JPH03169892A - Ｅｂｚｄ蛋白質に対する抗体 - Google Patents

Ｅｂｚｄ蛋白質に対する抗体

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JPH03169892A
JPH03169892A JP2269722A JP26972290A JPH03169892A JP H03169892 A JPH03169892 A JP H03169892A JP 2269722 A JP2269722 A JP 2269722A JP 26972290 A JP26972290 A JP 26972290A JP H03169892 A JPH03169892 A JP H03169892A
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amino acid
amino acids
ebzd
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brain
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JP2269722A
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Mohammed Shoyab
ショヤブ，モハメッド
Hans Marquardt
マルカート，ハンス
George J Todaro
トダロ，ジョージ　ジェイ．
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Oncogen LP
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
患（腫瘍形成を含む）の基本的原因であると思われる。
増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（例え
ば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興味が
持たれており、更にまた特に有糸分裂が癌に影響を及ぼ
すかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を理解
することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はりガンド又はレセプ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に
用いられているペンゾジアゼピン（ＢＺＤ）は、Ｔ−ア
ミノ酪酸（ＧＡＢＡ）で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。
ＢＺＤによるＧＡＢＡ一作働性伝達の調節における第一
段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ飽
和できる結合部位に対する結合であると思われ、この場
合にその結合部位は“超分子複合体”（ｓｕｐｅｒ＋＋
＋ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏａ＋ｐｌｅｘ）の威分てある
と考えられる。この系を理解すること、及びその系を調
節又は制御することができることの必要性は、天然リガ
ンド及びそれが機能する態様を知ることに依存している
． これらの因子の検出、単離及び精製は、その混金物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのパイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生戒物の検出及び単離の助けとなって
いる。
〔従来の技術〕
Ｂｅａ　１等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
　ｈ　ｓ．（１９７９）　３　：９３　−　９６は、増
殖及びＤＮＡ合戒を正常細胞中でよりも形質転換細胞中
で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在することを
報告している。Ｈｏｌｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｔ．（１９８０）７７　：　５９
８９−５９９２は、上皮細胞成長阻害物質の精製を記載
している。
Ｌｅｔａｎｓｋｙ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｒｅ　．　（１
９８２）　２　：　３９−４５は、ウシの胎盤から精製
されたペプチドがｍ瘍の増殖及びＤＮＡ中へのチごジン
の取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑
制することを報告している。Ｃｈｅｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．（１９８２）　７　：３
６４　−　３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹
水流体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄ　ｉ
ｎｇ及びＳｃｈａｌｌｙ　，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９８２）７９：７０１４−
７０１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して
抗一分裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視
床下部から単離することを報告している。これらの殆ど
の因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの
基本的構造は知られていない。
ジアゼパム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（
１９８３）６０　：　３８３−３８５、Ｃｏｓ　ｔａ等
、Ｎｅｕｒｏ　ｈａｒｍａｃｏｌ．　（１９８４）２３
：　　９８９　　９９ＬＦｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒｏ
ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　（１９８４）２３　：　１３５
９１３６２、及びＡｌｈｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９
８５）　２２９　：　１７９−１８２によって報告され
そして説明されている。
〔発明の概要〕
新規な方法及び組成物が提供され、これらの組成物は、
ゲル浸透力ラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジェントの酸性（０．１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の或分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組底物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配゜列が提供
され、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチド
の生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結
合する抗体が提供される。
〔具体的な説明〕
天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規なＭｉ威物、及び種々の
ポリペプチドをコードしている核酸配列が提供される．
そのポリペプチドは脊椎動物、特に啼乳動物の脳細胞中
に天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は
実質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をも
つ．その諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そして
脳細胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲
の種々の組織中に一般的に見いだされる．このポリペプ
チドは、ホモジナイズされた脳組織又はその精製された
両分を用いてクロマトグラフィーカラムから酸性水性ア
セトニトリル溶離剤で溶出することによって単離可能で
あることを特徴とする。一つの因子は逆相ＨＰＬＣ及び
ゆるやかな直線グラジエントの酸性水性アセトニトリル
を用いてクロマトグラフィーによって実質的に純粋に単
離することができる。その他の成分については所望の活
性は水性酸性ｎ−プロパノールを直線グラジエントとし
て用いて更に精製することができる．そのクロマトグラ
ムは、約０．　１〜０．５ａｆｆｉ／分の流速で合理的
な分離を得るために４時間以上の時間にわたって展開す
ることができる．逆相ＨＰＬＣを用いての分離では脳組
織からの部分的に精製されたサンプルをもたらすのが普
通である．部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグラフィ
ーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリルを用い、
特に均一に溶出することによって好都合に達成すること
ができる．好都合には、媒体は０．　１％トリフルオロ
酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルであることができ
る。
二或分は実質的に異なった生理学的活性及び組或をもつ
．内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼピン（１
！ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ペイ’）　ウＬ　
（ｖａｌｉｕｍ）アゴニストとしてジアゼバムレセブタ
ーに結合する活性を示し、そして細胞賞蛋白質であるこ
とは明らかである，　ＥＢＺＤは、低い投与量では、啼
乳動物に興奮及び増強された意識を引き起こし、一方高
い投与量では、鎮静を引き起こす．拍動心臓細胞集合体
については、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一
方高い投与量では心臓拍動度数は増大する．それらの化
合物はジアゼバム結合性阻害剤について公表された（前
記のＧｕｉｄｏｔｔｉ等の文献）配列との幾らかの相同
性を示す． このペプチドは、脳シナプトソームへのペンゾジアゼピ
ンの結合を抑制することにおいて、約１〜１０−、普通
には３〜６−のＫｉをもつことを更に特徴とする（後記
の実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約７〜１５ｋ
Ｄａｌ、普通には８〜１２ｋＤａｌ，又はＳＯＳ−ＰＡ
ＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記の
実験の項を参照のこと）。このペブチドは親水性である
。１０００ユニット／■を越える比活性を得ることがで
きる（後記の実験の項を参照のこと）。
ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのア藁ノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異なっ
た種にわたる共通配列）はジアゼバム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。
第二の成分は脳因子（ＢＰ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い。その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の戒長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形或
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
８Ｆは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５　〜２ＱｋＤａｌ，普通には約８〜１８ｋＤａｌ
の分子量をもつ。この蛋白質は逆相ＨＰＬＣ及び直線グ
ラジエントの０．　１％ＴＰＡ水性ｎ−プロバノールを
用い、約２０〜２６％ｎ−プロバノールで溶出して精製
することができる。その精製された蛋白質は少なくとも
約１５　Ｘ　１０’ユニット／■の比活性をもつことが
できる（後記の実験の項を参照のこと）。
第三威分は、アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤ
のアミノ酸５４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるブローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペブチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。
これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には哺乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズご、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセブター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のペプチド、例えば、抗体形或のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合させ、又は１個以上の、普通には数で
約ｌＯ％以下の、一層普通には数で約５％以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるア旦ノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する。
ＥＢＺＤポｌペブチド ＥＢＺＤボリ゛ペプチドは約２０キロドルトン（ｋＤａ
ｌ）未満、普通には約１５ｋＤａｌ未満であることを特
徴とし、そして普通には少なくとも約１　ｋＤａｌ，一
層普通には少なくとも約２ｋＤａｌである。
そのポリペプチド組成物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下
で０．１％水性トリフルオロ酢酸中の０〜６０％アセト
ニトリルの直線グラジエントを用いて、２８〜５０％ア
セトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、一層
特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、一層特異的
には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμ−ボンダ
パック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　　Ｃ＋ｓカラムから溶出
することを更に特徴とする。
ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、一層普
通には少なくとも約２０個のアミノ酸、そして約１２５
個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よりも少
ないアミノ酸をもつ．天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約７〜１５ｋＤａ　Ｉの範囲内の分子量を
もつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも２つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
ａ．　Ｙ　ａａａ　ａａａ　Ａｒ　Ｋ　Ｑ　Ａ　Ｔ　ａ
ａｂｂ．ＫＷＤＡＷ ｃ．　Ａ　Ｍ　ａａｃＡ　Ｙ　（Ｘ）Ｘ　Ｖ　Ｅ　Ｅｄ
．　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａｃ　ａａｐＥ　Ｅ　Ｍ　Ｌ　Ｆ　
Ｉ　Ｙ　ａａａ　Ｈ　Ｙ　Ｋｅ．ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥ
ＲＰＧＭＬＤｆ．　　ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬ
ＤＦＴＧＫｇ．κＧＴＳＫＥＤＡ 上記の配列において、 ａａａは芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及びヒ
スチジンであり； ａａｃはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり； ａａｃはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定
的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり； ａａｃは脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａａは脂肪族中性アミ
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもので
あり；ａａｃは脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミドで
あって且つ４〜５個の炭素原子をもつものであり； Ａｒは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フエニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にＹを包含
し； ａａｑは脂肪族アミノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； ａａｐは脂肪族アミノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり；そして Ｘは０又は１である。
主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＥ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のア逅ノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである： ａ．　　ＴＫＰａａｃ　　ロＥＥＭＬＦＩＹａａａ　　
ＨＹＫＱＡＴａａｃ　　Ｇｂ．　ＫＷＤＡＷａａｃ　ａ
ａｃ　　Ｌａａｃ　ａａｃ　ａａｋａａＬＫＥａａａ　
ＡＭａａカＡＹ　（Ｘ）ｘＶＥＥ　ａａｃ　ＫＫ ｃ．　ＫＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤＦＴ上記の
配列において、 ａａｃ　１　８ａ”　Ｈ　ａａ″、及びＡｒは前記で定
義した通りであり； ａａｃは脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜゜６
個の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には５〜
６個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ； ａａｃは脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、−
ｉ普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミノ
酸であり： ａａｃは脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アミノ酸であることができ； ａａｃは脂肪族ア逅ノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性
中性ア逅ノ酸であり； ａａｊは中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、一層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり； ａａａは脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、一層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性ア逅ノ酸であり；ａａｃ　は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり； ａａ一は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ酸
であり： ａａｃは約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａゝは脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａ１は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又は
極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロキ
シル基をもち、好ましくはＡであり；Ｘ′はＸと同じで
あり、普通には１〜３個のアミノ酸であり、それは脂肪
族アミノ酸であり、それは一般的には４〜６個の炭素原
子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特に
Ｎ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド、
及び塩基性アミノ酸であり； Ｘは０又は１であり；そして ａａｃは脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性ア逅ノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ．Ｘの他に更に、本発明
のポリペプチド群の種々のメンバー間に共通構造を維持
するために１〜３個、好ましくは１〜２個の挿入又は欠
失があってもよいことが理解されるであろう。又、アミ
ノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが、ある場合には、Ｄ−
アごノ酸が使用されてもよい． 特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：ψ−Ｚ’　−ａａｃ−ａａａ−ａａｃ
−ａａｃ−ａａｃ−ａａａ−ａａｃ−ａａａκ一ａａａ
−ａａａ−ａａａ−ａａａ−ａａａ−Ｐ−ａａａ−ａａ
ａＥ−ａａｃ　”−Ｍ−Ｌ−ａａａ−ａａ！３−Ｙ−ａ
ａ！ｓ−ａａａａａａ−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｔ−ａａａ−Ｇ−
ａａａ−ａａａ−ａａａａａａ−ａａａ−ａａａ−Ｐ−
Ｇ−ａａａ−ａａａ−Ｄ−ａａａａａ“−Ｇ−ａａａ−
ａａａ−Ｋ−Ｈ−Ｄ−＾−ＬａａＳｓａａａ−Ｌ−ａａ
ａ−ａａａ−ａａａ−ａａａ　−Ｋ−Ｂ−ａａａＡ−Ｍ
−ａａａ−ａａａ−Ｙ−（Ｘ）ｘ　−Ｖ−［４！ａａａ
一Ｋ−Ｋ−ａａａ−ａａ？７−ａａａ−ａａａ−　Ｚｃ
上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜ｌＯ個のアミノ酸、好ましくは１〜
９個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばＥ−Ａ−Ａ又はＨ−Ｅ−Ｔ−Ｒ等も
ａ１に結合することができ、またこの場合に、２個のア
ミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれかのア
ミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じライン上のア
ミノ酸が一緒に採用され；ａａｃ・ａ・■は２〜６個の
炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特にグリシ
ン、アラニン、プロリン、パリン、ロイシン及びイソロ
イシンであり； ａ　ａ　Ｓ　ｒ　Ｉ　＆　＋　ｔ　％　＊コ％＋　３？
＋　３５１　６１１１　６１１　Ａｌｌ　７３１　？雫
は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合
に特にａａｃ・＋６・ｚｓ・３Ｓ＋３’ｌ・７３・７９
がいずれかのものであり、そして残りが好ましくは極性
ア累ノ酸、特にセリン、スレオニン、システイン、メチ
オニン、アスパラギン及びグルタミンであり； ａ１ｎ　ｈ＊　’Ｉ・ｌ’ｌ＋　１４ｓ　１！＋　２４
＋　３＠・％６＋　５９・ｈ４＋　１Ｂは脂肪族中性ア
ミノ酸（極性及び非極性アミノ酸を包含する）又は脂肪
族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタξン酸
であり；特に８１・７・３１．　３４・Ｓ９゜７ｓは中
性アミノ酸である時に非極性であり、残りは中性アミノ
酸である時に極性であり、そしてまた，，Ｉｎ　＆＋　
７＋　１’？＋　１９．３４＋　３ｆｒｒ　Ｓ６＋　ｈ
ａ　は好ましくは酸性アミノ酸であり； ａａｚ・１０−　１ｆｆ＋　ｔ’Ｊｒ　！Ｓｖ　２ｈ＋
　！？＋　４２＋　４３＋　４５＋　４９＋ママは脂肪
族中性アミノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラ
ニン、ヒスチジン、チロシン、及びトリプトファンであ
り、好ましくは、ａａａ・＋＋１＋！＆・２７・４Ｓ・
７７は好ましくは芳香族アミノ酸であり、一方残りのア
ミノ酸は好ましくは脂肪族アミノ酸であり；ａａ２＋　
９・１！＋　１４１　３６１　３９゜４＆＋　４酋＊　
Ｓｌ＋　ｂ’ｌ＊　’ｌ−は脂肪族中性又は塩基性アミ
ノ酸、即ちリジン及びアルギニンであり、この場合にａ
ａ３′５８．　６’ｌｌ　ｆ＆は塩基性以外の時に好ま
しくは非極性であり、そして残りは塩基性以外の時に好
ましくは極性であり、但しａａ４ｋは極性でも非極性で
もよく、そしてａ　ａ　３　＋　１　２　ｒ　＋　４・
３９゛４１＋　Ｓ１１＋　ｂ”ｌ゜７ｂは好ましくは塩
基性アミノ酸であり；ａａ２″は塩基性又は芳香族、特
にフエニルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてｚＣはＯ
Ｈ，ＮＨ！、又は１〜６個の、普通には１〜４個のアミ
ノ酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のアミノ酸
の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列Ｍ−
Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配列である。
１個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも１５個、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸
を配列中にもつ： Ｅ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアえノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を
意図しており、そして２は０又はｌである。その配列は
合計でｌＯ個までの、普通には合計で８個までのアくノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ一末端は
追加の配列Ｖ−Ｈ−Ｅ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの部
分をもつことができ、モしてＣ一末端は配ＪＩＪＭ−Ｐ
−１’ｌ−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことがで
きる． 特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約工
５個、好ましくは少なくとも約２０個、一層好ましくは
少なくとも約３０個の７５ノ酸をもち、下記の配列の１
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２
個、そして一層好ましくは少なくとも１５個の、星印（
＊）で示したアミノ酸を含む＜ｂ＝ウシ、ｈ＝ヒト）． Ｈ−Ｍ−Ｋ−Ｋ４−Ｌ−Ｈ−Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔ本本 Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−１ 本発明の特に好ましい組成物については、上記の諸配列
が、約５個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約３個以下
のアミノ酸によってである。
ＥＢＺＤ組成物は少なくとも約２０％の純度、一層普通
には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
それが由来する組織からの成分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が■重量％未満、好ましくは約０．　１
重量％未満、一層好ましくは約０．００１重量％未満で
あるＥＢＺＤ組成物は特に興味がある。本発明のＥＢＺ
Ｄ＆［ｌ戒物は、後記の実験の項で記載するアノセイ条
件下で粗シナブトソーブ膜への’Ｉ＋−ジアゼバムの結
合を４０％競争に必要な量によって測定して、少なくと
も１５ユニット／■の比活性をもつ。
比活性は普通には少なくとも５００ユニット／■、好ま
しくは少なくとも約１０００ユニット／■であり、そ゛
して１２５０ユニット／■以上であってもよい。一般的
には、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組
織１ｇ当り少なくとも約１０，ｑ当量あり、そして普通
には脈絡叢中の湿った組織１ｇ当り少なくとも約２０ｘ
当量ある。前記したように、本発明の化合物は心臓細胞
集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼすこと
ができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下させ、こ
の少ない投与量は一般的には約１５０ｘ／ｉｌｆｆｉ未
満である（実験の項を参照のこと）　．　ＥＢＺＤのそ
の他の特徴は、生理学的活性がＥＢＺＤについて立証さ
れる種々の試験から明らかである。
凰返王 脳因子は少なくとも２ｋＤａｌ、一層普通には少なくと
も５ｋＤａｌそして約２５ｋＤａ　１以下、一層普通に
は約２２ｋＤａ　１以下であることを特徴とする。脳因
子は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように
、少なくとも約ＩＸＩＯ’、一層普通には少なくとも約
５Ｘ１０’、好ましくは少なくとも約１０ｈ１好ましく
は少なくとも約１．５Ｘ１０’の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約１０％の純度、一層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの戊分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい． 脳因子の配列は、Ｎ一末端近くに又はＮ一末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む：Ｎ−Ｋ−Ｅ−
Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−　１−
Ｘ−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示
す。
脳因子はヒトＴ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスボリンＡ又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも１桁の、 好ましくは少なくとも２桁のオーダーで識別することが
できる。
孜』０１ｉ 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： Ａ［ｉＡ らら６ （；Ａｔ； ＡＬｉＬｉ ＡＴじ じＡｔｉ しＡＩ ｒ１’ｌＪ ＡＬｉｉ ｌｊＡＡ ｌｊ′ｔ／ Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　＊ ＡＡＡ　ＴＴＧ　　ＡＡＣ　ＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡ
ＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧ＾＾　ｌ６９３＝Ｅ起Ｊｉ
ｌΩＩ１狸：ウシの脳に由来するｃＤＮＡクローンのヌ
クレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列（＊）。ア
ミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係で番号
づけされている。ＥＢＺＤと相同な領域は太線によって
上に線引きされており、そして疎水性及び非荷電のアご
ノ酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在的なグ
リコシル化部位は囲まれている。
それ故にペブチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、一層ｆ通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ。ＥＢＺＤとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約１０％の純度、好ましくは少なくとも約５
０％の純度、一層好ましくは少なくとも約８０％の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの域分を含まない
。
膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。
興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。
本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、一般的には
少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉａ＋ｐｅｔ）ヘモ
シアニン、グロプリン、等を用いることができる．ポリ
ペプチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えば
グルグルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息
香酸等を利用することができる。アジュバントとしては
フロインド（Ｐｒｅｕｎｄ）アジュバント、水酸化アル
ミニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔で１回以上の追加免疫注射を行なう．モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
その牌臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
ーと融合させる。
例えば、Ｇａｌｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ
　Ｉａ＋ｍｕ−ｕ圏ｕ（１９８７）８１　：　７７　：
米国特許第４，３８１．２９２号及び第４．３６３．７
９９号を参照のこと。しかしながら、特定の目的に対し
ては、その他の哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）
を、ヒトＦｉｌをもつ抗体の生産のために、用いること
ができる．ＥＢＺＤボリベブチド及びＥＢＺＤポリペプ
チドに特異的に結合する抗体は、個々に又は一緒にして
、インビボ及びインビトロの両方に用途がある。主題？
化合物はジアゼパムレセプターへの結合のためのアゴニ
ストとして用いることができる。本発明の化合物は、ジ
アゼバムレセブターの数及び分布を求めるのに用いるこ
とができる。加えて、本発明の化合物は哺乳動物宿主の
心臓拍動を調■するのに、哺乳動物宿主を鎮静させるの
に、又は哺乳動吻宿主に興奮を引き起させるのに用いら
れる。
脳因子ポリペプチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に
結合する抗体は、個々に又は一緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある．このポリペプチドは
腫瘍抑制特性をもっているので、このポリペプチドは、
腫瘍細胞の過度の増殖を抑制するために、正常細胞及び
腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合物と共に用いること
ができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる：正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる；骨
髄が啼乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合；細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる。
脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する（この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい）
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。
このポリペプチドは、ポリペプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アンセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性
粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３．
８１７．８３７号、第３，　８５０，　７５２号、第４
，１７４，３８４号、第４，２７７，４３７号及び第４
，３７４，９２５号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアンセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうがに依存する。種々のアッセイ法は
ＥＩＡ　，　ＥＬＩＳＡ　，ＲＩＡ　，ホモゲニアスＥ
ＩＡ　，　　ドットープロット、ウエスターンズ（Ｗｅ
ｓｔｅｒｎｓ）等と称される。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イディオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イディオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イディオタイプはジアゼバムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞距害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組成物は多数の種々の組織、例えば牌
臓及び精巣中に見いだすことができる。
本発明の化合物を単離するために、脳＆ｌｌＩｍから血
餅を排除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条
件下で有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４
ｋＤａ１未満である低分子量物質を除去する。
その生底物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０．　１％トリフルオロ酢酸
水溶液溶離剤を用いて処理して、その生或物の活性の抑
制剤として作用するらしい化合物を排除する．その諸両
分をパイオアッセイによって観察する．その生戒したＥ
ＢＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィー力ラム
、例えば、μ−ボンダパック−ＣＩ８カラムを用い、水
性０．１％トリフルオロ酢酸中の約０〜６０％アセトニ
トリルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及
び遅い溶出速度、例えば４時間以上、好ましくは５時間
以上を用いて更に精製した。本発明のＥＢＺＤ化合物は
約３０〜５０％アクリロニトリル、一層特定的には３０
〜４０％アクリロニトリルの両分中に見いだされる。
ＢＰ化合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、Ｏ．　１
％水性アセトニトリルの直線グラジエントを用い、３２
〜３６％アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回
以上繰り返して、更に精製する。このＷｗｉされた両分
を次いで、逆相肝ＬＣを用い、０．　１％水性ｎ−プロ
バノールの直線グラジエントを用い、約２２〜２４％ｎ
−プロバノールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り
返して、更に精製する。
他の方法として、本発明のポリペプチドは、特にポリペ
プチドが３０個未満のアミノ酸、一層特定的には２５個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合戒する
ことができる。例えば、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ，　Ｓｏｌｔｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｔｄｅ
　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ，″Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．
　　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙＳｐｅｃｉａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　　Ｐａｒｔ　Ａ
＋Ｖｏｌ．　２，　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅ
ｒｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（米国）　１９
８０、１〜２８４頁を参照のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約２０個以上のアくノ
酸をもつもの、一層特定的には約３０個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる．ポリペプチドをコード
するためにゲノムＤＮＡ，　ｃＤＮＡ、合ｒＩｉ．ＤＮ
Ａ又はそれらの組み合せを用いることができ、いずれか
のイントロンの存在はそのイントロンのための機能的ス
プライシング系をもつ宿主細胞を用いることによって解
決される。ほとんどの場合において、オープンリーディ
ングフレームが用いられ（イントロンなし）、この場合
にそのリーディングフレームをコードする配列は発現宿
主中で機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される
。
特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
れるｃＤＮＡがある。このｃＤＮＡは開始のメチオニン
から約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを含む。
下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している。
５’　−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡ
ＡＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴＮａｅｌ １ −Ｇ −Ａ Ｇ −Ｇ− −Ｇ −ＣＧ Ｈｉｎｄ　　ｍ ↓ −−−−−Ｔ−Ａ−ＴＧＴ−−−−−ＧＴＧ−−−ＡＴ
−−−−−−　　ＧＡＣ ＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡ
ＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡ　　　５１１ＴＧＡＣＴ
ＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧ八八八ＣＧＧＴＴＡ
ＣＴＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴ
ＣＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴ　
　　５９０ＴＧＴＴＡＣＴＴＴ／ＡＣＴＴＣＧ／ＡＴ（
ｐｏｌｙ　Ａ）−３’　　６０７上記はウシとヒトのヌ
クレオチド及びＥＢＺＤの推定されたアミノ酸配列を比
較して示し゛ζいる。ヒトの配列において異る残部はウ
シの配列の上及び下に示されており、それは３つのオー
バラップするｃＤＮＡクローンから求められた。ヌクレ
オチド残部はウシのクローンの複合配列に関して番号付
けされており、アミノ酸残基は開始のメチオニンに関し
て番号付けされている。ウシの配列のリーディングフレ
ームは星印（＊）に挟まれている。３つの別個のクロー
ンのポリ（Ａ）士付加部位における差異は逆スラッシュ
によって示されている。
ウシのｃＤＮＡブローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌＩ［の制限部位が示されている。
実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグ
メントが二本発明のポリペプチドの発現に用いることが
できる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし１個以上のアミノ酸の異な
っているポリペプチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ベクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペプチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、５′末端および３′末
端において、しばしば野生型の制御領域以外の、転写お
よび翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナルのそれぞ
れによって挟まれている。従って、プロモーター領域は
５′末端において用いられ、キャップ配列、制御された
発現のためのオペレーター、およびエンハンサー配列等
を含み、構威的発現のためにプロモーター制御を含んで
いないことができる。３′末端においては、夕一ξネー
ター、終止コドン、および最適にはボリアデニル化配列
等が存在する。
転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にする１種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される。マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤（ｂｉｏｃｆｄｅ）耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生威物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる：米国特許第４，４１１．９９４号、ＥＰＡ８８．
　６３２および１１６，２０１。
コード配列は正しいリーディングフレームで分泌リーダ
ーおよびプロセッシングシグナルに連結されることによ
って、その融合コード配列を発現ベクター中に挿入して
発現造或物を提供することができる。
ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、グラジェン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００ｌｔ
ｇ／Ｉｄである。投与方法に応じて、用量は約０．５〜
５００Ｉ！ｇ／ｋｇまで、より通常には約５　〜５０ｎ
／ｋｇまで変化することができ、用量が２５ｇ／ｋｇを
越える場合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、
所望の反応、投与方法および用量の反復性等によって変
化する。
以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
Ｂｉｏ−Ｓｔｌ　ＴＳＫ−２５０ゲル口過ＩＩ　Ｐ　Ｌ
　Ｃカラムを、パイオーラッドラボラトリーズ（リッチ
モンド、カルフォルニア）より購入した。μ一Ｂｏｎｄ
ａｐａｋ−Ｃ＋ｓカラムをウォーターズアソシェート（
ミルフォールド、マサチューセッツ）より入手した。ト
リブシン（ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシンおよびスタ
フィ口コッカル・アウレウス困豆鮭１匹匹虹ａｕｒｅｕ
ｓ）ｖ８プロテアーゼは、ワーリントン（Ｗｏｒｔｈｉ
ｎｇＬｏｎ）から得る。エンドプロティナーゼＬｙｓ　
−　Ｃをべ一リンガーマンハ．イムから得た。３１１−
ラベル化ジアゼパム、ＲＯ１５−１７８８、フルニトラ
ゼパムおよびβ一カルボリンをＮＥＷ　、ボストン、マ
サチューセッツから得た。キャリャフリー１！ＳＩ−ヨ
ウ素はアマー゛シャム（アーリントンハイト、イリノイ
）製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０　ｇ湿重量）を融
解し次いで細断した。細断した組織を、２３７９ａｄ！
のエタノール（９８％）　、１８．５一の濃ＭＣＩ，お
よび２．５−のアブロティニン〔ウシの肺源の２３　Ｔ
ＴＵ／ｄ（シグマケミカル社）〕から威る２４００ｄの
抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマー
シャル混合機中でホモジナイズした。ホモジネートを４
℃で一夜で撹拌し、ベックマン型１９ローター中８００
Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、次いで上澄みを注意深
く除去した。最終量は約２０７（ｌｄであった。クロロ
ホルム（２０７０ｄ）および２０７ｄの酸性の水（２０
３ａｄの水と４ＩＩ１の濃ＨＣｊ２＞を上澄みに添加し
、混合物を約１時間激しく撹拌し、次いで室温に放置し
二相に分離した。水性の上相を注意深く除去し次いでス
ペクトラボール透析膜チューブ（３．５００ＭＷ力ット
オフ、アメリカンサイエンティフィックプロダクト）中
、４℃で０．　１　Ｍ酢酸２０１を２回取り換えて透析
した．透析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾燥材料（
７８５■）を粗分画と称した． ゛ル゛クロマトグーフ　ー Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０Ｘ　２．
　１　ｃｍ）を高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ
）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付けた．
粗分画を０．１％三フフ化酢酸を用い４０％アセトニト
リル水溶液中に８■／ｄの濃度で溶解した。カラムを０
．１％三フフ化酢酸（ＴＦＡ）　　と共に４０％アセト
ニトリルを用いて平衡化した。２ｄのアリコート（１６
■のタンパク質）を注入し次いで０．　１％濃度のＴＦ
Ａを有する４０％アセトニトリル水溶液を移動相として
均一に溶出を行った。流速を２ｄ／分に設定しそしてチ
ャートスピードを０．２５Ｃ１ｌ／分に設定した。
クロマトグラフィー処理を室温で行った。５ｄの分画を
採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いでペン
ゾジアゼピン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−ＢＣ＾
）および威長押制活性について３回分析した。
ＢＺＤ−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述
べた如く、４９回のクロマトグラフィー操作を行った。
全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した。約６
５■の活性な乾燥粉末を得た。これをＴＳＫ−２５０分
画と称した。この分画は約９３６ユニットのＢＺＤ−Ｏ
ＣＡ活性を含有していた。
ＴＳＫ−２５０　　　の′　　　　　クロマトグーフィ
ーＴＳＫ−２５０分画を０．　１％ＴＦＡに溶解し（２
■／戚）、更にμ−Ｂｏｎｄａｐａｋ−Ｃ．ｓカラム（
７８ｍｍ（内径）×３０ｃｍ）を用い室温で逆相１１　
Ｐ　Ｌ　Ｃにより分別した。試料を均一に適用し、カラ
ムを洗浄し次いで０．　１％ＴＦＡで平衡化した。流速
を２ｌＩＩ１／分に設定し、そしてチャート速度を０．
２５ｃｍ／分に設定した。第一の溶剤０．１％ＴＦＡと
第二の溶剤０．　１％ＴＦＡ中のアセトニトリルと間で
の線状グラジエント法を用いた。グラジエントの条件は
２０分内でＯ〜２８％、次いで１４０分内で２８〜４２
％、１０分内で４２〜５２％更に６分内で５２〜１００
％であった．全ての溶剤は、ＨＰＬＣ等級のものであっ
た。４１Ｉ１の分画を採取した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでｔｌＺＤ−Ｂ
ＣＡに対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜
３２％アセトニトリル濃度間で？容出した。
分画３６と分画３７をプールし、次いで１２成の０．　
１％ＴＦＡで希釈した。混合物を、ｐ　−Ｂｏｎｄａｐ
ａｋ−Ｃ＋ｓカラム［３．９ｍｍ（内径）Ｘ３０Ｃｌｌ
）に均一に適用した。流速はＩＩｄ／分であり、チャー
ト速度は０．２５ｃｍ／分であった。第一の溶剤０．１
％ＴＦＡと第二の溶剤０．　１％ＴＦＡを有するアセト
ニトリルとの間で直線グラジエント法を用いた。グラジ
エント条件は次の通りであった。１０分内で０〜３０％
、次いで６０分内で３０〜４０％であった。分画を採取
した。殆ど全ての活性（約８５０ユニット）部分は３１
％までのアセトニトリル濃度で分画６内に溶離した。こ
の分画をＨＰＬＣ　　Ｃｐｓ分画と称し、これは約６８
０Ｋのタンパクを有していた． また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒｌ−　ＥＢＺＤを精製した。
”シナプトソームのｉ１ 粗シナプス膜分画を、体重２００ｇまでのスブラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ，　Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（１９７４）刀−　：　４８０
２　−　４８０６）の記載の如く調製した．シナブス膜
を、５０ｍＭのトリスーＨＣｆ　（ｐＨ７，４）で３回
洗浄し、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離
によりベレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を５
０ｍＭ　｝リスーＨＣＩ　（ｐＨ７．４）に懸濁させ次
いで−２０゜Ｃで保存した。
ＥＢＺＤ一　八　　　　についてのア　セイ種々の両分
又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブト
ソームへの’Ｈ−ＢＺＤの結合の阻害を、結合競争活性
の指標として使用した。シナブトソーム膜への’Ｈ　−
　ＢＺＤの結合を、２５団のβ一カルボリンの不在下又
は存在下のいずれかで使いｔ舎ての１２Ｘ７５閣のボリ
ブロビレン管中において２通り実施した。その結合混合
物は、所望の種々の濃度の試験化合物、２０ｓＭのＴｒ
ｉｓ−１１ｃｊ！　（ｐＨ＝７．　４　）　、シナブス
膜懸濁液（７０〜１００ｌｌｇのタンパク質）　、１〜
５　ｍＭ（７）’Ｉｆ−ＢＺＤ及び合計体積０．　Ｉ　
Ｉｄ中０．　５％の最終濃度のジメチルスルホキシドを
含んだ。４℃で３０分間のインキュベーションの後、０
．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ＝　７．　４　）中
１０％の冷ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）
　０．　７　ｍを各々の管に添加した。その懸濁液をす
ぐ４　”ＣでＧＦ／Ｂフィルターにより真空濾過した。
そのフィルターを、１■／ＩＩＩ１のＢＳＡを含む５０
ｗＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ＝７．　４　）　１
０ｄにより洗浄した。そのフィルターを、計数バイアル
に移し、そしてアクアシン（Ａｑｕａｓｓ　ｉｎｅ）　
（ＮＥＮ）　１０−を、各バイアルに添加し、そしてＢ
ｅｃｋｍａｎ　β一カウンターを用いて放射能を測定し
た。２５／／Ｍのβ一カルボリンの存在において結合し
た放射能（合計結合の２〜８％）は、非特異的であると
思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された。タ
ンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いて、Ｌｏｗｒ
ｙ，など．，Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９５１
）ユ茜：２６５〜２７５の方法によって測定した。
ポリアクリルアξド゛ル　”’　　　　ＰＡＧＥ）０．
１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）、０．１％の
ＳＯＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％のポリアクリル
アミドビスーアクリルアミド（３０：０．８）の１５ｃ
ｍの分離ゲル（０．７５ｍｍの厚さ）を使用した。その
ゲルは、ゲノレ２０ｄ当りＴＥＭＨＤ（ＢｉｏＲａｄ）
　１０ｐｌを含み、そして、２０％の過硫酸アンモニウ
ムの１．　０　ｍ／　ｍｌのゲルを用いることによって
重合されたものである。分離ゲルの条件と同一の緩衝液
条件を用いる３．５％のアクリルアミド溶液の上層ゲル
を、下層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約３ｆｆｌｌｌ
を残して、コム（Ｃｏｍｂ）を、その上のゲル中に挿入
した。
０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）、７Ｍ
の尿素、１％のＳＯＳ及び１％の２−メルカブトエタノ
ール中サンプル４０ｍを、２分間煮沸し、そしてすぐに
適用した。そのランニング緩衝液は、０．１％のＳＤＳ
を含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ−　７．　２
　）であった。トラッキング染料がゲルの底に達するま
で、そのゲルを、室温で５　Ｖ　／　ｃｍで泳動させた
。そのゲルを、５０％メタノール及び９％酢酸中に固定
し、固定溶液中において０．１％クーマシーブルー（Ｃ
ｏｏｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）により染色し、そして５０
％メタノール及び９％酢酸により脱染色した。脱染色の
後、そのゲルを乾燥せしめた。
１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅ＋＋ｖｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２
２７　：　６８０　〜６８５のＰＡＧＥ法もまた、使用
された。ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒｉｌ．など．
，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２１１　：　１４３
７〜１４３９の銀染色法又はクーマシーブルー染色法の
いずれかによって検出した。
タンパク　のヨウソ Ｂａｒｒｉｄｇｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ
．　（１９７Ｂ）５０　：　５４〜６５によって記載さ
れているクロラミン−Ｔ法を用いて１２５１により、又
はＢｔｏｃｈｅａ＋．Ｊ．　（１９７３）ユ３３　：　
５２９〜５３９に記載されている−”Ｉ　　Ｂｏｌｔｏ
ｎ及びｌｆｕｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベ
ルした．ＥＢＺＤに・　る ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した．生後６週間のＳｐｒａｇｕｅＤ
ａｉｖｌｅｙラットを、完全フロイントアジュバント中
に乳化された、合計２０汀の精製タンパク質により感作
した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントアジュバ
ント中タンパク質１０ｔｔｇを用いて２週間隔で与えた
。各接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記に概
説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体につ
いてスクリーンした。
そのアッセイのために適切な抗血清は、一般的に、２〜
３回のみの追加免疫接種の後、得られた。
ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニュージーランドホワイ
トウサギ）における精製されたウシの脳のＥＢＺＤに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、４０ｌｌｇ及び２０ｘのタン
パク質を、それぞれ、１次接種及び追加免疫注射のため
に使用した。
ラジオイムノアッセイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　ＸＩＯ”ｃｐｍ
／Ｋの比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し、そ
して４゜ＣでＴＮＥＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ　−
　ｆｌｃ　ｌ、ｐＨ＝７．４　；　５ａ＋ＭのＥＤＴＡ
　；　　１５０ｍＭのＮａＣｌ　；０．０５％のＮＰ−
４０　；　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とボ
リブロピレン管（３ｄの容！）に添加された：精製され
た脳因子の標準又はサンプル１０ｍ、ラット抗血清（Ｔ
ＮＥＮ緩衝液中においてｌ：３０に希釈された）　１０
ｌ！！及び１　２５■によりラベルされたウシの脳因子
（〜５　Ｘ１０’ｃｐｍ）　３０ｍ．室温で４５分間の
インキュベーションの後、熱失活されホルマリンにより
固定されたＳ．アウレアス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の１０
％懸濁液５０μを添加し、そしてその混合物をさらに３
０分間放置した。次に、免疫吸着剤をｎ−ブチルフタレ
ート油のクッションを通して遠心分離し（１５，ＯＯＯ
Ｘ　ｇ、１分）、モしてＳ．アウレアスベレット中の放
射能活性の量を、ｒ一分光測定によって測定した。抗血
清の不在において結合した放射能は非特異的であると思
われ、そしてデーターはそれに応じて修正された。
ＲＩＡ反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織（お
よそ１ｇの正味重Ｍ）を、１０ｄの冷ホモジナイゼーシ
ョン＄１衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−｝１ｃｆ，ｐＨ＝
　７．　４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍＭの
ＮａＣｆ　；　０．　２％のＮＰ４０　；　０．２　ｍ
Ｍのフエニルメチルスルホニルフルオリド；一当り１０
０カリクレイン阻害剤ユニットのＴｒａｓｙｌｏｌ）に
添加し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーに
より３回、１５秒間の破壊により均質化した。その抽出
物を取り出し、そして１００，　０００×ｇで３０分間
の遠心分離により残骸を除去した。
次に、この上清液を、５分間９５℃へ加熱し、そして低
速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連の
ｌ：３の希釈の抽出物を、ＴＮＥＮ緩衝液により調製し
、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標準曲線は
各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性物質の量
を、直接的な比較により算定した。
ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドプロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃを含むＯ．ＬＭのＴｒｉｓ−アセテー｝　（ｐｉ
｛＝８．　０　）　４０ｎにおいて２４゜Ｃで１６時間
消化した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準で１０＝
１であった。ペプチドフラグメントを、水中０．０５％
ＴＦＡから０．０４５％ＴＦＡを含む６０％アセトニト
リルまでの直線２時間グラジエントを用いてμ一Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ−Ｃｕｅカラム（ｌｌａ　ｔｅｒｓ）でのｒ
ｐＨＰＬＣによって分離した。ペプチドをモニターし、
モして２１４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、集
め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した。
Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した。ＢＺＤ結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１１．５００
）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピー
クとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムＴＳＫ
−２５０からの活性フラクション２４のクロマトグラフ
ィーの結果、その活性は３１〜３２％のアセトニトリル
の間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プールさ
れたフラクション３６及び３７の再クロマトグラフィー
は、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたらし
た。その精製は第１表に要約される。
粗原料　７８５ｂ１，０１０’　　　　　１．２９ｌＯ
０ ａ：上記のアッセイ条件下で粗シナブトソーム膜への３
１■−ジアゼパムの結合に対する４０％競争のために必
要とする材料。
ｂ：プールされた材料の直接計量による。
Ｃ：２８０ｔａμでの吸光度から計算された。
ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイす
ることは不可能であった。この数は、フラクション２４
及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す。
８４，２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で達戊した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した。しかしながら、最大の阻害度は、８州の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎないこ
とが見出された。Ｋｆ値は、コ１１ジアゼバム又は３Ｉ
Ｉ　−　ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして
使用されても、約５犀であることが見出された。
精製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示された。ペプチドの分子量は、Ｉ
Ｏ．５Ｋドルトンであると算定された。
ＬａｅｍｍｌｉのＳＯＳ−ＰＡＧＥ法による精製された
蛋白質（ウシ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ〜７
Ｋドルトンを有する単一のバンドを与えた。精製された
タンパク質は、溶離用溶媒としてＯ．　１％のＴＦＡ　
と共に、水中４０％アセト二トリルを用いるＢｉｏ−Ｓ
ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０ｃｍ　Ｘ　７．　５
　ｔｒｔｍの内部直径）から単一の対称ピークとして出
現した。その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラ
フィー法によって約１１．５Ｋドルトンであることが計
算された。この精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、類似
する物理化学的特性及び生物学的特性を示した。
シナプトソーム膜への、′ｔｓ■−ラベルされた（クロ
ラミン−Ｔ法又はＢｏｌｔｏｎ及びＩｆｕｎｔｅｒ法の
いずれかによる）精製タンパク質の特異的結合は観察さ
れなかった。
Ｕ■坐見奄 ＲＩＡ系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のＥＢＺＤを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シＥＢＺＤに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の１２５Ｉ−ラベル化ＥＢＺＤの除去を測定した。ウシ
およびヒトのＥＢＺＤは、ウシ！ｌ！ＢｚＤ蛋白質に対
して調製されたラット抗血清に結合するｌ　ｔｓ１−ラ
ベル化ウシＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示し
た。このことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決
定基が存在していることを示している。
エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によって得られモ
して逆相ＨＰＬＣによって精製されたウシＥＢＺＤのペ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった．従って、ＥＢＺＤの免疫原決定基はエンド
プロティナーゼＬｙｓ−Ｃによって生した単一ペプチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々の組織中のＥＢＺＤの分布を下記第２表に示す。
第２表二種々のラビット組織中のＥＢＺＤの分布組　織
　　　　　　　罐当量／組織１ｇ（湿重）脳　　　　　
　　　　　　　　　　３．８０腎Ｆｉ１　　　　　　３
．４２ 唾液腺　　　　　　　　　　　１．７６肝！　　　　　
　１．５２ 胃　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２７結腸　
　　　　１．０５ 牌臓　　　　　０．９７ 肺　　　　　　　　　　　　　　　０．８４心ＩＩ　　
　　　　Ｏ．７３ 胸腺　　　　　０．６７ 膵臓　　　　　０．５０ 大腿筋　　　　　　　　　　　０．３７甲状腺（Ｔｈｙ
ｒｏｉｄ）　　　　　　　０．　０６血清または血漿　
　　　　　　ＮＪ． Ｎ．Ｄ．＝検出できず。
ＲｒＡ法の詳細は前述してある。
血清または血漿以外の試験組織はすべて、ＲＩＡによっ
て検出されるＥＢＺＤを含有していた．ウシの脳、肺臓
および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　，　７
．　６および６．８Ｋ当量を含有していたが、ヒトの脳
は組織１ｇ（湿重）当り１５．７Ｉｌｇ当量を含有して
いることが見い出された。ラビット脳中のＥＢＺＤの濃
度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるか
に低いものであることが見い出された。ＥＢＺＤはモン
キーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク質に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（｝ＩＥＰ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ
　１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）およ
び膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ
、それぞれ濃縮細胞（〜１０９細胞）ｌｄ当り９．１，
８．９　，　８，６　．０．３２および０．２６１ｎｌ
当量のＥＢＺＤを含有していた。ＥＢＺＤ　１　ｇは約
６Ｘ１０”分子を含んでいる。従って、ＭＣＦ　７．　
ＨＥＰ　２およびＨＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜５
Ｘ１０’分子のＥＢＺＤを含有している。
従って、ＥＢＺＤは哺乳動物の組織中に広く分布してお
り、そしてＤＢＩ　とは異り脳に特有のペプチドではな
い。広い組織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的な
ものというよりむしろ一般的なものであろうということ
を示唆している。
組織 大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 嗅索 Ｅａｚｏｌ度は前述の如く Ｈ当ｉｔ／組織１ｇ（湿重） ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ １７．４ ２６．７ １４．３ １．７ １６．２ ８．３ にＲＩＡによって測定した． 第３表は、ＲＩＡによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢＺＤの分布を要約している．脳の領
域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、ＥＢＺＤ
濃度の実質的な局所的変化があることが示された。試験
したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡叢にお
いて見い出され、そして最低濃度は下垂体において見い
出された。
ＥＢＺＤの　”（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ）　：体重２．３
〜２．６ｋｇの雄性ニュージーランドラビットをこの実
験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、ニ
ューロファーマコル．（ｈ肛独ｈＬｍａｃｏｌ．）　　
（１９７２年）ｔｔ：１〜１６頁に記載されたの直接穿
刺法に若干の変更を施すことによってｉｃｖ注射を行な
った。動物は、頭蓋に小さな穴（直径０．　８　ｍ　）
を開ける（ベントバルビタール麻酔下）ことによって実
験の２日前に準備した。この穴は正中線に対して１．　
Ｏ　ｍｍ側方およびプレグマに対して１．Ｏｍ口吻側に
位置している．実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に
局所麻酔薬を噴霧する。
＃２６の針を頭蓋の表面から１２鵬の深さまで鉛直に挿
入する。正確な位置決めは大脳脊髄液の出現によって指
示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、こ
の針を同じ深さまで再度挿入する．注射は、常に、注射
器微量ビエレットを用いてｌＯｌの容量で３０〜６０秒
間にわたって実施する。対照の動物には同容量の滅菌食
塩水を与える。薬剤はすべて滅菌した等張の食塩水中に
溶解し、そしてその遊離塩基として表現される。
動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ
ｔａｎｃｈ’ｉｏｎ）内に位置させる。結腸温度は、リ
ーズーノースラップ・スピードマックス・レコーダー（
Ｌｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｓｐｅｅｄｏｎ＋ａｘ
　ｒｅｃｏｒｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線
が引かれているＹＳ■スキャンニング・テレサーモメー
ター（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒｍｏ
ｍｅｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタプローブ
によって測定される。実験は２２．０±１．０℃の常温
室内で実施する。
興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る．２５■／ｋｇのベントバルビタールを静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は自
らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けにな
っていることができる。
ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の常同的（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉ
ｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した。
ｂＥＢＺＤ 回屋 注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する。
呼吸は９０分から２０４分まで増加した。
運動活性の増大。機能冗進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）なし。痛覚脱失なし。
則虹屋 注射のｌＯ分後、呼吸は９８分から６５分まで減少。強
迫的咀哨および軽度の興奮。興奮は短時間続いた．機能
冗進なし。痛覚脱失なし。
恩曵．星 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８分
から５０分まで）。注射の１０分後、立直り反射欠如。
動物は深い麻酔状態にはなかった。
ｂＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。
８日齢のヒナ鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を単個
細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法により
、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル（
Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（ＤｅＨａａｎ）、ジェ
イ．セル．フィズ．（ム蝕旦２社ム）（１９Ｂ３年）具
Ｌ３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特性を基準にすれ
ば、この調製物は戒体の啼乳動物のプルキンエ線維、主
たる心臓の伝導系に似ている〔ごルダルおよびデハーン
、ディ・イニシエイション・オヴ・ザ・ハートビート（
Ｔｈｅ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒ
ｔｂｅａｔ）デニス・ノーブル（Ｄｅｎｉｓ　Ｎｏｂｌ
ｅ）鳩、１９７５年、オツクスフォート・ユニバーシテ
ィ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｐｒｅｓｓ）　、ロンドン、ｐ．７）。これらの集塊は
２４゜Ｃで平衡化しｂＥＢＺＤを用いて２４時間処理し
た。２つの個別の実験において、１００ｑ／ｍの量で処
理した集塊の収縮速度は対照と有意に相違した。これを
以下に示す。
実験１： （測定された収縮速度（秒）７５回の収縮間間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　１４
　　　１１．４８　　　　１．４４　　　　０．３８処
理　１４　　７．９４　　２．０４　　０．５５実験２
： Ｎ　平均　標準偏差ＳＥＭＥＡＮ 未処理　　！３　　　２４．５９　　　　３，１８　　
　　０．８８処理　１２　　１９．３３　　２．３７　
　０．６８各実験において、スチューデンｌ−Ｔテスト
によれば、処理された母集団は有意に未処理の母集団と
異なっている。これら２つの母集団が同じものであると
いう確率は０．０００１より小さイ（ｐ　＝　０．　０
０００）　．起ｌ虹祝ヒ ウシおよびヒトのＥＨＺＤのアミノ酸配列を、（ａ）エ
ンドプロティナーゼリシンＣ，（ｂ）キモトリプシン、
（Ｃ）スタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　
Ｉｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８および（ｄ）
臭化シアンを用いたｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの消化
により得られたペプチドのマイクロシークエンス分析に
よって決定した。ペプチドフラグメントは揮発性溶剤を
用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した。アミノ末端をブ
ロックしたペプチドを１２ＮＨＣｆ中で周囲温度におい
て１６時間インキユベーションした。次いで、試料を凍
結乾燥によって乾燥させた．ペプチドを、４７０Ａ型気
相プロテインシークエンサー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕ
ｅｎｃｅｒ）　（アプライド・バイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｇｓ．Ｉｎｃ．））
による自動反復エドマン分解に付した，　ｒｐ｝ＩＰＬ
Ｃによってフエニルチオヒダントインアミノ酸を分析し
た。
これとは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはペプチドを、６ＮＨＣＩｌを用いて１０５゜Ｃで１
６〜２０時間減圧において加水分解した。得られたアミ
ノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ（
Ｐｔｃｏ）ＴＡＧ　システム〔ウォーターズ・アソシエ
ーツＣＨａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））によっ
て分析した。フエニルチオ力ルバモイルアミノ酸を２５
４ｎＭの吸光度によって検出した。
聾訣坐北ヱ盪遣 ｂ［！ＢＺＤおよびｈＥＢＺＤ（７）７ミノ酸配置を、
６ＮＩＩＣＡで加水分解した後、アミノ酸自動分析装置
を用いて決定した。これらの蛋白質には、システィンを
除くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これらの
データから計算された最小分子量は約９．９００であり
、ＳＯＳ−　ＰＡＧＥによって確ｆ［されたイ直と一致
する。
Ｎ一末端アミノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を、公
表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示す。
ｂＥＢＺＤ配列と異なるｈｌＥＢＺＤアミノ酸配列中の
残基には下線を引いた。
ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＥＢＺＤのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるたった１個の塩基変化
と一致する。これらの結果は、ヒトおよびウシのＥＢＺ
Ｄが異なる種の間で構造的に高度に保存されていること
を立証している。
ウシの組織から単離したポリ（Ａ”　）ＲＮＡをｃＤＮ
Ａ合成用の鋳型として使用した。第１鎖のｃＤＮＡ合成
はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）
逆転写酵素とを使用して実施した。第２鎖は大腸菌ＲＮ
ａｓｅ　Ｈ　，　　ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡ
リガーゼ（ＮＡＤ”　）を使用して合成した。ＳＩヌク
レアーゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■
の大断片によるフィルイン反応によって２本ｊＪｃＤＮ
Ａを平滑末端化した。ターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼを使用して、デオキシグアニン残
基約１５個をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に加えた。次
に、このＧの尾部をもつｃＤＮＡをＡ−５０カラム上で
サイズ分別して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと導入さ
れなかったデオキシグアニン残基とを除去した。次に、
プールしたｃＤＮＡの濃縮を、ＥｃｏＲＩで消化したλ
ｇｔ．１０　　０ＮＡの存在下におけるエタ／′一ル沈
殿によって実施した。
ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ．１０に対するＧの尾部を
もつｃＤＮＡの連結反応は、３′末端にデオキシシトシ
ン１２個を含みそして５′末端にＥｃｏＲＩ開裂ＤＮＡ
の１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１本
鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法に
よって実施した。連結したＤＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒｏ
バ〃ケージングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６
００　ｒｋ−　ｍｋ”　Ｈｆｌ中へ導入した。これは、
組換え（野生型でない）フ，エージに感染すると細胞溶
菌される。その方法により、放射性標識合戒オリゴヌク
レオチド〔１７ヌクレオチド長：その配列はウシＥＢＺ
Ｄ中に見出される６個の連続するア壽ノ酸（ＫＷＤＡＷ
Ｎ）によって推定した〕を使用し、プラークからのＤＮ
Ａを二重にスクリーニングした。コドンが不明なので、
オリゴヌクレオチドの３２種の縮重プールとしてＭＳＩ
を合成した．ＭＳ１によるスクリーニングにより陽性の
プラークを得これをプラーク精製し、そして１．　８　
ｋｂの挿入部を含有することが示された。この挿入部を
プラスミドｐＥＭＢＬ中にサブクローン化した。これを
ｐＭＰ１と称する。挿入部を制限地図化した後、続いて
適当な数片をＭ１３株中に更にサブクローン化し、そし
てＳａｎｇｅｒ−　Ｃｏｕ　ｌｓｅｒのジデオキシ法に
よって配列を決めた。
ｐＭＰｌ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほとん
ど同じ挿入部の５′末端から約３００塩基対の［）Ｎ＾
配列を含んでいた。更に、ｐＭＰＩのヌクレオチド配列
により、配列が決定されているウシＥＢＺＤに関して決
定したアもノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）ア
ミノ酸配列が予想された。これらの２種の蛋白質が密接
に関連していることはア【ノ酸配列゛の顕著な保存性に
よって示唆されている。配列が決まっているＥＢＺＤか
らアミノ酸３個を除去することにより、残りのアくノ酸
をｐＭＰ１の配列と関連させることができ、この結果ア
ミノ酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存的
置換を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。
ｐＭＰＩの発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している。最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をｐ
ＭＰ１がコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端ア壽ノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。
Ｕ聾遺伝ヱ坐発現 ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮＡは０．　６　ｋｂｐの挿入部であり、これ
をρＢＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得た。配
列決定を行なったところ、ｐＭＰ１と相同のコード配列
が得られた。ウシのエンドゼビン（ｂＥＢＺＩ））をコ
ードするＤＮＡ断片を、Ｄｒａ　Ｉ消化およびＮａｅ　
Ｉ消化を組合せることにより、ｃＤＮＡブラスミド（Ｅ
ＢＺＤ）から切り出した。その断片をゲル電気泳動によ
って精製し、発現ベクター（ｐＳＭ　１　．２）中にＳ
ｔｕ　！部位に挿入した。ｐｓＭ１．２発現ベクターの
形或は、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子（Ｂｏｌ　ｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ（１９７７
）　２　：　９５）　、ｐＴＲ２１３のｌａｃプロモー
ターおよびリポソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳ
Ａ（１９７９）四：　７６０−７６４　１をｐＬＧ３０
０のｉ−Ｚ融合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎｔｅ等、Ｃｅｌｌ
（１９８０）２０：　５４３−５５３　）にスブライシ
ングすることによって行なった。得られたプラスミドは
クローニング部位例えばＳｔｕ　１部位に挿入された外
来遺伝子を融合蛋白質として発現することができる。こ
の構造において、ＥＢＺＤに関する全コード配列は、ｃ
ｒｏ蛋白質の最初の２個のアミノ酸をコードするＤＮＡ
に位相を合わせて融合された。プラスミドｐｓ８１０８
は挿入部を正しい配向で含んでおり、プラスごドｐｓＢ
１０３は挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラ
スくドｐｓＢ１２５は挿入部を含んでいない。各種のプ
ラスξドを含む大腸菌｝１８１０１クローンを対数期ま
で増殖させ、そして振とうしなから３７゜Ｃで２時間、
最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを加えることによって誘導
した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄
剤処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清（細
胞賞ゾル）とベレット（細胞質内封入体）とに分けて、
免疫化学的技術によって分析することができる。
発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐｓＢ１０Ｂ）を含む大腸菌クローンだけが高
いレベルのＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大部分の
ｃｒｏ−ＥＢＺＤは上清分画（細胞質ゾル）中に見出さ
れた。ベレット分画（細胞質封入体）中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐｓ
Ｂ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃｒｏ−
ＥＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘導後に
、細胞培養物ｌｌ当り０．　５■のｃｒｏ−ＥＢＺＤが
産生されたものと推定される。
Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０分取用カラム（６０Ｘ
２．ｌｃｍ）を高圧液体クロマトグラフィー（　ＨＰＬ
Ｃ　）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）０．ｌ％を
含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画を８■／
Ｉｄの濃度で溶解した。カラムを０．　１％ＴＦＡを含
む４０％アセトニトリルで平衡化した。アリコート２−
（タンパク！１６■）を注入し、最終濃度０．　１％の
ＴＦＡを含む水中の４０％アセトニトリル移動相によっ
て均一に展開を実施した。ＯＦの位置（分画２３）が分
かった後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分画を
監視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであった
。前記の浸透クロマトグラフィーから脳因子（ＣＩＡ）
の見掛けの分子量を計算したところ、約１８ｋＤａｌで
あった。
ＴＳＫ−２５０　　　の　　１　　　クロマトグーフィ
−１５試行からのＴＳＫ−２５Ｑ画分２３をプールした
（容１７５ｍ）。プールされた材料を水中０．　１％Ｔ
ＦＡにより２倍に希釈した。この混合物を、水中０．　
１％↑ＦＡによりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダバ
ッターＣ．カラム（７８ｉａｍ内径Ｘ　３００ｍｓ＋）
に室温にて均一に注入した。一次溶剤Ｏ．ｌ％ＴＦＡと
二次溶剤０．１％ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの間で
直線グラジエントを用いた。グラジェント条件は２ｏ分
間に０〜２８％、１４０分間に２８〜４２％、１０分間
に４２〜５２％、そして次に６分間に５２〜１００％で
あった．すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであった。４
−の両分を集めた。各両分のアリコートを５ＯｎのＢＳ
Ａと共に乾燥し、そしてＣＩＡについてアッセイした。
Ｇ４Ａの２個のピークを貯蔵した。第ｌの活性（α）は
３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
１０試行からの活性画分３０及び３ｌをプールし、そし
てＯ．ｌ％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμ−ボンダバックカラム（７８　Ｘ　３００ｍ
ｍ）に均一に適用し、そしてカラムを０．　１％ＴＦＡ
で洗浄しそして平衡化した。流速はＬｄ／分であり、そ
してチャートスピードは０．１ｃｍ／分であった。やは
り、第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．　１％ＴＦ
Ａの濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジエ
ントを用いた。グラジエント条件は、４０分間に０〜３
０％、２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に３
８〜１００％であった。最初の１２画分は６一であり、
そして次に４ｄ画分を集めた。アリコートをＣＩＡにつ
いてアッセイした．活性は３２〜３３．５％の間のアセ
トニトリル濃度において溶出した。
両分３０〜３２をプールした。１２Ｊｄ！の０．１％Ｔ
ＦＡをプールされた両分に加えた．混合物（２４ｄを、
０．　１％ＴＰＡで平衡化された分析用μ−ボンダパッ
クＣｌｌｌカラム（３．　９　Ｘ　３００ａｍ）上に均
一に適用した．流速及びチャートスピードはそれぞれ０
．４一／分及びＱ．　ｌ　ｃｍ　／分であった。やはり
、第１溶剤０．１％ＴＰＡと第２溶剤０．　１％ＴＦＡ
の濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジエント
を用いた。
グラジエント条件は、２５分間にＯ〜３０％、２００分
間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％で
あった。２ｄの両分を集めた。両分のアリコートをＣＩ
Ａについてアッセイした。活性は分析用Ｃ．カラムから
、約３４％のアセトニトリル濃度において溶出した。
両分２９　−　３１をプールし、そして０．　１％ＴＦ
Ａで２倍に希釈し、モしてμ−ボンダバックＣ．カラム
（３．９Ｘ　３００ｍｍ）に適用した。第１溶剤０．　
１％ＴＦ＾と第２溶剤０．　１％ＴＦ＾の濃度を有する
ｎ−プロパノールとの間の直線グラジエントを用いた。
グラジエント条件は、４０分間に０〜１８％、２２５分
間に１８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であ
った。流速は０．４ｄ／分であり、そしてチャートスピ
ードは０．１ｃｍ／分に設定された。画分を集め、そし
てアリコートをＣＩＡについてアッセイした．活性は約
２３％のｎ−プロパノール濃度において溶出した．両分
２８及び２９をプールし、そして０．１％ＴＦＡにより
５倍希釈し、そして０．　１％ＴＦＡの濃度を有するｎ
−プロバノールを第２溶剤として用いてμ−ボンダバッ
クＣＩｌｌカラム（３１９Ｘ　３００ｍｎ＋）上で再ク
ロマトグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジ
エント条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初
の８個の両分は６ｄであり、そして１．　６　ｍの両分
を集めた。各両分のアリコートをＣＩＡについてアッセ
イした。ほとんどの活性が画分１５〜ｌ７に現われた．
両分１５〜１７は約１５ｘｒの蛋白質及び約２３０　Ｘ
　１０’ユニットのＧｌ＾を含有していた。
この画分をＨＰＬＣ　　Ｃ＋＊’画分とした．最終精製
画分は、ＣＣＬ６４を試験細胞として用いた蛋白質Ｋ当
り１５．３３　Ｘ　１０’ユニットの比活性を有してい
た．次の第４表は結果を要約する． 第４表　ウシ脳因子の精製 粗製物　　３，６８０　　　１．５５１　　　　０．４
２１ＴＳＫ−２５０　　　　　６３０　　　２．７６０
　　　　　４．３８ＨＰＬＣ−Ｃ１８’　　０．０１５
　　　　２３０　　　　１５，３３３．００１００ １８１ １４．８ （＊） ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジ
ンの取り込みを５０％阻害するために必要な材料アッセ
イはＮｕｎｃ９６ウェルブレー｝　（Ｋａａ＋ｓｔｒｕ
ｐｖｅｊ９０．　ＤＫ　　４＋０００＋　Ｒｏｓｋｉｌ
ｄｅ　，デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細胞（Ａ５
４９）又は柔ンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細胞と
して使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びペー
ニシリン／ストレプトマイシン（　Ｐ　／　Ｓ　）　（
０．５７■／一ずつ）及びグルタくンを伴うドルベコ改
変イーグル培地（ＤＭＥＭ）　５０μｌ中３．５ＸｌＯ
’ｍ胞を、端のウエル以外のすべてのウエルに導入した
。端のウエルには５０ｄのＰＢＳを導入し、そしてプレ
ートを３７゜Ｃにてインキエベートした。
試験サンプルを、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４
日後、５０Ｊｌ１の試験サンプルを各試験ウエルに加え
、他方対照ウエルには５０ハの培地のみを加えた。プレ
ートを３７゜Ｃにて３日間インキユベートした。４日目
に、＋　！ＳＩ−ヨード−２′−デオキシウリジンのｔ
容液（（４Ｃｉ／■−０．　５ｍＣｉ　／ｄ　（　０．
　ｉ　ｐ！アイソトープ／ｄ、１０％ＦＣＳ　ＳＰ／Ｓ
、グルタミンを含有するＤＭＥＭ中）１００Ｊ１１を各
ウエルに加え、モしてフ゜レートを３７”Ｃにてインキ
ユベートした．５日目に、培地をウエルから吸引し、２
００　ｄのＰＢＳで１回洗浄した。次に、２００　ｌ１
１のメタノールを各ウエルに加え、プレートを１０分間
インキユベートし、そしてメタノールを吸引により除去
した．水酸化？トリウム（２００ｍ、ＩＭ）を各ウエル
に加え、プレートを３０分間３７゜Ｃにてインキユベー
トし、そして次に水酸化ナトリウムをタイターテック（
Ｔｉｔｅｒ−ｔｅｃ）プラグ（フロー・ラブス）により
取り出した。
プラグを１２Ｘ７５ｍｍのプラスチックチューブに移し
、そして放射能を定量測定するためにγ一カウンターで
計数した。
ソフトアガー・コロニー　　ア　セイ １０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中０．　５％寒天（
アガーノーブル；ディフコラボラトリーズ、デトロイト
、ミシガン）の２．　０　ｒｎ１の基層を６０肋のコス
ター組織培養皿に加えた。同じ培地一ウシ血清混合物゛
、１．　Ｏ　ｘｌＯ’　Ａ５４９　Ａｇ３　（ソフトア
ガー増殖クローン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験
されるべきサンプルを含有する０．３％寒天を加えた。
プレートを空気中５％ＣＯ■の加湿雰囲気中で３７゜Ｃ
にてインキエベートし、そして７日後に適切な補充物を
含有する０．　３％寒天２．　０　ｄの添加により再供
給した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そし
て低倍率の無作為の視野５個当り６細胞？り多いコロニ
ーの数を７日及び１４日後に計数した。
コロニーノ　゜ア・・セイ このアッセイは６ウエルーファルコンブレート（９．６
ｃｄの面積／ウエル）中で行った。Ａ５４９細胞（２０
０）を各ウエル中、ｌＯ％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ及びグル
タミンを含むｌＩＩｉＯＤＭＥＭ中にプレートした。プ
レートした直後に、］．　Ｏ　ｄの培地中種々の濃度の
試験材料を２連で加えた。対照ウエルには試験材料をな
んら含まない１．０−の培地のみを加えた。プレート空
気中５％ＣＯ■の加湿雰囲気中３７゜Ｃにて１０日間イ
ンキユベートし、５０％メタノール中０．　２％メチレ
ンブル−１．　０　，ｄを各ウエルに添加し、そして２
０分間放置し、染料を除去し、そして各ウエルを０．　
１　ｍの水で２回洗浄し、そして空気乾燥した。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した．生理ヱ剪杜置 １）ＮＡ合成の５０％阻害が、それぞれ９８ｔｔｇ／Ｉ
ｍ、２１ｎ／ｄ及び９５ｎｇ／ｒｔｌの粗画分、ＴＳＫ
−２５０画分及び最終純蛋白質において観察された。従
って、Ａ５４９ヒト肺癌細胞における５０％ＤＮＡ合戒
阻害が純蛋白質の約９ｎＭ濃度において見られた。
ｂＢＦはまた、寒天（　Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞Ａ５
４９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中での
コロニー形成の５０％減少が約７６ｎｇ／一のｂＢＦに
おいて見られた。Ａ５４９細胞のコロニー形成率はこの
蛋白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／ＩＲｌ（１
．２４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形或率は
対照のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約８０ｎｇ
／ｄのｂＢＦの存在下では＾５４９細胞のコロニは見ら
れなかった。
Ａ５４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非存在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、ｂＢＦは量依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、ＤＮＡへの＋　ｚｓＩ
−デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準
である。
ｂＢＦはＡ５４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５　Ａ
ｇ）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−　７　）の種々のクロ
ーンの増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（Ｗｌ−２
６）の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、
ネズミ線維芽細胞セルライン３Ｔ３−Ａ３１に対して増
殖刺激的である。
ヒトＴ一細胞機能（Ｚａｒｌｉｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　４６８−４７
６　）に対する脳因子の効果を研究するために、同種異
系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された増
殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定す
るためのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘパリン処理血
液から、フィコールーハイパク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（ＨＳ）が補充されたＲ　ＰＭＩ　１６４０の培
地（ギブコ、グランドアイル、ＮＹ）中に１×１０’Ｐ
ＢＬ／一の濃度で懸濁した．次に、０．ｌ戚のこれらの
ＰＢＬ　（応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅｌｌ
）と称する）を９６−ウエルプレートの２連の丸底ウェ
ルのそれぞれに加え、そして次に０．０５１ｄの培地の
み又は２Ｘ１０’個のＸ一線照射された（２５００Ｒａ
ｄ）　同ｍ異系細胞〔゜“刺激細胞”（ｓｔｉａ＋ｕｌ
ａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と称する〕を含有する０．０５
ｍの培地、及び０．０５，ｄの培地のみ又は種々の濃度
の脳因子（０．９〜７５ユニット脳因子／ウエルをもた
らす）を含有する培地を加えた。細胞を５％ＣＯｚイン
キュベーター中で３７゜Ｃにてインキエベートし、そし
て２日目及び５日目に０．０５一の培地を各ウエルから
取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有する培
地０．０５ｄを添加した。
増殖応答を決定するため、６日目に各鮮からウエルの内
容物をプールし、そして０．　１　ｄを９６−ウエルプ
レートの４連のウエルのそれぞれに加え、次に０．０２
５ｌＩ１の容量中１μＣｉの３Ｈ−チミジン（３Ｈ−Ｔ
ｄＲ　，ニューイングランドニュークレア、ボストン、
ＭＡ）を加えた。６時間後、ウエルの内容物を多ウエル
収得器を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し
、これらのストリップをシンチレーション液体を含有す
るバイアルに移し、そして’Ｈ　−　ＴｄＲ取り込みを
β一カウンター中での計数により決定した。
細胞変性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果を決
定するため、６日目にウエルからフ゜−ルされた残りの
リンパ球を９６−ウエルプレートの３連の球底ウエルに
加え（０．１５ｍ／ウエル）、そして０．１５ｄの４倍
逐次希釈物も３連のウエルのそれぞれに加えた。ＳＩＣ
，ラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）を調製
するため、同種異系刺激細胞の提供者から生じたリンポ
プラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞１．　５　ＸＩ
Ｏ’を５００ｕＣｉ”Ｃｒ（Ｎａ．ＣｒＯｍ＋　ニュー
イングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）により３
７゜Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細胞を１５％熱不
活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地で３回洗
浄し、そしてこの培地に６Ｘ１０’細胞／ｄで再懸濁し
た。次に、０．０５ｍの標的細胞を、エフエクター細胞
を収容する各ウエルに、及び培地のみ〔自然（ｓｐｏｎ
ｔａｎｅｏｕｓ）　”Ｃｒ放出を決定するため〕又は洗
剤のみ（ＳＩＣｒ放出を決定するため）を収容するウエ
ルに加え、そしてプレートを３７”Ｃにて６時間インキ
エベートした。次に、上清の一定のアリコートを各ウェ
ルから取り出し、モしてγカウンター中で計数するため
にチューブに移した。特異的″Ｃｒ放出％を次のように
して決定した。
次の第５表が結果を示す。
第５表、 ヒトＴ−リンパ球のアロ抗原 ２０７ １０３．６９０ ７０，１４０ ６４．５０７ ７８，２８７ ８７．０９５ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体■のヘバリン処理
血液から得られ、そして個体ＣからのＸ一線照射された
（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ）により刺
激され、そして６日後、３Ｈ−チごジン（’＋１　Ｔｄ
Ｒ）の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
ｃｐ片＝カウント／分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬのＴ一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ　−　Ｕン
バ球の生成に対して観察された。
同じ量のＳＩＧ，放出を生じさせる未処理のエフェクタ
ー細胞の数として、７５ユニットの脳因子と共にインキ
ユベートされた約１６倍多くのエフェクター細胞が４２
％のＳＩＣｒ放出を生じさせるために必要である。
上記の結果から、この発明の化合物はインビトロ及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである．この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形威されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セブターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼバムリセプターもしくはＧＡＢ＾一作働
性リセブターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除
去するために他の添加物と組合わせて使用することがで
きる。脳因子化合物はまた、Ｔ一細胞の増殖の調節のた
めにも使用することができる。ＥＢＺＤ化合物はＥＢＺ
Ｄリセブターの活性を調節するためにも使用することが
できる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である．

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記の組成物に結合することができ、そして該組成
    物又はそれの免疫原フラグメントに応答して調製されて
    いる抗体であって、 前記組成物が、１５〜１２５個のアミノ酸をもちそして
    少なくとも１個のエピトープ部位をもつ第一ポリペプチ
    ド配列を含んで成り、哺乳動物の細胞からの成分を実質
    的に含まない組成物であって、該エピトープ部位は哺乳
    動物の脳中に見いだされる第二ポリペプチドとは交差反
    応性でありそして試験管内でジアゼパムレセプターと特
    異的に結合することができ、該第一ポリペプチドは下記
    のペプチド配列の１又は複数を含有するアミノ酸配列を
    含んでいる、該組成物： ａ、Ｙａａ＾ｅ　ａａ＾ａ　ＹＫＱＡＴ　ａａ＾ｂｂ、
    ＫＷＤＡＷ ｃ、ＡＭ　ａａ＾ｃ　ＡＹ（Ｘ）＿ｘ　ＶＥＥｄ、ＴＫ
    Ｐａａ＾ｄ　ａａ＾ｐ　ＥＥＭＬＦＩＹ　ａａ＾ｅ　Ｈ
    ＹＫｅ、ＫＧＴＳＫＥＤＡ 上記の配列において、 ａａ＾ａは芳香族アミノ酸であり； ａａ＾ｂ及びａａ＾ｃはいずれかのアミノ酸であり；ａ
    ａ＾ｄ及びａａ＾ｅは脂肪族中性アミノ酸であり；ａａ
    ＾ｐは脂肪族アミノ酸であり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり；そして ｘは０又は１である； ことを特徴とする、前記抗体。 ２、モノクローナル抗体である、特許請求の範囲第１項
    記載の抗体。 ３、哺乳動物の脳中に見いだされ、約７，０００〜１５
    ，０００の分子量をもちそしてジアゼパムレセプターに
    優先的に結合することができるポリペプチドの存在を検
    知する方法であって、抗体を、該ポリペプチドを含有し
    ていると思われる試料と混合し、そして該抗体との複合
    体形成の存在を決定する、ことを特徴とし、該抗体が下
    記の組成物に結合することができ、該組成物又はそれの
    免疫原フラグメントに応答して調製されたものであり、
    該組成物が、１５〜１２５個のアミノ酸をもちそして少
    なくとも１個のエピトープ部位をもつ第一ポリペプチド
    配列を含んで成り、哺乳動物の細胞からの成分を実質的
    に含まない組成物であって、該エピトープ部位は哺乳動
    物の脳中に見いだされる第二ポリペプチドとは交差反応
    性でありそして試験管内でジアゼパムレセプターと特異
    的に結合することができ、該第一ポリペプチドは下記の
    ペプチド配列の１又は複数を含有するアミノ酸配列を含
    んでいる、該組成物： ａ、Ｙａａ＾ｅ　ａａ＾ａ　ＹＫＱＡＴ　ａａ＾ｂｂ、
    ＫＷＤＡＷ ｃ、ＡＭ　ａａ＾ｃ　ＡＹ（Ｘ）＿ｘ　ＶＥＥｄ、ＴＫ
    Ｐａａ＾ｄ　ａａ＾ｐ　ＥＥＭＬＦＩＹ　ａａ＾ｅ　Ｈ
    ＹＫｅ、ＫＧＴＳＫＥＤＡ 上記の配列において、 ａａ＾ａは芳香族アミノ酸であり； ａａ＾ｂ及びａａ＾ｃはいずれかのアミノ酸であり；ａ
    ａ＾ｄ及びａａ＾ｅは脂肪族中性アミノ酸であり；ａａ
    ＾ｐは脂肪族アミノ酸であり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり；そして ｘは０又は１である； 前記方法。
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