BRPI0620797A2 - anticorpos anti-il-6 que previnem a ligação de il-6 complexado com il-6ralfa a gp130 - Google Patents
anticorpos anti-il-6 que previnem a ligação de il-6 complexado com il-6ralfa a gp130 Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0620797A2 BRPI0620797A2 BRPI0620797-9A BRPI0620797A BRPI0620797A2 BR PI0620797 A2 BRPI0620797 A2 BR PI0620797A2 BR PI0620797 A BRPI0620797 A BR PI0620797A BR PI0620797 A2 BRPI0620797 A2 BR PI0620797A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- amino acid
- acid sequence
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 238
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 53
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 52
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 29
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 8
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 219
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 211
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 23
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 9
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 9
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 8
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 3
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 3
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229960003323 siltuximab Drugs 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 2
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 208000018819 hormone-resistant breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010062904 Hormone-refractory prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 102000004495 STAT3 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 239000002988 disease modifying antirheumatic drug Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052623 human IL6R Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229940051022 radioimmunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108010045039 seminal vesicle-specific antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/248—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
Abstract
ANTICORPOS ANTI-IL-6 QUE PREVINEM A LIGAçãO DE IL-6 COMPLEXADO COM IL-6RALFA A GP1 30. A presente invenção refere-se a anticorpos anti-IL-6 incluindo uma região variável de anticorpo que previne IL-6 de se ligar a gp130. A presente invenção também proporciona composições e métodos para tratamento de doenças relacionadas a IL-6 baseadas nos antagonistas IL-6 da invenção.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-IL-6 QUE PREVINEM A LIGAÇÃO DE IL-6 COMPLEXADO COM IL-6RALFA A GP130".
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a antagonistas de interleucina-6 (IL-6) que são úteis na supressão de trajetória de sinalização de IL-6, e no trata- mento de doenças relacionadas a IL-6. Em particular, esta invenção se rela- ciona a anticorpos anti-IL-6 que bloqueiam a interação entre IL-6 e gp130, e podem ser bem sucedidamente usados para o tratamento de doenças pro- vocadas por IL-6, preferivelmente câncer e doenças auto-imunes. Antecedentes da Invenção
A interleucina-6 (IL-6) está envolvida em várias doenças, incluin- do muitos cânceres e doenças imunes. A interleucina-6 é secretada por mui- tos cânceres avançados, tais como câncer de próstata independente de hormônio, e acredita-se ser um fator de crescimento para tais cânceres. Em adição, a secreção de IL-6 por células de câncer é acreditada causar caque- xia, a característica de síndrome de enfraquecimento de cânceres avança- dos. Portanto, a inibição da ação da IL-6 seria útil no tratamento de tais cân- ceres.
A IL-6 também desempenha um papel-chave no desenvolvimen- to de célula B. As doenças auto-imunes com um componente de anticorpo significante, tal como artrite reumatóide, podem ser tratadas pela inibição da IL-6. As enfermidades envolvendo proliferação de células B, tais como mie- Ioma múltiplo e Iinfoma de célula B, podem também serem tratadas pela ini- bição da atividade de IL-6.
Em adição, a IL-6 desempenha um papel importante na remode- Iagem do osso pela promoção de reabsorção do osso. Os inibidores de ativi- dade de IL-6 teriam o efeito de reduzir reabsorção de osso, e podem ser u- sados para tratar osteoporose.
Quando a IL-6 é produzida como parte de uma doença ou en- fermidade, ela é freqüentemente complexada com uma subunidade IL- 6Ralfa solúvel, e é freqüentemente secretada a partir de células na forma de tal complexo. Como um resultado, não é freqüentemente útil tratar um paci- ente com um anticorpo ou outro inibidor que bloqueie a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa, porque tal anticorpo ou inibidor pode não ter o efeito em um com- plexo pré-formado. Portanto, existe uma necessidade na técnica de um tra- tamento aperfeiçoado de doenças mediadas por IL-6.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona composições e métodos para tratamento de doenças mediadas por IL-6, em particular, cânceres e doen- ças auto-imunes, que envolvem IL-6 sobre ativação. Especificamente, a pre- sente invenção proporciona um novo antagonista de IL-6 que bloqueia efeti- vamente a interação entre IL-6 e gp130, em particular, um antagonista de IL- 6 que impede o IL-6 pré-formado e complexo de IL-6Ralfa de se ligarem a gp130. Em adição, a presente invenção proporciona métodos de gerar um novo antagonista de IL-6 que bloqueia a interação entre IL-6 e gp130.
Desse modo, em um aspecto, a presente invenção proporciona um antagonista de IL-6 isolado que impede a IL-6 complexada com IL-6Ralfa de se ligar ao gp130. Em uma concretização, o antagonista de IL-6 isolada contém uma região variável de anticorpo e uma região Fc derivada de um anticorpo humano. Em concretizações alternativas, a região Fc adequada para a invenção pode ser derivada de um anticorpo obtido de um camun- dongo, de um rato, de uma vaca, de um cachorro, de uma galinha, de um cavalo, de um peixe, de um macaco, ou de outra espécie não-humana. Em uma concretização preferida, a região variável de anticorpo se liga a uma região na IL-6 tal que a ligação bloqueia estericamente a interação entre a IL-6 e gp130.
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR1 de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoáci- do Fx1FSX2X3WMX4(SEC) ID NO:1). X1, X2, X3 ou X4 podem ser qualquer aminoácido. Preferivelmente, X1 é Thr, Ser, Ala ou Cys; X2 é Asn ou Asp; X3 é Tyr ou Ala; e X4 é Asn ou Asp. Em particular, a CDR1 de cadeia pesada pode conter uma das seguintes seqüências de aminoácido: FTFSNYWMN(SEQ ID N0:2), FSFSNYWMN (SEQ ID N0:3), ou FTFS-DAWMD (SEQ ID NO:4).
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR2 de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoáci- do EIRX1X2X3NX4X5AX6X7YAESVKG (SEQ ID NO:5). X1, X2, X3, X4, X5, X6 ou X7 podem ser qualquer aminoácido. Preferivelmente, Xi é Leu ou Ser; X2 é Lys ou Thr; X3 é Ser ou Ala; X4 é Asn ou Lys; X5 é Tyr, Gly, Gln ou His; X6 é Thr ou He; e X7 é His ou Tyr. Em particular, a região variável de anticorpo inclui uma CDR2 de cadeia pesada contendo uma das seguintes seqüências de aminoácido: ElRLKSNNYATHYAESVKG (SEQ ID N0:6), EIRLKSNKGA- THYAESVKG (SEQ ID N0:7), EIRLTSNKQAIYYAESVKG (SEQ ID NO:8), ou EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID N0:9).
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR3 de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoáci- do X1X2X3X4GX5X6X7X8 (seq ID N0:10). X1i X2, X3, X4, X5, X6, X7 ou X8 po- dem ser qualquer aminoácido. Preferivelmente, X1 é Glu, Leu ou Pro; X2 é Asp, Leu, Phe ou Thr; X3 é Tyr ou Leu; X4 é Tyr ou Asp; X5 é Tyr ou Ala; X6 é Pro, Met ou uma ligação de peptídeo; X7 é Asp ou Leu; e X8 é Tyr ou His. Em particular, a região variável de anticorpo inclui uma CDR3 de cadeia pe- sada contendo uma das seguintes seqüências de aminoácido: EDYYGYPDY (seq ID N0:11), LLYDGYLH (seq ID N0:12), LFYDGYLH (seq ID NO:13), ou PTLYGAMDY (seq ID NO: 14).
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR1 de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácido Rasesvxx1Nx2Gisfm (seq ID N0:15). X1 ou X2 podem ser qualquer ami- noácido. Preferivelmente, X1 é Asp, Gly ou His; e X2 é lhe ou Tyr. Em parti- cular, a região variável de anticorpo inclui uma CDR1 de cadeia leve conten- do uma das seguintes seqüências de aminoácido: RASESVDNFGISFM (SEQ ID NO:16), RASESVGNFGISFM (SEQ ID NO:17), RASESVHNF- GISFM (SEQ ID NO:18), e RASESVDNYGISFM (SEQ ID NO:19).
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR2 de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácido 5 XASNQGS (SEQ ID NO:20). X podem ser qualquer aminoácido. Preferivel- mente, X é Ala, Val ou Thr. Em particular, a região variável de anticorpo in- clui uma CDR2 de cadeia leve contendo uma das seguintes seqüências de aminoácido: TASNQGS (SEQ ID NO:21), VASNQGS (SEQ ID NO:22), ou AASNQGS (SEQ ID NO:23).
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um anta- gonista de IL-6 isolada compreendendo uma região variável de anticorpo que inclui uma CDR3 de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácido QQXiKEX2PX3T (SEQ ID NO:24). X1, X2 ou X3 podem ser qualquer aminoá- cido. Preferivelmente, Xi é Ser ou Gly; X2 é Val ou He; e X3 é Trp ou Tyr. Em particular, a região variável de anticorpo inclui uma CDR3 de cadeia leve contendo uma das seguintes seqüências de aminoácido: QQSKEVPWT (SEQ ID NO:25), QQSKEVPYT (SEQ ID NO:26), QQSKEIPWT (SEQ ID NO:27), ou QQGKEVPWT (SEQ ID NO:28).
Em algumas concretizações, o antagonista de IL-6 da presente invenção é um anticorpo, ou um fragmento deste.
Em algumas concretizações, o anticorpo inclui uma cadeia leve contendo uma das seqüências de amino: SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31, ou SEQ ID NO:32. Alternativamente, o anticorpo inclui uma cadeia leve contendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a qualquer uma das seqüências acima identificadas, por exemplo, SEQ ID NO:31 (Mabns471).
Em outras concretizações, o anticorpo inclui uma cadeia pesada contendo uma das seqüências de amino: SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35, ou SEQ ID NO:36. Alternativamente, o anticorpo inclui uma cadeia pesada contendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a qualquer uma das se- qüências acima identificadas, por exemplo, SEQ ID NO:35 (Mabns471). A presente invenção também proporciona ácidos nucléicos que codificam o antagonista de IL-6, conforme descrito nas várias concretizações acima. Em particular, a presente invenção proporciona ácidos nucléicos que codificam a cadeia leve e/ou cadeia pesada dos anticorpos anti-IL-6 acima descritos
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um antago- nista de IL-6 isolada incluindo uma região variável de anticorpo que se liga a um epitopo na IL-6 contendo um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Aso34 e Trp157, tal que a ligação bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e gp130.
Tipicamente, o antagonista de IL-6 inclui uma porção Fe. Preferi- velmente, a porção Fc é derivada de um anticorpo humano. Em uma concre- tização mais preferida, todas as regiões constantes no antagonista de IL-6 são derivadas de um anticorpo humano. Em concretizações alternativas, a região Fc adequada para a invenção pode ser derivada de um anticorpo ob- tido de um camundongo, de um rato, de uma vaca, de um cachorro, de uma galinha, de um cavalo, de um macaco, ou de outra espécie não-humana.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratamento de uma doença em um indivíduo pela administração ao indi- víduo do antagonista de IL-6 da invenção, conforme descrito acima. Especi- ficamente, a presente invenção proporciona um método para tratamento de uma doença, ou um sintoma, em um indivíduo, pela administração de uma proteína incluindo uma região V de anticorpo que se liga a IL-6 e bloqueia estericamente sua interação com gp130. Tais proteínas incluem, mas não estão limitadas a, anticorpos, fragmentos de anticorpo que carecem de vá- rias regiões constantes, minicorpos, proteínas scFv, proteínas de fusão de anticorpo. Preferivelmente, a região V de anticorpo que se liga a IL-6 e blo- queia estericamente sua interação com gp130 não bloqueia esterericamente a interação entre IL-6 e a subunidade IL-6 de receptor-alfa. O método da presente invenção é particularmente útil no tratamento de doenças, enfermi- dades, e efeitos colaterais que envolvem IL-6, tais como, por exemplo, do- enças auto-imunes, incluindo, mas não limitas a, artrite reumatóide, síndro- me de Sjogren, esclerose múltipla, eritematose de Iupos sistêmica, doença de Graves, doença de Hashimoto, e doença de Castleman, inflamação agu- da e crônica, e osteoporose, e outras enfermidades envolvendo perda de massa de osso, e cânceres incluindo, mas não limitados a, câncer de prósta- ta independente de hormônio, enfermidades proliferativas de célula B1 tais como Iinfoma de não-Hodgkin de célula B, e cânceres avançados de intesti- no, seio, cólon, pulmão, cérebro, e outros tecidos.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de gerar um antagonista de IL-6 descrito em várias concretizações acima. Em particular, a presente invenção proporciona um método de gerar um antagonista de IL-6 por (a) primeiro gerar anticorpos contra um complexo de IL-6 e IL-6Ralfa por imunização de um animal com uma composição in- cluindo IL-6 e IL-6Ralfa, e (b) identificação de um anticorpo que inibe a inte- ração entre gp130 e IL-6. A IL-6 e IL-6Ralfa podem estar em uma configura- ção de proteína de fusão para facilitar a formação da IL-6/IL-6Ralfa comple- xa. Em uma concretização preferida, a composição também inclui uma por- ção adicional que facilita apresentação de antígeno, tal como uma porção Fc.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo específico para um complexo de IL-6 e IL-6Ralfa, e capaz de im- pedir IL-6 de se ligar a gp130.
Outras características, objetivos e vantagens da presente inven- ção são aparentes na descrição detalhada que se segue. Deve ser compre- endido, contudo, que a descrição detalhada, enquanto indica concretizações da presente invenção, é dada por meio de ilustração somente, não de limita- ção. Várias mudanças e modificações dentro do escopo da invenção tornar- se-ão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição detalha- da.
Em resumo, a invenção se refere a:
Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, ou um fragmento deste, compreen- dendo um região variável de anticorpo, no qual a região variável de anticorpo se liga a um epitopo na IL-6 em um modo que a ligação bloqueia esterica- mente a interação entre a IL-6 e gp130 na superfície de uma célula adoenta- da.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual referida ligação impede que a IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gp130, mas não bloqueie esteri- camente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual referido epitopo na IL-6 compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Leul 9, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 e Trpl57.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma se- qüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em FTFSNYWMN(SEQ ID NO:2), FSFSNYWMN (SEQ ID NO:3), e FTFSDAWMD (SEQ ID NO:4).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma se- qüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em EIRLKSNNYATHYAESVKG (SEQ ID NO:6), EIRLKSNKGATHYAESVKG (SEQ ID NO:7), EIRLTSNKQAIYYAESVKG (SEQ ID NO:8), e EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO:9).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma se- qüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em EDYYGYPDY (SEQ ID NO:11), LLYDGYLH (SEQ ID NO:12), LFYDGYLH (SEQ ID NO:13), e PTLYGAMDY (SEQ ID NO: 14).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma seqüên- cia de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em RASESVDNFGISFM (SEQ ID NO:16), RASESVGNFGISFM (SEQ ID N0:17), RASESVHNFGISFM (SEQ ID N0:18), e RASESVDNYGISFM (SEQ ID N0:19).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma seqüên- cia de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em
TASNQGS (SEQ ID NO:21), VASNQGS (SEQ ID NO:22), e AASNQGS (SEQ ID NO:23).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a região variável de anti- corpo compreende uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma seqüên- cia de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em
QQSKEVPWT (SEQ ID NO:25), QQSKEVPYT (SEQ ID NO:26), QQSKEIPWT (SEQ ID NO:27), e QQGKEVPWT (SEQ ID NO:28).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de
(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), ou (SEQ ID NO:4); e uma CDR2 de cadeia pesada de
(SEQ ID NO:6); (SEQ ID NO:7); (SEQ ID NO:8); ou (SEQ ID NO:9); e uma CDR3 de cadeia pesada de
(SEQ ID NO:11); (SEQ ID NO:12); (SEQ ID NO:13); ou (SEQ ID NO:14).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente compreendendo uma CDR1 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:16); (SEQ ID NO:17); (SEQ ID NO:18); ou (SEQ ID NO:19); e uma CDR2 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:21); (SEQ ID NO:22); ou (SEQ ID NO:23); e uma CDR3 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:25); (SEQ ID NO:26); (SEQ ID NO:27); ou (SEQ ID NO:28).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:2), (SEQ ID N0:3), ou (SEQ ID NO:4); e uma CDR2 de cadeia pesada de
(SEQ ID NO:6); (SEQ ID NO:7); (SEQ ID NO:8); ou (SEQ ID NO:9); e uma CDR3 de cadeia pesada de
(SEQ ID NO:11); (SEQ ID NO:12); (SEQ ID NO:13); ou (SEQ ID NO:14), e uma CDR1 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:16); (SEQ ID NO:17); (SEQ ID NO:18); ou (SEQ ID NO:19); e uma CDR2 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:21); (SEQ ID NO:22); ou (SEQ ID NO:23); e uma CDR3 de cadeia leve de
(SEQ ID NO:25); (SEQ ID NO:26); (SEQ ID NO:27); ou (SEQ ID NO:28).
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, de qualquer outro compreendendo uma região constante de anticorpo.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, compreendendo uma porção Fc.
Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual a porção Fc é humana.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32.
Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO:31, ou uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:31.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo consistindo em
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, e SEQ ID NO:36.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente, no qual o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:35, ou uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:35.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente compreendendo uma cadeia pesa- da compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:35, e uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:31.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente compreendendo uma cadeia pesa- da compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:34, e uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NC:30.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente compreendendo uma cadeia pesa- da compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:36, e uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
• Um anticorpo anti-IL-6 correspondente compreendendo uma cadeia pesa- da compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:33, e uma cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:29.
• Uma molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo especificado acima e abaixo.
• Uma composição farmacêutica adequada para o tratamento de uma doen- ça provocada por IL-6 compreendendo uma quantidade farmacologicamente efetiva de um anticorpo anti-IL-6, conforme especificado acima e abaixo, op- cionalmente junto com um transportador, diluente ou excipiente farmaceuti- camente aceitáveis.
• Um uso de uma anticorpo anti-IL-6, conforme especificado acima ou abai- xo, para a manufatura de um medicamento para o tratamento de câncer, ou uma doença auto-imune.
• Uso correspondente, no qual a doença é provocada por IL6 ou IL6 comple- xada com IL-6Ralfa.
• Uma proteína de fusão compreendendo uma porção Fc de um anticorpo, IL6Ralpha e IL-6, preferivelmente no qual Fc deriva de uma mamífero não- humano, tal como, camundongo, e IL-6Ralfa e IL6 derivam de origem huma- na.
• Uma proteína de fusão, no qual IL6Ralpha é fundida ao terminal C da por- ção Fe, e IL6 é fundida ao terminal C de IL6Ralpha. • Um uso de uma proteína de fusão para a manufatura de um anticorpo anti- IL-6 obtido por imunização de um mamífero com referida proteína de fusão, no qual o anticorpo classificado tem as seguintes propriedades:
(i) a região variável de referido anticorpo e liga a um epitopo na IL-6, (ii) bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e gp130 na superfície de uma célula adoentada, e
(iii) impede que IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gp130, mas não bloqueie estericamente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa.
• Um uso correspondente, no qual õ anticorpo classificado é um anticorpo conforme especificado acima e abaixo.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1A representa a ativação indesejada de gp130 nas célu- las adoentadas, ou outras células-alvos resultante de superprodução de IL-6.
A figura 1B representa um antagonista de IL-6 que bloqueia es- tericamente a interação entre IL-6 e gp130, e cuja ligação a IL-6 não é afeta- da pela slL-6Ralfa pré-ligada.
A figura 2 mostra um alinhamento de seqüências de região V de anticorpo exemplares da presente invenção. As posições de variação entre as seqüências são indicadas com setas. As CDRs são envolvidas por caixa.
A figura 3 é um representação esquemática de concretizações exemplares de proteína usada na presente invenção.
A figura 4 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplares da invenção para FC-IL6Ralpha-IL6.
A figura 5 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplares da invenção para IL-6.
A figura 6 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplares da invenção para IL-6 e IL-6Ralfa não- covalentemente complexadas.
A figura 7 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplares da invenção para IL-6Ralfa sozinha.
A figura 8 mostra um resultado experimental ilustrando que os anticorpos exemplares da invenção inibem a interação entre FC-IL6Ralpha- IL6 e gp130.
A figura 9 mostra um resultado experimental ilustrando a capaci- dade de bloquear liberação de haptoglobina de células HepG2 estimuladas com um complexo de FC-IL6Ralpha-IL6 por anticorpos exemplares da in- venção.
A figura 10A representa resultados experimentais refletindo que a proteína de fusão FC-IL6Ralpha-IL6 estimula a proliferação de células de carcinoma epiteliais humanas A431.
As figuras 10B-1 e 10B-2 representam resultados experimentais refletindo que as concretizações exemplares da invenção inibem proliferação de células de carcinoma epiteliais humanas A431 estimuladas pela proteína de fusão Fc-IL6Ralpha-ll6.
A figura 11 ilustra propriedades farmacocinéticas de anticorpos exemplares da invenção.
A figura 12 mostra um resultado experimental refletindo inibição in vivo de secreção de haptoglobina pelos anticorpos exemplares da inven- ção, usando os procedimentos descritos no Exemplo 6.
A figura 13 mostra um resultado experimental refletindo inibição de metástase pelos anticorpos exemplares da invenção.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção proporciona um novo antagonista de IL-6 que bloqueia efetivamente a interação entre IL-6 e gp130, suprimido, desse modo, sinalização de IL-6 na presença de complexos de IL-6/IL-Ralpha. Conforme discutido acima, desde que IL-6 é tipicamente complexada com IL-6Ralfa quando produzida como parte de uma doença ou enfermidade, a presente invenção alcança, desse modo, melhores efeitos terapêuticos com- parados aos anticorpos existentes que bloqueiam a interação entre IL-6 e a IL-6Ralfa (van Zaanen et ai, (1996), J. Clin. Invest.. 98(6):1441-8).
Em uma concretização particular, a presente invenção propor- ciona um antagonista de IL-6 contendo uma região variável de anticorpo que se liga a uma região na IL-6, tal que a ligação bloqueia estericamente a inte- ração entre a IL-6 e gp130. Por "bloqueia estericamente" é significativo o meio de bloquear uma interação entre primeira e segunda proteínas por uma terceira ligação de proteína à primeira proteína. A ligação entre a primeira e a terceira proteínas impede a segunda proteína de se ligar à primeira proteí- na devido a interações de van der Waals ou eletrostáticas entre a segunda e a terceira proteínas.
A presente invenção também proporciona composições para tratamento de doenças, enfermidades e efeitos colaterais envolvendo IL-6 baseada no antagonista de IL-6 da invenção.
Vários aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes nas seguintes subseções. O uso de subseções não é significativo para limi- tar a invenção. Cada subseção pode se aplicar a qualquer aspecto da inven- ção. Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que de outro mo- do citado. Conforme usado nesta descrição, o termo "compreende" e varia- ções do termo, tal como "compreendendo" e "compreende" são pretendidas para excluírem outros aditivos, componentes, inteiros ou etapas. IL-6 e sua interação com IL-6Ralfa e gp130
A sinalização de IL-6 é compreendida por ocorrer por sua intera- ção com subunidade IL-6 receptor-alfa (IL-6Ralfa) e gp130, uma proteína receptora de transmembrana que tranduz os sinais de IL-6 para STAT3, que, em seguida, ativa a transcrição de vários genes. A estrutura de uma porção extracelular do complexo de sinalização foi determinada (Boulanger et al., (2000), Science. 300:2101, os ensinamentos dos quais são aqui incorpora- dos por referência). Esta estrutura indica que o complexo de sinalização con- tém duas cópias de IL-6, duas cópias da subunidade de IL-6Ralfa, e duas cópias de gp130. A análise da estrutura também indica que IL-6 se liga ao receptor gp130 através de três epítopes conservados conhecidos como lo- cais I, Il e III. IL-6 deve primeiro formar um complexo com IL-6Ralfa através do local I. O local Il é um epitopo composto formado pelo complexo binário de IL-6 e IL-6Ralfa, que interage com região de ligação de citocina CHR e D2D3 de gp130. Subseqüentemente, o local Il interage com o domínio de ativação similar a imuglobulina de gp130 (D1 ou IGD) para formar o comple- xo de hexâmero de sinalização competente (Boulanger et al., (2003) Scein- ce, 300:2101, os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referên- cia). O epitopo de ligação de local I de IL-6 está localizado nas helicoidais A e D, e interagem com IL-6Ralfa. As quatro interfaces de proteína-proteína únicas remanescentes no hexâmero podem ser separadas em dois locais compostos, locais Il e III. Os estudos das três estruturas dimensionais do complexo de hexâmero revelaram que um número de resíduos de IL-6 parti- cipam na é importante para a interação entre IL-6 e gp130. Tais resíduos incluem, mas não estão limitados a, Leu19, Arg24, Lys 27, Arg30, Tyr31, Asp34 e Trp157.
Desse modo, o efeito de formação do complexo de hexâmero é dimerizar gp130 e justapor seus domínios intracelulares, de modo que sinali- zação continua no nível intracelular. A subunidade IL-6Ralfa não tem um domínio intracelular, e serve somente para estabilizar o complexo. A IL-6 de mamífero não é capaz de se ligar a gpm130 na ausência de IL-6Ralfa. A su- bunidade de IL-6Ralfa canônica tem três domínios extracelulares, e uma re- gião de transmembrana que ancora a subunidade de IL-6Ralfa à membrana da célula de expressão. "IL-6Ralfa solúvel" ou "slL-6Ralfa" é significativo uma proteína tendo a porção extracelular da subunidade IL-6Ralfa, mas ca- recendo do segmento de transmembrana. A proteína variante de slL-6Ralfa, carecendo do segmento de transmembrana, pode ser gerada pela transla- ção de uma IL-6Ralfa de codificação de mRNA alternativamente repartida, ou por clivagem proteolítica da forma ligada de membrana de IL-6Ralfa .
slL-6Ralfa está presente no soro, e pode também ser secretada pela mesma célula que expressa IL-6. IL-6 forma um complexo com sIL- 6Ralfa. Uma vez que o complexo IL-6/ slL-6Ralfa tenha se formado, ele é razoavelmente estável, e não pode estar ligado por um anticorpo que se completa com a interação IL-6/ slL-6Ralfa. O complexo IL-6/ slL-6Ralfa tem uma meia-vida de soro significantemente extendida comparada a IL-6 sozi- nha. Somente certas células no corpo, tais como células B, têm ambas IL- 6Ralfa e gp130, enquanto muitas células adicionais têm somente gpm130. O complexo IL-6/ slL-6Ralfa pode se ligar às células tendo somente gp130, e estimula transdução de sinal. Conseqüentemente, ativação indesejada de gp130 em muitas células pode resultar de superprodução de IL-6 (figura 1A). Portanto, anticorpos ou outras moléculas que bloqueiam estericamente a interação entre IL-6 e gp130 podem ser particularmente úteis na supressão de sinalização indesejável de IL-6 (ver figura 1B).
Antaaonistas de IL-6 que Bloqueiam Estericamente a Interação com gp130
Desse modo, conforme mostrado na figura 1B, a presente inven- ção contempla um antagonista de IL-6 que bloqueie estericamente a intera- ção com gp130, e cuja ligação a IL-6 não seja afetada por slL-6Ralfa pré- ligada. "Antagonistas de IL-6" da presente invenção incluem anticorpos ou fragmentos destes; equivalentes funcionais de anticorpos; anticorpos modifi- cados, tais como, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos; ou outras proteínas ou moléculas capazes de se ligarem a ou se associarem com IL-6 ou complexo de IL-6/IL-6Ralfa para evitar ligação a gp130.
Em uma concretização preferida, o antagonista de IL-6 da inven- ção contém uma região variável de anticorpo no complexo IL-6 ou IL-6Ralfa, tal que a ligação bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e gp130. Mais preferivelmente, o antagonista de IL-6 da invenção é um anticorpo. Por e- xemplo, a ligação da região variável de anticorpo a quaisquer regiões ou epí- topes que participam diretamente na interação entre o complexo IL-6/IL- 6Ralfa e gp130 é suficiente para interferir estericamente com ligação a gp130. Em adição, a ligação a quaisquer regiões ou epítopes adjacentes àqueles que participam diretamente na interação pode também ser suficiente para bloquear estericamente à interação entre IL-6/IL-6Ralfa e gp130. Tais regiões ou epítopes podem existir na IL-6/IL-6Ralfa, ou como locais compos- tos somente formados pelo complexo de IL-6 e IL-6Ralfa. Em particular, epí- topes adequados aos quais ligacao pode bloquear estericamente a interacao entre IL-6 e gp130 incuem, mas nao estao limitados a, quaisquer epistopes incluindo pelo menos um dos seguintes aminoacidos: Leu19, Arg24, Lys27, Argo30, Tyr31, Asp34 e Trp157 de II-6 humana.
Geracao de Anticorpos que Bloqueiam Estericamente a Interacao Entre IL-6 e gp130
Desse modo, uma característica importante da invenção é o iso- lamento de anticorpos que se ligam ao complexo de IL-6/ IL-6Ralfa, e blo- queiam estericamente a interação IL-6/gp130. Tais anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. De acordo com a invenção, tais anticorpos po- dem ser gerados pelo seguinte método. Em uma primeira etapa, um camun- dongo, um rato, um coelho, ou outro mamífero, é imunizado com uma com- posição de proteína compreendendo IL-6 e IL-6Ralfa. É preferível ter o IL-6 e IL-6Ralfa formando um complexo. Para facilitar a formação do complexo, IL- 6 e IL-6Ralfa podem ser covalentemente ligados por, por exemplo, reticula- ção química, ou por conexão através de um articulador de polipeptídeo. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, o objetivo de tal imunização é que somente as superfícies expostas de IL-6 são ou superfícies ligadas por gp130, ou não são superfícies de neutralização. Anticorpos que são esteri- camente bloqueados por IL-6Ralfa não devem ocorrer. Imunogens particu- larmente preferidos incluem IL-6 covalentemente ligados, e IL-6Ralfa solú- veis, que podem ser produzidos pela ligação de IL-6 e IL-6Ralfa in vitro e, em seguida, tratando com um agente de reticulação padrão, de acordo com procedimentos-padrão, ou pela expressão de IL-6 e IL-6Ralfa como uma proteína de fusão, preferivelmente fixadas por um articulador, por exemplo, conforme descrito por Peters et aí U. Immunol.. (1998) 161:3575-81, os en- sinamentos dos quais são aqui incorporados por referência). De acordo com a invenção, tipicamente, uma proteína de fusão de ímunogen incluindo IL-6 e IL-6Ralfa também inclui uma porção adicional que facilita a apresentação de antígeno, tal como uma região Fe. A composição de proteína pode ser admi- nistrada a um mamífero com ou sem adjuvante, de acordo com qualquer de uma variedade de métodos-padrão. A composição pode ser administrada somente uma vez, mas é preferivelmente mais do que uma vez, de acordo com tabelas de reforço-padrão.
Como uma segunda etapa, antisoro policlonal é colhido a partir de mamíferos imunizados. O soro policlonal pode ser usado diretamente, ou pode ser purificado por afinidade de acordo com métodos-padrão. Alternati- vamente, o processo de geração de anticorpos monoclonais é iniciado. Célu- las de produção de anticorpo são removidas a partir do animal imunizado, por exemplo, por remoção cirúrgica do baço ou retirada de PBMC, e classifi- cação subseqüente. Células de produção de anticorpo potenciais são, em seguida, imortalizadas por fusão com uma linha de célula imortalizada, de acordo com procedimentos-padrão, clonadas em cavidades de microtitula- ções, e classificadas para produção de anticorpos que se ligam ao inuno- gem.
Em outra concretização, como uma segunda etapa, uma biblio- teca mostradora é gerada pelo isolamento de células apropriadas de animais não-imunizados ou imunizados, seguido pelo isolamento de ácidos nucléicos que codificam regiões V de anticorpos, inserção dos ácidos nucléicos que codificam região V em fagos, levedura, bactéria, ou outros sistemas mostra- dores genéticos replicáveis. Os números da biblioteca são, em seguida, classificados por sua capacidade de se ligar a complexos de IL-6/IL-6Ralfa.
Em alguma concretização, como uma terceira etapa, os anticor- pos produzidos por linhas de célula policlonal, ou as regiões V de anticorpo selecionadas a partir da biblioteca, são opcionalmente submetidas a classifi- cações secundárias. Especificamente, os clones de anticorpo, ou as regiões V de anticorpo, são testados por sua capacidade de se ligar a IL-6 sozinha, para se ligar a IL-6Ralfa sozinha, ou se ligar a complexo de IL-6/IL-6Ralfa, e para a capacidade de inibir a interação entre um complexo de IL-6/IL-6Ralfa e gp130. A partir dos resultados destes testes, os anticorpos ou regiões V de anticorpo podem ser classificados em vários grupos: anticorpos de neutrali- zação que se ligam a IL-6 e bloqueiam interação com gl130, anticorpos que se ligam a IL-6 IL-6Ralfa, anticorpos de não-neutralização que se ligam a IL- 6, anticorpos de neutralização que se ligam ao complexo de IL-6/IL-6Ralfa, mas não a IL-6 ou IL-6Ralfa sozinha e bloqueiam a interação com gp130, e anticorpos de neutralização que se ligam a IL-6 e bloqueiam interação com IL-6Ralfa. Os anticorpos de cada classe, exceto a última, são esperados. Tais ensaios de ligação e sinalização são bem-conhecidos na técnica de bioquímica de proteína e transdução de sinal, e concretizações específicas são adicionalmente detalhadas nos Exemplos.
Identificação de Anticorpos que não Extendem Significantemente a Meia- vida de Soro de IL-6
Um efeito indesejado de anticorpos anti-IL-6 é que eles freqüen- temente prolongam a meia-vida do soro de IL-6. O peso molecular de IL-6 é cerca de 25.000 Dáltons, que é bem abaixo do limite de folga renal de 50.000 Dáltons, enquanto o peso molecular de um complexo de anticorpo-IL- 6 é acima de 150.000 Dáltons. A formação de complexos de anticorpo anti- IL-6/antígeno geralmente tem o efeito de aumentar a meia-vida do soro de IL-6 porque o peso molecular do complexo é maior do que o limite de folga renal. Desse modo, a presente invenção também proporciona métodos para identificar anticorpos que se ligam a IL-6, ou complexo de IL-6/IL-6Ralfa, mas não extende significantemente a meia-vida do soro de II-6.
O método envolve, como uma primeira etapa, o isolamento de um painel de anticorpos anti-IL-6. Como uma segunda etapa, os anticorpos são, em seguida, testados para seu efeito na meia-vida do soro de IL-6, por exemplo, conforme segue. IL-6 é administrada a um animal, tal como um roedor. É conveniente usar uma forma etiquetada de IL-6, tal como IL-6 ra- dioativo. Um anticorpo a ser testado é também administrado ao mesmo ani- mal, preferivelmente por uma rota diferente de administração. Como um con- trole negativo, PBS é administrado no lugar de, ou o anticorpo, ou a IL-6.
Amostras de soro são obtidas em vários tempos após administração das proteínas, e testadas para níveis de IL-6, e o anticorpo de acordo com técni- cas-padrão. Por exemplo, IL-6 raioetiquetada iodinatada pode ser quantifica- da usando-se um contador de radiação, e o anticorpo pode ser detectado por um método ELISA na captura de IL-6.
É contemplado que alguns anticorpos têm um perfil farmacociné- tico extendido comparado a outros, e alguns anticorpos causam um aumento das farmacocinéticas de IL-6, enquanto outros anticorpos causam somente uma extensão moderada ou essencialmente nenhuma. Dependendo da apli- cação particular, uma classe de anticorpos preferidos da invenção são aque- les que tem um perfil farmacocinético favorável, mas não extendem signifi- cantemente o perfil farmacocinético de IL-6.
Seqüências de Regiões Variáveis de Anticorpo As seqüências de regiões V de anticorpo identificadas de acordo com métodos descritos acima são caracterizados usando-se métodos de seqüenciamento-padrão conhecidos na técnica. Um método exemplar é des- crito em detalhes no Exemplo 4. Seqüências exemplares de cadeia pesada de anticorpo e regiões V de cadeia leve que se ligam a IL-6 e bloqueiam sua interação com gp130 são mostrados na figura 2. A figura 2 também ilustra um alinhamento das seqüências de região V de anticorpo identificada de acordo com a presente invenção. A variação de posições entre as seqüên- cias são indicadas com setas. As regiões de CDR são envolvidas por caixa.
As regiões V da invenção podem ser configuradas com regiões constantes humanas para formarem um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico exemplar podem incluir regiões de VH e VL descritas na figura 2, e regiões constantes derivadas de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgD ou IgM. Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser expressos com regi- ões constantes de isotipo híbrido, conforme descrito na publicação PCT WO 02/072605, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência. As regiões V da invenção podem também serem configuradas como porções Fab, "minicorpos" carecendo do domínio de CH2, ou como porções Fv de cadeia simples. Estas últimas configurações são menores do que os anticor- pos totais, e têm características de difusão aumentadas, que podem ser Ci- teis em situações requerendo penetração eficiente de tecido, tal como no tratamento de tumores que secretam IL-6. Expressão
Os anticorpos e proteínas contendo regiões variáveis de anticor- po da invenção são preferivelmente expressos em células de mamíferos, tais como NS/0 células, células de CHO, SP2/0células, células de BHK, ou ou- tras células de mamífero. A expressão de anticorpos em células de mamífe- ros é bem-conhecida na técnica de projetos de proteína. Os anticorpos po- dem também serem expressos em células de plantas, tais como milho ou tabaco, células de inseto, tal como via um vetor de baculovírus, células de fungos, tais como S. Cerevisiae ou Pichia pastoris, ou em células bacteriais, que são mais úteis na expressão de configurações menores, tais como mo- léculas Fv de cadeia simples. Administração
Os antagonistas de IL-6 da invenção são usados no tratamento de uma variedade de doenças e enfermidades envolvendo expressão de IL- 6. Tais doenças e enfermidades incluem, mas não estão limitadas a, cânce- res, tais como câncer de próstata independente de hormônio, enfermidades proliferativas de célula B, tais como Iinfoma de não-Hodgkin de célula B, e cânceres avançados de rim, seio, cólon, pulmão, cérebro, e outros tecidos; enfermidades auto-imunes de acionamento de anticorpo, tais como artrite reumatóide, miastenia gravis, eritematose de lúpos sistêmica, e outras doen- ças auto-imunes. As moléculas da invenção podem também serem usadas para tratar caquexia em pacientes com câncer, que freqüentemente resultam de superprodução de IL-6 e IL-6Ralfa por tumores.
Os antagonistas da invenção podem causar um efeito colateral relacionado ao alvo de imunossupressão, particularmente inibição de forma- ção de anticorpo. Quando um paciente está recebendo um anticorpo da in- venção, ele é freqüentemente útil em suplementar o tratamento com um a - gente anti-infectivo profilático. Tais tratamentos profiláticos são bem- conhecidos na técnica de tratamento de pacientes imunosuprimidos.
Um antagonista da invenção é tipicamente administrado por in- fusão, mas podem também serem administrados por administração subcutâ- nea, intradermal, intramuscular, ou injeção intraperitoneal, inalação, ou ad- ministração oral. Para um humano adulto de 70 quilogramas, uma dose na faixa de cerca de 50 a 2000 miligramas é preferida, com uma dose na faixa de 100-800 miligramas mais preferida, e uma dose de cerca de 300-600 mi- ligramas é mais preferida.
A dose precisa pode ser ajustada em uma base de paciente por paciente. Por exemplo, quando se trata um tumor sólido em um paciente, a eficiência de uma dada dose pode ser avaliada conforme segue. Em vários pontos após administração de um anticorpo da invenção, biópsias do tumor são retiradas, e testadas para ativação de gp130, por exemplo, por imuno- manchamento com um anticorpo anti-fosfotirosina apropriado. O objetivo é ter inibição contínua, essencialmente completa de ativação de gp130 no tu- mor. Se a inibição de ativação de gp130 não é completa, a dose pode ser aumentada, ou a freqüência de dosagem pode ser aumentada.
Deve ser compreendido que as concretizações acima descritas e os exemplos que se seguem são dados por meio de ilustração, não limita- ção. Várias mudanças e modificações dentro do escopo da presente inven- ção tornar-se-ão aparentes àqueles versados na técnica a partir da presente descrição.
Exemplos
Exemplo 1. Expressão de um complexo de IL-6/IL-Ralfa para uso como um antíqeno
Para gerar anticorpos que se ligam a uma superfície de IL-6 que interfere com sua ligação a gp130, e seja accessível em complexo de IL- 6/lL-6Ralfa, uma proteína de fusão compreendendo um domínio Fc, os do- mínios extracelulares de IL-6Ralfa, e IL-6, foi expressa de um plasmídeo de- nominado pdCs-Fc-IL6Ralfa-IL6. A proteína de fusão é referida aqui como Fc-IL6Ralfa-IL6. O domínio Fc foi derivado lgGV2a de camundongo, e a IL- 6Ralfa e IL-6 foram baseadas nas seqüências humanas. A seqüência desta proteína e o DNA que codifica esta proteína são mostrados abaixo.
Seqüência de proteína de Fc-IL6Ralfa-IL6(SEQ ID NO:37):
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLI£GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQ ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKSFKCKVNNKDLPAPIER TISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNT EPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHKHHTTKS FSRTPGSqddddd k PPEEPQLSCFRK5PLS1TVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDPQEPCQYSQES QKFSCQIAVPEGDSSFYXVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNP RWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQ LRAQEEFGQGEWSEWSPBAMGTPWTESRSPPAr gqqgs qqqq s vepvppq EDSKDVÃAPH RQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQ GFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDA ITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
Seqüência sublinhada: murina Fc IgGy Seqüência de caso inferior: articulador contendo local de clivagem de ente roquinase
Seqüência em negrito: N6Ralfa humana Seqüência de caso inferior sublinhada: articulador Seqüência itálica: IL6 humana
Seqüência de DNA que codifica Fc-IL6Ralfa-IL6 matura(SEQ ID NO:38)
GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTC TTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCC CTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAG ATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAG GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATG AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGA ACCATCTCAAT^ACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCA GAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCT GAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACT GAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAG AAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAAT CACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGÂCCCCGGGTTCAGGGGATGACGATGACGATAAG CTTCCCCCCGAGGAGCCCCAGCTCTCCTGCTTCCGGAAGAGCCCCCTCAGCAATGTTGTT TGTGAGTGGGGTCCTCGGAGCACCCCATCCCTGACGACAAAGGCTGTGCTCTTGGTGAGG AAGTTTCAGAACAGTCCGGCCGAAGACTTCCAGGAGCCGTGCCAGTATTCCCAGGAGTCC CAGAAGTTCTCCTGCCAGTTAGCAGTCCCGGAGGGAGACAGCTCTTTCTACATAGTGTCC ATGTGCGTCGCCAGTAGTGTCGGGAGCAAGTTCAGCAAAACTCAAACCTTTCAGGGTTGT GGAATCTTGCAGCCTGATCCGCCTGCCAACATCACAGTCACTGCCGTGGCCAGAAACCCC CGCTGGCTCAGTGTCACCTGGCAAGACCCCCACTCCTGGAACTCATCTTTCTACAGACTA CGGTTTGAGCTCAGATATCGGGCTGAACGGTCAAAGACATTCACAACATGGATGGTCAAG GACCTCCAGCATCACTGTGTCATCCACGACGCCTGGAGCGGCCTGAGGCACGTGGTGCAG CTTCGTGCCCAGGAGGAGTTCGGGCAAGGCGAGTGGAGCGAGTGGAGCCCGGAGGCCATG GGCACGCCTTGGACAGAATCCAGGAGTCCTCCAGCTAGAGGGGGCGGGGGCAGTGGGGGC GGGGGCAGTGTAGAACCGGTACCCCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCTGCCCCACAC AGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGC ATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAG GCACTGG CAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAA TCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG GTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTG CAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCA ATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAAC CAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAG TCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAG
Para análise rápida de expressão de proteína para caracterizar o produto de proteína de fusão de Fc-IL-Ralfa-IL6, o plasmídeo pdCs-Fc- IL6Ralfa-IL6 foi introduzido em células HEK de rim embriônicas humanas (ATCCne CRL-1573) por transfecção transiente usando Iipofectamina (Invi- trogen).
Para obter-se clones estavélmente transfectados que expressam Fc-IL6Ralfa-IL6, o DNA de plasmídeo apropriado foi introduzido rio mieloma de camundongo NS/Océlulas por eletroporação. Células NS/O foram cresci- das em meio Eagle modificado de Dulbecco, suplementado com 10% de so- ro bovino fetal inativado por calor, 2 mM de glutamina e penicili- na/streptomicina. Cerca de 5x106 células foram lavadas uma vez com PSB, e ressuspensas em 0,5 ml de PBS. 10 pg de DNA de plasmídeo Iinearizado foram, em seguida, incubados com as células em uma Cubeta Gene Pulsei® (folga de eletrodo de 0,4 cm, BioRad) em gelo por 10 minutos. Eletroporação foi realizada usando-se Gene Pulse® (BioRad, Hercules, CA) com ajustes em 0,25 V e 500 pF. Células foram permitidas recuperar por 10 minutos no gelo, após o qual elas foram ressuspensas em meio de crescimento, e colo- cadas em placas de 96 cavidades. Os clones estavelmente transfectados foram selecionados por seu crescimento na presença de 100 nM de meto- trexato (MTX), que foi adicionado ao meio de crescimento dois dias pós- infecção. As células foram alimentadas de 3 em 3 dias duas ou três mais vezes, e clones resistentes a MTX apareceram em 2 a 3 semanas. Os so- brenadantes dos clones foram avaliados por anti-Fc ELISA para identificar produtores altos. Clones de alta produção foram isolados e propagados no meio de crescimento contendo 100 nM de MTX. O meio de crescimento tipi- camente usado foi H-SMF ou meio CD (Life Technologies).
A proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 foi subseqüentemente cap- turada do meio para análise adicional. Para caracterização de rotina por ele- troforese de gel, as proteínas de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6, secretadas no meio, foram capturadas em gotas de Proteína A Sepharose® (Repligen, Cambrid- ge, MA) e, em seguida, eluídas por ebulição da amostra em tampão de a- mostra de proteína, com ou sem um agente de redução, tal como β- mercaptoetanol. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE, e as faixas de proteína foram visualizadas por manchamento de Coomassie.
Será reconhecido por aqueles versados na técnica que qualquer de uma variedade de proteínas pode ser usada como alternativas para a proteína Fc-IL6Ralfa-IL6 descrita acima. Por exemplo, outras configurações de IL-6Ralfa e IL-6 podem ser usadas, tais como IL-6Ralfa-IL-6-Fc, albumi- na-IL-6Ralfa-IL6, citocina-IL-6Ralfa-IL6, onde ácitocina é escolhida para es- timular uma resposta imune contra o complexo IL-6/IL-6Ralfa. As proteínas compreendendo uma citocina, uma porção Fe, e um complexo IL-66Ralfa/IL- 6, podem ser usadas, por exemplo, de acordo com os métodos de Gillies et al (W001/07081, as descrições dos quais sendo incorporadas por referên- cia). Finalmente, IL-6 e IL-6Ralfa podem ser produzidas separadamente, reticuladas quimicamente, e usadas como um antígeno. Quando uma porção Fc e/ou uma porção de citocina secundária são usadas, é geralmente vanta- joso que estas porções sejam a partir do animal que está sendo imunizado, tal como um camundongo.
Na preparação para a caracterização dos anticorpos descritos abaixo, DNAs codificando Fc-IL6 e Fc-IL6Ralfa foram construídos similar- mente conforme descrito acima. As proteínas correspondentes foram purifi- cadas similarmente conforme descrito acima. Em adição, IL-6 humana, IL6Ralfa humana e gp130-Fc humano foram comprados de R&D Sistems, Inc, para uso em certos experimentos abaixo. Representações esquemáticas destas proteínas usadas nos experimentos são mostradas na figura 3. A pro- teína e seqüências dé DNA de construções reveladas são providas conforme se segue. Fc-IL6Ralfa Matura (SEQ ID NO:39)
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQ ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIER TISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNT EPVLDSEX3SYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGSGDDDDDK LPPEEPQLSCFRKSPLSNWCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQES QKFSCQLAVPEG DS S FYIVSMCVASS VGSKFSKTQT FQGCGILQPDPPANITVTAVARN P RWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHWQ LRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPA
DNA que codifica Fc-IL6Ralfa Matura (SEQ ID NO:4Q)
GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTC
TTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCrTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCC
CTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAG
ATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAG
GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATG
AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGA
ACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCA
GAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCT
GAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACT
GAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAG
AAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAAT
CACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACCCCGGGTTCAGGGGATGACGATGACGATAAG
CTTCCCCCCGAGGAGCCCCAGCTCTCCTGCTTCCGGAAGAGCCCCCTCAGCAATGTTGTT
TGTGAGTGGGGTCCTCGGAGCACCCCATCCCTGACGACAAAGGCTGTGCTCTTGGTGAGG
AAGTTTCAGAACAGTCCGGCCGAAGACTTCCAGGAGCCGTGCCAGTATTCCCAGGAGTCC
CAGAAGTTCTCCTGCCAGTTAGCAGTCCCGGAGGGAGACAGCTCTTTCTACATAGTGTCC
ATGTGCGTCGCCAGTAGTGTCGGGAGCAAGTTCAGCAAAACTCAAACCTTTCAGGGTTGT
GGAATCTTGCAGCCTGATCCGCCTGCCAACATCACAGTCACTGCCGTGGCCAGAAACCCC
CGCTGGCTCAGTGTCACCTGGCAAGACCCCCACTCCTGGAACTCATCTTTCTACAGACTA
CGGTTTGAGCTCAGATATCGGGCTGAACGGTCAAAGACATTCACAACATGGATGGTCAAG
GACCTCCAGCATCACTGTGTCATCCACGACGCCTGGAGCGGCCTGAGGCACGTGGTGCAG
CTTCGTGCCCAGGAGGAGTTCGGGCAAGGCGAGTGGAGCGAGTGGAGCCCGGAGGCCATG
GGCACGCCTTGGACAGAATCCAGGAGTCCTCCAGCTTAG Fc-IL6 Matura (SEQ ID N0:41)
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCWVDVSEDDPDVQ ISWFVNNVEVHTAQTQTHEEDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIER TISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNT EPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKEDSKDVA APHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMMKDG CFQSG FNEETCL VKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKN LDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
DNA que codifica Fc-IL6 Matura (SEQ ID NO:42)
GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTC TTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCC CTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAG ATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAG GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATG AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGA ACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCA GAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCT GAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACT GAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAG AAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAAT CACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACCCCGGGTAAAGAAGATTCCAAAGATGTAGCT GCCCCACACAGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATC CTCGACGGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGC AGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGA TGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTTTG GAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCC AGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAAT CTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAG GCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAG TTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAG
Exemplo 2. imunização com um complexo IL-6/IL-6Ralfa
Vinte camundongos (Balb/C) foram imunizados com proteína Fc- IL6Ralfa-IL6 produzida conforme descrito no Exemplo 1, e anticorpos mono- clonais para esta proteína foram produzidos de acordo com uma modificação do método de Kohler e Milstein (1975) (Nature. 256:495-7). Especificamente, 1 micrograma de Fc-IL6Ralfa-IL6 foi injetado subcutaneamente com 100 mi- crolitros de adjuvante de Freund completo. Injeções foram repetidas 14 dias mais tarde, usando 1 micrograma de proteína injetado intraperitoneamente com 100 microlitros de adjuvante de Freund completo. 24 dias após a primei- ra injeção, os camundongos foram reforçados com 1 micrograma de proteína de Fc-IL6Ralfa-IL6 em 100 microlitros de PBS intravenosamente. Três dias mais tarde, os camundongos foram sacrificados, e os baços excisados, e as células do baço cultivadas de acordo com os procedimentos-padrão. 435 milhões de células de baço dos dois camundongos com respostas de anti- IL6Ralfa/IL6 policlonais foram fundidas com 175 milhões de células NS/0 em uma razão de 2,4 células de baço para 1 célula NS/0. Célula imortalizada B/híbridos de célula NS/0 foram produzidos de acordo com procedimentos- padrão, e hibridomas foram, em seguida, classificados para a produção de anticorpos contra a proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 usando Tecnologia ELISA.
Exemplo 3. Classificação de anticorpos que bloqueiam a interação entre o complexo IL-6/IL-6Ralfa e gp130
Ligação
Clones positivos do Exemplo 2 foram adicionalmente testados conforme segue. O isotipo do anticorpo foi determinado, e clones baseados em IgM não foram caracterizados adicionalmente. Os anticorpos monoclo- nais baseados em IgG foram testados para sua capacidade de se ligar a, ou IL-6, ou IL-6Ralfa, usando Fc-IL6 e Fc-IL6Ralfa imobilizados de acordo com os procedimentos-padrões. Alguns clones se ligam a IL-6, alguns se ligam a IL-6Ralfa, e alguns não se ligam a proteínas, sugerindo que estes monoclo- nais podem reconhecer alguma porção do articulador, ou podem reconhecer epítopes compostos consistindo ambos em porções de IL-e e IL-6Ralfa.
Os resultados exemplares das características de ligação de anti- corpos típicos da invenção são mostrados na figura 4 (ligação a Fc-IL6Ralfa- IL6), figura 5 (ligação a IL-6), figura 6 (ligação a IL-6 e IL-6Ralfa não- covalentemente complexados), e figura 7 (IL-6Ralfa sozinha). Os resultados indicam que, para este conjunto de anticorpos, a ligação a IL-6 e IL-6 e IL- 6Ralfa covalentémente ligados foi similar, ligação a complexos IL-6-6Ralfa não-covalentes dão um sinal menos forte (possivelmente por causa da dis- sociação de IL-6 de IL-6R durante etapas de lavagem), e ligação a IL-RaIfa sozinha não pode ser detectada. Testes de competição
Para caracterizar adicionalmente os anticorpos que reconhecem IL-6, os seguintes testes de competição foram realizados. Primeiro, a capa- cidade dos anticorpos monoclonais de inibir a interação entre Fc-IL6Ralfa- IL6 e gp130 foi testada. Os ensaios de inibição foram realizados baseados nos métodos descritos por Scheller et ai., J. Immuno. Methods. 291:93- 100(2004), os ensinamentos dos quais são, desse modo, incorporados por referência. Quatro anticorpos, denominados Mabn9195, Mabns309, Mabns471 e Mabns476 foram identificados, que bloqueiam esta interação. Segundo, inibição da interação entre Fc-IL6 e Fc-IL6Ralfa pelos anticorpos foi testada. Nenhum dos anticorpos foram verificados inibir esta interação, que foi esperada baseada no fato que os anticorpos derivados de uma imu- nização com Fc-IL6Ralfa-IL6 suportou uma classificação inicial para ligação a Fc-IL6Ralfa-IL6.
Os resultados típicos ilustrando a inibição da interação entre Fc- IL6Ralfa-IL6 e gp130 são mostrados na figura 8. Ensaio baseado em célula
Os anticorpos MabneI 95, Mabn9309, Mabns471 e Mabne476 fo- ram testados para sua capacidade de bloquear a liberação de haptoglobina de células HepG2 estimuladas com um complexo de Fc-IL6Ralfa-IL6. A hap- toglobina é uma proteína secretada pelas células do fígado durante estados inflamatórios. As células HepG2 são uma linha de célula de fígado. A libera- ção de haptoglobina de células HepG2 proporciona um bioensaio convenien- te para a atividade de complexos de IL-6Ralfa/IL6.
O ensaio foi realizado conforme se segue. Células HepG2 foram colocadas em 0,1 x 106 células por cavidade em uma placa de 96 cavidades, e permitidas crescerem em DMEM suplementado com 10% de meio de Soro Bovino Fetal (FBS) durante a noite. As células foram, em seguida, lavadas com PBS, e incubadas em meio sem alimento, DMEM sem FBS, por 1 hora a 37°C. As células foram, em seguida, incubadas em meio de estimulação, DMEM (sem PBS) na presença de 8 ng/ml de complexo de Fc-IL6Ralfa-IL6, e várias concentrações de anticorpo de teste suplementado por 22 horas. Os sobrenadantes foram retirados, e os níveis de haptoglobina foram determi- nados por um método ELISA para detecção de haptoglobina. Um procedi- mento ELISA-padrão foi seguido, usando-se um anticorpo de haptoglobina anti-humano alvo (Sigman°H5015) para captura, um anticorpo haptoglobina anti-humano de camundongo (US Biologicaln°H1820-05) como um primário, e um anticorpo IgG-HRP anticamundongo (Promegan°W402B) como um an- ticorpo secundário. Os resultados típicos são mostrados na figura 9.
Análise Biacore
A ligação de anticorpos Mabn9195, Mabn9309, Mabne471 e Mabn9476 foi quantitativamente caracterizada usando-se uma máquina Bia- Core. Os anticorpos foram imobilizados em um chip; proteína de IL-6 foi passada sobre o chip, e taxas de entrada e taxas de saída foram medidas.
Parâmetro mAbns195 mAbn9309 mAbne471 mAbns476 Kd(1/Ms) 2,4 χ 106 8 χ 105 1,8 χ 106 2,5-2,6 χ 106 KdO/s) 4,8 χ 10 3 1,1 χ IO-4 1,4 χ 10"5 1,2-2,6 χ 10"4 K0(PM) 2000 135 7,5 47-106
Inibicão de proliferação de linhas de célula de câncer 20 Os anticorpos da invenção foram testados para sua capacidade
de inibir a proliferação de células A431 e células LP-1. A inibição da prolife- ração de células LP-1 é descrita no exemplo 8. A inibição de proliferação de A431 foi medida conforme segue. No dia 1, as células foram colocadas em placas de 96 cavidades em 25.000 células/cavidade em DMEM contendo 25 10% de FBS, com 200 microlitros por cavidade. No dia 3, as células foram lavadas com 200 microlitros de PBS. As células foram desprovidas de ali- mento por 1 hora a 37°C em 100 microlitros de DMEM.
No dia 3, diluições de anticorpos anti-IL6 foram preparadas em 96 placas de fundo em U em DMEM contendo IL6Ralfa-IL6-His6 (33 ng/ml), com todas as proteínas preparadas como diluição 2X porque elas foram, mais tarde, transformadas nas placas contendo as células. Os controles in- cluíam DMEM, DMEM-1%FBS e IL6Ralfa-IL6-His6 em 0%FBS. As placas foram incubadas com as diluições de proteínas por 1 hora a 37°C, após o qual 100 microlitros de proteína foram transferidos para a células sem ali- mento.
No dia 5, as células em cada cavidade foram lavadas duas ve- zes com 200 microlitros de PBS, e, em seguida, 100 microlitros de uma so- lução para medir fosfatase ácida. A solução foi acetato de sódio a 0,1 M pH 5,5, 0,1% de Triton X-100, 2,5 mg/ml de paranitrofenilfosfato. As placas fo- ram incubadas a 37°C por 1 hora, após o qual a reação foi cessada com 100 microlitros de NaOH a 0,1 N, e a placa foi lida a 410 nm.
Os resultados típicos foram ilustrados nas figuras 10A, 10B-1 e 10B-2. Conforme mostrado nas figuras 10B-1 e 10B-2, os anticorpos da in- venção inibem a proliferação de células de carcinoma epitelial humano A431 vistas com estimulação por proteína de fusão IL-6-6Ralfa. Um resultado típi- co de proliferação de células A431 estimulada por proteína de fusão IL-6/IL- 6Ralfa é mostrado na figura 10A.
Exemplo 4. Seqüência de região V de anticorpos que se ligam a IL-6 e blo- queiam interação com gp130
As seqüências de região V de anticorpos monoclonais MabnsI 95, Mabns309, Mabn9471 e Mabns476 foram determinadas de acor- do com os procedimentos-padrões. O mRNA de cada clone de hibridoma foi purificado usando-se o kit Dynabeads Direct mRNA (DynaI), seguindo-se as instruções do fabricante. PCR de transcrição reversa (RT-PCR) foi realizada para obter-se cDNA usando-se o kit de síntese de DNA BD SMART^ (BD Clontech) de acordo com o manual do fabricante. Duas PCR sucessivas fo- ram realizadas usando-se o cDNA como gabarito, oligonucleotídeos embuti- dos, e a polimerase KOD (EMO Biosciences), conforme instruído pelo fabri- cante. Os 3' oligonucleotídeos foram específicos para amplificar VH e Vk de um anticorpo de IgGyI, enquanto os 5' oligonucleotídeos eram oligonucleo- tídeos embutidos a partir de síntese de cDNA BD SMART® (seqüências adi- cionadas ao 5' durante a RT-PCR).
Por exemplo, regiões V de cadeia pesada e de cadeia leve fo- ram obtidas por amplificação de PCR usando-se um iniciador de região constante e um iniciador de região V com as seqüências de oligonucleotí- deos e condições indicadas abaixo:
Amplificação de VH
PCR#1
5'Olinucleotídeo n91: ; 5r acaacgcagagtacgcgg 3' <seq id no:43)
3'Olinucleotídeo nQ 1: : 5' aggagagctgggaaggtgtg 3' (Seq id no:44)
PCR#2
5' Olinucleotídeo n9 2: 5' acaacgcagagtacgcgg 3' (seq id no:45)
3' Olinucleotídeo n9 2: s' tagcccttgaccaggcatccc 3' (seq id no:46)
Amplificação de Vk
PCR#1
5' Olinucleotídeo n9 1
3' Olinucleotídeo n91
no:48)
pcr#2
5, Olinucleotídeo n9 2:
3' Olinucleotídeo n9 2:
5' ACAACGCAGAGTACGCGG 3' (SEQ ID NO:47)
5' ctgccatcaatcttccacttgac 3' (seq id
5' catcctctcttccagctctc 3' (seq id ho:49)
5' ctgaggcacctccagatg 3' (seq id no:50)
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Os produtos de PCR foram purificados de gel de agarose usan- do-se o kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN), e subclonados no vetor TOPO blunt pCR4 (Invitrogen) para seqüenciamento. As seqüências foram obtidas usando-se iniciadores T7 e T3 e procedimentos de seqüenciamento- padrão.
As seqüências de cadeia leve e de cadeia pesada, incluindo as seqüências de região V de Mabn9195, Mabne309, Mabne471 e Mabns476, são mostradas abaixo: Região matura de Mabn°195 VH (SEQ ID NO:33)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYAT HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTREDYYGYPDYWGQGTTLTVSS
Região matura de Mabn°195 VK (SEQ ID NO:29) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYVASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK
Reoião matura de Mabn°309 VH (SEQ ID NO:34) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNKGAT HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCASLLYDGYLHWGQGTLVTVSA
Reoião matura de Mabn°309 VK (SEQ ID NQ:30) DIVLTQS PASLAVSLGQRATISCRASES VGN FGIS FMNWFQQKPGQPPKLLIYTASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMY FCQQSK1VFWTFGGGTKLEIK
Reoião matura de Mabn°471 VH (SEQ ID NO:35) EVKFEE SGGGL VQ PGGSMKLS CVAS G FS FSN Y WMNWVRQS PEKGLEW VAEIRLT SNKQAI YYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCASLFYDGYLHWGQGTLVTVSA
Reoião matura de Mabn°471 VK (SEQ ID NO:31) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVGNFGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMY FCQQSKEIPSfTFGGGTKLEIK
Região matura de Mabn°476 VH (SEQ ID NO:36) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHAT YYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAE DTGIYYCTT PTLYGAMDYWGQGT SVTVSA
Região matura de Mabn°476 VK (SEQ ID NO:32) DIVLTQS PASLAVSLGQRATISCRASESVHN FGIS FMNWFQQKPGQPPKLLI YTASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDTAMYFCQQGKEVPWTFGGGTKLEIK
DNA oue codifica região matura de mAbn°195 VH (SEQ ID NO:51) GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTC TCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCT CCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACA CATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGT GTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGG GAGGACTACTACGGCTACCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
DNA oue codifica região matura de mAbn°195 VK (SEQ ID NO:52) gacattgtggtgacccagtctccagcttctttggctgtgtctctaggtcagagggccacc atctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattttggcattagttttatgaactggttc caacagaaacctggacagccacccaaactcctcatctatgttgcatccaaccaaggatcc ggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat cctatggaggaggatgatactgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttccgtgg acgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
DNA que codifica região matura de mAbn9309 VH (SEQ ID NO:53) gaagtgaaacttgaggagtctggaggaggcttggttcaacctggaggatccatgaaactc
tcctgtgttgcctctggattcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtct
ccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagactgaaatctaataagggtgcaaca
cattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagggatgattccaaaagtagt
gtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtgccagc
cttttgtatgatggttacttacattggggccaagggactctggtcactgtctctgca DNA que codifica região matura de mAbnQ309 VK (SEQ ID NO:54)
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc atctcctgcagagccagcgaaagtgttggtaattttggcattagttttatgaattggttc caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatactgcatccaaccaaggatcc ggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat cctatggaggaggatgattctgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttccgtgg acgttcggtggaggcaccaaactggaaatcaaa
DNA gue codifica região matura de mAbn9471 VH (SEQ ID NO:55)
gaagtgaagtttgaggagtctggaggaggcttggtgcaaccgggaggatccatgaaactc tcctgtgttgcctctggattcagtttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtct ccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgacatctaataagcaggcaata tattatgcggagtctgtgaaagggagattcaccatctcaagagatgattccaaaagtagt gtctacctgcaaatgaacaacctaagagctgaagacactggcatttattactgtgccagc cttttctatgatggttacttacattggggccaagggactctggtcactgtctctgca
DNA gue codifica região matura de mAbn9471 VK (SEQ ID NO:56)
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggcxgtgtctctagggcagagggccacc atctcctgcagagccagcgaaagtgttggtaattttggcattagttttatgaactggttc caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatactgcatccaaccaaggatcc ggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat cctatggaggaggatgattctgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggagattccgtgg acgttcggtggaggcaccaaactggaaatcaaa PNA que codifica região matura de mAbn9476 VH (SEQ ID NO:57) GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAMCTC TCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCT CCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGTAAAGCTAATAATCATGCAACA
TACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGT GTCTACCTGCAAATGAACAGCCTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACGACÇ CCTACTCTCTATGGCGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCTGCA
DNA que codifica região matura de mAbnQ476 VK (SEQ ID NO:58) GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTTGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTCATAATTTTGGCATTAGCTTTATGAACTGGTTC
CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTGCATCCAACCAAGGATCC
GGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT
CCTGTGGAAGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAACAAGGTAAGGAGGTTCCGTGG
ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC
As seqüências das regiões V foram alinhadas conforme mostra- do na figura 2. As variações de posição entre as seqüências são indicadas com setas. As regiões de CDFR são envolvidas por caixa. Baseado no ali- nhamento, é aparente que cada anticorpo representa um isolado indepen- dente, e que os anticorpos são similares um ao outro. Os anticorpos 309 e 471 são proximamente relacionados, com somente uma substituição na ca- deia leve, uma substituição Ile/Val na posição 98; e somente seis substitui- ções na cadeia pesada. Estes anticorpos podem derivar de um clone IgM original que diversifica através de mutação somática e, desse modo, não pode ser verdadeiramente independente.
Os anticorpos 195 e 476 são mais similares um ao outro do que os anticorpos 309 e 471. Os anticorpos 195 e 476 diferem nas posições 5 na cadeia leve e nas posições 18 na cadeia pesada. A análise das CDR3 na cadeia pesada dos anticorpos 195 e 476 sugerem que estas cadeias foram formadas por eventos independente de união V-D-J, e, desse modo, repre- sentam anticorpos derivando de IgM originais independentes. Desse modo, as seqüências de anticorpo na figura 2 representa pelo menos 3 seleções independentes de anticorpos que se ligam a IL-6 humana, e bloqueiam a interação com gp130.
Exemplo 5. Propriedades farmacocinéticas de anticorpos que se ligam a IL-6 e bloqueiam interação com gp130
A meia-vida de soro de anticorpos 195 e 476 em camundongos foi determinada. Os anticorpos 195 e 476 foram etiquetados 125I de acordo com procedimentos-padrões. Cerca de 25 microgramas de proteína de anti- corpo etiquetado foi injetado intravenosamente em camundongos Balb/c, e amostras de sangue foram retiradas em vários tempos incluindo 12, 24, 48 e 72 horas após injeção. Os níveis de radioatividade nas amostras de sangue totais foram determinados. Baseado nesta análise, a meia-vida de elimina- ção foi cerca de 5 dias para cada anticorpo. Os dados exemplares são mos- trados na figura 11.
Exemplo 6. Inibição in vivo de secrecão de haptoqlobina
Os anticorpos da invenção foram selecionados especificamente para sua capacidade de inibir a ligação de IL-6 a subunidade receptora gp130. Neste experimento, usando-se um ensaio que mede a secreção de haptoglobina induzida pela administração de um complexo solúvel de IL-6- 6Ralfa/IL-6, a capacidade de anticorpo Mabns471 e um anticorpo comercial anti-IL-6 de bloquear a ativação de uma trajetória dependente de gp-130 in vivo foi comparada.
No dia O, camundongos Balb/c fêmeas de nove semanas de ida- de (n=3 por grupo de tratamento) foram injetados intraperitonealmente com 100 Mg de, ou anticorpo Mabne471, ou um anticorpo comercial anti-IL6 de R&D Systems (R&D Systems MAb n9206) em um volume de 200 μl. Os ca- mundongos em grupos de controle positivo e negativo receberam 200 μΙ de PBS. Após 24 horas, os camundongos nos grupos de controle experimental e positivo foram administrados com 4μg de muFc-IL6Ralfa-IL6 intraperito- nealmente em um volume de 200 μl para induzir secreção de haptoglobina, e os camundongos no grupo de controle negativo foram administrados com 200 μl de PBS. Em 0, 8 e 24 horas após tratamento, aproximadamente 100 μΙ de sangue foi obtido de cada camundongo por sangria retroorbital, e a fração de plasma foi isolada. A concentração de haptoglobina na fração de plasma foi determinada usando-se um kit ELISA de murina haptoglobina (lmmunology Consultants Laboratory, Inc., Newberg, OR1 CatnºE90HPT), seguindo as instruções do fabricante.
Conforme mostrado na figura 12, os níveis de haptoglobina nos camundongos tratados com anticorpo Mabnº471 foram significantemente menores, cerca de 30% do nível visto no grupo de controle positivo em 24 horas, e também significantemente menor do que em camundongos tratados com o anticorpo comercial MAbns206. Os níveis aumentados de haptoglobi- na vistos nos camundongos do grupo de controle negativo foram apropria- dos devido à irritação causada pelo procedimento de sangria repetido retro- orbital. Desse modo, a inibição atual de secreção de haptoglobina causada especificamente por Fc-IL6Ralfa-IL6 é ainda maior do que 70%, quando a prática de secreção de haptoglobina vista nos camundongos de controle é subtraída. Estes resultados demonstram que o anticorpo da invenção, por exemplo, anticorpo ne471, que se liga a IL-6 e bloqueia sua interação com a subunidade receptora de gp-130, é efetivo na inibição de trajetórias de sina- lização dependente de gp-130 que pode ser ativada por um complexo pré- formado de IL-6Ralfa/IL6.
Exemplo 7. Atividade de antitumor in vivo
Os anticorpos MabnsI 95, Mabns309, Mabne471 e Mabn9476 fo- ram testados para atividade de antitumor in vivo. Um modelo de metástase de pulmão foi observado em camundongos SCID usando células de PC3- MM2 que secretam IL-6, e para qual IL-6 é um fator de crescimento. Cerca de 2,0 χ 106 de células de PC3-MM2 foram injetados i.v. em cada camun- dongo. Após 11 dias os camundongos foram tratados com cinco doses diá- rias de 5 pg/ml dos anticorpos monoclonais MabneI 95, Mabne309, Mabns471 e Mabne476. Os resultados típicos são mostrados na figura 13. Conforme ilustrado na figura 13, os anticorpos MabnQ195, Mabnº309, Mabnº471 e Mabnº476 inibem metástase em camundongos.
Outro experimento foi feito usando-se tratamento de anticorpo após somente 5 dias pós-injeção de célula, ao invés dos 10 dias usuais. Re- sultados similares foram obtidos.
Exemplo 8. Construção de anticorpos anti-IL6 com regiões constante huma- nas
Um anticorpo quimérico contra IL-6 que inclui as regiões V a par- tir do anticorpo Mabn9471 e regiões constantes humanas foi construído por técnicas conforme descritas na Patente U.S.N9 6.969.517, para Gillies et ai, os ensinamentos da qual são, desse modo, incorporados por referência. As seqüências de DNA que codificam as regiões V de Mabns471 foram obtidas por amplificação de PCR usando-se os seguintes oligonücleotídeos. As regi- ões em letras minúsculas são para adaptadores e as regiões de letras mai- úsculas são região V específica.
<table>table see original document page 38</column></row><table>
As seqüências derivadas de camundongo resultantes foram in- seridas em um vetor de expressão de anticorpo, conforme descrito na Paten- te U.S.N0 6.969.517, exemplo 3, para gerar um plasmídeo de expressão que codifica um anticorpo quimérico com uma cadeia leve kappa humana, e uma cadeia pesada IgGI humana.
De modo a obter clones de célula humana estavelmente trans- fectadas, o DNA de plasmídeo foi introduzido nas células NS/0 de mieloma de camundongo por eletroporação, conforme descrito abaixo. Células NS/0 foram crescidas em meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal. Cerca de 5 χ 106 de células foram lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em 0,5 ml de solução tampão de fosfato (PBS). Dez pg de DNA de plasmídeo Iinearizado foi, em seguida, incubado com as células em uma Cubeta Gene Pulse® (folga de eletrodo de 0,4 cm, BioRad) em gelo por 10 minutos. Eletroporação foi realizada usando-se Ge- ne Pulse® (BioRad) com ajustes em 0,25 V e 500 pF. Células foram permiti- das recuperar por 10 minutos no gelo, após o qual elas foram re-suspensas em meio de crescimento, e colocadas em placas de 96 cavidades. Os clones estavelmente transfectados foram selecionados por crescimento na presen- ça de 100 nM de metotrexato (MTX)1 que foi introduzido dois dias pós- transfecção. As células foram alimentadas de 3 em 3 dias duas a três mais vezes, e clones resistentes a MTX apareceram em 2 a 3 semanas. Os so- brenadantes dos clones foram avaliados por anti-Fc ELISA para identificar produtores altos (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods. 125,191). Clones de alta produção foram isolados e propagados no meio de crescimento con- tendo 100 nM de MTX.
Para confirmar que o anticorpo 471 quimérico retém as proprie- dades desejadas, esta molécula foi testada para inibição de produção de haptoglobina in vitro, conforme descrito no exemplo 6 acima; para inibição de proliferação de células de mieloma de LP-1; e para inibição de produção de haptoglobina in vivo, conforme descrito no exemplo 6 acima. Como con- troles, os anticorpos anti-IL-6 Mab 206 (R&D Systems; Minneapolis, Minne- sota) e CNTO (Zaki Μ. H. et. al., Int J. Câncer. (2004)111:592-5) foram usa- dos.
Efeitos de anticorpo 471 quimérico (Ch anti-IL-6ne471) produzido
de uma linha de célula estavelmente transfectada na secreção de haptoglo- bina são indicados na tabela abaixo. Resultados similares foram obtidos de anticorpo 471 quimérico produzido de células transientemente transfectadas.
<table>table see original document page 39</column></row><table> Os resultados indicam que o anticorpo 471 quimérico é efetivo na inibição da função de ambas IL-6 e a proteína de fusão de IL-6-6Ralfa. Em contraste, Mabn°206 é relativamente inefetivo na inibição de secreção de haptoglobina estimulada por, ou IL-6, ou proteína de fusão de IL- 6/ILRalfa, e CNTO-328 mostra um defeito profundo na inibição de secreção de haptoglobina estimulada por proteína de fusão de IL-6/IL-6Ralfa.
O anticorpo 471 quimérico foi também testado para sua capaci- dade de inibir proliferação de células de mieloma de LP-1. LP-1 é uma linha de célula de mieloma humana cuja proliferação pode ser estimulada por IL-6.
O ensaio de proliferação de célula de LP-1 foi realizado confor- me segue. Células de LP-1 foram compradas de DSMZ (catn°ACC41) (Ger- gij-Hemming P et ai, Blood (1996) 88:2250). As células foram cultivadas em 20% de FBS e, em seguida, enfraquecidas por 3 dias em 1% de meio de FBS antes do ensaio de proliferação. Após inanição, as células foram Iava- das três vezes e diluídas em 0,5% de meio contendo FBS. Anticorpos anti- IL-6 foram diluídos e incubados na placa com, ou 0,005 ng/ml de IL-6, ou 0,05 ng/ml de estimulação de proteína de fusão de FclL6Ralfa-IL6 por uma hora a 37°C 5% de CO2. Em seguida, 100.000 células em 100 μl foram adi- cionadas às cavidades de uma placa de 96 cavidades com 100 μl de proteí- nas diluídas mais estimulação, incubadas por 56 horas, e, em seguida, 3H Thimidina foi adicionada por pelo menos 16 horas. As células foram, em se- guida, colhidas das cavidades com água nas placas de filtro de microfibra de vidro e radioativamente foi medida por contagem de cintilação líquida.
A tabela abaixo mostra os resultados típicos com anticorpo 471 quimérico produzido de uma linha de célula estavelmente transfectada. Os resultados similares foram obtidos do anticorpo 471 quimérico de células transientemente transfectadas.
<table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table>
Os resultados indicam que o anticorpo 471 quimérico é efetivo na inibição de proliferação de LP-1 estimulada por ambas IL-6 e a proteína de fusão de IL-6-6Ralfa. Em contraste, Mabn°206 é inefetivo na inibição de proliferação de LP-1 estimulada por IL-6, e CNTO-328 mostra um defeito profundo na inibição de proliferação de LP-1 estimulada por proteína de fu- são de IL-6/IL-6Ralfa.
Os efeitos inibitórios de anticorpo 471 quimérico e vários anti- corpos de controle na secreção in vivo foram também testados conforme descrito no Exemplo 6.
Os seguintes resultados foram obtidos.
<table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table>
Estes resultados indicam que anticorpo 471 quimérico (referido como Ch 471 na tabela acima) bloqueia fortemente a secreção de haptoglo- bina estimulada por um complexo de IL-6/IL-Ralfa, enquanto anticorpos de controle, tais como Mabne206 e CNTO-328 são menos efetivos, ou inefetivos na inibição de secreção de haptoglobina.
Exemplo 9. Tratamento de um paciente humano com anticorpos e métodos da invenção
Os anticorpos anti-IL-6 da invenção são usados para tratar do- enças e enfermidades humanas conforme segue. Em geral, o método prefe- rido de administração é por i.v infusão, ou i.v. injeção, embora injeção subcu- tânea, inalação, distribuição oral, e outros métodos sejam também possíveis. A administração cerca de uma vez 2, 3 ou 4 semanas é usada, embora a freqüência de administração possa variar dependendo das necessidades do paciente. Uma dose típica é cerca de 100 a 800 mgs para um humano adul- to. Os pacientes tratados são monitorados para sinais de infecção que po- dem resultar de imunossupressão.
Por exemplo, um paciente com doença de Castleman é tratado com anticorpo 471 quimérico da invenção cerca de uma vez de duas em du- as semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infu- são de gota.
Um paciente com rinite reumatóide é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de quatro em quatro semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gota. A progressão de destruição de junta é verificada ser significantemente inibida por monotera- pia, mesmo quando comparada a fármacos anti-reumáticos de modificação de doença.
Um paciente com doença de Crohn é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de quatro em quatro semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gota.
Um paciente com mieloma múltiplo é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de três em três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gota. O tratamento com 471 quimérico é combinado com um tratamento de cuidado-padrão para mieloma múltiplo conforme determinado por um médico, conforme apropriado para o paciente.
Um paciente com câncer de próstata metastático avançado, com uma história de tratamento por quimioterapia convencional, é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de três em três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gota. O trata- mento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um tratamento de cuidado-padrão para câncer de próstata conforme determinado por um mé- dico, conforme apropriado para o paciente. Fármacos antiinflamatórios não- esteroidais, por exemplo, Naproxen®, são também preferidas. Como um re- sultado de quimioterapia anterior, o paciente tem células brancas diminuídas e baixos níveis de células T simples. O paciente é monitorado particularmen- te proximamente para infecção de imunossupressão, e são dados antibióti- cos profiláticos. Verificou-se que o tratamento tem um efeito positivo em sin- tomas tipo caquexia, tal como perda de osso.
Um paciente com câncer de seio refratário de hormônio é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de três em três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão de gota. O tratamento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um tratamento de cuidado-padrão para câncer de seio avançado conforme determinado por um médico, conforme apropriado para o paciente. Fármaco antiinflamatórios não-esteroidais, por exemplo, Naproxen®, são também preferidos.
Em uma estratégia de tratamento alternativa, um paciente com câncer de próstata refratário por hormônio avançado, ou câncer de seio re- fratário de hormônio avançado, é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez de três em três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, em combinação com uma imunocitocina, tal como KS-IL-2. Este dois agentes podem ser co-administrados por infusão de gota. Antes do tratamento, o pa- ciente é dosado com uma quantidade imunoestimulatória de ciclofosfamida. Drogas antiinflamatórias não-esteroidais, por exemplo, Naproxen®, são tam- bém preferidos. Sem desejar estar ligado pela teoria, à combinação de um anticorpo anti-IL6 da invenção e uma imunocitocina, tal como KS-IL2, é par- ticularmente efetiva, em parte porque a IL-6 causa uma supressão de sinali- zação de IL-12 e respostas de TH1, e os anticorpos da invenção revertem esta inibição.
Um paciente com um Iinfoma de célula B é tratado com anticor- po 471 quimérico cerca de uma vez de três em três semanas em uma dose de cerca de 8 mg/kg, opcionalmente em combinação com um anticorpo tal como Rituxan® a cerca de 375 miligramas por metro quadrado de área su- perficial do corpo, que é administrado toda semana. Alternativamente, no caso de um paciente com Iinfoma refratário, tratamento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um radioimunoconjugado, tal como Bexxar® ou Zevalin®.
Claims (32)
1. Anticorpo anti-IL-6, ou um fragmento do mesmo, compreen- dendo um região variável de anticorpo, no qual a região variável de anticorpo se liga a um epitopo na IL-6 em um modo que a ligação bloqueia esterica- mente a interação entre a IL-6 e gp130 na superfície de uma célula adoenta- da.
2. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 1, no qual referida ligação impede que a IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gp130, mas não bloqueie estericamente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa.
3. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual referido epitopo na IL-6 compreende um aminoácido selecionado a par- tir do grupo consistindo em Leu19, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31, Asp34 e Trp 157.
4. Anticorpo anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo consistindo em FTFSNYWMN(SEQ ID NO:2), FSFSNYWMN (SEQ ID NO:3), e FTFSDAWMD (SEQ ID NO:4).
5. Anticorpo anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo consistindo em EIRLKSNNYATHYAESVKG (SEQ ID NO:6), EIRLKSNKGATHYAESVKG (SEQ ID NO:7), EIRLTSNKQAIYYAESVKG (SEQ ID NO:8), e EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO:9).
6. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 -3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo consistindo em EDYYGYPDY (SEQ ID NO:11), LLYDGYLH (SEQ ID N0:12), LFYDGYLH (SEQ ID NO: 13), e PTLYGAMDY (SEQ ID NO:14).
7. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em RASESVDNFGISFM (SEQ ID NO:16), RASESVGNFGISFM (SEQ ID NO:17), RASESVHNFGISFM (SEQ ID NO:18), e RASESVDNYGISFM (SEQ ID NO:19).
8. Anticorpo anti-IL-6, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em TASNQGS (SEQ ID NO:21), VASNQGS (SEQ ID NO:22), e AASNQGS (SEQ ID NO:23).
9. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, no qual a região variável de anticorpo compreende uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em QQSKEVPWT (SEQ ID NO:25), QQSKEVPYT (SEQ ID NO:26), QQSKEIPWT (SEQ ID NO:27), e QQGKEVPWT (SEQ ID NO:28).
10. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 4 a 6, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), ou (SEQ ID NO:4); e uma CDR2 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:6); (SEQ ID N0:7); (SEQ ID N0:8); ou (SEQ ID NO:9); e uma CDR3 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:11); (SEQ ID NO:12); (SEQ ID NO:13); ou (SEQ ID NO:14).
11. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 7 a 9, compreendendo uma CDR1 de cadeia leve de (SEQ ID NO: 16); (SEQ ID NO:17); (SEQ ID NO:18); ou (SEQ ID NO:19); e uma CDR2 de cadeia leve de (SEQ ID NO:21); (SEQ ID NO:22); ou (SEQ ID NO:23); e uma CDR3 de cadeia leve de (SEQ ID NO:25); (SEQ ID NO:26); (SEQ ID NO:27); ou (SEQ ID NO:28).
12. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 10 ou 11, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), ou (SEQ ID NO:4); e uma CDR2 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:6); (SEQ ID NO:7); (SEQ ID NO:8); ou (SEQ ID NO:9); e uma CDR3 de cadeia pesada de (SEQ ID NO:11); (SEQ ID NO:12); (SEQ ID NO:13); ou (SEQ ID NO:14), e uma CDR1 de cadeia leve de (SEQ ID NO:16); (SEQ ID NO:17); (SEQ ID NO:18); ou (SEQ ID NO:19); e uma CDR2 de cadeia leve de (SEQ ID NO:21); (SEQ ID NO:22); ou (SEQ ID NO:23); e uma CDR3 de cadeia leve de (SEQ ID NO:25); (SEQ ID NO:26); (SEQ ID NO:27); ou (SEQ ID NO:28).
13. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 12, compreendendo adicionalmente uma região constante de anticorpo.
14. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 13, com- preendendo uma porção Fc.
15. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 14, no qual a porção Fc é humana.
16. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 13 a 15, no qual o anticorpo compreende uma cadeia leve compre- endendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo con- sistindo em SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32.
17. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 16, no qual o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO:31, ou uma seqüência que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO:31.
18. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 13 a 15, no qual o anticorpo compreende uma cadeia pesada com- preendendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, e SEQ ID NO:36.
19. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com a reivindicação 18, no qual o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma seqüên- cia de aminoácido de SEQ ID NO:35, ou uma seqüência que é pelo menos -90% idêntica a SEQ ID NO:35.
20. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 16 a 19, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:35, e uma cadeia leve compreen- dendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:31.
21. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 16 a 19, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:34, e uma cadeia leve compreen- dendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID N0:30.
22. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 16 a 19, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:36, e uma cadeia leve compreen- dendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
23. Anticorpo anti-IL-6 de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 16 a 19, compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:33, e uma cadeia leve compreen- dendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:29.
24. Molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
25. Composição farmacêutica adequada para o tratamento de uma doença provocada por IL-6 compreendendo uma quantidade farmaco- logicamente efetiva de um anticorpo anti-IL-6 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, opcionalmente junto com um veículo, diluen- te ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
26. Uso de uma anticorpo anti-IL-6 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, ou uma doença auto-imune.
27. Uso de acordo com a reivindicação 26, no qual a doença é provocada por IL6 ou IL6 complexada com IL-6Ralfa.
28. Proteína de fusão compreendendo (i) uma porção Fc de um anticorpo, (ii) IL6Ralpha, e (iii) IL-6.
29. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 28, no qual IL6Ralpha é fundida ao terminal C da porção Fe, e IL6 é fundida ao terminal C de IL6Ralpha.
30. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 28 ou 29, no qual a porção Fc é murina, e IL6Ralpha e IL6 é humana.
31. Uso de uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 30, para a fabricação de um anticorpo anti-IL-6 obtido por imunização de um mamífero com referida proteína de fusão, no qual o anticorpo classificado tem as seguintes propriedades: (i) a região variável de referido anticorpo e liga a um epitopo na IL-6, (ii) bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e gp130 na su- perfície de uma célula adoentada, e (iii) impede que IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gp130, mas não bloqueie estericamente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa.
32. Uso de acordo com a reivindicação 31, no qual o anticorpo classificado é um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75538305P | 2005-12-30 | 2005-12-30 | |
| US60/755,383 | 2005-12-30 | ||
| PCT/EP2006/012236 WO2007076927A1 (en) | 2005-12-30 | 2006-12-19 | Anti-il-6 antibodies preventing the binding of il-6 complexed with il-6ralpha to gp130 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0620797A2 true BRPI0620797A2 (pt) | 2011-11-22 |
Family
ID=37950573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0620797-9A BRPI0620797A2 (pt) | 2005-12-30 | 2006-12-19 | anticorpos anti-il-6 que previnem a ligação de il-6 complexado com il-6ralfa a gp130 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7820155B2 (pt) |
| EP (1) | EP1966244B1 (pt) |
| JP (1) | JP2009521909A (pt) |
| KR (1) | KR20080090484A (pt) |
| CN (1) | CN101346395A (pt) |
| AT (1) | ATE550353T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006332216A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0620797A2 (pt) |
| CA (1) | CA2635615A1 (pt) |
| DK (1) | DK1966244T3 (pt) |
| EA (1) | EA200870130A1 (pt) |
| ES (1) | ES2382164T3 (pt) |
| PL (1) | PL1966244T3 (pt) |
| PT (1) | PT1966244E (pt) |
| WO (1) | WO2007076927A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA200806610B (pt) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
| US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| DK1252192T3 (da) | 2000-02-11 | 2006-11-20 | Merck Patent Gmbh | Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid |
| MXPA03008031A (es) | 2001-03-07 | 2003-12-04 | Merck Patent Gmbh | Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida. |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| PL206975B1 (pl) | 2001-12-04 | 2010-10-29 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie |
| ATE393169T1 (de) * | 2003-12-30 | 2008-05-15 | Merck Patent Gmbh | Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung |
| EP1699821B1 (en) * | 2003-12-31 | 2012-06-20 | Merck Patent GmbH | Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS |
| US7670595B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
| US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
| CN101330930B (zh) | 2005-10-21 | 2011-11-23 | 中外制药株式会社 | 心脏病治疗剂 |
| EA200870130A1 (ru) | 2005-12-30 | 2009-02-27 | Мерк Патент Гмбх | Антитела против ил-6, предотвращающие связывание с gp130 комплекса ил-6 и альфа-рецептора ил-6 |
| JP5754875B2 (ja) | 2006-04-07 | 2015-07-29 | 国立大学法人大阪大学 | 筋再生促進剤 |
| TW200831528A (en) | 2006-11-30 | 2008-08-01 | Astrazeneca Ab | Compounds |
| WO2008065384A2 (en) * | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Astrazeneca Ab | Antibodies specific for the complex of interleukin-6 and the interleukin-6 receptor |
| US9725514B2 (en) | 2007-01-23 | 2017-08-08 | Shinshu University | Chronic rejection inhibitor |
| TWI561530B (en) | 2007-05-21 | 2016-12-11 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to il-6 and use thereof |
| US8178101B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-05-15 | Alderbio Holdings Inc. | Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia |
| US7906117B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-03-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever |
| US8062864B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-11-22 | Alderbio Holdings Llc | Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies |
| US9701747B2 (en) | 2007-05-21 | 2017-07-11 | Alderbio Holdings Llc | Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration |
| US8252286B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-08-28 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US8404235B2 (en) | 2007-05-21 | 2013-03-26 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| WO2009109584A1 (en) * | 2008-03-07 | 2009-09-11 | Ferring International Center S. A. | ANTIBODY BINDING ONLY TO IL6-sIL6R COMPLEX |
| US8034344B2 (en) | 2008-05-13 | 2011-10-11 | Novimmune S.A. | Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof |
| US10717781B2 (en) | 2008-06-05 | 2020-07-21 | National Cancer Center | Neuroinvasion inhibitor |
| US8188235B2 (en) | 2008-06-18 | 2012-05-29 | Pfizer Inc. | Antibodies to IL-6 and their uses |
| KR20110043643A (ko) * | 2008-07-02 | 2011-04-27 | 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 | 인터루킨 6 면역치료제 |
| WO2010036460A2 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-cd147 antibodies, methods, and uses |
| US8323649B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| US8337847B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-25 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies |
| US9212223B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-12-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| WO2010065077A2 (en) | 2008-11-25 | 2010-06-10 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antagonists of il-6 to prevent or treat thrombosis |
| US9452227B2 (en) | 2008-11-25 | 2016-09-27 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments |
| US8992920B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-03-31 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis |
| US8420089B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-04-16 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| CN102405230A (zh) | 2009-04-22 | 2012-04-04 | 默克专利有限公司 | 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白 |
| TW201825115A (zh) | 2009-05-13 | 2018-07-16 | 美商建新公司 | 抗人類cd52免疫球蛋白 |
| EP2464666B1 (en) * | 2009-07-15 | 2018-03-21 | Eva Kovacs-Benke | Combination of a human interleukin-6 antagonist and a human interleukin-6 receptor antagonist in therapy of tumour diseases |
| TWI523661B (zh) * | 2009-07-31 | 2016-03-01 | Shin Maeda | Anti-IL-6 receptor antibody in the manufacture of inhibitors of metastatic inhibition of lung cancer metastasis to the liver |
| DK2467401T3 (en) | 2009-08-19 | 2017-03-20 | Merck Patent Gmbh | ANTIBODIES FOR THE DETECTION OF INTEGRIN COMPLEX IN FFPE MATERIAL |
| WO2011066374A2 (en) | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antagonists of il-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever |
| US9775921B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-10-03 | Alderbio Holdings Llc | Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody |
| EP2516467A2 (en) | 2009-12-23 | 2012-10-31 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof |
| SI2578231T1 (sl) | 2010-05-28 | 2023-01-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Okrepljen protitumorski T celični odzivnik |
| ES2847891T3 (es) | 2010-11-23 | 2021-08-04 | Vitaeris Inc | Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral |
| EP2726506A1 (en) | 2011-05-27 | 2014-05-07 | Dutalys | Removal of monomeric targets |
| EP2723380B1 (en) | 2011-06-24 | 2019-08-21 | Stephen D. Gillies | Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof |
| WO2013019690A1 (en) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Ohio State University | Small molecule inhibitors of il-6 and uses thereof |
| WO2013059548A1 (en) * | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Sanofi | Compositions and methods for treating cancer using jak2 inhibitor |
| EP3489258A1 (en) * | 2012-11-08 | 2019-05-29 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Il-6 antagonists and uses thereof |
| EP2970496B1 (en) * | 2013-03-12 | 2018-07-18 | Institute of Arthritis Research LLC | Immunologically active polypeptide |
| AR095199A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Genzyme Corp | Anticuerpos anti-cd52 |
| EP4163633A1 (en) | 2013-09-13 | 2023-04-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting and quantifying host cell protein in cell lines and recombinant polypeptide products |
| NZ718144A (en) | 2013-09-13 | 2022-05-27 | Genentech Inc | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| CN103897061B (zh) * | 2014-03-25 | 2017-06-16 | 宝船生物医药科技(上海)有限公司 | 阻断西妥昔单抗和egfr结合的抗体、其试剂盒及杂交瘤细胞 |
| TWI713453B (zh) | 2014-06-23 | 2020-12-21 | 美商健生生物科技公司 | 干擾素α及ω抗體拮抗劑 |
| RS59805B1 (sr) * | 2014-11-07 | 2020-02-28 | Sesen Bio Inc | Unapređena il-6 antitela |
| MA41116A (fr) * | 2014-12-01 | 2017-10-10 | Ferring Bv | Compositions d'inhibiteur de trans-signalisation par l'il-6 sélectif |
| EP3912636A1 (en) * | 2014-12-01 | 2021-11-24 | Ferring B.V. | Administration of a selective il-6-trans-signalling inhibitor |
| TWI763630B (zh) | 2015-07-02 | 2022-05-11 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 雙環內醯胺及其使用方法 |
| CN109843886B (zh) | 2016-10-17 | 2022-04-19 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 二环吡啶酮内酰胺及其使用方法 |
| US11072607B2 (en) | 2016-12-16 | 2021-07-27 | Genentech, Inc. | Inhibitors of RIP1 kinase and methods of use thereof |
| KR20200012823A (ko) | 2017-02-01 | 2020-02-05 | 예일 유니버시티 | 이뇨제 내성의 치료 |
| US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
| KR20200074160A (ko) | 2017-10-20 | 2020-06-24 | 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 | 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물 |
| CN109867723B (zh) * | 2017-12-05 | 2022-06-17 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 抗人il6单克隆抗体及其制备方法和用途 |
| KR20200116089A (ko) | 2018-01-05 | 2020-10-08 | 코비디아 테라퓨틱스, 인크. | 면역억제 없이 il-6 매개 염증을 치료하기 위한 방법 |
| EP3781571B1 (en) | 2018-04-20 | 2024-01-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | N-[4-oxo-2,3-dihydro-pyrido[3,2-b][1,4]oxazepin-3-yl]-5,6-dihydro-4h-pyrrolo[1,2-b]pyrazole-2-carboxamide derivatives and related compounds as rip1 kinase inhibitors for treating e.g. irritable bowel syndrome (ibs) |
| US20200405883A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-31 | Baxalta Incorporated | Method of treatment with viral-based gene therapy |
| CN111057152B (zh) * | 2019-12-11 | 2022-03-11 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种抗人IL-6Ra单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4079461B2 (ja) | 1994-12-29 | 2008-04-23 | 中外製薬株式会社 | Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤 |
| US7083950B2 (en) * | 1998-09-25 | 2006-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use |
| SK782002A3 (en) * | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| MXPA03008031A (es) | 2001-03-07 | 2003-12-04 | Merck Patent Gmbh | Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida. |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| DK1562968T3 (da) * | 2001-11-14 | 2013-10-28 | Janssen Biotech Inc | Anti-il-6-antistoffer, sammensætninger, fremgangsmåder og anvendelser |
| WO2004045507A2 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Centocor, Inc. | Anti-angiogenic uses of il-6 antagonists |
| WO2004071404A2 (en) | 2003-02-04 | 2004-08-26 | Centocor Inc. | Use of il-6 antagonists in combination with steroids to enhance apoptosis |
| JO3058B1 (ar) | 2005-04-29 | 2017-03-15 | Applied Molecular Evolution Inc | الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها |
| EA200870130A1 (ru) | 2005-12-30 | 2009-02-27 | Мерк Патент Гмбх | Антитела против ил-6, предотвращающие связывание с gp130 комплекса ил-6 и альфа-рецептора ил-6 |
-
2006
- 2006-12-19 EA EA200870130A patent/EA200870130A1/ru unknown
- 2006-12-19 DK DK06829726.6T patent/DK1966244T3/da active
- 2006-12-19 WO PCT/EP2006/012236 patent/WO2007076927A1/en active Application Filing
- 2006-12-19 AT AT06829726T patent/ATE550353T1/de active
- 2006-12-19 CA CA002635615A patent/CA2635615A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-19 PL PL06829726T patent/PL1966244T3/pl unknown
- 2006-12-19 KR KR1020087018721A patent/KR20080090484A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-12-19 JP JP2008547875A patent/JP2009521909A/ja active Pending
- 2006-12-19 CN CNA2006800491952A patent/CN101346395A/zh active Pending
- 2006-12-19 BR BRPI0620797-9A patent/BRPI0620797A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-19 ES ES06829726T patent/ES2382164T3/es active Active
- 2006-12-19 AU AU2006332216A patent/AU2006332216A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-19 EP EP06829726A patent/EP1966244B1/en not_active Not-in-force
- 2006-12-19 PT PT06829726T patent/PT1966244E/pt unknown
- 2006-12-29 US US11/647,992 patent/US7820155B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-07-29 ZA ZA200806610A patent/ZA200806610B/xx unknown
-
2010
- 2010-07-12 US US12/834,546 patent/US8536308B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1966244A1 (en) | 2008-09-10 |
| JP2009521909A (ja) | 2009-06-11 |
| WO2007076927A1 (en) | 2007-07-12 |
| AU2006332216A1 (en) | 2007-07-12 |
| PL1966244T3 (pl) | 2012-08-31 |
| EP1966244B1 (en) | 2012-03-21 |
| US7820155B2 (en) | 2010-10-26 |
| US20070178098A1 (en) | 2007-08-02 |
| ATE550353T1 (de) | 2012-04-15 |
| EA200870130A1 (ru) | 2009-02-27 |
| CA2635615A1 (en) | 2007-07-12 |
| ES2382164T3 (es) | 2012-06-05 |
| US8536308B2 (en) | 2013-09-17 |
| US20110038877A1 (en) | 2011-02-17 |
| DK1966244T3 (da) | 2012-04-23 |
| ZA200806610B (en) | 2009-11-25 |
| PT1966244E (pt) | 2012-05-17 |
| CN101346395A (zh) | 2009-01-14 |
| KR20080090484A (ko) | 2008-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0620797A2 (pt) | anticorpos anti-il-6 que previnem a ligação de il-6 complexado com il-6ralfa a gp130 | |
| EP2187964B1 (en) | High affinity human antibodies to human nerve growth factor | |
| JP5513888B2 (ja) | グルカゴン受容体抗体に関する組成物および方法 | |
| PT2576618T (pt) | Anticorpos contra gdf8 humano | |
| AU2008266745B2 (en) | Joint destruction biomarkers for anti-IL-17A therapy of inflammatory joint disease | |
| ES2865112T3 (es) | Anticuerpos de unión a protofibrillas A-beta mejorados | |
| JP2005514409A (ja) | Ｍｕｃ１８抗原に対する抗体の使用 | |
| PT2305711T (pt) | Métodos para tratar a dor da osteoartrite por meio da administração de um antagonista de fator de crescimento do nervo e composições contendo o mesmo | |
| PT1449850E (pt) | Anticorpos humanos enxertados em rdc¿s e fragmentos desses anticorpos | |
| BRPI0719953B1 (pt) | Anticorpos humanos de alta afinidade para receptor de il-4 humano | |
| JP2009525758A (ja) | Ｐａｒ−２に結合する抗体 | |
| BR112013009083B1 (pt) | Anticorpos humanos para oncostatina m, seu processo de fabricação, fragmento de ligação a antígeno, composição farmacêutica, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante estavelmente transformada ou transfectada | |
| BR112020010536A2 (pt) | molécula de fusão, proteína e célula isoladas, composição, e, método para tratar um câncer | |
| KR20200106056A (ko) | 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 항-cxcl13 항체 | |
| CN114728065A (zh) | 针对cd3和bcma的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白 | |
| JP2022527373A (ja) | Ｒｅｔを結合するヒト抗体およびその使用方法 | |
| DK2340039T3 (en) | Use of IL-20 antagonists for treating osteoporosis | |
| TWI745670B (zh) | 抗cd27抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| KR102428255B1 (ko) | 위암의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20150131286A (ko) | 항-cd52 항체 | |
| CN115920078A (zh) | 靶向紧密连接蛋白18.2的抗体药物偶联物 | |
| MX2010012812A (es) | Metodos de tratamiento que utilizan proteinas de union del receptor de la interleucina-21. | |
| PT1988660E (pt) | Um método de processamento e equipamento de utilizador para as informações de configuração inicial de concessão de-serviço | |
| BR112021014574A2 (pt) | Competidores cd31 e usos dos mesmos | |
| TW202144433A (zh) | 抗體或其抗原結合片段、其製備方法及醫藥用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 5A ANUIDADE. |
|
| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2161 DE 05/06/2012. |