JP7170342B2 - ホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置及び方法 - Google Patents
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Description
3次元的に分布している細胞に対して複数を同時または時間差を持たせてプログラマブルな光刺激を行う技術は、光遺伝学研究の研究レベルを格段に進歩させる技術である。このためには細胞の3次元位置を高速にセンシングし、その情報をもとに複数の光スポットを生成する技術開発が必要である。
また、本発明者らは、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相3次元像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡を結合し、蛍光3次元像と位相3次元像を同時に3次元計測し、蛍光3次元像のみならず位相3次元像を含め多様な情報が観測可能なマルチモーダルなディジタルホログラフィック顕微鏡を提案している(特許文献2を参照)。
しかしながら、刺激対象となる細胞が広範囲に亘って存在することや、画像化のための光学系が2次元照明であることから局所的に特定された細胞を励起することに留まることが問題の一つである。神経細胞を更に理解するためには、ミリ秒オーダの精度、及び3次元マルチスポットに照明でき細胞を刺激できることが必要である。そのため、上述の如く、3次元的に分布している細胞に対して複数を同時または時間差を持たせてプログラマブルな光刺激を行う技術が必要とされており、そのため細胞の3次元位置を高速にセンシングし、そのセンシング情報をもとに複数の光スポットを生成する装置が要望されている。
3次元イメージング用ホログラフィック光学系は、複数の刺激対象物の蛍光分布の3次元観察を行う系である。また、3次元光刺激用ホログラフィック光学系は、3次元空間に位置する複数の刺激対象物に対して刺激を付与する系である。どちらの系もホログラフィック技術によって実現される。
なお、蛍光励起光は、コヒーレント性を有するレーザ光、部分的にコヒーレント性を有するLEDなどの光の双方を用いることができる。また、蛍光励起光として、可視光や紫外線光レーザより生体組織の透過性に優れる近赤外光レーザを用いて、刺激対象物に対して2光子吸収による励起を生じさせることも可能である。
空間光変調素子(SLM;Spatial Light Modulator)とは、電圧によって液晶分子の状態が変化し、位相遅延が発生又は振幅が変調する素子である。空間光変調素子は、液晶分子の配向により入射光電場の偏光状態に対して異なる働きを生じさせることができ、ある方向の直線偏光に対して常光線として作用するときに、それに垂直な直線偏光に対して異常光線として作用する。そのため、特定の直線偏光方向に対してのみ作用する偏光依存性のある2重焦点レンズを実現できる。蛍光信号光は、空間光変調素子で実現される2重レンズによって、2つの回折光が生じることになり、この2つの回折光は、共に同じ偏光であり自己干渉が生じるのである。
生体内の生きた細胞に対して光刺激を付与すべく、共に反射型(落射型)の光学系にする。なお、生体外の細胞に対して光刺激を付与する場合、3次元イメージング用ホログラフィック光学系は、反射型(落射型)でなく透過型にする場合は、観察する蛍光信号光は微弱であるため、蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号光のみを通過させるダイクロイックミラーや蛍光波長の特定の波長および位相計測のためのレーザ波長を通過させるバンドパスフィルタを用いる。
3次元光刺激用ホログラフィック光学系では、ホログラムを書き換える必要があるため空間光変調素子を用いることになるが、3次元イメージング用ホログラフィック光学系では空間光変調素子に限定されず、偏光依存性を有する2重焦点レンズ,偏光依存性を有する回折格子付き2重焦点レンズ、固定の体積型ホログラフィック光学素子も使用することができる。
位相イメージング用ホログラフィック光学系を更に備えることにより、例えば、細胞観察の際には、蛍光3次元像により細胞核の時空間情報を、位相3次元像により細胞核および細胞壁の時空間構造を同時に取得して、蛍光3次元像と位相3次元像を同時かつ高速撮影することを可能にする。
本発明のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法は、下記1)~6)のステップを備えるものである。
1)複数の刺激対象物に蛍光励起光を照射するステップ。
2)刺激対象物の蛍光信号光による3次元蛍光分布のホログラム情報を取得するステップ。
3)取得した3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、刺激対象物の状態を観察するステップ。
4)取得した3次元蛍光分布のホログラム情報に基づき光刺激用ホログラムを生成するステップ。
5)光刺激用ホログラムを用いて複数の光スポットを空間的に形成し複数の刺激対象物に対して同時に光刺激を付与するステップ。
6)光刺激付与に伴う蛍光信号光による3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、刺激付与後の刺激対象物の状態を観察するステップ。
上記5)の刺激対象物に対して同時に刺激を付与するステップは、光刺激用ホログラムによる単一波長の変調光を用いるだけでなく、刺激対象物の特性に応じて、光刺激用ホログラムによる変調光の波長を複数同時に用いる、又は、波長を切替えて用いることが可能である。光刺激用ホログラムによる変調光が蛍光励起光の場合には、光刺激付与に伴って蛍光信号光が現れるため、刺激付与直後の刺激対象物の状態を観察することができる。また、光刺激用ホログラムによる変調光が刺激対象物の状態を制御する状態制御用光の場合には、例えば、オプトジェネティクス分野において細胞のオンとオフを制御することに用いることができる。
3次元イメージング用ホログラフィック光学系Aは、レーザ光源21から照射されるレーザ光(蛍光励起光)による刺激対象物10の蛍光信号光を取り扱う光学系である。光学系Aは、刺激対象物10の蛍光信号光を対物レンズ11により平行光に近い形とし、位相変調型空間光変調素子(以下、単に「空間光位相変調素子」と呼ぶ)12に入射させる。空間光位相変調素子12を透過した蛍光信号光は、チューブレンズ13を通り、イメージセンサ14に到達する。ここで、空間光位相変調素子12は、回折格子が重畳された2重焦点レンズとして機能することにより、蛍光信号光の自己干渉によりイメージセンサ14では蛍光3次元像を取得できる。蛍光信号光は自己干渉するため、得られる蛍光3次元像は等傾角の干渉縞パターンのホログラムになる。演算ユニット15では、等傾角の干渉縞パターンのホログラムを用いて、複数の刺激対象物10の3次元蛍光分布情報である3次元マップ30を算出する。
刺激対象物10は、例えば、生体の細胞群であり、3次元イメージング用ホログラフィック光学系Aによって、複数の細胞の3次元蛍光分布情報を、3次元マップ30の個々の蛍光位置31a~31eとして取得できる。そして、3次元光刺激用ホログラフィック光学系Bによって、複数の光スポットを空間的に形成し、刺激対象物10である複数の細胞に対して同時に刺激を付与できる。
まず、刺激対象物の3次元マップをどのように作成するのかについて説明する。刺激対象物が励起光によって蛍光する特性を有すると仮定する。刺激対象物に蛍光励起光が照射されると、刺激対象物が蛍光信号光を発する。図2のAに示すように、擬似点源σ(xs,ys,zs)の蛍光物体が発した蛍光信号光は、対物レンズ11を通り、空間光位相変調素子12を透過し、チューブレンズ13を通り、イメージセンサ14に到達する。蛍光信号光と共に、反射光又は透過光の蛍光励起光が混じることがあるが、例えば、ダイクロイックミラー(図示せず)を用いて、特定の波長の光を反射し、その他の波長の光を透過することにより、蛍光励起光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調することができる。刺激対象物が細胞群等の場合、複数の蛍光物体が存在することになるが、これらの複数の蛍光物体は、試料空間(例えばガラス容器に収納された試料空間)内における擬似点光源の重ね合わせと見ることができる。
偏光依存性を有する空間光位相変調素子12では、特定の偏光方位の光を通過させて光軸上に集光し、偏光方位が異なる光は遮断する。また、空間光位相変調素子12が、回折格子が重畳された2重焦点レンズの機能を有すると、光軸と平行に入射する光は光軸上で集光するのではなく、回折格子によって集光点が光軸上からズレることになる。異なるスリットによって回折してきた光波が干渉する結果、入射する光は特定の方向にのみ強く伝搬していく。隣り合ったスリットで回折した光波の間に光の波長の整数倍の光路長の差があるとき、強い回折光が生じることになる。偏光依存性によって、特定の偏光方位の光を通過させるので、回折格子のスリットを通過する偏光方位を、特定の偏光方位に一致させ、回折格子によって回折を受け、集光点が光軸上からズレるようにする。ここで、シャッター(図示せず)の開口は、光軸上に集まる光を遮断できるように、光軸上に設けない。遮断される光としては、回折格子の偏光方位と異なる偏光方位を有する光、光学素子での表面反射光、ランダム偏光のノイズ光などである。
入射波面uinが下記式(5)で表される特定の位相分布を有する場合には、対物レンズ23の後の前方焦点面(FFP)における波面は下記式(6)で表される。
3次元イメージング用ホログラフィック光学系Aでは、蛍光染色試薬の種類に応じて、複数のレーザ光源を同時に使用または切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して形状変化と動きを計測し、3次元的に分布している細胞に対して複数を同時または時間差を持たせてプログラマブルな光刺激を行うことが可能である。
一方、レーザ光源21bは、蛍光励起光と同一又は異なる波長の刺激光を出射した後、ビームスプリッタ17aとビームスプリッタ17bを透過し、対物レンズ11を通り、刺激対象物10に照射する。ビームスプリッタ17aは、レーザ光源21aから出射される蛍光励起光は反射し、レーザ光源21bから出射される刺激光は透過する。また、ビームスプリッタ17bは、レーザ光源21aから出射される蛍光励起光およびレーザ光源21bから出射される刺激光は透過するが、刺激対象物10から発する蛍光信号光は反射する。
また、レーザ光源21aが刺激対象物の細胞群に刺激を付与する波長光を出射するものであり、レーザ光源21bが刺激対象物の蛍光励起光を出射するものである場合には、刺激を付与した瞬間の細胞群の状態を観察できる。
なお、本実施例では、3次元光刺激用ホログラフィック光学系におけるレーザ光源及び空間光位相変調素子の光学系B1と光学系B2を形成しているが、更に光学系を増やして、それら複数の波長の光を結合させて刺激光として用いることも可能である。
本実施例のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置では、実施例2の装置と同様に、3次元イメージング用ホログラフィック光学系Aが刺激対象物10の蛍光信号光を蛍光励起光の入射側と反対側(透過側)で処理するのではなく、蛍光励起光の入射側と同じ側で、刺激対象物10の蛍光信号光を処理する系となっている。
図12に示す3次元イメージング用ホログラフィック光学系A´は、透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と、反射型蛍光顕微鏡との2つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、1つのイメージセンサで位相3次元像と蛍光3次元像の2つのホログラムを同時に取得できる系である。
本発明のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法は、図13のフローに示すように、複数の刺激対象物に蛍光励起光を照射するステップ(S01)と、刺激対象物の蛍光信号光による3次元蛍光分布のホログラム情報を取得するステップ(S02)と、取得した3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、刺激対象物の状態を観察するステップ(S03)と、取得した3次元蛍光分布のホログラム情報に基づき光刺激用ホログラムを生成するステップ(S04)と、光刺激用ホログラムを用いて複数の光スポットを空間的に形成し複数の刺激対象物に対して同時に光刺激を付与するステップ(S05)を備え、ステップS02に戻り、光刺激付与に伴う蛍光信号光による3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、刺激付与後の刺激対象物の状態を観察する。図13のフロー図において、1回目のステップS03では、刺激付与前の刺激対象物の状態を観察し、2回目以降の繰り返しのステップS03で、刺激付与後の刺激対象物の状態を観察する。これにより、観察→光刺激→観察→光刺激→・・・→光刺激→観察といったダイナミックな観察が可能である。
かかるフローによれば、3次元蛍光分布の観察、その観察結果に基づき光刺激用ホログラムの作成、光刺激を実行、光刺激を実行したことによる細胞群などの刺激対象物の状態変化までを観察することができる。
本発明のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置について、複数の対象物の3次元位置をセンシングし、得られた3次元蛍光分布情報に基づいて3次元的に位置する複数の対象物に同時に光刺激を付与できるといった効果を確認すべく、実験を行ったのでその結果を説明する。
実験には、上述の実施例5のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置を用いた。図10,11に示すレーザ光源21は、緑色レーザ(中心波長532nm)の光源を用い、試料の刺激対象物10は、直径10~14μmの蛍光ビーズを使用した。試料として使用した蛍光ビーズは、緑色光(波長532nm)によって励起され、550~600nmの範囲の黄色蛍光を発する特性を有する。そして、ホログラムに係る干渉稿の視認性を高めるために、575±12.5nmを中心とするバンドパスフィルタ、電子倍増機能を搭載したCCDセンサ(EMCCD:Electron Multiplying CCD)を適用し、バンドパスフィルタをEMCCDの前に配置した。
図16(d)(e)に示す画像は、図16(a)の上側に位置するビーズを選択して励起光を照射したものと、図16(a)の下側に位置するビーズを選択して励起光を照射したものの、それぞれのホログラム及び再生像を示している。
図16(c)(d)(e)に示す再生像のSN比(SNR:signal-to-noise ratio)は、それぞれ27.8、32.2、33.0であり、SN比は、照射の焦点を制御することによって改善されることがわかる。ここで、SN比は、再生像の信号領域の平均強度とノイズ領域の平均強度の比として定義される。
h→∞を適用して、蛍光ビーズを照射すると、図17(a)に示すように、中央上側にホログラムが観測されるが、画像下側の破線で囲んだ部分にも薄くホログラムが見られる。このホログラムは、集光の奥行き位置がズレているため、蛍光ビーズ面で光が広がり、別の蛍光ビーズも照射していることが原因で生じている。
一方、h=80μmといった奥行き情報を適用すると、図17(c)に示すホログラムが得られる。図17(c)に示すホログラムでは、図17(a)に示すホログラムのように、画像下側に別のホログラムが見られていないことから、奥行き方向に集光スポットが正しく照射されていると言える。図17(d)に示す再生像では、図17(b)に示す再生像と比べてSN比が改善されている(SN比:25.65 → 29.96)。
この実験は、さらに4つの異なる奥行き情報(40,60,80,100μm)の空間光位相変調素子22に対して繰り返し行われた。この実験結果の記録されたホログラム及びそれに対応して得られた再生像を、それぞれ図18(a)(b)に示す。また、図18(c)は、実験と理論計算による焦点面からの再構成距離と奥行き位置がよく一致していることが確認できる。
上記実施例に示す装置を用いて、水中に浮遊する蛍光ビーズの3次元イメージングを動画記録し再生できることを実証した。図20(1)(2)に示す画像は、図20(1)の左側に位置するビーズを選択して励起光を照射したものと、図20(1)の右側に位置するビーズを選択して励起光を照射したものの、それぞれのホログラム及び再生像を示している。図20(3)は、これら2つのビーズの浮遊動作を動画記録しそれを再生像し、時間の経過に伴う再生像の3次元位置を測定してプロットしたものである。動画は15フレーム/秒であり、動画撮影機能によっても、2つの浮遊ビーズの3次元動作の軌跡の測定を行えることが確認できた。
次に、上記と同様の実験をヒト肺癌細胞(NCI-H2228 ATCC(登録商標)CRL-5935TM)に対して行った結果について説明する。試料となるヒト肺癌細胞の核をヨウ化プロピジウム(PI:Propidium Iodide)(Thermo Fisher Scientific社製、P1304MP)で染色して使用した。励起光として532nmレーザ光源を用いた。ヒト肺癌細胞の蛍光は620nmにピーク強度を有する。650±12.5nmの範囲のバンドパスフィルタを使用した。実験結果を図19に示す。
図19(a)は、多数のヒト肺癌細胞の蛍光画像であり、この内、1つのヒト肺癌細胞だけ選択して励起光を照射して蛍光させた画像が図19(b)であり、図19(b)の1つのヒト肺癌細胞の核からの蛍光をホログラムとして記録したものが図19(c)であり、図19(c)のホログラムから得られた再生像が図19(d)である。また、2つのヒト肺癌細胞を選択して励起光を照射して蛍光させた画像が図19(e)であり、図19(e)の2つのヒト肺癌細胞の核からの蛍光をホログラムとして記録したものが図19(f)であり、図19(f)のホログラムから得られた再生像が図19(g)である。
図19に示す結果から、ヒト肺癌細胞の核からの蛍光は、ホログラムとして記録でき、記録したホログラムから再生像が得られることが確認できた。なお、ヒト肺癌細胞は、光学系の軸方向の位置で80μmのデフォーカス(光学系の結像面から光軸方向にズレている状態)を有する。
次に、上記と同様の実験をヒメツリガネゴケの細胞に対して行った結果について説明する。試料となるヒメツリガネゴケの細胞核を蛍光タンパク質で染色し、励起光としてレーザ光源を照射して蛍光させ、バンドパスフィルタを使用して、ヒメツリガネゴケの細胞核の蛍光を観察した。実験結果を図21に示す。
図21(1)(2)は、複数のヒメツリガネゴケの細胞核の蛍光画像であり、図21(1)(2)から、A~Cの細胞核を蛍光観察できる。図21(1)では、Aの2つの細胞核の蛍光が強く明瞭に観察されているのに対して、図21(2)では、Bの細胞核の蛍光が強く明瞭に観察されている。また図21(1)(2)共に、Cの細胞核の蛍光はぼやけて拡がっている。ヒメツリガネゴケの細胞核の奥行きが変化しているために、蛍光が強く明瞭に観察される細胞核、そうではないものがある。
図21(3)は、図21(1)(2)の複数のヒメツリガネゴケの細胞核からの蛍光をホログラムとして記録したものである。そして、図21(3)のA~Cのホログラムから得られた再生像が図21(4)~(6)である。複数のヒメツリガネゴケの細胞核からの蛍光は、ホログラムとして記録でき、記録したホログラムから、図21(4)~(6)に示す3つの再生像が得られることが確認できた。図21(4)~(6)に示す3つの再生像は、今回実験に用いたヒメツリガネゴケの細胞核の場合において、3つの奥行きの再生面があることを意味している。図21(3)に示すホログラムは、焦点面から40μmシフトした位置で撮影しているものである。図21(4)~(6)に示す3つの再生像は、これを処理して複素振幅分布を求めた後、光波伝搬計算して再生像を求めたものであり、伝搬距離はそれぞれ320mm、660mm、940mmである。伝搬距離が大きくなっているのは顕微鏡で拡大しているためであり、物体空間の距離に変換すると、40μm、60μm、75μmとなる。図21(4)~(6)に示す3つの再生像から、焦点面からそれぞれ40μm、60μm、75μm離れた位置に蛍光タンパク質で染色された細胞核A~Cが存在していることがわかる。
特に、本発明は、哺乳類の動物において人工的な神経回路網を構築できる可能性がある。すなわち、有効な神経回路網を構築するためには、数百のニューロンが刺激される必要があり、またニューロン信号の伝搬に類似させるためには、数ミリ秒の時間分解能を必要とするが、高精度と高速応答を有する空間光位相変調素子を用いることにより、これらが実現可能である。
10a カバーガラス
10b ガラスプレート
11,23 対物レンズ
12,22,22a,22b 空間光位相変調素子
13 チューブレンズ
14 イメージセンサ
15 演算ユニット
16 データ通信
17,17a~17d,28 ビームスプリッタ
18,18a,26,32a,32b 反射鏡
19,27,31 4f光学系
21,21a~21c レーザ光源
25 制御部
30 3次元マップ
30a,30b 1/2波長板
31a~31e 蛍光位置
A,A´ 3次元イメージング用ホログラフィック光学系
B,B1,B2 3次元光刺激用ホログラフィック光学系
Claims (14)
- 蛍光励起光を用いた複数の刺激対象物の蛍光信号光を自己干渉させたホログラムを用いて3次元蛍光分布情報を取得する3次元イメージング用ホログラフィック光学系と、
取得した前記3次元蛍光分布情報に基づき生成した光刺激用ホログラムを用いて複数の光スポットを空間的に形成し複数の前記刺激対象物に対して同時に刺激を付与する3次元光刺激用ホログラフィック光学系を備え、
前記3次元光刺激用ホログラフィック光学系は、第1の空間光変調素子と制御部を有し、
前記制御部は、前記3次元イメージング用ホログラフィック光学系が取得した前記3次元蛍光分布情報に基づいて、前記ホログラムと同じ又は同等の空間分解能と3次元観察範囲で特定した複数の刺激対象物の位置に、複数の光スポットを同時に形成する光刺激用ホログラムのパターンの制御を第1の空間光変調素子に対して行う ことを特徴とするホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。 - 3次元光刺激用ホログラフィック光学系は、前記3次元蛍光分布情報に基づいて、第1の空間光変調素子を制御し、3次元空間に複数の光スポットを同時に形成する前記光刺激用ホログラムを生成し、
3次元イメージング用ホログラフィック光学系は、第2の空間光変調素子、偏光依存性を有する2重焦点レンズ、偏光依存性を有する回折格子付き2重焦点レンズ、又は、固定の体積型ホログラフィック光学素子を備え、前記蛍光信号光を自己干渉させて等傾角干渉縞のホログラムを用いて前記3次元蛍光分布情報を取得し、これらを繰り返す ことを特徴とする請求項1に記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。 - 前記制御部は、前記3次元蛍光分布情報に基づいて、光刺激を付与する複数の刺激対象物の位置を、奥行き方向の少なくとも焦点位置から±100μmの範囲で、光刺激する複数の刺激対象物の位置を特定し、特定した位置に複数の光スポットを同時に形成するための前記光刺激用ホログラムを算出し、第1の空間光変調素子を制御し前記光刺激用ホログラムを生成することを特徴とする請求項2に記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 第1の空間光変調素子は、位相変調型空間光変調素子、又は、振幅変調型空間光変調素子の何れかであることを特徴とする請求項1~3の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 3次元光刺激用ホログラフィック光学系は、前記光刺激用ホログラムによる変調光の波長を複数同時に用いる、又は、波長を切替えて用いることを特徴とする請求項1~4の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 3次元光刺激用ホログラフィック光学系において、前記光刺激用ホログラムによる変調光は、前記蛍光励起光、又は、前記刺激対象物の状態を制御する状態制御用光であることを特徴とする請求項1~5の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 3次元イメージング用ホログラフィック光学系は、第2の空間光変調素子を備え、前記蛍光信号光を自己干渉させて等傾角干渉縞のホログラムを用いて前記3次元蛍光分布情報を取得することを特徴とする請求項1~6の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 前記刺激対象物を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相3次元像を取得する位相イメージング用ホログラフィック光学系を更に備えたことを特徴とする請求項1~7の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 前記刺激対象物が、細胞群であり、該細胞群に対して前記光刺激用ホログラムを用いて複数の光スポットを空間的に形成し複数の前記細胞群に対して同時に刺激を付与することを特徴とする請求項1~8の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 3次元イメージング用ホログラフィック光学系と、3次元光刺激用ホログラフィック光学系とが共に反射型であることを特徴とする請求項1~9の何れかに記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激装置。
- 複数の刺激対象物に蛍光励起光を照射するステップと、
前記刺激対象物の蛍光信号光を自己干渉させて3次元蛍光分布のホログラム情報を取得するステップと、
取得した前記3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、前記刺激対象物の状態を観察するステップと、
取得した前記3次元蛍光分布のホログラムと同じ又は同等の空間分解能と3次元観察範囲で特定した複数の刺激対象物の位置に、複数の光スポットを同時に形成する光刺激用ホログラムを生成するステップと、
前記光刺激用ホログラムのパターンの制御を空間光変調素子に対して行い、 前記光刺激用ホログラムを用いて複数の光スポットを空間的に形成し複数の前記刺激対象物に対して同時に光刺激を付与するステップと、
光刺激付与に伴う蛍光信号光による3次元蛍光分布のホログラム情報を計算機で再構成することにより、刺激付与後の前記刺激対象物の状態を観察するステップと、
を備えることを特徴とするホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法。 - 前記光刺激用ホログラムを生成するステップは、
前記3次元蛍光分布のホログラム情報に基づいて、光刺激する複数の刺激対象物の位置を特定するステップと、
特定した位置に複数の光スポットを同時に形成するための前記光刺激用ホログラムを算出するステップ、
を備えることを特徴とする請求項11に記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法。 - 前記刺激対象物に対して同時に刺激を付与するステップは、
前記光刺激用ホログラムによる変調光の波長を複数同時に用いる、又は、波長を切替えて用いることを特徴とする請求項11又は12に記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法。 - 前記光刺激用ホログラムによる変調光は、前記蛍光励起光、又は、前記刺激対象物の状態を制御する状態制御用光であることを特徴とする請求項13に記載のホログラフィック3次元マルチスポット光刺激方法。
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