KR19990022283A

KR19990022283A - 인체 케모킨 베타-11 및 인체 케모킨 알파-1

Info

Publication number: KR19990022283A
Application number: KR1019970708762A
Authority: KR
Inventors: 하오동 리
Original assignee: 벤슨 로버트 에이치.; 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-03-25
Also published as: AU6162896A; CA2222280A1; EP0833914A4; AU723891B2; WO1996039522A1; CN1190991A; JPH11507224A; EP0833914A1

Abstract

본 발명은 인체 케모킨 폴리펩티드 및 상기 케모킨 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 재조합 기법에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 백혈병, 종양, 만성 감염, 자가면역질환, 섬유증 질환, 상처 치료 및 건선의 치료를 치료를 위해 상기 케모킨 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 케모킨 폴리펩티드에 대한 길항물질 및 이의 치료적 용도, 즉 류마티스성 관절염, 자가 면역 및 만성 및 급성 염증성 및 감염성 질환, 알러지 반응, 프로스타글란딘-의존성 발열 및 골수 장애를 치료하는 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산 서열 내의 돌연변이 및 상기 폴리펩티드의 변경된 농도에 관련된 질병을 검출하는 진단 분석에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 케모킨 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내의 돌연변이를 검출하는 분석 방법 및 숙주 내에서 상기 폴리펩티드의 변경된 수준을 검출하는 진단 방법에 관한 것이다.

Description

인체 케모킨 베타-11 및 인체 케모킨 알파-1

인터크린 시토킨이라고 하는 케모킨은 구조적, 기능적으로 관련이 있는 시토킨의 아군이다. 이 분자들은 크기가 8 내지 10kd이다. 일반적으로, 케모킨은 아미노산 수준에서 20% 내지 75%의 상동성을 나타내고, 2개의 이황화 결합을 형성하는 4개의 보존적 시스테인 잔기를 특징으로 한다. 케모킨은 처음 2개의 시스테인 잔기의 배열에 근거하여, 2개의 아군, 즉 알파 및 베타로 분류하였다. 알파 아군에서는 처음 2개의 시스테인이 1개의 아미노산에 의해 분리되어 있고, 따라서 C-X-C 아군이라고도 한다. 베타 아군에서는 2개의 시스테인이 인접하고 있고, 따라서 C-C 아군이라고 한다. 지금까지 인체에서는 이 군에 속하는 8개 이상의 상이한 성분들이 확인되었다.

인터크린 시토킨은 다양한 기능을 나타낸다. 그 고유 특징은 단핵구, 호중구, T 림프구, 호염기구 및 섬유아세포를 비롯하여 독특한 세포 종류의 화학주성적 이동을 유인하는 성질이 있다는 것이다. 많은 케모킨은 전염증(proinflammatory) 활성을 갖고 있고 염증 반응동안 다수의 단계에 관여한다. 이러한 활성들로는 히스타민 방출 자극, 리소좀 효소와 류코트리엔 방출, 내피 세포에 대한 표적 면역 세포의 증가된 유착성, 보체 단백질의 증가된 결합성, 과립구 유착 분자와 보체 수용체의 유도된 발현성 및 호흡폭발을 포함한다. 염증에 대한 관련성외에도 특정 케모킨은 다른 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 대식세포 염증 단백질 1(MIP-1)은 조혈 간상부 세포의 증식을 억제할 수 있고, 혈소판 인자-4(PF-4)는 내피 세포 증식의 강력한 억제제이며, 인터루킨-8(IL-8)은 각질세포의 증식을 촉진하고 GRO는 흑색종 세포의 오토크린 성장인자이다.

다양한 생물학적 활성의 견지에서 케모킨이 림프구 이동, 상처 치유, 조혈 작용 조절과, 알러지, 천식 및 관절염과 같은 염증 질환을 비롯하여 다수의 생리적 상태와 질병 상태에 연루되어 있다는 것은 놀라운 것이 아니다.

C-C 지류의 구성원들은 하기 세포에 대한 효과를 나타낸다: 기생충 감염을 감소시키고, 호흡 시스템의 기도에 만성 염증을 야기시키는 기생충을 파괴하는 호산구; 척추동물에서 종양 형성을 억제하는 대식세포; 및 알러지성 염증에서 일정 역할을 수행하는 히스타민을 방출하는 호염기구: 그러나, 한 지류의 구성원은 케모킨의 기타 지류에 정상적으로 반응하는 세포에 대한 효과를 나타내며, 따라서, 상기 지류의 구성원에 부착할 수 있는 정확한 역할은 밝혀지지 않았다.

C-C 지류의 구성원들이 우선적으로 단핵세포에 작용하며, C-X-C 지류의 구성원들은 우선적으로 호중구에 작용하지만, 현저한 화학주성은 이들 기준에 기초하여 임의의 케모킨에 할당될 수 없다. 한 군의 몇몇 케모킨은 다른 군의 케모킨의 특성을 나타낸다.

본 발명의 폴리펩티드는 보존된 시스테인 잔기르 보유한다. 즉, 케모킨 베타-11은 C-C 영역을 보유하고, 케모킨 알파-1은 C-X-C 영역을 보유한다. 이들은 공지된 케모킨과 높은 아미노산 서열 상동성을 보유하며, 따라서 인체 케모킨으로 추정된다.

본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드로 암호된 폴리펩티드, 이 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 용도 및 이 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 인체 케모킨 폴리펩티드이며, 본 명세서에서 때로 인체 케모킨 베타-11(Ckβ-11) 및 케모킨 알파-1(Ckα-1)으로 지칭한다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드들의 작용을 억제하는 방법에 관한 것이다.

첨부되는 도면은 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 영역을 제한하고자 하기 위한 것이 아니다.

도 1은 cDNA 서열 및 Ckβ-11의 상응하는 추정 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 초기 17개의 아미노산은 리더 서열을 나타내며, 따라서 추정되는 성숙 폴리펩티드는 81개의 아미노산을 포함한다. 아미노산을 위한 표준 한 문자 약어를 사용하였다. 서열결정은 373 자동화 DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템즈, 인코오포레이티드)를 이용하여 수행하였다. 서열 결정의 정확도는 97% 이상으로 생각된다.

도 2는 cDNA 서열 및 Ckα-1의 상응하는 추정 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 초기 22개의 아미노산은 리더 서열을 나타내며, 따라서 상기 추정되는 성숙 폴리펩티드는 87개의 아미노산을 포함한다. 아미노산을 위한 표준 한 문자 약어를 사용하였다.

본 발명의 일 양태에 따라, 도 1 및 도 2의 추정 아미노산 서열(서열 번호 2 및 서열 번호 4)을 보유한는 성숙 폴리펩티드 또는 1994년 11월 11일자로 기탁된 ATCC 수탁번호 75948(Ckβ-11) 및 75947(Ckα-1)의 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다.

Ckβ-11을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다수의 인간 성인 및 태아 cDNA 라이브러리, 예를 들어 인간 태아 비장 cDNA 라이브러리로부터 분리할 수 있다. Ckβ-11는 케모킨의 C-C 지류의 한 구성원이다. 이는 최초 약 17개의 아미노산 잔기가 추정 리더 서열이어서 성숙 단백질이 81개의 아미노산을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 상기 단백질은 쥐 란테스(RANTES) 폴리펩티드에 대해 89 아미노산 연장부에 걸쳐 31% 동일성 및 47% 유사성이라는 최대의 상동성을 보유한다. 또한, 케모킨 내의 4개의 부분적으로 보존된 시스테인 잔기가 상기 폴리펩티드 내에서 발견된다는 것은 중요한 사실이다.

Ckα-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 성인 및 태아 cDNA 라이브러리, 예를 들어 인간 편도선 cDNA 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 이는 최초 약 22개의 아미노산 잔기가 추정 리더 서열이어서 성숙 단백질이 87개의 아미노산을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 상기 단백질은 양(오비스 아리에스)의 인터루킨-8에 대해 89 아미노산 연장부에 걸쳐 31% 동일성 및 80% 유사성이라는 최대의 상동성을 보유한다. 또한, 케모킨 내의 4개의 부분적으로 보존된 시스테인 잔기가 상기 폴리펩티드 내에서 발견된다는 것은 중요한 사실이다.

본 발명의 폴리펩티드는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있으며, 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. 상기 DNA는 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있으며, 1본쇄는 암호화 쇄 또는 비암호화 (안티센스) 쇄일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1의 암호화 서열(서열 번호 1) 및 도 2의 암호화 서열(서열 번호 3) 또는 기탁된 클론의 서열과 동일하거나, 유전 암호의 잉여 또는 퇴화로 인해 암호화 서열이 도 1의 DNA(서열 번호 1) 및 도 2의 DNA(서열 번호 3) 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 함호화 서열일 수 있다.

도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 3)의 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단지 성숙 폴리뉴클레오티드를 위한 암호 서열; 리더 서열 또는 분비 서열 또는 전구단백질 서열과 같은 추가의 암호 서열; 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열(및 임의로 추가 암호 서열); 및 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열의 5' 및/또는 3' 비암호 서열 또는 인트론과 같은 비암호 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드란 용어는 폴리펩티드의 암호 서열 뿐만 아니라 부가 암호 서열 및/또는 비암호 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.

또한, 본 발명은 도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)의 추정 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론들의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드들의 단편, 유사체 및 유도체를 암호하는 전술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연발생적 대립유전자 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비자연발생적 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)에 도시한 바와 같은 동일한 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 클론들의 cDNA에 의해 암호된 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)의 폴리펩티드들 또는 기탁된 클론들의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드들의 단편, 유도체 또는 유사체를 암호하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체로는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

전술한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 번호 1) 및 도 2(서열 번호 3)에 도시된 암호 서열이나 기탁된 클론들의 암호 서열의 자연 발생적 대립유전자 변이체인 암호 서열을 가질 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 1개 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가가 있을 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 대안적인 형태이다.

또한, 본 발명은 성숙 폴리펩티드의 암호 서열이, 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현과 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비 서열로서 작용하는 리더 서열에 대해 동일한 리딩 프레임에 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 가진 폴리펩티드는 전단백질이고, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩티드의 성숙 형태를 형성하는 리더 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질 + 부가 5' 아미노산 잔기인 전단백질을 암호할 수 있다. 리더 서열을 갖는 성숙 단백질은 전단백질이고 상기 단백질의 불활성 형태이다. 리더 서열이 일단 절단되면 활성이 있는 성숙 단백질이 남게 된다.

따라서, 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질, 또는 전구서열을 갖는 단백질, 또는 전구서열과 전서열(리더 서열)을 모두 가진 단백질을 암호화할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있도록 하는 마커 서열에 대해 프레임내에서 융합된 암호 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 박테리아 숙주인 경우, 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드를 정제할 수 있도록 하는 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사히스티딘 태그이거나, 또는 예를 들면 숙주가 포유류, 예컨대 COS-7 세포인 경우에는 헤마글루티닌(HA)일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 유래의 에피토프에 상응한다[참조: Wilson, I. 등, Cell, 37:767 (1984)].

본 명세서에 사용한 용어 유전자는 폴리펩티드 쇄를 생성하는 데 연루된 DNA의 단편을 의미하며; 이는 암호 서열의 전 및 후 영역(리더 서열 및 추종 서열) 뿐만 아니라 개별적인 암호 서열(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다.

본 발명의 전장 유전자의 단편은 cDNA에 대한 하이브리드화 프로브로 사용하여 전장 cDNA를 분리할 수 있고, 상기 유전자에 대해 높은 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 보유하는 다른 cDNA를 분리할 수 있다. 이러한 형태의 프로브는 30 이상의 염기를 보유하는 것이 바람직하며, 예를 들어 50 이상의 염기를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프로브를 사용하여 전장 전사체에 상응하는 cDNA 클론 및 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 함유하는 게놈 클론(들)을 동정할 수 있다. 스크린의 한 예는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 이용하여상기 유전자의 암호 영역을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 보유하는 표지된 올리고뉴클레오티를 이용하여 상기 라이브러리의 어떤 구성원에 상기 프로브가 하이브리드화하는지를 결정하기 위해 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열간의 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상인 경우에는 전술한 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 엄격한 조건하에서 전술한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 엄격한 조건이란 용어는 하이브리드화가 서열간의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상인 경우에만 일어난다는 것을 의미한다. 바람직한 일 양태에서 전술한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열 번호 1)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA(들)에 의해 암호화된 성숙 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능이나 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.

또는, 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 동일성을 갖지만 활성을 보유할 수도, 보유하지 않을 수도 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 20개 이상의 염기, 바람직하게는 30개 이상, 보다 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 서열 번호 1의 폴리뉴클레오티드를 회수하기 위한 상기 폴리뉴클레오티드의 프로브로서, 또는 진단 프로브나 PCR 프라이머로서 이용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편 및 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대해 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 보유하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것인데, 상기 단편은 30개 이상의 염기, 바람직하게는 50개 이상의 염기를 보유한다. 본원에 언급한 기탁물(들)은 특허 절차에 있어서 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약하에 기탁된 것이다. 이 기탁물은 단지 당업자가 편리하게 이용할 수 있도록 제공된 것이지, 35 U.S.C §112하에서 기탁이 필수적이라는 인정에 따른 것이 아니다. 기탁물내에 함유된 폴리뉴클레오티드의 서열 뿐만 아니라 이 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원에 참고적으로 포함되어, 본원에 제시된 서열들과 어떤 논쟁이 생기는 경우 중재하는 역할을 한다. 기탁물을 제조하거나 사용하거나 판매하는 데에는 허가증이 필요할 수도 있으나 이러한 허가증이 허여되지는 않을 것이다.

본 발명은 추가로, 도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)의 추정 아미노산 서열을 갖거나, 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드, 이 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)의 폴리펩티드, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드와 관련하여 사용된 단편, 유도체 및 유사체란 용어는 상기 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능이나 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체에는 전단백질 부의 절단에 의해 활성화되어 활성이 있는 성숙 폴리펩티드를 생성할 수 있는 전단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 재조합 폴리펩티드가 바람직하다.

도 1(서열 번호 2) 및 도 2(서열 번호 4)의 폴리펩티드, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 1개 이상의 아미노산 잔기가 보존성 또는 비보존성 아미노산 잔기(바람직하게는 보존성 아미노산 잔기)로 치환되고 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 유전 암호에 의해 암호화되거나 암호화되지 않는 것이거나, 또는 (ii) 1개 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 함유하는 것이거나, 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드가 이 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합하고 있는 것, 또는 (iv) 성숙 폴리펩티드 또는 전단백질 서열의 정제에 사용되는 서열이나 리더 또는 분비 서열과 같이 성숙 폴리펩티드에 부가 아미노산들이 융합되어 있는 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자라면 본원의 교시로부터 본원의 범위내에 속하는 것이라는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 동종성으로 정제하는 것이 바람직히다.

분리된이란 용어는 본래의 환경(예컨대, 자연발생인 경우에는 천연 환경)에서 물질이 분리되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 동물 생체내에 존재하는 자연발생의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것이 아니고, 자연계중에서 공존하는 물질 일부나 전체로부터 분리된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 또는 폴리펩티드는 분리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있으며(또는) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 상기 벡터나 조성물은 천연 환경중의 일부가 아니라는 점에서 분리된 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 2의 폴리펩티드(특히, 성숙 폴리펩티드) 뿐만 아니라 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대해 70% 이상의 유사성(바람직하게는 70% 이상의 동일성)을 보유하는 폴리펩티드 및 더 바람직하게는 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대해 90% 이상의 유사성(더 바람직하게는 90% 이상의 동일성)을 보유하는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 30개 이상의 아미노산 및 더 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 일부분을 보유하는 폴리펩티드의 일부분을 포함한다.

당업자에게 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 유사성은 아미노산 서열 및 한 폴리펩티드의 보존된 아미노산 치환과 두 번째 폴리펩티드의 서열을 비교하므로써 결정할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 일부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 상기 단편은 전장 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 일부분은 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의한 본 발명 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.

숙주 세포는 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된다(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염). 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 비루스 입자, 파지 등일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 숙주 세포는 필요에 따라 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선택 또는 Ckβ-11 및 Ckα-1 유전자의 증폭을 위해 변형된 통상적인 배양 배지 내에서 배양할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포 이용시 이미 사용되었으며, 당업자에게는 자명한 것들이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기법을 이용하여 폴리펩티드를 제조하는데 사용할 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드 서열은 여러 가지 발현 매개체중 임의의 하나, 특히 폴리펩티드 발현용 벡터 또는 플라스미드 내에 포함될 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 염색체 DNA 서열, 비염색체 DNA 서열 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA, 백시니아, 아데노비루스, 계두 비루스 및 슈도라비에스와 같은 비루스 DNA의 조합에 의해 유도된 벡터를 들 수 있다. 그러나, 복제할 수 있고, 숙주 세포 내에서 생존할 수 있는 기타 임의의 플라스미드 또는 벡터를 사용할 수도 있다.

적합한 DNA 서열은 다양한 방법으로 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 상기 DNA 서열은 당업계에 공지된 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법은 당업자가 용이하게 수행할 수 있는 것들이다.

발현 벡터 내의 DNA 서열은 적합한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동가능하게 연결되어 mRNA 합성을 유도한다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜리 lac 또는 trp , 파지 람다 P_L프로모터 및 기타 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들의 비루스 내에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 들 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보좀 결합 위치 및 전사 종결자를 함유한다. 또한, 상기 벡터는 발현을 증폭하기 위해 적합한 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 발현 벡터는 디히드폴레이트 리덕타아제 또는 진핵세포 배양을 위한 네오마이신 내성 또는 이. 콜리 내의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 추적자를 제공하는 유전자를 함유하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같은 적합한 DNA 서열 뿐만 아니라 적합한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터는 숙주 세포를 형질전환하고, 이 숙주 세포를 이용하여 단백질을 발현하도록 할 수 있다.

적합한 숙주의 예로는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜리, 스트렙토마이세스속, 살모넬라 타이피무리움; 진균류 세포, 예를 들어 효모; 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 S2 및 Sf9; 아데노비루스; 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS 또는 보웨스 흑색종; 식물 세포 등을 들 수 있다. 상기 숙주의 적합한 선택은 본 명세서의 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 또한 광범위하게 상술한 바와 같은 서열 하나 이상을 포함하는 재조합 구성물을 포함한다. 상기 구성물은 본 발명의 서열이 순방향 또는역방향으로 삽입된 플라스미드 또는 비루스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 일양태의 바람직한 관점에서, 상기 구성물은 조절 서열, 예를 들어 상기 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있다. 그 예로서 하기 벡터를 제시한다: 박테리아용: pQE70, pQE60, pQE-9(퀴아젠), pBS, pD10, 파지스크립트, psiX174, 피블루스크립트 SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타젠); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아). 진핵세포용: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44. pXT1, pSG(스트라타젠), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(파마시아). 그러나, 숙주 내에서 복제할 수 있고, 생존할 수 있는 한 기타 플라스미드 또는 벡터를 사용할 수도 있다.

프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라아제) 벡터 또는 기타 선택성 마커를 보유하는 벡터를 이용하여 임의의 바람직한 유전자로부터 선택할 수 있다. 두 개의 적합한 벡터는 PKK232-8 및 PCM7 이다. 특정 박테리아 프로모터의 예로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, P_L및 trp를 들 수 있다. 진핵세포 프로모터의 예로는 CMV 초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로비루스의 LTR 및 쥐 메탈로티오네인-I을 들 수 있다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자에게 널리 알려져 있다.

추가의 일양태에서, 본 발명은 상기 구성물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 고등 진핵세포, 예를 들어 포유류 세포 또는 하등 진핵세포, 예를 들어 효모 세포를 일 수 있으며, 상기 숙주 세포는 원핵세포, 예를 들어 박테리아 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포내로 상기 구성물의 도입은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염 또는 전기영동으로 수행할 수 있다( Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

숙주 세포 내에서 상기 구성물은 통상적인 방법으로 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수도 있다.

성숙 단백질은 적합한 프로모터의 조절 하에서 포유류 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포 내에서 발현될 수 있다. 또한, 무세포 해독 시스템을 사용하여 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNA를 이용하여 상기 단백질을 제조할 수 있다. 원핵세포 및 진핵세포와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 본 명세서에 참고 인용한 문헌[ Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕, 콜드 스프링 하버 (1989)]에 기재되어 있다.

고등 진핵세포에 의해 이루어지는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 상기 벡터 내에 인핸서 서열을 삽입하므로써 증가된다. 인핸서는 일반적으로 약 10 내지 300 bp 이며, 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시키는 DNA의 시스-작용성 요소이다. 그 예로는 복제 원점의 bp 100 내지 270 후미의 SV40 인핸서, 복제 원점 후미의 폴리오마 인핸서 및 아데노비루스 인핸서를 들 수 있다.

일반적으로 재조합 발현 벡터는 복제 원점 및 선택성 마커, 예를 들어 이. 콜리 및 에스. 세레비재 TRP1 유전자의 앰피실린 내성 유전자 및 고발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함하여 숙주를 형질전환시키고, 하류 구조 유전자의 전사를 가능하게 한다. 이러한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK)와 같은 당분해 효소, 알파-인자, 산 포스파타제 또는 열 충격 단백질 등을 암호화하는 오페론으로부터 유도할 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 서열 및 종결 서열, 바람직하게는 주변세포질 간격 또는 외세포성 매질 내로 해독된 단백질의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열을 보유하는 적합한 파지 내에서 조립된다. 임의로, 상기 이종 서열은 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제와 같은 바람직한특성을 부여하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

박테리아용으로 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열과 함께 작용 프로모터를 보유하는 적합한 해독 개시 및 종결 서열을 작동가능한 해독상 내에 삽입하므로써 구성된다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선택성 마커 및 복제 원점을 포함하여 벡터의 보존 및 필요에 따라 숙주 내에서의 증폭을 보장한다. 형질전환을 위해 적합한 원핵세포 숙주의 예로는 이. 콜리, 바실러스 섭틸러스, 살모넬라 타이피무리움 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로콕쿠스속에 속하는 여러 가지 종을 들 수 있으며, 기타 원핵세포도 숙주로 이용할 수 있다.

박테리아용 발현 벡터의 비제한적인 대표예는 널리 알려진 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판되는 플라스미드로부터 유도된 선택성 마커 및 박테리아 복제 원점을 포함할 수 있다. 이러한 시판 벡터의 예로는 pKK223-3(스웨덴, 웁살라에 소재하는 파마시아 파인 케미칼스) 및 pGEM1(미국, 위스콘신, 메디슨에 소재하는 프로메가 바이오텍)을 들 수 있다. 이들 pBR322 백본 부위는 적합한 프로모터 및 발현하려는 구조 서열과 조합된다.

이하, 적합한 숙주균의 형질전환, 상기 숙주균의 적합한 세포 밀도로의 성장, 선택된 프로모터의 적합한 수단(예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의한 유도 및 추가 기간 동안의 세포 배양에 대해 기술한다.

세포는 전형적으로 원심분리, 물리적 또는 화학적 수단에 의한 분쇄 및 생성된 조 추출물의 추가 정제를 위한 보존에 의해 수집된다.

단백질의 발현을 위해 사용된 미생물 세포는 임의의 편리한 방법, 예를 들어 냉동-해동 반복 처리, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제를 이용하는 방법에 의해 분쇄할 수 있으며, 상기 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 여러 가지 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175 (1981)]에 기재된 원숭이 신장 섬유아세포인 COS-7 세포주 및 상용성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 들 수 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서를 포함하며, 또한 임의의 필요한 리보좀 결합 위치, 폴리아데닐화 위치, 결찰 공여체 및 수용체 위치, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비전사된 서열을 포함한다. SV40 결찰로부터 유도된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 위치를 이용하여 필요한 비전사된 유전 요소를 제공할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수한다. 필요에 따라 단백질 재접힘 단계를 사용하여 성숙한 단백질의 배치를 완전하게 할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 최종 정제 단계를 수행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연 정제된 생성물 또는 화학 합성된 생성물 또는원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 배양물 내의 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포)로부터 재조합 기법에 의해 생성된 생성물일 수 있다. 재조합 생성 기법에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 포유류 또는 기타 진핵생물 탄수화물에 의해 글리코실화되거나, 글리코실화되지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의폴리펩티드는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 연구 시약 및 인간 질병의 치료 및 진단용 물질로 사용할 수 있다.

인체 케모킨 폴리펩티드는 암 화학요법중 보조 보호성 치료로서 골수 간상 세포 콜로리 형성을 억제하기 위해 사용할 수 있으며, 백혈병에도 사용할 수 있다.

또한, 인체 케모킨 폴리펩티드는 건선의 치료를 위한 표피 각질세포 증식을 억제하기 위해 사용할 수 있는데, 이는 각질세포 과증식을 특징으로 한다.

또한, 인체 케모킨 폴리펩티드는 숙주 방어 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포 및 대식세포의 침입을 자극하고, 이를 활성화하고, 종양의 자가생장을 억제하므로써 고형 종향을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 내성이 있는 만성 및 급성 감염, 예를 들어 미코박테리아 감염에 대해 식세포성 백혈구의 유도 및 활성화에 의해 숙주 방어를 증강시키는데 사용할 수 있다.

또한, 인체 케모킨 폴리펩티드는 T-세포 매개된 자가 면역 질병 및 림프구성 백혈병의 치료를 위해IL-2 생합성을 억제하므로써 T 세포 분화를 억제하는데 사용할 수 있다.

또한, Ckβ-11 및 Ckα-1는 파편 세정의 유인 및 염증성 세포를 촉진하는 연결 조직에 의해, 또한 그의 과량의 TGFβ-매개된 섬유증의 조절에 의해 상처 치료를 자극하는데 사용할 수 있다. 동일한 방식으로, Ckβ-11 및 Ckα-1는 또한 기타 섬유관련 장애, 예를 들어 간경화, 골관절염 및 폐 섬유증을 치료하는데 사용할 수 있다.

또한, 인체 케모킨 폴리펩티드는 주혈흡충증, 선모충증 및 회충증에서와 같이 조직을 침입하는 기생충의 유충을 사멸시키는 명확한 기능을 보유하는 호산구의 존재를 증가시킨다.

또한, 상기 폴리펩티드는 여러 가지 조혈 후대세포의 활성화 및 분화를 조절하므로써, 예를 들어 화학요법후 골수로부터 성숙 백혈구를 방출시키므로써 조혈 작용을 조절하는데 사용할 수 있다.

또한, 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 목적을 위해 사용할 수 있으며, 인간 질병의 치료제 또는 진단제를 고안하는데도 사용할 수 있다.

전장 Ckβ-11 또는 Ckα-1 유전자의 단편은 cDNA 라이브러리를 위한 하이브리드화 프로브로 사용하여 상기 전장 유전자를 분리하고, 상기 유전자에 대한 높은 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 보유하는 기타 유전자를 분리할 수 있다. 그러나, 이러한 형태의 프로브는 일반적으로 20개 이상의 염기를 보유한다. 상기 프로브는 30개 이상의 염기를 보유하는 것이 바람직하며, 예를 들어 50개 이상의 염기를 함유할 수도 있다. 또한, 상기 프로브를 이용하여 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 함유하는 전장 전사체 및 게놈 클론(들)에 상응하는 cDNA 클론을 동정할 수 있다. 스크린의 한 예는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 이용하므로써 상기 유전자의 암호화 영역을 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 보유하는 표지된 올리고뉴클레오티드는 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린하는데 사용되어 상기 프로브가 하이브리드화하는 라이브러리의 수를 결정할 수 있다.

또한, 본 발명은 Ckβ-11 또는 Ckα-1 핵산 서열 내의 돌연변이의 존재에 관련된 질병 또는 이 질병에 대한 감수성을 검출하기 위한 진단 분석법의 일부분으로서 Ckβ-11 또는 Ckα-1 유전자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 질병은 케모킨 폴리펩티드의 기준 이하의 발현에 관련되어 있다.

Ckβ-11 및 Ckα-1 내에 돌연변이를 보유하는 개체는 DNA 수준에서 여러 가지 기법에 의해 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들어 혈액, 뇨, 타액, 조직 생체 검사 재료 및 부검 재료로부터 획득할 수 있다. 게놈 DNA는 검출을 위해 직접 사용하거나, 분석 이전에 PCR에 의해 효소적으로 증폭시킬 수 있다[참조: Saiki 등, Nature, 324: 163-166 (1986)]. 또한, RNA 또는 cDNA도 동일한 목적에 사용할 수 있다. 예를 들어, Ckβ-11 및 Ckα-1을 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머는 Ckβ-11 및 Ckα-1 돌연변이를 동정하고, 분석하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상적인 유전형에 비해 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 방사능 표지된 Ckβ-11 및 Ckα-1 RNA 또는 대안으로 Ckβ-11 및 Ckα-1 안티센스 DNA 서열에 대해 증폭된 DNA를 하이브리드화하므로써 동정할 수 있다. 완벽하게 쌍을 이룬 서열은 RNase A 분해 또는 융점 차이에 의해 잘못 쌍을 이룬 이중 서열과 구별할 수 있다.

DNA 서열 차이에 기초한 유전 테스트는 변성제의 존재 또는 부재하에서 DNA 단편의 겔 내에서의 전기영동적 이동의 변경을 검출하므로써 수행할 수 있다. 작은 서열 결실 및 삽입은 고 해상 겔 전기영동에 의해 가시화할 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 상이한 DNA 단편의 이동이 그들의 특이적인 융점 또는 부분적인 융점에 따라 상이한 위치에서 지연되는 변성 포름아미드 구배 겔 상에서 구별할 수 있다[참조: 예를 들어, Myers 등, Science, 230: 1242 (1985)].

또한, 특정 위치에서의 서열 변화는 RNsae 및 S1 방어와 같은 뉴클레아제 방어 분석 또는 화학적 절단법에 의해 확인할 수 있다[참조: 예를 들어, Cotton 등, PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)].

따라서, 특이적인 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 방어, 화학적 절단, 직접적인 DNA 서열결정 또는 제한 효소를 이용하는 방법(예를 들어, 제한 단편 길이 다형성(RFLP)) 및 게놈 DNA의 서던 블로팅과 같은 방법으로 수행할 수 있다.

더 통상적인 겔 전기영동 및 DNA 서열 결정 이외에, 돌연변이도 동일계내 분석에 의해 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 여러 가지 조직 내에서 Ckβ-11 및 Ckα-1 단백질의 변경된 수준을 검출하기 위한 진단 분석법에 관한 것인데, 그 이유는 정상적인 대조용 조직 샘플과 비교하여 상기 단백질의 과발현으로 인해 질병, 예를 들어 종양의 존재 또는 이에 대한 민감성을 검출할 수 있기 때문이다. 숙주로부터 유도된 샘플 내에서 Ckβ-11 및 Ckα-1 단백질의 수준을 검출하기 위해 사용된 분석법은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 방사능면역 분석법, 경쟁적-결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, ELISA 분석법 및 샌드위치 분석법을 들 수 있다. ELISA 분석법[참조: Coligan 등, Current Protocols in Immunology, 1(2), Chapter 6 (1991)]은 초기에 Ckβ-11 및 Ckα-1 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 또한, 리포터 항체는 상기 단일클론 항체에 대해 제조한다. 상기 리포터 항체에 부착되는 검출가능한 시약의 예로는 방사능, 형광 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 효소를 들 수 있으며, 본 예에서는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 효소를 사용한다. 샘플은 숙주로부터 제거하고, 상기 샘플 내에서 단백질을 결합하는 고형 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 접시 상에서 배양한다. 상기 접시 상의 임의의 자유 단백질 결합 위치는 BSA와 같은 비특이성 단백질과 함께 배양하여 피복한다. 이어서, 상기 단일클론 항체는 이 단일클론 항체가 상기 폴리스틸렌 접시에 부착된 임의의 Ckβ-11 및 Ckα-1 단백질에 부착하는 시간 동안 상기 접시 내에서 배양한다. 모든 미결합된 단일클론 항체는 완충용액으로 세척한다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 결합된 상기 리포터 항체는 상기 접시 내에 위치하고 있으며, Ckβ-11 및 Ckα-1에 결합된 임의의 단일클론 항체에 대한 상기 리포터 항체의 결합으로 귀착된다. 이어서, 상기 접시에 퍼옥시다아제 기질을 첨가하고, 주어진 시간 동안에 현상된 색의 양은 표준 곡선에 대해 비교시 주어진 환자 샘플내에 존재하는 Ckβ-11 및 Ckα-1 단백질의 양으로 측정한다.

경쟁 분석을 사용할 수도 있는데, 이때 Ckβ-11 및 Ckα-1에 특이적인 항체가 고형 지지체에 부착되어 있고, 표지된 Ckβ-11 및 Ckα-1 및 숙주로부터 유도된 샘플이 상기 지지체를 통과하며, 예를 들어 액체 섬광 크로마토크래피에 의해 검출된 표지의 양은 샘플내의 단백질의 양과 관련되어 있다.

샌드위치 분석은 ELISA 분석과 유사하다. 샌드위치 분석에서, Ckβ-11 또는 Ckα-1은 고형 지지체 위를 통과하고, 상기 고형 지지체에 부착된 항체에 결합한다. 이어서, 제 2 항체를 Ckβ-11 또는 Ckα-1에 결합시킨다. 이어서, 제 2 항체에 특이적인, 표지된 제 3 항체를 상기 지지체 위로 통과시켜 상기 제 2 항체에 결합시키므로써 Ckβ-11 또는 Ckα-1의 양을 측정할 수 있다.

본 발명은 인체 케모킨 폴리펩티드에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 상기 수용체를 암호화하는 유전자는 당업자에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류법[참조: Coligan 등, Current Protocols in immun. 1(2), Chapter 5 (1991)]으로 동정할 수 있다. 발현 클로닝을 사용할 수 있는데, 이때 폴리아데닐화된 RNA는 상기 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조하고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울로 나누고, COS 세포 및 상기 폴리펩티드에 비반응성인 기타 세포의 형질감염에 사용한다. 유리 슬라이드에서 성장한 형질감염된 세포는 표지한 폴리펩티드에 노출시킨다. 상기 폴리펩티드는 요오드화 또는 위치-특이성 단백질 키나아제에 대한 인식 위치의 삽입을 포함하는 여러 가지 수단에 의해 표지할 수 있다. 고정화 및 배양한 후, 상기 슬라이드는 자동방사능 분석법으로 분석한다. 양성 푸울은 동정하고, 서브푸울을 제조하고, 반복적인 서브푸울링 및 재스크리닝 과정을 이용하여 재형질감염하고, 추정적인 수용체를 암호화하는 단일 클론을 실질적으로 수득한다.

수용체 동정을 위한 다른 방법으로서, 표지된 폴리펩티드를 세포막에 광활성 결합시키거나, 수용체 분자를 발현하는 제조물을 추출할 수 있다. 가교 결합된 물질은 PAGE 분석으로 용해하고, X-선 필름에 노출시킨다. 상기 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지된 복합체는 배제하고, 펩티드 단편 내로 재용해하고, 단백질 미세서열결정을 수행할 수 있다. 미세서열결정으로 획득한 아미노산 서열은 한 세트의 퇴화 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하는데 사용하여 추정적인 수용체를 암호화하는 유전자를 동정하기 위한 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 사용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 인체 케모킨 폴리펩티드에 대한 길항물질 및 작용물질을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 작용물질은 상기 폴리펩티드와 유사한 생물학적 기능을 갖는 화합물이지만, 길항물질은 이러한 기능을 차단한다. 화학주성은 본 발명의 폴리펩티드중 어느 하나에 의해 주화된 세포를 이 세포가 투과하기에 충분한 직경(약 5 ㎛)의 세공을 보유한 필터의 상부에 위치시키므로써 분석할 수 있다. 잠재적인 작용물질의 용액은 상부 구획 내의 적합한 대조용 배지를 갖는 챔버의 바닥에 위치시키는데, 상기 작용물질의 농도 구배는 시간이 경과함에 따라 상기 다공성 막 내로 또는 상기 다공성 막을 통하여 이동하는 세포를 계수하므로써 측정한다.

길항물질에 대해 분석하는 경우, 본 발명의 인체 케모킨 폴리펩티드는 상기 챔버의 바닥에 위치시키고, 잠재적인 길항물질을 첨가하여 상기 세포의 화학주성이 방해되는 지의 여부를 결정한다.

대안으로, 상기 폴리펩티드의 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제조물은 표지된 인체 케모킨 폴리펩티드, 예를 들어 상기 화합물의 존재 하에서 방사능과 함께 배양한다. 그후, 이 상호작용을 차단할 수 있는 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 이러한 방식으로 길항물질에 대해 분석하는 경우, 상기 케모킨은 사용하지 않으며, 상기 수용체와 상호작용할 수 있는 작용물질 자체의 능력을 측정한다.

잠재적인 Ckβ-11 및 Ckα-1 길항물질의 예로는 상기 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 몇몇 경우에 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 잠재적인 길항물질의 다른 예로는 상기 폴리펩티드의 음성 우성 돌연변이체를 들 수 있다. 음성 우성 돌연변이체는 야생형 폴리펩티드의 수용체에는 결합하나, 생물학적 활성을 보유하지 않는 폴리펩티드이다.

또한, 안티센스 구성물은 안티센스 기법을 이용하여 제조한다. 안티센스 기법을 이용하여 삼중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 상기 두 가지 방법은 모두 DNA 또는 RNA에 대한 폴리펩티드의 결합에 기초한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리펩티드 서열의 5' 암호화 부위를 사용하여 길이가 약 10 내지 40개의 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적이도록 설계하므로써[삼중 나선; 참조: Lee 등, Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney 등, Science, 241: 456 (1988); 및 Dervan 등, Science, 251: 1360 (1991)], 전사 및 인체 케모킨 폴리펩티드의 생성을 방지할 수 있다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA에 하이브리드화하며, 상기 mRNA 분자의 폴리펩티드로의 해독을 차단한다[안티센스; 참조: Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, 미국, 플로리다, 보카 라톤에 소재하는 CRC 출판사 (1988)]. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 세포에 전달되어 상기 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 인체 케모킨 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있다.

다른 잠재적인 인체 케모킨 길항물질은 상기 폴리펩티드의 자연적으로 또는 합성적으로 변형된 유사체인 상기 폴리펩티드의 펩티드 유도체인데, 상기 유도체는 생물학적 기능을 상실했음에도 불구하고, 상기 폴리펩티드의 수용체를 인식하고, 이 수용체에 결합하므로써 상기 수용체를 효과적으로 차단한다. 이러한 펩티드 유도체의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 길항물질은 특정한 자가 면역 질병 및 만성 염증성 및 감염성 질병에서 대식세포 및 그들의 전구물질의 화주성 및 활성화, 및 호중구, 호염기구, B 림프구 및 일부 T 세포 아군, 예를 들어 활성화된 T 세포 및 CD8 세포독성 T 세포 및 천연 킬러 세포의 화주성 및 활성화를 억제하는데 사용할 수 있다. 자가 면역 질병의 예로는 다발성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병을 들 수 있다.

또한, 상기 길항물질은 단핵 식세포의 보충 및 활성화를 방지하므로써 규폐증, 유육종증, 특발성 폐 섬유증을 포함하는 감염성 질병을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 이들은 호산구 생성 및 이동을 방지하므로써 특발성 호산구과다 증후군을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 내독소 쇼크도 대식세포의 이동을 방지하고, 그들의 본 발명의 케모킨 폴리펩티드의 생성을 방지하므로써 상기 길항물질에 의해 치료할 수 있다.

또한, 상기 길항물질은 동맥 벽 내에서 단핵구 침윤을 방지하므로써 죽상동맥 경화증을 치료하는데 사용할 수 있다.

또한, 상기 길항 물질은 케모킨-유발 유양 돌기 세포 및 호염기구 탈과립 및 히스타민의 방출에 의해 억제되는 후기상 알러지 반응, 만성적 두드러기, 아토피성 피부염을 비롯하여 히스타민에 의한 알러지 반응 및 면역 질환 치료에 사용할 수 있다. 알러지성 천식, 비염, 및 습진과 같은 IgE에 의한 알러지 반응의 치료에도 사용될 수 있다.

또한, 상기 길항 물질은 상처 부근에 단핵구의 유인을 방지하므로써 만성 및 급성 염증 치료에 사용할 수 있다. 만성 및 급성 염증성 폐 질환은 폐에서의 단핵 식세포의 격리와 관련이 있으므로, 길항 물질은 정상적인 폐의 대식세포를 조절하는데 사용될 수 있다.

또한, 길항 물질은 환자의 관절내의 활액으로 단핵세포가 유인되는 것을 방지하므로서 류마티스 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 단핵구 유입 및 활성은 변성 및 염증성 관절증의 병인론에 중요한 역할을 한다.

상기 길항 물질은 1차적으로 IL-1 및 TNF에 기인하는 유해한 다단계를 방지하는데 사용될 수 있으며, 이는 기타 염증성 시토킨의 생합성을 방지한다. 이런 방식으로 길항 물질은 염증을 방지할 수 있다. 이러한 방식으로 상기 길항물질은 케모킨에 의해 유발된 프로스타글란딘-의존 열병을 저해하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 상기 길항 물질은 예를 들어, 재생 불량성 빈혈증 및 골수이형성 증후군과 같은 골수 부전의 경우를 치료하는데 사용할 수 있다.

또한, 상기 길항 물질은 또한 폐에서의 호산구 축적을 방지하므로서 천식 및 알러지를 치료하는데 사용할 수 있다. 또한 길항 물질은 천식성 폐의 현저한 특징인 상피하 기저막 섬유 조직 증식을 치료하는데 사용할 수 있다.

상기 길항 물질은 예를 들어 후술할 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 사용할 수 있다.

인체 케모킨 폴리펩티드 및 작용물질 및 길항물질은 적절한 약학적 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 이 조성물은 폴리펩티드의 치료학적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화는 투여 방식에 적합해야 한다.

또한, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 약학적 조성물 성분으로 충전시킨 1종 이상의 용기를 포함하는 약학적 포장 또는 키트를 제공한다. 상기 용기들과 관련하여, 약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 주목할 수 있는 데 이는 인체 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 기관에 의해 승인된 것이다. 추가로, 폴리펩티드 및 작용 물질 및 길항 물질을 기타 치료학적 화합물과 함꼐 사용할 수 있다.

약학적 조성물은 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로와 같은 통상적인 방법으로 투여할 수 있다. 약학적 조성물은 특정 징후를 치료 및/또는 예방하기 위한 유효량으로 투여할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드는 체중 1kg 당 약 10㎍ 이상을 투여하며, 대부분의 경우에는 1일에 체중 1 kg당 약 8 mg을 초과하지 않는 양을 투여한다. 대부분의 경우에, 투여 경로, 증상 등을 고려하여 매일 체중 1kg당 약 10㎍ 내지 약 1 mg으로 복용한다.

인체 케모킨 폴리펩티드, 및 폴리펩티드인 작용 물질 또는 길항 물질은 생체내에서 이 폴리펩티드를 발현시키는 본 발명에 따라 사용할 수 있으며, 이를 종종 유전자 요법이라고 칭한다.

따라서, 예를 들어 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 환자의 세포를 조작한 후, 조작된 세포를 환자에게 제공하여 폴리펩티드로 치료할 수 있다. 이 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 포함하는 레트로비루스 입자를 사용하는 당업계에 공지된 방법에 의해서 세포를 유전자 조작할 수 있다.

유사하게, 예를 들어 당업계에 공지된 과정으로 생체내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해서 생체내에서 조작할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 포함하는 레트로비루스 입자를 생산하는 생산 세포를 환자에게 투여하여 생체내에서 세포를 조작하고 생체내에서 폴리펩티드를 발현시킨다. 이러한 방법에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당업자들에게 분명해질 것이다. 예를 들어, 유전자 조작 세포의 발현 매개물은 레트로비루스 이외의 것, 예를 들면, 적절한 이송 매개물과 조합한 후 생체내에서 사용할 수 있는 아데노비루스일 수 있다.

레트로비루스 플라스미드 벡터는 몰로니(Moloney) 쥐 육종 비루스, 몰로니 쥐 백혈병 비루스, 비장 괴사 비루스, 로스(Rous) 육종 비루스 및 하베이(Harvey) 육종 비루스, 조류 leukosis 비루스, 기본 원숭이 백혈병 비루스, 인간 면역결핍성 비루스, 아데노비루스, 골수증식성 육종 비루스 및 포유류 종양 비루수를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 일 양태에서, 레트로비루스 플라스미드 벡터는 몰로니 쥐 백혈병 비루스로부터 유도된다.

벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 Miller 등의 문헌[참조: Biotechnique vol. No. 9, 980-990 (1989)]에 기재된 레트로비루스 LTR; SV40 프로모터; 및 인체 시토메갈로비루스(CMV) 프로모터를 포함하는 1종 이상의 적절한 프로모터, 또는 기타 임의의 프로모터(예, 이에 한정되는 것은 아니지만, 히스톤, pol III, 및 β-액틴 프로모터를 비롯한 진핵 세포 프로모터와 같은 프로모터)를 들 수 있다. 기타 비루스 프로모터로는 아데노비루스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 B19 파르보비루스 프로모터를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 적절한 프로모터의 선택은 본 명세서의 내용으로 당업자들에게 분명해질 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 적합한 프로모터의 예로는 아데노비루스 주 후기 프로모터와 같은 아데노비루스 프로모터; 또는 사이토메갈로비루스(CMV) 프로모터와 같은 이종 프로모터; 호흡 syncytial 비루스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 열 충격 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 헤르페스 단일 티미딘 키나아제 프로모터와 같은 비루스 티미딘 키나제 프로모터; 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 레트로비루스 LTRs, β-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 프로모터는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 천연 프로모터일 수 있다.

레트로비루스 플라스미드 벡터는 생산자 세포주를 형성하기 위해서 패키징 세포주로 형질 도입하는데 사용된다. 형질 감염시킬 수 있는 패키징 세포는, PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pp. 5-14 (1990)]에 기술된 DAN 세포주를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통하여 패키징 세포로 형질 도입할 수 있다. 이 방법으로는 전기 영동, 리포좀 사용 및 CaPO₄침전을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한가지 대안으로, 레트로비루스 플라즈미드 벡터는 리포좀 내로 캡슐화되거나, 리피드에 결합된 후, 숙주내로 투여할 수 있다.

생산자 세포주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로비루스 벡터 입자를 생성한다. 이어서, 레트로비루스 벡터 입자는 생체내 또는 생체 외에서 진핵 세포로 형질 도입하는데 사용할 수 있다. 형질 도입된 레트로 비루스 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현시킬 수 있다. 형질 도입될 수 있는 진핵 세포의 예로는 배 간상 세포, 배 암종 세포 뿐만 아니라 조혈 간상 세포, 간세포, 섬유 아세포, 골아세포, 각질세포, 내피 세포 및 기관지 내피 세폴를 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 서열은 염색체 동정에 이용할 수 있다. 특별하게 서열은 각각의 인간 염색체 상의 특정 위치를 표적으로 하고, 이 위치에 하이브리드화할 수 있다. 추가로, 현재 염색체 상의 특정 부위에 대한 동정이 요구되고 있다. 실제 서열 자료(반복 다형 현상)를 근거로 한 염색체 표시 시약중 염색체 위치를 표시하기 위해 사용할 수 있는 것은 거의 없다. 본 발명에 따른 염색체의 DNA 지도화는 질병과 관련된 유전자를 갖는 서열과 상관 관계를 갖는 중요한 제 1 단계이다.

간단히, 서열은 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15-25bp)를 제조하여 염색체에 지도화할 수 있다. 3' 미해독된 영역의 컴퓨터 분석은 게놈 DNA내의 하나 이상의 엑손을 연결하지 않는 프라이머를 신속하게 선택하는데 사용되며, 따라서 증폭 과정이 복잡해진다. 이어서, 이들 프라이머는 개개의 인간 염색체를 포함하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝을 위해 사용된다. 프라이머에 해당하는 인간 유전자를 포함하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생성할 수 있다.

체세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 염색체에 특정 DNA를 배정하는 신속한 과정이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 본 발명을 사용하여, 유사한 방식으로 특정 염색체 또는 거대 게놈 클론의 푸울로부터 단편의 패널을 통하여 하위 정위를 수행할 수 있다. 유사한 방법으로 염색체에 지도화할 수 있는 기타 지도화 방법은 동일계내 하이브리드화 방법, 표지된 흐름-분류 염색체를 사용한 예비 스크리닝 방법, 및 염색체 특정-cDNA 라이브러리를 구성하기 위한 예비선택 방법을 포함한다.

중기 염색체 확산중에 cDNA 클론의 하이브리드화 위치에 있는 형광물질(FISH)은 1 단계에서 정확한 염색체 위치를 제공하는데 사용된다. 이 기술은 500 또는 600 염기와 같이 짧은 cDNA에 사용될 수 있다. 이 기술에 대한 내용은 문헌[참조: Verma 등, Human Chromosomes: a Manual of Basic Technique, Pergamon Press, 뉴욕 (1988)]에 기재되어 있다.

일단 서열이 정확한 염색체 위치에 지도화되면, 염색체 상에 서열의 물리적 위치는 유전자 지도화 자료와 상관 관계를 갖을 수 있다. 이 자료는 예를 들어, 문헌[참조: V. McXusick, Mendelian Inheritance in Man(존스 홉킨스 대학 웰치 의학 도서관 이용)]에서 찾을 수 있다. 동일한 염색체 부위에 지도화된 유전자 및 질병의 관계는 연계 분석을 통하여 동정할 수 있다(물리적으로 인접한 유전자의 동시 유전).

이어서, 병에 걸린 개체 및 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 결정할 필요가 있다. 만약 임의의 정상적인 개체에서는 관찰되지 않지만 병에 걸린 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰된다면, 이 돌연변이는 질병의 원인으로 생각할 수 있다.

물리적 지도화 및 유전자 지도화 기술의 현재 분석능으로, 질병과 관련된 염색체 부위상에 위치한 cDNA의 정확한 위치는 50 내지 500의 잠재성 원인 유전자이다(이는 1메가 염기 지도화 분석능 및 20 kb당 1 유전자으로 가정한다).

폴리펩티드, 이의 단편 또는 기타 유도체, 또는 이의 유사체, 또는 이를 발현시키는 세포는 이에 대한 항체를 생성하기 위해서 면역원으로 사용할 수 있다. 이들 항체는 예를 들어, 다중 클론 또는 단일 클론 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물 뿐만 아니라 키메라, 단일 사슬 및 인체에 적용시킬 수 있는 항체를 포함한다. 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용하여 상기한 바와 같은 항체 및 단편을 생성할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 동물내로 폴리펩티드를 직접 주입하거나, 또는 동물, 바람직하게는 인체에 폴리펩티드를 투여하므로써 생성할 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 폴리펩티드 자체에 결합할 것이다. 이 방법에서, 폴리펩티드 단편을 암호화하는 서열만이 전체 고유 폴리펩티드와 결합하는 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. 이어서, 항체는 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴레펩티드를 분리하는데 사용된다.

단일 클론 항체를 제조하기 위해서, 연속 세포주 배양액에 의해 생성된 항체를 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술[참조: Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-497(1975)], 트리오마 기술, 인체 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor 등, Immunology Today 4: 72 (1982)] 및 인체 단일 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole 등, in Monoclonal Antibodies 및 Cancer Therapy, Alan R, Liss, Inc, p 77-96 (1985)]을 포함한다.

단일 사슬 항체의 생성(미국 특허 4,946,778)을 위한 기술은 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 단일 사슬 항체를 생성하기 위해 적용할 수 있다. 또한, 돌연변이 생쥐를 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대해 인체에 적용할 수 있는 항체를 발현시키기 위해서 사용할 수 있다.

추가로 본 발명은 하기의 실시예들을 참고로 기재할 것이나, 이는 본 발명을 이들 실시예에 제한하려는 것이 아니라는 것을 인지해야 한다. 특별한 지시가 없으면 모든 부 또는 양은 중량을 기준으로 한다.

이하, 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해서 일부 빈번하게 사용한 방법 및/또는 용어에 대한 설명을 기술한다.

플라스미드는 대문자 및/또는 숫자의 앞 및/또는 뒤에 소문자 p로 나타낸다. 본 명세서에서 출발 플라스미드는 시판되는 플라스미드, 제한없이 누구나 사용할 수 있는 플라스미드 또는 문헌에 기재된 방법에 따라 이용가능한 플라스미드로 부터 구성된 플라스미드일 수 있다. 또한, 기술한 것과 동등한 의미의 플라스미드는 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 당업자들에게는 자명할 것이다.

DNA의 분해는 DNA의 특정 부위에 작용하는 제한 효소를 촉매로 이용하는 DNA의 절단을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 각종 제한 효소는 시판되며, 당업자들에게 공지된 반응 조건, 보조인자 및 기타 필요사항들을 사용하였다. 분석을 위하여, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 단편 1㎍을 약 20 ㎕ 완충용액 내에 효소 약 2 유니트와 함께 사용하였다. 플라스미드 구조를 위한 DNA 단편을 분리하기 위해서, 전형적으로 DNA 5 내지 50㎍을 더 큰 부피로 20 내지 250 효소 유니트로 분해하였다. 적절한 완충액 및 특정 제한 효소의 기질 양은 제조업자에 의해 결정된다. 통상적으로, 37℃에서 약 1시간의 배양시간이 사용하였으나, 공급자의 지시에 따라 달라질 수 있다. 분해 후에, 반응물을 폴리아미드겔에 직접 전기영동시켜 원하는 단편을 분리하였다.

분열된 단편의 크기별 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. 등, Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)]에 기재된 8% 폴리아미드 겔을 사용하여 수행하였다.

올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있는 1본쇄의 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트가 없으며, 따라서 키나아제의 존재하에 ATP를 이용하여 포스페이트를 첨가하지 않으면 올리고뉴클레오티드를 상호 연결할 수 없다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결된다.

연결은 2본쇄의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다[참조: Maniatis, T. 등, Id., p 146]. 특별한 언급이 없는 경우, 연결은 공지된 완충액 및 거의 동일한 몰의 연결된 DNA 단편 0.5㎍당 T4 DNA 리가아제(리가아제) 10 유니트를 사용하여 수행할 수 있다.

특별한 언급이 없는 경우, 형질 전환은 문헌[참조: Graham, F. 및 Van der Eb. A., Virology]에 기재된 방법으로 수행하였다.

본 발명의 제1양태에 따라, 인체 Ckβ-11 및 인체 Ckα-1인 신규한 폴리펩티드 뿐만 아니라 이의 생물학적으로 활성이 있고, 진단적 또는 치료적으로 유용한 단편, 이의 유사체 및 유도체가 제공된다.

본 발명의 제2양태에 따라, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA를 비롯하여 상기 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산 분자 뿐만 아니라 이의 생물학적으로 활성이 있고, 진단적 또는 치료적으로 유용한 단편, 이의 유사체 및 유도체가 제공된다.

본 발명의 제3양태에 따라, Ckβ-11 및 Ckα-1 서열에 충분히 하이브리드화하는 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브가 제공된다.

본 발명의 제4양태에 따라, 상기 단백질 및 상기 단백질의 후속 회수가 가능한 조건 하에서 Ckβ-11 또는 Ckα-1 핵산 서열을 함유하는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 기법에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제5양태에 따라, 예를 들어 고형 종양, 만성 염증, 백혈병, T-세포 매개된 자가면역 질병, 기생충 감염, 건선, 천식, 알러지를 치료하기 위해, 조혈을 조절하기 위해, 성장 인자 활성을 자극하기 위해, 혈관생성을 억제하기 위해, 상처 치료를 촉진하기 위한 치료 목적으로 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제6양태에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다.

본 발명의 제7양태에 따라, 예를 들어 특정 자가 면역 질병, 아테롬성 경화증, 만성 염증성 및 감염성 질병, 히스타민 및 IgE-매개된 알러지 반응, 프로스타글란딘-의존성 발열, 골수 장애, 암, 규폐증, 유육종증, 류마티스성 관절염, 쇼크, 과호산성 증후군 및 천식성 폐내의 섬유증의 치료에 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하기위해 사용할 수 있는 상기 폴리펩티드에 대한 길항물질이 제공된다.

본 발명의 제8양태에 따라, Ckβ-11 및 Ckα-1 핵산 서열 및 상기 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질의 돌연변이에 관련된 질병 또는 이 질병에 대한 민감성을 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제9양태에 따라, 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조에 관련된 목적을 위해 시험관 내에서 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법에 제공된다.

이러한 본 발명의 양태 및 기타 다른 양태는 본원의 교시로부터 당업자라면 명확하게 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1

Ckβ-11의 박테리아 발현 및 정제

Ckβ-11, ATCC # 75948을 암호화하는 DNA 서열은 프로세싱된 Ckβ-11 핵산 서열의 5' 및 3' 단부 서열(추정 시그날 펩티드 서열은 제외)에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기 증폭시켰다. Ckβ-11 유전자에 상응하는 추가의 뉴클레오티드는 각각 5' 및 3' 단부 서열에 추가하였다. 5' CCCGCATGCCAACTCTGAGTGGCACCA 3'을 보유하는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 SphI 제한 효소 부위(진한 문자)에 이어서, 성숙 단백질을 암호화하는 서열의 2번째 뉴클레오티드로부터 출발하는 Ckβ-11 암호 서열의 18 뉴클레오티드(밑줄친 문자)를 함유하였다. ATG 이후의 코돈에서 첫 번째 염기는 SphI 부위로부터 시작하며, 나머지 2개의 염기는 추정 성숙 단백질의 첫 번째 코돈(잔기 18)의 두 번째 및 세 번째 염기에 상응하였다. 3' 서열 5' CCCGGATCCCAATGCTTGACTCGGACT 3'은 BamhI 부위(진한 문자)에 대해 상보적인 서열을 포함하였고, 이어서 종결 코돈 보다 선재하는 유전자 특이성 서열의 18 뉴클레오티드를 함유하였다. 이 제한 효소 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE-9상의 제한 효소 부위에 상응하였다(미국, 캘리포니아, 채트스워드에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드). pQE-9은 항생제 내성(Amp^I), 박테리아 복제 원점(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화하였다. 이어서, pQE-9은 SphI 및 BamHI를 이용하여 분해하였다. 증폭된 서열은 pQE-9내로 결합되고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 프레임내로 삽입하였다. 이어서, 상기 결합 혼합물을 이용하고, 문헌[참조; Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 레버러토리 프레스 (1989)]에 기재된 방법에 따라 퀴아젠 인코오포레이티드에서 시판되는 이.콜리 균주 M15/rep4을 형질전환시켰다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 다수의 사본을 포함하며, 이는 lacI 리프레서를 발현시키고 카나마이신 내성(Kan^I)을 부여한다. LB 평판 상에서 성장할 수 있는 능력에 의해 형질 전환체를 동정하고, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 제한 분석을 수행하였다. 목적 구성물을 함유하는 클론은 Amp(100 ㎍/ml) 및 Kan(25 ㎍/ml)를 보충한 LB 배지의 액상 배양액에서 하룻밤(O/N) 성장시켰다. O/N 배양액을 이용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 거대 배양액을 접종하였다. 세포를 0.4 내지 0.6 의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)까지 증식시켰다. IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드)를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. lacI 리프레서를 불활성화시키고, 증가된 유전자 발현을 유도하는 P/O를 제거하므로써 IPTG를 유도하였다. 세포는 추가의 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 세포 펠렛은 카오트로픽제(chaotropic agent)인 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 내에 용해시켰다. 상기 용액을 정화한후, 용해된 Ckβ-11을 6-His 태그를 함유하는 단백질과 강하게 결합시키는 조건하에 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 용액으로부터 정제하였다[참조: Hochuli, E 등, J. Chromatography 411:177-184 (1984)]. Ckβ-11(＞98% 순도)는 6몰 구아니딘 HCl pH 5.0 하에서 칼럼으로부터 용출시켰다. GnHCl로부터의 재생은 몇가지 방법으로 수행할 수 있었다[참조: Taenicke, R. 및 Rudolph, R., Protein Structure- A Practical Approach, IRL press, NY (1990)]. 초기에, 단계 투석을 이용하여 GnHCl을 제거하였다. 대안으로, 니켈-킬레이트 칼럼으로부터 분리된 상기 정제된 단백질은 선형 GnHCl 구배를 감소시키면서 운용하는 제 2 칼럼에 결합할 수 있다. 상기 단백질은 상기 칼럼에 결합하는 동안 재생될 수 있으며, 후속적으로 250 mM 염화나트륨, 25 mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액으로 용출하였다. 최종적으로, 가용성 단백질은 5 mM 중탄산 암모늄을 함유하는 저정 완충액에 대해 투석하였다.

실시예 2

Ckα-1의 박테리아 발현 및 정제

Ckα-1, ATCC # 75947을 암호화하는 DNA 서열은 프로세싱된 Ckα-1 핵산 서열의 5' 및 3' 단부 서열(추정 시그날 펩티드 서열은 제외)에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기 증폭시켰다. Ckα-1 유전자에 상응하는 추가의 뉴클레오티드는 각각 5' 및 3' 단부 서열에 추가하였다. 5' CCCGCATGCCTTCTGGAGGTCTATTCACA 3'을 보유하는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 SphI 제한 효소 부위(진한 문자)에 이어서, 성숙 단백질을 암호화하는 서열의 2번째 뉴클레오티드로부터 출발하는 Ckα-1 암호 서열의 21 뉴클레오티드를 함유하였다. ATG 이후의 코돈에서 첫 번째 염기는 SphI 부위로부터 시작하며, 나머지 2개의 염기는 추정 성숙 단백질의 첫 번째 코돈(잔기 23)의 두 번째 및 세 번째 염기에 상응하였다. 결과적으로, 상기 코돈의 첫 번째 염기는 최초의 서열과 비교시 G 로부터 C로 변경되었으며, 결과적으로 재조합 단백질 내에서는 Val으로 Leu로의 치환이 이루어졌다. 3' 서열 5' CCCGGATCCGGGAATCTTTCTCTTAAAC 3'은 BamhI 부위(진한 문자)에 대해 상보적인 서열을 포함하였고, 이어서 종결 코돈 보다 선재하는 유전자 특이성 서열의 19 뉴클레오티드를 함유하였다. 이 제한 효소 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE-9상의 제한 효소 부위에 상응하였다(미국, 캘리포니아, 채트스워드에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드). pQE-9은 항생제 내성(Amp^I), 박테리아 복제 원점(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화하였다. 이어서, pQE-9은 SphI 및 BamHI를 이용하여 분해하였다. 증폭된 서열은 pQE-9내로 결합되고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 프레임내로 삽입하였다. 이어서, 상기 결합 혼합물을 이용하고, 문헌[참조; Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 레버러토리 프레스 (1989)]에 기재된 방법에 따라 퀴아젠 인코오포레이티드에서 시판되는 이.콜리 균주 M15/rep4을 형질전환시켰다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 다수의 사본을 포함하며, 이는 lacI 리프레서를 발현시키고 카나마이신 내성(Kan^I)을 부여한다. LB 평판 상에서 성장할 수 있는 능력에 의해 형질 전환체를 동정하고, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 제한 분석을 수행하였다. 목적 구성물을 함유하는 클론은 Amp(100 ㎍/ml) 및 Kan(25 ㎍/ml)를 보충한 LB 배지의 액상 배양액에서 하룻밤(O/N) 성장시켰다. O/N 배양액을 이용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 거대 배양액을 접종하였다. 세포를 0.4 내지 0.6 의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)까지 증식시켰다. IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드)를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. lacI 리프레서를 불활성화시키고, 증가된 유전자 발현을 유도하는 P/O를 제거하므로써 IPTG를 유도하였다. 세포는 추가의 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 세포 펠렛은 카오트로픽제(chaotropic agent)인 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 내에 용해시켰다. 상기 용액을 정화한후, 용해된 Ckβ-11을 6-His 태그를 함유하는 단백질과 강하게 결합시키는 조건하에 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 용액으로부터 정제하였다[참조: Hochuli, E 등, J. Chromatography 411:177-184 (1984)]. Ckβ-11(＞98% 순도)는 6몰 구아니딘 HCl pH 5.0 하에서 칼럼으로부터 용출시켰다. GnHCl로부터의 재생은 몇가지 방법으로 수행할 수 있었다[참조: Taenicke, R. 및 Rudolph, R., Protein Structure- A Practical Approach, IRL press, NY (1990)]. 초기에, 단계 투석을 이용하여 GnHCl을 제거하였다. 대안으로, 니켈-킬레이트 칼럼으로부터 분리된 상기 정제된 단백질은 선형 GnHCl 구배를 감소시키면서 운용하는 제 2 칼럼에 결합할 수 있다. 상기 단백질은 상기 칼럼에 결합하는 동안 재생될 수 있으며, 후속적으로 250 mM 염화나트륨, 25 mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액으로 용출하였다. 최종적으로, 가용성 단백질은 5 mM 중탄산 암모늄을 함유하는 저정 완충액에 대해 투석하였다.

실시예 3

COS 세포에서의 재조합 Ckβ-11의 발현

플라스미드 Ckβ-11 HA의 발현은 1) SV40 복제 원점, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이. 콜리 복제 원점, 4) CMV 프로모터에 이어지는 다중링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도된다. 완전한 Ckβ-11 전구체 및 그의 3' 말단에 프레임내로 융합된 HA 태그를 암호화하는 DNA 단편은 상기 벡터의 다중링커 영역으로 클로닝하므로써, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터의 조절 하에 이루어지도록 하였다. 에피토프에 상응하는 HA 태그는 전술한 바와 같이 인프루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도하였다[참조: I. Wilson 등, Cell, 37:767 (1984)]. 표적 단백질에 대한 HA 태그의 주입으로 HA 에피토프를 인식하는 항체를 이용하는 재조합 단백질의 용이한 검출이 가능하다.

플라스미드 구성 방법은 하기와 같다:

Ckβ-11, ATCC # 75948을 암호화하는 DNA 서열은 2개의 프라이머를 사용한 PCR로 구성하였다: 5' 프라이머 5' AAAAAGCTTGCCATGGCCCTGCTACTG 3'은 HindIII 부위 및 그 뒤에 이어지는 개시 코돈에 대해 -3 위치로부터 출발하는 Ckβ-11 암호 서열의 18 뉴클레오티드를 함유한다; 3' 서열 5' CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTATAGGTTAACTGCTGCGAC 3'는 XbaI 부위에 대해 상보적인 서열, 해독 종결 코돈, HA 태그 및 Ckβ-11 암호 서열의 최종 20 뉴클레오티드(종결 코돈은 포함하지 않음)를 포함한다. 따라서, PCR 생성물은 HindIII 부위, 프레임내에 융합된 HA 태그로 이어지는 Ckβ-11 서열, HA 태그에 이웃한 해독 종결 중지 코돈, 및 XbaI 부위를 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp은 HindIII 및 XbaI 제한 효소를 이용하여 분해 및 연결하였다. 연결 혼합물을 이. 콜리 균주 SURE(캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 스트라타젠 클로닝 시스템스)내로 형질전환시키고, 형질 전환된 배양액을 앰피실린 배지 평판상에 평판 배양시켰으며, 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA는 형질전환체로부터 분리하였으며, 정확한 단편의 존재에 대해 제한 분석법으로 테스트하였다. 재조합 Ckβ-11의 발현을 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 콜드 스프링 레버러토리 프레스 (1989)]을 이용하여 발현 벡터내로 형질감염시켰다. Ckβ-11-HA 단백질의 발현은 방사능표지법 및 면역침전법을 사용하여 검하였다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 레버러토리즈 (1988)]. 형질 감염 2일 후에 세포를 8 시간 동안³⁵S-시스테인으로 표지하였다. 그후, 배양 배지를 수거하고 세포를 세정제(RIPA 완충액 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.1% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)를 이용하여 용해시켰다[참조: Wilson, I 등, Id. 37: 767 (1984)]. 세포 용해물 및 세포 배양액을 HA 특이성 단일 클론 항체로 침전시켰다. 침전된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 4

COS 세포에서의 재조합 Ckα-1의 발현

플라스미드 Ckα-1 HA의 발현은 1) SV40 복제 원점, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이. 콜리 복제 원점, 4) CMV 프로모터에 이어지는 다중링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도하였다. 완전한 Ckα-1 전구체 및 그의 3' 말단에 프레임내로 융합된 HA 태그를 암호화하는 DNA 단편은 상기 벡터의 다중링커 영역으로 클로닝하므로써, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터의 조절 하에 이루어지도록 하였다. 에피토프에 상응하는 HA 태그는 전술한 바와 같이 인프루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도하였다[참조: I. Wilson 등, Cell, 37:767 (1984)]. 표적 단백질에 대한 HA 태그의 주입으로 HA 에피토프를 인식하는 항체를 이용하는 재조합 단백질의 용이한 검출이 가능하다.

플라스미드 구성 방법은 하기와 같다:

Ckα-1, ATCC # 75947을 암호화하는 DNA 서열은 2개의 프라이머를 사용한 PCR로 구성하였다: 5' 프라이머 5' AAAAAGCTTAGAATGAAGTTCATCTCG 3'은 HindIII 부위 및 그 뒤에 이어지는 개시 코돈에 대해 -3 위치로부터 출발하는 Ckα-1 암호 서열의 18 뉴클레오티드를 함유한다; 3' 서열 5' CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTAGGGAATCTTTCTCTT 3'는 XbaI 부위에 대해 상보적인 서열, 해독 종결 코돈, HA 태그 및 Ckα-1 암호 서열의 최종 20 뉴클레오티드(종결 코돈은 포함하지 않음)를 포함한다. 따라서, PCR 생성물은 HindIII 부위, 프레임내에 융합된 HA 태그로 이어지는 Ckα-1 서열, HA 태그에 이웃한 해독 종결 중지 코돈, 및 XbaI 부위를 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp는 HindIII 및 XbaI 제한 효소를 이용하여 분해하고, 연결하였다. 연결 혼합물은 이. 콜리 균주 SURE(캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 스트라타젠 클로닝 시스템스)내로 형질전환시키고, 형질 전환된 배양액을 앰피실린 배지 평판상에 평판 배양시켰으며, 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA는 형질전환체로부터 분리하였으며, 정확한 단편의 존재에 대해 제한 분석법으로 테스트하였다. 재조합 Ckα-1의 발현을 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 콜드 스프링 레버러토리 프레스 (1989)]을 이용하여 발현 벡터내로 형질감염시켰다. Ckα-1 HA 단백질의 발현은 방사능표지법 및 면역침전법을 사용하여 검하였다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 레버러토리즈 (1988)]. 형질 감염 2일 후에 세포를 8 시간 동안³⁵S-시스테인으로 표지하였다. 그후, 배양 배지를 수거하고 세포를 세정제(RIPA 완충액 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.1% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)를 이용하여 용해시켰다[참조: Wilson, I 등, Id. 37: 767 (1984)]. 세포 용해물 및 세포 배양액을 HA 특이성 단일 클론 항체로 침전시켰다. 침전된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 5

바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 케모킨 Ckβ-11의 클로닝 및 발현

전장 Ckβ-11 단백질 ATCC # 75948을 암호화하는 DNA 서열은 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭시켰다.

5' 프라이머는 서열 5' CGCGGGATCCGCCATCATGGCCTGCTACTGGCCCT 3'을 보유하였으며, BamHI 제한 부위(진한 문자)와 그 뒤에 이어지는 Ckβ-11 유전자의 최초 20 뉴클레오티드 바로 뒤에 존재하는 진핵 세포의 해독 개시를 위한 유효 시그날[참조: Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987)]과 유사한 6개의 뉴클레오티드를 함유하고 있다(해독을 위한 개시 코돈인 ATG는 밑줄로 나타냈다).

3' 프라이머는 서열 5' CGGCGGTACCTGGCTGCACGGTCCATAGG 3'을 보유하였으며, 제한 엔도뉴클레아제 Asp781을 위한 절단 부위와 Ckβ-11 유전자의 3' 비해독된 서열에 상보적인 19 뉴클레오티드를 함유하였다. 증폭된 서열은 시판되는 키트(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 진클린 BIO 101 인코오포레이티드)를 이용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리하였다. 이어서, 상기 단편은 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp781을 이용하여 분해하고, 그후 1% 아가로즈 겔 상에서 다시 정제하였다. 이 단편은 F2라 지칭하였다.

벡터 pRG1(pVL941 벡터의 변형, 후술함)은 바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 Ckβ-11 단백질의 발현을 위해 사용하였다[참조: Summers, M.D. 및 Smith, G.E., A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procudure, 텍사스 농업 실험원 원보 1555호]. 상기 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니아 핵 다면체 비루스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터 및 그 뒤에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제 BamHI와 Asp781을 위한 제한 부위를 함유하고 있다. 시미안 비루스(SV)40의 폴리아데닐화 부위는 효과적인 폴리아데닐화를 위해 사용하였다. 재조합 비루스의 용이한 검출을 위해, 이. 콜리로부터 베타-갈락토시다제 유전자를 상기 폴리헤드린 프로모터 및 그 뒤의 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호와 동일한 방향으로 삽입하였다. 상기 폴리헤드린 서열은 양측면이 동시 혈질감염된 야생형 비루스 DNA의 세포-매개된 단독 재조합을 위한 비루스 서열과 인접하였다. 다수의 다른 바쿨로비루스 벡터, 예를 들어 pAc373, pVL941 및 pAcIMI를 pRG1을 대신하여 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. 및 Summers, M.D., Virology, 170:31-39].

상기 플라스미드는 제한 효소인 BamHI와 Asp781로 분해하고, 이어서 송아지 장 포스파타아제를 이용하고, 공지된 방법에 따라 인산기를 제거하였다. 그후, 상기 DNA는 시판 키트(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 진클린 BIO 101 인코오포레이티드)를 이용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리하였다. 상기 벡터 DNA는 V2로 지칭하였다.

단편 F2 및 인산기 제거된 플라스미드 V2는 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결하였다. 이어서, 이. 콜리 H101 세포를 형질전환시키고, BamHI 및 Asp781을 이용하여 Ckβ-11 유전자를 갖는 플라스미드(pBac-Ckβ-11)를 함유하는 박테리아를 동정하였다. 상기 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 결정법으로 확인하였다.

상기 플라스미드 pBac-Ckβ-11 5 ㎍은 시판되는 선형화된 바쿨로비루스(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 파민겐의 바쿨로골드(등록상표)) 1.0 ㎍을 이용하고, 리포펙션법[참조: Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:74133-7417 (1987)]에 따라 동시형질감염하였다.

바쿨로골드(등록상표) 비루스 DNA 1 ㎍ 및 플라스미드 pBac-Ckβ-11 5 ㎍은 무혈청 그레이스 배지(미국, 메릴랜드, 게더스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰 내에서 혼합하였다. 리포펙틴 10 ㎕ + 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가한 후, 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 상기 형질감염 혼합물은 무혈청 그레이스 배지 1 ㎖를 보유하는 35 mm 조직 배양 평판 내에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 상기 평판을 전후로 흔들어 새롭게 첨가된 용액을 혼합하였다. 그후, 상기 평판은 27℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 5 시간 후에, 상기 형질감염 용액을 상기 평판으로부터 제거하고, 10% 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 상기 평판은 다시 배양기에 투입하고, 27℃에서 4일 동안 배양하였다.

4일후, 상청액을 수집하고, Summers 및 Smith의 방법(상기 참조)과 유사한 방법으로 플라크 분석을 수행하였다. 블루 갈(라이프 테크놀로지스 인코오포레이티드) 변형 아가로즈 겔을 사용하므로써 청색으로 염색된 플라크의 용이한 분리가 가능했다. (플라크 분석에 대한 상세한 설명은 라이프 테크놀로지스, 인코오포레이티드에서 배포하는 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학에 대한 사용자 지침서에 기재되어 있다)

일련의 희석을 수행하고, 4일이 경과한 후, 상기 비루스는 세포에 첨가하고, 청색으로 염색된 플라크는 에펜도르프 피펫의 단부를 이용하여 제거하였다. 그후, 재조합 비루스를 함유하는 한천은 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시켰다. 상기 한천은 간단한 원심분리로 제거하고, 재조합 바쿨로비루스를 함유하는 상청액을 이용하여 35 mm 접시에 접종된 Sf9 세포를 감염시켰다. 4일후, 이들 배양 접시의 상청액을 수거한 후, 4℃에서 저장하였다.

Sf9 세포는 10% 열-불활성화된 FBS로 보충된 그레이스 배지내에서 성장시켰다. 상기 세포는 감염의 다중도(MOI)를 2로 하여 재조합 바쿨로비루스 V-Ckβ-11을 이용하여 감염하였다. 6시간 후, 상기 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지(라이프 테크놀로지스, 인코오포레이티드)로 대체하였다. 42 시간후,³⁵S-메티오닌 5 μCi 및³⁵S-시스테인 5 μCi(아메르샴)을 첨가하였다. 상기 세포는 16 시간 동안 추가로 배양한 후, 원심분리하여 수거하였으며, SDS-PAGE 및 자동방사능 사진법으로 표지된 단백질을 시각화하였다.

실시예 6

바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 케모킨 Ckα-1의 클로닝 및 발현

전장 Ckα-1 단백질 ATCC # 75947을 암호화하는 DNA 서열은 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭시켰다.

5' 프라이머는 서열 5' GCCGGATCCGCCATCATGAAGTTCATCTCGACATC 3'을 보유하였으며, BamHI 제한 부위(진한 문자)와 그 뒤에 이어지는 Ckβ-11 유전자의 최초 20 뉴클레오티드 바로 뒤에 존재하는 진핵 세포의 해독 개시를 위한 유효 시그날[참조: Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987)]과 유사한 6개의 뉴클레오티드를 함유하고 있다(해독을 위한 개시 코돈인 ATG는 밑줄로 나타냈다).

3' 프라이머는 서열 5' CGCGGTACCGGTGTTCTTAGTGGAAA 3'을 보유하였으며, 제한 엔도뉴클레아제 Asp781을 위한 절단 부위와 Ckβ-11 유전자의 3' 비해독된 서열에 상보적인 17 뉴클레오티드를 함유하였다. 증폭된 서열은 시판되는 키트(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 진클린 BIO 101 인코오포레이티드)를 이용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리하였다. 이어서, 상기 단편은 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp781을 이용하여 분해하고, 그후 1% 아가로즈 겔 상에서 다시 정제하였다. 이 단편은 F2라 지칭하였다.

벡터 pRG1(pVL941 벡터의 변형, 후술함)은 바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 Ckα-1 단백질의 발현을 위해 사용하였다[참조: Summers, M.D. 및 Smith, G.E., A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procudure, 텍사스 농업 실험원 원보 1555호]. 상기 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니아 핵 다면체 비루스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터 및 그 뒤에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제 BamHI와 Asp781을 위한 제한 부위를 함유하고 있다. 시미안 비루스(SV)40의 폴리아데닐화 부위는 효과적인 폴리아데닐화를 위해 사용하였다. 재조합 비루스의 용이한 검출을 위해, 이. 콜리로부터 베타-갈락토시다제 유전자를 상기 폴리헤드린 프로모터 및 그 뒤의 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호와 동일한 방향으로 삽입하였다. 상기 폴리헤드린 서열은 양측면이 동시 혈질감염된 야생형 비루스 DNA의 세포-매개된 단독 재조합을 위한 비루스 서열과 인접하였다. 다수의 다른 바쿨로비루스 벡터, 예를 들어 pAc373, pVL941 및 pAcIMI를 pRG1을 대신하여 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. 및 Summers, M.D., Virology, 170:31-39].

단편 F2 및 인산기 제거된 플라스미드 V2는 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결하였다. 이어서, 이. 콜리 H101 세포를 형질전환시키고, BamHI 및 Asp781을 이용하여 Ckβ-11 유전자를 갖는 플라스미드(pBac-Ckα-1)를 함유하는 박테리아를 동정하였다. 상기 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열 결정법으로 확인하였다.

상기 플라스미드 pBac-Ckα-1 5 ㎍은 시판되는 선형화된 바쿨로비루스(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 파민겐의 바쿨로골드(등록상표)) 1.0 ㎍을 이용하고, 리포펙션법[참조: Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:74133-7417 (1987)]에 따라 동시형질감염하였다.

바쿨로골드(등록상표) 비루스 DNA 1 ㎍ 및 플라스미드 pBac-Ckα-1 5 ㎍은 무혈청 그레이스 배지(미국, 메릴랜드, 게더스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰 내에서 혼합하였다. 리포펙틴 10 ㎕ + 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가한 후, 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이어서, 상기 형질감염 혼합물은 무혈청 그레이스 배지 1 ㎖를 보유하는 35 mm 조직 배양 평판 내에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 상기 평판을 전후로 흔들어 새롭게 첨가된 용액을 혼합하였다. 그후, 상기 평판은 27℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 5 시간 후에, 상기 형질감염 용액을 상기 평판으로부터 제거하고, 10% 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 상기 평판은 다시 배양기에 투입하고, 27℃에서 4일 동안 배양하였다.

Sf9 세포는 10% 열-불활성화된 FBS로 보충된 그레이스 배지내에서 성장시켰다. 상기 세포는 감염의 다중도(MOI)를 2로 하여 재조합 바쿨로비루스 V-Ckα-1을 이용하여 감염하였다. 6시간 후, 상기 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지(라이프 테크놀로지스, 인코오포레이티드)로 대체하였다. 42 시간후,³⁵S-메티오닌 5 μCi 및³⁵S-시스테인 5 μCi(아메르샴)을 첨가하였다. 상기 세포는 16 시간 동안 추가로 배양한 후, 원심분리하여 수거하였으며, SDS-PAGE 및 자동방사능 사진법으로 표지된 단백질을 시각화하였다.

실시예 7

유전자 요법에 의한 발현

섬유아세포는 피부 생체 검사에 의해 검체로부터 획득하였다. 생성된 조직은 조직 배양 배지 내에 위치시켰으며, 소 단편으로 분리하였다. 조직의 작은 덩어리는 조직 배양 플라스크의 습윤 표면상에 위치시키고, 약 10개의 단편을 각각의 플라스크에 위치시켰다. 상기 플라스크는 뒤집고, 철저히 봉인하고, 실온에서 하룻밤 동안 유지하였다. 실온에서 24 시간후, 상기 플라스크를 뒤집고, 조직 덩어리를 플라스크의 바닥에 고정시킨 상태에서 새로운 배지(예를 들어, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 보유하는 햄의 F12 배지)를 첨가하였다. 이어서, 37℃에서 약 1 주일 동안 배양하였다. 이 시점에서, 새로운 배지를 첨가하고, 이어서 7일에 한 번 교환하였다. 추가로 2주일 동안 배양한 후, 섬유아세포로 이루어진 단층이 나타났다. 상기 단층은 트립신 처리하고, 더 큰 플라스크로 확대하였다.

몰로니 쥐 육종 비루스의 긴 말단 반복부에 인접한 pMV-7(Kirschmeier, P.T. 등, DNA 7:219-25 (1988))은 EcoRI 및 HindIII로 분해하였으며, 이어서 송아지 췌장 포스파타아제로 처리하였다. 상기 선형 벡터는 한천 겔 상에서 분획화하고, 유리 비드를 사용하여 정제하였다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA는 각각 5' 서열 및 3' 서열에 상응하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 상기 5' 프라이머는 EcoRI 위치를 함유하였고, 3' 프라이머는 HindIII 위치를 함유하였다. 동일한 양의 몰로니 쥐 육종 비루스 선형 백본 및 EcoRI 및 HindIII 단편은 T4 DNA 리가제의 존재하에서 함께 첨가하였다. 생성된 혼합물은 상기 두 단편의 연결을 위해 적합한 조건 하에서 유지하였다. 상기 연결 혼합물을 사용하여 박테리아 HB101을 형질전환하였으며, 이어서 상기 벡터에 소정의 유전자가 적합하게 삽입되었는가를 확인하기 위해 카나마이신을 함유하는 한천 상에서 평판 배양하였다.

암포트로픽(amphotropic) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 보유하는 둘베코의 변형된 이글 배지 내에서 조직 배양하여 합류 밀도로 성장시켰다. 이어서 상기 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 상기 배지에 첨가하고, 상기 패키징 세포는 상기 벡터로 형질전환하였다. 상기 패키징 세포는 상기 유전자를 함유하는 감염성 비루스 입자를 생성하였다(이하, 상기 패키징 세포는 생산자 세포로 칭한다).

새로운 배지를 형질도입된 생산 세포에 첨가하고, 이어서 배지를 군집된 생산자 세포의 10 cm 평판으로부터 수득하였다. 감염성 비루스 입자를 포함하는 산란 배지는 밀리 다공성 필터로 여과하여 부착된 생산자 세포를 제거하고, 이 배지를 섬유아세포로 감염시키기 위해서 사용하였다. 배지를 섬유아세포의 아군집 평판으로부터 제거하고, 신속하게 생산자 세포로 배지를 대체하였다. 이 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체하였다. 비루스의 역가가 높으면, 결국 모든 섬유아세포는 감염되고 선택할 필요가 없다. 만약 역가가 매우 낮으면, neo 또는 his같은 마커를 선택하기 위해서 레트로비루스 벡터를 사용할 필요가 있다.

조작된 섬유 아세포는 단독으로 또는 시토덱스 3 마이크로담체 비드상에 군집시키기 위해 증식시킨 숙주에 주입하였다. 이 후 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산할 수 있다.

본 발명의 각종 변형실시 및 다양성이 상기 기술로 미루어보아 가능하며, 따라서 본 발명은 특별하게 기재된 것 이외에도 첨부된 청구항내에서 실시될 수 있다.

서열목록

(1) 일반정보:

(i) 출원인: 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코오포레이티드; 리 하오동

(ii) 발명의 명칭: 인체 케모킨 베타-11 및 인체 케모킨 알파-1

(iii) 서열의 수: 16

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스테인 앤드 폭스 피.엘.엘.씨.

(b) 거리: 뉴욕, 뉴욕 애비뉴 1100

(C) 도시: 워싱톤

(D) 주: 디.씨.

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 20005-3934

(vi) 현 출원 자료

(A) 출원 번호: 추후 보정

(B) 출원인: 1996년 6월 5일

(C) 분류:

(vii) 전 출원 자료:

(A) 출원 번호: 08/460,987 및 08/464,401

(B) 출원일: 1995년 6월 5일 및 1995년 6월 5일

(viii) 대리인 정보:

(A) 성명: 죠지 에이. 골드스테인

(B) 등록 번호: 29,021

(C) 참조 번호: 1488.038PC02

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: (202) 371-2600

(B) 팩스: (202) 371-2540

(2) 서열 번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 297 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열 번호 1:

(2) 서열 번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 98 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄의 수:

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열 번호 2:

(2) 서열 번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 330 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열 번호 3:

(2) 서열 번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 109 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄의 수:

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열 번호 4:

(2) 서열 번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 5:

(2) 서열 번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 6:

(2) 서열 번호 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴크레오티드

(xi) 서열 번호 7:

(2) 서열 번호 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 8:

(2) 서열 번호 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 9:

(2) 서열 번호 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 57 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 10:

(2) 서열 번호 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 11:

(2) 서열 번호 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 54 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 12:

(2) 서열 번호 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 36 염기

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 13:

(2) 서열 번호 14에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 29 염기

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 14:

(2) 서열 번호 15에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 15:

(2) 서열 번호 160에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 번호 16:

기탁 미생물에 대한 표시(PCR 규칙 13bis)

A. 기탁 미생물에 관한 표시는 명세서 제5면 제23행에 기재되어 있음.

B. 기탁물에 대한 증명 추가 기탁물은 별지로 증명함 ■

1. 기탁 기관 명칭

미국 모식균 배양 수집수(ATCC)

2. 기탁 기관의 주소(국가명 및 우편번호 포함)

미국, 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301

3. 기탁 일자

1994년 11월 11일

4. 수탁 번호

ATCC 75947

C. 추가 표시(부적합한 경우 공란으로 둘 것) 이 정보는 별지에 계속됨 □

DNA 플라스미드, 374,801

D. 표시가 적용되는 지정국(모든 지정국에 대해 표시가 필요하지 않은 경우)

E. 표시에 대한 별도의 언급(부적합한 경우 공란으로 둘 것)

본 표시는 차후에 국제사무국에 제출될 것임(본 표시의 일반적인 성질, 예를 들어 기탁물의 수탁번호를 기재할 것)

접수처용: □ 본 서류는 국제 출원과 동시에 접수됨. 서명: ___________

국제사무국용: □ 본 서류는 ____년 __월 __일에 국제 사무국에 접수됨.

서명: ___________

기탁 미생물에 대한 표시(PCR 규칙 13bis)

A. 기탁 미생물에 관한 표시는 명세서 제5면 제22행에 기재되어 있음.

B. 기탁물에 대한 증명 추가 기탁물은 별지로 증명함 □

1. 기탁 기관 명칭

미국 모식균 배양 수집수(ATCC)

2. 기탁 기관의 주소(국가명 및 우편번호 포함)

미국, 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301

3. 기탁 일자

1994년 11월 11일

4. 수탁 번호

ATCC 75947

DNA 플라스미드, 374,797

E. 표시에 대한 별도의 언급(부적합한 경우 공란으로 둘 것)

서명: ___________

Claims

(a) 서열 번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열 번호 4의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있고, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드; 및

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제 2 항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 81을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 2 항에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 1 내지 87을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 2 항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(a) ATCC 수탁번호 75948내에 함유된 DNA에 의해 암호화되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(b) ATCC 수탁번호 75947내에 함유된 DNA에 의해 암호화되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있고, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드;

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 2 항의 DNA를 함유하는 벡터.
제 7 항의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작한 숙주 세포.
제 8 항의 세포로부터 상기 DNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
제 7 항의 벡터를 이용하여 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포의 제조 방법.
(i) 서열 번호 2의 추정 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드, 이의 단편, 유사체 및 유도체; (ii) 서열 번호 4의 추정 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드, 이의 단편, 유사체 및 유도체; (iii) ATCC 수탁번호 75948의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 및 이의 단편, 유사체 및 유도체; 및 (iv) ATCC 수탁번호 75947의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 및 이의 단편, 유사체 및 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
제 11 항의 폴리펩티드에 대한 작용물질로 효과적인 화합물.
제 11항의 폴리펩티드에 대한 길항물질로 효과적인 화합물.
제 11 항의 폴리펩티드의 치료 유효량을 케모킨 베타-11이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 케모킨 베타-11이 필요한 환자를 치료하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 치료 유효량이 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현시키므로써 제공되는 방법.
제 12 항의 화합물의 치료 유효량을 케모킨 알파-1이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 케모킨 알파-1이 필요한 환자를 치료하는 방법.
제 13 항의 길항물질의 치료 유효량을 케모킨 폴리펩티드의 억제가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 케모킨 폴리펩티드의 억제가 필요한 환자를 치료하는 방법.
상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 내의 돌연변이를 결정하는 단계를 포함하는 제 11 항의 폴리펩티드의 발현과 관련된 질병 또는 상기 질병에 대한 민감성을 진단하는 방법.
숙주로부터 유도된 샘플 내에 제 11 항의 폴리펩티드의 존재를 분석하는 단계를 포함하는 진단 방법.
- 표면 상에서 폴리펩티드에 대한 수용체를 발현하는 세포와 상기 수용체에 결합을 허용하는 조건 하에서 검색하려는 화합물을 접촉시키는 단계(이때, 상기 수용체는 상기 수용체에 대한 화합물의 결합에 대해 검출할 수 있는 신호를 제공할 수 있는 제 2 성분을 보유한다); 및

- 상기 화합물과 상기 수용체의 상호작용으로 생성된 신호의 존재 또는 부재를 검출하므로써 상기 화합물이 상기 수용체에 결합하고, 이를 활성화 또는 억제시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제 11 항의 폴리펩티드에 대한 수용체에 결합하고, 이를 활성화 또는 억제하는 화합물을 동정하는 방법.