JPH07181180A - 新規ストレスタンパク質ｐ２０、その精製方法、合成方法、抗体、測定方法及び免疫学的試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規ストレスタンパク質ｐ２０の提供。 【構成】 ラット骨格筋あるいはヒト胸筋の抽出液から
αＢ、ＨＳＰ２８の精製方法に準じて精製を行い、スト
レスタンパク質ｐ２０リッチフラクションはイムノアッ
セイ法で検出した。ストレスタンパク質ｐ２０は、スト
レスタンパク質に対する抗体の量的変化を簡単に把握す
る手段として有用であるので、自己免疫性疾患の診断薬
として使用できる。また、その抗体は、患者血清あるい
は血漿中のストレスタンパク質ｐ２０の濃度を測定する
ことができるので、生体の受けたストレスの程度を測定
すること等ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なストレスタンパ
ク質ｐ２０、その精製方法、その合成方法、その抗体、
その測定方法及びその免疫学的試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】今日ス
トレスタンパク質として知られる一連のタンパク質は、
ショウジョウバエの唾液線染色体において、これを高温
にさらした場合にパフが誘導される事から、１９７４年
にチセレスとミッチェルによって熱ショックタンパク質
として見いだされたのが最初であった。今日ではこのよ
うな熱ショック応答はすべての生物に普遍的に観察され
る現象である事が知られており、通常生育している温度
より高温にさらした場合、細菌、酵母の細胞から植物や
動物の培養細胞に至るまですべての細胞でショウジョウ
バエの熱ショックタンパク質とほぼ同じ分子量のタンパ
ク質の合成が非常に亢進される。また、これらの熱ショ
ックタンパク質のうちいくつかのものは重金属、エタノ
ール、亜砒酸塩などの毒物によっても誘導される事から
より一般的な意味でストレス応答と呼ばれるようにな
り、それに伴って熱ショックタンパク質もストレスタン
パク質と呼ばれるようになった。さらに、多くのストレ
スタンパク質はストレスにさらされた時だけでなく、ス
トレスにさらされていない正常の細胞においても発現し
ている事が明らかにされた。即ち、ストレスタンパク質
は、細胞にストレスがかかったときに初めて発現するタ
ンパク質と、正常な細胞においても発現しているタンパ
ク質の２種類に分ける事ができる。

【０００３】主要なストレスタンパク質は生物種により
異なるが、分子量などから４つのグループに分けること
ができる。即ち、 １．８３ｋＤａ〜９０ｋＤａの高分子量のもの ２．６６〜７８ｋＤａのＨＳＰ７０ファミリーと呼ばれ
るもの ３．５８〜６５ｋＤａのＨＳＰ６０ファミリーと呼ばれ
るもの ４．１５〜３０ｋＤａの低分子量のもの 哺乳類ではこのほかに１００〜１１０ｋＤａのタンパク
質も知られている。

【０００４】これらのストレスタンパク質の構造は、種
を越えて非常によく保存されていることから、生体内に
おいて重要な役割を担っていることが予想されていた。
ストレスタンパク質の重要な機能として、タンパク質の
正しい折り畳みへの関与や他のタンパク質との複合体の
形成、タンパク質の安定化が知られている。例えば、タ
ンパク質が合成後細胞膜を越えて細胞質以外のコンパー
トメントに局在化する反応においては、ストレスタンパ
ク質の結合によって不必要な折り畳みを回避して膜を通
過し易いような構造を保っており、膜を通過した後では
細胞内小器官の中でさらに別のストレスタンパク質が結
合して正しい折り畳み、会合を助ける。このようにタン
パク質の折り畳みや会合状態を制御して機能的構造体の
形成を助けるが、自らはその構造体の最終的な構成要素
とはならないような因子のことを一般に「分子シャペロ
ン」と呼んでいる。

【０００５】ＨＳＰ７０ファミリーやＨＳＰ６０ファミ
リーは分子シャペロンとして知られる代表的なものであ
る。ストレスタンパク質のもう一つの機能は、タンパク
質レベルや細胞レベルの信号伝達機構の調節における中
心的な役割である。ＨＳＰ９０と呼ばれるストレスタン
パク質のファミリーがこの点で特に注目を集めている。

【０００６】ＨＳＰ９０はｐ５０と呼ばれるタンパク質
とともにガンウイルスであるラウス肉腫ウイルスの作り
出すｐｐ６０ｓｒｃと呼ばれる酵素に結合し、酵素活性
の調節を行っている。ｐｐ６０ｓｒｃはＨＳＰ９０及び
ｐ５０が結合している間は酵素活性を持たず細胞をガン
化することはできないが、これら３分子の複合体が細胞
膜に近づくとＨＳＰ９０、ｐ５０は解離してｐｐ６０ｓ
ｒｃは細胞膜に埋め込まれ、酵素活性を持つようにな
る。同様の現象はほかのいくつかのガンウイルスの作り
出す酵素タンパク質についても観察されている。

【０００７】ＨＳＰ９０はまた、細胞内のステロイドホ
ルモンレセプターに結合し、その活性を調節している。
ステロイドホルモンレセプターはステロイドホルモンが
存在しない状態ではＨＳＰ９０等のタンパク質と結合し
て不活性な状態に保たれているが、ステロイドホルモン
と結合するとレセプターはＨＳＰ９０と解離してＤＮＡ
に結合し、ある種の遺伝子を活性化したり逆に抑制した
りする。

【０００８】このようなストレスタンパク質の機能を利
用して、ストレスタンパク質の実用面への応用が考えら
れる。心筋梗塞や脳卒中の患者では、心臓や脳への血流
の循環が一時的に滞って虚血状態に陥ることがあるが、
血流の再開によって急速に酸素の供給が再開されると、
フリーラジカルが生成され、さらに傷害を大きくする。
短時間の虚血状態の後、血流の再開によって引き起こさ
れるストレス応答の強さは傷害の程度とよく相関するこ
とから、ストレスタンパク質の量の変化を測ることによ
って組織や器官の傷害のマーカーとして使うことができ
る。一方、ストレスタンパク質を多く発現している細胞
は、虚血による傷害を受けにくいため、薬剤等で人工的
にストレスタンパク質を増やすことによって手術時虚血
による組織傷害の改善に利用することができる。

【０００９】結核、マラリヤ、ハンセン病などの感染症
では生体の免疫系がこれら微生物のストレスタンパク質
を標的として使っていることが知られてきたことから、
これらストレスタンパク質を感染症に対するワクチンと
して、あるいは生体の免疫性を高めるための補助剤とし
て使うことが考えられる。また、微生物のストレスタン
パク質とヒトのストレスタンパク質は非常によく似てお
り、ＲＡやＳＬＥでは自己のストレスタンパク質に対す
る抗体がしばしば見いだされることから、これら自己免
疫疾患との関連が疑われており、微生物のストレスタン
パク質に対する抗体を測定することで病気の診断にも役
立つ。

【００１０】傷害を受けた細胞で発現するストレスタン
パク質の量を測定することにより、医薬品、化粧品、食
品添加物の毒性を評価することもできる。本発明者ら
は、上記のような知験に基づき、既に低分子熱ショック
タンパク質の一種であるＨＳＰ２８及びαＢクリスタリ
ンをヒト骨格筋より精製し、その性状について明らかに
してきたが、これらのストレスタンパク質を精製するな
かから、新たなストレスタンパク質ｐ２０を単離するこ
とに成功し、本発明を完成するに至ったものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段、作用及び効果】本第１発
明は、骨格筋に含まれ、二量体を最小単位として存在す
る分子量約２万のストレスタンパク質ｐ２０にある。本
第２発明は、上記ストレスタンパク質ｐ２０の抗体にあ
る。

【００１２】本第３発明は、上記抗体を用いてイムノア
ッセイ法により精製することを特徴とする上記ストレス
タンパク質ｐ２０の精製方法にある。本第４発明は、ペ
プチド合成法により合成することを特徴とする上記スト
レスタンパク質ｐ２０の合成方法にある。

【００１３】本第５発明は、上記抗体を用いることを特
徴とする上記ストレスタンパク質ｐ２０の測定方法にあ
る。本第６発明は、上記ストレスタンパク質ｐ２０を測
定するための免疫学的試薬にある。

【００１４】ストレスタンパク質ｐ２０は、骨格筋より
ＨＳＰ２８及びαＢクリスタリンを精製する際に同時に
精製され、ストレスタンパク質ｐ２０のリッチフラクシ
ョンはイムノアッセイ法で検出される。ストレスタンパ
ク質ｐ２０は、αＢクリスタリンと類似の配列を有し、
５０％近い相同性を示す。

【００１５】ヒト及びラットに由来するストレスタンパ
ク質ｐ２０は、以下の配列を持つ１６０個または１６２
個のアミノ酸よりなる。

【００１６】

【数１】

【００１７】 （但し、Ｍ：メチオニン Ｋ：リジン Ｉ：イソロイシン Ｌ：ロイシン Ｒ：アルギニン Ａ：アラニン Ｖ：バリン Ｇ：グリシン Ｐ：プロリン Ｅ：グルタミン酸 Ｑ：グルタミン Ｔ：スレオニン Ｓ：セリン Ｙ：チロシン Ｗ：トリプトファン Ｆ：フェニルアラニン Ｄ：アスパラギン酸 Ｈ：ヒスチジン Ｃ：システイン） 上記のように、ヒトのストレスタンパク質ｐ２０とラッ
トのストレスタンパク質ｐ２０は、９０％近い相同性を
示し、分子量は、それぞれ１７，１３５と１７，５０４
である。ストレスタンパク質ｐ２０は、骨格筋のうちで
も、特に赤筋や心筋に多く存在する。

【００１８】本発明のストレスタンパク質ｐ２０は、ス
トレスタンパク質に対する抗体の量的変化を簡単に把握
する手段として有用であるので、自己免疫性疾患の診断
薬として使用できる。本発明のストレスタンパク質ｐ２
０の抗体は、上記ストレスタンパク質ｐ２０を適当な単
体と結合させ、マウス、ウサギ、ラットあるいはヤギな
どの動物に免疫することによって得ることができる。上
記本発明の抗体は、ストレスタンパク質ｐ２０、例え
ば、患者血清あるいは血漿中のストレスタンパク質ｐ２
０の濃度を測定することができる。従って、この測定値
から、生体の受けたストレスの程度を測定すること等が
できる。このため、本発明の抗体を用いることにより、
上記ストレスタンパク質ｐ２０を測定するための免疫学
的試薬を得ることができる。抗体としては、ポリクロー
ナル抗体の他にモノクローナル抗体を用いることができ
る。

【００１９】また、上記抗体を用いてイムノアッセイ法
によりストレスタンパク質ｐ２０を精製することができ
る。本発明のストレスタンパク質ｐ２０は、上記抗体を
用いて精製することにより得ることができるが、他の方
法として、従来の液相法、固相法などの方法で得ること
ができる。このうち、より簡単には、固相法による市販
のペプチド合成機を用いて得ることができる。

【００２０】固相法においてはポリマー性の支持体に前
記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応し
たアミノ酸を縮合させペプチド結合を形成させる。縮合
方法としては、例えばＤＣＣ法、酸無水物法、活性化エ
ステル法などの方法を使用することができる。α−アミ
ノ基の保護基としてはＢｏｃ基又はＦｍｏｃ基が使用で
きる。例えば、ペプチド自動合成装置を用いて合成する
時にはその装置のマニュアル指示に従い適宜アミノ酸の
性質を考慮して選択するのが好ましい。

【００２１】固相法において使用される保護アミノ酸の
保護基としては、ペプチド合成において一般的に使用さ
れる物が用いられる。たとえばα−アミノ基にＢｏｃ基
を用いるとき、Ａｓｐ、Ｇｌｕのカルボキシル基には、
エステル基により保護されるベンジル基又はシクロヘキ
シル基が、Ｔｈｒのヒドルキシル基にはベンジル基が、
Ｌｙｓの側鎖アミノ基にはｐ−クロロベンジルオキシカ
ルボニル基がそれぞれ用いられる。

【００２２】液相法にて合成するときには固相法と同
様、通常のペプチド合成法にしたがって行うことができ
る。公知の方法として例えば泉屋信夫著、「ペプチド合
成の基礎と実験」、丸善（株）、１９７５年などに記載
されている方法などが挙げられる。

【００２３】次に保護基及び支持体からの脱離は、α−
アミノ基保護基にＢｏｃ基を用いるときにはスカベンジ
ャーを含むフッ化水素、ＴＦＭＳＡなどを用いて行われ
る。スカベンジャーとしてはチオアニソール、エタンジ
チオール、ジメチルスルフィドなどが用いられる。ま
た、α−アミノ基保護基にＦｍｏｃ基を用いるときに
は、フェノールとＴＦＡとを含む混合物などを用いるこ
とができる。

【００２４】ストレスタンパク質ｐ２０の精製には一般
的に使用されるイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィ
ー、ゲルクロマトグラフィー、逆相型液体クロマトグラ
フィー等を単独にあるいは組み合わせて用いることによ
って行うことができる。精製されたストレスタンパク質
ｐ２０のアミノ酸組成は、アミノ酸分析装置によって容
易に測定することができる。

【００２５】

【実施例】以上説明した本発明の構成・作用を一層明ら
かにするために、以下に本発明の好適な実施例を説明す
る。 １．ストレスタンパク質ｐ２０の精製法 １）凍結胸筋（ヒト）５００ｇまたは冷凍骨格筋（ラッ
ト）７５０ｇを４倍量（ｖ／ｗ）の５０ｍＭ燐酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７．０（含５ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．
５ｍＭ ＰＭＳＦ）でホモジェナイズし、２００００×
ｇ／３０分の遠沈上清を取る。その上清に硫酸アンモニ
ウムを加え（４０％飽和）、塩析する分画を遠沈で集
め、３００−４００ｍｌの１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０（含１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、これ
を透析チューブに入れ、同じ燐酸緩衝液に対して透析す
る（５リットル×２）。

【００２６】２）透析物を遠沈（７８０００×ｇ／１
ｈ）し、不溶物を除き、上清をＤＥＡＥ−セファロース
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（５×３０ｃｍ）にかけ
る。カラムは上記燐酸緩衝液、ｐＨ８．０で充分洗って
から、吸着したｐ２０は、燐酸緩衝液の濃度勾配（０．
０１−０．４Ｍ）を上昇させ、溶出する。図１に酵素免
疫測定法で測定したｐ２０の溶出曲線を示す。尚、バッ
クの実線は、波長２８０ｎｍで測定したタンパク質の溶
出曲線である。

【００２７】３）イムノアッセイ法で検出したｐ２０を
含む分画を集め、硫安を加えて（５０％飽和）ｐ２０を
沈澱させ、これを４ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液、ｐＨ７．８（含１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かす。不溶
物を遠沈除去後、上清をバイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅ
ｌ） Ａ−５ｍ カラム（２．５×６０）にかける。カ
ラムは上記トリス−塩酸緩衝液を流し、ｐ２０を溶出す
る。図２に酵素免疫測定法で測定したｐ２０の溶出曲線
を示す。尚、バックの実線は、波長２８０ｎｍで測定し
たタンパク質の溶出曲線である。

【００２８】４）ｐ２０を含む分画を集め、限外濾過膜
［ＵＫ−１０，Ａｄｖａｎｔｅｃ（アドバンテック），
東京］で約２０ｍｌに濃縮し、これを０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ４．０（含７Ｍ尿素，１ｍＭ ＥＧ
ＴＡ ，１ｍＭ ＤＴＴ）（以後、酢酸／尿素緩衝液）
に対して４℃で透析する。透析物をＦＰＬＣシステム
［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］にセットし
た、ハイロード Ｓ セファロース（Ｈｉｌｏａｄ Ｓ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（１６／１０）にかけ
る。カラムは酢酸／尿素緩衝液で平衡化する。カラムに
吸着したｐ２０は酢酸／尿素緩衝液の食塩濃度を上昇
（０−０．５Ｍ／１２０ｍｌ）させて溶出する。図３に
酵素免疫測定法で測定したｐ２０の溶出曲線を示す。
尚、バックの点線は、波長２８０ｎｍで測定したタンパ
ク質の溶出曲線である。ｐ２０は、ＨＳＰ２７／２８と
αＢとの間に分離溶出される。ｐ２０は二つのピークと
して溶出される。前者をｐ２０−Ｓ、後者をｐ２０−Ｌ
とし、両分画をそれぞれ集め、アミコン セントリフロ
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｌｏ）ＣＦ２５ を使
って濃縮（２−３ｍｌ）する。

【００２９】５）濃縮したｐ２０−Ｓおよびｐ２０−Ｌ
分画を、酢酸／尿素緩衝液で平衡化したスーパーデック
ス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ｐｇ カラム［ハイロード
（Ｈｉｌｏａｄ）２６／６０］にかけ、同じ緩衝液で溶
出する。ｐ２０−Ｌは、重合体であり、カラムのボイド
ボリューム（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）近くに溶出さ
れるが、ｐ２０−Ｓは、二量体であり、低分子量領域に
溶出する。図４に酵素免疫測定法で測定したｐ２０の溶
出曲線を示す。尚、バックの点線は、波長２８０ｎｍで
測定したタンパク質の溶出曲線である。

【００３０】６）ｐ２０−Ｌ、ｐ２０−Ｓを含む分画を
それぞれ集め、酢酸／尿素緩衝液で平衡化したＴＳＫＳ
Ｐ−５ＰＷ カラム（０．８×７．５ｃｍ）にかけ、同
上緩衝液中の食塩濃度を上げて（０−０．４Ｍ）、ｐ２
０を溶出させる。図５に溶離液のタンパク質濃度を示
す。尚、バックの点線は、溶離液のＮａＣｌ濃度を示
す。主蛋白ピークを１０ｍＭ ヘプス（Ｈｅｐｅｓ）緩
衝液、ｐＨ７．５に透析し、尿素を除去し、ー２０℃で
凍結保存する。

【００３１】以上の各精製操作によって得られた分画の
合計容積、合計量、イムノアッセイにより決定したｐ２
０の合計量、そのタンパク質中の割合及び収率をそれぞ
れ表１（ヒト）及び表２（ラット）に示す。尚、収率
中、括弧内は、ｐ２０中のｐ２０−Ｌ及びｐ２０−Ｓの
収率を示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【表２】

【００３４】７）得られたｐ２０を還元剤無添加でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥすると、二量体の位置にもバンドが検出さ
れる。同一条件で、ラット骨格筋粗抽出液でも二量体が
検出されることから、細胞中では二量体を最小単位とし
て存在していることがわかる。ラット組織でのｐ２０の
分布は、αＢ、ＨＳＰ２８と同様に骨格筋、特に赤筋や
心筋に多く存在した。これら筋組織抽出液を庶糖濃度勾
配遠心すると、ＨＳＰ２８の場合と同様に重合型と解離
型の２つの成分に分離し、熱ストレスを与えた後の２成
分の変化は、同一検体中のＨＳＰ２８の変動と類似して
いる。以上の結果より、ｐ２０は、ストレスタンパク質
として機能するタンパク質であることが示された。

【００３５】２．ｐ２０の一次構造決定 上記１．６）で得られたヒト及びラットのｐ２０を各種
プロテアーゼまたはＣＮＢｒで処理し、各フラグメント
を分離後、ペプチドシーケンサーで分析して、一次構造
を決定した。結果を式２に示す。

【００３６】

【数２】

【００３７】 （但し、Ｍ：メチオニン Ｋ：リジン Ｉ：イソロイシン Ｌ：ロイシン Ｒ：アルギニン Ａ：アラニン Ｖ：バリン Ｇ：グリシン Ｐ：プロリン Ｅ：グルタミン酸 Ｑ：グルタミン Ｔ：スレオニン Ｓ：セリン Ｙ：チロシン Ｗ：トリプトファン Ｆ：フェニルアラニン Ｄ：アスパラギン酸 Ｈ：ヒスチジン Ｃ：システイン） 上記式２から、ｐ２０は、αＢクリスタリンと類似の配
列を有し、５０％近い相同性を示すことがわかる。ま
た、ヒトのｐ２０とラットのｐ２０は、９０％近い相同
性を示すことがわかる。ヒトのｐ２０は、１６０個のア
ミノ酸よりなり、分子量が１７，１３５である。一方、
ラットのｐ２０は、１６２個のアミノ酸よりなり、分子
量が１７，５０４である。

【００３８】３．ｐ２０に対する抗血清の作製とイムノ
アッセイ系の作製 １）精製したｐ２０溶液を完全アジュバントと１：１の
割合で混合し、ウサギ皮内十数カ所に注射する（０．２
ｍｇ／ウサギ）。上記の免疫を２週間隔で繰り返し、４
回目の免疫終了１週間後に採血する（６０−８０ｍｌ／
ウサギ）。以後は、一ケ月間隔で免疫・採血を繰り返
す。

【００３９】２）抗血清中のｐ２０特異抗体（ポリクロ
ーナル抗体）は、ｐ２０［４ｍｇ／２ｇ ＣＮＢｒ−セ
ファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）］を結合させたセフ
ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで精製する。抗
血清に硫安を加え（５０％飽和）、塩析するＩｇＧ分画
を集め、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７（含
０．１Ｍ Ｎａｃｌ，０．１％ ＮａＮ３）に溶解し、
透析後、上記のカラムにかける。カラムを上記燐酸緩衝
液に１Ｍ ＮａＣｌを加えた溶液で洗い、非特異的吸着
物質を除去する。カラムに吸着しているｐ２０抗体は、
０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ２．５（含１Ｍ
ＭａＣｌ）を流し、溶出する。溶出した抗体は直ちにＮ
ａＯＨを加えて中和する。ｐ２０抗体は、動物種特異性
が低く、ヒトあるいはラットのｐ２０に対する抗体は、
ブタ、ウシ、モルモットなどの多種動物のｐ２０と広く
交叉反応する。

【００４０】３）イムノアッセイ系の作製 精製ｐ２０抗体ＩｇＧを（ｐＨ４．５）に１％のペプシ
ン（シグマ、ブタ腸由来）を加えて消化して、Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメ
ントは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ１５０
カラムを使って分離する。

【００４１】ａ）上記抗体フラグメント溶液（０．２ｍ
ｇ／ｍｌ ｉｎ ０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ７）にポリ
スチレン球（直径３ｍｍ）を浸し（４度／１２時間）、
抗体を吸着させる。球は燐酸緩衝液で洗った後、Ａ液
［１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７（含０．１Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ウシ血清
アルブミン）］中、４℃で保存する。

【００４２】ｂ）上記抗体フラグメントを還元し、ＳＨ
基を持ったＦａｂ’フラグメントを得る。これに大過剰
の ｏ−フェニレンジマレイミドを作用させ、ＳＨ基を
介してマレイミド基を導入する。マレイミド基を持った
抗体Ｆａｂ’フラグメントと大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ（一分子につきＳＨ基を数個持つ）と混合
し、抗体Ｆａｂ’とガラクトシダーゼの結合物（酵素標
識抗体）を作製する。これをストレスタンパク質ｐ２０
を測定するための免疫学的試薬とする。酵素標識抗体の
量は、酵素活性で表し、１ユニットは、１分間に１μｍ
ｏｌを産生する能力を示すものとする。

【００４３】ｃ）イムノアッセイの手法 ｐ２０を含む検体あるいは標準ｐ２０溶液０．５ｍｌに
抗体結合ポリスチレン球一つを加え、３０℃で５時間振
とうする。球は上記Ａ液で洗ってから、上記Ａ液で希釈
した酵素標識抗体（２ｍＵ／０．２ｍｌ）中に移し、４
℃で一夜振とうする。球を上記Ａ液で洗い、上記Ａ液１
００μｌを含む試験管に移す。３０℃で５０μｌの １
ｍＭ ４−メチルアンベリフェリ−β−Ｄ−ガラクトサ
イドを加えて振とうする。２０分後に２．５ｍｌの０．
１Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．３）を加
えて酵素反応を止め、産生した ４−メチルアンベリフ
ェロンを蛍光光度計で測定する（励起波長３６０ｎｍ，
蛍光波長４５０ｎｍ）。標準曲線（検量曲線）を図６
（ヒト）及び図７（ラット）に示す。

【００４４】尚、上記実施例では、抗体を用いて精製に
よってｐ２０を得ているが、上記アミノ酸配列によりに
基づき、ペプチド合成機によって合成しても、同じくｐ
２０を得ることができた。以上本発明の実施例について
説明したが、本発明はこうした実施例に何等限定される
ものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲におい
て、種々なる態様で実施し得ることは勿論である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＤＥＡＥーセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）カラムによるｐ２０の溶出曲線図である。

【図２】 バイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ａー５ｍカ
ラムによるｐ２０の溶出曲線図である。

【図３】 Ｓ セファロース（Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）カラムによるｐ２０の溶出曲線図である。

【図４】 スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５
ｐｇカラムによるｐ２０ーＬ及びｐ２０−Ｓの溶出曲線
図である。

【図５】 ＳＰ−５ＰＷカラムクロマトグラフィーによ
るタンパク質の溶出曲線図である。

【図６】 ヒトｐ２０に対する抗体のβーＤ−ガラクト
サイダーゼ活性を示す標準曲線図である。

【図７】 ラットｐ２０に対する抗体のβーＤ−ガラク
トサイダーゼ活性を示す標準曲線図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨格筋に含まれ、二量体を最小単位とし
   て存在する分子量約２万のストレスタンパク質ｐ２０。
2. 【請求項２】 ヒトに由来し、以下の配列を持つ１６０
   個のアミノ酸よりなる請求項１記載のストレスタンパク
   質ｐ２０。 MEIPVPVQPSWLRRASAPLP GLSAPGRLFDQRFGEGLLEA ELAALCPTTLAPYYLRAPSV ALPVAQVPTDPGHFSVLLDV KHFSPEEIAVKVVGEHVEVH ARHEERPDEHGFVAREFHRR YRLPPGVDPAAVTSALSPEG VLSIQAAPASAQAPPPAAAK
3. 【請求項３】 ラットに由来し、以下の配列を持つ１６
   ２個のアミノ酸よりなる請求項１記載のストレスタンパ
   ク質ｐ２０。 MEIRVPVQPSWLRRASAPLP GFSTPGRLFDQRFGEGLLEA ELASLCPAAIAPYYLRAPSV ALPTAQVPTDPGYFSVLLDV KHFSPEEISVKVVGDHVEVH ARHEERPDEHGFIAREFHRR YRLPPGVDPAAVTSALSPEG VLSIQATPASAQASLPSPPAAK
4. 【請求項４】 請求項１、２または３記載のストレスタ
   ンパク質ｐ２０の抗体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の抗体を用いてイムノアッ
   セイ法により精製することを特徴とする請求項１、２ま
   たは３記載のストレスタンパク質ｐ２０の精製方法。
6. 【請求項６】 ペプチド合成法により合成することを特
   徴とする請求項１、２または３記載のストレスタンパク
   質ｐ２０の合成方法。
7. 【請求項７】 請求項４記載の抗体を用いることを特徴
   とする請求項１、２または３記載のストレスタンパク質
   ｐ２０の測定方法。
8. 【請求項８】 請求項４記載の抗体を用いることを特徴
   とする請求項１、２または３記載のストレスタンパク質
   ｐ２０を測定するための免疫学的試薬。