JPH11236400A - モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体及び遊離ソマトメジン濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 純粋な担体タンパク質サブユニットを抗原と
したモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との提
供。純粋な担体タンパク質サブユニットを利用してヒト
体液中の遊離ソマトメジンの濃度の測定方法の提供。 【解決手段】 ソマトメジン様ポリペプチドと結合でき
る担体タンパク質サブユニット以外の純粋な担体タンパ
ク質様ポリペプチドに対するモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体。ソマトメジン様ポリペプチドと結
合できる担体タンパク質サブユニット以外の純粋な担体
タンパク質様ポリペプチドと複合したソマトメジンを未
結合のソマトメジンから分離することにより、ヒト体液
中の遊離ソマトメジンの濃度を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ヒトソマトメジ
ン担体タンパク質サブユニット及びその製造方法に関す
る。さらに詳しくは、この発明は、ヒトソマトメジン様
ポリペプチドに結合し、インシュリン様成長因子として
も知られている担体タンパク質サブユニットに関する。
さらにこの発明は、特に純粋なヒトソマトメジン担体タ
ンパク質サブユニットに関する。またこの発明はヒト血
漿から上記の担体タンパク質サブユニットを製造する方
法に関する。この製造方法には、一連の各種クロマトグ
ラフィの段階によって、ヒト血清画分CohnIV-1から製造
する方法が含まれている。この発明の担体タンパク質サ
ブユニットと方法は、各種の治療、診断などの有用な用
途に用いることができる。またこの発明は、ヒトソマト
メジン担体タンパク質様ポリペプチドをコードするDNA
分子、組換えDNA 分子、かような分子で形質転換された
宿主、ヒトソマトメジン担体タンパク質様ポリペプチド
の製造方法、前記分子を使用して製造されるヒトソマト
メジン担体タンパク質様ポリペプチド、宿主及び方法に
関する。更に詳しくは、この発明は、DNA 分子と、適切
な宿主でのその発現に関する。上記の組換えDNA 分子
は、前記のヒト担体タンパク質の生物活性を有するポリ
ペプチドをコードするDNA 分子をもっている。以下の開
示から明らかなように、この発明のDNA 分子、組換えDN
A 分子、宿主及び方法は、各種の治療、診断などの有用
な用途に有用なポリペプチドの製造に使用することがで
きる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ソマト
メジン("SM" とも呼称される) は有用な生物学的特性を
有するホルモンである。SMは、約7,500 ダルトンの分子
量を有するポリペプチドである。SMは、(a) 成長ホルモ
ン("GH" とも呼称される) の成長促進作用を仲介し、
(b) 弱いインシュリン様活性を有し (そのため "インシ
ュリン様増殖因子" 又は"IGF" とも呼ばれている) 、
(c) 各種骨格組織などの組織に対して分裂促進性であ
り、及び(d) 大きな担体タンパク質に結合した血漿で輸
送される。ヒトには、２種のSM組成がある。SM-Cは塩基
性のポリペプチドでSM-Cと呼ばれることがある。SM-Cは
出生後のGHの成長促進作用を仲介する。SM-Aは、主とし
て、IGF-IIとして知られているポリペプチドと、各種の
量の修飾形SM-Cとの混合物である〔Spencer, E.M.編集
"Insulin-like Growth Factors/Somatomedins"中のSpen
cer,E.M.等、"The Identity of Human Insulin-like Gr
owth Factors I and II With Somatomedinsand A With
RAT SM I and II" (Walter de Gruyter, 1983年) 参
照〕。IGF-IIはGH依存性は小さいが、胎児の成長に役割
をもっている。

【０００３】SMは、骨形成 (例えば骨粗しよう症の治療
時) 、創傷の治癒、動物とGH欠損症のヒトの成長を刺激
し、生体内で有用である。SM-Cの血清中濃度は、先端巨
大症、脳下垂体性巨人症、GH欠損症及びその外の成長関
連症状を診断するのに測定される〔Greenspan F.S.とFo
rsham, P.H. 編集"Basic and Clinical Endocrinology
89頁 (1986年) のSpencer E.M."Somatomedins" (Appl
eton-Century-Crofts)参照〕。またSMは、組織培養で各
種の細胞の増殖を生体外で刺激するのにも用いられるの
で正常な及び異常な細胞増殖の調節の研究に有用であ
る。ある種の乳癌細胞と腎臓癌細胞が産生するSMは、癌
組織の増殖を保持するのに必要な、癌細胞と血管の繊維
状組織の両者の増殖を刺激する(Spencer E.M. 等、"Pos
sible Auto-Stimulation of Human Mammary Carcinoma
Growth by Somatomedins" 、 Annals of the N.Y. Aca
d. Sci.、 464巻、 448頁、1986年；Huff K.K. 等、"Se
cretion of Insulin-like Growth Factor-I-related P
rotein by Human Breast Cancer Cells" Cancer Resea
rch、46巻、4613〜4619頁、1986年参照) 。SMの作用を
阻止することは、これらの癌の増殖を制御するのに有用
である。

【０００４】ヒトSMは、他のタンパク質によって生体内
で輸送され調節されるようである (Hintz R.L.等、"Dem
onstration of Specific Plasma Protein Binding Site
s For Somatomedin"、J.Clin. Endo-crinol. Metab. 、
45巻、 988頁、1977年参照)。これらのタンパク質は生
体内でSMと結合してSMの生物活性を調節するようであ
る。中性pH下でヒト血清をゲル濾過した結果、免疫反応
性SM-C活性の95％と恐らくIGF-II活性が、約150,000 〜
160,000 ダルトン(150〜160 キロダルトン即ち、kDa)の
位置と、35〜50kDa の範囲に少量溶出することが分かっ
た。ごく少量の免疫反応性活性が7.5kDaに溶出する。そ
こには遊離のSMが現れるはずである(Smith,G.L. 、Mole
cular and Cellular Endocrinology、34巻、83〜89頁、
1984年参照) 。このことはSMが血漿中でより大きなタン
パク質と複合していることを示す。

【０００５】ヒト血漿中の少なくとも２種のクラスのタ
ンパク質又はタンパク質複合体がSMと結合すると報告さ
れている(Drop,S.L.等、"Immunoassay of A Somatomedi
n-binding Protein From Human Amniotic Fluid; Level
s In Fetal, Neonatal, AndAdult Sera" 、J.Clin. End
ocrinol. Metab.、59巻、 908頁、1984年；WilkinsJ.R.
等、"Affinity labeled Plasma Somatomedin-C+/Insuli
n-like Growth Factor I Binding Proteins 、"J.Clin.
Invest.、75巻、1350頁、1985年参照) 。本願では、一
方のクラスの天然のタンパク質又はタンパク質複合体
を、その機能がSMを輸送することのようなので、SM "担
体タンパク質" と呼称する。この用語はその担体タンパ
ク質が単一のタンパク質であることを示そうとするもの
ではない。１つ以上の担体タンパク質があり、それはタ
ンパク質複合体である。本願では他方のクラスのものを
"羊水結合タンパク質" 又は"AFBF"と呼ぶ。１つ以上の
AFBFがある。SMと結合する追加のクラスのタンパク質又
はタンパク質複合体を見出すことも可能である。

【０００６】担体タンパク質活性は、SM-C活性と同様に
GH- 依存性でGH欠損症のヒトでは低く、GH産生腫瘍、先
端巨大症として知られている症状を有する患者では高い
(White R.M.等、 "The Growth Hormone Dependence of
Somatomedin-binding Protein In Human Serum"、J.Cl
in. Endocrinol. Metab.、53巻、49頁、1981年参照)。
担体タンパク質は、潜在的に価値のある用途を示す生物
学的特性を示す。生体内では、SMが担体タンパク質と結
合すると、SMの半減期が、試験される動物の種によって
約１時間から約24時間まで増大すると報告され(Cohen,
K.L. 等、"The Serum Half-life of Somatomedin Activ
ity:Evidence for Growth Hormone Dependence"、Acta
Endocrinol.、83巻、 243頁、1976年) そのSMは遊離さ
れるまで不活性になる。他のモデル系の研究は、担体タ
ンパク質を含有する不純な製剤は、(a) 潅流されている
ラットの心臓でのSMの代謝作用を消失させ(Meuli,C.
等、"NSILA-carrier Protein Abolishes The Action Of
Nonsuppressible Insulin-like Activity (NSILA-s) O
n Perfused Rat Heart" 、Diabetologia、14巻、 255
頁、1978年) 、(b) 培養中の細胞でのSMの分裂促進作用
を阻害し(Knauer, D.J. 、Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.
A.、77巻、7252−7256頁、1980年及びKuffer, A.D.等、
"Partial Purification Of A Specific Inhibitor Of T
he Insulin-like Growth Factors By Reversed Phase
High-performance Liquid Chromatography"、J. of Chr
omatography、 336巻、87−92頁、1984年) 、及び(c)
ラットの脂肪組織でのSMのインシュリン様活性を阻止す
る(Zapf, J. 等、"Inhibition Of TheAction Of Nonsup
pressible Insulin-like Activity On Isolated Rat Ce
lls By Binding To Its Carrier Protein"、J. Clin.
Invest.、63巻、1077頁、1979年) 。担体タンパク質の
一部分純粋の製剤は、SMを測定する競合結合アッセイを
行う試験で放射能標識を付けたSMとともに使用されてい
る(Moses, A.C.等、Endocrinology 、 104巻、 536頁、
1979年参照) 。

【０００７】その価値のある生物学的特性のため、その
活性の原因である担体タンパク質若しくはそのサブユニ
ットを単離し特性を決定しようと多くの努力がなされて
いる。本願の発明がなされる前は、担体タンパク質若し
くはその活性サブユニットを純粋な形で単離して特性を
決定しようという試みはことごとく失敗している。これ
は血漿中の担体タンパク質の濃度が低いことが一部影響
している。精製に成功するには、担体タンパク質が酵素
によって消化され、特にpHの変化に対し不安定なため
に、活性の損失の問題も解決しなければならない。担体
タンパク質サブユニットの精製は、血漿中にAFBPが存在
し、これもソマトメジンと結合するのでさらに複雑であ
る。

【０００８】担体タンパク質は糖タンパク質である。中
性pH下の血清中で担体タンパク質はSMと結し、得られた
複合体は、ゲル濾過法で測定すると、約150 〜160kDaの
分子量をもっている。中性pH下での担体タンパク質複合
体の分子量は、他の測定法で測定したところ約125kDaで
あった。酸性条件下で血清もしくは血漿をゲル濾過クロ
マトグラフィに付すと、結合していたSMが担体タンパク
質から分離し、分子量が約40〜50kDa の担体タンパク質
のユニットが精製すると報告されている。そのユニット
もソマトメジンと結合する(Hintz, R.L.等、"Demonstra
tion Of Specific Plasma Protein Binding Sites For
Somatomedin"、J. Clin. Endocrinol. Metab. 、45巻、
988 頁、1977年参照) 。40〜50kDa の酸性で安定なユニ
ットは150 〜160kDaの担体タンパク質複合体を再生する
よう誘導できないので、他の文献は、担体タンパク質
も、それ自体ソマトメジンと結合しない酸性に対して不
安定なユニットで一部構成されていると示唆している(M
oses, A.C.等、Endocrinology 、104 巻、536 頁、1979
年参照) 。Furlanettoは、血清を35〜55％の硫酸アンモ
ニウム溶液で処理し、沈澱を単離し、その沈澱を0.05M
トリス液、pH8.20に溶解し、トリス緩衝液を用いるDEAE
セファデックスA-50のクロマトグラフィに付したと報告
している(Furlanetto, R.W. "The Somatomedin C Bindi
ng Protein : Evidence For A Heterologous Subunit S
tructure" 、J. Clin. Endocrinol. Metab. 、51巻、12
頁、1980年参照) 。Furlanettoはそれ以上の精製を開示
しなかった。むしろ、Furlanettoは、各種の画分で実験
を行って、血清中のソマトメジン-C結合活性が少なくと
も２つのユニットで構成され、一方はストークス半径が
36ÅでSM-Cと結合し (いわゆる酸性で安定なユニット)
、他方はストークス半径が30〜38ÅでSM-Cと結合しな
い (いわゆる酸性で不安定なユニット) というFurlanet
toの見解を確認している。

【０００９】Wilkins は、アフィニティ・ラベリング法
によって、SM-Cと複合した血漿タンパク質を同定した
(Wilkins. J.R. 等、"Affinity-labeled Plasma Somato
nedin-C/Insulin-like Growth Factor I Binding Prote
ins" 、J. Clin. Invest.、75巻、1350頁、1985年参照)
。 ¹²⁵I-SM-Cを、全血漿と、血漿のセファデックスG-2
00 画分とにおいてSM-Cと結合したタンパク質に共有結
合で架橋結合させた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動法とオートラジオグラフィとに
よって、さらにAFBPを約160 、110 、80、50及び25kDa
の種に同定した。Wilkins 等は、160kDaの担体タンパク
質複合体は、６つの約25kDa(24−28kDa)のサブユニット
の複合体で構成され、各々サブユニット＋SM-Cで構成さ
れていると仮定した。しかし、Wilkins 等は、この25kD
a のサブユニットの単離若しくは精製の報告はしなかっ
た。他の研究者は、わずかに大きいサブユニット構造を
提案したが確認していない (Daughaday, W.H. 等、"Cha
racterization Of Somatomedin Binding in Human Seru
m By Ultracentrifugation And Gel Filtration"、J.CL
IN. Endocrinol. Metab. 、55巻、916 頁、1982年参照)
。

【００１０】いく人もの研究者が、酸性で安定な40〜50
kDa の担体タンパク質ユニットをヒト血漿から単離しよ
うとして失敗したことを報告している。Draznin 等は、
わずかに１％のSM結合活性を含有する物質を報告したが
その物質が担体タンパク質若しくはAFBPに由来するもの
か否かは開示していない〔Draznin,B.等,G. Giordano等
編集"Somatomedins and Growth" の149 〜160 頁(Acade
mic Press 1979年) 参照〕。Fryklund等は、新しい凍結
ヒト血漿を、ポリエチレングリコール沈澱法、カルボキ
シメチル−セファデックスクロマトグラフィ及びゲル濾
過法で分画した〔Fryklund, L.等,G.H.Sato 等編集Horm
ones and Cell Culture の49〜59頁(Cold Spring Harbo
r Laboratory 1979 年) 参照〕。Fryklund等は、その担
体タンパク質が、35kDa と45kDa の２つの似ていない連
鎖で構成されていると提案した。Fryklund等はグリシン
がＮ末端分子分析法によって遊離されたことを開示した
が、そのグリシンがどの連鎖に由来するのか、または両
端ともにグリシンで終わっているか否かは同定しなかっ
た。Fryklund等の製剤の報告された結合活性は非常に低
くその純度は報告されなかった。Fryklund等は、担体タ
ンパク質若しくはAFBPがその製剤中に存在しているか否
かを確認しなかった。Morris, D.H.等は、ヒトCohn画分
IVを酢酸で抽出し、 ¹²⁵I-IGF-I とともにインキュベー
トし、Sephacryl S-200 のクロマトグラフィに付すこと
によって粗製のSM結合性画分を得たと報告している(Mor
ris,D.H.等"Structure of Somatomedin-binding Protei
n : Alkaline pH-Induced Dissociation of an Acid-St
able, 60,000 Molecular Weight Complex Into Smaller
Components"、Endo-crinology、 111巻、 801〜805
頁、1982年参照) 。Morris等は、見掛けの分子量が60,0
00と46,000で結合性放射性SM-Cを含有する画分を報告し
た。Morris等は、これらの画分をpH8.0 に暴露すると、
60,000と46,000ダルトンの ¹²⁵I-IGF-I 結合活性体が4
6,000と30,000の複合体を有する画分にシフトすると報
告した。これらの画分はそれ以上精製されなかった。Ma
rtin等は、その酸性で安定なユニットに対するポリクロ
ーナル抗体を製造したと報告した。酸性で安定なユニッ
トは、2M酢酸、75mM NaCl でヒトCohn画分IVを抽出する
ことによって単離された。SMをSP- セファデックスに吸
着させることによって除去した後、酸性で安定なユニッ
トをIGF-II−アフィニティ−クロマトグラフィで得て、
免疫化に用いた。Martin等は、HPLCを用いると酸性で安
定なユニットをさらに精製することができることを開示
した。その最終生成物の純度を確認するデータは何も与
えられなかった(Martin, J.L. 等、"Antibody Against
Acid-Stable Insulin-Like Growth Factor Binding Pro
tein Detects 150,000 Molecular Weight Hormone-Depe
ndent Complex In Human Plasma" J. Clin.Endocrinol.
Metab.、 261巻、 799〜801 頁、1985年参照) 。Kuffe
r等は、彼がインシュリン様成長因子の阻害剤(SM)とし
て報告したものの部分的精製について報告した(Kuffer,
A.D. 等、"Partial Purification of A Specific Inhi
bitorof the Insulin-Like Growth Factors By Reverse
Phase High-Performance Liquid Chromatography" 、
J. of Chromatography、336 巻、87〜92頁、1984年参
照) 。Kuffer等は、セファデックスG-75とBio-Gel P-30
カラムを用いる、酸性条件下でのイオン交換クロマトグ
ラフィと連続ゲルクロマトグラフィによって、Cohn画分
IV-1から分子量が16,000〜18,000のSM阻害剤を製造し
た。アフィニティクロマトグラフィと高性能液体クロマ
トグラフィにかけた後、Kuffer等は、 "大きな明らかに
均一なタンパク質のピークと、小さな不均一なピーク"
に対応する活性の２つのピークとして "阻害活性" を得
た。Kuffer等は核ピークの活性体の単離は報告しなかっ
た。

【００１１】上記の研究は、いずれもソマトメジン様ポ
リペプチドに結合できるヒト担体タンパク質サブユニッ
トのクラスを開示していない。さらにこれらのどの研究
も、SMに結合できかつ均一に精製された担体タンパク質
のサブユニットを開示していない。担体タンパク質がAF
BP若しくは汚染物の代わりに単離されたことを確証し、
生物活性を試験するには純度が要求される。不純な製剤
は酵素を含有しているので生成物を不安定にし、容易に
分解するが変性する。また不純な製剤は動物やヒトには
使用できない。その理由は、もとの血清に存在している
か又は精製過程で生成した多くの不純物は抗原性なので
望ましくない生物学的作用を生ずることがあるからであ
る。例えば骨粗しょう症のヒトに使うには汚染物をすべ
て除去する必要がある。というのはこれらの汚染物が抗
原性であるか又は不利な生物学的作用をもっているから
である。

【００１２】その外の研究者は、SMに結合しうる異なる
タンパク質をヒトの妊娠中期の羊水から単離して得た
が、その羊水はタンパク質若しくは"AFBP"に結合する。
このAFBPは担体タンパク質でもなく担体タンパク質のサ
ブユニットでもない(Wilkins J. R.等、"Affinity-labe
led Plasma Somatomedin-C/Insulin- like Growth Fact
or I Binding Proteins"、J. Clin. Invest.、75巻、13
50頁、1985年参照) 。AFBPは、(a) 担体タンパク質のい
わゆる酸性に対して安定なユニットより小さく、分子量
が32−40kDa の範囲にあり、(b) グリコシル化されてお
らず、(c) その報告されたＮ末端分子中のこの発明の担
体タンパク質サブユニットとは異なり(Povoa G. 等、"I
solation And Characterization of A Somatomedin-bin
ding Protein From Midterm Human Amniotic Fluid" 、
Eur. J. Biochem.、 144巻、199 −204 頁、1984年参
照) 、及び(d) 異なる免疫学的特性をもっている(Drop,
S.L.S. 等 "Immuno-assay of A Somatomedin-Binding
Protein From Human AmnioticFluid: Levels In Fetal,
Neonatal and Adult Sera"、J. Clin. Endocrinol. Me
tab. 、59巻、 908頁、1984年; Martin J.L. 等、前記
文献、J. Clin. Endocrinol. Metab. 、61巻、 799−80
1 頁、1985年参照) 。AFBPに対する抗血清は、150kDaの
担体タンパク質若しくはその酸性で安定なユニットと交
差反応しない。Drop等は、ラジオイムノアッセイ(RIA)
で測定したAFBPのレベルが、幼年期中に減少し (これは
担体タンパク質と逆である) 、また担体タンパク質と異
なり、日中に有意に変化することが見出されたと報告し
た。またEnbergは、次の４つのクロマトグラフィの工
程:CM-Affigel blue、ヒドロキシルアパタイト、高速タ
ンパク質液体クロマトグラフィゲル濾過法及び高性能液
体クロマトグラフィ(HPLC)ヒドロキシルアパタイトによ
って、ヒト成人の血漿からAFBPを単離した(Enberg G.、
"Purification of A High Molecular Weight Somatomed
in Binding Protein From Human Plasma" 、Biochem. a
nd Biophy.Res. Commun.、 135巻、 178〜182 頁、1986
年参照) 。Enbergは、 "可能な" Ｎ末端分子Ala-Pro-Tr
p-を報告したが、それは、AFBPが単離されたのであっ
て、Enbergが誤って結論した150kDaの担体タンパク質で
はないことを証明している。

【００１３】SMに結合するタンパク質も細胞培養抽出物
中に同定された (例えばAdams, S.O. 等、Endocrinolog
y 、115 巻、520 〜526 頁、1984年) 。これまでにその
担体タンパク質は単離されていない。Spencer は、肝臓
細胞の初代培養物が、SMと複合するタンパク質を産生す
ることを初めて示した (Spencer E.M.、"The Use OfCul
tured Rat Hepatocytes To Study The Synthesis Of So
matomedin And Its Binding Protein" FEBS LEtters、9
9巻、157 頁、1979年参照) 。その後、いくつもの正常
及び異常の細胞形がSMと複合するタンパク質を合成する
ことが見出された。パッファローラットの肝臓腫瘍の培
養細胞(BRL3A) は、抗体反応性、Ｎ末端のアミノ酸分子
及びグリコシル化されていないことで担体タンパク質と
異なる33kDa のSM結合性タンパク質を生成する(Lyons
R.M. 等、"Characterization of Multiplication-Stimu
latory Activity "MSA"Carrier Protein"、Molecular a
ndCellular Endocrinol. 45巻、263 〜270 頁、1986
年；Mottola. C. 等、J. ofBiol. Chem. 261巻、1180
〜1188頁、1986年参照) 。Romanus 等は、上記の結合性
タンパク質に対する抗体が胎児血清中に存在するタンパ
ク質と交差反応するが成熟ラットの血清とは交差反応し
ないと報告した(Romanus J.A. 等、"Insulin-like Grow
th Factor Carrier Proteins In Neonatal And Adult R
at Serum are Immunologically Different Demonstrati
on Using A New Radioimmunoassay ForThe Carrier Pro
tein From BRL-3A Rat Liver Cells" 、Endocrinology
、 118巻、1743頁、1986年参照) 。上記のBRL-3A結合
性タンパク質はAFBPのげっ歯類相当物かもしれないが、
Ｎ末端分子のデータは２つの分子間に全く類似性がな
い。

【００１４】多くのタンパク質とポリペプチドが組換え
DNA 技術を用いて製造されている。この方法で担体タン
パク質様ポリペプチドを製造する報告は発表されていな
い。担体タンパク質様ポリペプチド遺伝子をクローン化
し発現するのに、組換えDNA法の技術を使うには多くの
障害がある。担体タンパク質様ポリペプチドをコードす
る遺伝子を得ることは、種々の理由のため困難である。
本願発明の前には、担体タンパク質及び担体タンパク質
サブユニットのタンパク質配列は知られていなかったの
で、サブユニットをコードするDNA 分子は知られていな
かった。ヒト組織の起源は全く確認されていなかった。
繊維芽細胞は、特性が決定されていない大きなSM結合性
タンパク質を少量産生することは分かっていた(Adams,
S.O.等、Endocrinology 、 115巻、520 〜526 頁、1984
年参照) 。肝臓は、ソマトメジンの主な起源であるが、
担体タンパク質を産生することは全く知られていなかっ
た。その上に、肝臓は、リボヌクレアーゼがあるためmR
NAを単離するのに用いることは困難である。血清中の担
体タンパク質の量は非常に少ない。したがって、mRNAは
まれである。担体タンパク質をコードするDNA 分子を含
有するゲノムは介在配列を含有している。これらの理由
とその他の理由のために、担体タンパク質様ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を単離しようとする通常の方法す
なわち、所望の分子を大量含有しているmRNAの起源を同
定し、そのmRNAからcDNAのライブラリーを作り、所望の
分子を有するcDNAと雑種形成するよう設計されたオリゴ
ヌクレオチドプーブでライブラリーをスクリーニングし
て、それらcDNA分子から遺伝子を単離するかあるいは組
立てるという方法には多くの落し穴があった。

【００１５】本発明は斯かる事情に鑑みてなされたもの
であり、純粋な担体タンパク質サブユニットを抗原とし
て使用したモノクローナル抗体とポリクローナル抗体と
を提供することを目的とする。

【００１６】本発明の他の目的は、純粋な担体タンパク
質サブユニットを利用して、ヒト体液中の遊離ソマトメ
ジンの濃度を測定する方法を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】請求項１に係るモノクロ
ーナル抗体は、ソマトメジン様ポリペプチドと結合でき
る担体タンパク質サブユニット以外の実質的に純粋な担
体タンパク質様ポリペプチドに対する抗体であることを
特徴とする。

【００１８】純粋な担体タンパク質サブユニットを抗原
としたので、現在は入手できないモノクローナル抗体が
産生される。

【００１９】請求項２に係るポリクローナル抗体は、ソ
マトメジン様ポリペプチドと結合できる担体タンパク質
サブユニット以外の実質的に純粋な担体タンパク質様ポ
リペプチドに対する抗体であることを特徴とする。

【００２０】純粋な担体タンパク質サブユニットを抗原
としたので、高い力価、高い親和性または高い阻止特性
を有するポリクローナル抗体が産生される。

【００２１】請求項３に係る遊離ソマトメジン濃度測定
方法は、ヒト体液中の遊離ソマトメジンの濃度を測定す
る方法において、ソマトメジン様ポリペプチドと結合で
きる担体タンパク質サブユニット以外の実質的に純粋な
担体タンパク質様ポリペプチドと複合したソマトメジン
を未結合のソマトメジンから分離することを特徴とす
る。

【００２２】担体タンパク質様ポリペプチドと複合した
ソマトメジンを未結合のソマトメジンから分離すること
ができ、ヒト体液中の遊離ソマトメジンの濃度を正確に
測定できる。

【００２３】

【発明の実施の形態】本願では以下の用語を使用する。 ソマトメジン様のもの：SM-C、SM-A、IGF-I 及びIGF-II
に限定されている訳ではないがこれらを含む、ヒトSM若
しくはインシュリン様成長因子の１つの生物活性を示す
ポリペプチド。そのポリペプチドは、天然のヒトSMのア
ミノ酸の外に他のアミノ酸を含有しているか、または天
然ヒトSMの全アミノ酸を含有していない。

【００２４】担体タンパク質：ヒト血漿中に存在する糖
タンパク質若しくは糖タンパク質複合体であって、SM様
ポリペプチドの結合を行う工程によって生体内でヒトSM
の生物活性を調節する性能を示し、成長ホルモン依存性
で、SMと複合すると生理的pH条件で約125,000 〜160,00
0 ダルトンの見掛けの分子量を示す。またこの担体タン
パク質は多形である。例えば、異なる個体の細胞は、原
型に、生理的には類似しているが、構造がわずかに異な
る担体タンパク質の種を産生する。

【００２５】サブユニット：ポリペプチドの断片、一
部、または大きなタンパク質ユニットの成分。サブユニ
ットという用語は、他の別個のポリペプチド連鎖と共有
結合もしくはその外の形態の結合で結合した別個のポリ
ペプチド連鎖という通常の意味に限定されない。

【００２６】担体タンパク質サブユニット：担体タンパ
ク質のサブユニットのクラス。ポリペプチド：ペプチド
結合で接続されたアミノ酸の線状連鎖。またポリペプチ
ドは、同じアミノ酸連鎖のシスティンの間に１つ又はそ
れ以上のジスルフィド結合をもっている。

【００２７】担体タンパク質様ポリペプチド：担体タン
パク質のヒトソマトメジン調節生物活性を示し、ソマト
メジン様ポリペプチドと結合できるポリペプチド。担体
タンパク質様ポリペプチドは担体タンパク質のソマトメ
ジン-C調節活性を示すものが好ましい。担体タンパク質
様ポリペプチドは、上記のソマトメジン調節活性をもっ
ている場合、ソマトメジン様ポリペプチドに結合できる
担体タンパク質サブユニットである。このポリペプチド
は、担体タンパク質又はこのような担体タンパク質サブ
ユニットのアミノ酸の外に１つ又はそれ以上のアミノ酸
を含有している。このポリペプチドは、担体タンパク質
若しくはこのような担体タンパク質のサブユニットのア
ミノ酸の全部を含有しているわけではない。というの
は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が削除されたか又は１
つの又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され
ているからである。したがって、担体タンパク質様ポリ
ペプチドは、アミノ酸残基が添加され、削除され若しく
は取替えられた、担体タンパク質若しくは担体タンパク
質サブユニットのアミノ酸配列をもっている。担体タン
パク質様ポリペプチドは、担体タンパク質の天然グリコ
シル化がなされているか、担体タンパク質の天然グリコ
シル化がないか、又は担体タンパク質の天然グリコシル
化とは異なるグリコシル化がなされている。したがっ
て、担体タンパク質様ポリペプチドは、担体タンパク質
の関連する天然グリコシル化がなされていない。このポ
リペプチドは、天然グリコシル化がなされている形態で
測定した場合、約40,000〜50,000ダルトン又はそれ未満
の分子量のものが好ましい。このポリペプチドは、前記
形態で測定した場合、約30,000ダルトン又はそれ未満の
分子量のものがさらに好ましい。

【００２８】ソマトメジン-C("SM-C" 若しくは"IGF-
I")：出生後の成長を調節する主要ホルモン。SM-Cは、G
Hの成長促進作用を仲介し、担体タンパク質と結合す
る。

【００２９】ヌクレオチド：糖の部分（ペントース）、
ホスファート及び複素環式塩基で構成されているDNA 若
しくはRNA のモノマー単位。その４つのDNA 塩基はアデ
ニン("Ａ")、グアニン("Ｇ")、シトシン("Ｃ")及びチミ
ン("Ｔ")である。４つのRNA塩基はＡ，Ｇ，Ｃ及びウラ
シル("Ｕ")である。

【００３０】DNA 分子：隣接するペントースの３′と
５′の炭素間をホスホジエステル結合で互いに接続され
たヌクレオチドの配列で構成された、全ヒトゲノム以外
の分子。DNA 分子は、ヒトゲノムの一部分である、ヌク
レオチドの単離された配列で構成されている。DNA 分子
は、単一のDNA 分子 (通常 "一重鎖DNA"と呼ばれてい
る) 、または相補的ヌクレオチドで構成されている２つ
のDNA 分子 (通常 "二重鎖DNA"と呼ばれている) で構成
されている。

【００３１】組換えDNA 分子：少なくとも２つのDNA 分
子を連結若しくは付加することによって得られる、少な
くとも１つのヌクレオチド配列を有するDNA 分子。

【００３２】ゲノム：細胞若しくはウイルスの全DNA 。
これは生物のポリペプチドをコードする遺伝子、オペレ
ーター、プロモーター及びリボソーム結合部位などの相
互作用部位をもっている。

【００３３】遺伝子：そのmRNAによって、特異的ポリペ
プチドのアミノ酸の配列をコードするDNA 分子。

【００３４】cDNA：RNA を鋳型として用いて第１DNA 鎖
をRNA 指向性合成法で合成し、次いでそのDNA 鎖を鋳型
として用いてDNA 指向性合成法で第２DNA 鎖を合成する
ことによって、RNA 分子から産生される二重鎖DNA 分
子。

【００３５】転写：遺伝子からmRNAを産生する工程。

【００３６】翻訳：nRNAからポリペプチドを産生する工
程。

【００３７】発現：転写と翻訳によってポリペプチドを
産生する工程。

【００３８】プラスミド：無傷の "レプリコン" を含有
する非染色体の二重鎖DNA 分子であり、その分子は宿主
内で複製される。プラスミドが単細胞生物内に置かれる
と、その生物の特性がそのプラスミドのDNA のために変
化する。プラスミドで形質転換された細胞は "形質転換
細胞" と呼ばれる。

【００３９】ウイルス：細胞若しくは生物に感染しう
る、タンパク質の外皮若しくはユート内のDNA 分子若し
くはRNA 分子。

【００４０】ファージ若しくはバクテリオファージ：細
菌ウイルス。

【００４１】ビヒクル又はベクター：プラスミド、ファ
ージ、哺乳類ウイルス、コスミドなどの、宿主を形質転
換しかつ宿主内で複製しうるDNA 分子であり、かような
DNA分子は、DNA の必須の生物機能、例えば複製、コー
トタンパク質の産生の損失、又はプロモーター若しくは
結合部位の損失なしに決定可能なしかたで切断される１
つ又はそれ以上の部位を有し、形質転換された宿主を同
定するのに適切なマーカー、例えばテトラサイクリン耐
性を有する。

【００４２】クローン化：１つのかような生物、細胞若
しくはDNA 分子由来の生物、細胞若しくはDNA 分子の集
団を得る工程。

【００４３】発現制御配列：遺伝子に操作して連結した
場合、遺伝子の発現を制御し調節するDNA 配列。これに
は次のものが含まれる。すなわち、lac 系、trp 系、ta
c 系、trc 系、ファージλの主要オペレーターとプロモ
ーターの領域、T7系、fdコートタンパク質の制御領域、
SV-40 の制御配列、アクチン系、メタロチオネイン系、
LTR(レトロウイルスの、プロモーターを含有する長い末
端の繰返し部分) 系、並びに真核細胞若しくは原核細胞
または生物とそのウイルス若しくはその結合体の遺伝子
の発現を制御することが知られているその外の配列であ
る。

【００４４】宿主、宿主生物又は宿主細胞：ビヒクル若
しくはベクターで形質転換されうる、真核細胞若しくは
原核細胞又は生物。

【００４５】担体タンパク質サブユニット この発明によれば、ソマトメジン様ポリペプチドに結合
できるヒト担体タンパク質サブユニットを入手すること
によって前記問題点が解決される。この発明の担体タン
パク質サブユニットのソマトメジン様ポリペプチドに結
合する性能は、これらのサブユニットが、生体外にて、
ほぼ生理的pH下でソマトメジン-Cに結合することによっ
て証明された。この結合活性は、この発明の担体タンパ
ク質サブユニットが、生体内で、ソマトメジン様ポリペ
プチドと結合し、天然の担体タンパク質の輸送と調節の
活性を実質的に与えることを証明した。本願で担体タン
パク質サブユニットがソマトメジン様ポリペプチドに結
合する性能に言及する際は、この性能が、前記のポリペ
プチドに生体外もしくは生体内で結合することを意味す
る。担体タンパク質サブユニットは、インシュリンと結
合する性能は実質的にもっていない。

【００４６】この発明の担体タンパク質サブユニットは
各々単一のポリペプチド鎖を構成している。この発明の
担体タンパク質サブユニットは、下記式（式中、Ｒはシ
ステイン若しくは半シスチン）で表されるＮ末端アミノ
酸分子をもっている。

【００４７】

【数１】

【００４８】半シスチンは、ジスルフイド結合によっ
て、同じポリペプチド鎖中の別の半シスチンアミノ酸に
結合したアミノ酸を意味する。担体タンパク質は多形で
あるから、担体タンパク質サブユニットのアミノ酸分子
も、その担体タンパク質の多形特性によって変化する。
例えば、担体タンパク質サブユニットは、Ｎ末端から５
番目の位置のアラニン ("Ala")の代わりにグリシン ("G
ly")残基をもっている。同様に、Ｎ末端から14番目の位
置にある Gluはphe で一部時々取替えられる。

【００４９】この発明の担体タンパク質サブユニット
は、ある範囲の分子量をもっている。本願に記載する担
体タンパク質サブユニットの分子量は、β−メルカプト
エタノール"BME" のような適切な還元剤の存在下で行わ
れる、分子量が公知のタンパク質に対してSDS-PAGEゲル
電気泳動法で測定した分子量である。公知のタンパク質
標準品は、200,000 〔ミオシン（Ｈ鎖）〕、97,400 (ホ
スホリラーゼｂ）、66,200 (ウシ血清アルブミン) 、4
3,000 (オボアルブミン) 、25,700 (αキモトリプシノ
ーゲン) 、18,400 (β−ラクトグロブリン）及び14,300
(リゾチーム) であった。分子量の約15,000、21,000、
26,000及び30,000ダルトンの担体タンパク質サブユニッ
トが単離され同定された。これらの担体タンパク質サブ
ユニットは分子量が異なる。というのは、これらは、担
体タンパク質中にその大きさのポリペプチドとして存在
しているか、又は、酵素による消化若しくは他の原因に
よって切断されるからである。これらの差異の原因が何
であっても、この発明の担体タンパク質サブユニット
は、分子量が約30,000又はそれ未満である。この発明の
担体タンパク質サブユニットとしては、分子量が約15,0
00から約30,000のものが好ましい。

【００５０】この発明の担体タンパク質サブユニット
は、過ヨウ素酸シッフ試薬に対する陽性反応と、アガロ
ースに架橋結合されたコンカナバリンＡ(Con-Aセフアロ
ース、ファーマシア社) と結合する性能によって分かる
ように、糖タンパク質である。Con-A セファロースに対
する結合性はグルコースとマンノースの残基を含有する
糖タンパク質に特有のものである。特異的残基は、α−
D-マンノピラノシルとα−D-グルコピラノシルの残基を
含有している。それ故に担体タンパク質サブユニットは
実質的にグリコシル化されている。

【００５１】またこの発明は、SM結合性を有する特に純
粋な担体タンパク質サブユニットを提供するものであ
る。この発明の担体タンパク質サブユニットは、特に、
他のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、多糖類、脂
質及び塩を含有していない。この発明によれば、ヒトと
動物の治療剤に、動物成長促進剤として用いたり、ヒト
などの動物診断剤とヒトなどの動物の研究用途に用いる
のに充分な純度でこれらのサブユニットを得ることがで
きる。

【００５２】またこの発明は、ソマトメジン様ポリペプ
チドに結合できる少なくとも１つの担体タンパク質サブ
ユニット若しくはその医薬として許容される塩、及び医
薬として許容される担体の有効量からなる治療様組成物
を提供するものである。このような治療様組成物の担体
タンパク質サブユニットは、少なくとも１つの特に純粋
な担体タンパク質サブユニットである。この発明の担体
タンパク質サブユニットの組成物は、SMの重要な生物学
的特性に関連する多くの治療用途をもっている。ヒト担
体タンパク質サブユニットを含有する組成物は、増大し
調節されていないSM依存性の成長に関連する疾患の治療
に有用である。したがって、結合によってSMを不活性化
する、この発明の担体タンパク質サブユニットの性能に
よって、いくつもの症状を新たに治療することができ
る。このような治療において、担体タンパク質サブユニ
ットの有効量は、生物学的に活性で調節されていないSM
が過剰に存在している際に、そのSMの活性を阻止若しく
は不活性化するのに充分な量であることは明らかであ
る。例えば、担体タンパク質サブユニットの有効量は、
モル基準で、生物学的に活性のSMの量の10倍以上であ
る。例えば、いくつも癌即ち繊維肉腫、軟骨肉腫及び肝
癌細胞系はSMを産生することが分かっている(De Larco
J.E.等、"A Human Fibrosarcoma Cell Line Producing
Multiplication Stimulating Activity "MSA"-related
Peptides" 、Nature、 272巻、 356〜358 頁、1978年参
照。) 乳癌と腎臓癌は、癌の増殖を自己刺激するSMを産
生する(Spencer E.M. 等、"Possible Auto-stimulation
Of Human Mammary Carcinoma GrowthBy Somatomedins"
、Annals New York Academy Sciences、 464巻、 448
〜449頁、1986年参照) 。内皮細胞と繊維芽細胞の増殖
もSMで刺激されるので、乳癌が産生するSMはパラ分泌と
して作用して、腫瘍の生存に重要な支持ストローマ組織
の増殖を刺激する(Bar R.S. 等、"Receptors For Multi
plication-stimulatingActivity on Human Arterial an
d Venous Endothelial Cells"、J. Clin. Endocrinol.
Metab. 、52巻、 814頁、1981年；Clemmons D.R. 等、
"Hormonal Control Of Immunoreactive Somatomedin Pr
oduction By Cultured Human Fibroblasts" 、J. Clin.
Invest.、67巻、10頁、1981年参照) 。この発明のヒト
担体タンパク質サブユニットを投与すれば、SMの作用を
阻止することによって、腫瘍の増殖速度を低下させ、さ
らに、悪性細胞を他の薬剤に対してより感受性にするこ
とが期待できる。

【００５３】また担体タンパク質サブユニットによる治
療は、糖尿病性増殖性網膜症の二次的症状の失明を防止
するのに役立つであろう。Spencer 等は、SM-Cが糖尿病
性網膜症の内皮と繊維芽細胞の増殖を刺激する因子の１
つであるようであることを示した〔Lorenzi, M. 、Spen
cer, E.M. 等、"Improved Diabatic Control, GrowthFa
ctors and Rapid Progression of Retinopathy"、New E
ngland Journal of Medicine 、 308巻、160 頁、1983
年；Ashton I.K. 等、"Plasma somatomedin indiabetic
s with retinopathy and joint contractures" (Spence
r, E.M.編集"Insulin-Like Growth Factors/Somatomedi
ns", Walter de Gruyter 中) 参照〕。SM-C (及び多分I
GF-IIも) のこの有害な作用を阻止する担体タンパク質
サブユニットの性能は、有用な新しい治療法になる。

【００５４】またこの発明の担体タンパク質サブユニッ
トは抗体を作るのに有用である。この発明によれば、純
粋な担体タンパク質サブユニットは、高い力価、高い親
和性若しくは高い阻止特性を有するポリクローナル抗体
と、現在は入手できないモノクローナル抗体とを産生す
る抗原として使用できる。これらの抗体は、イムノアッ
セイ、即ちアフィニティクロマトグラフィとイムノヒス
トケミストリーが、担体タンパク質の活性を阻止するた
めに特異的な測定をするのに利用できる。

【００５５】また担体タンパク質サブユニットは、体液
中のSMの遊離レベルを測定する第１の手順を行うのに利
用できる。この方法により、全SMだけしか測定できない
現在の方法が改良されるであろう。というのは、遊離レ
ベルは、実際に、SMの生物活性を決定するものだからで
ある。担体タンパク質サブユニットの抗体は、流体中の
遊離SMから、SM−担体タンパク質複合体を分離するのに
利用されるであろう。そのとき遊離のSMは、例えばRIA
で測定できる。

【００５６】またこの発明は、少なくとも１つのソマト
メジン様ポリペプチドと実質的に複合した少なくとも１
つの担体サブユニットからなる組成物を提供するもので
ある。このような組成物は、各種の治療用途をもってい
るであろう。SMは、多くの治療用途に潜在的に有用な生
物活性をもっている。

【００５７】しかし、血漿中に要求されるSMの定常レベ
ルを維持するためには、毎日多数の注射をしなければな
らない、というのはSMの半減期は遊離状態で１時間より
短いからである。この障害は大量投与で克服することは
できない、その理由は、(a)SMが皮下組織、筋肉組織及
び血管組織 (繊維芽細胞、内皮細胞、筋肉細胞、脂肪細
胞及び内皮細胞) に対して強い分裂促進因子であり、局
所組織の増殖を起こし、(b) 大量の遊離SMが低血糖症を
起こし、及び(c) 定常の血漿中濃度を維持するのに必要
なSMの過剰量は経費が効率的でないからである。

【００５８】SMは、この発明の担体タンパク質サブユニ
ットに複合させることによって、安全で有効な整理学的
な方法で、かつその半減期を有意に延長して、標的組織
に送ることができる。SM担体タンパク質サブユニット複
合体中のSMは、注射部位では分裂促進性ではなく、また
低血糖性でもない。この複合体は、制御され長期間にわ
たって吸収されるように製剤することができる。標的組
織に送られた後、解離してSMを放出する。したがって治
療は、生理的分配系に似ている。SM-C、IGF-II及び他の
ソマトメジン様ポリペプチドの治療及び酪農業の用途に
は、少なくとも１つのヒトソマトメジン様ポリペプチド
と少なくとも１つの担体タンパク質サブユニットの組成
物によって成功することができる。１つ又はそれ以上の
担体タンパク質サブユニットと１つ又はそれ以上のSMと
からなる組成物は、閉経後の骨粗しよう症、他の形態の
骨粗しよう症及びヒトGH欠損症のような疾患の治療と、
創傷の治療と、動物の成長の向上に有用である。かよう
な組成物は、SMを骨組織に送り、骨の増殖を刺激するの
に使用される。担体タンパク質サブユニット−SM複合体
からSMが解離すると、骨芽細胞を刺激して閉経後の骨粗
しよう症の場合に骨形成を増大し、補てつ関節の多孔質
のマトリックスに充満して補てつ具を安定化し、未結合
の骨折部の治癒を促進する。

【００５９】またソマトメジン様ポリペプチドと結合で
きる少なくとも１つの担体タンパク質サブユニット又は
その医薬として許容される塩、及び医薬として許容され
る担体の有効量からなる治療様組成物と、かような組成
物を用いる治療法は、自然治癒の機構若しくは応答が生
物学的に活性なソマトメジンが調節されたレベルで存在
することを必要とする傷害若しくは疾病を治療するのに
有用である。例えば、かような組成物は、自然の生理的
応答が創傷部位に内因性SMが存在することを必要とする
創傷の治癒に有用である。担体タンパク質サブユニット
の有効量は、内因性の生物学的に活性なソマトメジンの
半減期を延長するのに充分な量である。

【００６０】少なくとも１つの担体タンパク質サブユニ
ットとSM-Cの組成物は、酪農業での有効な生物分解性の
成長促進剤として使用することができる。現在、抗生物
質とステロイド剤は、商業上重要な動物成長促進剤であ
る。これら両者には重大な健康上の問題があるから、新
しい薬剤が求められており、特に生物分解性のものが要
望されている。GHが研究されている。が、しかしSM-C−
担体タンパク質サブユニット複合体の方がはるかに有効
である, というのは、SM-CがGHの成長促進作用の直接の
メディエータだからである。SM-Cは糖尿病誘発性でもな
く、脂肪分解性でもない。同じ理由が閉経後の骨粗しよ
う症にあてはまるので、SM-Cは、担体タンパク質サブユ
ニットを含有する組成物で投与されなければならない。

【００６１】これらのすべての理由から、担体タンパク
質様活性に必要なタンパク質構造を決定しようとする多
くの試みがなされてきた。しかしこの発明の担体タンパ
ク質サブユニットは同定され単離されたことはなく、純
粋な形態で単離されたこともない。

【００６２】この発明の他の態様は、(a) pHが約4.5 〜
7.5 の水溶液に可溶性のCohn画分IV-1の部分を、架橋デ
キストランのスルホプロピル誘導体の吸着剤のクロマト
グラフィに付して、pHを増大していく水溶液で連続溶離
を行い、(b) ソマトメジン結合活性を含有する段階(a)
から得た画分のpHが約4.0 より低い酸性溶液を段階(a)
と同じ吸着剤のクロマトグラフィに付してその通過画分
を集めるか、又は段階(a) で得た画分を、硫酸アンモニ
ウム約10％の中性溶液から吸着させることによって、ア
ガロースのフェニル誘導体のクロマトグラフィに付し
て、ほぼ中性のpHのもとで、約0.5Mチオシアン酸ナトリ
ウム溶液で溶離し、(c) ソマトメジン結合活性を有する
段階(b) からの画分をゲル濾過法のクロマトグラフィに
付して、酸性水溶液で溶離し、(d) ソマトメジン結合活
性を有する段階(c) から得た画分を、ほぼ中性のpHのも
とで吸着させることによって、実質的に純粋なソマトメ
ジン-Cに架橋させた固体支持体のクロマトグラフィに付
して、酸性水溶液で溶離し、次いで(e) ソマトメジン結
合活性を有する段階(d) で得た画分を逆相高性能液体ク
ロマトグラフィに付することからなる、ヒト血漿からヒ
ト担体タンパク質サブユニットを製造する方法である。

【００６３】組換えDNA と担体タンパク質様ポリペプチ
ドまたこの発明には、担体タンパク質様ポリペプチドを
コードするDNA 分子、組換えDNA 分子、ベクター、宿主
を、確認、同定及び単離すること、並びに担体タンパク
質様ポリペプチド、即ち担体タンパク質のソマトメジン
調節活性を示しソマトメジン様ポリペプチドに結合でき
るポリペプチドの産生にこれらの分子、ベクター宿主を
用いる方法が含まれる。この発明によって、治療用と診
断用の組成物及び方法に用いる担体タンパク質様ポリペ
プチドを得ることができる。この発明によれば、これら
のポリペプチドを、従来利用できなかった方法で多量に
製造できる。またこの発明には、特にこれらポリペプチ
ドの、より好ましくは、ヒト血漿中に天然に存在する他
のポリペプチドを全く含有していないものを製造するこ
とが含まれる。

【００６４】上記開示から明らかなように、この発明の
DNA 分子と組換えDNA 分子は、適切な宿主中で、担体タ
ンパク質様ポリペプチドの発現を指向することができる
遺伝子をもっている。また適切な宿主内でこれらのDNA
分子及び組換えDNA 分子を複製することによって、これ
らポリペプチドをコードする遺伝子を大量に製造するこ
とができる。したがって、これらのポリペプチド遺伝子
の分子構造と特性は容易に決定できる。これらポリペプ
チドと分子は、宿主内で産生されるとき、又は適切な修
飾の後、組成物と、これらの生成物自体の製造法を改良
する方法と、治療と診断の組成物と方法に用いる方法に
有用である。

【００６５】この発明の基本的な態様は、担体タンパク
質ポリペプチド、即ち担体タンパク質のソマトメジン調
節活性を示しソマトメジン様ポリペプチドに結合できる
ポリペプチドをコードする遺伝子からなるDNA 分子を提
供するものである。かようなDNA 分子は、全ヒトゲノム
ではないようにして単離された。かようなDNA 分子はイ
ントロンを含有しない方が好ましい。またかようなDNA
分子は、ヒトゲノムによってコードされている他のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を特に含有していないもの
が好ましい。かような遺伝子は、分子量が自然のグリコ
シル化によって生成する形態で測定される場合、約40,0
00〜50,000ダルトン若しくはこれより低い分子量を有す
るポリペプチドをコードするのが好ましい。かような遺
伝子は、担体タンパク質のソマトメジン調節活性とより
好ましくは担体タンパク質のソマトメジン-C調節活性を
示すポリペプチドをコードする。またこのような遺伝子
は、ソマトメジン様ポリペプチドに結合しうる担体タン
パク質サブユニット、より好ましくはソマトメジン-Cに
結合しうる担体タンパク質サブユニットである担体タン
パク質様ポリペプチドをコードする。

【００６６】またこの発明は、担体タンパク質を産生す
る細胞若しくは組織に見出されるmRNAからcDNA分子を製
造し、どのcDNA分子が、図６〜図８のDNA 配列に基づい
た１つ又はそれ以上の標識をつけたポリヌクレオチドプ
ローブと雑種形成を行うかを決定し、雑種形成したcDNA
分子を分析し、次いで担体タンパク質様ポリペプチドを
コードする遺伝子を有するDNA 分子を得ることからなる
DNA 分子の製造方法を提供するものである。この工程に
おいて、その遺伝子を有するDNA 分子は、他のcDNA分
子、合成DNA 分子、又は組換えDNA 分子と雑種を形成す
る１つ又はそれ以上のcDNA分子を連結することによって
得られる。前記プローブに雑種形成するcDNA分子は、ヒ
ト肝臓遺伝子ライブラリー、ヒト繊維芽細胞遺伝子ライ
ブラリー、ヒト胎盤ライブラリー、及びヒトの内皮のラ
イブラリーで構成されている群から選択されたcDNA分子
である。その方法において、標識をつけたポリヌクレオ
チドのプローブは図２に示すDNA 配列をもっている。ま
たこの発明には、その方法で製造されるDNA 分子と、そ
の方法で得られるDNA 分子によってコードされる担体タ
ンパク質様ポリペプチドをコードするDNA 分子とが含ま
れる。

【００６７】またこの発明は、担体タンパク質様ポリペ
プチドをコードするDNA 分子と選択的に雑種を形成する
DNA 分子LCP 、LCP 0.70、LCP 0.77、LCP 2.3 、LCP 2.
5 、FCP 1.8 及びFCP 2.5 のいずれか１つのDNA 配列の
すべて若しくは一部を有するオリゴメクレオチドプロー
ブを提供するものである。

【００６８】さらに、この発明のDNA 分子は、DNA 分子
のLCP 0.70、LCP 0.77、LCP 2.3 、LCP 2.5 、FCP 1.8
及びFCP 2.5 からなる群、DNA 分子のLCP 0.70、LCP 0.
77、LCP 2.3 、LCP 2.5 、FCP 1.8 及びFCP 2.5 のいず
れか１つと雑種を形成し、担体タンパク質様ポリペプチ
ドをコードするDNA 分子、並びに前記DNA 分子のいずれ
か１つによってコードされるポリペプチドをコードする
DNA 分子から選択される。好ましいDNA 分子は、LCP 2.
3 の担体タンパク質関連部分であるDNA 分子を含有して
いる。他の組換えDNA 分子は、LCP 2.3 の担体タンパク
質関連部分であるDNA 分子と、LCP 2.3 の前記の部分で
コードされるポリペプチドをコードするDNA 分子とを含
有している。

【００６９】さらに、この発明のDNA 分子は、図６〜図
８のアミノ酸−１〜290 の配列、図６〜図８のアミノ酸
１〜290 の配列、又は図６〜図８のアミノ酸27〜290 の
配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有し
ている。またDNA 分子は、図６〜図８のアミノ酸27〜29
0 の配列を有し、かつアミノ酸27に先行してメチオニン
残基を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有し
ている。

【００７０】またDNA 分子はアミノ酸27〜290 の配列を
有し、かつ宿主によって認識される分泌、シグナル若し
くはその外の前駆物質の配列を構成し、アミノ酸27に先
行するアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有している。

【００７１】これらのDNA 分子は、かようなDNA 分子
が、操作によって、発現制御配列に連結されている組換
えDNA 分子を構築するのに用いられる。好ましくはかよ
うな組換えDNA 分子は、ベクター若しくはビヒクルを構
成している。この発明は、かようなDNA 分子をベクター
に導入することからなるベクターの製造方法を提供する
ものである。その方法には、そのDNA 分子の発現を制御
及び調節するために、前記ベクターに発現制御配列を導
入する付加工程が含まれている。その発現制御系は、La
c 系、trp 系、tac 系、trc 系、T7系、ファージλの主
要オペレーターとプロモーターの領域、fdコートタンパ
ク質の制御領域、SV-40 の制御配列、アクチン系、メタ
ロチオネイン系、LTR(レトロウイルスのプロモーターを
含有する長い末端の繰返し) 系、並びに遺伝子、真核細
胞若しくは原核細胞及びそのウイルス及びその結合体の
発現を制御する他の配列である。

【００７２】この発明の組換えDNA 分子とベクターは、
宿主中で担体タンパク質様ポリペプチドを産生すること
ができる。またこの発明には、これらの組換えDNA 分子
若しくはベクターの少なくとも１つで形質転換される宿
主が含まれる。形質転換される宿主は、イー・コリ(E.
coli) 、シュードモナス属(Pseudomonas) 、バシラス・
サチリス(Bacillus subtilis) 、バシラス・ステアロサ
ーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) の菌株、
他の細菌、酵母、真菌、動物、昆虫若しくは植物の宿主
及びヒトの組織細胞である。

【００７３】この発明は、適切な宿主をかような組換え
DNA 分子若しくはベクターで形質転換し、次いでその宿
主を培養して前記のポリペプチドを製造する段階からな
る担体タンパク質様ポリペプチドの製造方法を提供する
ものである。この方法には、前記ポリペプチドを集める
追加の段階が含まれている方が好ましい。この方法にお
いて、宿主は、イー・コリ、シュードモナス、バシラス
・サチリス、バシラス・ステアロサーモフィラスの菌
株、他の細菌、酵母、真菌、動物、昆虫若しくは植物の
宿主及びヒトの組織細胞である。またかようなポリペプ
チドの製造方法は、かような組換えDNA 分子若しくはベ
クターで形質転換された宿主を培養する段階で構成され
ている。

【００７４】またこの発明は、上記の組換えDNA 分子若
しくはベクターによって、発現についてコードされてい
るポリペプチドを提供するものである。

【００７５】また、この発明は、ソマトメジン様ポリペ
プチドに結合しうる担体タンパク質サブユニット以外の
特に純粋な担体タンパク質様ポリペプチドを提供するも
のである。かような特に純粋なポリペプチドは、ヒト血
清中に天然に存在している物質を特に含有していない方
が好ましい。かようなポリペプチドは、成熟した担体タ
ンパク質様ポリペプチドである。かような成熟したポリ
ペプチドは、分泌、シグナル若しくは他の前駆物質の配
列を構成するアミノ酸残基が削除されているポリペプチ
ドである。

【００７６】この発明は、図６〜図８のアミノ酸−１〜
290 の配列を有する特に純粋なポリペプチドを提供する
ものである。

【００７７】またこの発明は、図６〜図８のアミノ酸１
〜290 の配列を有する特に純粋なポリペプチドを提供す
るものである。この発明には、アミノ酸27〜290 の配列
と、アミノ酸27より先行するメチオニン残基を有するポ
リペプチドが含まれる。さらにこの発明は、図６〜図８
のアミノ酸27〜290 の配列を有する特に純粋なポリペプ
チドを提供するものである。

【００７８】この発明には、ポリペプチドが担体タンパ
ク質様ポリペプチドのままで残っている限りは、１つ又
はそれ以上のアミノ酸残基が付加されるか又は削除され
るか又は取替えられている配列27〜290 を有するポリペ
プチドが含まれる。

【００７９】この発明には、図６〜図８のアミノ酸−１
〜290 の配列を有するポリペプチド、及びその配列の一
部と、担体タンパク質のソマトメジン調節活性とを有
し、ソマトメジン様ポリペプチドに結合しうるポリペプ
チドが含まれる。

【００８０】またこの発明は、担体タンパク質の天然の
グリコシル化を欠く担体タンパク質様ポリペプチドを提
供するものである。 またこの発明は、前記の少なくと
もひとつの担体タンパク質様ポリペプチド若しくはその
医薬として許容される塩及び医薬として許容される担体
の有効量からなり、先端巨大症におけるソマトメジン-C
の作用を阻害し、糖尿病網膜症において網膜の血管と繊
維組織の増殖を阻害し、長身小児の成長を阻害し、ケロ
イド瘢痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出症において眼の
眼窩内の組織の増殖を阻害し、又はヒト若しくは動物の
創傷の治癒を刺激する治療用組成物である。この発明に
は、前記組成物の有効量を投与することからなり、ソマ
トメジン依存性癌の増殖を阻害し、先端巨大症における
ソマトメジン-Cの作用を阻害し、糖尿病網膜症において
網膜の血管と繊維組織の増殖を阻害し、長身小児の成長
を阻害し、ケロイド瘢痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出
症において眼の眼窩内の組織の増殖を阻害し、又はヒト
若しくは動物の創傷の治癒を刺激する方法が含まれる。

【００８１】またこの発明には、少なくとも１つのソマ
トメジン様ポリペプチドと実質的に複合した前記の少な
くとも１つの担体タンパク質様ポリペプチドを含有する
組成物が含まれる。かような組成物は、かような組成物
の有効量からなり、ヒトの骨粗しよう症を治療し、骨の
増殖を刺激し、動物の成長を刺激し、ヒトと動物の創傷
の治療を刺激し、又は成長ホルモン欠損症の患者の成長
を刺激するのに用いる治療用組成物に使用される。又か
ような組成物は、かような組成物の有効量を投与するこ
とからなる前記症状の治療方法に用いられる。

【００８２】この発明は、発現制御配列に連結された前
記担体タンパク質様ポリペプチドをコードする遺伝子を
含有するDNA 分子と、発現制御配列に操作で連結された
ソマトメジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有
するDNA 分子とを有する組換えDNA 分子を提供するもの
である。宿主は、少なくとも１つの上記組換えDNA 分子
で形質転換されて、両種のポリペプチドを産生できるよ
うになる。

【００８３】また単一のベクターが、前記の少なくとも
１つの担体タンパク質様ポリペプチドをコードするDNA
分子と、発現制御配列に各々操作で連結されたソマトメ
ジン様ポリペプチドをコードするDNA 分子とを含有する
ように構築される。宿主はこのようなベクターで形質転
換される。担体タンパク質様ポリペプチドとソマトメジ
ン様ポリペプチドの複合体からなる組成物の製造方法に
は、適切な宿主をかようなベクターで形質転換し、前記
宿主を培養して前記ポリペプチドを製造することが含ま
れる。その方法にはポリペプチドを集める追加の段階を
含めてもよい。その方法は、かようなベクターで形質転
換された宿主を単に培養することで構成されていてもよ
い。またかような組成物の製造方法には、前記の担体タ
ンパク質様ポリペプチドをコードするDNA 分子を有する
少なくとも１つの組換えDNA 分子若しくはベクターで適
切な宿主を形質転換し、かような宿主を、ソマトメジン
様ポリペプチドをコードするDNA 分子を有する少なくと
も１つの組換えDNA 分子若しくはベクターで共形質転換
し(co-transforming) 、次いでかような宿主を培養し
て、両種のポリペプチドを産生させることが含まれる。
またこの発明には、かような各種類の組換えDNA 分子若
しくはベクターの少なくとも１つで形質転換された宿主
が含まれる。

【００８４】最後にかようなポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体とポリクローナル抗体が製造される。ま
たこの発明のポリペプチドは、そのポリペプチドと複合
したソマトメジンを、未結合のソマトメジンから分離す
ることからなるヒトの体液中の遊離ソマトメジンの濃度
の測定法に使用できる。

【００８５】ソマトメジン結合活性の検定法 ソマトメジン結合活性は、リガンドとして、放射能標識
をつけた ¹²⁵I-SM (SM-C又はIGF-II) を用いるタンパク
質結合活性検定法で測定した。結合した ¹²⁵I-SMの量を
標準製剤のそれと比較する。

【００８６】標準物は、10名の正常な提供者から得たヒ
ト血清を集めたものをゲル濾過することによって調整し
た。血清35mlを4N酢酸35mlに添加した。清澄になった
後、試料を、1M酢酸で平衡化したセファデックスG-50
(５×100cm) (分画範囲1,500 〜30,000) を用い流速80m
l／hrのクロマトグラフィに付した。 ¹²⁵I-SM-Cを用い
て、全画分のソマトメジン結合活性を検定した。その結
合活性はKd０〜0.4 に現れた。これらの画分を凍結乾燥
し、1M酢酸に再溶解し、再度クロマトグラフィに付して
結合SMの全痕跡を除いた。最終の粉末を35mlの0.1Mリン
酸緩衝液pH7.0 に再溶解し、 100μl づつに分けて−26
℃で貯蔵した。各結合活性の検定に、この物質１本づつ
を、任意に1.0U/ml の値を与えて対照物として使用し
た。

【００８７】この検定法はZapf等が報告した方法である
〔"Serum Levels of the Insulin-like Growth Factor
(SM) and its Carrier"、Acta Endocrinol.、95巻、 50
5〜517 頁、1980年参照〕。例えば担体タンパク質サブ
ユニットがまだSMと複合している場合、両者を、1M酢酸
を用いるセファデックスG-50クロマトグラフィ(0.9×11
0cm)によって分離した。次いで、結合活性のピーク (Kd
１−0.4)部分を凍結乾燥し、検定緩衝液で再構成し、試
験した。結合SMを含有していなかった試料について、そ
の試料を検定緩衝液に対し透析して直接試験するか、又
は結合活性の濃度が低い場合は0.1M酢酸に対し透析し、
凍結乾燥し、少量の検定緩衝液に溶解した。検定緩衝液
は、予め試験をして競合する活性体が含有されていない
ことを確認した0.2 ％のヒト若しくはウシの血清アルブ
ミンを含有する0.1Mリン酸ナトリウムpH7.0 緩衝液であ
った。SM-C若しくはIGF-IIをSpencer の方法でヨウ素化
した(Grecr, E.O.、E.M. Spencer等、"Serum Somatomed
in Response to Human Growth Hormone Infusion in Pa
tients with Piabetes Mellitus ; Correlation withth
e Degree of Control of Diabetes" 、Am.J. Med. Sci.
、 287巻、７〜10頁、1984年参照) 。試料と標準物の
連続希釈物 (２倍若しくは４倍）を３回づつ検定した。
検定管には、 100μl の ¹²⁵I-SM、20,000cpm と 200μ
l の試料を入れた。室温において２時間インキュベート
することによって満足すべき結果が得られたが、検定は
４℃で16時間行った。結合した ¹²⁵I-SMを、炭素抽出法
で遊離物から分離した。２％の活性炭を含有する。１％
ヒト（又はウシ) アルブミンの0.1Mリン酸緩衝液pH7.0
の氷冷溶液0.8ml を添加し、その試験管を４℃で15′間
遠心分離した。遠心分離後、上澄液を計数した。結合し
たcpm 値を線量の対数値に対してプロットしたが、未知
物の濃度は1.0U/ml の値を与えられた標準品の濃度に関
連していた。結合の特異性は、標識をつけていないSMの
大過剰とともに試料をインキュベートすることによって
測定した。

【００８８】他のソマトメジン結合検定法 ドット−ブロット (Dot-blot) 検定法とウェスターン法
もポリペプチドの存在をソマトメジン結合活性によって
測定するのに使用することができる。

【００８９】ドットブロットの"Binding In Wells"法 ニトロセルロース膜と3-MM濾紙を最初に水中に入れ、次
にPBS(10mM NaPO₄、pH7.2 、0.15M NaCl)中に20〜30分
間浸漬した。濾紙の上に膜を置いて、両者をドットブロ
ット装置の上に置いた。ドットブロット装置はメーカー
(Bio-Rad) の説明書にしたがって組立てて固定した。ド
ットブロット装置には96個のウエルがあり、多数の試料
を同時に処理するのに非常に便利である。ウエルを 200
μl のPBS ですすぐ。担体タンパク質様ポリペプチドを
PBS で希釈して適切な濃度にし、全体積を50μl ／ウエ
ルにする。対照とブランクのウエルには夫々、BSA(ウシ
血清アルブミン) を入れるか若しくはタンパク質なしに
する。試料をウエルに入れ、膜を重力で通過させる。タ
ンパク質の膜への結合は30〜60分以内に完了する。膜を
200μl ／ウエル１％BSA 含有PBS でブロックし、この
液を重力で30分間流動させ、その際、膜を通じて減圧で
"吸引(pull)" する。ウエルを、 100μl のTBS(50mM
トリス−HCl pH7.5、0.15M NaCl)、 0.1％ツイーン20
で３回洗浄する。 ¹²⁵I-SM-C (20,000〜200,000cpm) を
50μl PBS ／ウエル中に添加する。装置をParafilmでし
っかりと覆い、1.5 〜２時間、４℃に保持する。この段
階でSM-Cの担体タンパク質様ポリペプチドとの結合が行
われる。装置を分解し、膜を大量のTBS ；TBS 、 0.1％
ツイーン20；及びTBS で洗浄する。各洗浄はゆるやかに
振盪しながら４℃で15分間行う。膜を風乾し、増感スク
リーン付きのコダックX-Omat AR フィルムに−70℃で１
〜６時間露光させる。

【００９０】ドットブロットの"Binding In Bab"法 膜の前処理、ドットブロット装置の組立て、及びタンパ
ク質の膜への結合を上記と同様に行った。タンパク質を
膜に結合させた後、ドットブロット装置を分解し、膜を
風乾した。風乾した膜を皿にとり、ゆっくり振盪しなが
ら４℃にて、次の溶液：TBS ＋３％NP40で30分間；TBS
＋１％BSA で１時間；TBS ＋ 0.1％ツイーン20で10分間
洗浄する。得られた膜を、６〜 10ml の結合溶液(TBS、
１％BSA、0.1 ％ツイーン20) の入ったバッグ内に入れ
る。 ¹²⁵I-SM-C (２〜20ミリオンcpm)を添加し、ゆっく
り振盪しながら、４℃にて２時間又は一夜進行させる。
この段階でSM-Cが担体タンパク質様ポリペプチドに結合
する。その膜を、大量のTBS, 0.1％ツイーン20で２回洗
浄し、TBS だけで２回洗浄する。洗浄は各々15分間づつ
４℃でゆっくり振盪しながら行う。膜を風乾し、増感ス
クリーン付きのコダックX-Omat AR フィルムに−70℃で
５〜16時間露光させる。

【００９１】ウェスターン法 担体タンパク質様ポリペプチドを含有するタンパク質の
試料をポリアクリルアミド-SDSゲルに加えて展開する。
通常12％のゲルが用いられるが、これは10,000〜70,000
ダルトンのタンパク質を良好に分離できる。分離は電気
泳動法で行う。次にゲル中のタンパク質をニトロセルロ
ース膜にブロットし、得られた膜を37℃で５分間風乾燥
する。結合タンパク質を含有するその膜を、TBS ＋３％
NP40で４℃にて30分間すすぐ。膜の非特異的部分を１％
BSA 含有TBS で４℃にて２時間ブロックする。膜をTBS
＋ 0.1％ツイーン20で４℃にて10分間すすぐ。膜を、６
−10 ml TBS 、１％BSA 、 0.1％ツイーン20＋500,000c
pm ¹²⁵I-SM-Cの入ったバッグ中に入れることによって、
¹²⁵I-SM-Cでプローブする。膜を一夜４℃でゆっくり振
盪して、SM-Cと、膜に固定された担体タンパク質様ポリ
ペプチドとの結合を行う。得られた膜を、TBS ＋ 0.1％
ツイーン20で２回各々15分間づつ、TBS で３回各々15分
間づつ洗浄する。膜を風乾し、増感スクリーン付きコダ
ックX-OmatARフィルムに−70℃にて５〜16時間露光させ
る。

【００９２】担体タンパク質サブユニットの血漿からの
製造方法 担体タンパク質サブユニットの製造の手順はCohn画分IV
-1で開始した。これは、約10％の血漿タンパク質と、も
との血漿担体タンパク質活性の40％を含有するヒト血漿
の画分である。それは黄緑色のペーストで、固形分が約
35％であり、固形分の大部分は変性された不溶性のタン
パク質と糖タンパク質である。このペーストは、１kg当
たり約10mgの担体タンパク質を含有している。

【００９３】下記の検定緩衝液はすべて、特にことわら
ない限り、次の酵素阻害剤を含有させた。すなわち、１
ミリモル("mM")のフェニルメチルスルホニルフルオリド
("PMSF")、１mMのN-エチルマレイミド("NEM") 、及び１
mMエチレンジアミン四酢酸("EDTA")である。担体タンパ
ク質は固有のプロテアーゼ活性を有し、少なくともひと
つの他の血漿プロテアーゼが、アフィニティークロマト
グラフィの段階によって共精製(co-purify) されたので
酵素阻害剤は必須のものである。

【００９４】実施例１ (a) イオン交換クロマトグラフィ 画分IV-1を１kgのバッチで処理した。１kgの画分IV-1
を、酵素阻害剤を含有する40mM酢酸アンモニウム−酢酸
溶液pH5.65の10l 中に添加し、一夜４℃で撹拌した。生
成した懸濁液を遠心分離し、上澄み液を、10,000MW半透
膜を用いる限外濾過法で約１l に濃縮した。

【００９５】濃縮液全体を、40mM酢酸アンモニウム−酢
酸緩衝液(pH5.65)で予め平衡化した架橋デキストランの
スルホプロピル誘導体(SP-セファデックス、ファーマシ
ア社) を充填した４℃の10×25cmカラムに注入した。そ
のカラムを、まず５l の同じ緩衝液で洗浄し、次いで10
l の50mM酢酸アンモニウム(pH6.8) で洗浄し、最後に２
l の50mM酢酸アンモニウム−アンモニア(pH9.6) で洗浄
した。得られたpH9.6の溶出液を集めて凍結乾燥した。
結合検定法で測定した、凍結乾燥物質のSM結合活性の回
収率は20％であった。これは約10倍の精製度であった。

【００９６】(b) 疎水性相互作用クロマトグラフィ SM結合活性を有する凍結乾燥生成物を、10％硫酸アンモ
ニウムと50mMトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン("トリス")−ヒドロクロリド("トリス−HCl") pH7.5
とを含有する緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対して透析
して、フェニルアガロースカラム (フェニル−セファロ
ース、ファーマシア社）に注入した。そのカラムをまず
１l の同じ緩衝液で溶離し、次に0.5Mのチオシアン酸ナ
トリウム("NaSCN") を含有する50mMトリス−HCl pH7.5
の２l で溶離し、最後に50mMトリス(pH9.0) の２l で溶
離した。溶出画分を集め、280nM でのUV吸光度を測定
し、結合検定法でSM結合活性の試験を行った。SM結合活
性はNaSCN 画分に現れた。その画分を凍結乾燥し、蒸留
水に対して透析した。かなりの量の沈澱が現れ、上澄み
液から分離した。この段階では、20倍の精製度で回収率
が70％であった。

【００９７】(c) ゲル濾過 得られた上澄み液を凍結乾燥し、0.5M酢酸に溶解し、5,
000 〜230,000 の分画範囲を有する架橋デキストランゲ
ル (セファデックスG-150 、ファーマシア) の２×100
カラムのクロマトグラフィに付した。SM結合活性を有す
る画分を集めた。SM結合活性の回収率は結合検定法で80
〜90％であり、５倍の精製度であった。

【００９８】(d) アフィニティークロマトグラフィ まずSM-Cアフィニティーカラムを、アガロースのヒドロ
キシスクシンイミジル誘導体(Affi-Gel 15、BioRad)
に、ヒト血漿から予め精製して調整したSM-C(Spencer,
E.M.編集、Insulin-Like Growth Factors/Somatomedin
s、Walter de Gruyter 1983年の81頁のSpencer 等の報
告参照) をpH8.0 、25℃にて２時間かけて結合させて製
造した。先の段階で得た、合した担体タンパク質画分
を、0.1Mリン酸ナトリウムpH7.0 に対して透析し、SM-C
アフィニティカラムに注入した。同じ緩衝液の15mlで洗
浄した後、SM結合活性体を10mlの0.5M酢酸で溶離して凍
結乾燥した。

【００９９】得られたSM結合活性体を、次に、分画範囲
が4,000 〜90,000で、0.5M酢酸にて平衡化した可及デキ
ストランゲル (セファデックスG-100 、フエーマシア
社) のクロマトグラフィに付した。SM結合検定法で判明
した活性を有する画分を凍結乾燥した。

【０１００】(e) 高性能液体クロマトグラフィ("HPLC") 上記の凍結乾燥物質を、ブチルシラン〔Vydak C4 RP
(逆相) 〕のカラムを用いるHPLCのクロマトグラフィに
付した。SM結合活性体を、0.1 ％トリフルオロ酢酸("TF
A") によるアセトニトリル０〜60％線状勾配液で溶離し
た。SM-C結合活性のシャープなピークが39％のアセトニ
トリルに出現し、これを集めた。このピークのSM結合活
性は、12.5％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動("SDS-PAGE")に付して銀染料(Biorad)
で染色したところ単一のバンドとして出現した。

【０１０１】単離した担体タンパク質サブユニットは、
β−メルカプトエタノールの存在下のSDS-PAGEで約26kD
a の分子量を示した。担体タンパク質サブユニットの全
収率は、もとの結合活性の４％であった。

【０１０２】この担体タンパク質サブユニットのＮ末端
アミノ酸分子を、Hunkapillar とHoodの方法(Methods i
n Enzymology、91巻、486 頁、1983年) で、自動化され
た気相配列決定装置(Beckm- an 6300)を用いて測定し
て、次の配列であることが分かった。 Gly-Ala-Ser-Ser-Ala-Gly-Leu-Gly-Pro-Val- Val-Arg-R-Glu-Pro-R-Asp-Ala-Arg-Ala- Leu-Ala-, ただし配列中のＲはシスティン又は半シスチンを示す。

【０１０３】この担体タンパク質サブユニットは ¹²⁵I-
SM-Cと結合し、過ヨウ素酸シッフ("PAS") で染色するこ
とによって、グリコシル化されていることが分かった。

【０１０４】実施例２ (a) イオン交換クロマトグラフィ １kgのCohn画分IV-1を、阻害剤（１mM EDTA 、１mM NE
M、0.1mM PMSF及び１ mg/l アプロチニン) を含有する4
0mM酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液pH5.65の４lで、一夜
40℃にて抽出した。得られたタンパク質溶液を9,000 ×
g で30分間遠心分離し沈澱を上澄み液から分離した。得
られた沈澱を、４l の上記緩衝液で４時間再抽出した。
両方の抽出で得られた上澄み液をいっしょにした。

【０１０５】この上澄み液を、上記緩衝液で４℃にて平
衡化したSP−セファデックスカラム(2000ml 樹脂) に注
入した。注入後、Ａ₂₈₀ が1.0 以下に低下するまで、カ
ラムを同じ緩衝液で洗浄した。さらに、Ａ₂₈₀ が1.0 以
下になるまで、カラムを阻害剤を含有する50mM酢酸アン
モニウム緩衝液pH6.8 で洗浄した。次にSM結合活性体
を、阻害剤を含有する60mM酢酸アンモニウム−アンモニ
ア緩衝液pH9.6 で溶離した。最後に、カラムを、1.0M N
aCl を含有する60mM酢酸アンモニウム−アンモニアpH9.
6 で洗浄した。

【０１０６】１kgのCohn画分IV-1からの抽出物は、約5,
000 単位のSM−結合活性体を与えた。結合検定法で測定
した結果、pH9.6 の画分で、約7.5 ％の活性体が回収さ
れた。その画分の重量は約5.5gであった。

【０１０７】(b) イオン交換クロマトグラフィ 上記のカラムから得たpH9.6 画分を、阻害剤(0.1mM EDT
A 、PMSF、NEM 及び１mg/l アプロチニン) を含有する1
M酢酸溶液の130ml に溶解した。この溶液を、同じ緩衝
溶液に対して、一夜４℃にて透析し、同じ緩衝液で予め
平衡化した５×40cmSP−セファデックスカラムに注入し
た。Ａ₂₈₀ が約0.2 になるまでカラムを洗浄し、次に、
阻害剤を含有する60mMの酢酸アンモニウム−アンモニア
pH9.6 で溶離した。SM結合活性体は通過画分中にあり、
その通過画分は４℃で蒸留水に対して一夜透析し、いく
らかの変性タンパク質を沈澱させたものである。透析
後、沈澱を、9,000 ×g で30分間遠心分離し、上澄み液
を凍結乾燥した。可溶性通過画分中のSM結合活性体を定
量的に回収し、一方SM-CをpH9.6 画分で回収した。

【０１０８】(c) ゲル濾過 SM結合活性を有する画分の一部(0.33g) を次いで最少量
の0.5M酢酸溶液に溶解し、同じ条件で予め平衡化した2.
5 ×100 cmのセファデックスG-100 カラムに注入した。
カラムを0.5M酢酸で溶離した。５mlづつの画分のＡ₂₈₀
とSM結合活性を測定した。活性を示すこれらの画分を合
して凍結乾燥した。この段階での精製は５倍であり、SM
結合活性体を定量的に回収した。いくつかの試験では全
物質を処理する必要があった。

【０１０９】(d) アフィニティクロマトグラフィ 上記段階で得た結合活性を有する画分80mgを、阻害剤を
含有する0.1Mリン酸緩衝液, pH7.0 の40mlに溶解し同じ
緩衝液に約４時間透析した。透析後、得られた溶液を３
mlのSM-Cアフィニティカラムの樹脂と混合した。その混
合物を４℃で一夜ゆっくり撹拌して結合を増大させた。
得られた樹脂を、カラムを通過させてタンパク質溶液か
ら分離した。カラムをまず50mlのリン酸緩衝液で洗浄
し、次に0.5Mの酢酸で溶離した。SM結合活性体 (約10単
位) を真空遠心分離器 (Speed-VacConcentrator, Savan
t Instruments) で乾燥した。

【０１１０】(e) HPLC 回収されたSM結合活性体10単位を１mlの0.1 ％TFA 溶液
に溶解した。その試料をVydak C4 RP カラムに注入した
後、カラムを０〜60％アセトニトリル勾配液で60分間溶
離した。担体タンパク質のピークが約39％のアセトニト
リルに出現し、これを集めて凍結乾燥した。SM結合活性
体を定量的に回収したが、約60μg であった。

【０１１１】そのSM結合活性体は、銀染色後、SDS-PAGE
上に分子量が約15kDa の単一バンドとして出現した。こ
の実施例の全収率は約３％であった。

【０１１２】純粋な担体タンパク質サブユニットの比活
性は４μg/単位と測定された (但しその１単位とは、上
記のように、正常な10名の男性と女性の集団から得た標
準血漿１ml中の量である) 。

【０１１３】Ｎ末端分子の決定については、SM結合活性
体を、変性し、4Mグアニジン−HCl、0.5Mトリス−HCl(p
H8.6)及び0.7 ％β−メルカプトエタノールで一夜還元
した。ヨードアセトアミドを溶液に添加した。反応を暗
所で１時間行い、TFA を0.1％まで添加して反応を停止
させた。得られた反応混合物をHPLCカラムに注入し、前
記のようにして、カルボキシアミドメチル化担体タンパ
ク質サブユニットを回収し、Ｎ末端分子分析に用いた。
その分析結果は、実施例１に記載したのと同じＮ末端ア
ミノ酸分子を示した。

【０１１４】実施例３ 担体タンパク質サブユニットを、ゲル濾過法(c) によっ
て実施例２と同様にして精製した。SM結合活性を有する
得られた試料の一部の30mgを0.1 ％TFA 溶液に溶解し、
分取Vydak C4RPカラムに注入した。そのカラムを０〜60
％アセトニトリル勾配液で60分間溶離した。約39％のア
セトニトリルで溶離されたSM結合活性体を集め凍結乾燥
した。SM結合活性体を定量的に回収した。

【０１１５】得られた試料を、次に、β−メルカプトエ
タノールを含有するトリス−グリシン緩衝液に再懸濁さ
せ、SDS-PAGE(12.5 ％ポリアクリルアミド) で分離し
た。15、21、26及び30kDa の担体タンパク質サブユニッ
トに対応するバンド (これらは各々ウエスタンブロット
の標識をつけたSMと結合している) をゲルから切取り、
タンパク質をトリス−グリシン緩衝液中に電気溶離を行
った。各担体タンパク質サブユニットを凍結乾燥し、回
収率は定量的であった。

【０１１６】実施例４ 創傷の治癒を増大するSM担体タンパク質サブユニットの
抗力を測定するよう企図した実験を次のように行った。
６頭の麻酔をかけた300g体重雄Sprague-Dawleyラットの
各々の、背中の４分円の各々に、Schilling-Huntワイヤ
メッシュを巻いたシリンダーを、皮下(S.C.)移植した。
内径が20×5.8mm で堆積が 520μl の円筒形チャンバー
は、ステンレス鋼ワイヤメッシュで作製した。一方端は
ワイヤメッシュでシールし、他方端をシラスティックの
ディスクでシールした。移植後、創傷治癒の一般的な進
行が起こった。即ち、血管に血栓が生じ、次いで多形核
白血球、マクロファージ及び繊維芽細胞がワイヤメッシ
ュを通じて移動し、次に繊維増殖、コラーゲン合成及び
脈管形成が起こった。このプロセス中、中空のチャンバ
ー内に集まった創傷液をサンプリングするか、又はこの
液に活性試薬を注射した (シラスティックのディスクを
通じてS.C.) 。ほとんどのものが移植後17日で治癒が完
了した。しかし中央の空洞は完全にはなくならなかっ
た。

【０１１７】15kDa のSM担体タンパク質サブユニット
を、0.1 ％のウシアルブミンを含有するPBS(150mM の塩
化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)に溶解し
た。創傷のチャンバーにこの溶液100 μl (1.4μg の15
kDa の種を含有している) を12時間毎に注射した。この
量は、生物学的に活性なソマトメジンの量のわずかに過
剰な量にして、存在するソマトメジンの半減期を増大す
るように選択した。17日後、創傷シリンダーを取出し、
繊維組織を、各シリンダーから注意深くかきおとした。
15kDa の担体タンパク質サブユニット物質を注入したシ
リンダーは、すべて、対照よりかなり大きい密な繊維組
織が充満していた。具体的に述べれば、15kDa の担体タ
ンパク質サブユニットを含有する創傷チャンバーには1
9.5±７(SD)mgのタンパク質が沈積し、一方、対照のチ
ャンバーには 7.0±1.6mg が沈積した。DNA 合成を担体
タンパク質サブユニットを含有するチャンバーの方がは
るかに大きかった (対照の 380±15μg に対して1160±
200μg であった。) 同様に、ヒドロキシプロリンの濃
度 (コラーゲン合成の指標) は担体タンパク質サブユニ
ットを含有するチャンバーの方がはるかに高かった (対
照の270 μg に対して460 μg であった) 。

【０１１８】これらの結果は、15kDa の担体タンパク質
サブユニットを創傷チャンバーに注射すると治癒速度が
著しく増大することを証明している。

【０１１９】実施例５ 担体タンパク質サブユニットがSM-Cの血漿半減期を増大
することを示すために動物実験を行った。15kDa のヒト
担体タンパク質サブユニットは、ラットの血流に注射さ
れた精製ヒヒトSM-Cの半減期を延長することが判明し
た。

【０１２０】¹²⁵I-SM-Cを15kDa の担体タンパク質サブ
ユニットとともに、一夜４℃にて、PBS(10mMリン酸ナト
リウム、pH7.25、150 mM塩化ナトリウム) 中でインキュ
ベートすることによって、担体タンパク質サブユニット
と ¹²⁵I-SM-Cとの複合体を製造した。その複合体を、ゲ
ル濾過法で、遊離の ¹²⁵I-SM-Cから分離した。 ¹²⁵I-SM
-Cの比活性は6.7 ×10⁵ cpm/μg であった。

【０１２１】ラット (約200g) に麻酔をかけ頸静脈にカ
テーテルを取付けた。注射する前に、カテーテルとシリ
ンジは、４％のBSA (ウシ血漿アルブミン) ですすい
で、タンパク質がプラスチックの表面に付着するのを防
止した。４頭のラットにBSA を、４頭のラットに２μg
の ¹²⁵I-SM-Cだけを、そして４頭のラットには15kDa の
担体タンパク質サブユニットを複合させた２μg の ¹²⁵
I-SM-Cを夫々注入した。上記の複合体とSM-Cは両者とも
にPBS 中にいれたものを用いた。１頭のラットには、担
体タンパク質サブユニットを複合させた１μg の ¹²⁵I-
SM-Cを注入した。血液試料(100〜200 μl)を、注入後、
多数の時点で採取した。血球は、直ちに、遠心分離によ
って血漿から分離した。25μl の血漿部分を計数して、
存在する ^{1 25}I-SM-Cの濃度を測定し、10μl 部分を15％
ポリアクリルアミド−SDS ゲル上で試験してSM-Cのイン
テグリティを測定した。注射は２日間実施した。各午前
中に、２頭のラットに複合体を注射し、２頭のラットに
はSM-Cだけを注射した。３日目に４頭の対照のラットに
BSA を注射した。

【０１２２】この試験は、15kDa の担体タンパク質サブ
ユニットが、循環中のSM-Cの半減期を著しく増大するこ
とを証明している。同計数値のSM-C (即ち1.3 ×10⁵ c
pm/ml ラット血液) を、単独又は担体タンパク質サブユ
ニットと複合させて、ラットに投与した。図13に示すよ
うに遊離のSM-Cの大部分は、循環系から急速に除かれる
が、一方担体タンパク質サブユニットは、SM-Cがこのよ
うに除去されるのを保護する〔15％SDS(ドデシル硫酸ナ
トリウム) ポリアクリルアミドゲルで試験した試料は、
¹²⁵I の計数値はすべてSM-Cのものであることを示し
た、即ち実験を阻害する遊離の ¹²⁵I は全く存在しな
い〕。7.5 分後に遊離SM-Cの残量が連続して出現した
が、これはSM-Cが不飽和のラット担体タンパク質サブユ
ニット分子を占有しているためである。明らかに、注射
された全遊離SM-Cの30％とさえ結合するのに充分な内因
性担体タンパク質サブユニットは存在していなかった。
ラット若しくはヒトには治療に有用な内因性不飽和担体
タンパク質サブユニットが充分に存在していないことに
は留意すべきである。したがってSM-Cはその担体タンパ
ク質サブユニットに複合させて投与しなければならな
い。

【０１２３】組換えDNA と担体タンパク質様ポリペプチ
ド タンパク質配列の情報に基づいたオリゴヌクレオチドプ
ロセスの製造 担体タンパク質は、単離されてソマトメジンと結合でき
る性能を保持するサブユニットをもっており、そのサブ
ユニットは、グリコシル化されている場合は約15、21、
26、30及び45kDa の見掛けの分子量を有し、グリコシル
化されていないか又はその外の復翻訳修飾を受けている
場合はかなり低い分子量を有している。このサブユニッ
トのＮ末端配列が同じで各種のサブユニットが同じ単一
若しくは複数の遺伝子でコードされている場合は、担体
タンパク質様ポリペプチドをコードするDNA を同定する
ために共通のＮ末端配列に基づいたプローブを製造する
ことができるはずである。担体タンパク質サブユニット
は実施例２と同様にして単離・精製され、S-15として同
定された。このタンパク質S-15をカルボキシメチル化し
て、Applied Biosystems Gas Phase Protection Sequen
cer Model 470 を用い、自動化されたエドマン分解法で
Ｎ末端配列の分析を行った。最初の42のアミノ酸を図１
に示す。その上、サブユニットS-15は、リシンがプロリ
ンに続いて位置していない場合、アルギニンとリジンの
後の位置で特異的に分解させるプロテアーゼのトリプシ
ンで分解させた。具体的に述べれば、カルボキシメチル
化S-15を0.3M炭酸水素ナトリウムpH8.0 中のトリプシン
で消化した。トリプシン断片をVydak C4カラムを用いて
逆相HPLCによって分離した。精製断片を集め、以下のよ
うにして配列を決定した。またT-1 、T-6 、T-7 、 T-
1′及びT-10と命名されたいくつかの上記トリプシン断
片の配列を図１に示す。アミノ末端とトリプシン断片T-
7 との相同性から、サブユニットS-15の最初の57のＮ末
端アミノ酸が２つの未決定のアミノ酸を除いて決定さ
れ、図２に示した。

【０１２４】cDNAライブラリーをスクリーニングするた
めのプローブとして役立つ多くのオリゴヌクレオチドを
上記の分子から設計した。これらのプローブには、短い
縮重プローブと長いコドンでバイアスされたプローブが
含まれる。Ｎ末端の57アミノ酸分子の部分に対応する１
つのオリゴヌクレオチドは48mer として同定され、図２
に示した。

【０１２５】担体タンパク質mRNAを含有するポリＡ⁺ RN
A を製造するための組織の選択 担体タンパク質の遺伝子を単離するのに利用される方法
は、大量の担体タンパク質を作る組織を同定し、その組
織からmRNAを単離し、そのmRNAからcDNAライブラリーを
構築し、オリゴヌクレオチドのプローブを用いて遺伝子
をスクリーニングする方法である。期待されることは、
濃縮されたcDNAライブラリーが、おそらく１コピーしか
もっていないゲノム（全DNA)ライブラリーよりも多くの
コピー数のかような遺伝子を含有していることである。
どの組織若しくは細胞の種類が、血漿中に見出されるタ
ンパク質である担体タンパク質を作るのかを確認した文
献情報は全くない。繊維芽細胞が、大きいが特性を決定
されていないソマトメジン結合性タンパク質を少量産生
することが報告されている(Adams等の前記文献) 。しか
しSM-Cの大部分は肝臓で合成されることが知られてい
る。さらにSM-Cは、繊維芽細胞と、心臓、骨、胎盤、及
び腎臓のような他の組織で合成される。それ故に、SM-C
と担体タンパク質が同じ組織で合成されると推測して、
肝臓の細胞と繊維芽細胞を、担体タンパク質をコードす
るmRNAの２つの可能性のある起源として選択した。

【０１２６】かようなmRNA、RNA の組織若しくは細胞系
の起源を同定するため、いく人ものヒトの肝臓からmRN
A、RNA を単離して、担体タンパク質を合成する性能に
ついて試験した。さらに、各種の繊維芽細胞系を、担体
タンパク質を作る性能について検定した。

【０１２７】ポリＡ⁺ 含有RNA の製造 全RNA とポリＡ⁺ 含有RNA を、標準の方法(Chirgwin,
J.M. 、Pryzbyla, A.E.、MacDonald, R.J. 、及びRutte
r, W.J.、Biochemistry、18巻、5294−5299頁、1979
年、及びIversen,P.L.、Mata J.E. 及びHines, R.N. 、
Biotechniques 、５巻、521 −523 頁、1987年参照) に
したがって、各種の肝臓組織と繊維芽細胞から単離し
た。組織 (例えば肝臓組織) 又は細胞 (例えば繊維芽細
胞) を、GIT 緩衝液 (4Mイソチオシアン酸グアニジニウ
ム、20mM EDTA 、100mM トリス−HCl pH7.6)中でホモジ
ネートした。破片を除き、RNA を含有する上澄み液を、
２％のSarkosyl (ラウリルサルコシン酸ナトリウム) と
１％のβ−メルカプトエタノール中に入れた。次いでこ
の混合物を、塩化セシウム勾配液を用いて遠心分離し
た。プレットをフェノールとクロロホルムに再懸濁させ
て抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。mRNAを示す
ポリＡ⁺ RNA は、全RNA をオリゴ−dTセルロースカラム
を通過させることによって全RNA から精製した(Aviv,
H. とLeder, P. 、PNAS、69巻、1408頁1972年参照) 。
得られたポリＡ⁺ 含有RNA を、10mMトリスpH7.4、１mM
EDTA 、0.05％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) でカラム
から溶離し、濃縮し、その後使用するために貯蔵した。
肝臓のポリＡ⁺ RNA はH10 及びH14 の名称が与えられ、
肝臓の試料から精製されたことを示し、繊維芽細胞のポ
リＡ⁺ RNAには、RNA の細胞起源を示す、コードネームW
138、HS27、MRC5、8387、及びMDA-MB-231をつけた。

【０１２８】翻訳製品用のRNA の試験 H10 とH14 由来のヒト肝臓ポリＡ⁺ RNA の一部を、標準
の方法(Davis, L.G.等、"Basic Methods in Molecular
Biology"、elsevier、New York、NY 1986年参照) にし
たがって、ウサギ網状赤血球翻訳キットを用い、³⁵S-メ
チオニンで生体外で翻訳した。タンパク質翻訳生成物を
Robert C Baxter(Royal Prince AlfredHospital, オー
ストラリア) から提供された抗体を使用し、(Davisの方
法にしたがって) 免疫沈澱させた。なおこの抗体は、Ma
rtin, J.L.等"Antibody AgainstAcid- Stable Insulin-
like Growth Factor Binding Protein …" 、J. Clin.
Endocrinol. Metab. 、261 巻、 799−801 頁、1985年
の方法にしたがって調製されたものである。その抗体
は、ヒト血清から得られるいわゆる酸安定性サブユニッ
トを含有する物質に対する抗体である。免疫沈澱させた
タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
分析した。抗担体タンパク質サブユニット抗体と特異的
に反応する、約68,000、43,000、39,000、及び32,000ダ
ルトンのタンパク質バンドが同定された。対照の血清で
はタンパク質は沈澱しなかったが、これは対照の血清が
抗担体タンパク質サブユニット抗体を含有していなかっ
たからである。この結果は、担体タンパク質が肝臓で作
られており、肝臓mRNAで作られたcDNAライブラリーは、
担体タンパク質遺伝子を含有しているはずであることを
示している。

【０１２９】いくつかの繊維芽細胞系も担体タンパク質
を製造する性能について試験した。例えば、W138胚様繊
維芽細胞(American Type Culture Collection No. CCL-
75)は10％ウシ胎児血清を含有するDMEM-F12培地中、70
〜80％の集密度まで増殖した。細胞を血清なしの培地に
移して72時間インキュベートした。培養物の上澄み液を
収穫し、TCA 沈澱法又は遠心分離法で濃縮した。試料を
SM-Western分析法に付した所(SDS-PAGE の工程は非還元
条件下で実施している) 、W138細胞が合成され、この細
胞は、大きさが25,000〜45,000ダルトンの範囲にあるSM
-Cに結合しうる少なくとも４つのタンパク質を分泌する
ことを示した。これらのタンパク質のうち約40,000ダル
トンのタンパク質 (還元性SDS-PAGEによる) も、抗担体
タンパク質サブユニット抗体によって特異的に認識され
た。この実験において、血清なし培地でのW138細胞の72
時間の培養は³⁵S-システィンを添加して行った。タンパ
ク質は、抗担体タンパク質サブユニット抗体で免疫沈澱
させて、還元性条件下でSDS-PAGEによって分析した。

【０１３０】抗担体タンパク質サブユニット抗体に認識
されかつSM-Cが結合した担体タンパク質サブユニットを
コードする他の細胞系としては、HS27 (ヒト繊維芽細
胞) 、MRC5 (ヒト繊維芽細胞) 、8387 (ヒト繊維肉腫)
及びMDA-MB-231 (ヒト乳癌) が挙げられる。他の繊維芽
細胞系から単離されるポリＡ⁺ RNA も担体タンパク質を
コードすると考えられる。

【０１３１】これらの起源から得られるポリＡ⁺ RNA 生
成物は非常に多数の異なるmRNAを含有するということを
認識すべきである。担体タンパク質若しくは担体タンパ
ク質サブユニットに対して特異的なmRNAを除いて、他の
mRNAは望ましくない汚染物である。あいにく、これらの
汚染物のRNA は、後のこの発明のクローン化工程を通じ
て担体タンパク質サブユニットmRNAと同様に挙動する。
それ故にそれらがポリＡ⁺ RNA 中に存在すると、結局、
多数の望ましくない細菌のクローンが製造され、これら
のクローンは担体タンパク質以外のポリペプチドをコー
ドする遺伝子をもっている。この汚染があると、所望の
担体タンパク質ハイブリッドクローンを単離する際に複
雑なスクリーニング上の問題が起こる。担体タンパク質
の場合、スクリーニング問題は、所望のクローンを同定
するためにスクリーニングプローブとして作用する担体
タンパク質mRNA若しくはDNA 又はその部分る充分に精製
された試料がないので、一層悪化している。唯一の入手
しうるプローブは、限定されたＮ末端タンパク質分子の
情報に基づいたものであった。それ故に、担体タンパク
質のクローンのスクリーニング工程は非常に時間がかか
り困難である。さらに、担体タンパク質クローン自体の
ごく小パーセントしか、生物学的若しくは免疫学的に活
性な形で担体タンパク質様ポリペプチドを発現しないの
で、活性クローンの単離は困難なスクリーニング工程で
ある。

【０１３２】担体タンパク質のcDNAを含有する二重鎖cD
NAの合成 ポリＡ⁺ RNA を含有する担体タンパク質mRNAを、特にGu
blerとHoffman が報告しているように、鋳型のように使
用して、相補的DNA(cDNA) を製造した。cDNAのライブラ
リーを、潜在的な担体タンパク質様ポリペプチドをコー
ドすることが分かったmRNAから作製した。そのラインは
λベクターgt10に構築したが、他のベクター〔例えばλ
gt11 (Young R.A.とDavis R.W.、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA、80巻、1194−1198頁、1983年) 〕にも構築する
ことができる。二重鎖CDNAは特にGubler-Hoffman法(Gub
ler, U. とHoffman, B.J. 、Gene、25巻、 263〜269
頁、1983年) によって作製した。この方法では、第一の
連鎖cDNAが、ポリＡ⁺ RNA をコピーするためMoloney 逆
転写酵素を用いて合成された。以下のラインにはランダ
ムに初回抗原刺激を受けた(random-primed) ヒト肝臓cD
NAライブラリー(H14)、２つのオリゴdTで初回抗原刺激
を受けたヒト肝臓cDNAライブラリー〔H14 、H10/H14 (H
10とH14 のプール) 〕及びオリゴdTで初回抗原刺激をう
けたヒト胎児繊維芽細胞ライン(W138)が含まれる。ラン
ダムプライマー〔pd(N）₆ 〕とオリゴdT(pT_12-18 ）プ
ライマーはファーマシア社から入手した。第二の連鎖は
RNAseHとDNA ポリトラーゼＩの組合わせを用いて製造し
た。

【０１３３】得られたcDNA集団は、実際には、ポリＡ⁺
RNA 中に存在した各種のmRNAから生成するcDNAの複雑な
混合物である。その上、Moloney 逆転写酵素により早期
に終結されるので、多くのcDNAがポリＡ⁺ mRNAの各種mR
NAの不完全なコピーである。

【０１３４】二重鎖cDNAのクローン化 広範囲の宿主・ビヒクルの組合わせがこの発明にしたが
って製造された二重鎖cDNAをクローン化若しくは発現す
るのに用いられる。例えば、有用なクローン化ビヒクル
若しくは発現ビヒクルは次のような染色体、非染色体及
び合成DNA 分子のセグメントで構成されている。即ちSV
40の各種公知の誘導体と公知の細菌プラスミド (例えば
colE1 、pCR1、pBR322、pMB9及びその誘導体を含むイー
・コリ(E. coli) 由来のプラスミド) ；広い宿主域のプ
ラスミド例えばRP4 ；ファージDNA 例えばファージλの
多数の誘導体 (例えばNM989)及び他のDNA ファージ例え
ばM13 と繊維状一重鎖DNA ファージ；並びにプラスミド
とファージDNA の組合わせに由来するベクター例えばフ
ァージDNA を利用するために修飾されたプラスミド；若
しくは他の発現制御分子；または２μプラスミド若しく
はその誘導体のような酵母プラスミドである。有用なク
ローン化宿主若しくは発現宿主には、次のものが含まれ
る，即ち、細菌宿主〔例えばイ・コリHB101 、イー・コ
リX1776 、イー・コリX2282 、イ・コリMRCI、イー・コ
リLE392 、イー・コリC600、及びシュードモナス属(Pse
udomonas) の菌株、バシラス・サチラス、バシラス・ス
テアロサーモフィラスなどの細菌〕；酵母などの真菌；
動物、昆虫、又は植物の細胞が含まれる。勿論、すべて
の宿主／ベクターの組合わせが等しく有効なわけではな
い。当該技術分野の熟練者であれば、本願に記載された
原理を適切に検討して、この発明の範囲を逸脱すること
なく、宿主・ビヒクルの組合わせを特定して選択するこ
とができる。

【０１３５】さらに、特定な各クローン化ビヒクル若し
くは発現ビヒクル内で、二重鎖DNAを挿入する各種の部
位を選択することができる。これらの部位は通常その部
位を切断する制限エンドヌクレアーゼで命名されてい
る。これらの部位は、当該技術分野の熟練者によく知ら
れている。この発明に有用なクローン化若しくは発現の
ビヒクルは選択されたDNA 断片を挿入するための制限エ
ンドヌクレアーゼ部位をもつている必要がないことは勿
論理解すべきである。かわりに、ビヒクルは外の手段に
よってDNA 断片に接続することができる。

【０１３６】クローン化若しくは発現のビヒクル若しく
はベクターと、特に、選択されたDNA 断片を接続して組
換えDNA 分子を形成するその中の選択された部位は、種
々の因子によって決定される。例えば特定の制限酵素に
感受性の部位の数、発現されるタンパク質の大きさ、宿
主細胞酵素によるタンパク質分解反応にたいする所望の
タンパク質の感受性、精製によって除去することが困難
で、宿主細胞タンパク質によって発現されるタンパク質
の汚染若しくは結合、ベクター分子に対する開始コドン
と終止コドンの位置のような発現の特性、及び当該技術
分野の熟練者に知られているその外の因子である。ベク
ターと、特定の遺伝子の挿入部位はこれらの因子の釣合
いによって決定され、すべての選択が与えられた場合に
等しく有効であるわけではない。

【０１３７】異種のDNA をクローン化ビヒクル若しくは
発現ベクターに挿入して組換えDNA分子を作製するいく
つもの方法が当該技術分野では公知であるが、この発明
によって初期のクローン化を行うのに好ましい方法は、
λgt10の EcoRIによる消化である。次にまず EcoRIリン
カーをcDNA分子に負荷した後、二重鎖cDNAを上記のλgt
10に連結する。得られた組換えDNA 分子はクローン化ベ
クター中の選択された位置に挿入遺伝子をもっている。

【０１３８】勿論、DNA 分子をクローン化若しくは発現
のビヒクルに挿入して組換えDNA 分子を形成させるその
他の公知の方法は、この発明に等しく有用である。これ
らの方法には、例えばdA-dT トレイリング(trailing)
法、直接連結法、合成リンカー、エキソヌクレアーゼと
ポリメラーゼがリンクされた修復反応とこれに続く連結
反応、又はDNA ポリメラーゼと適切な一重鎖鋳型と連結
反応によるDNA ストランドノ延長法が含まれる。

【０１３９】勿論、クローン化ビヒクルの選択された部
位に挿入されるcDNA断片のヌクレオチド分子には、所望
のポリペプチドをコードする実際の遺伝子の一部ではな
いポリペプチドが含まれるか、又は所望のタンパク質の
完全な遺伝子の断片だけが含まれているということは理
解すべきである。最終的にどのようなDNA 分子が挿入さ
れても、形質転換された宿主が、担体タンパク質の、ソ
マトメジン調節生物活性を有し、ソマトメジン様ポリペ
プチドに結合しうるポリペプチドを産生するか、又はDN
A 分子自体が、かような生物活性と結合活性を有するポ
リペプチドを産生するのに有用なDNA 分子を含有するク
ローンを選択する雑種形成プローブとして有用であるこ
とだけが要求される。

【０１４０】異種の遺伝子を含有するクローン化ビヒク
ル若しくは発現ベクターは、宿主が担体タンパク質様ポ
リペプチドを発現できるように宿主を形質転換するのに
用いられる。適切な宿主の選択も、当該技術分野で知ら
れている多くの因子で制御されている。これらの因子に
は、例えば選択されたベクターとの適合性、ハイブリッ
ドプラスミドがコードするタンパク質の毒性、所望のタ
ンパク質回収の容易さ、発現特性、安全性及び経費が含
まれる。すべての宿主が特定の組換えDNA 分子のクロー
ン化若しくは発現に等しく有効なわけではないというこ
とを理解した上で、上記因子の釣合いをとらねばならな
い。

【０１４１】この合成法で、好ましい初期のクローン化
ビヒクルはλgt10で、好ましい初期の制限エンドヌクレ
アーゼ部位は EcoRI部位である。好ましい初期の宿主は
イー・コリである。

【０１４２】Maniatis, T. 等、Molecular Cloning :
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NY 、1982年、及びDavis, L.
G. 等、"Basic Methods in Molecular Biology" (Elsev
ier New York 、NY、1986年("Maniatis")に記載されて
いるようにして製造した EcoRIリンカーを付加したcDNA
分子に、 EcoRIで制限したλgt10 DNA(Promega) を連結
した。

【０１４３】アニーリングした後得られるハイブリッド
DNA は、勿論、異なる組換えDNA 分子と、DNA 分子が挿
入されていないいくつかのクローン化ビヒクルの大きな
混合物である。しかし各組換えDNA 分子は EcoRI部位に
cDNAセグメントを含有している。かようなcDNAセグメン
トは各々、ひとつの遺伝子又はその断片を含有してい
る。cDNA断片のごく少数だけが担体タンパク質又はその
一部をコードしている。その大部分は他のタンパク質の
１つ若しくはその一部をコードし、そのmRNAはこの発明
の方法で用いられるポリＡ⁺ RNA の一部であったもので
ある。また、先に作製したライブラリーのクローンはい
ずれも担体タンパク質様ポリペプチドを発現できないこ
ともありうるということを理解すべきである。あるいは
それらはかようなクローンをスクリーニングし同定する
のにだけ有用である。

【０１４４】cDNA挿入断片を有する、得られたλDNA ベ
クターを、λファージ詰込みキット(Stratagene)を用い
てλファージに詰込んだ。

【０１４５】イー・コリ細胞 (例えばc600hf1)を組換え
ファージに感染させ、濃厚培地プレート (例えばLB) に
プレートした。ファージプラークが目視できるまで、プ
レートを37℃でインキュベートした。

【０１４６】そのファージプラーク (クローン) は、肝
臓から得たポリＡ⁺ RNA の混合物の種々の大きさの完全
もしくは部分的なコピーを示す各種の組換えDNA 分子を
含有している。これらのプラークの大部分は、各々、単
一の組換えDNA 分子を含有している。しかし、これらの
組換えDNA 分子のごく少数だけが担体タンパク質に関連
している。したがってこのクローンはスクリーニングし
て、担体タンパク質に関連するクローンを他のクローン
から選択しなければならない。

【０１４７】担体タンパク質cDNAを含有するクローンの
スクリーニング 担体タンパク質cDNAを含有するクローンをスクリーニン
グするいくつかの方法がある。これらの方法には、RNA
選択雑種形成法、ディファレンシャル雑種形成法、合成
プローブによる雑種形成法、又は所望のタンパク質を産
生するクローンを、免疫学的若しくは生物学的検定法で
スクリーニングする方法が含まれる。本願発明の発明者
等は、合成プローブによる雑種形成法が、最も便利で、
初代クローンのスクリーニングには有望な方法なので、
これを選んだ。

【０１４８】組換えDNA 分子と、この分子で形質転換さ
れた細菌培養物とは、プローブによる雑種形成法で同定
されるが、完全な担体タンパク質cDNA分子を含有してい
るとか、又はそのDNA 分子が実際に担体タンパク質をコ
ードするか若しくはクローンが担体タンパク質様ポリペ
プチドを発現できるようにするという保証はない。しか
し組換えDNA 分子は、担体タンパク質サブユニットのmR
NAのコーディング分子に対して相補的な広範囲のヌクレ
オチド分子を含有することは確かである。それ故に、組
換えDNA 分子は、他の組換えDNA 分子とこれで形質転換
れたクローンを迅速にスクリーニングして、標準の若し
くは完全な担体タンパク質サブユニットヌクレオチドの
コーディング分子を含有する別のセットのクローンを同
定するプローブの起源として少なくとも使うことができ
る。これらのクローンは、次に、担体タンパク質の生物
活性と結合活性を示すポリペプチドの可能性のある発現
について直接分析される。一層重要なのは、これらハイ
ブリッドプラスミドの挿入DNA 断片のヌクレオチド分子
とそのアミノ酸翻訳生成物は通常の手段を用いて測定す
ることができ、そのDNA 分子は、適切な発現ベクターを
構築するのに使用され、そのベクターによって、このベ
クターで形質転換された適切な宿主内で担体タンパク質
様ポリペプチドが合成できるということである。

【０１４９】オリゴヌクレオチドプローブの雑種形成 ファージcDNAライブラリーをイー・コリと混合し、LB
(濃厚培地) プレートにプレートした。このプレート
を、ファージのプラークが目視可能になるまで37℃でイ
ンキュベートした。各プラークは、cDNA挿入断片を含有
する独得のλgt10ファージのクローンを示す。約50万〜
100 万のファージプラークが実験毎に分析された。

【０１５０】標準の方法 (Davis とManiatis) を用い
て、これらプラークのファージDNA をプレートからニト
ロセルロースフィルター (細孔直径が0.45μm 、Schlei
cher and Schuell社又はMillipore 社) に移して、分析
を行った。したがってフィルターのDNA パターンはプレ
ートのプラークのパターンのレプリカであった。ファー
ジDNA 内に含有されている挿入断片をプローブと雑種形
成させて同定した後、フィルターは、プレートと単離さ
れたファージを対応させることができる。

【０１５１】オリゴヌクレオチドプローブ、48の塩基で
構成された48mer (図２に示す) を、ランダムに初回抗
原刺激を受けたヒト肝臓cDNAライブラリーH14 をスクリ
ーニングするのに使用した。そのプローブは、担体タン
パク質サブユニットS-15のアミノ酸 Ala(29)からLeu(4
4) までをコードするヌクレオチドにまたがっている分
子に相当するものであった。この単一のオリゴヌクレオ
チドは、ヒトコドンに対するバイアスが最大になるよう
に設計した。

【０１５２】雑種形成の条件は、前記48塩基のプローブ
(48mer) を、胎盤由来のヒトゲノムDNA のサザーンブロ
ットと、各種の緊縮度下でアミノ酸Gly(1)からTyr(57)
まで(図３に示す) をコードする181bp の合成DNA のサ
ザーンブロットとに結合させることによって決定した。
雑種形成のための最終の条件は、最小のバックグランド
で遺伝子の同定を行える条件であるが、40％ホルムアミ
ド、５×SSPE (0.9M塩化ナトリウム、50mMりん酸ナトリ
ウム pH7.4、５mM EDTA)、42℃であった。

【０１５３】ランダムに初回抗原刺激をうけたH14 ヒト
肝臓cDNAライブラリー由来のファージプラークのレプリ
カをもつているニトロセルロースフィルターを、上記雑
種形成条件を用いて³²Ｐの標識を付けた48mer と雑種を
形成させた。雑種形成は通常一夜実施し、フィルターは
オートラジオグラフィにかける前に、0.1 ×SSC (15mM
塩化ナトリウム、1.5mM クエン酸ナトリウム pH7.0) 、
0.1 ％SDS 中、45〜50℃で数回すすいだ。48mer と強く
雑種形成したDNA をオートラジオグラフィで同定し、対
応するファージプラークを単離した。ファージのもとの
プレーティングは高密度で行ったから、プレーティング
とスクリーニングの第二の段階は単一のプラークを単離
することが要求された。またスクリーニングのこの第２
段階で、最初に単離されたファージプラークが実際に48
mer と雑種を形成することが確認された。シングルプラ
ークをプレートから取出し、ファージをファージ緩衝液
(100mM NaCl 、 10mM MgSO₄ 、50mMトリス、pH7.5 、0.
01％ゼラチン) に溶離させた。細菌を遠心分離法で除い
た後、これらのファージの貯蔵品は４℃に保持した。フ
ァージDNA を精製し特性を決定した〔即ち、標準の方法
（例えばManiatisの方法) にしたがって挿入断片 (大き
さ) を測定するため EcoRIのような制限エンドヌクレア
ーゼで制限した〕。挿入断片は、標準法を用い、pBR322
若しくはpGEMのようなより小さなプラスミドに、 EcoRI
部位で、しばしばサブクローン化した。

【０１５４】陽性プラークの数を同定した (48／スクリ
ーニングされた600,000 のプラーク) 。これらのうち９
個をさらに分析するために選択した。これらのクローン
のうち２個（cLCP 0.70 とcLCP 0.77 と命名する) は、
大きさが約700 〜800bp で48erのプローブで最も強い結
合性を示したが、配列決定を行う前に、より小さな断片
に切断した。

【０１５５】48mer と雑種形成する断片は初期の配列決
定候補であるが、以下のようにして同定した。cDNA挿入
断片LCP 0.70とLCP 0.77を制限エンドヌクレアーゼHae
IIIで切断した。これらの断片を、アガロースゲル電気
泳動法で分離し、ニトロセルロース膜に移転させ、³²Ｐ
標識48mer プローブでプローブした。Hae III 断片をプ
ローブしたとき、１つの断片だけが48mer と結合した。
この90bpの断片はクローンLCP 0.70とLCP 0.77の両方に
存在していた。この断片を単離して、Sanger,F.等Proc.
Natl. Acad. Sci.、74巻、5463頁、1977年の方法にし
たがって配列を決定した。LCP 0.70とLCP 0.77の両方の
90bp断片のDNA 分子は、次に示す、担体タンパク質サブ
ユニットS-15、即ちGln(23) からGlu(50) までまたがる
アミノ酸配列に正確に一致した。上の列は担体タンパク
質サブユニットS-15の最初の57のアミノ酸を示し、下の
列は84bpのHae III 断片の翻訳を示す。１つのノンマッ
チ(non-match)は、45位のアミノ酸が同定されていなか
ったためである。DNA 分子分析の結果それはトレオニン
（Ｔ）と同定した。 GASSAGLGPVVRCEPCDARALAQCAPPPAVCAELVREPGCGCCLXCALSEGQPXGIY :::::::::::::::::::::: ::::: QCAPPPAVCAELVREPGCGCCLTCALSE

【０１５６】これらのクローンはcLCP 0.70 及びcLCP
0.77 と命名され、その組換えDNA 分子はλgt10 : LCP
0.70 及びλgt10 : LCP0.77と命名され、そのDNA 挿入
断片はLCP 0.70及びLCP 0.77と命名された。この命名法
は、そのクローンと組換えDNA分子が、肝臓cDNAから単
離された、担体タンパク質に関連するcDNAを含有するフ
ァージλgt10で構成されていることを示す。

【０１５７】挿入断片LCP 0.70とＬCP 0.77 は大きさと
制限部位が類似していることが分かった。挿入断片LCP
0.70とLCP 0.77は夫々約700bp と770bp である。LCP 0.
70とLCP 0.77の制限地図を図４に示す。LCP 0.70とLCP
0.77挿入断片のDNA 配列は、一重鎖と二重鎖のジデオキ
シ配列決定法(Sanger F.等、Proc. Natl. Acad. Sci.US
A、74巻、5463頁、1977年) で得たが、図６〜図８に示
す配列に含まれており、夫々スクレオチド１−699 と７
−769 である。アミノ末端に加えて、トリプシン断片T
1′とT10 がこれらクローンのDNA 分子と一致した。LCP
0.70とLCP 0.77は、夫々17,558と20,320ダルトルのタ
ンパク質をコードするのに充分に大きなものである。し
たがって、全S-15分子をコードするのに必要な情報はこ
れらの挿入断片に含まれている。

【０１５８】LCP 0.70とLCP 0.77とにクロス雑種形成さ
せることによる、担体タンパク質をコードするDNA 配列
を含有するクローンの同定

【０１５９】上記のようにして単離したクローンcLCP
0.70 とcLCP 0.77 の組換えDNA 分子とDNA 挿入断片
を、cDNAで先に調製したクローンのライブラリーを、フ
ァージプラークと雑種形成させることによってスクリー
ニングするのに使用した。この方法によれば、LCP 0.70
で作った放射性プローブを、ニトロセルロースフィルタ
ーに固定した組換えファージのDNA と雑種形成させるこ
とによって、関連クローンを迅速に同定することができ
る。

【０１６０】LBプレートから移したファージプラークに
相当するファージDNA を含有するニトロセルロースフィ
ルターを次のようにして調製した。

【０１６１】700bp のLCP 0.70又は770bp のLCP 0.77の
EcoRI制限断片を、ヒト肝臓のランダムに初回抗原刺激
を受けたcDNAライブラリーH14 、ヒト肝臓のオリゴdTで
初回抗原刺激を受けたcDNAライブラリーH10/H14 及びヒ
ト胎児繊維芽細胞オリゴdTで初回抗原刺激を受けたcDNA
ライブラリーW138をスクリーニングするのに使用した。
またこれらのプローブは、担体タンパク質をコードする
他の組織由来のRNA を用いて構築された他のcDNAライブ
ラリーをスクリーニングするのにも使用できた。さらに
これらのプローブはゲノムライブラリーをスクリーニン
グするのに使用できた。

【０１６２】そのプローブ断片(LCP 0.70 若しくはLCP
0.77) を、組換えDNA 分子の EcoRI消化生成物を約１％
のアガロースゲル中で電気泳動を行い（挿入断片をクロ
ーン化ビヒクルから分離するため）、次いでDE81ペーパ
ーに電気溶離させて精製した。次に特異的な断片を濃縮
し、 "ニツクトランスレーション法" の標準法で、³²Ｐ
の標識をつけた。

【０１６３】上記プローブと、cDNAクローンを含有する
ニトロセルロースフィルターとの雑種形成は、特に以下
のようにして行った。

【０１６４】オリゴdtで初回抗原刺激を受けたヒト肝臓
cDNAライブラリーH10/H14 由来の約500,000 のクローン
と、オリゴdTで初回抗原刺激を受けたヒト胎児繊維細胞
cDNAライブラリーW138由来の約500,000 のクローンをス
クリーニングした。

【０１６５】W138繊維芽細胞ライブラリー中の陽性シグ
ナルの頻度は約0.1 ％であった。一方肝臓ライブラリー
内の頻度は0.01〜0.02％にすぎなかった。陽性クローン
を、プラークで精製し、制限地図を作製し配列分析を行
って担体タンパク質cDNAを含有する他のクローンを同定
することによって特性を決定した。クローンは、一重鎖
及び二重鎖の配列決定法 (Sanger) を用いて配列を決定
した。

【０１６６】2.3kb の挿入断片(cLCP 2.3)を含有するク
ローンを、全長の担体タンパク質様のもののコーディン
グ配列を含有する、ヒト肝臓のオリゴdTで初回抗原刺激
を受けたcDNAライブラリーH10/H14 から単離した。夫々
1.8kb の挿入断片(cFCP 1.8)と2.5kb の挿入断片(cFCP
2.5)を含有するクローンを、W138の繊維芽細胞オリゴdT
で初回抗原刺激を受けたcDNAライブラリーから単離し
た。これらクローンのDNA 配列分析結果（図６〜図８）
は、両者とも全担体タンパク質様ポリペプチドコーディ
ング配列を含有していることを示した。コードされたタ
ンパク質は、27番アミノ酸 (81番のヌクレオチド) リー
ダー＋264 番アミノ酸(792番ヌクレオチド) 成熟コーデ
ィング領域で構成されている。肝臓と繊維芽細胞のクロ
ーンは、共にコーディング領域中に、特に同じヌクレオ
チド配列を示している。肝臓クローンのうちの１つは、
５位のアミノ酸のALA の代わりにGLY をコードしている
(但し１位は成熟タンパク質の最初のアミノ酸であ
る）。この多型性は、Cohn画分IV-1から精製された担体
タンパク質サブユニットに観察されたものに一致する。

【０１６７】LCP 0.70若しくはLCP 0.77をプローブとし
て用いる、W138ヒト胎児繊維芽細胞RNA 、ヒト肝臓RNA
H10/H14 、ヒト胎盤RNA 及びマカック属サルの肝臓RNA
をノザーン分析した結果、担体タンパク質mRNAは大きさ
が約2,000 〜2,500 塩基であることが分かった。したが
って、2.2 〜2.4kb のクローンは、恐らくこれらRNAに
相当する全長のcDNAを示すものであろう。ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) 増幅法(Saiki R.K.等、Science 、239
巻、483 〜491 頁、1988年) によって、ヒト肝臓cDNAラ
イブラリーとクローンcLCP 2.3を分析した結果は、cLCP
2.3が３′の非翻訳領域中に約200bp の小さな欠落があ
ることを示唆している。実際に、細菌、2.5kb 挿入断片
(cLCP 2.5)を含有するクローンが肝臓cDNAライブラリー
から単離された。この挿入断片(LCP 2.5) は、1063の X
hoI 部位と1270の SphI 部位との間の200bp の "挿入"
を除いてLCP 2.3 と同じである (図５) 。LCP 2.5 はFC
P2.5 と明らかに類似している。

【０１６８】上記のような、クローンLCP 0.70とLCP 0.
77のDNA 挿入断片を用いて行うクローンスクリーニング
法は、組換えDNA 法、合成法、天然起源若しくはその組
合わせから生成するDNA 分子を含有するその外のクロー
ン、及び単一若しくは多重の、塩基置換、挿入、逆位、
若しくは欠落を含む突然変異による上記DNA 分子のいず
れかに関連するDNA 分子を含有するクローンに、等しく
うまく利用できることは勿論明らかなことである。それ
故に、かようなDNA 分子とその同定法もこの発明に含ま
れる。また、上記のDNA 分子ではスクリーニングされな
かったが、そのヌクレオチドの配列の結果から、上記DN
A 分子によってコードされるポリペプチドをコードする
DNA 分子もこの発明に含まれると理解されるべきであ
る。

【０１６９】その上に、ヒト担体タンパク質様ポリペプ
チドをコードするDNA 分子と、非ヒト起源由来の担体タ
ンパク質をコードするDNA 分子との間に相同性が予想さ
れるので、この発明のDNA 分子は、これらの非ヒト担体
タンパク質をコードするDNAの選別と、治療組成物と治
療法に用いるこれら非ヒト担体タンパク質のクローン化
と発現に有用である。結局、この発明のDNA 分子、又は
それから調製若しくは誘導したオリゴヌクレオチドは、
担体タンパク質若しくは担体タンパク質サブユニットで
はない担体タンパク質様ポリペプチドをコードする他の
DNA 分子を選別するのに利用できる。これらの分子とポ
リペプチドもこの発明の一部である。

【０１７０】担体タンパク質の活性を示すポリペプチド
の発現 担体タンパク質様ポリペプチドをコードするDNA 分子を
発現させることによるポリペプチドの製造は、イー・コ
リと哺乳類の細胞で行った。

【０１７１】別のシグナル配列を有する全長の担体タン
パク質様配列の、イー・コリ中での発現 遺伝子のシグナル配列がプレプロインシュリンに対する
それによって置換されている担体タンパク質遺伝子の全
コーディング領域を含有するDNA 断片を、発現ベクター
pKK233−２ (ファーマシア社) に連結した。このベクタ
ーは、−35trpシグナルが lac−10領域から17塩基の距
離 (共通距離) のところに位置するtrp−lac 融合プロ
モーターをもつている。lac オペレーター配列が存在す
ると、IPTG (イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド）を培地に添加することによって、このプロモー
ターからの発現が誘発される。その上に、このベクター
はlacZリボソーム結合部位を含有している。

【０１７２】担体タンパク質遺伝子の成熟コーディング
配列に融合されたプレプロインシュリンシグナル配列を
含有する挿入断片(pDJ4219) は、以下の方法 (図９に示
す)で作ることができる。その開始ATG が NcoI 制限部
位内に含有されているプレプロインシュリンシグナル配
列を合成した。そのシグナル配列に、 SacI 部位を通じ
て、成熟担体タンパク質の最初の４つのアミノ酸をコー
ドするヌクレオチドGGCGCGAGCTCGが続いている。したが
って図９に示す NcoI ／ SacI 断片を生成させることが
できた。この断片を、また図９に示す、担体タンパク質
のコーディング配列の残りの部分を含有する SacI ／ X
hoI 断片に連結した。 XhoI 部位は、翻訳終止部位をこ
えて85bpのところに位置しているが、標準の方法を用い
て、HindIIIリンカーを付加することによって、Hind II
I部位に予め変換してあった。プレプロインシュリンシ
グナル配列と担体タンパク質コーディング領域とをもつ
ている、得られた NcoI ／Hind III断片をpKK233−２の
NcoI 部位とHind III部位に挿入した。IPTGで誘発され
た、イー・コリ中のこの構造の発現によって、25,000〜
30,000ダルトンのタンパク質が得られ、抗担体タンパク
質抗体に結合するその性能によって同定された。発現は
³⁵Ｓ−システインの存在下で行った。IPTGで誘発して２
時間後に、細胞抽出物（細胞質と細胞周辺腔）を抗担体
タンパク質抗体で免疫沈澱させて、SDS-PAGEに付した。
担体タンパク質の、IPIGによって誘発される性能が照明
された。というのは、IPTGによる誘発なしで増殖され
た、上記の構造を有する細胞は、ほんのごくわずかな量
の25,000〜30,000ダルトンのタンパク質しか発現しなか
ったからである。pKK233−２だけを試験した対照の試料
は、上記の大きさの範囲のタンパク質を全く示さなかっ
た。

【０１７３】部分担体タンパク質様配列の、COS 細胞内
での発現 pDJ4209 とpDJ4211 由来の挿入断片 (図10に示す) を、
哺乳類発現ベクターpSVL若しくはpDJ4210 ( ファマシア
社) のユニーク XbaI 部位に連結した。pSVLはSV40の後
期プロモーター、イントロン及びポリアデニル化部位を
もつている。またpSVLは、SV40とpBR322の複製開始点も
もっている。pDJ4210 はpSVLと似ているが、xBR322の代
わりにpUC19 の複数開始点をもっている。

【０１７４】これらの挿入断片は各々、部分担体タンパ
ク質遺伝子、具体的にいえば、成熟配列の最初の120 の
コドンと、これに続いて、読取り枠を終結する合成配列
(5′−CTCTAGAG・・ 3′) とをもっている。各々以下の
ような異なる制御領域をもっている。

【０１７５】pDJ4209 は、 EcoRI部位からストレッチし
ている全５′非翻訳領域（114 のヌクレオチド) をもっ
ているが、予め XbaI 部に変換されてある。またpDJ420
9 は担体タンパク質シグナル配列も含有している。pSVL
に含有されているpDJ4209 XbaI 断片はpDJ4207 と呼称
する。

【０１７６】pDJ4211 は、44のヌクレオチドの５′非翻
訳領域と担体タンパク質シグナル配列を含有している。
pDJ4210 に含有されているpDJ4211 XbaI 断片は、pDJ4
212と呼ばれ、図11に示してある。

【０１７７】部分担体タンパク質遺伝子を含有するベク
ターを、COS 細胞 (欠陥SV40で形質転換されたサル細
胞) に移入させ、一過性の発現を測定した。細胞はDMEM
-F12中で増殖させた。タンパク質に³⁵Ｓ−システインで
標識をつけた。培地を集め、抗担体タンパク質抗体で免
疫沈澱させ、SDS-PAGEに付した。pDJ4212 とpDJ4207 を
用いる発現の試験によって、約14,000ダルトンと約16,0
00ダルトンの２つのタンパク質を得た。これらのタンパ
ク質の発現はpDJ4207 よりもpDJ4212 の方が大きかっ
た。

【０１７８】全長の担体タンパク質様配列のCHO 細胞に
おける発現 全担体タンパク質遺伝子＋５′と３′の非翻訳領域（夫
々114 と700 のヌクレオチド) を含有するLCP 2.3 の1.
66kb EcoRI／Hind III断片を、β−アクチンプロモータ
ー（スタンホード大学の認可を受けた）と、哺乳類細胞
中での発現に必要な他の機能とをもっている哺乳類発現
ベクター pKG3226に挿入した。得られたベクターを pKG
4403と呼称し図12に示す。pKG4403 を用いてCHO(チャイ
ニーズハムスター卵巣) 細胞を形質転換し、安定して形
質転換された細胞系を薬剤選択法によって得た。形質転
換されたCHO のプール由来の血清のないよう調整された
培地を、³⁵Ｓ−標識生成物の免疫沈澱法と、SM-Cウエス
タン法での ¹²⁵I-SM-Cに結合する性能とによって、担体
タンパク質様ポリペプチドの発現について分析した。免
疫沈澱によって検出するために、細胞を、10％のウシ胎
児血清で補充したDMEM-F12中で80％の集密度まで増殖さ
せ、血清なしの培地に移し、１時間システインを供給せ
ず、続いて一夜、³⁵Ｓ−システインで標識を付けた。そ
の培地を、抗担体タンパク質サブユニット抗体で免疫沈
澱させ、得られたタンパク質を、還元条件下、SDS-PAGE
で分析した。37,000と39,000ダルトンの担体タンパク質
様ポリペプチドが特異的に同定された。SM-C結合製を検
出するため、血清なしに調整された培地 (標識がついて
いない) を、形質転換プールを接種して48時間後に集
め、非還元条件下でSDS-PAGEに付した。そのタンパク質
をそのゲルからニトロセルロースフィルターに移し、
¹²⁵I-SM-Cでプローブした。43,000ダルトンを45,000ダ
ルトンの２つの新規の担体タンパク質様ポリペプチドが
観察された。 CHO細胞に内在する23,000ダルトンのタン
パク質は、形質転換されていない対照CHO プールのみな
らず形質転換されたプールにも検出された。大きさの差
異 (37,000と39,000対43,000と45,000) は、恐らく、SD
S-PAGEが還元条件下かまたは非還元条件下で行ったこと
が原因であろう。

【０１７９】LCP 2.3 のこの遺伝子は、単一若しくは多
重の、塩基置換、欠落、挿入若しくは逆位を含む突然変
異のような遺伝子の修飾が、遺伝子にまだ起こっていな
いか、又は遺伝子の特性若しくはその遺伝子から発現さ
れるポリペプチドの特性を修飾するのに続いて採用され
ないという可能性がある。またこの遺伝子は、図６〜図
８に示すものに比べて生理的に類似しているが構造がわ
ずかに異なる遺伝子若しくはポリペプチドをもたらすこ
とになる多型性を排除しない。

【０１８０】勿論、通常の方法でポリＡ⁺ RNA 由来のク
ローン化されたcDNAが５′−末端ヌクレオチドを欠き、
人工的な分子さえ含有していることは理解されるべきで
ある。

【０１８１】図６〜図８に示すポリペプチドの構造は、
勿論、生体酵素との相互反応によって起こるポリペプチ
ドの修飾はいずれも、例えばグリコシル化を考慮してい
ない。それ故に、図６〜図８に示すアミノ酸分子は、生
体内に産生される担体タンパク質と同一でないことは理
解されなければならない。

【０１８２】担体タンパク質活性をコードする染色体遺
伝子が細菌宿主内では発現できないのは、これらの介在
分子がかような宿主によって適正に処理されないからで
あるとはいえ、染色体遺伝子は、恐らく、真核宿主中に
担体タンパク質様ポリペプチドを産生する場合に非常に
重要であろう。なおこの真核宿主のなかでは、ヒトの、
非コーディング領域、イントロン及びコーディング領域
が、高レベルで発現させて、生成物を適正に処理して生
物学的に活性の担体タンパク質様ポリペプチドにするの
に重要である。

【０１８３】担体タンパク質の活性を示すポリペプチド
の収量と活性の改善 タンパク質の産生レベルは３つの主要因子で支配され
る。即ち、細胞内のその遺伝のコピーの数、これら遺伝
のコピーが転写される効率、及びそれらが翻訳される効
率である。転写と翻訳（両者で発現を構成している）の
効率は、さらに、所望のコーディング分子の前記通常位
置するヌクレオチド分子に依存している。これらのヌク
レオチド分子、即ち発現制御分子は、RNA ポリメラーゼ
が相互に作用して転写を開始し (プロモーター分子) 、
リボソームがmRNA (転写反応の生成物) と結合し相互に
作用して翻訳を開始する位置を決定する。かような発現
制御分子がすべて、等しい効率で機能するわけではな
い。したがって、所望のタンパク質の特異的なコーディ
ング分子を、その隣接ヌクレオチド分子から分離し、代
わりに、そのコーディング分子を他の公知の発現制御分
子に融合させて、高レベルの発現を促進することが有利
である。これが達成されたならば、新しく設計されたDN
A は、細胞内の遺伝子コピーの数を増大してさらに発現
タンパク質の収量を改善するために、高いコピー数のプ
ラスミド又はバクテリオファージ誘導体に挿入できる。

【０１８４】いくつもの発現制御分子が上記のように採
用される。これらの分子には、オペレーター、プロモー
ター、及びイー・コリのラクトースオペロン（“lac
系”）のリボソーム結合分子とリボソーム相互作用分子
(シャイン・ダルガルノ分子のような分子を含む) 、イ
ー・コリのトリプトファンシンテターゼ系（“trp
系”）の対応する分子、ファージλの主要なオペレータ
ーとプロモーターの領域（Ｏ _L Ｐ_L とＯ_R Ｐ_R ）、T7RN
A ポリメラーゼにしか認識されないバクテリオファージ
T7プロモーター、繊維状一重鎖DNA ファージの制御領
域、SV40の初期と後期のプロモーター、アクチンプロモ
ーター、レトロウイルスの長い末端繰返し部に位置する
プロモーター、又は真核細胞若しくは原核細胞及びそれ
らのウイルス又はその組合せの遺伝子の発現を制御する
その外の分子が含まれる。それ故に、適切な宿主内での
特定のポリペプチドの産生を改善するために、そのポリ
ペプチドをコードする遺伝子を、従来どおりに調製し
て、その前者の発現制御分子の近くで、又は前記の改善
された発現制御分子の１つの制御下で、組換えDNA 分子
に挿入される。このような方法は当該技術分野で公知で
ある。

【０１８５】翻訳の効率を改善するその外の方法には、
開始コドンの前に、化学的若しくは酵素で作られたオリ
ゴヌクレオチドを挿入する方法がある。この方法によっ
て、一層適切な一次構造と二次構造の伝令RNA を得るこ
とができる。さらに具体的に述べると、分子は、AUG 開
始コドンが、ヘアピンの頂部若しくは他の一重鎖領域の
容易に接近できる位置 (即ち二次構造でマスクされてい
ない位置) に生成するように設計することができる。ま
た前記のシャイン・ダルガルノセグメントの位置と分子
も同様に最適化することができる。伝令RNA の一般構造
(折たたみ構造) の重要性が証明されている。

【０１８６】所望の生成物の細胞収率のさらなる増大
は、細胞内で利用できる遺伝子の数を増やすことによっ
てきまる。これは、担体タンパク質様遺伝子の挿入によ
って (その転写と翻訳の制御要素のあるなしにかかわら
ず) 、高コピー数プラスミド又は温度でコピー数が制御
されるプラスミド (即ち、プラスミドのコピー数が温度
を上昇させると増大するような突然変異部分を有するプ
ラスミド) 内で達成することができる。

【０１８７】あるいは、遺伝子量の増大は、例えば、さ
きに記載された方法で設計された組換えDNA を溶原性バ
クテリオファージに挿入して (最も簡単にはそのプラス
ミドを制限酵素で消化して行う) 、１つの線状分子を作
ることによって達成され、次いでこの線状分子は制限フ
ァージλクロニングビヒクルと混合され、DNA リガーゼ
とともにインキュベートすることによってその組換えDN
A 分子が産生される。次に所望の組換えファージが従来
どおりに選択され、宿主菌株のイー・コリを溶原化する
のに利用される。

【０１８８】それ故、この発明の挿入DNA は、さきに述
べたような他の発現ベクター、及び先に述べたような各
種の宿主に用いられるこれらのベクターに挿入されて、
担体タンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現
が改善されることは理解されるべきである。

【０１８９】またこの発明によって製造される担体タン
パク質様ポリペプチドの生物活性は、この発明のDNA 分
子を使って、哺乳類細胞系を形質転換しその系で遺伝子
を発現させることによって改善することができる。この
ような哺乳系は公知である。かような系の１つは、CHO
（チャイニーズハムスター卵巣）(DHFR)細胞系であり、
この系では遺伝子の発現はメトトレキセート(MTX) によ
って増幅される。これらの発現系はグリコシル化タンパ
ク質を産生することができる。かような細胞は、担体タ
ンパク質様遺伝子のコピー数を大きく増大するよう誘導
することができる。

【０１９０】また担体タンパク質様ポリペプチドは、融
合タンパク質の形態 (例えば分泌を指向する真核若しく
は原核のＮ末端セグメントに連結された形態）、プロ担
体タンパク質様ポリペプチドの形態（例えば、分泌時に
切断できる担体タンパク質シグナル分子のすべて若しく
は一部で出発する形態）、又は成熟担体タンパク質様ポ
リペプチドとして（発現と分泌中の初期のメチオニンを
含む外来性アミノ酸の分解によって）、又はf-met 担体
タンパク質様ポリペプチドの形態が製造できることは理
解されるべきである。この発明の特に有用な１つのポリ
ペプチドは、容易に分解されるアミノ酸、又はアミノ末
端に接続される一連のアミノ酸を有する成熟担体様ポリ
ペプチドである。このような構造によって、そのタンパ
ク質は適切な宿主中で合成することができ（その宿主に
は成熟担体タンパク質サブユニットには存在しない開始
シグナルが必要であるが）、次いで余分のアミノ酸が切
断されて成熟担体タンパク質サブユニットが産生され
る。

【０１９１】担体タンパク質サブユニット又は担体タン
パク質様ポリペプチドを、治療様に、ソマトメジン様分
子と組合わせて使用しなければならない場合、２つの分
子を、同じ細胞内、好ましくは哺乳類細胞内に共産生(c
o-produce)させてもよい。両方の遺伝子を含有するベク
ターで共形質転換(cotransform) してもよく、両方のタ
ンパク質を発現する安定な細胞系を選択してもよい。し
たがって、担体タンパク質様ポリペプチドとソマトメジ
ン様ポリペプチドの両者を含有する複合体を産生するに
は、唯一の発酵・精製方式が必要である。

【０１９２】これらの異なる形態のポリペプチドの収率
は、上記のいずれかの方法若しくはその組合わせによっ
て改善することができる。この発明のDNA 分子に用いら
れるコドンのいくつか若しくはすべての異なるコドンは
置換することができる。これらの置換されたコドンは、
置換されたコドンがコードするアミノ酸と同一のアミノ
酸をコードするが、ポリペプチドが一層高い収率で得ら
れる。あるいは、１つのコドン又はコドンの組合わせを
置換して、アミノ酸を置換するか、又は担体タンパク質
様ポリペプチドを長くするか若しくは短くすることによ
って、ポリペプチドの特性を有用な状態に変化させるこ
とができる（例えは安定性が増大し、溶解性が増大し、
治療活性が増大する）。

【０１９３】結局、この発明の組換えDNA 分子で産生さ
れるポリペプチドの活性は、この発明の範囲を逸脱する
ことなく、公知の手段によって、この発明のDNA 分子又
はポリペプチドを断片化するか、収縮するか、又は誘導
体化することによって改善することができる。

【０１９４】この発明の発明者等は、この発明のいくつ
かの実施態様を記載したが、これらの実施態様を変更し
て、この発明の方法と組成物を利用する他の実施態様を
提供することができることは明らかである。この発明の
範囲は実例として提供した特定の実施態様ではなくて特
許請求の範囲によって定義される。

【図面の簡単な説明】

【図１】約15,000ダルトンの分子量を有するヒト担体タ
ンパク質サブユニットのＮ末端の42のアミノ酸残基の配
列と、トリプシン断片のT1、T6、T7、T1′及びT10 のＮ
末端の配列とを示す図である。

【図２】図１に示すサブユニットのＮ−末端の57のアミ
ノ酸の配列と、プローブとして用いるよう設計されたア
ミノ酸29−44をコードするオリゴヌクレオチド（48mer)
とを示す図である。

【図３】181bp の合成DNA のタンパク質とDNA 配列と、
その対応するタンパク質の配列とを示す図である。

【図４】図２のプローブと雑種を形成したDNA 挿入断片
LCP 0.70とLCP 0.77の大きさと制限部位、及びこれらDN
A 挿入断片LCP 0.70とLCP 0.77のDNA 配列を有するプロ
ーブと雑種を形成したDNA 挿入断片LCP 2.3 の大きさと
制限部位を示す図である。

【図５】LCP 2.3 の配列を決定する方法を示す図であ
る。

【図６】DNA 分子LCP 2.3 のコーディング鎖のヌクレオ
チド配列と、それがコードするポリペプチドの291 のア
ミノ酸のアミノ酸配列とを示す図である。

【図７】DNA 分子LCP 2.3 のコーディング鎖のヌクレオ
チド配列と、それがコードするポリペプチドの291 のア
ミノ酸のアミノ酸配列とを示す図である。

【図８】DNA 分子LCP 2.3 のコーディング鎖のヌクレオ
チド配列と、それがコードするポリペプチドの291 のア
ミノ酸のアミノ酸配列とを示す図である。

【図９】イー・コリ細胞内で発現させるのに用いる、 p
KK233-2 に挿入された264 のアミノ酸を有するヒト担体
タンパク質様ポリペプチドの遺伝子を含有するベクター
pDJ4219 の機能・部分制限地図を示す図である。

【図１０】適切な宿主を形質転換するために用いられ、
培養すると担体タンパク質様ポリペプチドを産生するベ
クターに用いられる各種の組換えDNA 分子の製造方法を
示す図である。

【図１１】COS 細胞内で発現させるのに用いる、pSVL誘
導体pDJ4210 に挿入された成熟担体タンパク質の最初の
120 のアミノ酸を有するヒト担体タンパク質様ポリペプ
チドの遺伝子を含有するベクターpDJ4212 の機能・部分
制限地図を示す図である。

【図１２】CHO 細胞内で発現させるのに用いる、pKG322
6 に挿入された264 のアミノ酸を有するヒト担体タンパ
ク質様ポリペプチドの遺伝子を含有するベクターpKG440
3の機能・部分制限地図を示す図である。

【図１３】循環中のSM-Cの半減期に対する15kDa の担体
タンパク質サブユニットの作用を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３ Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｃ 39/395 39/395 Ｎ Ｄ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/36 (72)発明者 キャロル，トーキントンヴァサー アメリカ合衆国 94903 カリフォルニア サンラファエル イディルベリーロード 1304

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ソマトメジン様ポリペプチドと結合でき
   る担体タンパク質サブユニット以外の実質的に純粋な担
   体タンパク質様ポリペプチドに対する抗体であることを
   特徴とするモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ソマトメジン様ポリペプチドと結合でき
   る担体タンパク質サブユニット以外の実質的に純粋な担
   体タンパク質様ポリペプチドに対する抗体であることを
   特徴とするポリクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒト体液中の遊離ソマトメジンの濃度を
   測定する方法において、ソマトメジン様ポリペプチドと
   結合できる担体タンパク質サブユニット以外の実質的に
   純粋な担体タンパク質様ポリペプチドと複合したソマト
   メジンを未結合のソマトメジンから分離することを特徴
   とする遊離ソマトメジン濃度測定方法。