DE69033306T2

DE69033306T2 - Proteinkomplex

Info

Publication number: DE69033306T2
Application number: DE69033306T
Authority: DE
Inventors: Eva Akerloef; Ake Pousette
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Akerloef Eva Huddinge Se; Pousette Ake Aelvsjoe Se; Merck Serono SA
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 2000-04-13
Anticipated expiration: 2010-04-03
Also published as: AU5431890A; ATE185150T1; JP2886979B2; US5304464A; EP0474645B1; ES2139568T3; US5453354A; JPH04505614A; DK0474645T3; EP0474645A1; DE69033306D1; EP0965595A1; WO1990012032A1; SE8901127D0; AU635258B2

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Makromolekül mit proteinartiger Beschaffenheit, welches die Sperma- bzw. Spermienbeweglichkeit aktiviert, ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Reinigung des Makromoleküls aus extracellulären Flüssigkeiten, pharmazeutische Zubereitungen, die das Makromolekül umfassen und Antikörper, die gegen Determinanten gerichtet sind, die für dieses Makromolekül charakteristisch sind.

STAND DER TECHNIK

Es ist bereits bekannt gewesen, daß nur Spermatozoen mit einer guten Bewegungsfähigkeit und mit einer relativ geradlinigen fortschreitenden Beweglichkeit die Möglichkeit haben, eine Befruchtung zustandezubringen, und daß nur die Spermatozoen mit der besten Morphologie in den Zervikalschleim eindringen (Fredricsson B. und Björk G. (1977): Morphology of postcoital spermatozoa in the cervical secretion änd its clinical significance. Fertil. Steril. 28: 841-845). Es war auch bereits bekannt, daß Serum die Spermienbeweglichkeit unterstützt / Austin R. (1985) "Sperm maturation in the male and female genital tracts." In: Biology of Fertilization, Band 2 (Hrsg. C. Metz und A. Monroy), Seiten 121 bis 147, Academic Press, New York / und deshalb in Verbindung mit der Spermientrennung für die in-vitro-Fertilisation verwendet wird.
Es gibt jedoch Probleme, die der Verwendung einer Flüssigkeit innewohnen, die Tausende von Komponenten umfaßt, und eine spezifische Wirkungskomponente würde eine sicherere und vorhersagbarere Wirkung ergeben als eine solche Flüssigkeit. Ein wirksamer Faktor würde auch die Wirkung ohne gefährliche Begleiterscheinungen, z. B. immunologische Faktoren oder Infektionskrankheiten ergeben.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Während der Arbeit mit der in-vitro-Fertilisation wurden standardisierte Modellsysteme, beispielsweise für einen Spermienbeweglichkeitstest entwickelt, um homogenere Populationen von beweglichen und lebensfähigen Spermatozoen zu erhalten und um den Adenosintriphosphat (ATP)-Gehalt von Sperma bzw. Spermien und deren spezifische fortschreitende Beweglichkeit (SPM) zu analysieren: Åkerlöf E., Fredricsson B., Gustafson O., Lundin A., Lunell N-O., Nylund L., Rosenborg L. und Pousette Å (1987) Int. J. Androl. 10, 663-669 und Pousette Å., Åkerlöf E., Lundin A., Rosenborg L. und Fredricsson B. (1986) Int. J. Androl. 9, 331-340.
Diese standardisierten Modellsysteme wurden die Werkzeuge für die weitere Untersuchung von Serum, um den Faktor oder die Faktoren zu finden, welche dem Sperma die Beweglichkeit verleihen, die erforderlich ist, damit eine Befruchtung stattfindet. Durch eine umfangreiche Forschungsarbeit haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung nun herausgefunden, daß die Spermienbeweglichkeit durch ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von ungefähr 200.000 Dalton aktiviert wird.
Dieses Makromolekül ist von proteinartiger Beschaffenheit, im wesentlichen rein und aktiviert die Spermienbeweglichkeit.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung offenbart ein proteinartiges Makromolekül mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr 5,1, welches Aluminium umfaßt. Das Molekulargewicht des Makromoleküls beträgt vorzugsweise ungefähr 250.000 Dalton.
Das erfindungsgemäße Makromolekül ist im wesentlichen homogen und aus extracellulären Flüssigkeiten, insbesondere aus dem Serum von Tieren oder Menschen erhältlich.
Das proteinartige Makromolekül wird aus extracellulären Flüssigkeiten von Tieren oder Menschen, vorzugsweise aus Serum und gemäß einer bevorzugten Ausführungsform aus Serum von Menschen aufgereinigt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein proteinartiges Makromolekül mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr 5,1, welches Apolipoprotein A1, Immunglobulin und Albumin umfaßt, durch ein dreistufiges Verfahren gereinigt, das Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatofokussieren und Fast Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Spermienbeweglichkeits-Aktivität nach jedem einzelnen Reinigungsschritt überprüft.
Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zubereitungen, umfassend ein Makromolekül mit proteinartiger Beschaffenheit, welches im wesentlichen rein ist, ein Molekulargewicht von ungefähr 250.000 Dalton hat und die Spermienbeweglichkeit aktiviert, zusammen mit einem beliebigen geeigneten Arzneimittelträger.
Beispiele für geeignete Träger sind Kulturmedien oder andere Salzlösungen.
Die pharmazeutischen Zubereitungen werden gemäß an sich bekannten Verfahren hergestellt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen werden bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit, vorzugsweise in-vitro verwendet.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zum Bestimmen der potentiellen Fruchtbarkeit von Sperma durch Behandeln einer Probe mit einem Makromolekül gemäß der Erfindung und Vergleichen ihrer Beweglichkeit mit einem bekannten Standard.
Das SPAP wurde aus Serum aufgereinigt, das von männlichen Blutspendern erhalten wurde, und 30 Minuten lang bei 56ºC inkubiert, bevor es bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt wurde.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde das Reinigungsverfahren in drei Schritten durchgeführt und ergab ein Makromolekül, das Apolipoprotein A1, Ig und Albumin in ungefähr äquimolaren Mengen umfaßt und ein Molekulargewicht von ungefähr 250.000 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 5,1 aufweist.

Diese Schritte waren:

1. Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Sepharose® und Elution mit einem linearen NaCl-Gradient, 0-0,25 mol/l.
2. Chromatofokussieren auf PBETM94 mit Histidin-HCl als Ausgangspuffer. Das pH-Interval war 6,0 - 4,0.
3. Fast Protein Flüssigchromatographie (FPLC®, Pharmacia) an zwei Superose® 12 HR 10/30-Säulen (in Reihe geschaltet) mit Molekulargewichtstrennung.
Durch Hinzufügen eines vierten Schrittes wie etwa Affinitätschromatographie auf Blue- Sepharose® wird ein SPAP, umfassend Apolipoprotein A1 und Immunglobulin mit einem Molekulargewicht von ungefähr 180.000 Dalton erhalten.
Um das Auftreten der Spermienbeweglichkeits-Aktivität in der Serumsfraktion nach jedem einzelnen Reinigungsschritt zu verfolgen, wurden die Zubereitungen einem spezifischen fortschreitenden Beweglichkeits-(SPM)-Test und einer Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen.
Für die Herstellung eines Makromoleküls, das Apolipoprotein A1 und Ig umfaßt, wurde ein vierstufiges Protokoll verwendet, das Ionenaustausch (DEAE-Sepharose®)-Chromatographie, Chromatofokussieren, Ausschluß-FPLC® (wobei die Elution einem Molekulargewicht von ungefähr 250 kD entspricht) und Blue-Sepharose®-Chromatographie (keine Bindung aber Eliminierung von Albumin) einschließt. Das reine Protein aktivierte bei einer Konzentration von 20-70 nmol/l die Beweglichkeit im gleichen Maß wie Serum.
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen wies eine Bande auf, die einem Molekulargewicht von ungefähr 180 kD entspricht. In Gegenwart von Mercaptoethanol ergab die Fraktion nach Blue-Sepharose zwei Banden, die 50 kD und ungefähr 25 kD entsprechen. Ohne den Blue-Sepharose®-Schritt eluierte der nicht-reduzierte Komplex als größere Komponente, und nach der Reduktion ergab die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese anschließend eine weitere Bande bei ungefähr 67 kD, was nahelegt, daß sich das Molekül dann in einem Komplex mit Albumin befindet, wobei letzteres durch den Blue-Sepharose®-Schritt entfernt wird. Die Aminosäuresequenzanalyse des Blue-Sepharose®-Eluats führte zur Identifizierung von drei Proteinketten - denen von Apolipoprotein A1 und den schweren und leichten Immunglobulinketten - was nahelegt, daß die Zubereitung ein Apolipoprotein A1-Immunglobulin-Komplex war. Ein in einem Kaninchen erzeugtes Antiserum inhibierte die Spermienbeweglichkeit, wenn es direkt zu den Spermatozoen zugegeben wurde. Die Vorbehandlung von menschlichem Serum mit Kaninchen-Antiserum verringerte signifikant seine Fähigkeit, die Spermienbeweglichkeit zu aktivieren. Die Spermienaktivierungsfähigkeit des Proteinkomplexes wurde durch 5 Minuten langes Erwärmen auf 100ºC zerstört, was nahelegt, daß die Aktivität von intakten Protein-Konformationen abhängig war. Albumin, Apolipoprotein A1 und Immunglobuline hatten selbst nur geringe Auswirkungen auf die Spermienbeweglichkeit. Es erscheint wahrscheinlich, daß ein Apolipoprotein A1- Immunglobulin-Komplex die Aktivierung der Spermienbeweglichkeit vermittelt.
In diesem Zusammenhang werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
ApoA1 Apolipoprotein A1
ATP Adenosintriphosphat
D Dalton
FPLC® Fast Protein Flüssigchromatographie
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure
Ig Immunglobulin
IVF In-vitro-Fertilisation
MW Molekulargewicht
SDS Natriumdodecylsulfat
SPAP Spermien-aktivierendes Protein
SPM Spezifische fortschreitende Beweglichkeit
v/v Volumen/Volumen.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1-A veranschaulicht Ionenaustausch (DEAE-Sepharose®)-Chromatographie. Serum wurde auf eine DEAE-Sepharose®-Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten 0-0,25M NaCl eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und der A 280-Wert beobachtet. Aliquots von allen Fraktionen wurden im Hinblick auf die SPM untersucht. Die Spermienaktivierungsfähigkeit wurde bei ungefähr 0,2M NaCl eluiert.
Fig. 1-B veranschaulicht das Chromatofokussieren auf PBETM94. Nach der Dialyse gegen den Ausgangspuffer wurden die vereinigten Fraktionen auf die PBETM94-Chromatofokussierungssäule gegeben und Polypuffer® 74, pH 4,0 wurde aufgebracht. Die Fraktionen wurden gesammelt und im Hinblick auf den pH und die SPM untersucht. Die Spermienaktivierungsfähigkeit wurde bei pH 5,1 eluiert.
Fig. 1-C veranschaulicht die FPLC®. Die vereinigten Fraktionen wurden dialysiert, lyophilisiert (in Wasser gelöst) und auf zwei Superose® 12 HR 10/30-Säulen (in Reihe geschaltet) fraktioniert. Die Säulen wurden unter Verwendung von gebrauchsfertigen Standardsubstanzen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) geeicht. Ein Teil von jeder Fraktion wurde im Hinblick auf die SPM untersucht. Die Spermienaktivierungsfähigkeit wurde entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 250 kD eluiert.
Fig. 2 veranschaulicht die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart und in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol und diese wurde unter Verwendung von gebrauchsfertigen Gelen und Eichstandardsubstanzen durchgeführt.
Bahn 1 Phosphorylase b (94000), Albumin (67000), Ovalbumin (43000), Carbonatdehydrase (30000), Trypsin-Inhibitor (20100) und Lactalbumin (14.400)
Bahn 2 FPLC®-Eluat mit einer Proteinfraktion (in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol)
Bahn 3 Thyroglobulin (330000), Ferritin (220000), Albumin (67000), Katalase (60000), Lactatdehydrogenase (36000) und Ferritin (18500)
Bahn 4 FPLC®-Eluat mit einer Proteinfraktion in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol).
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen ergab eine Bande, die ein Molekulargewicht von ungefähr 180 kD entspricht. In Gegenwart von Mercaptoethanol ergab diese Fraktion zwei Banden, entsprechend 50 kD (welche später als schwere Kette von Immunglobulin identifiziert wurde) und ungefähr 25 kD (die später als Apolipoprotein A1 und die leichte Kette von Immunglobulin identifiziert wurde). Ohne den Blue-Sepharose®-Schritt eluierte der nichtreduzierte Komplex als größere Komponente und nach der Reduktion wies die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine weitere Bande bei ungefähr 67 kD auf, welche nahelegt, daß sich das Molekül dann in einem Komplex mit Albumin befindet, wobei letzteres durch den Blue-Sepharose®-Schritt entfernt wird.
Fig. 3 veranschaulicht die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol.
Bahn 1 wie Bahn 1 in Fig. 2
Bahn 2 normales Serum
Bahn 3 Blue-Sepharose®-Eluat mit Proteinfraktion
Bahn 4 wie Bahn 3 in Fig. 2
Bahn 5 FPLC®-Eluat mit Albuminfraktion
Bahn 6 FPLC®-Eluat mit Proteinfraktion.
Fig. 4 veranschaulicht die Wirkung des gereinigten SPAP auf die SPM (A) und den ATP-Gehalt (B). Spermien wurden unter Verwendung der Percoll®-Methode getrennt und in den Puffer B überführt. Gereinigtes SPAP wurde in zunehmenden Konzentrationen zu Aliquots der Spermienlösung zugegeben und die Spermatozoen wurden im Hinblick auf ihre Beweglichkeit 2,5 und 5 Stunden später und im Hinblick auf den ATP-Gehalt 2 und 3 Stunden nach der Zugabe von SPAP untersucht.

BESTE VORGEHENSWEISE ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG

Die Vorgehensweise für den Spermienbeweglichkeitstest wird im folgenden erläutert.
Samenproben. Ejakulate und Blutseren wurden von sechs Spendern gesammelt und innerhalb von zwei Stunden analysiert. /Fredricsson B. (1979) Andrologi 11, 57-61/. Die Abtrennung von beweglichen Spermatozoen erfolgte durch Eigenwanderung unter Verwendung einer Aufschwimm-Methode oder einer Percoll®-Gradientenmethode, gefolgt von einer Überführung der Spermatozoen auf ein definiertes Kulturmedium. /Åkerlöf E., Fredricsson B., Gustafson O., Lundin A., Lunell N-O., Nylund L., Rosenborg L., und Pousette Å (1987) Int. J. Androl. 10, 663-669/.
Für die Aufschwimm-Zubereitung wurden 0,3 ml Samen mit 1 ml Gewebekulturmedium, RPMI-1640 (Flow), das mit 13% (v/v) männlichem Humanserum, 24 mM HEPES (Sigma, USA), 50 IU/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin (GIBCO, Scotland) ergänzt wurde, (Puffer B) bedeckt. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden die obersten 0,5 ml, die bewegliche Spermien enthielten, entnommen. Für die Percoll®- Gradienten-Methode wurde 1 ml des Ejakulats vorsichtig oben auf einen Percoll®- Gradienten geschichtet. Nach 3 Stunden bei 37ºC (ohne Zentrifugation) wurde der obere Teil abgesaugt und verworfen und die unteren 3 mf wurden suspendiert. /Pousette Å., Åkerlöf E., Lundin A., Rosenborg L. und Fredricsson B. (1968) Int. J. Androl. 9, 331- 340/.
Die Fraktionen aus 5-10 Röhrchen (getrennt durch Aufschwimmen oder Percoll®) wurden zusammengegeben und zu einem Pumpen-Filtersystem zugegeben/Åkerlöf E., Fredricsson B., Gustafson O., Lundin A., Lunell N-O., Nylund L., Rosenborg L., und Pousette Å. (1987) Int. J. Androl. 10, 663-669/, um bewegliche Spermatozoen auf den Puffer A (Puffer B ohne Serum) zu überführen.
Nach der Verdünnung auf ungefähr 3 Millionen Spermatozoen/ml wurden Aliquots von 0,5 ml überführt und 0,1 ml Portionen von Puffer A (Kontrolle), Serum (Kontrolle), verschiedenen Zugaben oder Eluaten von den Reinigungsschritten wurden zugegeben. Während der Aufstellung des Protokolls für die Aufreinigung des Proteinkomplexes wurde die fortschreitende Beweglichkeit zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Für Routine-Zubereitungen wurde die Beweglichkeit 4-6 Stunden nach der Zugabe der Testlösungen gemessen, da die unspezifische Wirkung von Albumin zu diesem Zeitpunkt minimiert ist.
Zusätze. Serum (verwendet als Kontrolle in dem Spermienbeweglichkeitstest als Zusatz in Puffer B) wurde 30 Minuten lang bei 56ºC inkubiert und bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Normale Kaninchenseren, Kaninchen-Anti-Proteinkomplex-Serum sowie immunpräzipitierte Seren wurden direkt oder in verschiedenen Kombinationen zu dem Spermienbeweglichkeitstest zugegeben.
Gereinigtes menschliches Apolipoprotein A1 (A-9284 Sigma, MO., USA) wurde in Puffer A bis zu 1,7 g/l gelöst und zu dem Spermienbeweglichkeitstest zugegeben, was Endkonzentrationen von 0,04-0,3 g/l in den Teströhrchen ergab. Gammonativ® (Kabi, Stockholm, Schweden); das menschliches Immunglobulin und Albumin enthielt, wurde einer Blue-Sepharose®-Chromatographie unterzogen, um das Albumin zu entfernen. Das Immunglobulin wurde gefriergetrocknet, in Wasser gelöst und zu dem Spermienbeweglichkeitstest zugegeben.
Beweglichkeit. Die fortschreitende Beweglichkeit wurde wie beschrieben analysiert. /Pousette Å., Åkerlöf E., Rosenborg L. und Fredricsson B. (1986) Int. J. Androl. 9, 1-13/. Die Anzahl von Spermatozoen, die eine bestimmte Linie mit bekannter Länge in einer Bürkerkammer pro Zeiteinheit überschritten, wurde gezählt. Da die Konzentration bekannt war, wurden die Ergebnisse als Durchgänge pro Minute pro Million Spermatozoen/ml angegeben. Dieser Wert wird als spezifische fortschreitende Beweglichkeit (SPM) bezeichnet. Die Spermienbeweglichkeit wurde unter Verwendung von Aliquots von jeder eluierten Fraktion untersucht. Die Beweglichkeit wurde gewöhnlich 4-6 Stunden nach der Zugabe von Spermatozoen untersucht, um die anfängliche Zunahme der Spermienbeweglichkeit zu vermeiden, die beispielsweise nach der Zugabe von Albumin beobachtet werden kann.
Der ATP-Gehalt wurde in dem "standardisierten Modellsystem" untersucht, das in Pousette Å., Åkerlöf E., Lundin A., Rosenborg L., und Fredricsson B. (1986) Int. J. Androl. 9, 331-340 beschrieben ist, und das spezifische ATP wurde definiert als Gehalt von ATP (angegeben in mol) pro Spermatozoon.
Für die Reinigung von SPAP wurden Seren von männlichen Blutspendern 30 Minuten lang bei 56ºC inkubiert, bevor sie bei -20ºC bis zur Verwendung für die Aufreinigungen aufbewahrt wurden. Fraktionen wurden dialysiert und/oder lyophilisiert, bevor sie im Hinblick auf die Spermienaktivierungsfähigkeit in dem "standardisierten Modellsystem" untersucht wurden.
Ionenaustausch-Chromatographie. Serum (100) wurde auf einer 100 ml-DEAE- Sepharose®-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), die in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4 äquilibriert worden war, fraktioniert. Das Serum wurde zweifach mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4 verdünnt und auf die Säule aufgegeben. Nach dem Waschen wurde ein linearer Gradient von 2 · 300 ml 0-0,25M NaCl in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4 angelegt. Fraktionen (ungefähr 5 ml) wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm wurde beobachtet. Aliquots von allen Fraktionen wurden anschließend gegen 0,125M Phosphatpuffer, pH 7,4 dialysiert und im Hinblick auf die Fähigkeit, SPM zu stimulieren, untersucht. Fraktionen, die die Spermienbeweglichkeit fördern konnten, wurden vereinigt. Gewöhnlich wurden ungefähr 10 Fraktionen (50 ml), die bei ungefähr 0,2M NaCl in dem Gradienten gewonnen wurden, für die weitere Reinigung verwendet.
Chromatofokussieren auf PBETM94. Die vereinigten Fraktionen wurden lyophilisiert, in 5 ml Wasser (Millipore®) gelöst, gegen den Ausgangspuffer (0,025M Histidin-HCl, pH 6,0) dialysiert und zu einer 37 ml-PBETM94-Chromatofokussierungssäule zugegeben. Nach dem Waschen wurde Polypuffer® 74, pH 4,0 aufgetragen und die Fraktionen wur den im Hinblick auf den pH und die Spermienaktivierungsfähigkeit untersucht. Die Proben (1 ml von jeder Fraktion) wurden gegen 0,01M Phosphatpuffer dialysiert, lyophilisiert und in 250 ul 0,125M Phosphatpuffer, pH 7,4 gelöst, bevor sie zu dem Test der Spermienbeweglichkeit zugegeben wurden. Fraktionen, die eine Spermienaktivierungsfähigkeit aufwiesen, wurden vereinigt. Gewöhnlich wurden ungefähr 3 Fraktionen (15 ml), die bei ungefähr pH 5,1 eluierten, erhalten.
Fast Protein-Flüssigchromatographie® (FPLC)®. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 0,001 M Phosphatpuffer, pH 7,4 dialysiert und lyophilisiert, in 200 ul destilliertem Wasser (Millipore®) gelöst und auf zwei Superose® 12 HR 10/30-Säulen (in Reihe geschaltet), die in 0,125M Phosphatpuffer, pH 7,4 äquilibriert worden waren, fraktioniert. Eichungen erfolgten unter Verwendung von gebrauchsfertigen Standardsubstanzen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Ein Teil (10 ul) von jeder Fraktion (600 ul) wurde im Hinblick auf die Spermienaktivierungsfähigkeit untersucht. Gewöhnlich wurde die Aktivität in zwei Fraktionen (1,2 ml) gefunden, die einem Molekulargewicht von ungefähr 250 kD entsprechen.
Blue-Sepharose®-Chromatographie. Die vereinigten Fraktionen nach der FPLC® wurden auf eine Blue-Sepharose®-Säule (10 · 20 mm), die in 0,125M Phosphatpuffer, pH 7,4 äquilibriert worden war, gegeben. Die Spermienaktivierungsfähigkeit haftete nicht an dem Gel und wurde in den Fraktionen zurückgewonnen, die dem Hohlraumvolumen und der Waschung mit 0,125M Phosphatpuffer, pH 7,4 (gesamt: 30 ml) entsprachen. Dieses Material wurde lyophilisiert und in 1,0 ml Wasser gelöst; 10 ul wurden routinemäßig für den Spermienbeweglichkeitstest verwendet.
Eine analytische Scheibenelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (NaDodSO&sub4;), in Gegenwart von (reduzierend) und in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol wurde durchgeführt unter Verwendung des GE 2/4-Vertikalsystems (Pharmacia, Schweden) mit gebrauchsfertigen Gel-Casetten Kits (80 · 80 mm) zusätzlich zu einer Standardsubstanz für die Eichung (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Proteine wurden unter Verwendung von Coomassie Blue sichtbar gemacht. Die Proben für die Aminosäuresequenzanalyse wurden in einem Applied Biosystems 470 A Gasphasensequenzierer, der mit einem Online-Phenylthiohydantoin-Analysator 120 (Applied Biosystems Inc., Forster City, CA) ausgestattet war, abgebaut.
Die quantitative Bestimmung des Gesamtproteins erfolgte mit dem BIO-RAD Proteinassay (BIO-RAD Laboratories, München, BRD) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardsubstanzen. Apolipoprotein A1 wurde mittels Nephelometrie analysiert, wobei Reagenzien von Behringwerke (Marburg, BRD) verwendet wurden.
Die Immunisierung und Immunpräcipitation erfolgten an zwei 1-Jahr-alten männlichen New Zealand White-Kaninchen, wie es beschrieben ist /Vaitukaitis 1. Robbins J B, Nieschlag E und Ross G T. (1971), J. Clin. Endocrinol. Metab. 33, 988-991/ mit dem gereinigten Proteinkomplex. Das Protein, 20 ug für ein Tier und 80 ug für das andere, wurde in 1 ml Wasser mit 1 ml kompletten Freundschen Adjuvans vermischt, und das Gemisch wurde subkutan am Rücken der Tiere injiziert. Nach 10 Wochen wurde ein Antiserum in dem Kaninchen entdeckt, dem 20 ug SPAP verabreicht worden war.
Normales inaktiviertes männliches Serum und Kaninchen-Anti-SPAP-Serum wurden in Verhältnissen im Bereich zwischen 1 : 19 bis 19 : 1 (v/v) vermischt. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 25ºC inkubiert, bevor die Röhrchen bei 1400 · g 25 Minuten lang zentrifugiert wurden. Die Überstände, die durch Absaugung entfernt wurden, und die gebildeten Pellets wurden bei -20ºC aufbewahrt, bis sie verwendet wurden. Die Überstände wurden auf Spermienbeweglichkeit getestet und auf Apolipoprotein A1 hin untersucht.
Aminosäuresequenzanalysen wurden mit zwei verschiedenen Pools aus jeweils drei Zubereitungen von SPAP aus dem Blue-Sepharose®-Schritt durchgeführt, welche durch Aminosäuresequenzabbau analysiert wurden. Die erhaltenen Ergebnisse waren sehr ähnlich, was die Reproduzierbarkeit der Zubereitungen gewährleistet, und zeigten das Vorhandensein von drei hauptsächlichen N-terminalen Sequenzen, die ungefähr 25 Zyklen lang verfolgt wurden, bevor alle gegen einen ziemlich hohen Hintergrund schwer zu bestimmen waren (vergleiche Tabelle I).

TABELLE I

Aminosäuresequenzanalysen von SPAP. Der Abbau von zwei Zubereitungen ergab drei hauptsächliche N-terminale Sequenzen in mittleren Verhältnissen von ungefähr 1,4 : 1,1 : 1,0, welche 26, 20 bzw. 15 Zyklen lang interpretiert werden konnten, bevor ein hoher Hintergrund, Übertragung und Übereinstimmungen der Reste in den verschiedenen Strukturen sichere Zuordnungen verhinderten. Für die in jedem Zyklus identifizierten Tripletts war die Zuordnung zur Sequenz I, II bzw. III aus dem rückgewonnenen Material allein regelmäßig zweideutig, aber die Auflistung als zu I, II, III gehörend konnte leicht zugeordnet werden, sobald gefunden wurde, daß die verschiedenen Kombinationen in drei bekannte Strukturen paßten. I entspricht Apolipoprotein A1, II den leichten Ketten von Immunglobulin (k) und III den schweren Ketten von Immunglobulin (g, m und a). Die in jedem Zyklus identifizierten Reste sind in dieser Reihenfolge aufgeführt. An einigen wenigen Positionen (1, 7, 11) wurden nur zwei hauptsächliche Reste (einer in höherer Ausbeute) identifiziert, was Positionen widerspiegelt, in denen zwei der Strukturen gleiche Reste aufzuweisen schienen. Die rückgewonnenen Materialien werden entsprechend in ihrer Auflistung aufgespalten. Zuordnungen, die hauptsächlich aufgrund eines erheblichen Hintergrunds als unsicher angesehen werden, sind in Klammern angegeben. Zwei Zubereitungen ergaben beinahe identische Ergebnisse, mit Ausnahme einer leichten Variation der Ausbeuten der einzelnen Reste, unsicheren Zuordnungen und Längen von sicheren Sequenzbestimmungen.
Die Tripletts für jede Position wurden gegen bekannte Strukturen durchmustert, was zeigte, daß die drei Proteinstrukturen bereits zuvor bekannt waren. So entsprach eine genau menschlichem Apolipoprotein A1 / Baker H. N., Gotto A. M. JR. und Jackson R. L. (1975) J. Biol. Chem. 7, 2725-2738/, während die beiden anderen identisch waren mit den Hauptalternativen, die für die leichten und schweren Immunglobulinketten bekannt sind. Die leichte Kette entspricht einer typischen k-Kette, und die schwere Kette weist maximale Übereinstimmungen mit verschiedenen g-, m- oder a-Ketten auf, was man aus Übereinstimmungen mit bekannten Strukturen der schweren Kette folgern kann, und könnte sehr gut eine typische g-Kette sein. Wenngleich die Natur der Immunglobulinketten aus einer Sequenzanalyse in einem Gemisch nicht als endgültig angesehen werden sollte. Die Ergebnisse identifizieren nichtsdestoweniger eindeutig SPAP als aus drei Arten von Proteinketten, Apolipoprotein A1 und den schweren und leichten Immunglobulinketten zusammengesetzt, ohne offensichtliche Anzeichen für eine Multiplizität. Die Stoichiometrien sind schwer zu beurteilen, da die anfänglichen Ausbeuten bei dem Abbau für die Ketten leichte Unterschiede aufweisen können, aber ein Komplex zwischen dem Immunglobulin und den Apolipoproteinmolekülen, welcher äquimolare Mengen der Ketten ergibt, scheint möglich.
Die Spermienaktivierungsfähigkeit von SPAP wird wie folgt gezeigt:
Die Eluate von den verschiedenen Aufreinigungsschritten aktivieren Spermatozoen im gleichen Maß wie 16,7% (v/v) Serum. Die Spermienaktivierungsfähigkeit von gereinigtem SPAP erwies sich als von der SPAP-Konzentration abhängig. Die Aktivierung konnte unter Verwendung von SPM sowie von ATP nachgewiesen werden (Fig. 4). In dem "standardisiertem Modellsystem" mit 2,5 Millionen Spermatozoen/ml wurde die maximale Wirkung bei einer Konzentration von 20-70 nmol/l erhalten. Gereinigtes SPAP, das 5 Minuten lang auf 100ºC erwärmt worden war, aktivierte die Spermienbeweglichkeit nicht. Gereinigtes Albumin, Apolipoprotein A1 und Immunglobuline hatten nur geringe und kurzzeitige (einige Stunden dauernde) Wirkungen auf die Spermienbeweglichkeit.
Die Immunisierung und Charakterisierung von Anti-SPAP-Serum erfolgte durch Immunisieren von Kaninchen mit gereinigtem SPAP in komplettem Freundschen Adjuvans. Zehn Wochen nach der Immunisierung wurde in einem Kaninchen Antiserum mit ausreichendem Titer nachgewiesen. Wenn dieses Antiserum mit normalen männlichen Seren in Verhältnissen von ungefähr 9 : 1 (v/v) inkubiert wurde, bildete sich ein Niederschlag. Untersuchungen des Überstands auf Apolipoprotein A1 zeigten einen geringen Apolipoprotein A1-Gehalt, verglichen mit dem von unbehandelten Seren, was nahelegt, daß das meiste Apolipoprotein A1 durch das Kaninchenserum ausgefällt worden ist. Im Vergleich mit unbehandeltem menschlichen Serum wies das ausgefällte menschliche Serum eine geringere Fähigkeit (ungefähr 25%) zum Unterstützen der Spermienbeweglichkeit auf. Wenn Kaninchen-Anti-SPAP-Serum direkt zu Spermatozoen in dem "standardisierten Modellsystem" zugegeben wurde, wurde die Beweglichkeit im Vergleich zu derjenigen verringert, die sich bei der Zugabe von vorimmunisiertem Serum ergab.
Es zeigte sich, daß zu den Spermatozoen zugegebenes SPAP-Antiserum die Spermienbeweglichkeit hemmte. Die wahrscheinlichste Erklärung dafür ist, daß SPAP vorher an die Spermatozoen gebunden und anschließend durch die Antikörper erkannt wird.
Nach der Gelfiltration durch FPLC®-Chromatographie wurde für das Molekulargewicht der Fraktion ein Wert von ungefähr 250 kD berechnet und nach Blue-Sepharose® entsprach die auf SDS-Polyacrylamidgelen in Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol beobachtete Hauptbande ungefähr 180 kD. Der Unterschied beträgt ungefähr 70 kD, d. h. er entspricht dem Molekulargewicht von Albumin. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Anwesenheit von 2-Mercaptoethanol ließ die Komponenten erkennen (50 kD und 25 kD). Die Stöchiometrien des spermienaktivierenden Proteins sind schwer einzuschätzen, aber ein Komplex zwischen den Immunglobulin- und den Apolipoproteinmolekülen, welcher äquimolare Mengen der Ketten ergibt, erscheint möglich. Apolipoprotein A1, Immunglobuline und Albumin hatten getrennt eine geringere Wirkung auf die Spermienbeweglichkeit. Es erscheint wahrscheinlich, daß ein Apolipoprotein A1- Immunglobulin-Komplex die Aktivierung der Spermatozoen vermittelt.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die bedeutende Spermienaktivierungsfähigkeit in Serum durch eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von ungefähr 250 kD vermittelt wird. Es wurde nun gezeigt, daß diese Fraktion aus einem Komplex zusammengesetzt ist, der Albumin, Apolipoprotein A1 und die schweren und leichten Ketten von Immunglobulin enthält. Da das Kochen die Aktivierungsfähigkeit zerstört, ist es wahrscheinlich, daß die Wirkung eher durch das Makromolekül selbst als durch einen kleinen Liganden vermittelt wird. Da die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Abwe senheit von 2-Mercaptoethanol keine Banden unter 150 kD aufwies, aber Komponenten in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol beobachtet wurden, erscheint es wahrscheinlich, daß der Komplex von intakten Proteindisulfidbrücken abhängig ist. Für das Molekulargewicht des Komplexes bei der FPLC®-Chromatographie wurde ein Wert von 282C$D ungefähr 250 kD berechnet. Nach der Chromatographie an Blue-Sepharose® entsprach die Bande auf dem SDS-Polyacrylamidgel ungefähr 180 kD. Der Unterschied beträgt ungefähr 70 kD, d. h. könnte dem Molekulargewicht von Albumin entsprechen. Die Stöchiometrien sind schwer einzuschätzen, aber ein Komplex zwischen äquimolaren Mengendes Immunglobulins und des Apolipoproteins erscheint möglich. Das Molekulargewicht dieses Komplexes sollte ungefähr 180 kD betragen, was dem Wert entspricht, der bei der Gelelektrophorese gefunden wurde. Selbst wenn das Makromolekül ohne Albumin Spermatozoen aktivieren könnte, wird angenommen, daß die biologisch wirksame Form davon ein Molekül von Albumin enthält und ein Molekulargewicht von ungefähr 250 kD aufweist, was mit den Ergebnissen der FPLC® übereinstimmt. Unsere Studien zeigen, daß das erzeugte Antiserum mit dem Makromolekül und mit Immunglobulinen wechselwirkt.
Der Mechanismus, durch den das Makromolekül die Spermienaktivierung herbeiführt, ist nicht bekannt. Den geringen Mengen, die für die Aktivierung erforderlich sind, nach zu urteilen erscheint ein rezeptorvermittelter Mechanismus oder Enzym-Mechanismus wahrscheinlich. In diesem Zusammenhang kann angemerkt werden, daß Apolipoprotein A1 Lecithin : Cholesterolacyltransferase (LCAT) aktiviert, aber wir haben keinen Hinweis darauf, daß dieses oder irgendein anderes Enzym an der Spermienaktivierung beteiligt ist.
Der neue makromolekulare Komplex ist vermutlich auch in anderen extracellulären Flüssigkeiten vorhanden. So ist es bekannt, daß die Beweglichkeit die einzelne wichtigste Variable zum Beurteilen der Befruchtungsfähigkeit von Spermien ist, und daß verschiedene Seren und Follikelflüssigkeiten Spermien auf nicht-identische Weise aktivieren, das Makromolekül kann sowohl für die diagnostische als auch therapeutische Verwendung nützlich sein.

Claims

1. Proteinmakromolekül, umfassend einen im wesentlichen reinen Proteinkomplex, mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr 5, 1, aus Apolipoprotein A1, immunglobulin und Albumin, wobei das Makromolekül mit einem durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen bestimmten Molekulargewicht von ungefähr 250000 Dalton fähig ist, die Sperma- bzw. Spermienbeweglichkeit zu aktivieren.

2. Proteinmakromolekül nach Anspruch 1, worin das Apolipoprotein A1, das Immunglobulin und das Albumin in ungefähr äquimolaren Mengen vorliegen.

3. Verfahren zur Herstellung des Makromoleküls nach Anspruch 1, umfassend das Reinigen von extracellulären Flüssigkeiten durch ein dreistufiges Protokoll, das Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatofokussieren und Fast Protein- Flüssigchromatographie (FPLC) einschließt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die extracelluläre Flüssigkeit Humanserum ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Spermienbeweglichkeits-Aktivität nach jedem einzelnen Reinigungsschritt überprüft wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge eines im wesentlichen reinen Proteinkomplexes, mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr 5,1, aus Apolipoprotein A1, Immunglobulin und Albumin, wobei der Proteinkomplex mit einem durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen bestimmten Molekulargewicht von ungefähr 250000 Dalton fähig ist, die Spermienbeweglichkeit zu aktivieren, und einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Verwendung bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung bei der Behandlung von in Vitro-Unfruchtbarkeit.

9. Verfahren zum Bestimmen der potentiellen Fruchtbarkeit von Sperma bzw. Spermien, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe mit einem Makromolekül nach den Ansprüchen 1-2 behandelt wird und ihre Beweglichkeit mit einem bekannten Standard verglichen wird.