DE602004005338T2

DE602004005338T2 - Digitales holographisches mikroskop für dreidimensionale abbildung und verfahren zu dessen verwendung

Info

Publication number: DE602004005338T2
Application number: DE602004005338T
Authority: DE
Inventors: Frank Dubois; Catherine Yourassowsky
Original assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-17
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2024-05-18
Also published as: PL1631788T3; DE602004005338D1; EP1631788A1; US20080018966A1; EP1631788B1; DK1631788T3; US7362449B2; ATE356968T1; WO2004102111A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die digitale holografische Mikroskopie.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes digitales holografisches Mikroskop und ein Verfahren zur Erlangung dreidimensionaler Bilder hoher Qualität von Probestücken, darunter Fluoreszenz-Probestücke und dicke Probestücke, mit geringer Zeitverzerrung.
STAND DER TECHNIK
Das Prinzip der Interferometrie ist seit langer Zeit bekannt.
Die digitale Holografie und Scherografie entsprechen verschiedenen Gebieten der Interferometrie.
Bei der Scherografie erzeugt ein Probestück, welches aus einer streuenden Struktur besteht und von einem kohärenten Strahl beleuchtet wird, ein Speckel-Feld. Dieses Speckel-Feld interferiert mit sich selbst, nachdem es um eine Scherdistanz verschoben wurde. Da die interferierenden Speckel-Felder die Informationen über das Probestück tragen, ist die stark kohärente Beleuchtung mit einem Laser obligatorisch.
Dies hat zur Folge, dass Scherografie-Interferometer im Allgemeinen, und insbesondere das im Dokument US-A-5,257,089 veröffentlichten Scherografie-Interferometer, nicht dafür geeignet sind, eine genaue Einstellung der interferometrischen Strahlengänge zu ermöglichen, was dazu führt, dass sie nicht mit Lichtquellen wie teilweise kohärenten Lichtquellen zu verwenden sind.
Überdies unterscheidet sich der Weg, wie die Informationen in der Scherografie verarbeitet werden, von dem Weg, wie die Informationen in der digitalen Holografie verarbeitet werden: In der Scherografie werden die Informationen entnommen, indem die interferierenden Speckel-Felder in zwei verschiedenen Zuständen des analysierten Probestücks verglichen werden, um die Strukturdeformation des Probestücks zu analysieren. Im Gegensatz zur digitalen Holografie ist jedoch die Qualität der erhaltenen Bilder für Mikroskopieanwendungen nicht ausreichend.
Im Vergleich dazu beruht die digitale Holografie darauf, von einem Probestück, welches von einer Lichtquelle beleuchtet wird, Streifeninterferenzmuster aufzuzeichnen, und die holografische Rekonstruktion wird durch numerische Mittel durchgeführt.¹
Es sind verschiedene optische Verfahren angewendet worden, um die Phasen- und Amplitudeninformationen des Objektstrahls aus dem aufgezeichneten Interferenzmuster zu entnehmen.^2–3 Mit den Phasen- und den Amplitudeninformationen wird in der holografischen Rekonstruktion die Ausbreitung des Lichtstrahls simuliert, indem die Kirchhoff-Fresnel(KF)-Ausbreitungsgleichungen diskret angewendet werden.
Die digitalen holografischen Verfahren sind in verschiedenen experimentellen Situationen angewendet worden^4–12 und sind in der optischen Mikroskopie vielversprechend, wo die Möglichkeit der dreidimensionalen Rekonstruktion die sehr begrenzten Feldtiefen aufgrund der hohen Vergrößerungen überwindet.^13–15,24
Wenn ein digitales Hologramm eines experimentellen Probestücks aufgezeichnet wird, beruht die digitale holografische Rekonstruktion auf der Refokussierung des Probestücks Scheibe für Scheibe durch numerische Mittel und ohne jede mechanische Bewegung, derart, dass Probestücke untersucht werden können, die dicker sind als die Feldtiefe eines gewöhnlichen optischen Mikroskops. Es hat sich experimentell gezeigt, dass die Untersuchungstiefe in der digitalen Holografie im Vergleich zur klassischen Transmissionsmikroskopie mit einem Faktor von ungefähr 80 multipliziert wird.¹⁵ Die Gründe für derart größere Leistungsfähigkeiten sind die folgenden:

– Da es keine mechanische Bewegung gibt, erfordert die Recodierung für die vollständigen Informationen über das gesamte Probevolumen nur wenige Bilder (typischerweise 1, 3, 4 oder 5, abhängig von der erwarteten optischen Qualität des Ergebnisses). Die Folge ist, dass dynamische Phänomene mit geringer Zeitverzerrung untersucht werden können;
– Dank der verschiedenen aufgezeichneten Bilder werden die gesamten Probeinformationen in optischen Phasen- und optischen Intensitätsbildern aufgezeichnet. Die Folge ist, dass die Daten im Vergleich zu klassischen Mikroskopen, in welchen mechanische Parallelverschiebungsvorrichtungen benutzt werden, um die Probe in der Tiefe abzutasten, beträchtlich komprimiert sind.

Es sind verschiedene Anwendungen der digitalen Holografie vorgeschlagen worden.
Zum Beispiel schlugen T. Zhang und I. Yamaguchi eine Vorrichtung vor, welche eine Mach-Zehnder-Interferometeranordnung aufweist, bei welcher sich das Probestück in einem Arm des Interferometers befindet.¹³ Die Anordnung weist einen piezoelektrischen Umformer auf, welcher die Anwendung der Phasenverschiebungstechnik² zur genauen Ermittlung der optischen Phase des Signals ermöglicht. Bei dieser Vorrichtung wird jedoch, wie sehr oft in der Holo grafie, ein Laserstrahl verwendet, welcher eine Quelle für kohärentes Rauschen in den erhaltenen Ergebnissen ist.
Kürzlich ist in einem Dokument derselben Autoren eine Vorrichtung mit einem Aufbau ohne Abbildungslinse zwischen dem Probestück und dem elektronischen Bildsensor vorgeschlagen worden.¹⁴ Die Autoren zeigen, dass es möglich ist, die Vergrößerung der Vorrichtung zu verändern, indem die Form des Referenzstrahls verändert wird. Diese Vorrichtung weist jedoch denselben Nachteil auf wie die vorige, da ebenfalls eine Laserquelle verwendet wird.
Es ist auch vorgeschlagen worden, eine Vorrichtung zu benutzen, welche einen Michelson-Interferometeraufbau mit einer Laserstrahlenquelle aufweist, um Probestücke durch Rückstrahlung zu untersuchen.⁷ Ein piezoelektrischer Umformer ermöglicht die Anwendung des Phasenschrittverfahrens. Dieser Aufbau ist jedoch auf bestimmte Anwendungen begrenzt, welche den Rückstrahlungs-Beleuchtungsmodus erfordern.
Eine Vorrichtung, bei welcher ein Mach-Zehnder-Aufbau mit einem Phasenschrittverfahren mit einer teilweise kohärenten Quelle kombiniert wird, ist ebenfalls veröffentlicht worden.^15,24 Die Verwendung dieser Art von Beleuchtung ermöglicht es, das Problem des von einem Laserstrahl erzeugten kohärenten Rauschens stark zu reduzieren. Diese Vorrichtung führt zu sehr guten Ergebnissen, macht aber für jedes neue Probestück komplexe optische Einstellungen erforderlich. Die optischen Anforderungen, welche erfüllt werden müssen, wenn man mit dieser Art von Lichtquellen arbeitet, sind in Dokumenten des Standes der Technik herausgestellt worden.^15,19,24
Es ist auch ein Verfahren vorgeschlagen worden, um Beugungseffekte an den Hologrammgrenzen zu vermeiden, und ein Schema, um eine 3D-Mustererkennung basierend auf den mit dem Mikroskop erhalten digitalen Hologrammen durchzuführen.^16,17
Um fluoreszierende Probestücke zu untersuchen, sind spezielle Interferometer vorgeschlagen worden.
Zum Beispiel beschreibt die Patentanmeldung WO 03/002972 die Koppellung eines teilweise kohärentes Licht benutzenden digitalen holografischen Mikroskops mit einer Fluoreszenzanregungsquelle, um die 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenzsignalen zu ermöglichen.¹⁸ Das Verfahren zur Verwendung dieses Mikroskops umfasst den Schritt des Zusammenmischens beider Signale, um die Rekonstruktion des Fluoreszenzsignals durchzuführen. Obwohl dieses Mikroskop leistungsstark ist, erfordert es, für das digitale holografische Signal die fluoreszierenden Teile des Probestücks vom Hintergrund zu abstrahieren, und es kann nur mit fluoreszierender Beleuchtung nicht arbeiten.
Andere Anwendungen der digitalen holografischen Mikroskopie sind in den Literaturstellen 19 bis 20 ausgewiesen. In den beiden Literaturstellen schlagen die Autoren einen Interferometeraufbau vor, wobei das Probestück vor einem Mach-Zehnder- oder Michelson-Interferometer angeordnet werden kann und wobei sich das Probensignal in beiden Armen des Interferometers ausbreitet. Um wiederum einen den oben beschriebenen digitalen Holografie-Interferometern ähnlichen Aufbau zu erlangen, wobei das Probenstück in einem Arm des Interferometers angeordnet wird, ordnen die Autoren im Referenzarm des Interferometers einen Schritt zur Fokussierung und ein Nadelloch an. Die Funktion dieses Teilsystems ist es, durch ein optisches Filterverfahren den Referenzstrahl zu glätten, welcher einem Referenzstrahl in den vorigen Aufbauten ähnlich wird. Dieser Aufbau ermöglicht es im Prinzip, die digitale Holografie auf fluoreszierende Probestücke anzuwenden.
Das Filterverfahren in dem Referenzstrahl verändert jedoch beträchtlich die Beleuchtungsniveau und die Kohärenzeigenschaften des Referenzstrahls. Diese Veränderung der Beleuchtungsniveau muss ausgeglichen werden, indem das Strahlverhältnis in den Armen des Interferometers ausbalanciert wird. Überdies bringt es die Veränderung der teilweise kohärenten Eigenschaften mit sich, in einem unscharfen Modus zu arbeiten, um Punktspreizfunktionen ähnlicher Größe für den Objektstrahl und den Referenzstrahl zu erhalten. Dies führt zu einem schwachen Kontrast der interferometrischen Streifen. Außerdem ist die digitale holografische Rekonstruktion weniger leistungsstark, was zu einer merklichen Verringerung der Auflösung führt. Schließlich geben die Autoren keine experimentellen Beispiele für Fluoreszenz-Probenstücke.
Es gibt auch auf einem Abtastsystem und einem heterodynen Erfassungssystem basierende digitale Holografie-Interferometer, um digitale Hologramme aufzuzeichnen. Mit diesen Interferometern wird das Probestück von zwei fokussierten Strahlen abgetastet, welche an derselben Stelle interferieren.^21,22 Das Streulicht oder das Fluoreszenzlicht und der Referenzstrahl werden jeweils von einem photoelektronischen Vervielfacher und von einer Photodiode erfasst. Die Konstruktion des Hologramms wird durch elektronische Mittel durchgeführt, was diese Interferometer von den vorigen sehr verschieden macht. Überdies ist die Bildqualität eher schlecht, wie es in den Veröffentlichungen attestiert wird.
Mit anderen Worten zeigen die Vorrichtungen des Standes der Technik technische Nachteile wie die eingeschränkte Auswahl von Lichtquellen, mehrfache und komplexe Einstellungen, die Komplexität der Datenverarbeitung, die Zuverlässigkeit der dreidimensionalen Rekonstruktion oder die eingeschränkte Bildqualität.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegende Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erlangung dreidimensionaler Bilder eines Probestücks durch digitale holografische Mikroskopie bereitzustellen, welche eine Alternative zu den oben erwähnten Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik sein könnten.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, welche von einem Probestück in einer angemessenen Erfassungszeit Bilder sehr hoher Qualität ergeben.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, welche die Verwendung von Lichtquellen mit unterschiedlichen Kohärenzniveaus ermöglichen, welche von kohärenten Lichtquellen bis zu inkohärenten Lichtquellen reichen und teilweise kohärente Lichtquellen umfassen.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung fluoreszierender Probestücke bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, welche für eine rauscharme dreidimensionale Abbildung von stark verzerrten Probestücken der optischen Phase geeignet sind.
Es ist ferner eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, welche einfach anzuwenden sind, nämlich mit verringerten technischen Einstellungen im Vergleich zu den Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren mit gemäßigten Kosten im Vergleich zu den Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik bereitzustellen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den beigefügten Patentansprüchen definiert.
Vorzugsweise entspricht das erste Reflexionselement einem ersten Spiegel, das zweite Reflexionselement entspricht einem zweiten Spiegel, und der erste Spiegel und der zweite Strahlenteiler sind gemeinsam auf den beweglichen Mitteln befestigt.
Alternativ sind der erste Strahlenteiler und das zweite Reflexionselement Bestandteile eines erstens Prismas (34), während der zweite Strahlenteiler und das erste Reflexionselement Bestandteile des zweiten Prismas sind, wobei das erste Prisma auf den beweglichen Mitteln befestigt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Kippmittel des Mikroskops einen Keil auf, und das Mikroskop weist im ersten Interferometerarm (beziehungsweise im zweiten Interferometerarm) eine ergänzende optische Ausgleichsvorrichtung auf.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weisen die Kippmittel das zweite Reflexionselement auf, welches auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Möglicherweise ist das erste Reflexionselement auf einem Umformer (Sensor), vorzugsweise einem piezoelektrischen Umformer, von Messbewegungen befestigt, um durch die Verarbeitungsmittel eine digitale Holografieverarbeitung gemäß dem Phasenschrittverfahren auszuführen.
Alternativ weist das erfindungsgemäße Mikroskop ferner Umschaltmittel zum Umschalten des durch das erste Reflexionselement (das zweite Reflexionselement) reflektierten Strahls, in Bezug auf den durch das zweite Reflexionsmittel (das erste Reflexionsmittel) in den vorderen Brennebenen der Fokussierungsmittel (Scharfeinstellungsmittel) reflektierten Strahl mit einem präzisen Wechsel auf, um an den durch den zweiten Strahlenteiler 14 reflektierten und weitergeleiteten Störstrahlen eine präzise Streifenmodulation einzuleiten, die abgestimmt ist auf eine digitale Holografieverarbeitung durch die Verarbeitungsmittel gemäß dem Fourier-Transformationsverfahren.
Vorzugsweise weisen die Umschaltmittel das erste Reflexionselement und den zweiten Strahlenteiler auf, die auf den beweglichen Mitteln befestigt sind.
Alternativ weisen die Umschaltmittel den Keil auf, der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Die Umschaltmittel können auch den zweiten Spiegel (15) aufweisen, der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Vorzugsweise weisen die Umschaltmittel eine Drehplatte auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erlangen von 3D-Bildern eines Probestücks durch das Verwenden eines digitalen holografischen Mikroskops nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

– Bereitstellen der Beleuchtungsmittel, der Abbildungsmittel inklusive eines Objektivs und Fokussierungsmittel, des Differentialinterferometers, der Abbildungsvorrichtung und der Verarbeitungsmittel, des Positioniertisches und der Kippmittel;
– Anordnen des Positioniertisches außerhalb des Interferometers in der vorderen Brennebene des Mikroskopobjektivs;
– Positionieren der Abbildungsvorrichtung, so dass ihr Sensor in der hinteren Brennebene der Fokussierungsmittel angeordnet ist;
– Positionieren des Interferometers zwischen dem Objektiv und den Fokussierungsmitteln;
– Anordnen mindestens mancher der Reflexionsmittel und der Strahlenteiler des Interferometers auf den beweglichen Mitteln, um dadurch einen beweglichen Bestandteil zu bilden;
– Ausführen von Positionier- und Ausrichtungsvoreinstellungen des Mikroskops durch Hinzufügen eines Testprobestücks, durch: (i) Anordnen des Testprobestücks auf dem Positioniertisch (3); (ii) Beleuchten des Testprobestücks in Durchgang und/oder Rückstrahlung mit den Beleuchtungsmitteln, und Erzeugen eines Testmessstrahls dabei; (iii) Erzeugen von Störstrahlen aus dem Testmessstrahl durch das Interferometer; (iv) Entsprechendes Positionieren und Ausrichten des beweglichen Bestandteils des Interferometers, um mit Hilfe der beweglichen Mittel die optische Länge der Störstrahlen mit einer Genauigkeit im Bereich von weniger als der Maximalwellenlänge der Beleuchtungsmittel bis zu einem Mehrfachen der Maximalwellenlänge auszugleichen; (v) Entsprechendes Positionieren und Ausrichten der im zweiten Interferometerarm (jeweils im ersten Interferometerarm) Kippmittel geeignet zum Kippen des durch das zweite Reflexionsmittel (jeweils das erste Reflexionsmittel) reflektierten Strahls, relativ zu dem durch das erste Reflexionselement (jeweils das zweite Reflexionselement) reflektierten Strahl, um einen präzisen Kippwinkel, und zwar auf eine solche Weise, dass der durch das erste Reflexionselement (jeweils das zweite Reflexionselement) reflektierten Strahl, und der durch das zweite Reflexionselement (jeweils das erste Reflexionselement) reflektierten Strahl, in den vorderen Brennebenen der Fokussierungsmittel überlagert werden, wodurch ein präziser Wechsel zwischen den reflektierten und am Sensor der elektronischen Abbildungsvorrichtung durch den zweiten Strahlenteiler weitergeleiteten Störstrahlen erzeugt wird; (vi) Auffinden und Aufzeichnen der Streifeninterferenzbilderstreifeninterferenzbildes, die folglich durch die Störstrahlen auf dem Sensor der Abbildungsvorrichtung gebildet werden;
– sobald das Mikroskop derart voreingestellt worden ist, Ersetzen des Testprobestücks durch ein Probestück, das untersucht werden soll; und
– Beleuchten des Probestücks, um ein Interferenzbild zu erlangen, wie in (i) bis (vi) ausgewiesen;
– Aufzeichnen das Interferenzbilds;
– Mögliches Erfassen weiterer ähnlicher Interferenzbilder dieses Probestücks durch Ausführen des Phasenschrittverfahrens;
– Verarbeiten des Interferenzbilds/der Interferenzbilder zum Herausholen der optischen Amplitude und Phase des Probestücks durch Ausführen des Phasenschrittverfahrens oder der Fourier-Transformations-Datenverarbeitung.

Vorzugsweise weisen die Kippmittel einen Keil auf, und das Mikroskop weist im ersten Interferometerarm (jeweils im zweiten Interferometerarm) eine ergänzende optische Ausgleichsvorrichtung auf.
Alternativ weisen die Kippmittel das zweite Reflexionselement auf, das auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Reflexionselement auf einem Umformer, vorzugsweise einem piezoelektrischen Umformer, angeordnet, um das Phasenschrittverfahren auszuführen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mikroskop ferner das Umschalten des durch das erste Reflexionselement (das zweite Reflexionselement) reflektierten Strahls in Bezug auf den durch das zweite Reflexionsmittel (das erste Reflexionsmittel) reflektierten Strahl, mit einem präzisen Wechsel durch Umschaltmittel in den vorderen Brennebenen der Fokussierungsmittel, um an den reflektierten und durch den zweiten Strahlenteiler weitergeleiteten Störstrahlen eine präzise Streifenmodulation einzuleiten, die auf eine digitale Holografieverarbeitung durch die Verarbeitungsmittel gemäß dem Fourier-Transformationsverfahren abgestimmt ist.
Vorzugsweise weisen die Umschaltmittel das erste Reflexionselement und den zweiten Strahlenteiler (14) auf, die auf den beweglichen Mitteln befestigt sind.
Alternativ weisen die Umschaltmittel den Keil auf, der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Möglicherweise weisen die Umschaltmittel den zweiten Spiegel auf, der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist.
Vorzugsweise weisen die Umschaltmittel eine Drehplatte auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des Mikroskops oder des Verfahrens:

– um fluoreszierende und/oder dicke Probestücke zu untersuchen;
– in der differentiellen Kontrastmikroskopie;
– für In-Vivo-3D-Abbildungsanwendungen;
– zum Messen dreidimensionaler Mikroverteilungen von Brechungsindexes in einem Probestück;
– und um rasch ablaufende Phänomene zu untersuchen.

DEFINITIONEN:
Es wird auf den Abschnitt mit der Überschrift „Stand der Technik" Bezug genommen, um eine Definition für „Digitale Holografie" zu finden.
In der vorliegenden Beschreibung ist die Teilkohärenz eines Lichtstrahls in einer Ebene definiert und begründet die Fähigkeit irgendeines Punktepaars, gegenseitig zu interferieren. Es gibt Literaturstellen, in welchen die Zustände der Teilkohärenz des Lichts genau beschrieben sind.²⁸
Für die Teilkohärenz wird ein Unterschied zwischen der „räumlichen Teilkohärenz" und der „zeitlichen Teilkohärenz" gemacht.
Die „räumliche Teilkohärenz" quantifiziert die statistische Phasenkorrelation einer Lichtverteilung in einer Ebene an jedem Punktepaar. Es kann gezeigt werden, dass die Verringerung der räumlichen Kohärenz in einem optischen Abbildungssystem das kohärente Rauschen verringert, welches seinen Ursprung in der Lichtstreuung, den Mehrfachreflexionen und den Fehlern der optischen Einstellung hat.^15–18,24
Die „zeitliche Kohärenz" bezieht sich auf die Spektralbandbreite einer optischen Quelle und bewirkt die Verringerung des Streifenkontrasts, wenn es einen optischen Gangunterschied zwischen den Strahlen eines Interferometers mit zwei Strahlengängen gibt. Die Verringerung der zeitlichen Kohärenz führt ebenfalls zu einer Verringerung des kohärenten Rauschens in einem Abbildungssystem.²⁹
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 ist eine erste bevorzugte Ausführungsform eines digitalen holografischen Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt.
In 2 ist eine zweite bevorzugte Ausführungsform eines digitalen holografischen Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Art der Beleuchtungsmittel:
Teilweise kohärente Beleuchtungsmittel sind in der Literaturstelle¹⁸ veröffentlicht worden. In dieser Literaturstelle¹⁸ erhöht ein erstes Verfahren zur Erlangung einer teilweise kohärenten Beleuchtung die räumliche Kohärenz einer räumlich inkohärenten Lichtquelle durch Filtrierung des Strahles mit einem geeigneten Aufbau aus Fokussierungsmitteln und Blenden.
Es versteht sich, dass die Quelle eine Spektralbandbreite aufweist, welche um eine maximale Wellenlänge (Spitzenwellenlänge) zentriert ist.
Beispiele solcher Quellen sind Leuchtdioden, Breitbandquellen, welche durch einen Spektralfilter gefiltert sind, und Entladungslampen mit spektralgefilterten Emissionslinien.
In einem Interferometer weisen solche Quellen eine geringe zeitliche Kohärenz auf, und es müssen genaue Einstellungen der Strahlengänge vorgenommen werden.
In einem zweiten Verfahren zur Erlangung einer teilweise räumlich kohärenten Beleuchtung in der Literaturstelle¹⁸ wird die räumliche Kohärenz verringert, indem in geeigneter Weise ein bewegliches Mattglas in den Licht strahl einer stark kohärenten Quelle, wie z.B. eines Laserstrahls, eingebracht wird. Durch dieses Verfahren werden Quellen mit einer einstellbaren räumlichen Kohärenz versehen, während eine hohe zeitliche Kohärenz bewahrt wird.
Erste bevorzugte Ausführungsform:
Eine erste bevorzugte Ausführungsform des Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 1 dargestellt.
Wie in 1 dargestellt, weist das Mikroskop in der ersten bevorzugten Ausführungsform ein Beleuchtungsmittel 1 auf, welches in einem Durchgangsmodus arbeiten kann, und ein Beleuchtungsmittel 41, welches in einem Rückstrahlungsmodus arbeiten kann. In dieser bevorzugten Ausführungsform kann das Mikroskop somit selektiv in einem Durchgangsmodus oder einem Rückstrahlungsmodus arbeiten, indem selektiv auf das geeignete Beleuchtungsmittel 1 bzw. 41 geschaltet wird, während das andere Beleuchtungsmittel 41 bzw. 1 jeweils ausgeschaltet bleibt.
Es ist jedoch für den Fachmann ersichtlich, dass ein erfindungsgemäßes Mikroskop auch nur eines der Beleuchtungsmittel 1 oder 41 aufweisen kann.
Die Beleuchtungsmittel 1, 41 sind teilweise kohärent und müssen mindestens eine teilweise zeitliche Kohärenz 41 zeigen.
Das Mikroskop, wie es in 1 dargestellt ist, weist auch einen Probenhalter 40 auf, welcher ein zu untersuchendes Probestück 2 aufnehmen kann und auf einem Positioniertisch 3 angeordnet ist, und Abbildungsmittel, welche ein Objektiv oder eine Mikroskoplinse 4 und Fokussierungsmittel 6 umfassen. Das Mikroskopobjektiv 4 kann eine andere Vergrößerung als in der gewöhnlichen Mikroskopie aufweisen.
Der Positioniertisch 3 ermöglicht eine präzise Positionierung des Probestücks 2 relativ zum Objektiv 4, genauer eine präzise Positionierung des Probestücks 2 in der vorderen Brennebene des Objektivs 4. Zu diesem Zweck kann der Probenträger 3 gegebenenfalls motorisiert sein.
Im Rückstrahlungsmodus wird der vom Beleuchtungsmittel 41 emittierte Lichtstrahl von einem Strahlenteiler 11 reflektiert und vom Mikroskopobjektiv 4 durchgelassen, um das Probestück 2 zu beleuchten.
Das Mikroskop gemäß dieser ersten bevorzugten Ausführungsform weist ferner ein Differentialinterferometer 5 des Mach-Zehnder-Interferometertyps auf, welches zwischen dem Objektiv 4 und den Fokussierungssmitteln 6 angeordnet ist. Das Differentialinterferometer weist einen ersten und einen zweiten Interferometerarm auf, welche zwei verschiedenen Strahlengängen 28, 29 entsprechen. Die Fokussierungsmittel 6 weisen sowohl im ersten als auch im zweiten Interferometerarm eine vordere Brennebene 23, 24 auf.
Der erste Interferometerarm 28 weist einen ersten Strahlenteiler 13, ein erstes Reflexionselement, welches einem Spiegel 16 entspricht, und einen zweiten Strahlenteiler 14 auf. In dieser ersten bevorzugten Ausführungsform weist das erste Interferometer auch eine transparente Platte 18 auf, welche als optische Ausgleichsvorrichtung wirkt, deren Funktion noch erläutert wird.
Der zweite Interferometerarm 29 weist den ersten Strahlenteiler 13, ein zweites Reflexionselement, welches einem Spiegel 15 entspricht, und den zweiten Strahlenteiler 14 auf. In dieser ersten bevorzugten Ausführungsform weist das zweite Interferometer auch einen optischen Keil 17, welcher dazu geeignet ist, als Kippmittel zu wirken, oder einen Strahlablenker (siehe unten) auf.
Es sollte angemerkt werden, dass der erste Spiegel 16 und der zweite Strahlenteiler 14 auf beweglichen Mitteln, wie z.B. einer Drehplatte 20, befestigt sind.
Vorzugsweise weist das Mikroskop ferner eine elektronische zweidimensionale Abbildungsvorrichtung 7 auf, wie z.B. eine CCD-Kamera, wobei die elektronische Abbildungsvorrichtung 7 einen Sensor 33 aufweist und durch eine Pixelgröße und eine Anzahl von Pixeln in einer Dimension definiert ist. Die Abbildungsvorrichtung 7 ist derart in dem Mikroskop angeordnet, dass sich ihr Sensor 33 in der hinteren Brennebene des Fokussierungssmittels 6 befindet.
Vorzugsweise weist das Mikroskop auch Verarbeitungsmittel auf, wie z.B. einen Computer 8.
Es sollte angemerkt werden, dass das Mikroskop mit fluoreszierenden Proben entweder im Durchgangs- oder im Rückstrahlungsmodus arbeiten kann.
Wenn das Mikroskop dafür eingestellt ist, mit fluoreszierenden Proben zu arbeiten, weist das Beleuchtungsmittel 1 oder 41 eine Spektralbandbreite auf, die um eine bestimmte Anregungswellenlänge zentriert ist, oder das Beleuchtungsmittel 1 oder 41 weist eine breite Spektralbandbreite auf, welche durch einen geeigneten Filter für verringerte Spektralbandbreite 10 oder 10', wie z.B. einem Interferenzfilter, gefiltert wird. Ein Spektralbandbreiten-Sperrfilter 12 ist im Rückstrahlungs-Beleuchtungsmodus hinter dem Strahlenteiler 11 und im Durchgangs-Beleuchtungsmodus hinter dem Mikroskopobjektiv 4 angeordnet. Dieser Filter 12 kann auch direkt vor dem Sensor der elektronischen Abbildungsvorrichtung 7 angeordnet sein. Der Filter 12 ist ein Spektralbandpassfilter, der nur für das Fluoreszenzwellenlängen-Spektralband eine hohe Durchlässigkeit aufweist. Für Anwendungen, welche mehrere unterschiedliche Fluoreszenzanregungen und -emissionen mit speziellen Wellenlängen erfordern, können die Filter 10, 10' und 12 mit motorisierten Filterhaltern ausgetauscht werden.
In jedem Fall weist das Verfahren zur Erlangung von 3D-Bildern eines zu untersuchenden Probestücks 2 durch Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroskops die folgenden Schritte auf. Das Probestück 2 ist ungefähr (im Wesentlichen) an der vorderen Brennebene des Mikroskopobjektivs 4 angeordnet worden.
Wenn das Probestück 2 eine Dicke aufweist, welche es unmöglich macht, die gesamte Dicke des Probestücks gleichzeitig zu fokussieren, wird es dank des Positioniertisches 3 in solcher Weise vor dem Mikroskopobjektiv 4 angeordnet, dass die vordere Brennebene des Mikroskopobjektivs 4 das Probenvolumen schneidet.
Der vom Probestück 2 (Messstrahl) kommenden Lichtstrahl wird dann durch das Mikroskopobjektiv 4 durchgelassen und fällt auf den Strahlenteiler 13 ein. Der Strahlenteiler 13 teilt den Messstrahl in einen durchgelassenen Strahl 28 und einen reflektierten Strahl 29.
Der durchgelassene Strahl 28 wird durch die optische Ausgleichsvorrichtung 18 durchgelassen, welche einer transparenten Platte, wie z.B. einer optischen Planplatte, entspricht. Dann wird der durchgelassene Strahl 28 von dem Spiegel 16 reflektiert, wird von dem Strahlenteiler 14 reflektiert und durch das Fokussierungsmittel 6 durchgelassen, wodurch die vordere Brennebene des Mikroskopobjektivs 4 auf dem Sensor 33 einer elektronischen Abbildungsvorrichtung 7 abgebildet wird.
Die Vergrößerung des Bildes, welches man auf dem Sensor 33 erhält, ist durch das Verhältnis f/f_ML gegeben, wobei f die Brennweite des Fokussierungsmittels 6 und f_ML die Brennweite des Mikroskopobjektivs 4 ist.
Der Strahl 29, der vom Strahlenteiler 13 reflektiert wird, wird dann vom Spiegel 15 reflektiert, vom Keil 17 durchgelassen, wobei die Kippmittel so wirken, dass die Ausbreitungsrichtung des einfallenden Strahls verändert wird. Der Strahl 29 wird dann vom Strahlenteiler 14 durchgelassen und vom Fokussierungsmittel 6 durchgelassen, wodurch auch für diesen Strahl die vordere Brennebene des Mikroskopobjektivs 4 auf dem Sensor 33 der elektronischen Vorrichtung 7 abgebildet wird.
Es sollte angemerkt werden, dass der Keil 17 auf einer Positionier- und Ausrichtungsvorrichtung angeordnet sein kann.
Die Interferenzbilder der beiden Strahlen werden von der elektronischen Abbildungsvorrichtung 7 aufgezeichnet und vom Computer 8 digitalisiert, welcher auch benutzt wird, um die gesamte digitale holografische Verarbeitung durchzuführen.
Die Funktion des Strahlablenkers 17 ist es, die Ausbreitungsrichtung des vom Spiegel 15 reflektierten Strahls in Bezug auf den vom Spiegel 16 reflektierten Strahl zu verändern. Dies wird derart durchgeführt, dass die Intensitätsverteilungen der beiden Strahlengänge des Interferometers gleich sind und sich ohne Verschiebung in den vorderen Brennebenen 23 und 24 des Fokussierungsmittels 6 überlagern. Der Strahlablenker 17 erzeugt zwischen den vom Strahlenteiler 14 reflektierten und durchgelassenen Strahlen eine Verschiebung 27 auf dem Eingangssensor 33 der elektronischen Abbildungsvorrichtung 7.
Es sollte angemerkt werden, dass die Positionen der optischen Elemente 17 und 18 vertauscht werden können, ohne die Wirkungen des Mikroskops zu verändern, mit der Vorgabe, dass die Bedingung der Überlagerung in den vorderen Brennebenen 23, 24 des Fokussierungsmittels 6 erfüllt ist.
Überdies gibt es, da das digitale holografische Mikroskop mit teilweise kohärenter Beleuchtung arbeitet, eine Gruppe erforderlicher Einstellungen, um es richtig auszurichten. In diesem Fall macht es die zeitliche Kohärenz des Beleuchtungsmittels erforderlich, die Strahlengänge 13-16-14 und 13-15-14 mit einer typischen Genauigkeit im Bereich von weniger als der maximalen Wellenlänge bis zu einem Mehrfachen der maximalen Wellenlänge der Beleuchtungsmittel 1 oder 41 auszugleichen.
Die Funktion der transparenten Platte 18 ist es, die durch den Keil 17 eingeführte globale Veränderung des Strahlengangs auszugleichen.
In der Praxis sind jedoch die zulässigen Toleranzen für die Dicke solcher Elemente hinsichtlich der Erfordernisse der vorliegenden Erfindung nicht groß genug. Deswegen wird eine sehr feine Strahlengangeinstellung erreicht, indem der Spiegel 16 und der Strahlenteiler 14 auf der Präzisionsdrehplatte 20 mit einer Drehachse 31, welche zur Ebene der 1 senkrecht ist und sich zwischen dem Spiegel 16 und dem Strahlenteiler 14 befindet, angeordnet werden.
In gleicher Weise kann die Drehplatte 20 alternativ positioniert sein, um gleichzeitig den Strahlenteiler 13 und den Spiegel 15 zu drehen.
Ferner muss die räumliche Kohärenzfunktion jedes Strahls 28, 29 größer sein als die seitliche Verschiebung 27, um Interferenzen zwischen den beiden Lichtstrahlen mit hohem Kontrast auf dem Sensor 33 der elektronischen Abbildungsvorrichtung 7 aufzuzeichnen. In der Praxis ist die seitliche Verschiebung 27 zum Beispiel kleiner als die Pixelgröße des Abbildungsmittels 33, welche typischerweise 7 μm × 7 μm beträgt.
In der ersten bevorzugten Ausführungsform kann das Mikroskop in digitaler Holografie arbeiten und ist speziell dafür geeignet, das Phasenschrittverfahren zu verwirklichen. Zu diesem Zweck ist der erste Spiegel 16 auf einem piezoelektrischen Sensor angeordnet, welcher eine Subwellenlänge-Parallelverschiebung seiner Reflexionsfläche in eine zu seiner Reflexionsfläche senkrechte Richtung ermöglicht. Diese Bewegungsmöglichkeit wird benutzt, um das Phasenschrittverfahren² zu verwirklichen, um dem Interferenzmuster zwischen den beiden Strahlen die optischen Phasen- und die Intensitätsinformationen zu entnehmen. Über das Phasenschrittverfahren werden von der Abbildungsvorrichtung 7 und dem Computer 8 verschiedene Interferenzmuster mit einer schrittweisen Veränderung des Strahlengangs zwischen den beiden Strahlen aufgezeichnet.
Die entsprechenden Interferenzbilder werden in einem Algorithmus kombiniert, welcher mittels des Computers 8 die optischen Phasenveränderungen zwischen den beiden Strahlen errechnet.
Für multispektrale Anwendungen ist für jedes benutzte Wellenlängenband eine spezielle Kalibrierung der Bewegungsamplitude des piezoelektrischen Sensors erforderlich.
Es sollte angemerkt werden, dass in der vorliegenden Erfindung der Computer 8 die piezoelektrischen Bewegungen des Spiegels 16 steuert. Der Computer 8 kann auch die Lichtquellen 1 und 41 und gegebenenfalls die zugehörigen Filter 10, 10', 12, die Drehplatte 20 und den Positioniertisch 3 steuern.
Die resultierenden Phaseninformationen sind auf die differentielle Objektphase in Richtung der Verschiebung 27 bezogen. Sie werden integriert, um die optischen Phaseninformationen des Objekts zu erhalten.
Die Intensität des Objekts kann jedoch auch direkt aufgezeichnet werden, indem ein Bild mit einem Arm des Interferometers aufgezeichnet wird, welcher durch einen im Lichtstrahl 29 angeordneten mechanischen Verschluss 32, geschlossen wird. Der Verschluss kann irgendwo in einem der beiden Lichtstrahlen 29 und 28 derart angeordnet sein, dass er nur einen der beiden Strahlen verschließt.
In beiden Fällen werden die optische Phase und die Intensität des Objekts kombiniert, um die optische Amplitude des Objekts (des Probestücks) zu berechnen, welche für die digitale holografische dreidimensionale Abbildung verwendet wird.
Zweite bevorzugte Ausführungsform:
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform eines Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 2 dargestellt. In dieser zweiten Ausführungsform sind der erste Strahlenteiler 13 und das zweite Reflexionselement 15 Teile eines ersten Prismas 34, während der zweite Strahlenteiler 14 und das erste Reflexionselement 16 Teile eines zweiten Prismas 35 sind.
Die Prismen 34, 35 sind spezielle maßangefertigte Prismen, welche in dicken optischen transparenten Materialien hergestellt werden. Sie sind vorzugsweise aus zwei zusammengeklebten optischen Teilen aufgebaut. Die Reflexionselemente 15 und 16 sind an den inneren Totalre flexionsseiten der Prismen 34 und 35 angeordnet. Die Strahlenteiler 13, 14 befinden sich an der Grenze zwischen zwei verklebten optischen Teilen.
Das zweite Prisma 35 ist wie in der vorigen Ausführungsform auf der Drehplatte 20 angeordnet, um die beiden interferometrischen Strahlengänge auszugleichen.
Das zweite Prisma 35 wird ebenfalls von einem durch Computer 8 gesteuerten piezoelektrischen Sensor 36 um eine zweite eigenständige zur Ebene der 2 senkrechte Drehachse leicht gedreht. Durch Drehen des Prismas 35 mit dem piezoelektrischen Sensor wird das Phasenschrittverfahren durchgeführt. Außer jenen Veränderungen ist diese Ausführungsform mit der oben anhand der 1 beschriebenen identisch.
Die Prismen 34 und 35 können mit einer äußerst hohen Genauigkeit und mit geringen Toleranzen für die Winkel und die Größen hergestellt werden, welche mit der Genauigkeit vergleichbar sind, die für die Verwirklichung der Vorrichtung erforderlich ist.
Das Interferometer bewahrt seine Ausrichtung sogar, wenn ein Prisma leicht gedreht wird. Daraus folgt, dass diese Art von Intererometer sehr steif ist und in widrigen Umgebungen benutzt werden kann.
Durch diese zweite Ausführungsform erhält man ein sehr kompaktes Mikroskop.
Dritte bevorzugte Ausführungsform
Eine dritte bevorzugte Ausführungsform stellt einen anderen Weg bereit, um dieselbe Wirkung zu erzeugen wie diejenige, welche man mit dem Keil 17 und seiner ergänzenden optischen Ausgleichsvorrichtung 18 erhält, wie sie in der oben ausgewiesen ersten und zweiten Ausführungsform benutzt werden. In dieser dritten Ausführungsform gibt es den Keil 17 und die Planplatte 18 nicht, und der Spiegel 15 ist derart auf dem Dreh- und/oder Parallelverschiebungsmittel angeordnet, dass der Strahlengang ausgeglichen bleibt, und dass die Lichtintensitätsverteilungen identisch bleiben und in den vorderen Brennebenen 23 und 24 des Fokussierungsmittels 6 gleich positioniert bleiben.
Vierte bevorzugte Ausführungsform:
Eine vierte bevorzugte Ausführungsform des Mikroskops ist durch Verwirklichung des Fourier-Transformationsverfahrens statt des Phasenschrittverfahrens dafür geeignet, in digitaler Holografie zu arbeiten, d.h., das Mikroskop nimmt nur ein Interferenzbild des Probestücks auf. In dieser Ausführungsform sind die Anordnung und Zusammensetzung der Interferometerarme so eingerichtet, dass die Intensitätsverteilungen der beiden Strahlengänge des Interferometers gleich sind und sich mit einer kontrollierten Verschiebung in den vorderen Brennebenen 23 und 24 des Fokussierungsmittels 6 überlagern.
Bezug nehmend auf 1 kann dies erreicht werden, indem die Positionen und Ausrichtungen des Spiegels 15 und 16 eingestellt werden, und/oder indem die Positionen und Ausrichtungen der Strahlenteiler 13 und 14 eingestellt werden, und/oder indem die Elemente 17 und 18 gedreht oder verschoben werden.
Alternativ, unter Bezugnahme auf 2, kann dies erreicht werden, indem die Positionen und Ausrichtungen der Elemente 17 und 18 eingestellt werden. Die resultierenden interferierenden Strahlen auf dem Sensor 33 der elektronischen Abbildungsvorrichtung 7 werden durch eine Streifenmodulation moduliert. Die Streifenbreite dieser Modulation verringert sich auf dem Sensor 33, wenn die Verschiebung zwischen den Intensitätsverteilungen in den Brennebenen 23 und 24 vergrößert wird. Die Funktion des Keils ist es weiterhin, die Ausbreitungsrichtung des von 15 reflektierten Strahls in Bezug auf den von 16 reflektierten Strahl zu verändern.
Deswegen überlagern sich in dieser Ausführungsform auf dem Sensor 33 zwei Effekte. Es liegt eine Streifenmodulation aufgrund der in der Brennebene 23 und 24 eingeführten Verschiebung vor, und es liegt eine Verschiebung der beiden Bilder vor, welche durch das Element 17 eingeführt wird. Streifenmodulierte Bilder können durch ein spezielles Verfahren verarbeitet werden, welches als Fourier-Transformationsverfahren bezeichnet wird, das es möglich macht, die optische Phase und Intensität aus einem Bild zu entnehmen.²⁷ Diese Ausführungsform hat den Vorteil, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, um schnelle digitale Hologramme rasch ablaufender Phänomene aufzuzeichnen, da nur ein Bild benötigt wird. Daher wird die Auflösung verringert, was für das Fourier-Verfahren charakteristisch ist. In dieser Ausführungsform sind der piezoelektrische Sensor des Spiegels 16 und der piezoelektrische Sensor 36 nicht in Betrieb.
Obwohl die Erfindung unter Verwendung eines Mach-Zehnder-Interferometertyps beschrieben wurde, versteht es sich, dass auch andere Interferometer mit ungefähr identischen Fähigkeiten und Einstellungsmitteln zwischen dem Mikroskopobjektiv 4 und dem Fokussierungsmittel 6 verwendet werden könnten.
Wie in den vorstehenden Ausführungsformen veranschaulicht, kann das erfindungsgemäße Mikroskop unabhängig von den Probestücken quasi vollständig voreingestellt werden, so dass minimale zusätzliche Einstellungen erforderlich sind, um zuverlässige 3D-Bilder der Probestücke zu erhalten.
Datenverarbeitung:
Die Holografie ist ein optisches Verfahren, um dreidimensionale Bilder von Probestücken aufzuzeichnen und zu rekonstruieren. Das Hologramm wird mit der elektronischen Abbildungsvorrichtung, wie zum Beispiel einer CCD-Kamera, wie oben ausgewiesen, oder einer CMOS-Kamera, aufgezeichnet.
Die holografische Rekonstruktion wird durch das Computermittel 8 durchgeführt, wie oben ausgewiesen, welches so angelegt ist, dass die Ausbreitungsgleichungen der Wellenoptik verwendet werden, um das dreidimensionale Bild in der Tiefe zu untersuchen.
Zu diesem Zweck beinhalten die digitalen holografischen Informationen sowohl die optischen Phase als auch die Intensitätsinformationen des Probestücks. Die digitalen holografischen Informationen sind deshalb vollständiger als jede Art von interferometrischen Informationen, welche darauf abzielen, allein die von einem Probestück eingeführten Strahlengangveränderungen oder -variationen zu messen, wie hier im Folgenden noch theoretisch dargestellt wird.
Ausführungsformen, die mit dem Phasenschrittverfahren arbeiten:
Die allgemeine Form der Amplitudenverteilung in der vorderen Brennebene des Abbildungsmittels 6 lässt sich darstellen durch: uff(x, y) = ut(x, y) + ur(x, y) (1)wobei u_t(x, y) und u_r(x, y) die Amplitudenverteilung des vom Strahlenteiler 14 in der vorderen Brennebene des Fokussierungsmittels 6 durchgelassenen Strahls und des reflektierten Strahls sind.
Die folgenden Ausführungen betreffen das mit der Phasenschritttechnik arbeitetenden System.
Es lassen sich zwei Bedingungen auf dem Mikroskop wie folgt ausdrücken:

– Es wird ein geringes Kippen zwischen den beiden Strahlen vor dem Fokussierungsmittel 6 vorgenommen. Daraus folgt, dass die beiden Bilder auf dem Sensor 33 eine kleine Verschiebung aufweisen, welche eingestellt wird.
– Die beiden vom Strahlenteiler 14 reflektierten und durchgelassenen Strahlen weisen in der vorderen Brennebene des Fokussierungsmittels 6 die gleiche Intensität auf.

Es gilt: ut(x, y) = ur(x, y)exp{jϕ}exp{j2π(αxx + αyy)} (2),wobei (α_x, α_y) der Kippvektor zwischen der Ausbreitungsrichtung von u_t(x, y) und u_r(x, y), j = √–1, ist und ϕ eine globale optische Phasenveränderung zwischen u_t(x, y) und u_r(x, y) ist.
Es besteht ein 2D-Fourier-Transformationsverhältnis zwischen der vorderen und hinteren Brennebene des Fokussierungsmittels 6. Deswegen wird für den u_t(x, y)-Beitrag die folgende Amplitude in der Sensorebene 33 erhalten:
wobei (x', y') die Raumkoordinaten in der Sensorebene sind, mit U_t und U_r die Fourier-Transformationen von u_t und u_r bezeichnet sind, λ die mittlere Wellenlänge ist, f die Brennweite des Fokussierungsmittels 6 ist und (δ_x, δ_y) = (λfα_x, λfα_y) die Verschiebung zwischen U_t und U_r in der Sensorebene ist.
Aus den Gleichungen (2) und (3) folgt, dass die Amplitudenverteilung in den Sensorebene sich wie folgt ausdrücken lässt:
U_r lässt sich wie folgt zerlegen:
wobei A_r der Modulus der Amplitude von U_r und φ deren Phase ist.
Es wird angenommen, dass die Verschiebung (δ_x, δ_y) = (λfα_x, λfα_y) derart klein ist, dass
Daraus folgt, dass:
Unter Anwendung der Gleichungen (8) und (5) lässt sich Gleichung (4) wie folgt darstellen:
Um die optischen Phaseninformationen zu entnehmen, wenden wir zwischen U_r und U_t das Phasenschrittverfahren an, wobei verschiedene interferometrische Bilder mit geringen Strahlengangverschiebungen zwischen U_r und U_t aufgezeichnet werden, indem der piezoelektrische Sensor des Spiegels 16 benutzt wird. Zu Zwecken der Deutlichkeit schreiben wir Gleichung (9) um, indem wir die explizite Abhängigkeit von den Raumkoordinaten weglassen: Uout = Arexp{jφ}[exp{jα} +1] (10),wobei
Es gibt verschiedene Phasenschrittverfahren, bei welchen verschiedene Anzahlen interferometrischer Bilder benutzt werden. Das Verfahren mit vier Bildern wird hier im Folgenden ausgewiesen, es können aber auch Verfahren mit anderen Bilderzahlen angewendet werden.
Bei dem Verfahren, bei welchem 4 interferometrische Bilder benutzt werden, werden schrittweise optische Phasenverschiebungen von 0, π/2, π, 3π/2 eingebracht. Die vier interferometrischen Amplituden sind wie folgt definiert:
Da die Bilder in ihren Intensitäten erfasst werden, sind die Intensitäten, welche den Amplituden der Gleichungen (11) entsprechen, gegeben durch:
Die optische Phase α erhält man wie folgt:
Mit Hilfe der Gleichung (14) wird die optische Phasendifferenz zwischen U_r und U_t quantitativ mit einer additiven Phasenkonstante ϕ ermittelt. Die letztere kann auf verschiedene Weise entfernt werden.
Der einfachste Weg ist es, eine Phasenmessung ohne Probestück durchzuführen, welche später als zu entfernen Phase ϕ angesehen wird. Deswegen wird angenommen, dass man die quantitativen Informationen über die optische Phasendifferenz
erhält.
Die Addition der verschiedenen Gleichungen (13) liefert die Größe A² _r, bei welcher es sich um die Intensitätsinformationen über das Probestück ohne Phaseninformationen handelt.
Ein anderer Weg, um die Intensitätsinformationen zu erhalten, ist es, ein Bild aufzuzeichnen, während der Verschluss 32 geschlossen ist. Wenn die Signale in der Erfassungsebene mit einem Probenabstand Δ_s gesampelt werden, ergibt sich im Folgenden die erfasste Intensität durch:
wobei sich der Index D auf eine diskrete Funktion bezieht.
Deswegen liefern das vorgeschlagene optische System und die darauf bezogenen interferometrischen Verfahren die vollständigen Informationen über die Intensität und die differentiellen Phaseninformationen über das Probestück.
Die Kenntnis der optischen Phase des Probestücks erlangt man, indem man die differentielle Phase entlang der Differentialrichtung integriert.
Zur Vereinfachung, und ohne die Allgemeingültigkeit der Beschreibung einzuschränken, da die Verallgemeinerung ersichtlich ist, wird angenommen, dass die optische Phasendifferenz entlang der x-Achse liegt, und dass das Vorzeichen von δ_x negativ ist.
Berücksichtigt man, dass die Signale in der Sensorebene 33 mit dem Abstand Δ_s gesampelt werden, sind die differentiellen Phaseninformationen, welche aufgezeichnet werden, gegeben durch:
Der Index D bezieht sich auf eine diskrete Funktion.
Es wird angenommen, dass der Probenabstand so eingestellt ist, dass die Informationen ohne den Verlust bedeutender Informationen aufgezeichnet werden, also ohne Aliasing-Effekt. In diesem Fall können die differentiellen Phaseninformationen ausgedrückt werden durch: ΔφD(kΔs, lΔs) = C(φD(kΔs, lΔs) – φD((k – 1)Δs, lΔs)) (17),wobei φ_D(kΔ_s, lΔ_s) die optische Phase in der Probenposition (k, l) ist, und C eine Konstante ist, welche vom ursprünglichen differentiellen Abstand δ_x abhängt. C muss durch ein Kalibrierungsverfahren ermittelt werden, welches durchgeführt wird, indem ein kalibrierter Keil eingebracht wird, bevor das Instrument für tatsächliche Messungen benutzt wird.
Durch Aufsummieren von Δφ_D(kΔ_s, lΔ_s) über k = l, ..., t erhält man die Phase φ_D(tΔ_s, lΔ_s) mit einer zusätzlichen Integrationskonstante.
In den meisten Fällen kann die zusätzliche Integrationskonstante für jede Linie als identisch angenommen werden und ergibt letztlich über das gesamte Gesichtsfeld eine Konstante, welche keine bedeutende Rolle spielt.
Daraus folgt, dass die optische Phase φ_D und der Modulus der Amplitude A_D ermittelt worden sind, um das digitale holografische Rekonstruktionsverfahren durchzuführen.
Ausführungsformen für rasch ablaufende mit dem Fourier-Verfahren arbeitende Phänomene
Die folgende Beschreibung bezieht sich auf die mit dem Fourier-Verfahren arbeitenden Ausführungsformen des Mikroskops, bei denen die vollständige digitale holografische Phase und Amplitude einem einzigen Interferenzmuster entnommen werden.
Es lassen sich zwei Bedingungen der Vorrichtung wie folgt ausdrücken:

– Es wird ein geringes Kippen zwischen den beiden Strahlen vor dem Fokussierungsmittel 6 vorgenommen. Daraus folgt, dass die beiden Bilder auf dem Sensor 33 eine kleine Verschiebung aufweisen, welche eingestellt wird.
– Die beiden vom Strahlenteiler 14 reflektierten und durchgelassenen Strahlen weisen in der vorderen Brennebene des Fokussierungsmittels 6 die gleiche Intensität auf. Ohne die Allgemeinheit der Beschreibung einzuschränken, nehmen wir an, dass die Verschiebung in der x-Richtung liegt und mit s_x bezeichnet wird.

Dann gilt: ut(x, y) = ur(x + sx, y)exp{jϕ}exp{j2π(αxx + αyy)} (18),wobei (α_x, α_y), j = √–1 und ϕ wie oben definiert sind.
Es besteht ein 2D-Fourier-Transformationsverhältnis zwischen der vorderen und hinteren Brennebene des Fokussierungsmittels 6. Deswegen wird für den u_t(x, y)-Beitrag die folgende Amplitude in der Sensorebene 33 erhalten:
wobei (x', y') die Raumkoordinaten in der Sensorebene sind, mit U_t und U_r die Fourier-Transformationen von u_t und u_r bezeichnet sind, λ die mittlere Wellenlänge ist, f die Brennweite des Fokussierungsmittels 6 ist und (δ_x, δ_y) = (λfα_x, λfα_y) die Verschiebung zwischen U_t und U_r in der Sensorebene ist.
Wie beim Phasenschrittverfahren wird die Amplitude in der Sensorebene über dieselbe Annäherung berechnet, und schließlich folgt daraus, dass die erfasste Intensität ausgedrückt werden kann durch:
wobei α(x', y') für die optische Phasendifferenz zwischen U_t und U_r steht.
Verglichen mit dem Phasenschrittverfahren ist zu beobachten, dass eine Streifenmodulation vorliegt, welche ebenso schnell ist, wie s_x wichtig ist. Basierend auf solch einem mathematischen Ausdruck gibt es das Fourier-Verfahren, mit welchem man A_r und α(x', y') entnehmen kann²⁷.
Wenn jene Größen entnommen werden, erhält man die absolute optische Phase wie beim Phasenschrittverfahren durch Integration. Die diskreten Größen A_D und φ_D sind wie beim Phasenschrittverfahren definiert und können direkt für die digitale Holografie verwendet werden.
Durchführung der digitalen Holografie
Aus der obigen Beschreibung wird es angenommen, dass die optische Phase φ_D und der Modulus der Amplitude A_D in der Brennebene des Probestücks erhalten wurden.
Daraus folgt, dass das komplexe Amplitudenfeld in dieser Ebene berechnet werden kann gemäß: UDi(rΔs, tΔs) = AD(rΔs, tΔs)exp{jφD(rΔs, tΔs)} (21)
Dank dieser Informationen kann die digitale holografische Rekonstruktionstechnik zur Abbildung von Ebenen, welche sich außerhalb des Brennpunkts befinden, angewendet werden. Dies wird erreicht, indem man eine diskrete Form des Kirchhoff-Fresnel-Integrals anwendet:
wobei U_Di die gemessene komplexe Amplitude ist, U_Do die hinter einem Refokussierungsabstand d rekonstruierte komplexe Amplitude ist, F+1U,V die diskrete Fourier-Transformation ist, F–1U,V die inverse diskrete Fourier-Transformation ist, N die Probennummer entlang beiden Achsen ist, k = 2π/λ und (U, V) ganze Zahlen sind, die von 0 bis N – 1 variieren.
Eine detaillierte Beschreibung der Durchführung und des Bereichs des Refokussierungsabstandes, welcher durch das digitale Holografieverfahren erreicht werden kann, wird in Dokumenten des Standes der Technik gegeben.¹⁵
ANWENDUNGEN UND VORTEILE DER ERFINDUNG IM VERGLEICH ZUM STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur dreidimensionalen Mikroskopie durch digitale Holografie, welche(s) auf der Einbeziehung eines speziellen Differentialinterferometers in ein Abbildungssystem eines optischen Mikroskops beruht. Die vorliegende Erfindung ist so aufgebaut, dass sie die wichtigsten Mikroskopiemodi unterstützt, wie z.B. Hellfeld, Dunkelfeld, Fluoreszenz, Differentialkontrast, Phasenkontrast, welche in den Hauptanwendungen der optischen Mikroskopie von Interesse sind.
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft in der nichtinvasiven Untersuchung und Charakterisierung verschiedener Arten von Probestücken verwendet werden, insbesondere für die In-vivo-Abbildung dicker lebender biologischer Probestücke, um deren dynamisches Verhalten mit geringer Zeitverzerrung zu beobachten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Messung dreidimensionaler Mikroverteilungen von Brechungsindexes innerhalb dicker transparenter Probestücke. „Dickes Probestück" bedeutet, dass die Dicke zu groß ist, um mit einem klassischen optischen Verfahren über die gesamte Dicke ein scharfes Bild des Probestücks zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile im Vergleich zu denen des Standes der Technik.
Das System kann mit Durchgangsstrahlung, mit Rückstrahlung und mit einem breiten Bereich räumlicher Kohärenzzustände der Quelle arbeiten. Im Vergleich zu den Systemen, bei welchen ein Laserstrahl verwendet wird, verbessern die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung erheblich die Bildqualität dank der Tatsache, dass eine teilweise kohärente Beleuchtung verwendet werden kann.
Im Vergleich zu anderen Systemen, bei denen eine teilweise kohärente Beleuchtung verwendet wird und das Probestück sich in einem der Interferometerarme befindet, ermöglichen außerdem die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung Probestücke mit stärkeren optischen Phasenverzerrungen zu untersuchen, und die genaue Einstellung der optischen Länge der interferometrischen Arme wird unabhängig von dem Probestück durchgeführt, und wenn diese Einstellung einmal vorgenommen worden ist, dann ist das System bereit, für jedes Probestück benutzt zu werden.
Eine wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Beobachtung fluoreszierender Probestücke. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung die nichtinvasive dreidimensionale In-vivo-Abbildung des dynamischen Verhaltens fluoreszierender Makromoleküle oder Strukturen ohne die Zeitverzerrung der Laser-Raster-Mikroskopie.
Im Verhältnis zu den bisherigen Verwirklichungen^21,22 der Fluoreszenz in der digitalen Holografie ermöglicht das vorgeschlagene Verfahren, eine viel bessere Qualität zu erzielen.
Für eine direkte Verwirklichung der digitalen Holografie mit einem fluoreszierenden Bild sind bereits Verfahren und Vorrichtungen vorgeschlagen worden, siehe die Literaturstellen 19, 20. Obwohl die Anordnungen 19, 20 für Fluoreszenzsignale theoretisch verwendet werden könnten, erkannten die Autoren, dass die Ergebnisse aufgrund des schwachen Kontrastes des interferometrischen Signals eine sehr schlechte Qualität aufweisen könnten. In diesen Literaturstellen sind keine Ergebnisse mit Fluoreszenz angegeben. An diesem Punkt ist es sehr wichtig, die Unterschiede der vorliegenden Erfindung zu den in den Literaturstellen 19 und 20 vorgeschlagenen Anordnungen zu betonen. In der Tat erscheinen jene Anordnungen den in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen sehr ähnlich, da sie auch auf Mach-Zehnder- oder Michelson-Interferometern basieren, welche zwischen den Mikroskoplinsen und der Abbildungsebene angeordnet sind. Die Verwirklichung, die Betriebsmodi und die Leistungseigenschaften jener Systeme sind jedoch sehr verschieden von den Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Unterschiede sind die folgenden.
In den Anordnungen der vorliegenden Erfindung werden die beiden Kanäle des Interferometers auf dieselbe Weise auf der Sensorebene abgebildet. Der Unterschied zwischen den beiden Kanälen ist eine geringe Verschiebung zwischen den beiden Strahlen auf dem Sensor. Die Vorrichtung zeichnet Streifeninterferenzmuster zwischen zwei leicht verschobenen Bildern auf. In den beiden Kanälen liegt ein Licht der gleichen Intensität vor. Überdies ist die Verschiebung im Vergleich zu der räumlichen Kohärenzbreite klein, so dass der interferometrische Kontrast hoch ist.
In den in den Literaturstellen 19, 20 vorgeschlagenen Anordnungen beschreiben die Autoren die Verwirklichung absoluter interferometrischer Anordnungen. Um dieses Ziel zu erreichen, wird einer der interferometrischen Kanäle, der Referenzkanal, durch eine Blende optisch gefiltert, um alle Einzelheiten des ursprünglichen Probestücks zu eliminieren und eine große Punktstreuungsfunktion in der Sensorebene zu erhalten. Der zweite Strahl, der Objektstrahl, welcher die Probeninformationen trägt, fällt ohne Filterverfahren auf den Sensor ein und interferiert mit dem Referenzstrahl. Da der Referenzstrahl gefiltert ist, besteht ein großer Intensitätsunterschied zwischen den beiden Strahlen, welcher die Autoren dazu zwingt, die Intensität des Objektstrahls durch einen Neutraldichtefilter zu verringern. Daraus resultiert ein Verlust an Lichtintensität, welcher für Anwendungen kritisch sein kann, bei denen die Intensitätsniveaus schwach sind. Der Sensor nimmt das Interferenzmuster zwischen dem Objekt- und dem Referenzstrahl auf. Um die Sichtbarkeit der Streifen zu optimieren, ordnen die Autoren die Sensorebene derart defokussiert an, dass die Defokussierungsspreizung eine Größe aufweist, die der Punktspreizfunktion des Referenzstrahls ähnlich ist. Dies ist ein Hauptunterschied im Vergleich zu den vorliegenden Ausführungsformen: in der vorliegenden Erfindung können Probestücke nahe der Umgebung der Brennebene für jede Ebene analysiert werden. Wie in Literaturstelle 15 demonstriert wird, ist das digitale holografische Verfahren stärker in der Auflösung, wenn sich das Probestück näher an der Brennebene befindet. Überdies weisen die Anordnungen der Literaturstellen 19 und 20, auch mit ähnlichen Größen der Punktspreizfunktion, aufgrund der teilweise kohärenten Beleuchtung eine schlechte Sichtbarkeit der interferometrischen Streifen auf. In den vorgeschlagenen Anordnungen der vorliegenden Erfindung ist der Phasenkontrast sogar im Fall der inkohärenten Beleuchtung hoch.
In den Dokumenten der Literaturstellen 21 und 22 sind Vorrichtungen und Verfahren ausgewiesen, welche für eine 3D-Fluoreszenzabbildung verwendet werden. Diese Systeme unterscheiden sich jedoch sehr von dem vorliegenden und machen eine Abtastung der Probestücke erforderlich.
Hinsichtlich der 3D-Abbildung fluoreszierender Probestücke sind die konfokalen Mikroskope die vorherrschenden Systeme. Im Vergleich zu konfokalen Mikroskopen bieten das Mikroskop und Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile:

– Es ist nicht erforderlich, das Probestück in 3D abzutasten. Deswegen kann die Erfassung schneller sein.
– Es wird kein kohärenter Laserspot verwendet, um das Probestück abzutasten. Das Beleuchtungsniveau ist deswegen schwächer und für das Probestück weniger invasiv.
– Grundsätzlich sind die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung kostengünstiger.

Konfokale Mikroskope sind sehr leistungsstarke Geräte, die Ergebnisse sehr hoher Qualität liefern. Die Hauptmerkmale der konfokalen Mikroskope sind die optische Sektionierung und die Fähigkeit, das Rauschen zu eliminieren. In diesen Punkten behalten die konfokalen Mikroskope ihre Vorteile. Deswegen ist die hier vorgeschlagene Vorrichtung mehr eine Ergänzung als eine Konkurrenz für die konfokalen Mikroskope.
Ferner, hinsichtlich der Verwirklichung der Patentanmeldung WO 03/002972, erfordern die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht, dass die Fluoreszenzregionen mit den Regionen zusammenfallen, die verschiedene optische Brechungsindexes oder Durchlässigkeiten aufweisen.
Hinsichtlich der konfokalen Mikroskopie erfordert die Aufzeichnung der Informationen kein 3D-Abtasten, welches zeitraubend ist. Die vorgeschlagene Erfindung ist in der Auswahl der Fluoreszenzanregungsquelle flexibler. Insbesondere können die ausgewählten Quellen für lebende Objekte weniger schädlich sein als diejenigen, die bei der konfokalen Mikroskopie benutzt werden. Es kann ein weiter Bereich von Fluorochromen untersucht werden. Die Fluoreszenzbilder können mit den Ergebnissen kombiniert werden, die man in den anderen Mikroskopiemodi erhält, welche von der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht werden.
Differentielle Kontrastmikroskopie
Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch als neue Art eines Differential-Interferenzkontrast(DIC)-Mikroskops fungieren und bieten einige Vorteile gegenüber den klassischen Ausführungen.
In der Tat verwenden die klassischen Ausführungen Elemente, welche aus Polarisationseffekten Nutzen ziehen (zum Beispiel Normarski-Mikroskope). Deswegen sind diese Systeme im Allgemeinen sehr empfindlich für Störungen durch Polarisations-Restdoppelbrechung, welche durch die Probenbehälter eingebracht werden. Diese Nachteile werden mit der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vollständig beseitigt.
Außerdem wird in den vorgeschlagenen Anordnungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur Hoffman-Modulations-Kontrastmikroskopie in effizienterer Weise die numerische Blende der Mikroskoplinse benutzt, welche vollständig zu nutzen ist. Es muss auch betont werden, dass die vorliegende Erfindung die quantitative Phasenmessung unterstützt, während Systeme wie die klassischen DIC-Systeme hauptsächlich qualitativ sind.
Optische Sektionierung transparenter Probestücke
Überdies ermöglichen die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch die Untersuchung des Problems der Messung dreidimensionaler Mikroverteilungen von Brechungsindexes. In dieser Situation weist die verwendete Quelle eine sehr geringe räumliche Kohärenz auf, und das Probestück wird untersucht, indem das Probestück entlang der optischen Achse parallelverschoben wird, um es Scheibe für Scheibe zu fokussieren. Da die räumliche Kohärenz der Quelle sehr begrenzt ist, ist der Scheibeneffekt sehr hoch, und es ist möglich, die dreidimensionalen Brechungsindexverteilungen zu rekonstruieren.
Die alternative Lösung, um dieselbe Art von Messung durchzuführen, ist die optische Transmissionstomographie. In diesem Fall ist es jedoch erforderlich, mehrere Strahlen und mehrere Detektoren zu verwenden, und der Stand der Technik auf diesem Gebiet zeigt, dass tatsächlich nur sehr einfache Fälle untersucht werden können.
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21. B. W. Schilling, T.-C. Poon, G. Indebetouw, B. Storrie, K. Shinoda, Y. Suzuki und M. H. Wu, „Three-dimensional holographic fluorescence microscopy", Opt. Lett. 19, 1506–1508 (1997).
22. G. Indebetouw, T. Kim, T.-C. Poon und B. W. Schilling, „Three-dimension location of fluorescent inhomogeneities in turpid media by scanning heterodyne holography", Opt. Lett. 23, 135–137 (1998).
23. D. W. Robinson, und G. T. Reid – Herausgeber, „Interferogram Analysis" (Institute of Physics Publishing, 1993).
24. Frank Dubois, Maria-Luisa Novella Requena, Christophe Minetti, Olivier Monnom und Eric Istasse, „Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source", Appl. Opt. IP 43, 1131–1139 (2004).
25. G. Pretzler, H. Jäger und T. Neger, „High accuracy differential interferometry for the investigation of phase object", Meas. Sc. Technol. 4, 649–658 (1993).
26. Y. Y. Hung u.a., „Measurement of slopes of structural deflections by speckle-shearing interferometry", Experimental Mechanics, 281–285, Juli 1984.
27. T. Kreis, „Digital holographic interference-phase measurement using the Fourier-transform method", J. Opt. Soc. Am. A. 3, 847–855 (1986).
28. J. Shamir, „Optical Systems and Processes", SPIE Optical Engineering Press, Washington 1999 – Temporal Coherence 131–132, Spatial Coherence 136–137.
29. J.-P. Chavel, „Optical noise and temporal coherence", J. Opt. Soc. Am. 70, 935–943 (1980).

Claims

Mikroskop, geeignet zur Verwendung in der digitalen Holografie zur Erlangung von 3D-Bildern eines Probestücks, das Mikroskop mindestens aufweisend die folgenden Elemente: (i) Beleuchtungsmittel zum Beleuchten eines Probestücks in Durchgang (1) und/oder Rückstrahlung (41), wodurch ein Messstrahl erzeugt wird, wobei das Beleuchtungsmittel gekennzeichnet ist durch eine vorgegebene Spektralbandbreite, die eine Maximalbeleuchtungswellenlänge aufweist, wobei das Beleuchtungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend zeitlich kohärente und räumlich teilweise kohärente Beleuchtungsmittel, zeitlich und räumlich teilweise kohärente Beleuchtungsmittel und Fluoreszenzanregungsquellen; (ii) Abbildungsmittel, umfassend ein Mikroskopobjektiv (4), das eine vordere Brennebene aufweist, und Scharfeinstellungsmittel (6), die eine Hintere Brennebene aufweisen; (iii) ein Interferometer zum Erzeugen von Störstrahlen aus dem Messstrahl, das Interferometer aufweisend einen ersten Interferometerarm und einen zweiten Interferometerarm, der erste Interferometerarm aufweisend einen ersten Strahlenteiler (13), ein erstes Reflexionselement (16) und einen zweiten Strahlenteiler (14), und der zweite Interferometerarm aufweisend den ersten Strahlenteiler (13), ein zweites Reflexionselement (15) und den zweiten Strahlenteiler (14), wobei manche der Reflexionselemente (15, 16) und Strahlenteiler (13, 14) auf beweglichen Mitteln befestigt sind, um die optische Länge der Störstrahlen mit einer Ge nauigkeit im Bereich von weniger als der Maximalwellenlänge des Beleuchtungsmittels bis zu einem Mehrfachen der Maximalwellenlänge auszugleichen; (iv) eine elektronische Abbildungsvorrichtung (7), versehen mit einem Sensor (33), der in der hinteren Brennebene der Scharfeinstellungsmittel (6) angeordnet ist, zum Auffinden und Aufzeichnen der Streifeninterferenzbilder, die durch die Störstrahlen darauf gebildet werden; (v) Verarbeitungsmittel (8), die mindestens dafür erdacht sind, die Streifeninterferenzbilder durch digitale Holografieverfahren zu verarbeiten; wobei das Mikroskop dadurch gekennzeichnet ist, dass: das Interferometer hinter dem Mikroskopobjektiv (4) und vor den Scharfeinstellungsmitteln (6) angeordnet ist; und das Scharfeinstellungsmittel (6) sowohl im ersten als auch im zweiten Interferometerarm jeweils eine Vordere Brennebene aufweist; und dadurch, dass es des Weiteren umfasst: (vi) einen Positioniertisch (3), der außerhalb des Interferometers vor dem Mikroskopobjektiv (4) angeordnet ist, zum Positionieren des Probestücks im Wesentlichen in der vorderen Brennebene des Mikroskopobjektivs; (vii) Kippmittel (17, 15), die im zweiten Interferometerarm beziehungsweise im ersten Interferometerarm angeordnet sind, zum Kippen des Strahls, der durch das zweite Reflexionselement (15) beziehungsweise das erste Reflexionselement (16) reflektiert wird, relativ zum Strahl, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, um einen präzisen Kippwinkel, und zwar auf eine solche weise, dass der Strahl, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, und der Strahl, der durch das zweite Reflexionselement (15) beziehungsweise das erste Reflexionselement (16) reflektiert wird, in den vorderen Brennebenen (23, 24) der Scharfeinstellungsmittel (6) überlagert wird, wodurch ein präziser Wechsel zwischen den Störstrahlen, die reflektiert und durch den zweiten Strahlenteiler (14) weitergeleitet werden, am Sensor (33) der elektronischen Abbildungsvorrichtung (7) erzeugt wird.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Reflexionselement einem ersten Spiegel (16), und das zweite Reflexionselement einem zweiten Spiegel (15) entspricht, und dass der erste Spiegel (16) und der zweite Strahlenteiler (14) gemeinsam auf den beweglichen Mitteln befestigt sind.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Strahlenteiler (13) und das zweite Reflexionselement (15) Bestandteile eines erstens Prismas (34) sind, während der zweite Strahlenteiler (14) und das erste Reflexionselement (16) Bestandteile des zweiten Prismas (35) sind, wobei das erste Prisma (34) auf den beweglichen Mitteln befestigt ist.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kippmittel einen Keil (17) aufweisen, und dass das Mikroskop im ersten beziehungsweise im zweiten Interferometerarm eine ergänzende optische Ausgleichsvorrichtung (18) aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kippmittel das zweite Reflexionselement (15), das auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Reflexionselement (16) auf einem Umformer, vorzugsweise einem piezoelektrischen Umformer, von Messbewegungen befestigt ist, um durch die Verarbeitungsmittel (8) eine digitale Holografieverarbeitung gemäß dem Phasenschrittverfahren auszuführen.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren Umschaltmittel zum Umschalten des Strahls aufweist, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, in Bezug auf den Strahl, der durch das zweite Reflexionsmittel (15) beziehungsweise das erste Reflexionsmittel (16) reflektiert wird, mit einem präzisen Wechsel in den vorderen Brennebenen (23, 24) der Scharfeinstellungsmittel (6), um an den Störstrahlen, die reflektiert und durch den zweiten Strahlenteiler (14) weitergeleitet werden, eine präzise Streifenmodulation einzuleiten, die abgestimmt ist auf eine digitale Holografieverarbeitung durch die Verarbeitungsmittel (8) gemäß dem Fourier-Transformationsverfahren.
Mikroskop gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel das erste Reflexionselement (16) und den zweiten Strahlenteiler (14), die auf den beweglichen Mitteln (20) befestigt sind, aufweisen.
Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel den Keil (17), der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel den zweiten Spiegel (15), der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die beweglichen Mittel eine Drehplatte (20) aufweisen.
Verfahren zum Erlangen von 3D-Bildern eines Probestücks durch Verwenden eines digitalen holografischen Mikroskops nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das Verfahren aufweisend die folgenden Schritte: – Bereitstellen der Beleuchtungsmittel (1, 41), der Abbildungsmittel inklusive eines Objektivs (4) und Scharfstellungsmittel (6), des Differentialinterferometers (5), der Abbildungsvorrichtung (7) und der Verarbeitungsmittel (8), des Positioniertisches, der Kippmittel und des Interferometers; – Anordnen des Positioniertisches (3) außerhalb des Interferometers in der vorderen Brennebene des Mikroskopobjektivs (4); – Positionieren der Abbildungsvorrichtung (7), so dass ihr Sensor (33) in der hinteren Brennebene der Scharfeinstellungsmittel (6) angeordnet ist; – Positionieren des Interferometers (5) zwischen dem Objektiv und den Scharfeinstellungsmitteln; – Anordnen mindestens mancher der Reflexionsmittel und der Strahlenteiler des Interferometers auf beweglichen Mitteln, um dadurch einen beweglichen Bestandteil zu bilden; – Ausführen von Positionier- und Ausrichtungsvoreinstellungen des Mikroskops durch Hinzufügen eines Testprobestücks, durch: (i) Anordnen des Testprobestücks auf dem Positioniertisch (3); (ii) Beleuchten des Testprobestücks in Durchgang (1) und/oder Rückstrahlung (41) mit den Beleuchtungsmitteln (1, 41), und Erzeugen eines Testmessstrahls dabei; (iii) Erzeugen von Störstrahlen aus dem Testmessstrahl durch das Interferometer; (iv) Entsprechendes Positionieren und Ausrichten des beweglichen Bestandteils des Interferometers, um mit Hilfe der beweglichen Mittel die optische Länge der Störstrahlen mit einer Genauigkeit im Bereich von weniger als der Maximalwellenlänge der Beleuchtungsmittel bis zu einem Mehrfachen der Maximalwellenlänge auszugleichen; (v) Entsprechendes Positionieren und Ausrichten der Kippmittel (17, 15) im zweiten Interferometerarm beziehungsweise im ersten Interferometerarm, zum Kippen des Strahls, der durch das zweite Reflexionsmittel (15) beziehungsweise das erste Reflexionsmittel (16) reflektiert wird, relativ zum Strahl, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, um einen präzisen Kippwinkel, und zwar auf eine solche Weise, dass der Strahl, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, und der Strahl, der durch das zweite Reflexionselement (15) beziehungsweise das erste Reflexionselement (16) reflektiert wird, in den vorderen Brennebenen (23, 24) der Scharfeinstellungsmittel (6) überlagert wird, wodurch ein präziser Wechsel zwischen den Störstrahlen, die reflektiert und durch den zweiten Strahlenteiler (14) weitergeleitet werden, am Sensor (33) der elektronischen Abbildungsvorrichtung (7) erzeugt wird. (vi) Auffinden und Aufzeichnen der Streifeninterferenzbilder, die folglich durch die Störstrahlen auf dem Sensor (33) der Abbildungsvorrichtung (7) gebildet werden; – sobald das Mikroskop derart voreingestellt worden ist, Ersetzen des Testprobestücks durch ein Probestück, das untersucht werden soll; und – Beleuchten des Probestücks, um ein Interferenzbild zu erlangen, wie in (i) bis (vi) offenbart; – Aufzeichnen das Interferenzbilds; – Mögliches Erfassen weiterer ähnlicher Interferenzbilder dieses Probestücks durch Ausführen des Phasenschrittverfahrens; – Verarbeiten des Interferenzbilds/der Interferenzbilder zum Herausholen der optischen Amplitude und Phase des Probestücks durch Ausführen des Phasenschrittverfahrens oder der Fourier-Transformations-Datenverarbeitung.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kippmittel einen Keil (17) aufweisen, und dass das Mikroskop im ersten Interferometerarm beziehungsweise im zweiten Interferometerarm eine ergänzende optische Ausgleichsvorrichtung (18) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kippmittel das zweite Reflexionselement (15), das auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Reflexionselement auf einem Umformer, vorzugsweise einem piezoelektrischen Umformer, befestigt ist, um das Phasenschrittverfahren auszuführen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren das Umschalten des Strahls, der durch das erste Reflexionselement (16) beziehungsweise das zweite Reflexionselement (15) reflektiert wird, in Bezug auf den Strahl, der durch das zweite Reflexionsmittel (15) beziehungsweise das erste Reflexionsmittel (16) reflektiert wird, mit Hilfe von Umschaltmitteln mit einem präzisen Wechsel in den vorderen Brennebenen (23, 24) der Scharfeinstellungsmittel (6), um an den Störstrahlen, die reflektiert und durch den zweiten Strahlenteiler (14) weitergeleitet werden, eine präzise Streifenmodulation einzuleiten, die abgestimmt ist auf eine digitale Holografieverarbeitung durch die Verarbeitungsmittel (8) gemäß dem Fourier-Transformationsverfahren, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel das erste Reflexionselement (16) und den zweiten Strahlenteiler (14), die an den beweglichen Mitteln (20) befestigt sind, aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel den Keil (17), der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Umschaltmittel den zweiten Spiegel (15), der auf Parallelverschiebungs- und/oder Drehmitteln befestigt ist, aufweisen.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die beweglichen Mittel eine Drehplatte (20) aufweisen.
Verwenden des Mikroskops oder des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Untersuchen von fluoreszierenden und/oder dicken Probestücken.
Verwenden des Mikroskops oder des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche in der differentiellen Kontrastmikroskopie.
Verwenden des Mikroskops oder des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche für In-Vivo-3D-Abbildungsanwendungen.
Verwenden des Mikroskops oder des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zum Messen dreidimensionaler Mikroverteilungen von Brechungsindizes in einem Probestück.
Verwenden des Mikroskops nach einem der Ansprüche 7 bis 11, oder des Verfahrens, zum Untersuchen rasch ablaufender Phänomene.