관리-치료와 조합된다.
통상의 화학요법으로 치료된 이력을 가진, 진행된 전이성 전립선 암 환자를 키메라성 471 항체로 매 3 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다. 키메라성 471 항체로의 치료는 의사가 환자에 적합한 것으로 결정한대로 전립선 암에 대한 표준-관리-치료와 조합된다. 비-스테로이드성 항-염증 약물, 예를 들어 Naproxen™ 가 또한 처방된다. 전 화학요법의 결과로서, 환자는 백혈구가 저하되고 나이브 (naive) T 세포 수준이 낮아진다. 환자를 면역억제로부터 야기되는 감염에 대해 특히 밀접하게 모니터 하고, 예방 항생제를 제공한다. 치료가 카켁시아-유형 증상, 예컨대 골 감소에 긍정적인 효 과가 있음이 밝혀졌다.
호르몬-불응성 유방암 환자를 키메라성 471 항체로 매 3 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 적가 주입에 의해 투여하여 치료한다. 키메라성 471 항체로의 치료는 의사가 환자에 적합한 것으로 결정한대로 진행된 유방암에 대한 표준-관리-치료와 조합된다. 비-스테로이드성 항-염증 약물, 예를 들어 Naproxen™ 가 또한 처방된다.
대안적인 치료 전량에서, 진행된 호르몬-불응성 전립선 암 또는 진행된 호르몬-불응성 유방암 환자를 키메라성 471 항체로 매 3 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, KS-IL2 와 같은 면역사이토카인과 조합으로 치료한다.
이러한 2 가지 작용제는 적가 주입에 의해 함께 투여될 수 있다. 치료 전, 환자는 면역자극 양의 시클로포스파미드를 투여받는다. 비-스테로이드성 항-염증 약물, 예를 들어 Naproxen™ 가 또한 처방된다. 이론에 구애됨 없이, 부분적으로 IL-6 이 IL-12 신호 및 TH1 응답의 억제를 야기하여, 본 발명의 항체가 상기 억제를 반대로 하기 때문에, 본 발명의 항-IL6 항체와 KS-IL2 과 같은 면역사이토카인의 조합이 특히 유효하다.
B 세포 림프종 환자를 키메라성 471 항체로 매 3 주에 약 1 회 약 8 mg/kg 의 투여량으로, 임의로 매주 투여되는, Rituxan™ 과 같은 항체로, 체표면적 ㎡ 당 약 375 ㎎ 과 조합으로 치료한다. 대안적으로는, 불응성 림프종 환자의 경우, 키메라성 471 항체로의 치료는 Bexxar™ 또는 Zevalin™ 과 같은 방사능면역컨쥬게이트와 조합된다.
<110> Merck Patent GmbH <120> Interleukin-6 Antagonists <130> LEX-036PC, P05/228 <150> PCT/EP2006/012236 <151> 2006-12-19 <160> 62 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: designed sequence <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Phe Xaa Phe Ser Xaa Xaa Trp Met Xaa 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: designed sequence <400> 2 Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: designed sequence <400> 3 Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: designed sequence <400> 4 Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> 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ctcccggacc ccgggtaaag aagattccaa agatgtagct 720 gccccacaca gacagccact cacctcttca gaacgaattg acaaacaaat tcggtacatc 780 ctcgacggca tctcagccct gagaaaggag acatgtaaca agagtaacat gtgtgaaagc 840 agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga 900 tgcttccaat ctggattcaa tgaggagact tgcctggtga aaatcatcac tggtcttttg 960 gagtttgagg tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc 1020 agagctgtgc agatgagtac aaaagtcctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat 1080 ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag 1140 gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag 1200 ttcctgcagt ccagcctgag ggctcttcgg caaatgtag 1239 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH amplification PCR#1 5' oligonucleotide #1 <400> 43 acaacgcaga gtacgcgg 18 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH amplification PCR#1 3' oligonucleotide #1 <400> 44 aggagagctg ggaaggtgtg 20 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH amplification PCR#2 5' oligonucleotide #2 <400> 45 acaacgcaga gtacgcgg 18 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH amplification PCR#2 3' oligonucleotide #2 <400> 46 tagcccttga ccaggcatcc c 21 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VK amplification PCR#1 5' oligonucleotide #1 <400> 47 acaacgcaga gtacgcgg 18 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VK amplification PCR#1 3' oligonucleotide #1 <400> 48 ctgccatcaa tcttccactt gac 23 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VK amplification PCR#2 5' oligonucleotide #2 <400> 49 catcctctct tccagctctc 20 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VK amplification PCR#2 3' oligonucleotide #2 <400> 50 ctgaggcacc tccagatg 18 <210> 51 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 51 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg 300 gaggactact acggctaccc tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360 360 <210> 52 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 52 gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctaggtca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattttggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac ctggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 53 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 gaagtgaaac ttgaggagtc tggaggaggc ttggttcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagactga aatctaataa gggtgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gggatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtgccagc 300 cttttgtatg atggttactt acattggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 54 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttggt aattttggca ttagttttat gaattggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa actggaaatc aaa 333 <210> 55 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 55 gaagtgaagt ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac cgggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cagtttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga catctaataa gcaggcaata 180 tattatgcgg agtctgtgaa agggagattc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cctaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtgccagc 300 cttttctatg atggttactt acattggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 56 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 56 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttggt aattttggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgattc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga gattccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa actggaaatc aaa 333 <210> 57 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 57 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcttgtgctg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaagta aagctaataa tcatgcaaca 180 tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacag cctaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtacgacc 300 cctactctct atggcgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctctgca 360 360 <210> 58 <211> 334 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 58 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcttgggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttcat aattttggca ttagctttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctgtggaag aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcaac aaggtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VL forward primer (with Afl II site): 4447s <400> 59 cttaagcgac attgtgctga cccaatc 27 <210> 60 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VL reverse primer (with Bgl II site): 5225a <400> 60 agatctactt acgtttgatt tccagtttgg tgcc 34 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH forward primer (with Afl II site): 5226s <400> 61 cttaagcgaa gtgaagtttg aggagtc 27 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic: VH reverse primer (with Hind III site): 5227a <400> 62 aagcttactt acctgcagag acagtgacca g 31

Claims (32)

  1. 항체 가변 영역이, 결합이 질환 세포의 표면 상에서 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하는 방식으로 IL-6 상의 에피토프에 결합하는, 항체 가변 영역을 포함하는 항-IL6 항체 또는 그의 조각.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 결합이 IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하나, IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하지는 않는 항-IL6 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IL-6 상의 에피토프가 Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 및 Trp157 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 항-IL6 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 을 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00039
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 를 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00040
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 을 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00041
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 을 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00042
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 를 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00043
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 을 포함하는 항-IL6 항체:
    Figure 112008054773884-PCT00044
  10. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 의 중쇄 CDR1 및
    SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9 의 중쇄 CDR2; 및
    SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 의 중쇄 CDR3 을 포함하는 항-IL6 항체.
  11. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, 또는 SEQ ID NO:19 의 경쇄 CDR1, 및
    SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 또는 SEQ ID NO:23 의 경쇄 CDR2, 및
    SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 의 경쇄 CDR3 을 포함하는 항-IL6 항체.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 의 중쇄 CDR1, 및
    SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9 의 중쇄 CDR2; 및
    SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 의 중쇄 CDR3, 및
    SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, 또는 SEQ ID NO:19 의 경쇄 CDR1, 및
    SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 또는 SEQ ID NO:23 의 경쇄 CDR2, 및
    SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 의 경쇄 CDR3 을 포함하는 항-IL6 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 추가로 포함하는 항-IL6 항체.
  14. 제 13 항에 있어서, Fc 부분을 포함하는 항-IL6 항체.
  15. 제 14 항에 있어서, Fc 부분이 인간인 항-IL6 항체.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  17. 제 16 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:31 의 경쇄 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:31 과 90% 이상 일치하는 서열을 포함하는 항-IL6 항체.
  18. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:36 으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미 노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  19. 제 18 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:35 의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:35 와 90% 이상 일치하는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:35 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  21. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:34 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  22. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:36 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  23. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:33 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-IL6 항체.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  25. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 항-IL6 항체를, 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약물학적 유효량으로 포함하는, IL6 촉발 질환의 치료에 적합한 약학 조성물.
  26. 암 또는 자가면역 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 항-IL6 항체의 용도.
  27. 제 26 항에 있어서, 질환이 IL6 또는 IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL6 에 의해 촉발되는 용도.
  28. (i) 항체의 Fc 부분,
    (ii) IL6Rα 및
    (iii) IL6
    을 포함하는 융합 단백질.
  29. 제 28 항에 있어서, IL6Rα 가 Fc 부분의 C-말단에 융합되고, IL6 이 IL6Rα 의 C-말단에 융합된 융합 단백질.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, Fc 부분이 쥣과이고, IL6Rα 및 IL6 이 인간인 융합 단백질.
  31. 스크리닝된 항체가 하기 특성을 갖는, 포유류를 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 융합 단백질로 면역화하여 수득된 항-IL6 항체의 제조를 위한 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도:
    (i) 상기 항체의 가변 영역이 IL-6 상의 에피토프에 결합하고,
    (ii) 질환 세포의 표면 상의 IL-6 과 gp130 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하고,
    (ii) IL-6Rα 와 복합체를 형성한 IL-6 이 gp130 에 결합하는 것을 방해하나, IL-6 과 IL-6Rα 사이의 상호작용을 입체적으로 차단하지는 않는 특성.
  32. 제 31 항에 있어서, 스크리닝된 항체가 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 항체인 용도.
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