ES2589014T3

ES2589014T3 - Interferómetro fuera de eje

Info

Publication number: ES2589014T3
Application number: ES10150524.6T
Authority: ES
Inventors: Frank Dubois; Catherine Yourassowsky
Original assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-01-12
Publication date: 2016-11-08
Anticipated expiration: 2030-01-12
Also published as: EP2357539A1; EP2357539B1

Abstract

Microscopio holográfico digital fuera de eje, que comprende: - una fuente de luz parcialmente coherente espacialmente y temporalmente, dispuesta para producir un primer haz de luz parcialmente coherente (1); - un plano de registro (10); - un objetivo de microscopio (ML1); - una celda de objeto (Sa) dispuesta para mantener un espécimen que se va a estudiar en un plano focal frontal de dicho objetivo del microscopio, estando dicha celda del objeto (Sa) conjugada ópticamente con dicho plano de registro (10); - una rejilla (G) situada en un plano conjugado ópticamente con dicho plano de registro (10), definiendo dicha rejilla (G) una primera y una segunda trayectoria óptica, y estando dicha rejilla (G) dispuesta para dividir el primer haz de luz en un haz de luz difractado de orden distinto de cero a lo largo de la primera trayectoria óptica como haz de luz de referencia, y un segundo haz de luz con un orden de difracción diferente a lo largo de la segunda trayectoria óptica; - una primera lente (L5) situada en un punto posterior al objetivo del microscopio, estando dicha rejilla (G) situada en el plano focal posterior de dicha primera lente; - una segunda lente (L6), estando la rejilla (G) situada en el plano focal frontal de dicha segunda lente (L6) y una tercera lente (L7) acoplada ópticamente a dicha segunda lente (L6), estando dicho plano de registro (10) situado en el plano focal posterior de dicha tercera lente (L7) y estando dicha tercera lente dispuesta para recombinar el haz de luz de referencia y el segundo haz de luz para obtener un haz de luz recombinado que incidirá en el plano de registro, en el que interfieren entre sí, en el que la trayectoria óptica del haz de luz de referencia y la trayectoria óptica del segundo haz de luz no difieren en una cantidad mayor que la longitud de coherencia de la fuente de luz.

Description

DESCRIPCION

Interferometro fuera de eje

5

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a un microscopio holografico digital fuera de eje.

10 Estado de la tecnica

[0002] En los interferometros de la tecnica anterior, un haz de luz incidente se suele dividir en un haz del objeto y un haz de referencia que despues se recombinan en un plano de registro en el que el haz del objeto y el haz de referencia interfieren y producen franjas de interferencia. El objetivo de dichos dispositivos es la medicion de la

15 amplitud compleja de la luz (es decir, informacion de fase y amplitud).

[0003] Por lo general, la luz que se utiliza en dicha medicion posee una alta coherencia, como por ejemplo la luz producida por laseres. Esto presenta varios inconvenientes, como la aparicion de ruido coherente (campo de moteado o speckle) y el elevado coste relacionado con las fuentes de luz de alta coherencia.

20

[0004] En muchos casos, se introduce un pequeno angulo entre el haz del objeto y el haz de referencia con el fin de obtener franjas espacialmente heterodinas de baja frecuencia, tal como se describe en el documento US7002691. En general, estos tipos de configuraciones se denominan configuraciones fuera de eje, debido al angulo no nulo entre el eje del interferometro y uno de los haces que interfieren.

25

[0005] En dicha configuracion fuera de eje, es imprescindible disponer de una luz incidente de alta coherencia para observar interferencia: si las diferencias entre la longitud de la trayectoria del haz de referencia y la del haz del objeto son mayores que la longitud de coherencia del haz incidente, no se puede observar ninguna interferencia y se pierde la informacion de fase.

30

[0006] Esto quiere decir que, para una luz parcialmente coherente temporalmente, la diferencia en la longitud de la trayectoria en diferentes posiciones del plano de registro introducida por el pequeno angulo puede bastar para perturbar la coherencia, de manera que solo se observen interferencias en una parte del plano de registro, en la que se mantiene la coherencia.

35

[0007] El registro de informacion de fase y amplitud (o amplitud compleja) constituye la base de la holografla en general y, mas concretamente, de la microscopla holografica digital (MHD). En la MHD, se registra un holograma con una camara CCD y un ordenador lleva a cabo la reconstruction de un modelo tridimensional de la muestra observada. El holograma se obtiene mediante un interferometro. Este procedimiento proporciona una herramienta eficiente para

40 reenfocar, corte por corte, las imagenes de profundidad de muestras gruesas. La MHD permite obtener una formation de imagenes de contraste de fase cuantitativa con numerosas aplicaciones tales como la observation de muestras biologicas. La capacidad de reconstruccion de profundidad convierte a la MHD en una potente herramienta para la aplicacion de la velocimetrla 3D. Ya que la holografla proporciona la amplitud compleja, se han aplicado potentes procedimientos de procesamiento, como por ejemplo reenfoque automatizado, compensation de la aberration, 45 reconocimiento de patrones 3D, segmentation y procesamiento de bordes.

[0008] El principio de la holografla digital, con la separation del haz del objeto y el haz de referencia, consiste en la extraction de la informacion compleja de un haz de objeto a partir de los patrones de interferencia registrados entre el haz del objeto y un haz de referencia. La amplitud compleja se puede procesar posteriormente para calcular

50 el reenfoque digital y para llevar a cabo la formacion de imagenes de contraste de fase cuantitativa. Existen dos tipos principales de configuracion: configuracion en llnea y configuraciones fuera de eje.

[0009] La amplitud compleja se obtiene generalmente mediante un interferometro, como por ejemplo un interferometro de tipo Mach-Zehnder o de tipo Michelson.

55

[0010] En configuraciones en llnea, tal como describen I. Yamaguchi y col. en «Phase-shifting digital holography», Opt. Lett. 22, 1268-1270 (1997), el angulo entre el haz de referencia y el haz del objeto que inciden en el sensor de la camara es el mas pequeno posible. El calculo de la amplitud compleja requiere un procedimiento de escalonamiento de fase, en el que se registran varias imagenes interferometricas con pequenos cambios en la

trayectoria optica introducidos entre el haz del objeto y el de referencia. La information de fase optica se calcula aplicando las imagenes interferometricas en una formula.

[0011] La principal desventaja de la configuration en llnea radica en la necesidad de registrar secuencialmente 5 varias imagenes interferometricas, que limita la velocidad de adquisicion debido a la frecuencia de captura de la

camara. De hecho, el objeto debe permanecer estatico durante toda la operation de adquisicion, el tiempo que se tarda en registrar varios cuadros.

[0012] En la configuracion fuera de eje, tal como se describe en el documento US 6.525.821 y en «Fourier- 10 transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry», de Takeda y col, J.

Opt. Soc. Am. 72, 156-160 (1982), existe un angulo medio no nulo entre el haz del objeto y el de referencia que permite el calculo de la amplitud compleja a partir de una unica imagen interferometrica registrada. Respecto a la configuracion en llnea, esto supone una ventaja decisiva para el analisis de fenomenos que varlan rapidamente. Sin embargo, la utilization de un interferometro de tipo Mach-Zehnder o de tipo Michaelson en esas configuraciones requiere una 15 fuente optica de una alta coherencia temporal. De lo contrario, la modulation de franjas no es constante debido a los retardos opticos variables a lo largo del campo de vision entre el haz del objeto y el de referencia.

[0013] Tal como describen Dubois y col. en «Improved three-dimensional imaging with digital holography microscope using a partial spatial coherent source», Appl. Opt. 38, 7085-7094 (1999), y en «Application of digital

20 holographic microscopes with partially spatial coherence sources» en J. of Phys.: Conf. Series 139 (2008), el empleo de iluminacion parcialmente coherente mejora la calidad del registro holografico al disminuir los artefactos y ruidos coherentes. En la transmision, la reduction de ruido mas eficaz se obtiene mediante una iluminacion parcialmente coherente espacialmente. Este tipo de iluminacion se obtiene reduciendo las propiedades de coherencia de un haz laser o aumentando la coherencia espacial de una fuente incoherente, como un diodo emisor de luz (LED), por medio 25 de un sistema de filtrado optico.

[0014] Con la disposition que se emplea habitualmente para reducir la coherencia espacial de un laser, el haz laser se enfoca cerca de un vidrio deslustrado en movimiento. Para una position dada del vidrio deslustrado, la luz transmitida a traves de la muestra constituye un campo de moteado. Cuando el vidrio deslustrado esta en movimiento,

30 y suponiendo que el tiempo de exposition es lo suficientemente largo como para obtener un efecto promediador, se puede demostrar que este tipo de fuente es equivalente a una fuente lumlnica parcialmente coherente espacialmente cuya distancia de coherencia espacial es igual al campo de moteado promedio. Este procedimiento para preparar la fuente mantiene un alto grado de coherencia temporal que posibilita el procedimiento fuera de eje. Sin embargo, cuando se requieren tiempos de exposicion cortos surgen fluctuaciones en la iluminacion. En la practica, es diflcil 35 lograr que un vidrio deslustrado se mueva lo suficientemente rapido para registrar un objeto dinamico que requiere un tiempo de exposicion corto.

[0015] Con la disposicion que aumenta la coherencia espacial de una fuente incoherente o fuente no laser, se mantienen las propiedades de incoherencia temporal. En tal caso, no se puede aplicar la configuracion fuera de eje ni

40 registrar toda la informacion de amplitud compleja en un unico cuadro.

[0016] En lo que respecta a la colocation de las muestras, se pueden definir dos tipos de configuraciones principales: configuracion diferencial, tal como se describe en el documento EP 1631788, en el que la muestra esta situada frente al interferometro, y la configuracion clasica que se define en el documento EP 1399730, en el que la

45 muestra esta situada en un brazo del interferometro.

Objetivos de la invencion

[0017] La presente invencion tiene como objetivo proporcionar un interferometro que supere los inconvenientes 50 de los interferometros de la tecnica anterior.

[0018] Mas concretamente, la presente invencion tiene como objetivo proporcionar un interferometro fuera de eje capaz de trabajar con fuentes de luz parcialmente coherente.

55 [0019] En el documento de patente US3572934, se describe una interferometrla de desplazamiento (shearing) longitudinalmente invertido, en la que se utiliza una rejilla para dividir un haz de luz coherente en dos haces que interfieren. La fuente de luz que se emplea es coherente tanto temporal como espacialmente (laser).

[0020] En el artlculo «Time resolved digital holography: a versatile tool for femtosecond laser induced damage

studies», (Laser induced damage in Optical materials, 2009, Proc of SPIE vol. 7504), de A. Melninkaitis y col., se describe un dispositivo de registro holografico que comprende una rejilla para obtener una interferencia fuera de eje. La disposicion utiliza una fuente de luz con una elevada coherencia espacial y no serla capaz de registrar patrones de interferencia homogeneos con una fuente de luz parcialmente coherente espacialmente. En el artlculo «Resolution- 5 enhanced approaches in digital holography», (Optical Measurement Systems for Industrial Inspection VI, Proc. of SPIE, vol. 7389), de M. Paturzo y col., se describe un procedimiento que utiliza una rejilla de fase de difraccion dinamica para aumentar sinteticamente la apertura de un sistema holografico digital de formacion de imagenes en una configuracion desprovista de lentes.

10 [0021] La presente invencion tambien tiene como objetivo proporcionar configuraciones de microscopio holografico digital (MHD) que permiten utilizar las configuraciones fuera de eje con una fuente con coherencia temporal y/o espacial. De este modo se logra la capacidad de llevar a cabo un rapido registro holografico digital en color con niveles de ruido muy bajos.

15 [0022] La presente invencion tambien tiene como objetivo proporcionar microscopios holograficos digitales que permitan la utilizacion de fuentes con coherencia parcial creadas a partir de una fuente incoherente con la configuracion fuera de eje. Constituye una mejora considerable, ya que permite accionar el microscopio en modo rapido sin la desventaja de las fluctuaciones debidas a la configuracion con un laser (ruido coherente). Ademas, esta aplicacion permite utilizar fuentes de bajo coste, como el LED, y ofrece la posibilidad de registrar de manera simultanea 20 hologramas en rojo-verde-azul para proporcionar una microscopla holografica digital totalmente en color sin el ruido coherente.

Resumen de la invencion

25 [0023] Un primer aspecto de la invencion se refiere a un microscopio holografico digital fuera de eje tal como se expone en la reivindicacion independiente 1.

[0024] La expresion «fuera de eje» quiere decir que al menos uno de los haces de luz interferentes presenta un angulo no nulo con respecto al eje del interferometro, o de manera equivalente, que los haces de luz interferentes son

30 haces no paralelos.

[0025] La expresion «dos planos opticamente conjugados en un sistema optico» quiere decir que uno de los planos es la imagen optica del otro.

35 [0026] Una rejilla con una periodicidad d divide un haz incidente en varios haces cumpliendo con la condicion:

d{sin 6m + sin fy) = ml

en la que 0m es el angulo entre el haz de luz difractado y la normal de la rejilla, 0i es el angulo entre el haz de luz 40 incidente y la normal de la rejilla, A es la longitud de onda de la luz y m es un numero entero denominado «orden de difraccion». La luz que corresponde a la transmision directa (o reflexion especular en el caso de una rejilla de reflexion) se denomina «de orden cero» y se indica «m = 0». Los otros haces de luz forman angulos que se representan mediante numeros enteros m distintos de cero. Observese que m puede ser un valor positivo o negativo, lo que da lugar a ordenes difractados a ambos lados del haz de orden cero.

45

[0027] En las reivindicaciones independientes 3 y 4 adjuntas, se exponen otras configuraciones del microscopio holografico digital fuera de eje de acuerdo con la invencion. En las reivindicaciones dependientes adjuntas se exponen otros aspectos de la invencion.

50 Descripcion breve de los dibujos

[0028]

La fig. 1 ilustra la limitacion de la coherencia entre dos haces interferentes secantes en un plano.

55

La fig. 2 representa un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

La fig. 3 representa un microscopio holografico digital de transmision que trabaja en modo diferencial y comprende un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

La fig. 4 representa un microscopio holografico digital de transmision que comprende un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

5 La fig. 5 representa un microscopio holografico digital de reflexion que comprende un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

La fig. 6 representa un microscopio holografico digital de transmision que trabaja en modo diferencial y comprende un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

10

La fig. 7 representa un microscopio holografico digital de transmision con capacidad de trabajar con fluorescencia, que comprende un interferometro de acuerdo con la presente invencion.

Referencias de las figuras

15

[0029]

1. Primer haz de luz

2. Segundo haz de luz

3. Tercer haz de luz

20 4. Medios de registro

5. Haz de luz difractado (difraccion de orden distinto de cero)

6. Haz de luz paralelo difractado de orden distinto de cero 6'. Haz de luz paralelo difractado de orden cero

7. Haz de luz no difractado (o difraccion de orden cero)

25 8. Elemento de parada optica

9. Haz de luz incidente

10. Plano de registro

11. Medios de compensacion para cuna de compensacion

12. 2*Longitud de coherencia

30 13. Area de interferencia

14. Plano de coherencia

15. Interferometro

16. Espejo de referencia

17. Fuente de luz de excitacion por fluorescencia

35 Bs1, Bs2, Bs3 y Bs4: Divisores de haz

EF: Filtro de excitacion G: Rejilla

L1, L2, L3, l4, L5, L6 y L7: lentes M11 y M12: objetivos del microscopio 40 M1, M2 y M3: espejos

P: microorificio en una pantalla Sa: Muestra o portamuestras de transmision So: Fuente de iluminacion RA: Mecanismo giratorio

45 Rs: Muestra o portamuestras de reflexion

W: Cuna

[0030] En interferometrla, cuando se usa luz parcialmente coherente, resulta crucial mantener la coherencia de la luz incidente en un plano de registro para observar franjas de interferencia. En muchos casos, las franjas de

50 interferencia se obtienen dividiendo un primer haz de luz (incidente) para generar un segundo y un tercer haz de luz, y recombinando el tercer y el segundo haz de luz con un pequeno angulo introducido entre ellos.

[0031] En ese caso, la pequena longitud de coherencia de la luz incidente parcialmente coherente (la luz que se va a analizar) introduce una severa limitacion: al no ser paralelos, los planos de coherencia de ambos haces solo

55 pueden interferir en una pequena area en la interseccion entre ambos planos, sin que se observe ninguna interferencia cuando la distancia entre los planos de coherencia es mayor que la longitud de coherencia.

[0032] Esto se ilustra en la fig. 1, en la que un haz de luz perpendicular a un plano interfiere con otro haz de luz no paralelo con un a fuera de eje con respecto al plano. Tal como se representa, la luz no paralela solo es coherente

(capaz de interferir) en la proximidad del plano de coherencia 14, a una distancia menor que la longitud de coherencia 12, que define un area limitada 13 en la que se observa interferencia.

[0033] La presente invencion describe un interferometro en el que el plano de coherencia de un haz de luz 5 interferente no es perpendicular a la direccion de propagacion del haz de luz en la proximidad de un plano de registro.

Esto proporciona la capacidad del haz de luz no perpendicular para interferir con un haz de luz perpendicular y producir un contraste de franjas que no depende de la posicion en el plano de registro. Esto permite el registro de franjas interferentes fuera de eje (franjas espacialmente heterodinas) incluso en el caso de que la luz posea una longitud de coherencia limitada, como es el caso de la luz producida por un LED, una lampara de descarga de gas, etc.

10

[0034] Al utilizar como primer haz de luz (incidente) un haz de luz de coherencia temporal parcial, el segundo y el tercer haz de luz en interferometros de la tecnica anterior solo puede interferir en las zonas correspondientes definidas por la longitud de coherencia. Esto significa que la diferencia en la longitud de la trayectoria optica y el desplazamiento de fase debida a los dispositivos opticos dispuestos en la trayectoria optica entre el segundo y el tercer

15 haz de luz deberla continuar siendo menor que la longitud de coherencia de la fuente de luz.

[0035] La coherencia temporal es la medida de la correlacion media entre los valores de una onda en cualquier par de instantes, separados por un intervalo temporal t, que caracteriza si una onda puede interferir consigo misma en un instante diferente. El intervalo temporal a lo largo del cual varla la fase o la amplitud en una medida considerable

20 (por tanto, la correlacion se reduce en una medida considerable) se define como tiempo de coherencia Tc. En t = 0, el grado de coherencia es perfecto, mientras que se reduce considerablemente en el intervalo temporal Tc. La longitud de coherencia Lc se define como la distancia recorrida por la onda en el tiempo Tc. Se puede estimar la longitud de coherencia mediante la formula:

2ln(2) A2

25 lc =------------TT

nn A A

en la que A es la longitud de onda de la luz, AA es la amplitud espectral de la fuente y n es el Indice refractivo de propagacion. Para una tlpica fuente LED, esto representa desde algunas longitudes de onda hasta algunas decenas de longitudes de onda. Por ejemplo, para un LED con una longitud de onda de 650 nm y un ancho de banda espectral 30 de 15 nm (valores tlpicos para los LED disponibles en el mercado), la longitud de coherencia es de aproximadamente 20A. Esto significa que el haz de referencia fuera de eje no puede tener un desplazamiento de fase mayor que el tiempo de coherencia, en ningun lugar del plano de registro. Tambien supone que el numero de franjas inducidas por la diferencia angular entre el haz de referencia y el haz del objeto no puede ser superior a aproximadamente 20, lo cual constituye una severa limitacion.

35

[0036] La limitacion del tiempo de coherencia tambien puede deberse a la duracion del impulso de un laser de impulsos ultracortos. Normalmente, dicho laser de impulsos posee una duracion del impulso de varios femtosegundos, por lo que la longitud del impulso esta limitada a alguna longitud de onda. En ese caso, el tiempo de coherencia es igual a la duracion del impulso. De nuevo, esto supone que el numero de franjas inducidas por la diferencia angular

40 entre el haz de referencia y el haz del objeto no puede ser mayor que el numero de longitud de onda que representa la longitud del impulso.

[0037] Preferentemente, para evitar esta limitacion en ambos casos, la presente invencion aprovecha las propiedades particulares de las rejillas de difraccion para producir un haz de referencia fuera de eje sin perturbar la

45 coherencia temporal de los haces interferentes en el plano de registro.

[0038] En el interferometro 15 de la presente invencion, una rejilla de difraccion G esta situada en el plano focal posterior de una lente L5 situada en los ejes opticos de un haz de luz incidente 9. La rejilla G provoca la division del haz de luz incidente 9 para generar un haz difractado 5 (referencia) y un haz de luz no difractado 7 (que se convertira

50 en el haz del objeto). Despues, una segunda lente L6 situada a una distancia focal con respecto a la rejilla G modifica la forma del haz difractado y del haz no difractado para formar haces paralelos al eje optico. L5, L6 y la rejilla G se seleccionan para obtener, detras de L6, dos haces de luz separados espacialmente, un haz difractado y un haz de luz no difractado. El haz de luz no difractado puede convertirse en el haz del objeto o bien ser eliminado por un elemento de parada optica. En el ultimo caso, se puede proporcionar otro haz de objeto mediante una estructura optica mas 55 grande, tal como se describira mas adelante. El haz difractado se recombina posteriormente con el haz del objeto y se enfoca por medio de una lente de objetivo L7 en un plano de registro, con el plano de registro situado en el plano focal posterior de L7.

[0039] Al ser el haz difractado paralelo al eje optico de L7, pero no centrado en este eje optico, L7 introducira un angulo fuera de eje en dicho haz difractado.

5 [0040] Otra posibilidad consiste en que los haces de luz interferentes sean cualquier par de haces de luz difractados con un orden de difraccion diferente. Por ejemplo, se puede escoger el haz de luz difractado de orden +1 como haz de luz de referencia y se puede escoger el haz de luz difractado simetrico de orden -1 como haz del objeto.

[0041] Preferentemente, se utiliza un elemento de parada optica para detener todos los haces de luz menos los 10 dos haces difractados seleccionados para interferir en el plano de registro.

[0042] Se puede demostrar que, en dicha configuracion, la rejilla no perturba la coherencia temporal de cualquier haz de luz difractado de orden distinto de cero. La coherencia temporal esta relacionada con la trayectoria optica recorrida. Por lo tanto, resulta equivalente a probar que un impulso temporal optico que ilumina los planos

15 focales posteriores de L5 y L4 en un tiempo dado iluminara simultaneamente la totalidad del plano focal posterior de L7.

[0043] Se considera que una rejilla G, cuya transparencia viene definida por g(x,y)=(1+sinKx)/2, esta iluminada por una onda plana monocromatica de amplitud A. Suponiendo que la pareja de lentes L6-L7 constituye un sistema

20 afocal (L6-L7 forman un sistema de tipo 4f), la amplitud en el plano de registro viene dada por:

uv(x,y) = Bexpjj!l"V(f$ + /7)}'(-*+xf-*,y) (1)

en la que B es una constante que no desempena un papel relevante, j = V-l , v es la frecuencia optica, c es la 25 velocidad de la luz en el vaclo y /6 y f7 son las longitudes focales de L6 y L7. Al calcular la contribucion de un unico haz difractado en el plano de registro, la ecuacion (1) se convierte en:

u'v (x, y) = B'exp jj !"v (#$ + #7)} exp (-jK *+ x- (2)

30 en la que K = 2n/A, siendo A el periodo espacial de la rejilla. B'es una constante que no desempena un papel relevante.

[0044] La iluminacion mediante un impulso temporal con forma de delta de Dirac se obtiene al llevar a cabo la transformacion de Fourier de la ecuacion (2):

35 u't(x,y) = B'8 jt-1 (#6 + #7)&exp (-;K*+x) (2)

en la que t es el tiempo, la ecuacion (3) expresa el hecho de que un impulso de luz espacialmente uniforme en el plano focal frontal de L6 alcanzara simultaneamente todos los puntos del plano focal posterior de L7 sin intervalo de tiempo dependiendo de la posicion (x,y). La parte exponencial expresa el hecho de que el haz incide en el plano del sensor 40 con un angulo inclinado con respecto al eje optico. Por lo tanto, cuando se ecualicen las trayectorias opticas del interferometro de la presente invencion, sera posible registrar el patron de interferencia en la totalidad del plano del sensor entre el haz del objeto y el de referencia. El angulo inclinado del haz de referencia proporciona la configuracion fuera de eje.

45 [0045] Debido a que la propiedad demostrada de dicha rejilla no depende del haz de luz no difractado, la disposicion descrita, que comprende una rejilla G situada en un plano conjugado con el plano de registro 10, se puede utilizar en cualquier disposicion fuera de eje. Esta conjugation se puede obtener, por ejemplo, mediante un sistema de tipo 4f con una rejilla entre las dos lentes L5, L6 y una lente de enfoque L7.

50 [0046] En esta etapa, se puede observar que el haz difractado, que ahora tiene su plano de coherencia paralelo al plano de registro, puede interferir con cualquier haz de luz con una trayectoria optica equivalente y con su plano de coherencia paralelo al plano de registro. Mas concretamente, puede interferir con el haz de luz no difractado, pero tambien con haces de luz difractados de otro orden, o un haz de luz que pase a traves de otro brazo de un interferometro de tipo Mach-Zehnder o de tipo Michaelson de mayor tamano, siempre que la diferencia en la trayectoria 55 optica no supere la longitud de coherencia de la luz incidente.

[0047] En el microscopio holografico digital (MHD) fuera de eje de la presente invention, se registran hologramas digitales mediante fuentes de luz parcialmente coherente. Para obtener dichas fuentes de luz parcialmente coherente, se pueden utilizar fuentes de luz incoherente tales como diodos LED. Para obtener la coherencia parcial

5 necesaria para observar las franjas de interferencia que se requieren para determinar la information de fase de la luz entrante, se puede utilizar un filtro espacial.

[0048] En la fig. 3 se representa un primer ejemplo de un microscopio que hace uso de un interferometro 15 de acuerdo con la invencion. En esta figura, una fuente de luz parcialmente coherente So, como por ejemplo un LED,

10 esta situada en el plano focal posterior de una lente L1. Despues, el haz de luz producido se filtra espacialmente a traves de un microorificio P en una pantalla con el fin de aumentar su coherencia espacial. El microorificio P esta situado en el plano focal posterior de una lente L2, para iluminar la muestra Sa. La muestra Sa esta situada en el plano focal posterior del objetivo del microscopio ML1 y despues sigue al interferometro 15 tal como se describe anteriormente. El holograma en esta figura se registra por medio de una camara CCD.

15

[0049] En este ultimo caso, se inserta preferentemente una cuna W en la trayectoria optica de uno de entre el segundo o el tercer haz de luz, con el fin de provocar un leve desplazamiento de las imagenes producidas por los haces de luz difractado y no difractado, con el fin de obtener el interferograma diferencial tal como se describe en el documento EP 1631788. En este caso, se introducen preferentemente unos medios de compensation 11 en la

20 trayectoria optica del haz de luz no difractado para compensar el desplazamiento de fase introducido por la cuna en el haz difractado.

[0050] Otra posibilidad consiste en introducir el interferometro en una estructura optica mas grande, tal como un interferometro Mach-Zehnder representado en los MHD ilustrados en las figs. 4 a 7. En dicho caso, el haz de luz

25 no difractado 15 es detenido por un elemento de parada optica 8 y el haz del objeto se proporciona mediante otra trayectoria optica, por ejemplo otro brazo de un interferometro tipo Mach-Zehnder.

[0051] Como ocurre con los microscopios holograficos habituales, un primer haz de luz 1 se divide en un segundo haz de luz 2 y un tercer haz de luz 3 por medio de un primer divisor de haz Bs1, y se recombinan mediante

30 un segundo divisor de haz Bs2 para dar lugar a un haz recombinado, y dichos segundo y tercer haz de luz interfieren en el haz recombinado y forman un patron de interferencia en un medio de registro, tal como un sensor CCD, con el fin de obtener patrones de interferencia. En dicho caso, el interferometro 15 de la presente invencion se inserta en el brazo de referencia del interferometro tipo Mach-Zehnder con el fin de obtener la configuration fuera de eje, deteniendose el haz no difractado 6' mediante un elemento de parada optica 8.

35

[0052] Preferentemente, la presencia de las lentes L5 y L6 se compensa mediante las lentes L3 y L4 en la trayectoria del haz del objeto con el fin de compensar la modification de fase inducida por dichas lentes L5 y L6.

[0053] Preferentemente, la lente L7 se coloca despues del divisor de haz Bs2 del interferometro tipo Mach- 40 Zehnder, utilizado para recombinar el haz del objeto y el de referencia. Esto permite compartir dicha lente L7 entre el

haz del objeto y el de referencia.

[0054] Otra posibilidad consiste en sustituir la lente L7 por dos lentes situadas respectivamente en la trayectoria optica del haz de referencia y en la trayectoria optica del haz del objeto, con ambas lentes enfocando en los medios

45 de registro, pero situadas antes de los medios de recombination.

[0055] Tambien se pueden incorporar configuraciones que incluyen una fuente de excitation por fluorescencia, tal como se representa en la fig. 7.

50 [0056] Debido a que no es necesario utilizar ningun desplazamiento de fase, la MHD descrita se puede usar para registrar escenas dinamicas de gran rapidez, registrando varios cuadros sucesivos con el fin de registrar secuencias temporales de representation 3D de la muestra que se va a observar.

[0057] Esta aplicacion permite el uso de fuentes de bajo coste, como los LED, y, con sensores de color, permite 55 el registro simultaneo de hologramas rojo-verde-azul mediante una iluminacion con tres LED, a fin de proporcionar una microscopla holografica digital totalmente en color sin el ruido coherente. Hasta ahora, la aplicacion de la microscopla holografica digital en color requerla emplear complejos procedimientos de registro. En la invencion descrita, los tres colores se pueden registrar de manera simultanea.

[0058] En el mercado hay varios tipos de sensores de color, incluidos los sensores de un solo color, tales como los disenos de sensor triple y CCD de color. En los disenos de sensor triple, un bloque prismatico (es decir, un conjunto tricroico que comprende dos prismas dicroicos) puede filtrar el interferograma obtenido para generar los tres colores primarios, rojo, verde y azul, dirigiendo cada color hacia un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) o sensor de

5 plxeles activos (sensor de imagen CMOS) montado en cada cara del prisma.

[0059] Existen varios tipos de rejillas de transmision que se pueden aplicar. El tipo de rejilla mas sencillo es la rejilla de Ronchi, que esta formada por una placa optica transparente en la que estan impresas unas llneas opacas paralelas con una anchura I. Hay un espacio transparente constante L entre las llneas opacas consecutivas. Las rejillas

10 de Ronchi a menudo poseen una anchura de apertura transparente igual a la de la opaca. La cantidad significativa que caracteriza a una rejilla de Ronchi y el angulo de difraccion para una longitud de onda dada es el periodo de la rejilla P=L+1. El analisis de difraccion de una rejilla de Ronchi se lleva a cabo descomponiendo en primer lugar la funcion de transmitancia de acuerdo con una serie de Fourier. Para una longitud de onda dada, cada componente de Fourier da lugar a un orden de difraccion caracterizado por un angulo de difraccion 0m, en el que m es un numero 15 entero y 0 es el primer angulo de difraccion.

[0060] La amplitud difractada en cada orden de difraccion es proporcional al correspondiente componente de Fourier. En el interferometro de la invencion 15, el periodo de la rejilla se selecciona de manera que garantice una separacion espacial de los haces difractados en el plano, en el que esta situada la parada optica 8.

20

[0061] Habitualmente, lo que se mantiene es uno de los ordenes de difraccion (m=+1 o -1) para el haz de referencia que incide en el detector. Una limitacion de la rejilla de Ronchi consiste en la dispersion de la intensidad de la luz entre varios ordenes de difraccion, con lo que se reduce la luz disponible para las mediciones interferometricas.

25 [0062] Para optimizar la eficiencia de la difraccion en el orden de difraccion mantenido para el procedimiento holografico, se puede aplicar una rejilla de difraccion escalonada (blazed). Las rejillas de difraccion escalonadas tambien poseen una estructura periodica en una de las superficies de una placa optica. En este caso, se trata de un relieve en forma de diente de una superficie que optimiza la eficiencia de la difraccion en los ordenes de difraccion m=1 o m=-1.

30

[0063] Para optimizar la eficiencia de la difraccion, tambien es posible incorporar rejillas holograficas de fase gruesas. Este tipo de rejilla se obtiene registrando en un material fotosensible, por ejemplo gelatina dicromada, el patron de interferencia entre dos ondas planas. Posteriormente, la placa se procesa y es capaz de difractar mayormente la luz en un orden de difraccion de acuerdo con un modo de difraccion de Bragg. El angulo entre la onda

35 del plano de registro determina el periodo de la rejilla.

[0064] Despues, las salidas analogicas se pueden digitalizar y tratar mediante un ordenador con el fin de obtener una representacion tridimensional en color de las muestras.

40 [0065] Una fuente parcial temporal y espacial puede estar constituida por una fuente (So), una lente de colimacion (L1), un microorificio (P) y una lente (L2). La coherencia temporal se obtiene a partir de la anchura espectral de la fuente (So). Normalmente, puede tratarse de un LED con un espectro que presenta un pico (por ejemplo, la longitud de onda A = 650 nm, AA = 15 nm), o un conjunto de LED que proporcionan un conjunto de picos, para lograr un registro holografico en color. El haz se colima mediante la lente (L1) y se filtra por medio del microorificio (P) a fin 45 de aumentar la coherencia espacial. Se puede demostrar que la dependencia de la coherencia espacial emergente, que surge de la lente (L2), es uniforme y se puede modelizar mediante una funcion de coherencia y(x1 - X2, y1 - y2), en la que (xi, yi) y (x2, y2) son coordenadas espaciales perpendiculares al eje optico z.

[0066] Esta aplicacion de la fuente parcialmente coherente no supone ninguna restriction y se puede llevar a la 50 practica de maneras diferentes, como por ejemplo con un haz laser descorrelacionado mediante un vidrio deslustrado

en movimiento.

Descripcion de las realizaciones preferidas de la invencion 55 Configuracion Mach-Zehnder

[0067] La fig. 4 ilustra el esquema del microscopio holografico digital basado en una configuracion de tipo Mach- Zehnder que permite el registro fuera de eje con fuentes opticas con coherencia parcial espacial y temporal.

[0068] En el caso de la fig. 4, la fuente de luz esta constituida por una fuente (So), una lente de colimacion (L1), un microorificio (P) y una lente (L2).

[0069] Tras una reflexion en el espejo M1, el haz es dividido por Bs1 para generar el haz del objeto que ilumina

5 la muestra en la transmision y el haz de referencia, que se redirige hacia la lente del microscopio ML2. La imagen del

plano focal frontal de MI1 Se lleva a cabo mediante el conjunto de lentes MI1, L3, L4 y L7. Para formar la imagen, el plano focal posterior de L3 corresponde al plano focal frontal de L4 y el sensor esta situado en el plano focal posterior de L7.

10 [0070] En esta configuracion, el interferometro de la invencion 15 esta representado por las lentes L5, L6 y L7 y la rejilla G.

[0071] El brazo de referencia esta provisto de elementos correspondientes a las lentes MI1, L3 y L4; respectivamente, las lentes MI2, L5 y L6, de tal manera que el haz de referencia y el del objeto, excepto por la muestra,

15 la rejilla G y el elemento de parada optica 8, son casi identicos. Esto garantiza un alineamiento correcto de los dos haces en el sensor, en el que interfieren. La naturaleza parcialmente coherente espacialmente de la iluminacion as! lo requiere.

[0072] El plano focal frontal de la lente MI2, en el que se forma una imagen del componente opcional C, que

20 puede ser un compensador y/o un atenuador de la trayectoria optica, en el plano focal posterior de l5, que tambien

es el plano focal frontal del L6, en el que se encuentra la rejilla G. La funcion de la rejilla consiste en redirigir la luz mediante difraccion, de tal modo que el haz del objeto y el de referencia que inciden en L7 estan separados espacialmente y se propagan en paralelo. Tal como ya se ha demostrado, esta disposicion con L5, G, L6 y L7 permite mantener la coherencia temporal en el plano del sensor en el caso de coherencia temporal parcial, y producir una 25 interferencia fuera de eje.

[0073] La lente L7 superpone los haces del objeto y de referencia en el sensor con un angulo medio entre ellos que se origina a parti r de difraccion de la rejilla. En esta configuracion, el espejo M2 es paralelo a Bs2, y M3 es paralelo a Bs1. La orientacion relativa de los divisores de haz y los espejos permite ajustar, sin cambiar las posiciones del haz

30 en el sensor, la trayectoria optica rotando el mecanismo de rotacion RA, al que estan fijados firmemente el espejo M2 y el divisor de haz Bs2. Por lo tanto, la configuracion permite ecualizar los haces de referencia optica y de trayectoria del objeto.

[0074] Esta configuracion se puede adaptar a muestras reflexivas, tal como se representa en la fig. 5. En ese 35 caso, se retira el portamuestras Sa y el espejo M2 se sustituye por un tercer divisor de haz Bs3 que ilumina una

muestra reflexiva Rs a traves de la lente del objetivo ML1. La luz reflejada por la muestra y enfocada por la lente del objetivo se redirige despues mediante un tercer divisor de haz Bs3 hacia el segundo divisor de haz, de la misma manera que en la configuracion anterior. Se aplica la misma modificacion a la trayectoria optica del haz de referencia, sustituyendo la muestra por un espejo de referencia 16.

40

Configuracion diferencial

[0075] La configuracion Mach-Zehnder resulta adecuada para aplicaciones en las que las variaciones en la trayectoria optica introducidas por el objeto son limitadas: en el caso de un grosor del objeto muy fluctuante, la densidad

45 de las franjas puede acabar siendo demasiado elevada para ser registrada por el sensor.

[0076] Ademas, con una iluminacion parcial temporal reducida, en la configuracion de Mach-Zehnder, el ajuste fino de la trayectoria optica cuando se cambia el objeto puede resultar diflcil. Por ese motivo se propuso la microscopla holografica digital diferencial. En el ultimo caso, lo que se mide es la fase optica diferencial, que presenta las ventajas

50 de un intervalo dinamico incrementado para la medicion de fase y el ajuste permanente del interferometro, independientemente del grosor de la muestra.

[0077] Se puede utilizar ventajosamente en modo diferencial la configuracion fuera de eje con fuentes parcialmente coherentes, espacial y temporalmente. El esquema optico esta representado por la fig. 6.

55

[0078] La fuente parcialmente coherente espacialmente y temporalmente la constituye una fuente (So), una lente de colimacion (L1), un microorificio (P) y una lente (L2). El haz es colimado mediante la lente (L1) y filtrado por el microorificio (P) para aumentar la coherencia espacial.

[0079] Tras una reflexion en el espejo M1, el haz de luz ilumina la muestra y es transmitido por la lente del microscopio MI1. El haz de luz procedente de MI1 se divide mediante Bs1 en dos haces correspondientes a un segundo y a un tercer haz de luz. La imagen del plano focal frontal de MI1 situado dentro de la muestra se forma mediante el conjunto de lentes MI1, L3, L4 y L7. Con ese fin, el plano focal posterior de L3 coincide con el plano focal

5 frontal de L4 y el sensor esta situado en el plano focal posterior de L7. Del mismo modo, la imagen del plano focal frontal de MI1 se forma mediante el conjunto de lentes Ml 1, L5, L6 y L7, correspondiendo el plano focal posterior de L3 al plano focal frontal de L4. La distancia entre L4 y L7 es identica a la distancia entre L6 y L7.

[0080] Por lo tanto, se forma una imagen en el sensor CCD del mismo plano que el plano de la muestra, 10 correspondiente al plano focal frontal de MI1. Se introduce un desplazamiento entre las imagenes formadas por el

segundo y el tercer haz de luz haciendo rotar ligeramente el espejo M2 o el espejo M3. El desplazamiento es unicamente de unos pocos plxeles, o incluso de menos de un pixel en el sensor CCD. Los elementos correspondientes a las lentes L3 y L4 del primer canal optico 1, respectivamente las lentes L5 y L6, estan situados en la trayectoria optica del tercer haz de luz, de tal manera que la trayectoria optica tanto del segundo como del tercer haz de luz, a 15 excepcion de la muestra, la rejilla G y el elemento de parada optica 8, son identicas. Esto permite una alineacion correcta con el pequeno desplazamiento de los dos canales en el sensor en el que estan interfiriendo.

[0081] Se forma una imagen del plano focal frontal de la lente MI1 en el plano focal posterior de L5, que tambien es el plano focal posterior de L6, en el que se encuentra la rejilla G. La funcion de la rejilla consiste en redirigir la luz

20 mediante difraccion de manera que los haces incidentes de los dos canales en L7 esten separados espacialmente. La lente L7 superpone los dos haces en el sensor con un angulo medio entre ellos que se origina a partir de la difraccion de la rejilla. En la configuration, el espejo M2 es casi paralelo a Bs2 y M3 a Bs1. Estas orientaciones relativas de los divisores de haz y los espejos permiten el ajuste, sin cambios en las posiciones del haz en el sensor, la trayectoria optica mediante la rotation del mecanismo de rotation RA al que el espejo M2 y el divisor de haz Bs2 estan unidos 25 firmemente. Por lo tanto, la configuracion permite ecualizar el haz de referencia y el de la trayectoria del objeto.

[0082] El angulo medio entre el haz del objeto y el de referencia en el sensor proporciona la configuracion fuera de eje. Como ya se ha demostrado, hay una alineacion correcta, incluso en el caso de una fuente de coherencia temporal parcial, con el fin de proporcionar de manera homogenea un patron de franjas contrastado a lo largo de todo

30 el sensor CCD. Cabe senalar que se puede colocar un atenuador en la trayectoria optica del segundo haz de luz para compensar la perdida de luz originada por la rejilla. Se puede insertar una placa optica en la trayectoria optica del tercer haz de luz a fin de compensar la diferencia en la trayectoria optica introducida entre los dos canales por el atenuador.

35 [0083] Se puede utilizar una fuente de fluorescencia 17 cuando la muestra de interes es fluorescente, tal como se representa en la fig. 7. Su haz es reflejado por el divisor de haz fluorescente a traves de la lente MI1 para iluminar la muestra. La senal fluorescente que se propaga hacia atras se transmite mediante MI1 y se filtra espectralmente mediante SF con el fin de eliminar la parte de excitation fluorescente antes de que incida en Bs1. Debido a que la lente MI1 esta limitada por una apertura, la senal fluorescente incoherente presenta una coherencia espacial parcial 40 cuando surge de MI1, con el resultado de que los dos haces son capaces de interferir, siempre que el desplazamiento sea menor que el de la longitud de coherencia espacial.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Microscopio holografico digital fuera de eje, que comprende:

5 - una fuente de luz parcialmente coherente espacialmente y temporalmente, dispuesta para producir un primer haz de luz parcialmente coherente (1);

- un plano de registro (10);

10 - un objetivo de microscopio (ML1);

- una celda de objeto (Sa) dispuesta para mantener un especimen que se va a estudiar en un plano focal frontal de dicho objetivo del microscopio, estando dicha celda del objeto (Sa) conjugada opticamente con dicho plano de registro (10);

15

- una rejilla (G) situada en un plano conjugado opticamente con dicho plano de registro (10), definiendo dicha rejilla (G) una primera y una segunda trayectoria optica, y estando dicha rejilla (G) dispuesta para dividir el primer haz de luz en un haz de luz difractado de orden distinto de cero a lo largo de la primera trayectoria optica como haz de luz de referencia, y un segundo haz de luz con un orden de difraccion diferente a lo largo de la segunda trayectoria optica;

20

- una primera lente (L5) situada en un punto posterior al objetivo del microscopio, estando dicha rejilla (G) situada en el plano focal posterior de dicha primera lente;

- una segunda lente (L6), estando la rejilla (G) situada en el plano focal frontal de dicha segunda lente (L6) y una 25 tercera lente (L7) acoplada opticamente a dicha segunda lente (L6), estando dicho plano de registro (10) situado en el

plano focal posterior de dicha tercera lente (L7) y estando dicha tercera lente dispuesta para recombinar el haz de luz de referencia y el segundo haz de luz para obtener un haz de luz recombinado que incidira en el plano de registro, en el que interfieren entre si, en el que la trayectoria optica del haz de luz de referencia y la trayectoria optica del segundo haz de luz no difieren en una cantidad mayor que la longitud de coherencia de la fuente de luz.

30
2. Microscopio holografico digital de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la celda del objeto (Sa) esta iluminada por el primer haz de luz (1), estando dicho objetivo del microscopio (ML1) situado en un punto anterior a la rejilla (G) y en el que hay una cuna situada en la segunda trayectoria optica para producir un holograma diferencial.

35 3. Microscopio holografico digital fuera de eje, que comprende:

- una fuente de luz parcialmente coherente espacialmente y temporalmente, dispuesta para producir un primer haz de luz parcialmente coherente (1);

40 - un plano de registro (10);

- un objetivo de microscopio (ML1);

- una celda de objeto (Sa) dispuesta para mantener un especimen que se va a estudiar en un plano focal frontal de 45 dicho objetivo del microscopio, estando dicha celda del objeto (Sa) conjugada opticamente con dicho plano de registro

(10);

- una rejilla (G) situada en un plano conjugado opticamente con dicho plano de registro (10);

50 - un interferometro de tipo Mach-Zehnder, que comprende un primer divisor de haz (Bs1) y un segundo divisor de haz (Bs2), estando dicho primer divisor de haz (Bs1) dispuesto para dividir dicho primer haz de luz en un segundo haz de luz (2) y un tercer haz de luz (3);

- una primera lente (L5) situada en la trayectoria optica de dicho tercer haz de luz (3), dispuesta para enfocar dicho 55 tercer haz de luz en dicha rejilla (G);

- una segunda lente (L6) con el mismo eje optico que la primera lente (L5) y situada a un distancia focal de la rejilla (G), dispuesta para producir al menos un haz de luz difractado de orden distinto de cero, estando dicho segundo divisor de haz (Bs2) dispuesto para recombinar dicho segundo haz de luz y dicho haz de luz difractado para producir un haz

recombinado;

- un elemento de parada optica dispuesto para detener la luz difractada de orden cero de dicho tercer haz de luz;

5 - unos medios de registro dispuestos para registrar senales interferometricas producidas por la interaccion entre el segundo haz de luz y el haz de luz difractado, estando dichos medios de registro situados en el plano de registro (10) de dicho interferometro (15);

- unos medios de enfoque (L7) dispuestos para enfocar dicho haz recombinado sobre dichos medios de registro, 10 siendo la trayectoria optica del segundo y el tercer haz de luz esencialmente equivalentes y estando situados la celda

del objeto (Sa) y el objetivo del microscopio frente al primer divisor de haz (Bs1), definiendo una configuracion holografica diferencial.
4. Microscopio holografico digital fuera de eje, que comprende:

15

- una fuente de luz parcialmente coherente espacialmente y temporalmente, dispuesta para producir un primer haz de luz parcialmente coherente (1);

- un plano de registro (10);

20

- un objetivo de microscopio (ML1);

- una celda de objeto (Sa) dispuesta para mantener un especimen que se va a estudiar situado en un plano focal frontal de dicho objetivo del microscopio, estando dicha celda del objeto (Sa) conjugada opticamente con dicho plano

25 de registro (10);

- una rejilla (G) situada en un plano conjugado opticamente con dicho plano de registro (10);

- un interferometro de tipo Mach-Zehnder, que comprende un primer divisor de haz (Bs1) y un segundo divisor de haz 30 (Bs2), estando dicho primer divisor de haz (Bs1) dispuesto para dividir dicho primer haz de luz en un segundo haz de

luz (2) y un tercer haz de luz (3);

- una primera lente (L5) situada en la trayectoria optica de dicho tercer haz de luz (3), dispuesta para enfocar dicho tercer haz de luz en dicha rejilla (G);

35

- una segunda lente (L6) con el mismo eje optico que la primera lente (L5) y situada a un distancia focal de la rejilla (G), dispuesta para producir al menos un haz de luz difractado de orden distinto de cero, estando dicho segundo divisor de haz (Bs2) dispuesto para recombinar dicho segundo haz de luz y dicho haz de luz difractado para producir un haz recombinado;

40

- un elemento de parada optica dispuesto para detener la luz difractada de orden cero de dicho tercer haz de luz;

- unos medios de registro dispuestos para registrar senales interferometricas producidas por la interaccion entre el segundo haz de luz y el haz de luz difractado, estando dichos medios de registro situados en el plano de registro (10)

45 de dicho interferometro (15);

- unos medios de enfoque (L7) dispuestos para enfocar dicho haz recombinado sobre dichos medios de registro, siendo la trayectoria optica del segundo y el tercer haz de luz esencialmente equivalentes, y en los que la celda del objeto (Sa) y el objetivo del microscopio (M11) estan situados en la trayectoria optica del segundo haz de luz (2).

50
5. Microscopio holografico digital de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que un segundo objetivo del microscopio (M12) esta situado en la trayectoria optica del tercer haz de luz (3).
6. Microscopio holografico digital de acuerdo con la reivindicacion 4, que ademas comprende un tercer 55 divisor de haz (Bs3) situado en la trayectoria del segundo haz de luz para iluminar un objeto reflectante (Rs) y un cuarto

divisor de haz (Bs4) situado en la trayectoria del tercer haz de luz para iluminar un espejo de referencia (16), definiendo una geometrla de tipo Mach-Zehnder.
7. Microscopio holografico digital de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

la fuente de luz parcialmente coherente comprende unos medios de iluminacion (So) seleccionados entre el grupo formado por un LED, una lampara de descarga de gas, fuentes termicas y laser de impulsos.
8. Microscopio holografico digital de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dichos 5 medios de registro son unos medios de registro sensibles al color, y la fuente de luz produce de manera simultanea al

menos tres longitudes de onda distintas, para registrar un interferograma holografico en color.
9. Microscopio holografico digital de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que dicha fuente de luz comprende la menos tres LED de diferentes longitudes de onda.

10
10. Microscopio holografico digital de acuerdo con la reivindicacion 7 o 8, en el que las distintas longitudes de onda corresponden a cian, magenta y amarillo (CMY) o rojo, verde y azul (RGB) para la reconstruccion del color.
11. Microscopio holografico digital de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una 15 fuente de excitacion por fluorescencia (17) acoplada opticamente a dicho portamuestras.