DE69032922T2

DE69032922T2 - Menschliches intra-akrosomales spermaantigen zur verwendung in einem empfängnisverhütungsimpfstoff

Info

Publication number: DE69032922T2
Application number: DE69032922T
Authority: DE
Inventors: John Herr; Richard Wright
Original assignee: University of Virginia UVA
Current assignee: University of Virginia UVA
Priority date: 1989-03-03
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1999-09-30
Anticipated expiration: 2010-03-03
Also published as: ATE176156T1; EP0461177B1; JPH04505008A; CA2050910A1; NO312594B1; CA2050910C; NO913428L; EP0461177A1; ES2130121T3; AU5186290A; US5436157A; EP0461177A4; DE69032922D1; DK0461177T3; WO1990009802A1; AU649609B2; NO913428D0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Empfängnisverhütungsimpfstoffe. Insbesondere betrifft sie eine Klasse von intraakrosomalen Humanspermaantigenen zur Verwendung in einem Empfängnisverhütungsimpfstoff, eine Klasse von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gegen diese Antigene sowie damit zusammenhängende Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Antigene und Antikörper, einschließlich eines cDNA-Expressionssystems zur Herstellung des Antigens in vitro.
Antikörper gegen Sperma sind mit der menschlichen Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht worden, und die freiwillige Immunisierung von Tieren mit Sperma oder Extrakten des reifen Testis hat zu einer signifikanten Hemmung der Fruchtbarkeit geführt. Demgemäß haben die Forscher aktiv die Untersuchung von Spermaantigenen betrieben, in der Hoffnung, ein keimzellenspezifisches Antigen zu identifizieren, das als ein Immunogen in einem Empfängnisverhütungsimpfstoff verwendet werden kann. Der Ansatz der Identifizierung von gametenspezifischen Antigenen hat den Vorteil gegenüber anderen Ansätzen, wie z. B. dem HCG-Impfstoff, daß er ein Präfertilisationsimpfstoff ist - einer, der eine Immunität induziert, welche die Befruchtung blockiert, im Gegensatz zu einem Angriff auf das frühe Embryo.
Ein sicherer und wirksamer Empfängnisverhütungsimpfstoff wäre ein in hohem Maße wünschenswertes Verfahren der Geburtenkontrolle, da eine einzige Injektion oder nur einige wenige Injektionen eine Frau für mehrere Jahre unfruchtbar werden lassen könnten. Jedoch wurden bis zu den relativ neuen biotechnologischen und immunologischen Fortschritten sehr wenige Antigene, die für solche befruchtungsverhüten den Impfstoffe geeignet sind, identifiziert und gereinigt, insbesondere bei Menschen. Weiterhin waren humane Proteine deutlich schwieriger und teurer zu produzieren als die meisten viralen oder bakteriellen Proteine und waren nicht so immunogen. Das Aufkommen der Hybridom- und der rekombinanten DNA-Technologie hat die Möglichkeit mit sich gebracht, keimzellenspezifische Antigene zu identifizieren und die Humanform solcher Proteinantigene zur Untersuchung und potentiellen Anwendung in neuen Impfstoffen in Massenproduktion herzustellen.
Anderson und Alexander, Fertility and Sterility 40: 557- 571 (1983) diskutieren die allgemeine Anwendung der Gentechnologie und der monoklonalen Antikörpertechnologie auf die Entwicklung von befruchtungsverhütenden Impfstoffen. Sie diskutieren ebenfalls einige der Kandidaten für solche Impfstoffe, einschließlich der Spermaantigene Protamin, Lactatdehydrogenase-C&sub4; (LDH-C&sub4;), RSA-1, Akrosin und Hyaluronidase. Die Autoren geben an, daß LDH-C&sub4; gereinigt wurde und die Information über die Aminosäuresequenz zur Verfügung steht. Sie geben weiterhin an, daß monoklonale Antikörper (MABs) dagegen entwickelt wurden. Die Autoren geben ebenfalls auf Seite 561 an, daß (1) Spermaplasmamembranautoantigene die besten Ziele für die Wirkungen von befruchtungsverhütenden Antikörpern bieten und (2) Antigene, welche an die innere akrosomale Membran gebunden sind, wie z. B. Akrosin und Hyaluronidase, schlechte Kandidaten zu sein scheinen.
Über die letzten Jahre hinweg wurden viele verschiedene monoklonale Antikörper gegen humane und andere tierische Spermaantigene erzeugt. Beispielsweise offenbaren Lee et al., Journal of Reproductive Immunology 4: 173-181 (1982), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, Mäuse- MABs, die mit Antigenen reagieren, welche in dem akrosomalen Bereich von Humansperma lokalisiert sind. Solche Anti gene befinden sich scheinbar auf der Oberfläche des Spermas und sie weisen ein Molekulargewicht von ca. 10.000 auf.
Ein weiteres Beispiel ist ein Mäuse-MAB, welcher mit C11H bezeichnet wird, gegen ein akrosomales Antigen. Siehe Kallajoki und Souminen, International Journal of Andrology 7: 283-296 (1984), Kallajoki et al., International Journal of Andrology 9: 181-194 (1986) und Salonen und Kallajoki, International Journal of Andrology 10: 731-739 (1987), auf welche allesamt hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die Veröffentlichung von 1984 offenbart die Herstellung von C11H und daß dieses ein Antigen mit einem Molekulargewicht von 50.000 wie auch andere Komponenten mit einem Molekulargewicht von 24.000-34.000 erkennt. Das Antigen wurde in dem Sperma von Menschen und gewissen Tieren gefunden. Die Autoren wiesen darauf hin, daß sie glaubten, daß das Antigen Akrosin sei und sie gaben an, daß sie nicht wußten, ob es in dem Akrosom oder innerhalb der akrosomalen Membranen vorlag. Die Veröffentlichung von 1986 liefert weitere Informationen über den Antikörper und das Antigen. Die Autoren geben an, daß der Antikörper mit Akrosin reagierte und weiterhin, daß sich Akrosin in der akrosomalen Matrix befindet. Sie schlugen vor, daß Akrosin während der Akrosomenreaktion fast vollständig freigesetzt wird. Sie geben weiterhin an, daß dieser gegenüber einem 50 kD-Antigen und mehreren anderen in dem Bereich von 24-34 kD reagierte. Schließlich geben sie an, daß der MAB verwendet werden kann, um auf Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, zu screenen. Die Veröffentlichung von 1987 offenbart Versuche, in welchen C11H das Eindringen von Sperma in Zona-freie Hamstereier hemmte.
Huneau et al., International Journal of Androloay 11: 13-24 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, offenbaren einen Mäuse-MAB, der als a-HS 1E.1 bezeichnet wird, welcher mit Humansperma in dem äquatorialen Bereich der akrosomalen Membran reagiert. Fig. 2 in der Veröffentlichung weist darauf hin, daß der MAB mit der äußeren akrosomalen Membran reagiert. Das entsprechende Antigen hat ein Molekulargewicht, das gleich oder größer als 53 kD ist.
Solche Antikörper boten, wenigstens in der Theorie, die Möglichkeit, gametenzellenspezifische Antigene zu identifizieren, isolieren und charakterisieren, welche in einem Empfängnisverhütungsimpfstoff nützlich sein könnten. Jedoch waren die Bemühungen bis heute enttäuschend.
Anderson et al., Journal of Reproductive Immunology 10: 231-257 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, offenbaren einen Versuch in mehreren Laboratorien, welcher von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gesponsert wurde, um 66 verschiedene Mäuse-MABs auszuwerten, die mit Humansperma reagieren. Von diesen 66 reagierten nur 3 mit Antigenen, die wie gute Kandidaten für einen Empfängnisverhütungsimpfstoff aussahen. Einer dieser monoklonalen Antikörper, welcher mit MHS-10 bezeichnet wurde, zeigte eine starke Reaktivität mit Humansperma und testikulären Keimzellen und eine fehlende Kreuzreaktivität mit vielen anderen Geweben von Erwachsenen. Der Antikörper hemmte die Befruchtung in dem Hamstereieindringtest. Die Autoren gaben ebenfalls an, daß MHS-10 an ein Humansperma- Oberflächenantigen band und daß es mit einer Familie von Antigenen mit Molekulargewichten zwischen 14.000 und 30.000 reagierte.
Die Autoren offenbarten verschiedene Schwierigkeiten bei der Auswertung dieses MABs und der anderen MABs. Sie schlossen aus ihrer Auswertung von all den Antikörpern, daß der Ansatz mit einem monoklonalen Mäuseantikörper für die Identifizierung von für humanes reproduktives Gewebe spezifischen Antigenen nicht brauchbar ist und daß weiterhin die immunhistologischen Daten und die "überraschende Kreuzreaktivität der [meisten] der MABs mit nichtreproduktiven Gewe ben" die Notwendigkeit für ein umfassendes immunhistologisches Testen von neuen MABs durch qualifizierte Immunpathologiegruppen unterstreichen.
Wenigstens eine neuere Studie fährt darin fort, das herkömmliche Wissen zu überdenken, daß ein befruchtungsverhütendes Antigen auf der Spermaoberfläche erscheinen sollte. Primakoff et al., Nature 355: 543-546 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, berichten über ein affinitätsgereinigtes Meerschweinchenspermaprotein, welches als PH-20 bezeichnet wurde, das als ein Immunogen verwendet wurde, um eine Empfängnis bei männlichen und weiblichen Meerschweinchen zu verhindern. Das Antigen, welches ein Molekulargewicht von 64.000 aufweist, ist sowohl auf der Plasmamembran als auch der inneren akrosomalen Membran von Meerschweinchensperma vorhanden. In dem letzten Absatz des Artikels geben die Autoren an, daß die hohe empfängnisverhütende Wirksamkeit des Antigens von mehreren bestimmten Eigenschaften, einschließlich seinem Vorliegen auf der Spermaoberfläche abhängt. Sie geben weiterhin an, daß ein humanes funktionales Analogon von PH-20 ein Kandidat für ein wirksames empfängnisverhütendes Immunogen wäre.
Herr et al., Journal of Andrology 9 : 42 (1988) ist eine Zusammenfassung, welche weitere Daten über das Antigen berichtet, das durch MHS-10 identifiziert wurde. Insbesondere offenbart diese, daß das Antigen auf akrosomenförmigen Strukturen in dem Humansperma lokalisiert ist und daß das Peptid 7 Hauptisoformen mit einem Molekulargewicht von 22- 38 kD aufweist.
MHS-10 und sein entsprechendes Antigen, das humane akrosomale Spermaantigen 10 (SP-10), wurden nun durch die Erfinder im wesentlichen gereinigt und charakterisiert. Die Erfinder haben überraschend eine Klasse von intra-akrosomalen Humanspermaantigenen gefunden, die, im Gegensatz zu dem herkömmlichen Wissen, eine befruchtungsverhütende Aktivität haben könnten, wenn sie als ein Immunogen in einem Empfängnisverhütungsimpfstoff für weibliche Menschen verwendet werden. Die Erfinder haben ebenfalls die cDNA isoliert, welche für das SP-10-Antigen codiert, was die Verwendung von gentechnischen Verfahren erlaubt, um die Antigene in einer Form zu erzeugen, welche als ein Immunogen in einem Impfstoff nützlich ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein im wesentlichen gereinigtes intra-akrosomales Humanspermaantigen zur Verwendung in einem Empfängnisverhütungsimpfstoff zur Verfügung zu stellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verwendung als einen Empfängnisverhütungsimpfstoff zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des Antigens zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, monoklonale und polyklonale Antikörper, die mit dem intra-akrosomalen Humanspermaantigen der Erfindung reagieren, sowie Verfahren zur Herstellung der Antikörper zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zum Nachweisen von Humansperma oder zur Isolierung eines solchen Spermas zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe ist es, Verfahren und Zusammensetzungen für die biochemische, immunologische, funktionale oder eine andere überprüfende Analyse von Humansperma zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweisen von unreifen Keimzellen im Samen und die Anwendung dieses Verfahrens bei der Feststellung der Unfruchtbarkeit zur Verfügung zu stellen.
Noch eine weitere Aufgabe ist es, eine DNA-Sequenz und einen Expressionsvektor, die für das Antigen der Erfindung codieren, zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von immunogenen Peptiden des Antigens.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, transformierte Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, die das Antigen produzieren.
Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden teilweise in der Beschreibung, welche folgt, ausgeführt und werden teilweise aus der Beschreibung offensichtlich sein oder können durch die Praktizierung der Erfindung gewonnen werden. Die Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden mittels der Hilfsmittel und Kombinationen erreicht, welche besonders in den angefügten Ansprüchen angegeben werden.
Um die Aufgaben zu lösen und gemäß dem Zweck der Erfindung, wie sie hierin verkörpert ist und in breitem Umfang beschrieben wird, wird hierin ein im wesentlichen gereinigtes intra-akrosomales Humanspermaantigen, welches nach der Akrosomenreaktion mit dem Sperma assoziiert bleibt, offenbart. Vorzugsweise bleibt das Antigen nach der Akrosomenreaktion mit dem Spermakopf assoziiert, und am meisten bevorzugt ist es entweder mit der äußeren Fläche der inneren akrosomalen Membran oder mit dem äquatorialen Segment des Spermas verbunden.
Eine alternative Ausführungsform der Erfindung ist ein im wesentliches reines Polypeptid, das eine wesentliche Homologie mit diesem Antigen zeigt oder verändert wurde, um ein Polypeptid zu liefern, das eine erhöhte befruchtungs verhütende Immunogenität aufweist, wenn es mit dem unveränderten Polypeptid verglichen wird.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung des nativen Antigens der Erfindung. Reifes Humansperma wird homogenisiert, und die löslichen Proteine werden extrahiert. Der Extrakt wird mit einem immobilisierten monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der mit dem Antigen der Erfindung reagiert, wobei ein immobilisierter Komplex des Antikörpers und des Antigens gebildet wird. Das Antigen wird dann von dem monoklonalen Antikörper abgetrennt, um in einer im wesentlichen gereinigten Form gewonnen zu werden.
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein alternatives Verfahren zur Herstellung des nativen Antigens aus Humansperma. Ejakuliertes Sperma wird homogenisiert und die löslichen Proteine werden durch Umkehrphasenhochdruckflüssigchromatographie getrennt. Die SP-10-Peptide werden dann weiter durch eine präparative SDS-PAGE gereinigt.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen monoklonalen Antikörper gegen das intra-akrosomale Humanspermaantigen zur Verfügung. Dem Antikörper fehlt die Kreuzreaktivität mit im wesentlichen allen humanen somatischen Geweben und er hemmt die Sperma-Ei-Wechselwirkungen in dem Hamstereieindringtest.
Der monoklonale Antikörper wird hergestellt, indem ein Säugetier mit Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder dem Überstand, welcher aus einer Zentrifugation von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wurde, immunisiert wird. Die antikörperproduzierenden Zellen werden aus dem Säugetier gewonnen und mit Tumorzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen. Die Hybridome werden mit Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder dem Überstand, wel cher aus der Zentrifugation eines solchen Spermas erhalten wurde, gescreent, um Hybridome zu identifizieren, die einen Antikörper produzieren, der mit dem intra-akrosomalen Humanspermaantigen reagieren kann. Der Antikörper wird dann aus den identifizierten Hybridomen gewonnen.
Zusätzlich dazu, daß die hierin offenbarten monoklonalen Antikörper nützlich sind, um das Antigen der Erfindung zu reinigen, sind sie ebenfalls nützlich, um Humansperma nachzuweisen oder zu isolieren, das die Akrosomenreaktion durchlaufen hat. Der Antikörper wird mit einer Probe des Humanspermas für eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ausreichen, daß der Antikörper und irgendein Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, einen Antigen-Antikörper-Komplex bilden. Die Komplexe werden dann nachgewiesen oder aus der Probe entfernt. Im letzteren Fall werden die Spermazellen dann von dem Komplex getrennt und als ein Isolat gewonnen.
In einer alternativen und bevorzugten Ausführungsform wird das Antigen der Erfindung produziert, indem Wirtszellen kultiviert werden, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, welcher die Expression des Antigens in dem transformierten Mikroorganismus steuert. Der Expressionsvektor umfaßt eine rekombinante DNA-Sequenz, welche eine cDNA-Sequenz, die für das Antigen codiert, in operativer Verknüpfung mit geeigneten regulatorischen Steuernukleinsäuresequenzen enthält.
Die begleitenden Figuren, welche in die Beschreibung eingearbeitet sind und einen Teil davon bilden, stellen eine Ausführungsform der Erfindung dar und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Immunhistochemische Lokalisierung von SP-10 innerhalb der Tubuli seminiferi des menschlichen Testis. Fig. 1A. Querschnitte der Tubuli seminiferi, die mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper (1 : 1000) umgesetzt wurden, zeigen ein dunkles Reaktionsprodukt in dem zum Lumen hin gelegenen Kompartiment. X 180. Fig. 1B. Bei einer höheren Vergrößerung beobachtet man bei Gruppen von Keimzellen in einem ähnlichen Stadium in einem einzigen Tubulus seminiferus sowohl ein halbmondförmiges als auch ein kleineres granuläres Reaktionsprodukt (Pfeilspitzen). X 720. Fig. 1C. Ein Gewebeschnitt, welcher mit dem Kontroll-Mäuse-IgG&sub1; behandelt wurde, zeigt keine Anfärbung. X 180.
Fig. 2. Immunfluoreszenzlichtmikrographien, welche SP- 10 in ejakuliertem Humansperma lokalisieren. Fig. 2A. Eine Kombination aus Phasenkontrast- und Fluoreszenzbild zeigt eine kappenförmige Fluoreszenz über dem vorderen Teil des Spermakopfes. X 2870. Fig. 2B. Sperma nach einer künstlichen Induktion der Akrosomenreaktion mit dem Calciumionophor A23187. In dem Experiment, bei welchem das obige Photo aufgenommen wurde, zeigten 47,5% der Spermien vollständige Fluoreszenzkappen, 20,3% schwache Fluoreszenzkappen (gekrümmter Pfeil), 22,4% äquatoriale Streifen (gerader Pfeil), und 9, 9% der Spermien war nicht angefärbt. X 3350.
Fig. 3. Elektronenmikrographie eines Humanspermakopfes nach einer Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 und Protein-A-Gold. Goldpartikel werden über dem akrosomalen Kompartiment beobachtet. In Bereichen, wo das Akrosom schräg angeschnitten war, wie an der Spermaspitze, folgten die Goldpartikel einer bilaminaren Verteilung. Pfeilspitzen zeigen die Lage der akrosomalen Membranen, welche bei diesem nicht mit Osmium umgesetzten Material für Elektronen durchlässig sind. X 98.300.
Fig. 4. Eindimensionaler SDS-PAGE-Gel (10% Acrylamid)- Nitrocellulose-Elektroblot, welcher mit Amidoschwarz angefärbt wurde (A), und identisches Nitrocelluloseblatt, das mit dem MHS-10-mAB (B) oder dem Kontroll-IgG&sub1; (C) umgesetzt wurde. Spermaextrakte von 6 Spendern (1-6) enthielten β- Mercaptoethanol (mit R = reduziert markierte Bahnen) oder ihnen fehlte dieses Mittel (nichtreduziert = N). Pro Bahn wurden 25 ug Protein laufen gelassen. Das Muster der immunreaktiven SP-10-Peptide ist sowohl unter den Personen als auch bei den reduzierten und nichtreduzierten Extrakten identisch.
Fig. 5. Mit Silber angefärbtes zweidimensionales Gel (A) und Immunoblot (B), unter Verwendung von MHS-10-mAb mit Proteinen, die aus Humansperma extrahiert wurden. Eine eindimensionale Bahn, welche die Silberfärbung und das Immunoblotmuster des Spermaextraktes zeigt, liegt auf der rechten Seite jeder Figur. Die Molekulargewichte (MW) und isoelektrischen Punkte (pI) sind auf äem rechten bzw. unteren Rand angegeben. Die Pfeile bei der Silberfärbung oben zeigen die Lage der SP-10-Proteine (AP) bei 34 und 30 kDa, welche mit Banden und Punkten einer ähnlichen Masse auf dem Immunoblot unten verglichen werden können. Die 2-D- und 1- D-Gele wurden mit 75 bzw. 15 ug Spermaprotein beladen. Immunreaktive SP-10-Peptide mit 24-34 kD weisen einen pI von 4,9 auf, die Punkte bei 18 kD reichen mit ihrem pI von 5,1-5,4.
Fig. 6. Eindimensionale SDS-PAGE (16 cm-Gele)-Elektroblots, welche mit Amidoschwarz (A) und mit dem MHS-10-Antikörper (B) angefärbt wurden. Die Bahnen 1A & B enthielten 20 ug Humanspermaproteine; Bahnen 2 80 ug Eberspermaproteine; Bahnen 3 20 ug gereinigtes Eberproakrosin; Bahnen 4 15 ug gereinigtes Ebersperminogen. Der monoklonale Antikörper MHS-10 (1/1000) erkannte mehrere Peptide mit einer ähnlichen Masse wie die Humansperma-SP-10-Peptide in dem Eberspermahomogenat (Bahn 2B), waren aber mit dem gereinigten Eberakrosin (Bahn 3B) oder Sperminogen (Bahn 4B) nicht kreuzreaktiv. Die Kontrollbahnen 1-4C wurden mit Aszites eines anderen monoklonalen IgG&sub1;-Antikörpers umgesetzt.
Fig. 7. Immunoblot (Minigele) von Human (H)-, Bullen (B)-, Ratten (Rt)- und Kaninchen (Rb)-Sperma, das mit 1% SDS extrahiert wurde. Jede Bahn wurde mit 3 ug Protein beladen, welches durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen wurde. Die Bahnen wurden mit Amidoschwarz (Bahnen A), einer 1 : 2000-Verdünnung des MHS-10-Mab- Aszites (Bahnen B) oder einer 1 : 2000-Verdünnung von Null- Aszites (Bahnen C) angefärbt. Die Bahnen, welche mit Aszites inkubiert wurden, wurden anschließend mit HRP-markiertem sekundärem Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Antikörper inkubiert, worauf 0,05% DAB und Wasserstoffperoxid folgten. Die linke Bahn enthielt Molekulargewichtsstandards mit den angegebenen Molekulargewichten.
Fig. 8. Immunoblot von Human (Hs)-, Papio cynocephalus (Pc)-, Macaca mulatta (Mm)- und Macaca fascicularis (Mf)- Sperma, das mit 1% SDS extrahiert wurde. Jede Bahn wurde mit 10 ug Protein beladen, welches durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose überführt wurde. Die Bahnen wurden mit Amidoschwarz, einer 1 : 2000-Verdünnung von MHS- 10-Aszites oder einer 1 : 2000-Verdünnung von Null-Aszites wie angegeben angefärbt. Die Bahnen, welche mit Aszites inkubiert wurden, wurden anschließend mit HRP-markiertem sekundärem Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Antikörper inkubiert, worauf 0,05% DAB und Wasserstoffperoxid folgten.
Fig. 9. Northern-Blot von poly A+-RNA, welche aus den Testes von Menschen, Pavian (Papio papio, Papio cynocephalus anubis), Rhesusaffe (Macaca fascicularis), Hund und Katze wie auch aus menschlicher Plazenta und Leber isoliert wurde. Der Blot wurde mit einer mit p³² markierten Sonde hybridisiert, welche 628 bp des offenen Leserasters für Human-SP-10 überspannte. Eine 1,35 kb-mRNA wird in Bahnen beobachtet, welche humane, Pavian- und Rhesusaffen-poly A+- Testis-RNA enthalten.
Fig. 10. Northern-Blot-Analyse von poly(A)+-RNA aus humanen Testes, Leber und Plazenta. Ein ug der Testespoly(A)+-RNA und 2 ug der Leber- und Plazenta-poly(A)+-RNAs wurden auf einem 1% Formaldehyd-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, auf eine Biotrace-Membran überführt und mit einem nicktranslatierten 634 bp-SP-10-5-Fragment sondiert. Die SP-10-mRNA weist ungefähr 1,35 kb in der Länge auf.
Fig. 11. Fig. 11A. Vollständige Nukleotid- und vorhergesagte Proteinsequenzen, welche von den überlappenden SP- 10-5- und SP-10-10-cDNAs abgeleitet wurden. Der Einbuchstabenaminosäurecode für die Proteinsequenz ist unterhalb der Nukleotidsequenz angegeben. Die obere Zeile in jedem Paar von Sequenzen wurde von der SP-10-5-cDNA und die untere Zeile von der SP-10-10-cDNA wie angegeben abgeleitet. Die Numerierung auf der rechten Seite zeigt die Nukleotid- und Aminosäurepositionen an. Die durchgezogene Linie bei den die SP-10-10-Sequenz überspannenden Nukleotiden 554-610 stellt den mutmaßlichen alternativ gespleißten Bereich von SP-10-10 dar. Die sich wiederholenden Motive eins, zwei und drei sind durch einfach, doppelt bzw. dreifach unterstrichene Sequenzen bezeichnet. Die Stellen der potentiellen Nverknüpften Glykosylierung sind durch das Symbol -chobezeichnet, und die Stellen der potentiellen O-verknüpften Glykosylierung sind mit dem Symbol (+++) unterstrichen. Die 5'-Konsensus-Nukleotidsequenz, welche die eukaryotischen ATG-Startcodons flankiert, ist mit dem Symbol (~~~) unterstrichen, ein poly A-Additionssignal ist mit dem Symbol (^^^) unterstrichen und eine mRNA-Konsensus-Abbausequenz ist mit dem Symbol (***) unterstrichen. Die zwei im Raster liegenden Stop-Codons 5' von dem ATG sind mit TER bezeichnet. Eine innere EcoR1-Stelle ist an der Pfeilspitze angegeben. Fig. 11B. Hydrophobizitätsplot, welcher aus der abgeleiteten SP-10-5-Aminosäuresequenz erzeugt wurde. Die hydrophoben Reste liegen oberhalb der Mittellinie und die hydrophilen Reste liegen unterhalb der Linie. Die SP-10-5-, SP-10-10- und SP-10-214-cDNAs sind unter dem Plot angegeben. Die innere EcoR1-Stelle bei bp 695 ist angegeben.
Fig. 12. Western-Blot-Analyse von Humanspermaextrakten unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers MHS-10 und des polyklonalen SP-10-Antiserums, welches gegen das rekombinante Fusionsprotein pWRSP-210 erzeugt wurde. MHS-10 und das polyklonale Antiserum erkannten einen identischen Satz an SP-10-Polypeptiden in den Spermaextrakten. Humanspermaextrakte wurden hergestellt und einer SDS-PAGE unterworfen, geblottet und mit dem monoklonalen und polyklonalen Antikörper wie in Materialien und Methoden beschrieben inkubiert. Anfärbung der einer Elektrophorese unterzogenen Spermaextrakte mit Amidoschwarz, Bahn 1. Extrakte, die mit MHS-10, Bahn 2, oder Null-Aszites, Bahn 3, inkubiert wurden. Extrakte, die mit dem polyklonalen SP-10-Antiserum, Bahn 4, oder Präimmunserum, Bahn 5, inkubiert wurden.
Fig. 13. Immunfluoreszenzfärbung von Humansperma unter Verwendung von MHS-10 und dem polyklonalen SP-10-Antiserum. Sowohl der monoklonale MHS-10-Antikörper als auch das polyklonale Antiserum gegen das rekombinante Fusionsprotein pWRSP-210 reagierten mit der akrosomalen Kappe. Sperma, das mit polyklonalem SP-10-Antiserum, x1200 (A), Präimmunserum, x1200 (B), monoklonalem MHS-10, x1775 (C) oder Null-Aszites, x1775 (D), inkubiert wurde.
Fig. 14. Fig. 14A. Kryostatschnitt eines menschlichen Testis, welcher immunhistochemische Spermatiden und reifes Sperma (rechte obere Ecke) zeigt (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x964). Fig. 14B. Frühes Stadium eines Spermatids im Samen vor der Akrosomenbildung. Man beachte das Fehlen einer Immunfärbung mit MHS-10 (MHS-10, SPB, Hämatoxylin x1600). Fig. 14C. Spermatid in der Golgi-Phase in einem Samenab strich. Man beachte das oval geformte, immungefärbte akrosomale Körnchen neben dem Kern (Pfeil) (MHS-10, SPB, Hämatoxylin x2800). Fig. 14D. Spermatid in der späten Golgi-Phase in einem Samenabstrich, welcher ein immungefärbtes akrosomales Körnchen (Pfeil) und ein unvollständiges Flagellum zeigt (MHS-10, SPB, Hämatoxylin x2600). Fig. 14E. Spermatid in der frühen Kappenphase in einem Samenabstrich. Man beachte den unkondensierten Kern bei dem immunhistochemisch angefärbten Akrosom, welches proximal zu der Implantationshöhle liegt (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2205). Fig. 14F. Reifes Sperma in einem Samenabstrich, welches ein vollständiges immunhistochemisch angefärbtes Akrosom zeigt (MHS-10, SHP, Hämatoxylin x194B).
Fig. 15. Fig. 15A. Unreife Keimzelle in einem Samenabstrich, welche zwei Kerne innerhalb desselben Zytoplasmas zeigt (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2145). Fig. 15B. Spermatid im Samen mit zwei immunhistochemisch angefärbten akrosomalen Körnchen innerhalb desselben Zytoplasmas (MHS 10, SBP, Hämatoxylin x2293). Fig. 15C. Sperma mit zwei Flagellen mit zwei kondensierten Kernen (Pfeile) und vollständigen Akrosomen innerhalb desselben Zytoplasmas. Man beachte ebenfalls das Sperma mit einem großen unkondensierten Kern (unten links) und das mit einem abnorm großen Akrosom (unten rechts). (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x1583). Fig. 15D. Verbundene Spermatiden in einem Samenabstrich, welche eine asynchrone Entwicklung zeigen. Die Pfeile zeigen auf akrosomale Vesikel, welche sich im Stadium der Golgi-Phase befinden (untere linke Ecke) bzw. auf die Kappenbildungsphase (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x1500). Fig. 15E. Verbundene Spermatiden in einem Samenabstrich (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x1854). Fig. 15F. Mit zwei Flagellen versehene Spermatiden in einem Samenabstrich, welche ein immunreaktives Akrosom in der Kappenphase und unkondensierte Kerne zeigen (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x1672). Fig. 15G. Sperma mit unkondensierten Kernen und Mikroakrosom in einem Samenabstrich (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x1967). Fig. 15H. Sper matid in der Kappenphase, welchem ein Flagellum fehlt, in einem Samenabstrich (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2754). Fig. 151. Pleomorphe Fragmente von Spermaköpfen im Samen, welche ein immunhistochemisch angefärbtes Material zeigen (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2149). Fig. 15J. Spermatid in einem Samenabstrich, welches eine periphere Umhüllung (cuff) von immunreaktivem Material zeigt (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2754). Fig. 15K. Spermatid in einem Samenabstrich, welches eine periphere Umhüllung von immunreaktivem Material zeigt (MHS-10, SBP, Hämatoxylin x2368). Fig. 15L. Leukozyt in einem Samenabstrich, welcher mit anti-HLe-1 angefärbt ist. Man beachte das Fehlen einer immunhistochemischen Anfärbung der Spermatiden und des reifen Spermas im selben Feld (anti-HL3-1, SBP, Hämatoxylin x845).

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Nun wird im Detail auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, welche zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Die Erfindung betrifft ein intra-akrosomales Humanspermaantigen, welches mit dem Humansperma nach der Akrosomenreaktion assoziiert bleibt. Vor der Akrosomenreaktion wird das Antigen innerhalb des Akrosoms beobachtet. Es ist möglich, daß das Antigen vor der Akrosomenreaktion in der Akrosomenmatrix löslich ist. Nach der Akrosomenreaktion bleibt es auf dem Spermakopf ausgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen in intaktem Sperma, das keine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, mit der äußeren Fläche der inneren akrosomalen Membran und der inneren Fläche der äußeren akrosomalen Membran assoziiert, und es bleibt mit diesen Membranen nach der Akrosomenreaktion assoziiert. Am meisten bevorzugt wird das Antigen in Assoziierung mit den inneren akrosomalen Membranen und dem äquatorialen Segment von Humansperma, das eine Akrosomenre aktion durchlaufen hat, gehalten. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "assoziiert mit" oder Variationen davon mit einem hydrophoben Schwanz gebunden, welcher in die Membran eingefügt ist, oder lose durch elektrostatische Wechselwirkungen gebunden, und er umfaßt vor der Akrosomenreaktion ungebunden in der Akrosomenmatrix.
Somit stellt ein Aspekt der Erfindung ein im wesentlichen gereinigtes intra-akrosomales Humanspermaantigen zur Verfügung, welches mit dem Humansperma nach der Akrosomenreaktion verbunden bleibt, wobei das im wesentlichen gereinigte Antigen mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 reagieren kann, welcher durch die Hybridomzellinie exprimiert wird, die unter dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA unter der Zugriffsnummer ATCC HB 10039 hinterlegt ist.
Das Antigen der Erfindung ist testisspezifisch und bei der menschlichen Bevölkerung konserviert. Es scheint ein Differenzierungsantigen zu sein, welches während der Spermatogenese auftritt. Es scheint vor der Akrosomenreaktion in der akrosomalen Matrix von unreifem Humansperma lokalisiert zu sein.
Die Begriffe "im wesentlichen rein" und "im wesentlichen gereinigt" sowie Variationen davon sollen, wenn sie verwendet werden um sich auf das hierin offenbarte Antigen zu beziehen, bedeuten, daß das Antigen im wesentlichen frei von Proteinen oder Polypeptiden ist, die nicht das intraakrosomale Humanspermaantigen sind. In dem Zusammenhang des bevorzugten Antigens bedeutet im wesentlichen rein, daß, wenn das gereinigte Antigen durch aminoterminale Aminosäuresequenzierung sequenziert wird, die resultierende Sequenz mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz vergleichbar ist, welche aus dem offenen Leseraster der cDNAs erhalten wurde. Das im wesentlichen reine Antigen der vorliegenden Erfin dung ist zu wenigstens 90 Gew.-% rein, vorzugsweise zu wenigstens 95 Gew.-% rein und am meisten bevorzugt zu wenigstens 98 Gew.-% rein. Das heißt, das im wesentlichen reine Antigen der Erfindung enthält nicht mehr als 10%, vorzugsweise nicht mehr als 5% und am meisten bevorzugt nicht mehr als 2 Gew.-% an Proteinen oder Polypeptiden, welche nicht das Antigen sind. Die Reinheit wurde durch densitometrisches Abtasten von SDS-PAGE-Gelen, welche mit Amidoschwarz gefärbt waren, die das gereinigte SP-10-Antigen enthielten, und durch Aminosäuresequenzierung des NH&sub2;- Terminus des gereinigten Proteins bestimmt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen im wesentlichen gereinigt und umfaßt eine Familie von Proteinen oder Polypeptiden, welche ein Molekulargewicht von ca. 18 bis ca. 34 Kilodalton aufweisen, wie durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde. Die immunreaktiven Peptide mit Molekulargewichten von 24-34 kDa wiesen einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 4,9 auf, während die immunreaktiven Peptide in dem 18 kDa-Bereich pIs von 5,1-5,4 aufwiesen, wie durch isoelektrische Fokussierung bestimmt wurde. Die immunreaktiven Peptide scheinen aus einer einzigen Kette zu bestehen, da eine Reduktion der Disulfidbindungen die scheinbaren Molekulargewichte nicht veränderte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reagiert das Antigen mit monoklonalen Antikörpern, welche von der Zellinie, die mit ATCC HB 10039 bezeichnet ist, oder Mutanten oder Varianten davon produziert wurden.
Das Antigen der Erfindung wird in im wesentlichen gereinigter Form durch bekannte Proteinextraktionstechniken erhalten, welche gemäß hierin beschriebener Funde und Lehren modifiziert wurden. Reifes Humansperma wird gesammelt und homogenisiert. Die löslichen Proteine, einschließlich des Antigens, werden aus dem Homogenat durch bekannte Proteinextraktionstechniken extrahiert. Der Extrakt wird dann mit einem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, welcher mit dem Antigen reagieren kann. Der Antikörper und das Antigen reagieren unter Bildung eines Komplexes. Im allgemeinen wird der monoklonale Antikörper immobilisiert, beispielsweise durch Konjugation an ein festes Substrat, so daß das Antigen aus dem Extrakt entfernt werden kann. Vorzugsweise wird das feste Substrat, welches den Antikörper- Antigen-Komplex enthält, dann gewaschen, um andere Proteine und Verunreinigungen zu entfernen. Das Antigen wird dann von dem monoklonalen Antikörper durch bekannte Techniken abgetrennt und in im wesentlichen gereinigter Form gewonnen. In einer alternativen Ausführungsform kann ein polyklonaler Antikörper, welcher mit dem Antigen reagieren kann, verwendet werden, um das Antigen zu reinigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Antigen gemäß der Technik gereinigt, welche in Isojima et al., Clin. Exp. Immunol. 49: 449-456 (1982) und Isojima et al., Immunological Approaches to Conception and Promotion of Fertility (Talwar Herausg.), 323-333 (Plenum Publishing 1986), auf welche beide hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, offenbart ist. Der homogenisierte Spermaextrakt wird über eine Immunaffinitätschromatographiesäule laufen gelassen, die den monoklonalen Antikörper immobilisiert auf einem festen Träger wie z. B. Sepharose 4B enthält. Das Antigen wird dann von der Säule eluiert, indem der pH erniedrigt wird.
In einer alternativen Ausführungsform kann der Extrakt über eine Umkehrphasenhochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Säule laufen gelassen werden. Die Fraktionen, welche von der Säule eluieren, werden gewonnen. Die Proteinbestandteile der verschiedenen Fraktionen werden durch zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt. Der Bestandteil, welcher das Antigen enthält, wird identifiziert, indem die Blots auf dem Gel mit dem monoklonalen Antikörper umgesetzt werden und durch immunochemische Techniken bestimmt wird, welcher Bestandteil das Antigen enthält. Das Antigen kann dann in im wesentlichen gereinigter Form durch bekannte Techniken gewonnen werden. Das Verfahren wurde durch Mikrosequenzieren der Aminotermini der gereinigten Peptide verifiziert und es wurde gezeigt, daß die Aminosäuresequenzen mit den Aminosäuresequenzen überlappen, die aus der Genklonierung abgeleitet wurden, womit die Nützlichkeit des Verfahrens bestätigt wurde.
Das im wesentlichen gereinigte Antigen der Erfindung kann durch verschiedene Proteinreinigungstechniken weiter gereinigt werden. Die Proteinreinigungstechniken umfassen jene, die in dem US-Patent Nr. 4,446,122, welches am 1. Mai 1984 für Chu et al. erteilt wurde, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, identifiziert und beschrieben sind. Vorzugsweise wird das Antigen durch präparative Elektrophorese oder Affinitätsreinigung gereinigt.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Antigen der Erfindung durch allgemeine Techniken, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind, welche gemäß der hierin beschriebenen Funde und Lehren modifiziert und angewendet wurden, aus Humansperma isoliert und gereinigt werden. Solche Techniken umfassen Elektrophorese, Zentrifugation, Gelfiltration, Präzipitation, Dialyse, Chromatographie (einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunadsorptionsaffinitätschromatographie, Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie und Gelpermeationshochleistungsflüssigchromatographie), isoelektrische Fokussierung und Variationen und Kombinationen von diesen.
Eine oder mehrere dieser Techniken werden in einem Verfahren, das entworfen wurde, um Moleküle gemäß ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften zu trennen, aufeinanderfolgend eingesetzt. Diese Eigenschaften umfassen die Hydrophobizität, Ladung, Bindungsfähigkeit und das Moleku largewicht des Antigens. Die verschiedenen Fraktionen an Materialien, die nach jeder Technik erhalten werden, werden auf ihre Fähigkeit hin getestet, mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 zu reagieren, welcher von ATCC HB 10039 produziert wurde. Die Fraktionen, welche eine solche Aktivität zeigen, werden dann der nächsten Technik in dem schrittweisen Verfahren unterworfen, und die neuen Fraktionen werden wieder getestet. Dieser Prozeß wird wiederholt, bis nur eine Fraktion, welche mit dem MHS-10 reagiert, übrigbleibt und diese Fraktion nur eine einzige Bande erzeugt, wenn sie einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen wird.
Das Antigen der Erfindung kann durch bekannte Proteinmodifizierungstechniken modifiziert werden. Diese umfassen die Techniken, welche in dem US-Patent Nr. 4,302,386 offenbart sind, das am 24. November 1981 für Stevens erteilt wurde, auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Solche Modifikationen können die linmunogenität oder die befruchtungsverhütende Aktivität des Antigens erhöhen oder sie können keine Wirkung auf eine solche Aktivität aufweisen. Beispielsweise können einige wenige Aminosäurereste ausgetauscht oder entfernt werden. Alternativ kann das Antigen der Erfindung eine oder mehrere Aminosäuresequenzen enthalten, die für seine Immunogenität oder befruchtungsverhütende Aktivität nicht notwendig sind. Es kann beispielsweise der Fall sein, daß nur die Aminosäuresequenzen eines bestimmten Epitops des Antigens für die immunogene Aktivität notwendig sind. Unerwünschte Sequenzen können durch Techniken entfernt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Beispielsweise können unerwünschte Aminosäuresequenzen über einen begrenzten proteolytischen Verdau unter Verwendung von Enzymen wie z. B. Trypsin oder Papain oder verwandte proteolytische Enzyme entfernt werden. Alternativ können Polypeptide, welche den verschiedenen immunogenen Epitopen von SP-10 entsprechen, durch Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, chemisch synthetisiert werden. Diese umfassen die Verfahren, die in dem US-Patent Nr. 4,290,944 offenbart sind, das am 22. September 1981 für Goldberg erteilt wurde, auf welches hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Somit umfaßt das Antigen der Erfindung eine Klasse von modizierten Polypeptiden, einschließlich synthetisch abgeleiteter Polypeptide oder Fragmente des Antigens, welche gemeinsame Ursprungs-, Struktur- und Wirkungsmechanismuselemente wie z. B. eine befruchtungsverhütende Wirkung aufweisen, die sich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung befinden, da sie von den Fachleuten hergestellt werden können, wenn diesen die Lehren der vorliegenden Erfindung bekannt sind. Dieses umfaßt jegliches Polypeptid, das von der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus Fig. 11A abgeleitet ist, einschließlich von Fragmenten und Varianten der Sequenz, das immunogen ist und eine befruchtungsverhütende Wirkung aufweist. Beispielsweise haben wir gezeigt, daß ein Peptidfragment von SP-10, wie es in Fig. 11A gezeigt ist und welches 71 Aminosäuren (die Aminosäuren 143-213 in Fig. 11A) enthält, mit dem monoklonalen NHS-10- Antikörper reagiert. SP-10 kann andere Epitope enthalten, die mit MHS-10 reagieren, welche von den Fachleuten bestimmt werden können. Demgemäß befinden sich solche Polypeptide oder Peptidfragmente innerhalb des Umfangs der Erfindung. Da Fachleute Modifikationen solcher Epitope oder Derivate von diesen herstellen können, befinden sich darüber hinaus solche Modifikationen oder Derivate innerhalb des Umfangs der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie immunogen sind und bei Menschen oder anderen Primaten oder anderen Säugetieren eine befruchtungsverhütende oder empfängnisverhütende Wirkung aufweisen.
Der monoklonale Antikörper, welcher verwendet wurde, um das intra-akrosomale Antigen zu identifizieren, zu charakterisieren und zu reinigen, befindet sich innerhalb des Umfangs der Erfindung. Er reagiert mit einem im wesentlichen gereinigten intra-akrosomalen Humanspermaantigen, das mit dem Sperma nach der Akrosomenreaktion assoziiert bleibt. Vorzugsweise reagiert der Antikörper mit einem Humanspermaantigen, das vor der Akrosomenreaktion in der akrosomalen Matrix des reifen Humanspermas lokalisiert ist und nach der akrosomalen Reaktion in Assoziierung mit der inneren akrosomalen Membran oder dem äquatorialen Segment gefunden wird.
Dem monoklonalen Antikörper der Erfindung fehlt eine Kreuzreaktivität mit im wesentlichen allen humanen somatischen Geweben. Zusätzlich hemmt der Antikörper die Sperma- Ei-Wechselwirkungen bei dem Hamstereieindringtest. Diese Eigenschaften zeigen relativ schlüssig, daß man erwarten kann, daß das Antigen der Erfindung oder die aktiven Teile von diesem, nachdem sie einem weiblichen Menschen injiziert wurden, eine befruchtungsverhütende Aktivität aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung die Eigenschaften des monoklonalen Mäuseantikörpers, welcher von der Hybridomzellinie ATCC HB 10039 oder Mutanten oder Varianten von dieser produziert wurde. ATCC HB 10039 ist eine biologisch reine Kultur, welche bei der permanenten Sammlung der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA, 20852 erhältlich ist und dort am 28. Februar 1989 hinterlegt wurde. Die Immunglobuline, welche von diesem Hybridom erzeugt werden, gehören dem IgG1-Isotyp an, wie durch ein Enzymimmunoassay gezeigt wurde, wobei isotypspezifische Reagenzien eingesetzt wurden.
Der monoklonale Antikörper der Erfindung wird durch eine Modifikation der bekannten Techniken für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern und Hybridomen hergestellt. Die Modifikation spiegelt den Fund durch die Erfinder wider, daß das befruchtungsverhütende Antigen der Erfindung vor der Akrosomenreaktion in der akrosomalen Matrix vorliegt, aber dann nach einer solchen Reaktion in Assoziierung mit der inneren und äußeren akrosomalen Membran gefunden wird. Diese Kenntnis erlaubt die Modifikation der konventionellen Technik, um reproduzierbar monoklonale Antikörper gegen die befruchtungsverhütenden Antigene zur Verfügung zu stellen, welche nach der Akrosomenreaktion in Verbindung mit der inneren und äußeren akrosomalen Membran gefunden werden.
Demgemäß wird das Wirtstier entweder mit Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder dem Überstand, welcher aus einer Zentrifugation von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wird, immunisiert. Im ersten Fall befindet sich dann das Spermaantigen auf der Oberfläche des Spermas, da es mit der inneren akrosomalen Membran assoziiert bleibt. Im zweiten Fall wird der Überstand hohe Konzentrationen des Antigens enthalten, da er die Überreste der äußeren akrosomalen Membran enthält, welche ebenfalls das Antigen enthält. Der Überstand kann ebenfalls einen Teil des Antigens frei in Lösung enthalten, da es einen Hinweis gibt, daß das Antigen ebenfalls frei in Lösung in der akrosomalen Matrix vorliegen kann, bevor die Akrosomenreaktion stattgefunden hat. In beiden Fällen enthält das Material, welches dem Wirt injiziert wird, eine angereicherte Konzentration des interessierenden Immunogens. Somit würde man erwarten, daß ein größerer Teil der antikörperproduzierenden Zellen die monoklonalen Antikörper der Erfindung produziert.
Jeder Wirt, welcher Antikörper produziert, kann verwendet werden. Üblicherweise verwendete Tiere umfassen Kaninchen oder Nagetiere, wie z. B. Ratten oder Mäuse. Mäuse sind für die vorliegende Erfindung bevorzugt.
Wenn das Tier immunisiert wurde und genügend Zeit verstrichen ist, damit es anfangen konnte, Antikörper zu produzieren, werden die antikörperproduzierenden Zellen gewon nen. Obwohl alle antikörperproduzierenden Zellen verwendet werden können, sind B-Lymphozyten, welche aus der Milz des Tieres erhalten werden, bevorzugt.
Die antikörperproduzierenden Zellen werden mit Tumorzellen fusioniert, um Hybridome zu erzeugen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Begriff "Tumorzelle" jegliche Zelle, die in der Lage ist, mit einer antikörperproduzierenden Zelle zu fusionieren, um eine "unsterbliche" Hybridzelle zu erzeugen; d. h. eine solche, welche in der Lage ist, kontinuierlich in vitro kultiviert zu werden. Bevorzugte Tumorzellen sind antikörperproduzierende Zellen, welche transformiert wurden und welche ihre Fähigkeit verloren haben, ein Immunglobulin zu erzeugen. Solche Zellen umfassen Rattenmyelomzellen und Mäuseplasmazytomzellen. Besonders bevorzugt sind Mäuseplasmazytomzellen, denen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) fehlt, was die Selektion von Hybridomen aus unfusionierten antikörperproduzierenden Zellen oder Plasmazytomzellen erlaubt, wenn diese auf einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält, kultiviert werden.
Es sollte beachtet werden, daß die antikörperproduzierende Zelle und die Tumorzelle aus unterschiedlichen Tierspezies stammen können. Als Beispiel siehe Nowinski et al., Science 210: 534 (1980), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die Hybridome werden dann gescreent, wobei Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder der Überstand, welcher aus einer Zentrifugation von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wurde, in bekannten Immunoassays verwendet werden, um eines oder mehre Hybridome zu identifizieren, die den gewünschen monoklonalen Antikörper produzieren. Wenn die den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridome ausgewählt wurden, können die Antikörper aus solchen Hybridomen durch bekannte Techniken gewonnen werden. Im allgemeinen ist es nützlich, eines oder mehrere der den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridome zu klonieren, um diese zu einer kontinuierlichen Zellinie zu erweitern, welche verwendet werden kann, um die monoklonalen Antikörper der Erfindung in großen Mengen zu produzieren.
Das vorher erwähnte Verfahren der Herstellung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung ist ein in vitro-Verfahren. Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls einen in vivo-Prozeß zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das Spermaantigen. Solche Antikörper werden hergestellt, indem ein Hybridom der Erfindung intraperitoneal in einen histokompatiblen oder immunsupprimierten tierischen Wirt, vorzugsweise ein kleines Säugetier und am meisten bevorzugt eine Maus, eingebracht wird. Dieses bewirkt, daß der Wirt Aszitestumore produziert, welche dann wieder eine Flüssigkeit produzieren, die monoklonale Antikörper enthält, welche von dem Hybridom produziert werden. Nachdem genügend Zeit verstrichen ist, damit die Antikörper in ausreichenden Mengen produziert wurden, werden sie durch bekannte Techniken gewonnen. Dieses ist besonders nützlich, um den monoklonalen Antikörper in kommerziell nützlichen Mengen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Hybridome und kontinuierliche Zellinien, welche die monoklonalen Antikörper der Erfindung produzieren. Vorzugsweise produzieren die Hybridome und Zellinien monoklonale Antikörper gegen ein intra-akrosomales Antigen, welches nach der Akrosomenreaktion mit der inneren und äußeren akrosomalen Membran assoziiert bleibt. Am meisten bevorzugt haben die kontinuierlichen Zellinien die Eigenschaften der Hybridomzellinie mit der ATCC-Zugangsnr. HB 10039 oder Mutanten oder Varianten von dieser. Die Erfindung umfaßt ebenfalls einzelne Zellen innerhalb dieser Zellinien.
Ein Fachmann kann bekannte Techniken verwenden, um Mutanten oder Varianten von ATCC HB 10039 zu produzieren. Solche Mutanten oder Varianten sind von, der vorliegenden Erfindung umfaßt, solange wie sie monoklonale Antikörper produzieren, die mit dem intra-akrosomalen Antigen der Erfindung reagieren können. Zusätzlich wird ein Fachmann unter Verwendung von bekannten Techniken und der hierin offenbarten Lehre in der Lage sein, monoklonale Antikörper zu produzieren, die mit dem Antigen der Erfindung reagieren können, aber etwas andere Eigenschaften als ATCC HB 10039 oder die Antikörper, welche von einer solchen Zellinie produziert werden, aufweisen. Trotzdem sind solche monoklonalen Antikörper und die Hybridome oder Zellinien, welche sie produzieren, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verhindern die monoklonalen Antikörper, welche von ATCC HB 10039 produziert werden, daß solche monoklonalen Antikörper mit dem Antigen der Erfindung reagieren.
Das Antigen der Erfindung, vorzugsweise SP-10, kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper mit Epitopen reaktiv zu machen, die von dem Epitop verschieden sind, mit welchem MHS-10 reagiert. Das gereinigte oder im wesentlichen gereinigte Antigen kann als das Immunogen verwendet werden, um in den Wirt injiziert zu werden, wie vorher in dem Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper der Erfindung beschrieben wurde.
Da eine Vielzahl von verschiedenen Systemen und Verfahren verwendet werden kann, um einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der mit dem Humanspermaantigen der Erfindung reagieren kann, kann eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern aus diesen Maßnahmen resultieren, die sich von dem Antikörper unterscheiden, der in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird. Jedoch fallen solche monoklonalen Antikörper, deren Produktion durch die hierin gegebenen Lehren ermöglicht wird, immer noch klar in den Umfang die ser Erfindung. Das hervorstechende Merkmal solcher Antikörper für die Zwecke dieser Erfindung ist neben ihrer Monoklonalität ihre Reaktivität in irgendeiner Weise mit dem Humanspermaantigen der Erfindung, unabhängig von der Ursprungsspezies, dem Isotyp, der molekularen Spezifität, Affinität, dem Verfahren der Herstellung oder dem bestimmten Hybridomtyp, welcher bei ihrer Produktion eingesetzt wurde.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch die Verwendung von bekannten Techniken unter Berücksichtigung der hierin enthaltenen Lehren gereinigt werden. Beispielsweise wird Aszitesfluid, welches den monoklonalen Antikörper enthält, mit einem fraktionierenderi Material wie z. B. Ammoniumsulfat gemischt, um die Immunglobuline, einschließlich des monoklonalen Antikörpers der Erfindung, auszufällen. Der Niederschlag wird abgetrennt und in einer Lösung resuspendiert. Die Lösung wird durch eine Membran dialysiert, um das fraktionierende Material zu entfernen, was ein Dialysat erzeugt, das den monoklonalen Antikörper enthält. Das Dialysat wird dann durch eine Affinitätssäule wie z. B. eine Säule mit Protein A-Sepharosekügelchen laufen gelassen. Die Säule wird gewaschen und der Antikörper wird eluiert, indem der pH durch die Verwendung eines geeigneten Puffers erniedrigt wird.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls polyklonale Antikörper gegen das humane intra-akrosomale Spermaantigen. Solche Antikörper werden durch bekannte Techniken produziert, die unter Berücksichtigung der hierin enthaltenen Lehren geeignet modifiziert werden. Eine geeignete Menge des Antigens wird einem tierischen Wirt verabreicht, um eine immunogene Reaktion auszulösen. Jeder Wirt, der Antikörper produziert, kann verwendet werden. Üblicherweise verwendete Tiere umfassen Kaninchen und Nagetiere wie z. B. Ratten oder Mäuse.
Wenn das Tier immunisiert wurde und genügend Zeit verstrichen ist, damit es anfangen konnte, Antikörper zu produzieren, können polyklonale Antikörper, durch Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden. Das allgemeine Verfahren umfaßt ein Entnehmen von Blut aus dem Tier und ein Abtrennen des Serums aus dem Blut. Das Serum, welches Antikörper gegen das Antigen enthält, kann als ein Antiserum verwendet werden. Alternativ können die Antikörper aus dem Serum gewonnen werden. Eine Affinitätsreinigung ist eine bevorzugte Technik, um gereinigte oder im wesentlichen gereinigte polyklonale Antikörper gegen das Humanspermaantigen der Erfindung zu gewinnen.
Das bevorzugte Verfahren zur Produktion des Antigens der Erfindung besteht in einem Kultivieren einer prokaryotischen Zelle wie z. B. einem Bakterium, Pilzen oder anderen Mikroorganismen, oder einer eukaryotischen Zelle wie z. B. einer Hefe- oder einer Säugetierzelle oder -zellinie, die mit einem Expressionsvektor oder -virus transformiert ist, welche DNA enthalten, die für das Antigen oder irgendeinen gewünschten Teil von diesem codiert. Vorzugsweise ist die transformierte Zelle E. coli oder eine Zelle von einer Ovarienzellinie des Chinesischen Hamsters. Der Expressionsvektor enthält eine DNA-Sequenz, die für das Antigen oder irgendeinen gewünschten Teil von diesem codiert, welche operativ mit den geeigneten regulatorischen Steuernukleinsäuresequenzen verknüpft wurde, so daß die DNA-Sequenz in der transformierten Zelle der Wahl exprimiert werden kann.
Die DNA der Erfindung ist eine isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz (d. h. ein Polydeoxyribonukleotid), welche eine Polypeptid codiert, das das Antigen der Erfindung umfaßt. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "isoliert" und Variationen davon, daß die DNA von einer DNA isoliert ist, die Proteine codiert, welche normalerweise dieses Antigen begleiten. Somit umfaßt die DNA der Erfindung DNA, die das Antigen codiert, wenn diese DNA in einen Bakterienvektor wie z. B. ein Plasmid oder in einen viralen Vektor, der in einem Bakteriophagen untergebracht sein kann, kloniert wurde, vorausgesetzt, daß solche Klone von Klonen isoliert sind, die eine DNA enthalten, welche für andere Proteine codiert, die normalerweise das Antigen begleiten. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen rein" und Varianten davon, daß die DNA im wesentlichen frei von DNA und RNA ist, die nicht das Antigen der Erfindung codiert. Das heißt, es gibt nicht mehr als ca. 5 Prozent einer anderen DNA und RNA und vorzugsweise nicht mehr als ca. 1 Prozent einer anderen DNA und RNA in irgendeiner Probe, welche die DNA enthält, die das Antigen der Erfindung codiert. Vorzugsweise ist die DNA der Erfindung eine komplementäre DNA (cDNA).
Die cDNA der Erfindung wird aus einer Testes-cDNA- Expressionsbibliothek isoliert, wobei bekannte Techniken und die hierin enthaltene Offenbarung verwendet werden. Siehe Chang et al., Science 240: 324-326 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Ein Beispiel einer solchen Bibliothek ist die testesspezifische Lambdagt11-cDNA-Bibliothek, welche bei der Clonetech, Inc. erhältlich ist. Eine solche Bibliothek kann mit dem monoklonalen Antikörper der Erfindung gescreent werden, wobei bekannte immunchemische Techniken verwendet werden. Dieses erlaubt die Identifizierung und anschließende Isolierung, Reinigung und Sequenzierung der cDNA. Die SP-10-5A-cDNA wurde sequenziert, indem ein Sequenase-Sequenzierkit (U. S. Biochemical Corp.) verwendet wurde, wobei das Sanger-Dideoxy-Abbruchverfahren benutzt wurde (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467 (1977), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird).
Die genomische DNA der Erfindung wird durch die Anwendung von bekannten Techniken unter Berücksichtigung der hierin enthaltenen Lehren erhalten. Blots, welche humane genomische DNA enthielten, die mit verschiedenen Restrikti onsenzymen verdaut wurde, wurden getrennt mit Fragmenten sondiert, welche das 5'- und das 3'-Ende der SP-10-5-cDNA enthielten. Die 5'-SP-10-5-Sonde hybridisierte mit einer einzelnen Bande mit 5 kB, während die 3'-Sonde mit einer 1,5 kb-Bande hybridisierte. Dieses einfache Bandenmuster legt nahe, daß SP-10 durch ein Gen mit einer einzigen Kopie oder mehr als einer Kopie, welche als Wiederholungen in Tandemanordnung angeordnet sind, codiert wird.
Eine genomische Humanleukozyten-DNA-Bibliothek (Clontech) wurde mit einem 634 bp-Fragment von SP-10-5 gescreent. Fünf von 5 · 10&sup5; Plaques zeigten eine starke Hybridisierung mit SP-10-5. Diese Plaques wurden gereinigt und es wurde gezeigt, daß sie ebenfalls mit dem 3'-Ende von SP-10-5 hybridisierten, was nahelegt, daß diese Klone den gesamten Codierungsbereich von SP-10 enthalten. Chromosomale Lokalisierungsstudien zeigen, daß das Gen für SP-10 auf dem Chromosom 11, möglicherweise in dem Bereich der 11q2-Bande angeordnet ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die cDNA ungefähr 1,35 kb und umfaßt die Nukleotidsequenz, welche in Fig. 11A gezeigt ist. Fig. 11A zeigt ebenfalls die vorhergesagte Aminosäuresequenz des besonders bevorzugten Antigens der Erfindung, SP-10. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die cDNA ein 214 Basenpaar-Fragment des Gens, welches für das Antigen codiert. Von diesem Fragment wird angenommen, daß es das Epitop enthält, das von dem monoklonalen Antikörper MHS-10 erkannt wird, welcher von ATCC HB 10039 produziert wird. Das Peptid, welches das MHS-10-Epitop enthält, besteht aus 71 Aminosäuren, welche sich von der Aminosäure 143 bis zu der Aminosäure 213 erstrecken. Dieses Peptid überspannt eine Domäne des Proteins, welche mehrere Wiederholungsmotive enthält, die einen hydrophilen Charakter aufweisen.
Von den Fachleuten wird erkannt werden, daß die cDNA- Sequenz des bevorzugten Antigens durch bekannte Techniken unter Berücksichtigung der hierin offenbarten Lehren modifiziert werden kann. Beispielsweise können andere Codons substituiert werden, die für dieselbe Aminosäure wie das ursprüngliche Codon codieren. Alternativ können die Ersatzcodons für eine andere Aminosäure codieren, welche die befruchtungsverhütende Aktivität oder Immunogenität des Antigens nicht beeinträchtigen wird oder welche die befruchtungsverhütende Aktivität oder Immunogenität des Antigens verbessern kann. Beispielsweise können eine gezielte Mutagenese oder andere Techniken eingesetzt werden, um eine einzelne oder mehrere Mutationen wie z. B. Austauschungen, Insertionen, Deletionen und Transpositionen zu erzeugen, wie in Botstein und Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis," Science 229: 193-1210 (1985), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben wird. Da eine solche modifizierte DNA durch die Anwendung von bekannten Techniken auf die hierin enthaltenen Lehren erhalten werden kann, liegt eine solche DNA innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung.
Darüber hinaus wird von den Fachleuten erkannt werden, daß eine cDNA-Sequenz, welche aus einer cDNA-Expressionsbibliothek erhalten wurde oder aus einer isolierten Boten- RNA hergestellt wurde, die für das Antigen der Erfindung codiert, die natürlichen Allelvariationen zeigen kann, die bei Individuen angetroffen werden. Da solche variierten cDNA-Sequenzen durch die hierin enthaltenen Lehren erhalten werden, befinden sie sich innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Schließlich wird von den Fachleuten erkannt werden, daß die cDNA-Sequenz (oder Fragmente von dieser) der Erfindung verwendet werden kann, um andere cDNA-Sequenzen zu erhalten, welche mit dieser unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren, wobei allgemeine Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, oder verwendet werden kann, um irgendeine DNA zu erhalten, die mit der cDNA unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert. Eine solche DNA umfaßt jegliche genomische DNA. Demgemäß umfaßt die DNA der Erfindung DNA, die wenigstens 75 Prozent, vorzugsweise 90 Prozent und am meisten bevorzugt 95 Prozent Homologie mit der genomischen DNA zeigt, die für das Antigen SP-10 codiert, oder der cDNA aus Fig. 11, vorausgesetzt, daß eine solche homologe DNA das Antigen der Erfindung codiert.
Die DNA der Erfindung kann gemäß bekannten Techniken, welche unter Berücksichtigung der hierin enthaltenen Lehren geeignet modifiziert wurden, verwendet werden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, welcher dann verwendet wird, um einen Mikroorganismus für die Expression und Produktion des Antigens der Erfindung zu transformieren. Solche Techniken umfassen jene, die in den US-Patenten Nr. 4,440,859, welches am 3. April 1984 für Rutter et al. erteilt wurde, 4,530,901, welches am 23. Juli 1985 für Weissman erteilt wurde, 4,582,800, welches am 15. April 1986 für Crowl erteilt wurde, 4,677,063, welches am 30. Juni 1987 für Mark et al. erteilt wurde, 4,678,751, welches am 7. Juli 1987 für Goeddel erteilt wurde, 4,704,362, welches am 3. November 1987 für Itakura et al. erteilt wurde, 4,710,463, welches am 1. Dezember 1987 für Murray erteilt wurde, 4,757,006, welches am 12. Juli 1988 für Toole, Jr. et al. erteilt wurde, 4,766,075, welches am 23. August 1988 für Goeddel et al. erteilt wurde, und 4,810,648, welches am 7. März 1989 für Stalker erteilt wurde, offenbart sind, auf welche allesamt hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die DNA der Erfindung kann mit einer breiten Vielzahl von anderen DNA-Sequenzen zur Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die begleitende DNA würde von der Natur des Wirtes, der Weise der Einführung der DNA in den Wirt und davon, ob ein Beibehalten im Episom oder eine Integration gewünscht ist, abhängen.
Im allgemeinen wird die DNA (vorzugsweise die cDNA) in einen Expressionsvektor, wie z. B. ein Plasmid, in einer richtigen Orientierung und in einem korrekten Leseraster zur Expression eingefügt. Wenn nötig, kann die DNA mit den geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Steuernukleotidsequenzen verknüpft werden, die von dem gewünschten Wirt erkannt werden, obwohl solche Steuerungen im allgemeinen in dem Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann durch Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte mit dem Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, auf transformierte Wirtszellen zu selektionieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet das Einbauen einer DNA-Sequenz mit allen nötigen Steuerelementen in den Expressionsvektor, welche für ein selektionierbares Merkmal in der transformierten Zelle, wie z. B. eine Antibiotikaresistenz, codiert. Alternativ kann das Gen für ein solches selektionierbares Merkmal auf einem anderen Vektor liegen, welcher verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle einer Cotransformation zu unterziehen. Der bevorzugte Expressionsvektor zur Verwendung in der Erfindung ist pWR590 und pGEX.
Es wird erwartet, daß das Antigen der Erfindung oder ein immunogenes Fragment von diesem eine Nützlichkeit als ein Immunogen in einem Befruchtungsverhütungsimpfstoff für Menschen und andere Primaten und andere Säugetiere aufweist. Ein solcher Impfstoff kann durch Techniken hergestellt werden, welche den Fachleuten bekannt sind, und würde beispielsweise das Antigen, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein geeignetes Hilfsmittel und andere Materialien enthalten, welche traditionell in Impfstoffen angetroffen werden. Eine immunologisch wirksame Menge des Antigens oder des Fragments von diesem wird durch Mittel bestimmt, welche im Stand der Technik bekannt sind.
Die Kosteneffizienz der Expression und des Scale-ups von eukaryotischen Proteinen in E. coli hat dieses zum Modell der Wahl für die anfängliche Expression des rekombinanten SP-10-Impfstoffes gemacht. Viele Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die in E. coli exprimiert werden, können rasch abgebaut werden, wenn diese Proteine nicht mit einem großen E. coli-Protein fusioniert sind. (Wir haben das pWR590-Expressionssystem verwendet (Guo et al., Gene 29 (1984), 251-254, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird), welches den E. coli-lac-Promotor und einen Teil der codierenden Sequenz für beta-Galactosidase umfaßt, welcher für ungefähr 590 Aminosäuren codieren kann. Die Injektion des SP-10-Proteins, das an dieser abgeschwächten beta- Galactosidase befestigt war, hat sich in Kaninchen als sehr stark immunogen erwiesen.) In der bevorzugten Ausführungsform werden Gene, welche Teile des gesamten offenen Leserasters für das SP-10-Protein codieren, in ein bakterielles Plasmid eingeführt, welches einen starken Promotor und ein bakterielles Gen oder einen Teil von diesem enthält. Die Expression des SP-10-Proteins tritt in Verbindung mit dem Bakterienprotein auf, und die zwei Proteine sind durch Aminosäureverknüpfungen miteinander verbunden. Nach einer Lyse der Bakterien und einer Reinigung des resultierenden Fusionsproteins unter Verwendung von präparativer SDS-PAGE oder anderen Verfahren kann ein solches "Fusionsprotein" den Vorteil bieten, daß das Bakterienprotein als ein Hilfsmittel fungieren kann, um die Immunreaktion des Wirtes auf das rekombinante eukaryotische Antigen zu verstärken.
Das Antigen der Erfindung kann ebenfalls in quantitativen Tests mit dem monoklonalen Antikörper der Erfindung zum Nachweis von Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, verwendet werden. Das gereinigte Antigen kann als ein Standard oder eine Kontrolle verwendet werden. Eine direkte oder indirekte Immunfluoreszenz kann verwendet werden, um das Ausmaß, in welchem das Humansperma in einer Probe die Akrosomenreaktion durchlaufen hat, zu korrelieren. Diese Daten können verwendet werden, um eine Standardkurve zu entwickeln, wodurch das Ausmaß, in welchem das Humansperma in einer Probe die Akrosomenreaktion durchlaufen hat, durch einen Kompetitions- oder einen direkten Immunoassay von SP- 10 oder einem anderen intra-akrosomalen Antigen, das aus dem Kulturüberstand von Sperma, welches die Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wurde und durch einen Radioimmuntest oder einen enzymverknüpften Immuntest getestet wurde, bestimmt werden kann.
Das Antigen der Erfindung kann verwendet werden, um anti-Sperma-Antikörper nachzuweisen und zu messen. Den Nachweis von anti-Sperma-Antikörpern bezeugt über die Jahre hinweg eine Gruppe von Testverfahren, einschließlich Tests, die auf der Agglutination von Spermazellen (Kibrick-Test), der Zytotoxizität und Immobilisierung von Spermazellen (Isojima), dem Binden an die Spermaoberfläche oder zytoplasmatische Antigene (Herr et al., 1987, Am. J. Reprod. Immunol. 11: 75-81) basieren, wobei ELISA-oder RIA- Formate oder die Bindung von klassenspezifischen Immunkügelchen (Bronson) verwendet werden. Diese Tests unterscheiden sich durch die Tatsache, daß sie auf ganze Zellen gerichtet sind. Bis heute gab es keinen weithin verwendeten Test auf anti-Sperma-Antikörper, welcher einzelne molekulare Zielantigene oder Gruppen dieser Zielantigene einsetzte. Das Aufkommen der rekombinanten Methoden eröffnet die Möglichkeit, daß definierte Spermaantigene nun als Ziele zur Messung von anti-Sperma-Antikörpern eingesetzt werden können. SP-10 ist ein Beispiel eines Antigens, das in dieser Hinsicht funktionieren kann.
Das Antigen der Erfindung, einschließlich der Polypeptide, welche von der cDNA aus Fig. 11 codiert werden, der Fragmente, Modifikationen und Derivate davon, ist ebenfalls nützlich, um die Fruchtbarkeit und die Empfängnisverhütung bei Säugetieren, insbesondere Primaten, zu untersuchen, um die menschliche Fruchtbarkeit und Unfruchtbarkeit besser zu verstehen.
Die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Sperma, insbesondere Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, in verschiedenen Typen von Proben wie z. B. menschlichem Samen zu identifizieren. Die Antikörper können als ein Reagenz in bekannten Immunoassays verwendet werden, um das Vorliegen oder die Konzentration von Humansperma, Spermaköpfen oder Sperma nach der Akrosomenreaktion zu bestimmen. Solche Immunoassays umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Radioimmunassay, Kompetitionsimmunpräzipitationsassay, enzymverknüpften Immunassay und einen direkten oder indirekten Immunfluoreszenzassay. Eine Anwendung dieses Ansatzes ist die Identifizierung von Sperma in Vergewaltigungsbeweisstücken.
Eine Zusammensetzung zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration von Humansperma oder einer anderweitigen Auswertung von Sperma gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine Konzentration des Antikörpers, welche wirksam ist, um das Vorliegen eines solchen Materials nachzuweisen oder seine Menge zu quantifizieren. Der Antikörper kann mit irgendeinem geeigneten Träger gemischt werden oder an diesem befestigt werden, wie z. B. einem Latexpartikel, einem Kunststoffkügelchen oder einer Kunststoffmikrotiterplatte. Er kann ebenfalls mit einem Enzym oder einem Farbstoff konjugiert werden oder radiomarkiert werden, abhängig davon, welches immunologische Verfahren eingesetzt wird.
Die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper dieser Erfindung sind ebenfalls für die Isolierung oder Reinigung von Humansperma aus komplexen Mischungen oder Lösungen auf der Grundlage einer selektiven immunologischen Reaktion nützlich. Die Mischung wird mit immobilisierten Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht, welche das Sperma aus der Mischung abtrennen, indem sie immobilisierte Komplexe des Spermas gebunden an den Antikörper bilden. Wenn die Mischung entfernt ist, wird das Sperma von den Antikörpern getrennt und durch bekannte Techniken in gereinigter Form gewonnen. Vorzugsweise wird das Sperma durchlässig gemacht, bevor es mit den Antikörpern in Kontakt gebracht wird.
Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung, welche nützlich ist, um Sperma aus einer komplexen Mischung zu reinigen oder zu entfernen, enthält eine wirksame Menge des monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers dieser Erfindung, welcher auf einer annehmbaren Matrix immobilisiert ist oder sich in Mischung mit einem annehmbaren Träger befindet, um eine Reaktion und Bindung mit dem Sperma zu erlauben.
Die Antikörper dieser Erfindung sind ebenfalls nützliche Reagenzien im Hinblick auf eine Forschung über die Struktur, Funktion und Immunchemie von Humansperma, insbesondere Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat. Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, welche als ein Untersuchungsreagenz nützlich ist, enthält eine Menge des Antikörpers, welche wirksam ist, um die Information bei der Mischung mit der Probe und einer nachfolgenden Analyse zu ergeben. Die Bestimmung der Menge des Antikörpers, welche nötig ist, um ein bestimmtes Forschungsziel zu erreichen, hängt von den spezifischen Typen an Untersuchungen ab, welche beteiligt sind, und sie liegt leicht innerhalb der Fähigkeiten eines Forschers, der mit einer solchen Forschung befaßt ist.
Der monoklonale oder polyklonale Antikörper der Erfindung wird vorzugsweise in den folgenden diagnostischen Verfahren verwendet: (1) als eine Sonde für unreife Keimzellen im Samen, um die Unfruchtbarkeit nachzuweisen, die durch Defekte bei der menschlichen Spermatogenese verursacht wird; (2) als ein Marker für die Akrosomenreaktion in Humansperma; (3) als der aktive Ligand in einem Spermazellenaffinitätskügelchen zur Isolierung von Spermazellen für (a) die Reinigung von Spermazellen-DNA für eine nachfolgen de RFLP-Analyse mit einer Anwendung in der forensischen Wissenschaft und bei den Vaterschaftstests und (b) eine Isolierung von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, für eine nachfolgende Befruchtung von menschlichen Eiern; und (4) als eine Sonde zum Identifizieren von Spermaköpfen in einem Beweismaterial, das nach Vergewaltigungen erhalten wurde.
Das Rundzellensyndrom bezieht sich auf das Vorliegen von vielen runden Zellen, zusätzlich zu den Spermatozoen, im Samen. Diese runden Zellen können Lymphozyten, Makrophagen, abgestoßene Epithelzellen von akzessorischen Geschlechtsorganen und Keimzellen sein, welche nicht vollständig zu Spermatozoen gereift sind. Derzeit gibt es keine immunhistochemischen Sonden, welche selektiv während einer Analyse der runden Zellen, die im Samen vorhanden sind, unreife Keimzellen identifizieren.
Die vorliegende Erfindung erlaubt, daß die Anzahl der unreifen Keimzellen, welche in einer Samenprobe vorhanden sind, bestimmt wird. Dieses erlaubt einen genauen Nachweis der Fälle von unreifen oder übermäßig abgestoßenen Keimzellen und somit ein Identifizieren von Fällen, wo Probleme bei dem Prozeß der Spermatogenese auftreten. Dieses kann in Fällen bedeutend sein, wo die Spermatogenese durch Umwelttoxine, Infektionen des männlichen Geschlechtstraktes oder Veränderungen bei der normalen hormonellen Balance bei Männern gestört wird. Somit erlaubt die Erfindung eine differentielle Diagnose von runden Zellen im Samen, wobei sie eine positive Identifizierung einiger früher Stadien der Keimzellen ergibt.
Dieses wird dadurch erreicht, daß eine Probe, welche Humansperma enthält, mit dem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der Erfindung in Kontakt gebracht wird, wobei der Antikörper durch bekannte Techniken mit einer nachweisbaren Einheit markiert wurde. Das Bild, welches durch die Antikörper gebildet wird, wird dann ausgewertet und mit bekannten oder Standardbildern von Humansperma in dem passenden Entwicklungsstadium verglichen.
Die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der Erfindung sind ebenfalls als ein Marker für die Akrosomenreaktion in Humansperma nützlich. Sie konnten verwendet werden, um bei einer gegebenen Population die Anzahl von Spermien, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen können oder nicht (acrosome reactive or unreactive sperm) festzustellen. Der Antikörper wird mit einer Probe des Humanspermas für eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ausreichen, damit der Antikörper in jeglichem Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, einen Antigen-Antikörper-Komplex bildet. Der Komplex wird dann durch bekannte Techniken zum Nachweisen des Markers oder des nachweisbaren Anteils, welcher an dem Antikörper befestigt ist, nachgewiesen. Diese umfassen eine direkte oder indirekte Immunfluoreszenz, Radioimmunassay oder Enzymimmunassay. Diese Anmeldung kann nützlich sein, um eine Unfruchtbarkeit zu diagnostizieren, wenn eine solche Unfruchtbarkeit auf Störungen bei der Fähigkeit des Spermas, eine Akrosomenreaktion zu durchlaufen, als auch auf Störungen bei der Geschwindigkeit der Akrosomenreaktion beruht.
Derzeit vertrauen forensische Laboratorien und Labors, welche mit Vaterschaftstests befaßt sind, auf die wirkungsvollen Techniken der RFLP-Analyse, um potentielle Verdächtige zu identifizieren oder um den richtigen Vater eines bestimmten Kindes zu identifizieren. Indem DNA benutzt wird, die aus dem Beweismaterial von Opfern, vom Ort des Verbrechens oder aus dem Blut von möglichen Eltern erhalten wird, wird die DNA mit Restriktionsenzymen geschnitten und einer Elektrophorese unterzogen. DNA-Sonden, welche eine Reihe von spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb des menschlichen Genoms erkennen, werden dann eingesetzt, um einen spezifischen genetischen Polymorphismus zu identifizieren, womit die DNA von dem Ort des Verbrechens, dem Opfer oder dem Verdächtigen oder von einem Elternteil und einem Kind identifiziert wird. Ein gegenwärtiges Problem auf diesem Gebiet des DNA-Fingerprintings von Vergewaltigungsbeweismaterial ist die Isolierung von Sperma-DNA aus den anderen zellulären Materialien, welche von einem Vergewaltigungsopfer erhalten werden. Zellen (wie z. B. Bakterien, Hefe oder zervikale, anale oder orale Epithelzellen) können die Proben kontaminieren. Die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der Erfindung, die mit einem Kügelchen konjugiert sind, können verwendet werden, um solche Mischungen im Hinblick auf Spermazellen anzureichern und somit eine selektive Extraktion der Humansperma-DNA zu erlauben.
Die Akrosomenreaktion ist eine notwendige Voraussetzung für die Fruchtbarkeit. Es wird angenommen, daß nur Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, Eier befruchten kann. Da das Antigen der Erfindung auf der inneren akrosomalen Membran des Spermas, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, ausgestellt zu sein scheint, kann ein Konjugat aus Antikörper und Kügelchen verwendet werden, um selektiv Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, auf einem Kügelchen oder einer geeigneten Zellaffinitätsmatrix zu adsorbieren. Das Sperma kann dann von dem Kügelchen entfernt werden oder auf dem Kügelchen verwendet werden, um mit menschlichen Eiern eine Wechselwirkung einzugehen und diese zu befruchten.
Somit stellt die Erfindung ein Mittel zum Isolieren von Humanspermazellen, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen haben, zur Verfügung. Die immobilisierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörper der Erfindung werden mit einer Probe, welche Humanspermazellen enthält, für eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ausreichen, damit der Antikörper an die Spermazellen binden kann, um Antikörper-Spermazellen-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden dann aus der Probe entfernt. Vorzugsweise werden die gebundenen Komplexe gewaschen. Diese Spermazellen werden dann von den Antikörpern abgetrennt, wobei bekannte Techniken verwendet werden, um die Spermazellen als ein Isolat zur Verfügung zu stellen. Vorzugsweise ist der Antikörper an einem Immunaffinitätskügelchen befestigt.
Ein solches Kügelchen kann als ein Vehikel verwendet werden, um eine ausgewählte Population von Spermien, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen haben, in den Uterus oder Eileiter von unfruchtbaren Frauen zu verabreichen, welche im übrigen eine normale Ovulation aufweisen, aber die Diagnose einer "unerklärten Unfruchtbarkeit" aufweisen (möglicherweise eines immunologischen Ursprungs). Dieses würde dem Laboranten erlauben, eine in vivo-Kapazitation zu umgehen und der Frau eine Population von Spermien, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen haben, darzubieten. Weiterhin könnte das Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, welches von dem Affinitätskügelchen isoliert wurde, bei einer in vitro-Befruchtung von menschlichen Eiern verwendet werden.
Oft enthält ein Beweismaterial einer Vergewaltigung wenige Spermazellen. Dieses beruht oft auf der Tatsache, daß das Beweismittel das Eluat aus einem getrockneten Abstrich (swab) aus einer Körperhöhle ist, was zu Spermaköpfen führt, die von ihren Schwänzen abgelöst wurden. Die Spezifität des monoklonalen Antikörpers der Erfindung für Spermaköpfe und seine fehlende Kreuzreaktivität mit anderen humanen Zelltypen erlaubt, daß die Sonde bei einer Analyse von Beweismaterial einer Vergewaltigung eingesetzt wird, um das Vorliegen von Spermazellen zu beweisen.
Es wird ebenfalls erwartet, daß der monoklonale Antikörper der Erfindung als ein aktiver Bestandteil in einem empfängnisverhütenden Gel, einer Creme oder einer anderen Zusammensetzung nützlich ist. Eine Menge, die wirksam ist, um bei einem Menschen oder einem anderen Säugetier eine befruchtungsverhütende Wirkung zu erzeugen, wird mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt oder anderweitig zugegeben, welcher dann zu Verhütungszwecken verabreicht werden kann.
Man sollte verstehen, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine Umgebung im Lichte der hierin enthaltenen Lehren innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns liegen wird. Beispiele für die Produkte der vorliegenden Erfindung, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren für die Verwendung erscheinen in den folgenden Beispielen.

Beispiel 1

Herstellung des monoklonalen Antikörpers MHS-10

Monoklonale Antikörper wurden hergestellt, indem das Verfahren von Galfre et al., Nature 266: 550 (1977), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, verwendet wurde. Weibliche Balb/c-Mäuse wurden viermal mit 1 · 107 dreimal gewaschenen menschlichen Spermien in unvollständigem Freunds-Adjuvans immunisiert. Jede Immunisierung bedeutete drei Injektionen von jeweils 0,1 ml, die intramuskulär und intraperitoneal injiziert wurden. Das Sperma wurde von Spendern der Blutgruppe 0 erhalten. Nach einer Fusion der Milzzellen aus Mäusen mit der Myelomzellinie SP2/0 (Schulman et al., Nature 279: 269 (1978), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird) wurden die Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen, welche HAT-Selektionsmedium enthielten, verteilt. HAT-Selektionsmedium enthält Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin. Ein Enzymimmuntest(ELISA)- Screening auf Antikörper wurde 14 bis 21 Tage nach der Fusion durchgeführt, indem 1 · 10&sup5; Spermazielzellen pro Vertiefung eingesetzt wurden. Hybridome, welche eine posi tive Bindung an das Sperma hervorriefen, wurden vermehrt und durch das Grenzverdünnungsverfahren von Galfre et al. kloniert. Fünfundzwanzig stabile IgG-sezernierende Antispermahybridomlinien wurden etabliert.
Die Antikörper wurden dann durch indirekte Immunfluoreszenz auf ihre Fähigkeit getestet, an Humansperma zu binden. Die indirekte Immunfluoreszenzlokalisierung des HPTS- 10-Antigens auf ejakulierten humanen Spermatozoen wurde gemäß den Verfahren von Herr et al., Biol. Reprod. 32: 695- 711 (1985), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, durchgeführt. Eines dieser Hybridome, ATCC HB 10039, produzierte einen Antikörper eines Immunglobulins in der Unterklasse IgG1, welcher an das Akrosom von fixiertem, durchlässig gemachtem Humansperma band.

Beispiel 2

Hamstereieindringtest

Es wurde gezeigt, daß der Antikörper NHS-10 die Wechselwirkung von Humansperma mit Zona-freien Hamstereiern blockiert. Siehe Anderson et al., J. Reprod. Immunol. 10: 231 (1987) und Yangimachi et al., Biol. Reproduction 15: 471 (1976), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Bei diesem Test wurde die Zona pellucida von Hamstereiern durch Behandlung mit einer Protease aufgelöst und anschließend wurde Humansperma zu den Zona-freien Eiern zugegeben. Die Fähigkeit des Spermas, an das Ei zu binden und in dieses einzudringen, wurde bewertet, indem die Spermakerne gezählt wurden, die innerhalb des Eizytoplasmas lagen. Unter Verwendung dieser Technik wurde gefunden, daß der MHS-10-Antikörper die Anzahl von Spermien hemmt, die mit Hamstereiern wechselwirken.

Beispiel 3

Reinigung von MHS-10

Der Antikörper wurde zuerst wie folgt ausgefällt. Man gebe 8 ml eiskaltes gesättigtes Ammoniumsulfat langsam, tropfenweise unter Rühren zu 10 ml Aszitesfluid zu, welche 380-400 mg Gesamtprotein entsprechen. Dieses läßt man in der Kälte für 3 Stunden rühren. Man zentrifugiere bei 10.000 Upm in einem Sorvall RC-5B für 20 Minuten. Man verwerfe den Überstand und resuspendiere das Pellet in ungefähr 5 ml dH&sub2;O. Man dialysiere für 48 Stunden bei 4ºC gegen 4 Wechsel an PBS bei pH 8,0.
Eine Protein A-Säule wurde wie folgt präpariert. Man lasse 3 g Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) in ca. 50 ml PBS, pH 8,0, für 20 Minuten quellen. Man gieße das gequollene Gel in eine Einmalspritze, welche mit einem Teflonträger und einem Dreiwegeabsperrhahn ausgestattet ist. Man schließe sämtlichen überschüssigen Puffer aus, wenn die Säule durch Schwerkraft gepackt wird. Wenn sich sämtliches Gel in der Säule befindet, wasche man mit wenigstens 50 ml Puffer (PBS, pH 8,0). Man lagere in PBS und 0,2% Natriumazid bei 4ºC bis vor der Verwendung.
Der Antikörper wurde wie folgt auf der Protein A-Säule gereinigt. Man mische 2 ml dialysiertes gesättigtes Ammoniumsulfatpräzipitat (was 4 ml Aszites entspricht) mit Protein A-Sepharosekügelchen in PBS, pH 8,0, und schüttle über Nacht bei 4ºC über Kopf (end over end). Man gieße die Kügelchen in die Säule und wasche das nichtgebundene Material mit PBS, pH 8,0, heraus, bis die Grundlinie auf dem UV-Monitor eben ist. Man spüle stoßweise mit PBS, pH 5,5, um den gebundenen IgG1-Antikörper zu eluieren. Man pumpe den Puffer mit einer niedrigen Flußgeschwindigkeit, 0,6 ml/min. durch die Säule, da der Antikörper bei diesem pH langsam eluiert. Man reinige die Säule von verbleibendem gebundenem Material, einschließlich anderer Isotypen von Antikörpern mit 0,01 M Citratpuffer, pH 3,0, mit 0,87% NaCl. Schließlich reäquilibriere man die Säule mit PBS, pH 8,0, und lagere sie mit 0,2% Natriumazid bei 4ºC.
Eine typische Reinigung begann mit 10 ml Aszitesflüssigkeit, was 380-400 mg Gesamtprotein entsprach. Nachdem das SAS-Präzipitat in 5 ml dH&sub2;O resuspendiert und dialysiert ist, beträgt das Gesamtvolumen ungefähr 7 ml und die Proteinkonzentration 15 mg/ml.
Von 75 mg dialysiertem SAS-Präzipitat, welches auf einer Protein A-Säule gereinigt wird, sind 43 mg Proteine außer IgG, die nicht an die Säule binden (Fraktion I), und 32 mg sind reines IgG, das mit PBS bei pH 5,5 eluiert (Fraktion II). Eine kleine Menge an Immunglobulinen anderer Unterklassen wird mit Citrat bei pH 3,0 von der Säule gelöst (Fraktion III).
Ein erneutes Laden der Fraktion I auf die Säule und ein weiteres Eluieren ergab kein zusätzliches IgG, was zeigt, daß die Bindungskapazität der Säule mit den 75 mg SAS-Präzipitat anfangs nicht überschritten war.
Ein 10%-Acrylamidgel wurde laufen gelassen, um die Identität der gereinigten Fraktion zu bestätigen. Wenn 100 ug Protein aus dem Ausgangsaszites, Fraktion I und Fraktion II auf dem Gel laufen gelassen wurden und mit Comassieblau angefärbt wurden, waren nur zwei Banden der schweren und leichten Antikörperkette in Fraktion II vorhanden und wenig oder nichts war in der Fraktion I des Materials sichtbar, das nicht an die Protein A-Säule band.

Beispiel 4

Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper, die mit den Köpfen von Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, reagieren können, können durch Immunisierung von Mäusen mit dem Überstand, der aus der Trennung von Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, von den Produkten der Akrosomenreaktion resultiert, erhalten werden. Eine Anzahl von Verfahren kann eingesetzt werden, um Humansperma einer Akrosomenreaktion zu unterziehen, einschließlich einer Inkubation mit Ionophoren, Follikel- und Eileiterflüssigkeiten und löslicher oder intakter Zona pellucida. Das Sperma wird bei einer niedrigen Geschwindigkeit zentrifugiert (50 · g), um die Spermazellen von den löslichen Hybridvesikeln, die aus der äußeren akrosomalen Membran und der Plasmamembran bestehen, zu trennen. Dieser Überstand wird in Standardimmunisierungsprotokollen eingesetzt, wie in Beispiel 1 ausgeführt wird.

Beispiel 5

Reinigung von SP-10

Eine Affinitätssäule wurde wie folgt hergestellt. Mit Cyanbromid aktivierte Sepharose 4B (Sigma Chemical Co.) wurde als die immobilisierende Phase für den MHS-10-Antikörper verwendet. Um die Kügelchen herzustellen, wurden 3,0 g trockene Kügelchen in 1 mM HCl für 15 Minuten quellen gelassen und dann in 200 ml derselben gewaschen. Das Quellvolumen betrug ungefähr 10 ml. Die Kügelchen wurden mit Kupplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,3, mit 0,5 M NaCl) gewaschen und sofort in 15 ml einer Lösung von 32 mg gereinigtem MHS-10 in Kupplungspuffer überführt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC in einem 50 ml-Röhrchen über Kopf geschüttelt.
Die Kügelchen wurden dann mit 100 ml Kupplungspuffer von jeglichem nichtgebundenem Material freigewaschen. Nichtumgesetzte aktive Stellen auf den Kügelchen wurden blockiert, indem mit 0,1 M Tris, 0,1 M Glycin, pH 8,3, mit 0,5 M NaCl für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde.
Die Säule wurde in einer 12 ml-Spritze mit Teflonträger und Dreiwegeabsperrhahn hergestellt und wieder mit Kupplungspuffer gewaschen. Sie wurde dann abwechselnd mit 0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0, gefolgt von Kupplungspuffer, dann Acetatpuffer gewaschen u»d schließlich mit 0,1 M Hepes, pH 8,0, mit 0,2% Azid zur Lagerung äquilibriert.
Ein BCA-Proteintest auf das Material, das nicht an die Kügelchen band, zeigte, daß 2 mg der ursprünglichen 32 mg nicht banden.
Das Sperma wurde wie folgt präpariert. Man ließ frische Ejakulate sich für 1 Stunde verflüssigen und wusch dann zweimal mit 40 ml Ham's F10-Medium mit Hepes-Puffer, pH 8,0, indem bei 600 · g zentrifugiert wurde und der Überstand verworfen wurde. Spermapellets wurden bei -80ºC mit Proteaseinhibitoren (5 mM Benzamidin, 1 mM PMSF, 2 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Pepstatin) eingefroren gelagert.
Vor der Reinigung des Antigens wurden Spermapellets aufgetaut und in einem minimalen Volumen des Puffers, in welchem sie eingefroren waren, vorsichtig (dounce) homogenisiert.
Der Extrakt der löslichen Proteine wurde bei 10.000 · g in der Mikrozentrifuge zentrifugiert. Vorläufige Ergebnisse zeigten, daß die Ausbeute des Antigens weiter erhöht werden kann, indem die Pellets erneut in 1% SDS extrahiert werden und mit dem anfänglichen löslichen Extrakt vereinigt werden, so daß die endgültige SDS-Konzentration 0,25% beträgt.
Das Antigen wurde mit einer Affinitätssäule wie folgt gereinigt. Spermaextrakt wird entweder über eine 10 ml-Säule mit Sepharose 4B-Kügelchen geleitet oder mit den Kügelchen über Nacht bei 4ºC geschüttelt, um jegliche Proteine vorzuabsorbieren, welche nichtspezifisch an die Kügelchen selbst binden würden. Der Extrakt wurde auf das obere Ende der Affinitätssäule geladen und über die Säule rezirkulieren gelassen, indem bei 0,6 ml/min über Nacht bei 4ºC gepumpt wurde. Nichtgebundenes Material (Fraktion I) wurde mit 0,1 M Hepes-Puffer, pH 8,0, von der Säule gewaschen, bis die Grundlinie auf einem UV-Monitor eben war. Angereichertes Antigen (Fraktion II) wurde stoßweise mit 0,1 M Glycinpuffer, pH 2,2, mit 0,87% NaCl von der Säule gespült, und die Fraktionen wurden gesammelt, bis die Grundlinie wieder eben war. Schließlich wurde die Säule mit Hepes-Puffer, pH 8, reäquilibriert und bei 4ºC mit 0,2% Natriumazid gelagert. Die angereicherte Fraktion II kann über eine dritte Säule geleitet werden, welches die Affinitätssäule ist, die mit Ziegen-anti-Mäuse-IgG präpariert wurde, um jeglichen MHS-10-Antikörper zu entfernen, der von der MHS- 10-Affinitätssäule freigesetzt worden sein könnte.
Die Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Affinitätssäule wurde mit CNBr-aktivierter Sepharose auf genau dieselbe Weise, welche oben beschrieben wurde, wie die MHS-10-Affinitätssäule hergestellt, mit den folgenden Änderungen. Um eine 5 ml-Säule herzustellen, wurden 1,5 g trockene Kügelchen verwendet. Diese wurden über Nacht bei 4ºC mit 1,5 mg Ziegen-anti- Mäuse-IgG mit einer minimalen Kreuzreaktivität für humane, Pferde- und Rinderserumproteine (Jackson Immunochemical Laboratories, Inc.) inkubiert.
Bei einer typischen Antigenreinigung wurden 40 Spermaproben aufgetaut und wie oben beschrieben extrahiert. Das Gesamtvolumen betrug 7,8 ml, und 100 ul wurden zur Bestimmung der Proteinkonzentration und für eine Gelelektrophorese beiseite gestellt. Das Gesamtprotein wurde durch das BCA-Verfahten auf 68 mg bestimmt. Der Extrakt wurde mit Sepharose 4B-200-Kügelchen vorabsorbiert, und das resultierende Volumen von 38 ml wurde dann an die Affinitätssäule binden gelassen.
Proteine, welche nicht an die Affinitätssäule banden, wurden mit 0,1 M Hepes, pH 8,0, eluiert und als Fraktion I gesammelt. Nach einer Dialyse und Lyophilisierung wurde dieses Protein erneut in 1,0 ml PBS gelöst und das Gesamtprotein wurde auf 16 mg bestimmt.
Proteine, die an die Affinitätssäule banden, wurden mit 0,1 M glycingepufferter Salzlösung, pH 2,2, eluiert und als Fraktion II gesammelt. Das Gesamtvolumen der Fraktion II betrug 20 ml. Die Hälfte dieser Fraktion wurde weiter auf der Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Säule absorbiert, um jegliche Mäuseantikörper zu entfernen, die von der Affinitätssäule freigesetzt worden sein könnten. Nach einer Dialyse und Lyophilisierung wurde jede Hälfte dieser gereinigten Fraktion, die absorbierte und nichtabsorbierte, erneut in 100 ul PBS gelöst. Die absorbierte Hälfte der Fraktion enthielt 39 ug Protein und die nichtabsorbierte Hälfte enthielt 64 ug Protein. Weitere 65 ug Protein waren in der Fraktion III vorhanden, welche eluiert wurde, wenn die Säule erneut mit Hepes-Puffer, pH 8, äquilibriert wurde.
Das andere Protein, über das keine Rechenschaft abgelegt wurde, könnte in irgendeinem der verschiedenen Schritte, einschließlich einer nichtspezifischen Absorption an die Vorsäule, in dem System verlorengegangen sein. Die Menge, über welche in diesem Experiment keine Rechenschaft abgelegt wurde, schien, möglicherweise aufgrund der erhöhten Anzahl von Manipulationen, ungewöhnlich hoch. In anderen Experimenten ohne die Vorsäule oder die anti-Mäuse-IgG- Säule wären Ausbeuten von ungefähr 150 ug an angereichertem Antigen der Fraktion II aus 12 Ejakulaten typisch.
Um das Ausmaß der Anreicherung des Antigens sichtbar zu machen, wurde ein 10%iges Minigel mit 20 ug/Bahn des Ausgangsmaterials des Spermaextrakts und der 3 Fraktionen, die von der Affinitätssäule gesammelt wurden, laufen gelassen. Bei einem Western-Blot war kein Antigen in Fraktion I, dem Material, welches nicht an die Säule band, sichtbar. Sowohl Fraktion II als auch Fraktion III zeigten das volle Muster der Antigenbanden. Anomale Banden, anscheinend das Ergebnis von Mäuse-IgG, welcher von der Säule selbst freigesetzt wurde, waren auf dem Kontrollblot mit Null-Aszites wie auch in der Fraktion III und der nichtabsorbierten Fraktion II sichtbar. Die anti-Mäuse-IgG-Säule entfernte den Großteil dieser Kontamination in der absorbierten Fraktion.
Ein Anfärben des Blots mit Amidoschwarz oder eine Silberfärbung des Gels des angereicherten Proteins aus Fraktion II zeigte typischerweise zwei Banden, die in dem MHS-10- Bereich um 30 kD herum anfärbten, zwei weitere Banden um 50 kD und 66 kD und eine sehr starke Bande um 78 kD. Von den Banden, die größer waren als 30 kD, wurde angenommen, daß sie Verunreinigungen waren, da sie nicht immunreaktiv waren.
Das gereinigte SP-10-Antigen, welches auf 2-D-Gelen analysiert wurde, zeigte Peptide mit Molekulargewichten von 18-34 kDa. Peptidbanden mit 34, 26, 24 und 18 kD werden dann bis zur Homogenität (90%-98%) durch aufeinanderfolgende Elektrophorese und Elektroelution gereinigt. Ein 10%iges SDS-PAGE-Gel, welches die SP-10-Fraktion von der Affinitätssäule enthält, wird einer Elektrophorese in einer Dimension unterzogen, und Peptidbanden, welche dem immunreaktiven Antigen entsprechen, werden durch einen Immunoblot identifiziert. SP-10-Peptide werden dann als Streifen aus dem Gel ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Streifen werden auf 12%igen Gelen einer Elektrophorese unterzogen. Die Peptide weren auf ihre Reinheit hin geprüft. Die Peptide werden durch Elektroelution auf Nitrocellulosemembranen überführt und können dann zur Inokulation oder anschließenden biochemischen Analyse eluiert werden.

Beispiel 6

Reinigung des Antigens durch Umkehrphasen-HPLC

Reinigung von SP-10 aus Humanserum

Serum aus 8 bis 12 Ejakulaten wurde durch Zentrifugation in jeweils 25 ml Ham's F10-Medium, Hepes-Puffer, pH 7,4, zweimal bei 550 x g für 10 Minuten gewaschen und dann eingefroren bei = 20ºC gelagert, bis es benötigt wurde. Das Sperma wurde aufgetaut, in 1-2 ml 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) resuspendiert, vorsichtig homogenisiert, um lösliches Antigen zu extrahieren, und zweimal bei 13.000 · g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, dann durch einen 0,22 um-Filter filtriert, um unlösliches Material zu entfernen. Der lösliche Extrakt, welcher 5-10 mg Gesamtprotein enthielt, wurde auf einer Gilson-HPLC mit einer Brownlee- Umkehrphasensäule, 10 mm · 25 cm, gepackt mit Aquapore C-8, 300 A Porengröfle, 7 um Silicakügelchen, fraktioniert. Bei einer Flußgeschwindigkeit von 1,5 ml/min wurde ein Gradient von 0-80% Lösungsmittel B über 50 Minuten laufen gelassen. Lösungsmittel A war 0,1% TFA in destilliertem Wasser und Lösungsmittel B war 0,1% TFA in 2-Propanol. Fraktionen, welche den einzelnen Peaks entsprachen, wurden bei 230 nm nachgewiesen und manuell gesammelt.

Präparative Gelelektrophorese

Diese Fraktionen wurden mit einem Savant-Speed Vac lyophilisiert, in Laemmli-Probenpuffer gelöst und auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Proteine wurden für 40 Minuten bei 500 mA (10 mM CAPS-Puffer, 10% Methanol, pH 11,0) auf eine PVDF-Membran elektrogeblottet, welche mit einer zweiten PVDF-Membran und einer dritten Nitrocellulo semembran abgedeckt war, um Proteine einzufangen, welche durch das PVDF durchtraten. Die PVDF-Membranen wurden mit Comassieblau angefärbt, um die Proteine zu identifizieren, welche in jeder Fraktion vorhanden waren, während die Nitrocellulose mit dem MHS-10-Antikörper sondiert wurde, um die antigenen Banden zu identifizieren, welche zur Sequenzierung aus den PVDF-Blots ausgeschnitten werden sollten.

Aminosäurequenzierung

Eine Aminosäuresequenzierung wurde in der Protein- und Nukleinsäure-Sequenziereinrichtung der University of Virginia durchgeführt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde bestimmt, indem ein Applied Biosystems 470 A-Gasphasenproteinsequenziergerät verwendet wurde. Getrocknete Proben des MHS-10-Immunogens wurden in 75% Ameisensäure aufgenommen und auf einen Glasfaserfilter, welcher mit Polybren beschichtet war, aufgetragen. Der Filter wurde getrocknet und in das Sequenziergerät eingebracht. Ein Zyklus eines Edman-Abbaus wurde ohne Phenylisothiocyanat (PITC) durchgeführt, gefolgt von 20-30 Zyklen mit PITC. Eine Spaltung der N-terminalen Aminosäuren wurde über ein Gasphasentrifluoressigsäureanhydrid erreicht, was zu der Bildung von Anilinothiazolinonderivaten führte. Die PTH-Derivate oder eine Mischung von PTH-Standards wurden auf einem Waters 840- HPLC-System mit einer IBM C18-Umkehrphasensäule analysiert und werden bei Wellenlängen von 254 und 313 nm nachgewiesen. Zwei SP-10-Peptide, die 30 kD- und 18 kD-Formen, wurden isoliert und auf die Aminosäuren hin mikrosequenziert.
Die Sequenz des N-Terminus der ersten 12 Aminosäuren der 30 kD-Bande wurde als XTVAEXTSGEXA gefunden. Diese Sequenz war nach der vorhergesagten Sequenz, die von cDNAs, die mit der Aminosäure Nr. 78 begannen, abgeleitet war, ausgerichtet (aligned). Die Sequenz des N-Terminus der ersten 7 Aminosäuren der 18 kD-Bande wurde als XDEQXSG gefunden. Diese Sequenz war nach der vorhergesagten Sequenz, die von cDNAs abgeleitet war, welche mit der Aminosäure Nr. 140 begannen, ausgerichtet.

Beispiel 7

Charakterisierung des Antigens SP-10

Die biochemische und morphologische Charakterisierung von SP-10 zeigt ein saures, polymorphes Protein, welches bei der menschlichen Bevölkerung konserviert ist. Entstehend während der Spermatogenese innerhalb der naszierenden Akrosomen von sich entwickelnden Spermatiden und lokalisiert innerhalb des Akrosoms des intakten Spermas, ist SP- 10 nicht auf dem Plasmalemma lokalisiert, sondern wird nach der Akrosomenreaktion auf der Spermaoberfläche exponiert. SP-10 ist somit ein Differenzierungsmarker der Akrosomenentwicklung beim Menschen und ein Beispiel eines intraakrosomalen Immunogens, welches vor der Befruchtung exponiert wird, so daß es ein potentielles Ziel für eine Immunempfängnisverhütung bietet. SP-10 wurde von der Projektgruppe der Weltgesundheitsorganisation für Empfängnisverhütungsimpfstoffe aufgrund seiner Gewebespezifität und dem Beweis, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper die Sperma/Ei-Wechselwirkung bei dem Hamstereieindringtest hemmte, als ein "primärer Impfstoffkandidat" bezeichnet.

Materialien und Methoden

1. Immunzytochemie des menschlichen Testis

Testes wurden durch elektive Orchiektomien bei Prostatakarzinomen von Patienten erhalten, die nicht mit Steroiden behandelt wurden. Die Testes wurden in 2% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert und in Paraffin eingebettet. Zehn Mikrometer-Schnitte wurden auf mit Gelatine beschichteten Mikroskopobjektträgern angeordnet, in einer abgestuften Reihe von Ethanolen entparaffiniert und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) rehydratisiert. Die Schnitte wurden für 30 Minuten mit 10% normalem Ziegenserum vorbehandelt, 3x in PBS gewaschen und mit, einer 1 : 1000-Verdünnung des monoklonalen Antikörpers MHS-10 oder einem Kontroll-IgG&sub1; in 1% normalem Ziegenserum für 30 Minuten umgesetzt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einer 1 : 100-Verdünnung von Ziegen-anti-Mäuse-IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) für 30 Minuten behandelt, dreimal gewaschen und mit Mäuseperoxidase-anti- Peroxidase 1 : 200 in PBS für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von dreimal Waschen in PBS. Ein braunes Reaktionsprodukt, welches die Lage des SP-10-Antigens anzeigt, wurde mit 0,05% Diaminobenzidin mit 0,015% Wasserstoffperoxid entwickelt.

2. Immunfluoreszenzmikroskopie

Bewegliches Sperma. Lebendes ejakuliertes Sperma wurde 1,5 Stunden lang in RPMI 1640-Medium mit 3,5% BSA bei 37º mit 5% CO&sub2; inkubiert. 1,5 · 108 Spermien wurden für 1 Stunde mit dem MHS-10-Antikörper bei 1 : 100 oder Kontroll-IgG&sub1; bei 1 : 100, verdünnt in RPMI, inkubiert. Die Proben wurden 2x mit Medium gewaschen und für 1 Stunde mit einer 1 : 100- Verdünnung von Ziegen-anti-Mäuse-IgG-FITC (Jackson Immuno Research Laboratories) umgesetzt. Die Proben wurden 2x gewaschen und als Naßfixierungen (wet mounts) beobachtet. 50 Prozent der Spermien waren zur Zeit der Zugabe des primären Antikörpers beweglich; 25% bei der Zugabe des zweiten Antikörpers, und ungefähr 10% waren zur Zeit der Auswertung von 1000 beweglichen Zellen beweglich.
Wirkung der TX-100- oder Methanolpermeabilisierung. 3 · 10&sup8; Spermien wurden 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), welche 2 uM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, gewaschen. Die Spermien wurden 30 Minuten lang in 3% Paraformaldehyd fixiert. Aliquots wurden mit 0,5% Triton X100 oder 100% Methanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig gemacht. Nicht durchlässig gemachte Proben wurden mit PBS behandelt. Nach einem zweimaligen Waschen wurden die Proben mit einer 1 : 100-Verdünnung,von MHS-10 in PBS für 1 Stunde bei 37ºC, gefolgt von einer 1 : 100-Verdünnung des Ziegen-anti-Mäuse-IgG, inkubiert. Die Präparationen wurden 2x gewaschen und in 90% Glycerol, 0,25 M Tris, pH 7,5 fixiert und untersucht.
Routineverfahren zur Auswertung von MHS-10-angefärbten Spermien, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen haben. Basierend auf dem Nachweis (siehe Ergebnisse), daß die Permeabilisierung der Membran das SP-10-Antigen exponierte, wurde das folgende Standardverfahren entwickelt. Spermien aus verflüssigten Samenproben wurden zweimal in Ham's F10- Medium, das mit 0,1 M Hepes gepuffert war, gewaschen. Zur Induktion der Akrosomenreaktion wurden die Spermasuspensionen für 3 Stunden bei 37º in Biggers, Whitten & Whittingham (BWW)-Medium (Biggers et al., Methods in Mammalian Embryology (Herausg. J. C. Daniel), 1. Ausg., S. 86 (Freeman, San Francisco, 1971), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird) mit 3,5% Humanserumalbumin (HSA) kapazitiert. Die Proben wurden für 1/2 Stunde in 10 uM Calciumionophor A23187 in BWW, welches 0,3% HSA enthielt, eine Akrosomenreaktion durchlaufen gelassen. Das Sperma wurde auf einem Mikroskopobjektträger zytozentrifugiert, an der Luft trocknen gelassen und mit mehreren Tropfen 3% Paraformaldehyd für 45 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Objektträger wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 100% Methanol behandelt und mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) für 15 Minuten blockiert. Die Objektträger wurden mit einer 1 : 100- Verdünnung des monoklonalen Antikörpers MHS-10 in 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4, 1% NGS für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, worauf drei Wäschen in PBS folgten. Eine 1/100-Verdünnung von mit Fluoresceinisothiocyanat konjugiertem Ziegen-anti-Mäuse-IgG (Jackson Immuno Research) in PBS wurde als ein zweiter Antikörper eingesetzt. Die Probestücke wurden gründlich gewaschen und in 90% Glycerol, 10% 0,1 M Tris, pH 7,5, naßfixiert, wobei Orthophenylendiamin zugegeben wurde, um ein Schwächerwerden der Fluoreszenz zu verhindern.

3. EM-Immunzytochemie

Testisgewebe wurde in 2% Glutaraldehyd, 2% Formaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,3, fixiert. Ein Teil wurde in 2% Osmiumtetroxid nachfixiert. Das Gewebe wurde in Araldit 502 eingebettet. Goldschnitte wurden auf einem Ultramikrotom geschnitten und dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,2% Ovalbumin inkubiert, um nichtspezifische Stellen zu blockieren. Der monoklonale Antikörper MHS-10 oder Kontroll-IgG1 wurden 1 : 50 in 0,2% Ovalbumin verdünnt und über Nacht mit den Schnitten bei 4ºC umgesetzt. Nach einem erschöpfenden Waschen in Tropfen von PBS wurden die Schnitte für 2 Stunden in einer 1 : 25-Verdünnung von Protein A- Gold (Janssen Life Sciences, Piscataway, N. J.) inkubiert. Die Schnitte wurden dann in PBS gewaschen und für 10 Minuten in 5% Uranylacetat angefärbt und mit einem JEOL 100CX- Elektronenmikroskop angeschaut.

4. Western-Blots

Spendersperma wurde in Ham's F10-Medium gewaschen, bei -80ºC in Gegenwart von 5 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Pepstatin eingefroren und aufgetaut und mit. 1% SDS extrahiert. Ein Teil Extrakt wurde zu einem Teil 2x-Laemmli-Puffer (Laemmli, Nature (Lond) 227 : 680-85 (1970), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird) in Gegenwart oder Abwesenheit von β-Mercaptoethanol zugegeben. Die Proteine wurden durch ein- und zweidimensionale Elektrophorese gemäß dem Verfahren von O'Farrell, J. Biol. Chem. 250: 4007-21 (1975), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, analysiert. Der Elektrotransfer folgte Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350-54 (1979), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die Nitrocellulose wurde in 5% Milch in PBS/0,5% Tween-20 blockiert; in dem MHS-10-mAb (1/1000) in PBS/0,5% Tween-20, 1% Milch über Nacht bei 4ºC inkubiert; Ziegen-anti-Mäuse-IgG-Peroxidase wurde bei einer 1/5.000- Verdünnung eingesetzt. Der monoklonale Kontroll-IgG&sub1; wurde ebenfalls 1/1000 verdünnt. Die Silberfärbung von Proteinflecken auf den 2-D-Gelen folgte dem Verfahren von Wray et al., Anal. Biochem. 118: 197-203 (1981), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Ergebnisse

1. SP-10 ist ein Differenzierungsantigen der Spermatogenese.

Es wurde gefunden, daß SP-10 in einem bestimmten Stadium der Spermadifferenzierung in dem humanen Testis exprimiert wird. Eine immunhistochemische Untersuchung von in Paraffin eingebetten Testes (N = 3), welche an den monoklonalen MHS-10-Antikörper (Isotyp: IgG&sub1;) exponiert wurden, zeigte eine Bindung an adluminale Spermatiden und reife Spermien innerhalb der Tubuli seminiferi (Fig. 1A, B). Kontrollschnitte des humanen Testis, welche mit einem anderen monoklonalen IgG&sub1;-Antikörper inkubiert wurden (Fig. 1C), zeigten kein Immunreaktionsprodukt. Innerhalb der runden Spermatiden wurde eine Immunfärbung oft bei halbmondförmigen Strukturen wie auch bei kleineren ovoiden Körnchen beobachtet (Fig. 1B, Pfeilspitzen). Gruppen von ähnlich angefärbten Spermatiden, welche entweder halbmondförmige oder granuläre Immunreaktionsmuster zeigten (wie in Fig. 1B), wurden in Querschnitten von einzelnen Tubuli seminiferi beobachtet. Dieser Fund ist mit früheren Beobachtungen in dem humanen Testis konsistent, daß Keimzellen in mehreren Stadien der Differenzierung in jedem Querschnitt eines Tubulus seminiferus coexistieren können. Nicht alle Bereiche des Samenepithels zeigten eine Anfärbung, was entweder ein Fehlen der Expression von SP-10 in einigen Stadien der Spermatogenese oder eine mögliche Loslösung einiger Zellen aus dem Samenepithel in dem in Paraffin eingebetteten Material nahelegte. Basale Spermatogonien, Sertolizellen, Spermatozyten und Zellen innerhalb des testikulären Interstitiums zeigten keine Immunreaktivität.

2. SP-10 befindet sich innerhalb des Akrosoms von intaktem Sperma.

Durch Immunfluoreszenzmikroskopie wurde SP-10 in dem Kopf von Humansperma lokalisiert. Bewegliche, nicht durchlässig gemachte Spermien (N = 1000), welche mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper inkubiert und mit einem fluoreszierenden sekundären anti-Mäuse-Antikörper umgesetzt wurden, zeigten keine immunfluoreszente Anfärbung des Spermas (Daten nicht gezeigt). Dieses zeigte, daß SP-10 nicht in nachweisbaren Niveaus auf der Oberflächenplasmamembran von intaktem Sperma vorhanden war. Spermien, welche auf Objektträgern an der Luft getrocknet wurden, mit 3% Paraformaldehyd fixiert wurden, mit 0,5% Triton X-100 oder Methanol durchlässig gemacht wurden und dann mit dem monoklonalen Antikörper und einem fluoreszierenden sekundären anti- Mäuse-Antikörper umgesetzt wurden, wurden in einem kappenförmigen fluoreszierenden Muster angefärbt. Dieses Muster, welches der bekannten Morphologie des Akrosoms ähnelte, trat bei > 90% der Spermien in jeder Probe auf (Fig. 2A). Diese Ergebnisse zeigten, daß die Membranpermeabilisierungsbehandlungen das SP-10 für eine Antikörperbindung zugänglich machten.

3. Eine ultrastrukturelle Lokalisierung zeigte, daß SP-10 mit den akrosomalen Membranen verbunden ist.

Feinstrukturstudien wurden durchgeführt, um SP-10 mit höherer Auflösung zu lokalisieren. Reife ejakulierte Spermatozoen wurden in 2% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd fixiert, für eine Elektronenmikroskopie vorbereitet und auf den Kunststoffschnitten mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper und 10 nm-Goldpartikeln, die mit Protein-A beschichtet waren, immunmarkiert. Eine Konzentration von Goldpartikeln wurde über das akrosomale Kompartiment hinweg beobachtet (Fig. 3). Bei Schnitten, wo ein Teil des Akrosoms schräg angeschnitten war (wie in Fig. 3 an der Spermienspitze), wurden die Goldpartikel in einer bilaminären Anordnung beobachtet. Dies legte nahe, daß in reifen, intakten Spermien SP-10 ungleichmäßig innerhalb des Akrosoms verteilt ist und mit der inneren und äußeren akrosomalen Membran assoziiert ist. Eine genaue Zuordnung der Antigenlokalisation auf dem Feinstrukturniveau war bei diesen Präparationen schwierig, da gefunden wurde, daß die Nachfixierung in Osmiumtetroxid, welche die Zellmembranen definiert, die Antigenizität zerstört. Jedoch wurde durch ein Vergleichen von nicht mit Osmium umgesetzten immunmarkierten Proben gegenüber mit Osmium umgesetztem Sperma die Lage der akrosomalen Membranen so bestimmt, daß sie den elektronendurchlässigen Bereichen entsprechen, welche an den Pfeilspitzen in Fig. 3 angegeben sind. Dieses führte zu dem Schluß, daß SP-10 in reifem, intaktem, ejakuliertem Sperma auf den Stirnseiten von sowohl der inneren als auch äußeren akrosomalen Membran in der Nähe der akrosomalen Matrix angeordnet ist.

4. Biochemische Charakterisierung

Die molekularen Charakteristika von SP-10 wurden durch Western-Blots von ein- und zweidimensionalen Gelen untersucht, auf welchen Spermahomogenate einer Elektrophorese unterzogen wurden. Das Muster von immunreaktiven Spermaproteinen, welches auf Western-Blots eines eindimensionalen 10% Acrylamid-SDS-PAGE-Gels beobachtet wurde, erlaubte eine Auflösung von wenigstens 14 verschiedenen Peptidbanden (Fig. 4B), welche von 18-34 kDa reichten. Spermahomogenate, welche mit SDS und dem Disulfidbindungsreduktionsmittel β- Mercaptoethanol behandelt wurden, wurden mit Homogenaten verglichen, die nicht dem Reduktionsmittel ausgesetzt wurden (Fig. 4B). Das Muster der immunreaktiven Peptide war identisch, ob β-Mercaptoethanol vorhanden war oder nicht, was zeigte, daß die Reduktion von Disulfidbindungen die scheinbaren Molekulargewichte der immunreaktiven Peptide nicht veränderte.
Eine Silberfärbung eines Spermahomogenates, welches auf einem 2-D-Gel einer Elektrophorese unterzogen wurde, zeigte viele Proteinflecken, die isoelektrische Punkte über den pH-Bereich von 4,3 bis 6,5 besaßen (Fig. 5A). Der monoklonale MHS-10-Antikörper machte mit einer Reihe von Peptidflecken, welche in ihrem scheinbaren Molekulargewicht von 18 bis 34 kDa reichten, eine Immunreaktion durch (Fig. 5B). Immunreaktive Peptide mit scheinbaren Molekulargewichten von 24-34 kDa wiesen isoelektrische Punkte von ungefähr 4,9 auf, während die immunreaktiven Peptide in dem 18 kDa- Bereich mit pIs von 5,1-5,4 etwas basischer waren.

5. Alle getesteten Individuen weisen das SP-10-Protein auf.

Fig. 4B zeigt, daß immunreaktives SP-10 aus unterschiedlichen Individuen sehr ähnlich war. Die relative Intensität der Antikörperreaktivität mit irgendeiner Peptidbande war bei unterschiedlichen Individuen ähnlich, wie es auch das Vorliegen der vollständigen Anzahl von 14 verschiedenen immunreaktiven Peptidbanden in jedem Spermahomogenat war. Bis heute hat keine der getesteten Spermaproben, wobei entweder Immunfluoreszenz oder Western-Blots (N = 60) verwendet wurden, nicht mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper reagiert, was zeigt, daß SP-10 in der menschlichen Bevölkerung in hohem Maße konserviert ist.

6. SP-10 bleibt nach der Akrosomenreaktion mit dem Spermakopf assoziiert.

Es ist wohlbekannt, daß gewisse Bestandteile der akrosomalen Matrix während der Akrosomenreaktion aus dem Akrosom diffundieren, wenn die äußere akrosomale Membran mit der Spermaplasmamembran verschmilzt. Fig. 2B zeigt Immunfluoreszenzfärbungsmuster, welche erhalten wurden, wenn der monoklonale MHS-10-Antikörper mit Spermaproben umgesetzt wurde, die mit dem Calciumionophor A23187 behandelt wurden, welcher einige der Spermien induziert, so daß diese die Akrosomenreaktion durchlaufen. Mit Ionophor behandelte Populationen enthielten erhöhte Zahlen von Spermien, welche äquatoriale Streifen zeigten (Fig. 2B, dünne Pfeilspitzen), wie auch Spermien, welche entweder schwache Kappen oder schwache Kappen und äquatoriale Streifen zusammen zeigten (Fig. 2B, dicke Pfeilspitzen).
Diese lichtmikroskopischen Ergebnisse zeigten, daß SP-10 nach der Akrosomenreaktion teilweise mit dem Spermakopf assoziiert bleibt. Die schwachen Kappen legten nahe, daß SP-10 auf der inneren akrosomalen Membran bleibt, welche nach der Akrosomenreaktion auf dem Spermakopf exponiert wird, während die fluoreszierenden äquatorialen Streifen ein Beibehalten von SP-10 in Assoziierung mit dem äquatorialen Segment des Spermas zeigten.

Diskussion

Die Beobachtungen, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper nur mit runden Spermatiden und nachfolgenden Stadien der Spermiogenese auf Testisschnitten reagiert und auf dem EM-Niveau innerhalb des Akrosoms lokalisiert ist, verbunden mit dem Bericht, daß somatische Gewebe nicht mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper reagierten (Anderson et al., J. Reprod. Immunol. 10: 231-57 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird), zeigen zusammen, daß SP-10 als ein "Differenzierungsantigen", d. h. ein gewebespezifisches Molekül, welches in einem. präzisen Stadium der menschlichen Spermatogenese exprimiert wird, klassifiziert werden kann. Das MHS-10-Immunreaktionsprodukt war in dem Samenepithel als kleine ovoide Körnchen in der Nähe des Kerns von runden Spermatiden sichtbar. Diese Anfärbung, welche das früheste Stadium der Spermatogenese anzeigt, zu welchem SP-10 nachweisbar war, entspricht wahrscheinlich dem naszierenden akrosomalen Vesikel und/oder der perinukleären Golgi-Region. Der monoklonale MHS-10-Antikörper kann somit einen nützlichen Marker der Akrosomenentwicklung beim Menschen liefern. Eine klinische Anwendung dieser Antikörpersonde kann in der Diagnose des Auftretens von unreifen Keimzellen (Golgi-Phasen-Spermatiden und nachfolgende Schritte) in Samenproben mit sogenanntem "Rundzellensyndrom" liegen. Siehe Jassim und Festenstein, J. Reprod. Immunol. 11: 77-89 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Das Fehlen einer Kreuzreaktivität in somatischen Geweben verbunden mit seiner stadienspezifischen Expression während der Keimzellendifferenzierung paßt ebenfalls zu der möglichen Nützlichkeit von SP-10 als ein Empfängnisverhütungsimpfstoff. Mögliche Probleme der Autoimmunität, welche erwartet würden, wenn gewöhnliche somatische Antigene als Impfstoffimmunogene benutzt würden, können mit SP-10 nicht angetroffen werden.
Der Immunfluoreszenznachweis zeigte, daß in Spermien mit intaktem Akrosom und durchlässig gemachter Membran SP- 10 in einem kappenförmigen Immunfluoreszenzmuster angeordnet ist, welches die gesamte Ausdehnung des Akrosoms bei 90% oder mehr Spermien von einem bestimmten Spender zu umfassen schien. Es gab keinen Beweis, daß der MHS-10-Antikörper sein zugehöriges Antigen auf dem Plasmalemma von lebenden Spermien erkannte. Der Bericht des WHO-Workshops (Anderson et al., op. cit. 1987, S. 249) hatte geschlossen, daß der MHS-10-Antikörper (S20) "eine Reaktivität ... mit häufig vorhandenen Oberflächenantigenen auf reifem Sperma" zeigte. Die hierin berichteten Ergebnisse stimmen nicht mit dieser Schlußfolgerung für Sperma mit intaktem Akrosom überein, welches aus Populationen erhalten wurde, die wenig Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hatte, enthielten.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß nach der durch den Ionophor induzierten Akrosomenreaktion ein Anstieg bei der Anzahl an Spermien festgestellt wurde, die fluoreszierende Streifen oder fluoreszierende Streifen zusammen mit schwächeren fluoreszierenden Kappen zeigten. Wir interpretieren die verminderte Immunfluoreszenz der Kappe (schwache Kappe) so, daß diese zeigt, daß nach der Akrosomenreaktion SP-10, höchstwahrscheinlich in Assoziierung mit der inneren akrosomalen Membran, auf der Spermaoberfläche angeordnet bleibt. Das Beibehalten der Immunfluoreszenz nach der Akrosomenreaktion in einem gürtelähnlichen Streifen repräsentiert wahrscheinlich die Beibehaltung von SP-10 innerhalb des äquatorialen Segments. Die Immunfluoreszenz des äquatorialen Streifens schien, obwohl sie einen viel kleineren Bereich als die fluoreszierende Kappe abdeckte, von derselben Intensität zu sein wie das vollständige Kappenmuster, was zeigte, daß die Menge an SP-10 innerhalb des äquatorialen Segmentes vor und nach der Akrosomenreaktion ähnlich ist. Die Immunfluoreszenzdaten wiesen keine ausreichende Auflösung auf, um zu bestimmen, ob SP-10 nach der Akrosomenreaktion an der inneren und/oder äußeren akrosomalen Membran und der Matrix des äquatorialen Segments oder möglicherweise in allen diesen Subdomänen lokalisiert bleibt oder sich neu verteilt, so daß die Plasmamembran eingeschlossen wird, welche über dem äquatorialen Segment liegt.
Die von der WHO gesponserte Untersuchung in mehreren Zentren lieferte den Beweis, daß der monoklonale MHS-10- Antikörper (S20) Sperma-Ei-Wechselwirkungen bei dem Ham stereieindringtest hemmte. Unser Modell um dieses Ergebnis zu erklären postuliert, daß das SP-10-Antigen, obwohl es bei intaktem Sperma, das keine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, innerhalb der Grenzen der akrosomalen Membranen zurückgehalten wird, für die Wirkungen des MHS-10-Antikörpers nach der Akrosomenreaktion zugänglich ist.
Eine allgemeine Annahme bezüglich der Auswahl von geeigneten Spermaimmunogenen für die Entwicklung von Empfängnisverhütungsimpfstoffen ist, daß die Zielmoleküle Oberflächenbestandteile sein sollten, welche für die humoralen oder zellulären Immuneffektoren zugänglich sind. Obwohl die intra-akrosomale Lokalisation der SP-10-Peptide in dem reifen Sperma, das keine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, auf den ersten Blick diese Voraussetzung (caveat) nicht zu erfüllen scheint, eröffnet die Umformung der Spermakopfmembranen, welche die Akrosomenreaktion begleitet, die Möglichkeit, daß Bestandteile des Akrosoms, obwohl sie in intaktem Sperma von dem Immunsystem abgeschlossen sind, als eine Klasse als Kandidaten für Empfängnisverhütungsimpfstoffe nicht außer Acht gelassen werden sollten, ohne ihr Schicksal nach der Akrosomenreaktion zu untersuchen.
Untersuchungen mit Meerschweinchensperma haben bemerkenswerte Beweise geliefert, daß eine vollständige, aber reversible Empfängnisverhütung erreicht werden kann, indem weibliche Tiere mit dem gereinigten Spermaprotein PH-20 immunisiert wurden. Siehe Primakoff et al., Nature 335: 543- 46 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Dieses Molekül mit 64.000 Dalton ist sowohl auf der Plasmamembran als auch, nach der Akrosomenreaktion, auf der inneren akrosomalen Membran von Meerschweinchensperma vorhanden. Siehe Primakoff et al., J. Cell. Biol. 101: 2239 (1985); Myles et al., J. Cell. Biol. 99: 1634 (1984); Cowan et al., J. Cell. Biol. 103 : 1289 (1986); und Primakoff et al., Biol. Reprod. 38 : 921 (1988), auf welche sämtlich hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. PH-20 kann bei der Bindung der Spermien an die Zona pellucida eine Rolle spielen und scheint während der Akrosomenreaktion eine Proteolyse durchzumachen. Ein Antiserum gegen das PH-20-Protein aus Meerschweinchensperma weist jedoch keine Kreuzreaktivität mit Humansperma auf (Primakoff, persönliche Mitteilung). Obwohl SP-10 und PH-20 in Anbetracht ihres scheinbaren Molekulargewichtes und ihrer Immunreaktivität unterschiedliche Moleküle zu sein scheinen, haben sie die Eigenschaft gemeinsam, nach der Akrosomenreaktion in dem Spermakopf zu bleiben. Die bemerkenswerte Wirksamkeit von PH-20 beim Hervorrufen einer empfängnisverhütenden Wirkung in Meerschweinchen weist auf ein ähnliches empfängnisverhütendes Potential für SP-10 bei Menschen hin.
Eine Anzahl von Verfahren, einschließlich monoklonaler Antikörper und Lectinsonden wie auch mehrere Techniken mit Farbstoffen, wurden benutzt, um die Akrosomenreaktion auszuwerten. Siehe Lee et al., Fertil. Steril. 48: 649-58 (1987); Berger et al., Biol. Reprod. 40: 525-30 (1989); Cross et al., Gamete Res. 15: 213-26 (1986); und Wolfet al., Biol. Reprod. 32: 1157-62 (1985), auf welche sämtlich hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Da der monoklonale MHS-10-Antikörper gegen ein intra-akrosomales Antigen gerichtet ist, welches sich während der Akrosomenreaktion von einem kappenförmigen Immunfluoreszenzmuster zu einer schwachen Kappe und/oder einem Streifen verändert, kann dieser ebenfalls klinisch nützlich sein, um den akrosomalen Status festzustellen.
Wir haben einen hohen Grad an Ähnlichkeit zwischen den Individuen bei den immunreaktiven Formen von SP-10 auf Western-Blots wie auch übereinstimmende Immunfluoreszenzlokalisierungen auf dem Sperma jedes Individuums beobachtet, was zeigt, daß SP-10 in der menschlichen Bevölkerung konserviert ist. Diese Kenntnis ist wesentlich, um ein Empfängnisverhütungsimpfstoffmolekül auszuwählen, da dieses auf den meisten, wenn nicht auf allen Spermien vorhanden sein muß, damit ein Impfstoff die breitestmögliche Wirksamkeit erreichen kann. Die multiplen Formen von SP-10-Peptiden, die durch Western-Blotting identifiziert werden, können posttranslationale Modifikationen, eine proteolytische Prozessierung des Proteins innerhalb des Akrosoms, multiple Genprodukte oder mehrere dieser Möglichkeiten, die zusammenwirken, verkörpern. Der hohe Grad an Ähnlichkeit zwischen Individuen bei Western-Blots legt nahe, daß, welche dieser Alternativen auch immer wirkt, um den Polymorphismus bei den antigenen Peptiden zu erzeugen, die Mechanismen bei verschiedenen Individuen ähnlich arbeiten. Die Tatsache, daß eine Reduktion das Muster der immunreaktiven SP-10-Peptide nicht veränderte, legt ein Fehlen einer Bindung zwischen den Ketten und wenige oder keine Disulfidbindungen innerhalb einer Kette bei SP-10 nahe.
Die elektronenmikroskopischen Lokalisierungen bei intaktem, ejakuliertem Humansperma zeigen, daß SP-10 asymmetrisch innerhalb der akrosomalen Matrix angeordnet ist, wobei es in vielen Spermien mit der Stirnseite sowohl der inneren als auch äußeren akrosomalen Membran in der Nähe der akrosomalen Matrix assoziiert ist. Da der Polymorphismus von SP-10 auf dem Niveau der Aminosäuresequenz nicht vollständig verstanden wird und eine Funktion für die SP- 10-Polypeptide, neben ihrem Potential als Impfstoffimmunogene, bisher nicht bestimmt wurde, kann ein Verständnis der Bedeutung der scheinbaren Asymmetrie von SP-10 in dem Akrosom nur in einem allgemeinen Sinne diskutiert werden. Das Wissen über die räumliche Organisation der verschiedenen Moleküle innerhalb der akrosomalen Matrix und den akrosomalen Membranen bei intaktem Sperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, befindet sich derzeit im Anfangsstadium. Die Beweismittel legen nahe, daß SP-10 ein Bestandteil einer solchen akrosomalen "Lamina" in Humansperma sein kann. Darüber hinaus könnte seine asymmetrische Verteilung in der akrosomalen Matrix anzeigen, daß das Molekül eine hydrophobe Domäne enthält, welche direkt in die akrosomalen Membranen eingefügt ist.
Zusammenfassend haben wir durch ein- und zweidimensionale Immunoblots gezeigt, daß SP-10, welches aus ejakuliertem Humansperma extrahiert wurde, einen Polymorphismus der immunogenen Peptide von 18-34 kDa zeigte, wobei das Muster von Individuum zu Individuum konserviert war und durch Reduktionsmittel nicht verändert wurde. Die Mehrzahl der antigenen Peptide besaß isoelektrische Punkte von ungefähr 4,9. Die Immunzytochemie bei Testisschnitten zeigte, daß SP-10 in runden Spermatiden und Spermazoen innerhalb des adluminalen Kompartimentes des Samenepithels lokalisiert ist. Die Immunfluoreszenz zeigte, daß SP-10 nicht mit der Oberfläche von ejakuliertem Sperma mit intaktem Akrosom assoziiert war. Die licht- und elektronenmikroskopische Immunzytochemie lokalisierte SP-10 über das gesamte Akrosom hinweg, und der EM-Nachweis zeigte eine bilaminar angeordnete Assoziierung mit der inneren Fläche der äußeren akrosomalen Membran und der äußeren Fläche der inneren akrosomalen Membran. Nach der Induktion der Akrosomenreaktion mit dem Ionophor A232187 blieb SP-10 in Assoziierung mit der inneren akrosomalen Membran und dem äquatorialen Segment auf dem Spermakopf ausgestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper als ein Marker der Akrosomenentwicklung beim Menschen und als eine Sonde, um den Akrosomenstatus auszuwerten, benutzt werden kann. Die Ergebnisse stützen ebenfalls die Hypothese, daß eine Inhibition der Sperma-Ei-Wechselwirkung durch den monoklonalen anti-SP-10-Antikörper als eine Folge der Antigenexposition nach der Akrosomenreaktion auftreten kann.
Die Testisspezifität und die stadienspezifische Expression von SP-10, seine Konservierung bei der menschlichen Bevölkerung, die Fähigkeit des monoklonalen MHS-10-Antikörpers, die Befruchtung in dem Hamstereitest zu inhibieren, und vorläufige Beweise, welche nahelegen, daß SP-10 nach der Akrosomenreaktion mit dem Spermakopf assoziiert bleibt, legen die Nützlichkeit dieses Humanspermamoleküls als ein Empfängnisverhütungsimpfstoff nahe.

Beispiel 8

Identifizierung des humanen akrosomalen Antigens SP-10 in Primaten und Schweinen

Die intra-akrosomale Lokalisation von SP-10 hat zu Spekulationen hinsichtlich der Funktion des Moleküls geführt. Da die scheinbare Molekülmasse der beta- und gamma-Formen von Akrosin (Polakoski und Parrish, J. Biol. Chem. 252: 1888-94 (1977), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird) wie auch Sperminogen (Siegel et al., Biol. Reprod. 36: 1063-68 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird) mit der scheinbaren Masse von SP-10 überlappt, ist die Frage der Ähnlichkeit zwischen SP-10 und diesen zwei früher beschriebenen intra-akrosomalen Molekülen entstanden. In dieser Untersuchung haben wir gereinigte Präparationen von Schweineakrosin und Sperminogen benutzt (Gaben von Kenneth Polakoski), um zu zeigen, daß, obwohl SP-10 in Schweinen vorhanden ist, es von Akrosin und Sperminogen verschieden ist.
Da 5P-10 zuerst als ein Humanspermaantigen definiert wurde, wird die Identifizierung dieses Moleküls in anderen Spezies ein Modell zum Testen auf das befruchtungsverhütende Potential eines auf SP-10 basierenden Empfängnisverhütungsimpfstoffes begründen. Unter Einsatz von Western- und Northern-Blots zeigen wir, daß Primaten und Schweine potentielle Tiermodelle für die Untersuchung von SP-10 sind.

Materialien und Methoden

1. Spermaextrakte

Humansperma. Spermien, welche aus Ejakulaten eines Spenders erhalten wurden, wurden in Ham's F10-Medium gewaschen und bei -80ºC in Gegenwart von 5 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 ug/ml Leupeptin und 2 ug/ml Pepstatin eingefroren. Nach Auftauen und Extraktion in 1% SDS wurde ein Teil des Extraktes zu einem Teil 2x-Laemmli- Puffer (Laemmli, op. cit.) in Gegenwart oder Abwesenheit von β-Mercaptoethanol zugegeben.
Primatensperma. Sperma wurde von dem Regional Primate Research Center an der University of Washington aus der Cauda epididymides von Macaca mulatta, Macaca fascicularis und Papio cynocephalus anubis unter Opferung der Tiere erhalten. Die Caudae wurden in 10 ml menschliche Eileiterflüssigkeit (Irvine Scientific, Irvine, CA) gegeben, in kleine Stücke geschnitten, um zu ermöglichen, daß das Sperma austrat, und für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, und die resultierende Suspension wurde für 5 Minuten in ein konisches 15 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, um zu ermöglichen, daß sich Gewebetrümmer absetzten. Der Überstand, welcher das Sperma enthielt, wurde dekantiert und bei 1.000 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 ul Laemmli-Puffer ohne β-Mercaptoethanol suspendiert und unmittelbar für einen späteren Versand eingefroren. Beim Erhalt wurden die Proben 2 : 1 in 4x-Laemmli-Puffer mit β-Mercaptoethanol verdünnt.
Sperma von anderen Spezies. Kaninchensperma wurde über eine künstliche Vagina erhalten und war eine Gabe aus dem Labor von Eugene Oliphant. Bullensperma, das durch Elektroejakulation erhalten wurde, war ebenfalls eine Gabe aus dem Labor von Dr. Oliphant. Ratten-, Schweine- und Meerschweinchensperma wurde aus der Cauda epididymides dieser Spezies wie oben angegeben erhalten, mit der Ausnahme, daß nach der Zentrifugation nach dem Sammeln diese Spermapräparationen unmittelbar mit 1 ml 1% SDS und 1% β-Mercaptoethanol pro 108 Spermien extrahiert wurden.
Proteinbestimmungen wurden mit dem Verfahren von Tan, Anal. Biochem. 86: 327-331 (1978), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, durchgeführt. Die Gele wurden mit 10 ug Spermaextrakt pro Bahn beladen.

2. Western-Blots

Spermaextrakte wurden auf 10%igen PAGE-SDS-Gelen einer Elektrophorese unterzogen und für 12 Stunden bei 100 mA einem Elektrotransfer unterzogen, wobei dem Verfahren von Towbin et al., op. cit., gefolgt wurde. Die Nitrocellulose wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 5% Milch, 2,5% Tween-20, 1% BSA, 0,5% Ziegenserum und 0,15% Gelatine (Blockierungslösung) blockiert. Nitrocellulosestreifen wurden über Nacht bei 4ºC in dem MHS-10-mAB (1/1000 oder 1/2000) oder dem Kontroll-IgG1 (1/1000) in einer 1/5-Verdünnung der Blockierungslösung (Inkubationslösung) inkubiert. Nach einer dreimaligen Wäsche in der Inkubationslösung wurde der sekundäre Antikörper, Ziegen-anti-Mäuse-IgG- Peroxidase, bei einer Verdünnung von 1/10.000 auf den Blots für 2 Stunden bei Raumtemperatur eingesetzt. Die Blots wurden dann 3x in PBS gewaschen und mit 0,05% DAB und 0,01% H&sub2;O&sub2; entwickelt.

3. Northern-Blots

Markierte Sonde. Das offene Leseraster für SP-10 wurde bestimmt, indem zwei überlappende cDNAs verbunden wurden, welche aus dem humanen Testis durch ein anfängliches Screenen einer Testisexpressionsbibliothek mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper kloniert wurden. Siehe Beispiel 9. Das offene Leseraster besteht aus 795 Nukleotiden, welche ein Protein mit 265 Aminosäuren codieren. Ein Fragment bestehend aus 634 bp des offenen Leserasters für SP-10, welches aufgrund einer inneren EcoRI-Stelle hergestellt wurde, wurde mit P³²-dCTP (ICN) nicktranslatiert (Bethesda Research Labs, Rockville, MD) und verwendet, um poly A+-RNA auf Northern-Blots zu sondieren.
Testis-RNA. Humane Testes wurden von Patienten erhalten, welche sich einer chirurgischen Orchiektomie bei Prostatakrebs unterziehen mußten. Pavian (Papio papio und Papio cynocephalus anubis)- und Rhesusaffen (Macaca fascicularis)-Testes wurden eingefroren von dem Regional Primate Research Center der University of Washington erhalten. Poly A+-RNA wurde aus diesen Geweben isoliert, indem Oligo(dT)- Cellulose Typ 3 (Collaborative Research, Inc., Bedford, MA) verwendet wurde. Ein Mikrogramm der humanen Testes, 2 ug von humaner Leber und Plazenta und 10 ug von Pavian-, Rhesus-, Hunde- und Katzentestis-poly-A+-RNA wurden auf einem 1% Formaldehyd-Agarosegel gemäß Lehrach et al., Biochem. 16: 4743-51 (1977) und Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5794-98 (1980), auf welche beide hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, einer Elektrophorese unterzogen. Die abschließenden Membranwäschen bestanden aus 0,1 · SSPE, 0,5% SDS bei 65ºC.

Ergebnisse

Immunoblots von Proteinen, welche aus Ebersperma extrahiert wurden, zeigten, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper mehrere Spermaproteine bei dieser Spezies erkannte (Fig. 6, Bahn 2B). Von dem monoklonalen MHS-10-Antikörper wurden sowohl in Eber- als auch Humansperma Peptide mit 34 kDa, 29 kDa und mehrere schwächere Zwischenbanden erkannt. Interessanterweise zeigte der Immunoblot von Eberspermaproteinextrakten mehrere der Peptide unterhalb von 29 kDa nicht, welche auf dem Immunoblot des Humanspermaextraktes sichtbar waren.
Frühere Untersuchungen haben die Reinigung der akrosomalen Eberproteine Akrosin, Polakoski und Parrish, op. cit., und Sperminogen, Siegel et al., op. cit., berichtet. Die freundliche Gabe von gereinigtem Ebersperminogen und Eberakrosin von Dr. Kenneth Polakoski erlaubte uns zu fragen, ob der monoklonale MHS-10-Antikörper mit diesen vorher beschriebenen akrosomalen Matrixbestandteilen kreuzreagieren würde. Wie man in Fig. 6 sieht, waren die Einzelbanden von gereinigtem Sperminogen und Akrosin, Bahnen 3 und 4, nicht mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper reaktiv, obwohl der Eberspermaextrakt (Bahn 2B) klar erkennbar immunreaktive Proteine enthielt. Zusätzlich besaß die gereinigte Präparation von Akrosin ein beträchtlich höheres scheinbares Molekulargewicht als SP-10. Obwohl die gereinigte Präparation von Sperminogen ein ähnliches scheinbares Molekulargewicht aufwies wie ein immunreaktives Hauptpeptid von SP-10 bei 29 kD, erkannte der monoklonale MHS-10-Antikörper diese Sperminogenproteinbande auf dem Western-Blot nicht.
Ein Western-Blotting von Spermaextrakten von mehreren Spezies, einschließlich von Bulle, Ratte und Kaninchen, schlug darin fehl das Vorliegen von Proteinen zu zeigen, welche mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 eine Immunreaktion zeigten (Fig. 7). Zusätzlich zu den in Fig. 7 gezeigten Spezies wurde bei Spermaextrakten von Meerschweinchen und Katzen beobachtet, daß eine Reaktivität mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper auf Western-Blots fehlte.
Peptide, die mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper immunreaktiv waren, wurden auf Western-Blots nachgewiesen, die Spermaextrakte von Papio cynocephalus anubis, Macaca mulatta und Macaca fascicularis enthielten (Fig. 8). Jeder dieser Primaten zeigte ein polymorphes Immunreaktivitätsmuster, das zu dem polymorphen Immunreaktivitätsmuster ähnlich war, das bei Extrakten von Humansperma beobachtet wurde. Jedoch zeigten die Spermaextrakte von jedem dieser Primaten immunreaktive Peptide mit niedrigerer scheinbarer Masse als in den Humanspermaextrakten, einschließlich einer Bande bei ungefähr 14 kfla.
Northern-Blots (Fig. 9), welche mit poly A+-RNA beladen wurden, die aus Testes von Papio papio, Papio cynocephalus anubis und Macaca fascicularis gereinigt wurde, zeigten, daß die Testes dieser Spezies eine 1,35 kb-mRNA enthielten, welche mit der SP-10-Sonde mit 628 bp hybridisierte. Diese 1,35 kb-mRNA wies eine ähnliche Größe auf wie die humane testikuläre mRNA (Fig. 9). Die poly A+-RNA aus Testes von Hunden und Katzen hybridisierte nicht mit der Sonde, noch tat dieses die poly A+-RNA, welche aus der humanen Plazenta oder Leber erhalten wurde (Fig. 9).

Diskussion

Die Identifizierung von Peptiden in Schweinespermaextrakten, welche mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper immunreaktiv waren und ein ähnliches scheinbares Molekulargewicht aufwiesen wie humanes SP-10, zeigt, daß Schweinesperma SP-10 enthält. Das Fehlen der Immunreaktivität von gereinigten Präparationen von Akrosin oder Sperminogen mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper zeigt trotz der Tatsache, daß der Schweinespermaextrakt immunreaktiv war, einen Unterschied zwischen SP-10 und diesen früher beschriebenen intra-akrosomalen Komponenten. Dieses legt nahe, daß das SP-10-Protein ein neuer intra-akrosomaler Bestandteil ist.
Das polymorphe Muster der SP-10-Peptide, welches auf Western-Blots von Humanspermaextrakten beobachtet wurde, wurde ebenfalls bei Spermapeptiden beobachtet, die aus Pavianen und Rhesusaffen erhalten wurden. Warum diese multiplen immunreaktiven Peptide mit unterschiedlicher Masse im Sperma von Menschen und den anderen Primaten erscheinen, wurde nicht festgestellt. Da der monoklonale MHS-10-Anti körper erfolgreich eingesetzt wurde, um eine Lambda-gt11- Expressionsbibliothek auf SP-10 zu screenen, ist es wahrscheinlich, daß das MHS-10-Epitop aus Protein und nicht aus Kohlehydraten besteht. Das offene Leseraster für humanes SP-10 sagt ein Protein mit 265 Aminosäuren mit einer Masse von 28, 3 kDa voraus. Siehe Beispiel 9. Da zwei kanonische N-verknüpfte Glykosylierungsstellen auf dem humanen SP-10 identifiziert wurden, ist es wahrscheinlich, daß die Formen von SP-10 mit einem scheinbaren Molekulargewicht über 28,3 kDa glykosyliertes SP-10 darstellen. Jeder der Western- Biots von Primatensperma zeigte immunreaktive Banden in dem oberen Bereich des Musters bei ungefähr 29 kfla. Diese Banden entsprechen ungefähr der Masse, welche aus der Nukleotidsequenz ohne irgendeine Glykosylierung vorhergesagt wird. Wie bei den Humanspermaextrakten wurden multiple immunreaktive Formen unterhalb von 29 kDa bei den anderen Primaten beobachtet. Diese Ähnlichkeit zwischen humanem, Pavian- und Makak-SP-10 legt nahe, daß der Mechanismus, welcher für die Erzeugung des Polymorphismus von SP-10 verantwortlich ist, sei es Proteolyse, posttranslationale Modifikation, multiple Genprodukte oder eine Kombination dieser Ursachen, in Pavian- und Makaksperma wie auch in Humansperma funktioniert.
Schweine-SP-10 zeigte andererseits nicht die multiplen immunoreaktiven Peptide unterhalb von 29 kDa, welche bei den Extrakten von Primatensperma sichtbar sind. Ähnlich dem humanen SP-10 zeigten Schweinesperma-Immunoblots eine Bande bei ungefähr 34 kDa wie auch eine immunreaktive Hauptbande bei ungefähr 29 kDa (ungefähr die 28,3 kDa-Masse für das Protein, welche nach der Nukleotidsequenz vorhergesagt wird). Es ist derzeit unklar, ob diese Heterogenität Unterschiede in der Aminosäuresequenz, eine posttranslationale Modifikation oder die Folgen von einem Unterschied in der Lebensfähigkeit und Proteolyse der Spermapräparationen widerspiegelt.
Da SP-10 nach der von dem Ionophor induzierten Akrosomenreaktion mit dem Spermakopf assoziiert blieb und ein Beweis geliefert wurde, daß der monoklonalte MHS-10-Antikörper die Sperma/Ei-Wechselwirkung in dem Hamstereieindringtest hemmte, ist es möglich, daß SP-10 ein wirksames Immunogen zum Induzieren von Antikörpern sein könnte; welches die Befruchtung in vivo unterbinden würde, vorausgesetzt, daß ausreichende Niveaus des Antikörpers innerhalb des Eileiters induziert werden. Die Beobachtung, daß eine 1,35 kb-mRNA für SP-10 Pavianen, Makaken und Menschen gemeinsam ist, liefert einen zusätzlichen Beweis, der die Ähnlichkeiten unterstützt, die zwischen Menschen, Pavianen und Makaken bei dem immunreaktiven SP-10, das auf Western-Blots beobachtet wird, beobachtet werden. Zusammen zeigen diese Daten, daß Makaken und Paviane geeignete Primatenmodelle zum Testen des befruchtungsverhütenden Potentials eines rekombinanten SP-10-Impfstoffes sein könnten.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Untersuchung ein monoklonaler Antikörper gegen SP-10 (MHS-10) auf Western-Blots eingesetzt, um immunreaktives SP-10 in Spermaextrakten aus Pavian (Papio cynocephalus anubis) und zwei Makaken (Macaca mulatta und Macaca fascicularis) zu identifizieren. Bei jedem dieser Primaten erkannte der monoklonale MHS-10-Antikörper ein polymorphes Muster von immunreaktiven Peptiden, welches zu dem humanen Muster ähnlich war. Immunreaktives SP-10 wurde ebenfalls in Schweinesperma gezeigt. Unter Verwendung von gereinigten Präparationen der früher beschriebenen intra-akrosomalen Moleküle Akrosin und Sperminogen im Schwein haben wir beobachtet, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper nicht mit diesen Proteinen reagierte, was zeigt, daß SP-10 von diesen bekannten akrosomalen Komponenten verschieden ist. Sperma aus mehreren häufigen Spezies, einschließlich Kaninchen, Bulle, Ratte, Meerschweinchen und Katze, zeigte keine Immunreaktion mit dem monoklonalen MHS-10-Antikörper. Unter Verwendung einer radioaktiven Sonde, welche 628 Nukleotide des offenen Lese rasters für SP-10 überspannte, wurde auf Northern-Blots der poly A+-RNA, die aus Testes von Macaca fascicularis, Papio papio und Papio cynocephalus anubis erhalten wurde, eine Boten-RNA mit 1,35 kb mit einer identischen Größe wie die mRNA aus humanen Testes identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß Paviane, Makaken und Schweine mögliche Modelle zum Testen eines auf SP-10 basierenden empfängnisverhütenden Impfstoffes sein könnten.

Beispiel 9

Klonieren und Sequenzieren von cDNAs, welche für das humane intra-akrosomale Antigen SP-10 codieren

Dieses Beispiel beschreibt die Charakterisierung von cDNAs, welche für das humane akrosomale Spermaprotein, SP- 10, codieren. cDNAs, welche für SP-10 codieren, wurden isoliert, sequenziert, und die abgeleitete SP-10-Aminosäuresequenz wurde analysiert. Diese Arbeit identifizierte einige fundamentale Eigenschaften des SP-10-Proteins und legt nahe, daß ein alternatives Spleißen der SP-10-mRNA auftritt. Unter Verwendung der SP-10-cDNAs und des monoklonalen MHS-10-Antikörpers wird es möglich, die Expression von SP-10 während der Spermatogenese sowohl auf dem transkriptionalen als auch posttranskriptionalen Niveau zu untersuchen. Eine Überexpression von SP-10 unter Verwendung der SP-10-cDNAs sollte uns ebenfalls erlauben, seinen Wert als ein Immunogen für einen Empfängnisverhütungsimpfstoff festzustellen. Ein Feststellen der Immunogenität von mehreren SP-10-Peptiden unter Verwendung von rekombinanten Verfahren wird ebenfalls möglich gemacht, indem die SP-10-cDNAs kloniert und sequenziert wurden.

Materialien und Methoden

1. Isolierung und Analyse von cDNA-Klonen

Der monoklonale MHS-10-Antikörper wurde verwendet, um eine Lambda-gt11-Expressionsbibliothek des humanen Testis zu sondieren. Die Bibliothek war eine Gabe von Jose Millan. Siehe Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5311-15 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die Bibliothek wurde mit einer Dichte von 5 · 10&sup4; plaquebildenden Einheiten pro 150 mm-Petrischale mit E. coli Y1090 als Wirtsbakterium plattiert. Nach einem Wachstum bei 42ºC und Induktion mit Isopropyl-β-D-Thiogalactosid wurden die Nitrocellulosefilter mit 5% Milch und 5% Ziegenserum vorinkubiert und mit einer 1 : 1000-Verdünnung des monoklonalen MHS-10-Antikörpers (Isotyp IgG1) gescreent. Gebundener MHS-10 wurde durch Verwendung eines Ziegen-anti-Mäuse-IgG, welcher an Meerrettichperoxidase gekoppelt war (Jackson ImmunoResearch Laboratories), nachgewiesen. Ein möglicher Klon wurde beim Screenen von 50.000 pfu aus der Expressionsbibliothek identifiziert. Dieser Phage wurde unter Verwendung von MHS-10 plaquegereinigt und zeigte keine Reaktivität mit anderen monoklonalen IgG1-Antikörpern oder mit dem Ziegen-anti-Mäuse-IgG. Dieser Klon enthielt ein cDNA- Insert von 214 Basenpaaren (bp), das als SP-10-214 bezeichnet wurde, welches mit P³²-dCTP (ICN) nicktranslatiert wurde (Bethesda Research Labs) und verwendet wurde, um die gt11-Bibliothek erneut zu sondieren, um weitere Klone zu identifizieren, wobei das Verfahren von Benton und Davis, Science 196: 180-182 (1977), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, verwendet wurde. Fünf weitere Klone wurden identifiziert.
Drei Plaques, welche zu dem 214 bp-Klon homolog waren, wurden gereinigt und die Phagen-DNAs wurden isoliert. Diese Phagen-DNAs wurden mit EcoRI verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen. Der EcoRI-Verdau erzeugte bei allen drei Isolaten cDNA-Insertbanden mit ungefähr 650 bp und 400 bp. Northern-Blots, welche durchgeführt wurden, indem entweder das 650 bp- oder das 400 bp-Insert der cDNA SP-10-5 als eine Sonde verwendet wurde, ergaben identische Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Die 650 bp- und 400 bp- Inserts für alle drei Phagenisolate wurden isoliert und in pGEM3Zf (ProMega) subkloniert. Die cDNA, welche mit SP-10-5 bezeichnet wird, ist zusammengesetzt aus den cDNA-Inserts, welche in den Plasmiden pGEM-SP-5-650 und pGEM-SP5-400 enthalten waren. Die cDNAs, welche mit SP-10-8 und SP-10-10 bezeichnet sind, sind ebenfalls zusammengesetzt aus ihren entsprechenden 650 bp- und 400 bp-cDNA-Fragmenten. Eine Serie von Deletionen (nested deletions) wurde an jedem Ende des cDNA-Fragments in pGEM-SP-5-650 und pGEM-SP-5-400 durchgeführt, wobei das Erase-a-Base-System (ProMega) verwendet wurde, und beide Stränge jedes Inserts wurden unter Verwendung eines Sequenase-Sequenzierkits (US Biochemicals) sequenziert. Eine Serie von Deletionen wurde von dem einen Ende des 650 bp-SP-10-10-cDNA-Fragments in pGEM-SP-10-650 durchgeführt, und ein Strang wurde sequenziert. Das 400 bp- SP-10-10-Fragment in pGEM-SP-10-650 wurde sequenziert, indem von beiden Enden aus Primer eingesetzt wurden. Das gesamte offene Leseraster für SP-10 ist ein zusammengesetztes Konstrukt aus den SP-10-5- und SP-10-10-cDNAs.

2. Homologieanalyse

Homologiesuchen in den Genbank-, National Biomedical Research Foundation (NBRF) Protein- und Swiss Protein Library-Datenbanken wurden durchgeführt, indem die FASTA- und LFASTA-Programme von Pearson und Lipman verwendet wurden. Siehe Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-48 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Vergleiche wurden mit ktups von 1 und 2 laufen gelassen.

3. RNA-Isolierung und Northern-Blots

Humane Testes wurden nach elektiven Orchiektomien bei Prostatakrebs von Patienten erhalten, die nicht mit Steroiden behandelt wurden, und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Gewebe wurde dann auf Trockeneis zu einem Pulver zermahlen, und die RNA wurde isoliert, indem Guanidinisothiocyanat verwendet wurde, worauf eine CsCl-Zentrifugation folgte. Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-99 (1979), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Poly(A)+- RNA wurde isoliert, indem Oligo(dT)-Cellulose (Collaborative Research) verwendet wurde, wie von Bantle et al., Anal. Biochem. 72 : 413-427 (1976), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben wird.
1 ug der humanen Testes-poly(A)+-RNA und 2 ug der humanen Plazenta- und Leber-poly(A)+-RNA wurden auf einem 1%- Formaldehyd-Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Siehe Lehrach et al., Biochem. 16: 4743-51 (1977) und Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5794-98 (1980), auf welche beide hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die RNA wurde auf eine Biotrace-Membran (Gelman) geblottet, und ihre Vollständigkeit wurde beurteilt, indem die ribosomalen 18S- und 28S-RNA-Banden mit UV-Licht von hinten beleuchtet wurden (backshadowing). Die Membranen wurden vorhybridisiert (50% Formamid, 1% Milch, 5 · SSPE, 1% SDS und 100 ug/ml Lachssperma-DNA) und dann mit einem P³²-markierten 634 bp-Fragment hybridisiert, welches einen Teil des Codierungsbereiches aus SP-10-5 (bps 67-695) enthielt. Die abschließenden Membranwäschen bestanden aus 0,2 · SSPE, 0,5% SDS bei 65ºC.

Ergebnisse

1. Charakterisierung der SP-10-cDNAs

Eine cDNA-Expressionsbibliothek des humanen Testis wurde gescreent, indem der monoklonale MHS-10-Antikörper verwendet wurde. Das cDNA-Insert eines mit MHS-10 reagierenden Plaques wurde gereinigt, sequenziert, und man fand, daß dieses 214 bp in der Länge aufwies. Dieses Insert wurde dann als eine Sonde verwendet, um 3 größere cDNAs zu isolieren, welche als SP-10-5, SP-10-8 und SP-10-10 bezeichnet wurden. Ein 634 bp-Fragment der cDNA SP-10-5 wurde verwendet, um Northern-Blots zu sondieren, die poly(A)+-RNA aus humanen Testes, Leber und Plazenta enthielten (Fig. 10). Eine Bande mit 1,35 kb war in der Testes-RNA vorhanden, nicht aber in den Bahnen der Leber- oder Plazenta-RNA.
Eine Sequenzanalyse zeigte, daß die cDNAs SP-10-5 und SP-10-10 weithin überlappten (Fig. 11A). Durch ein Kombinieren der Sequenzen für SP-10-5 und SP-10-10 wurde eine partielle cDNA mit 1117 bp mit einem offenen Leseraster von 795 Basen, 265 Aminosäuren, für das SP-10-Protein identifiziert. Mit der Ausnahme einer im Raster liegenden (inframe) Deletion von 57 bp (19 Aminosäuren) in SP-10-10 waren die übrigen überlappenden Sequenzen für SP-10-5 und SP-10-10 identisch. Die 5'- und 3'-Enden der SP-10-8- Sequenz waren mit den SP-10-5- und SP-10-10-cDNA-Sequenzen identisch, wo sie überlappten, aber wie SP-10-5 wies diese nicht die 57 bp-Deletion auf, welche in der SP-10-10- Sequenz vorhanden war.
Die Sequenzanalyse identifizierte ebenfalls eine Konsensus-Polyadenylierungssequenz an Position 1094, 236 bp 3' von dem TAG-Stop-Codon und eine mögliche eukaryotische mRNA-Abbausequenz 71 bp 3' des Stop-Codons. Die 5'-Sequenz (CCAG), welche das Startmethionin flankierte, war ähnlich zu einer Konsensus-Sequenz, die 5' von den meisten eukaryotischen Start-Codons gefunden wird.
Die Aminosäuresequenz für SP-10, welche von der cDNA- Sequenz abgeleitet wurde, sagte ein Protein mit 28,3 kD voraus. Drei unterschiedliche sich wiederholende Aminosäuremotive wurden identifiziert (Fig. 11A). Das erste Motiv (Ser, Gly, Glu, Gln, (Pro oder Ala)) trat siebenmal auf. Es gab zwei weitere Varianten der ersten Wiederholung (Val, Gly, Glu, Gln, Pro) und (Ser, Asp, Glu, Gln, Pro), welche sich nur durch eine Aminosäure unterschieden. Das zweite Motiv (Ser, Glu, His, (Gly oder Ala), Ser) wurde dreimal wiederholt, während das dritte Motiv (Ser, Gly, Glu, His) viermal wiederholt wurde. Diese drei Motive umfaßten 76 der 108 Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 66 und 174.
Ein Hydrophobizitätsplot der SP-10-Aminosäuresequenz (Fig. 11B) zeigte einen hydrophoben Aminoterminus, welcher für ein Signalpeptid charakteristisch ist. Der zentrale Bereich des Proteins, welcher die wiederholten Motive enthielt, wies mehrere hydrophile Domänen auf, während der Carboxyterminus sehr hydrophob war. Zwei kanonische N-verknüpfte Glykosylierungssequenzen (Asp-X-Ser(Thr)) existierten bei den Aminosäuren 48 und 258, während eine Reihe von Serinen und Threoninen, die bei Aminosäure 80 begannen, mögliche O-verknüpfte Glykosylierungsstellen nahelegten. Die Sequenz (Ser-(Asp oder Glu)-X-X-Pro), welche bei dem Rest 140 auftrat, wurde ebenfalls als eine mögliche Zielstelle für eine O-verknüpfte Glykosylierung vorgeschlagen (Gerry Hart, persönliche Mitteilung).

2. Homologiesuchen

Die gesamten SP-10-cDNA- und Aminosäuresequenzen wurden mit den Genbank-, NBRF- und Swiss-Sequenzbanken verglichen, wobei die Suchprogramme für Bibliotheken Fasta und tFasta bei ktups von sowohl 1 als auch 2 verwendet wurden. Weder die SP-10-Nukleinsäure- noch die Aminosäuresequenz zeigten irgendeine Homologie mit den Sequenzen in den Banken. Die drei wiederholten Aminosäuremotive wurden ebenfalls mit denselben Sequenzbanken verglichen. Während mehrere Proteine eine einzelne Kopie von einem Motiv enthielten, enthielt keine mehrfache Kopien von irgendeinem der Motive.

Diskussion

Wir haben die Klonierung und die anfängliche Charakterisierung von cDNAs beschrieben, welche für das humane akrosomale Spermaprotein SP-10 codieren. Die Sequenzanalyse der SP-10-cDNAs zeigte mehrere interessante Merkmale des SP-10-Proteins. Ein Hydrophobizitätsplot, welcher nach der abgeleiteten Aminosäuresequenz erzeugt wurde, zeigte, daß SP-10 einen stark hydrophoben Aminoterminus enthielt, welcher für ein Signalpeptid charakteristisch ist. Wenn darüber hinaus die aminoterminalen 20 Aminosäuren einzeln auf Ladung und Hydrophobizität hin analysiert wurden, stimmten sie gut mit den Kennzeichen eines Signalpeptids überein. Ein Signalpeptid wäre nötig, um das SP-10-Protein durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums und in die Golgi- Vesikel zu transportieren, welche verschmelzen, um das sich entwickelnde Akrosom zu bilden.
Hinter der Signalsequenz existiert ein zentraler Peptidkern, welcher mehrere hydrophile Domänen enthält, die fast vollständig aus den drei sich wiederholenden Peptidmotiven bestehen. Man sollte bedenken, daß aufgrund der Deletion von 19 Aminosäuren der cDNA SP-10-10 eine einzelne Kopie von zweien der Motive fehlt. Die Rolle, welche diese einzigartigen Wiederholungen bei der Funktion von SP-10 spielen, ist noch unklar, da keine Proteine in den Genbank-, NBRF- und Swiss-Sequenzbanken gefunden wurden, die mehrere Kopien der Motive enthielten.
Eine Analyse der cDNA-Sequenzen zeigte 2 potentielle N- verknüpfte Glykosylierungsstellen und mögliche O-verknüpfte Glykosylierungsstellen. Kohlenhydrate an diesen Positionen könnten den Unterschied in der Größe zwischen der 34 kD-SP- 10-Spezies, welche bei Western-Blots beobachtet wird, und dem 28,3 kD-Peptid (26 kD nach Entfernen des Signalpeptids), das aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz berechnet wurde, ausmachen. Die Diskrepanz in der Größe wurde erwartet, da von anderen akrosomalen Proteinen, einschließlich des Akrosins von Kaninchen, Eber und Ziege, gezeigt wurde, daß sie glykosyliert sind. Humanes und Eber-Proakrosin liefen beispielsweise bei ungefähr 55 kD in einer SDS-PAGE, wurden aber aus mRNAs synthetisiert, die für Peptide mit nur ca. 45 kD codierten.
Die Heterogenität in der Größe, die vorher für das SP- 10-Protein beobachtet wurde, ist in Fig. 12 sichtbar. Unterschiedliche Glykosylierungsgrade könnten einen Teil der Heterogenität auf Western-Blots ausmachen. Die innere Deletion innerhalb der SP-10-10-cDNA legte nahe, daß ein differentielles Spleißen des SP-10-Transkriptes ebenfalls einen Teil der Heterogenität ausmachen könnte. Die SP-10- 10-mRNA mit einer Deletion von 19 Aminosäuren würde für ein Protein codieren, das 2 kD kleiner ist als das, welches von der SP-10-5-mRNA produziert wird. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß ein alternatives Spleißen die Hauptursache für die Heterogenität war, da das SP-10-Transkript auf Northern-Blots eine relativ deutliche Bande war. Eine Proteolyse des SP-10-Proteins während der Spermareifung und -lagerung trägt möglicherweise ebenfalls zu seiner Heterogenität in der Größe bei. Die Tatsache, daß alle drei SP- 10-cDNAs, die bis heute isoliert wurden, dort, wo sie überlappten, identische nichttranslatierte 3'-Sequenzen aufwiesen, legte nahe, daß multiple genomische SP-10-Gene wahrscheinlich nicht für die Heterogenität verantwortlich waren.
Die Produktion eines immunreaktiven MHS-10-Fusionsproteins aus der ursprünglichen 214 bp-cDNA hat das MHS-10- Epitop in einem Peptid des SP-10-Proteins mit 71 Aminosäuren lokalisiert. Die aminoterminalen 34 Aminosäuren dieses Peptids mit 71 Aminosäuren waren vollständig aus zwei der drei Typen von hydrophilen Motiven zusammengesetzt, während die carboxyterminalen 37 Aminosäuren sehr hydrophob waren (Fig. 11B). Da MHS-10 sehr wahrscheinlich gegen einen hydrophilen Bereich des SP-10-Peptids erzeugt wurde, umfassen wahrscheinlich eines oder mehrere der Motive in diesem Bereich von 34 Aminosäuren das MHS-10-Epitop oder tragen zu diesem bei.
Die Verfügbarkeit der cDNAs hat uns erlaubt, große Mengen von SP-10 als ein Fusionsprotein zu erzeugen. Das rekombinante Antigen erlaubt uns, zwei Hypothesen zu testen: 1) daß SP-10 als ein Immunogen eines Empfängnisverhütungsimpfstoffes wirksam sein könnte; und 2) daß Seren von Personen mit anti-Sperma-Antikörpern rekombinantes SP- 10 erkennen können. Wenn sich die letztere als richtig erweist, kann immobilisiertes rekombinantes SP-10 als ein nützliches Zielantigen zur Messung von anti-Sperma-Antikörpern dienen.
Zusammenfassend wurden cDNAs, welche für das intraakrosomale Protein SP-10 codierten, als ein erster Schritt bei dem Verständnis der Expression dieses Antigens während der Spermatogenese kloniert und charakterisiert. Drei überlappende SP-10-spezifische cDNAs wurden aus einer cDNA- Expressionsbibliothek von humanen Testes isoliert. Diese cDNAs hybridisierten mit einer 1,35 kb-mRNA, welche in humanen Testes vorhanden war, nicht aber in der Leber oder Plazenta gefunden wurde. Eine vollständige Sequenzierung dieser cDNAs, welche als SP-10-5, SP-10-8 und SP-10-10 bezeichnet wurden, erzeugte eine Sequenz mit 1117 bp, welche einen Codierungsbereich von 265 Aminosäuren für das SP- 10-Protein enthielt. Hydrophobizitätsplots, welche aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz erzeugt wurden, zeigten einen sehr hydrophoben Aminoterminus, was für ein Signalpeptid charakteristisch ist. Die Sequenzdaten zeigten, daß drei unterschiedliche Aminosäurewiederholungen insgesamt 16mal in dem zentralen Drittel des SP-10-Proteins auftraten. Interessanterweise weist die SP-10-10-cDNA eine innere im Raster liegende Deletion von 57 bp (19 aa) auf, welche in SP-10-5 nicht vorhanden ist, was nahelegt, daß ein alternatives Spleißen mehr als eine SP-10-mRNA erzeugt. Das SP-10-Protein scheint ein einzigartiges akrosomales Protein zu sein, was auf früheren immunhistologischen Daten und auf der Beobachtung basiert, daß SP-10-cDNA-Sequenzen keine signifikante Homologie zu anderen Sequenzen zeigten, die in den Genbank-, NBRF- oder Swiss-Sequenzbanken gefunden wurden.

Beispiel 10

Herstellung des Antigens durch Transformierte Mikroorganismen

Das SP-10-5A-cDNA-Insert wird aus pGE-SP-10-5 mit KPN I und SST I ausgeschnitten. Die Enden werden geglättet, indem Mungbohnennuklease verwendet wird und NcoI-Linker werden mit T4-DNA-Ligase befestigt. (Die SP-10-5-cDNA enthält keine inneren NcoI-Stellen.) Die Linker werden dann mit NcoI gespalten, und die cDNA wird durch Agarosegelelektrophorese und Elektroelution des Fragmentes von den nicht- ligierten Linkem abgetrennt. Die cDNA wird dann in die NcoI-Stelle des E. coli-Expressionsvektors pKK233-2 (Pharmacia) ligiert. Dieser Vektor enthält einen durch IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, U.S. Biochemicals Corp.) induzierbaren Promotor und die lacZ-Ribosomenbindungsstelle 5' von der cDNA-Insertionsstelle und eine Konsensus-Transkriptionsterminationssequenz 3' von der cDNA- Insertionsstelle. Die Linker, welche mit der cDNA ligiert sind, sind eine Mischung aus 3 NcoI-Linkern, welche jeweils ein AUG-Start-Codon in einem der drei Leseraster enthalten. Die cDNAs, welche in pKK233-2 ligiert sind, werden in E. coli transformiert. Die resultierenden Kolonien werden auf Nitrocellulose überführt, und die Filter werden für 4 Stunden bei 37ºC auf einer Agarplatte angeordnet, welche 2 mM IPTG enthält, um die Produktion des SP-10-5A-Proteins zu induzieren. Der Filter wird dann bei 100ºC in 5% Natriumdodecylsulfat (SDS) inkubiert, getrocknet und mit dem MHS-10- MAB und mit Meerrettichperoxidase-markierten Ziegen-anti- Mäuse-Antiseren inkubiert. Kolonien, welche eine positive Reaktion mit dem SP-10-MAB zeigen, werden isoliert, und 1 ml-Übernachtkulturen werden in Gegenwart von 2 mM IPTG wachsen gelassen. Die rekombinanten E. coli werden durch Zentrifugation gesammelt und in 4x-Proteinbeladungspuffer (4% SDS, 20 mM TRIS (pH 8,0), 0,5 M 2-Mercaptoethanol, 20% Glycerol) lysiert. Diese Proben werden gekocht, einer 1D- SDS-PAGE gemäß Laemmli, Nature (Lond) 227: 680 (1970), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, unterworfen, und mit dem MHS-10-MAB und mit Meerrettichperoxidase-markierten Ziegen-anti-Mäuse-Antiseren einem Western-Blot unterzogen. Jene Kolonien, welche eine MHS-10-reaktive Bande von ungefähr 27 kD zeigen (SP-10-5-cDNA codiert für 266 Aminosäuren), werden verwendet, um große Kulturen zur Isolierung des rekombinanten SP-10-5-Proteins anzusetzen. Rekombinante E. coli, welche aus den großen Präparationen gesammelt werden, werden lysiert, um das SP-10-5-Protein freizusetzen. Nach einer Zentrifugation, um die Zelltrümmer zu entfernen, wird das SP-10-5-Protein gereinigt, indem Ionenaustauschchromatographie, MHS-10-MAB-Affinitätschromatographie und präparative Elektrophorese verwendet werden.

Expression in pGEX.

Das pGEX-System produziert ein "reines" (nichtfusioniertes) rekombinantes Protein, welches wir sowohl allein als auch als ein Konjugat mit anderen Proteinen, welche das Immunsystem verstärken, als ein Impfstoffimmunogen verwen den wollen. Wir haben die SP-10-5-cDNA SP-10-5 zurück in die Plasmidexpressionsvektoren pGEX-2T und pGEX-3X eingebaut. Smith und Johnson, Gene 67: 31-40 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Wir haben eine Überexpression des rekombinanten SP-10 beobachtet. Diese Konstrukte ergeben ein Fusionspolypeptid mit dem Carboxylterminus des Glutathion-S-Transferaseproteins aus Schistosoma japonicum. Smith et al., PNAS 83: 8703-8707 (1986), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die meisten Fusionsproteine, welche in diesem System produziert werden, sind in wäßrigen Lösungen löslich und können aus rohen Bakterienlysaten unter nichtdenaturierenden Bedingungen durch Affinitätschromatographie auf immobilisiertem Glutathion gereinigt werden. Unter Verwendung von Batch-Waschverfahren können mehrere Fusionsproteine parallel in weniger als zwei Stunden mit Ausbeuten von bis zu 15 mg Protein/Liter Kultur gereinigt werden. Reines SP-10 wird durch Spaltung von dem Glutathion-S-Transferaseträger durch Verdau mit ortsspezifischen Proteasen wie z. B. Thrombin (für pGEX-2T) und Blutgerinnungsfaktor Xa (für pGEX-3X) hergestellt. Nach dem Verdau werden der Träger und jegliches ungespaltene Fusionsprotein durch Absorption auf Glutathionagarose entfernt.

Beispiel 11

Testen des Prototyps eines rekombinanten Impfstoffes auf eine Immunogenität in Kaninchen

Materialien und Methoden

1. Erzeugung von polyklonalen Kaninchen-SP-10-Antiseren

Ein 634 bp-SP-10-5-EcoRI-Fragment (bps 67-701, 202 aa) und die ursprüngliche 214 bp-SP-10-cDNA (bps 487-701, 71 aa), welche EcoRI-Enden aufwiesen, wurden in die E. coli- Expressionsvektoren pWR590 bzw. pWR591 eingefügt. Siehe Guo et al., GENE 29: 251-254 (1984), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das SP-10/β-Galaktosidase-Fusionsprotein, das aus der 634 bp-Insertion resultierte, wurde gemäß Guo et al. isoliert und einer SDS-PAGE unterzogen. Die SP-10/β-Galaktosidase-Fusionsproteinbande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, eingefroren, zu einem Pulver zermahlen und in PBS resuspendiert.
Zwei Kaninchen wurden subkutan gleiche Volumina der Gelaufschlämmung und von Freunds vollständigem Adjuvans (Gibco) injiziert, und dann wurde diesen zweimal mehr in Intervallen von zwei Wochen die Gelaufschlämmung in Freunds unvollständigem Adjuvans injiziert. Die Kaninchen wurden ausbluten gelassen und das Blut wurde auf IgG hin aufgearbeitet, indem eine Ammoniumsulfatfällung verwendet wurde.

2. Western-Blots und Immunfluoreszenz mit polyklonalen Antiseren, die gegen einen Prototyp des rekombinanten Impfstoffes erzeugt wurden

Spendersperma wurde in Ham's F-10-Medium gewaschen und bei -80ºC in Wasser eingefroren. Nachdem sie aufgetaut und verwirbelt wurde, wurde die Probe für 30 Sekunden bei 10.000 · g zentrifugiert, und ein Teil des Überstandes wurde zu einem Teil 2x-Laemmli-Puffer (Laemmli, op. cit.) mit β-Mercaptoethanol zugegeben. Die Proteine wurden einer SDS-PAGE unterzogen, auf Nitrocellulose überführt (Towbin et al., on. cit.), in 5% Milch in PBS/0,5% Tween-20 blockiert und in einer 1 : 1000-Verdünnung von MHS-10, Null-Aszites, polyklonalem Kaninchen-SP-10 oder Kaninchen-Präimmunseren in PBS/0,5% Tween-20, 1% Milch für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Ziegen-anti-Mäuse (Jackson ImmunoResearch Labs)- oder Ziegen-anti-Kaninchen (HyClone)-IgG- Meerrettichperoxidase wurde mit einer 1 : 5000-Verdünnung verwendet, und das Reaktionsprodukt wurde mit 0,05% Diaminobenzidin mit 0,015% Wasserstoffperoxid entwickelt. Alle Wäschen zwischen den Antikörperinkubationen wurden mit PBS/Tween/l% Milch durchgeführt.
Für Immunfluoreszenzuntersuchungen wurde das Sperma wie oben beschrieben gewaschen, in PBS resuspendiert und auf Objektträgern an der Luft getrocknet. Die Objektträger wurden für 30 Minuten in 3% Paraformaldehyd eingetaucht und für 20 Minuten in Methanol, um das Sperma zu fixieren und durchlässig zu machen. Sie wurden für 15 Minuten in 10% Ziegenserum in PBS vorinkubiert und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10, Null-Aszites, polyklonalen Kaninchen-SP-10-Antiseren oder Kaninchen-Präimmunantiserum bei einer 1 : 500-Verdünnung inkubiert. Die Objektträger wurden 5x in PBS gewaschen und in mit Fluorescein markierten Ziegen-anti-Mäuse-Antiseren (Jackson ImmunoResearch) (für MHS-10 und Null-Aszites) oder mit Fluorescein markierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antiseren (HyClone) (für polyklonale SP-10-Antiseren und Präimmunantiseren) bei 1 : 500-Verdünnungen bei Raumtemperatur für 1 Stunde in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Die Objektträger wurden dann 5x in PBS gewaschen, mit 90% Glycerol in 25 mM Tris (pH 8,0) fixiert und unter einem Zeiss-Phasenmikroskop, das mit Epifluoreszenz ausgerüstet war, angeschaut.

Ergebnisse

1. Western-Blots und Immunfluoreszenzlokalisierung

Ein 634 bp-SP-10-5-Fragment (bps 67-701, 202 aa) und die ursprüngliche 214 bp-SP-10-cDNA (bps 487-701, 71 aa) wurden in den E. coli-Expressionsvektor pWR590 eingefügt und als g-Galaktosidasefusionsproteine exprimiert. Die zwei Konstrukte, welche als pWRSP-210 und pWRSP-71 identifiziert wurden, erzeugten Fusionsproteine, die spezifisch mit MHS- 10 auf Western-Blots reagierten (Daten nicht gezeigt). Das pWRSP-210-Fusionsprotein wurde verwendet, um in zwei Kanin chen polyklonale Antiseren zu erzeugen. Die Antiseren wurden verwendet, um Western-Blots zu sondieren, die mit SDS solubilisierte Spermaextrakte enthielten (Fig. 12). (Die Antiseren, welche von den zwei Kaninchen produziert wurden, reagierten auf Western-Blots und in der Immunfluoreszenzlokalisierungsstudie identisch; daher wurden hier nur die Daten von dem Kaninchen Nr. 1 gezeigt.) Die polyklonalen Antiseren reagierten mit derselben Serie von Banden (17-34 kD) auf der Bahn des Humanspermaextrakts, wie dieses der mAB MHS-10 tat. Es war keine Kreuzreaktivität zwischen den polyklonalen SP-10-Antiseren und anderen nicht-SP-10-Spermaproteinen ersichtlich. Die Kaninchen-Präimmünseren zeigten keine Reaktivität mit irgendeiner Spermaproteinbande.
Mit Paraformaldehyd fixiertes Humansperma wurde zuerst mit den polyklonalen SP-10-Antiseren und dann mit einem mit Fluorescein markierten sekundären Ziegen-anti-Kaninchen- Antikörper umgesetzt. Nur eine Kappe auf dem Kopf der Spermien, die in der Morphologie dem Akrosom ähnlich war, zeigte überhaupt eine Reaktivität mit den polyklonalen Antiseren (Fig. 13A). Dieses kappenförmige Immunfluoreszenzbild war mit dem identisch, das mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 angefärbt wurde (Fig. 13C). Die Präimmunantiseren und Null-Aszites zeigten überhaupt keine Anfärbung des Spermas (Fig. 13B und 13D).

Diskussion

Die Beobachtungen, daß die polyklonalen Antiseren, welche gegen das SP-10/β-Galactosidase-Fusionsprotein hervorgerufen wurden: 1) mit der identischen Serie von Peptiden auf Western-Blots reagierten, wie dieses der monoklonale Antikörper MHS-10 tat, und; 2) eine präzise Immunfluoreszenzanfärbung auf der akrosomalen Kappe des Spermas zeigten, liefern zwei sich gegenseitig stützende Beweise, daß die isolierten cDNAs für das SP-10-Protein codieren. Hätten die SP-10-cDNAs für ein nicht-SP-10-Protein codiert, wel ches nur das MHS-10-Epitop gemeinsam hätte, wären die Western-Blot- und Immunfluoreszenzdaten für MHS-10 und die polyklonalen SP-10-Antiseren wahrscheinlich nicht identisch gewesen. Die inokulierten Kaninchen zeigten keine sichtbare Krankheitswirkung, wenn sie den rekombinanten SP-10-Impfstoff erhielten. Dieses legt nahe, daß sich der rekombinante Impfstoff als sicher und wirksam erweisen könnte. Die Tatsache, daß der rekombinante Impfstoff eine polyklonale Reaktion hervorrief, welche das native SP-10 erkannte, liefert einen weiteren Beweis, daß der rekombinante Impfstoff wirksam sein wird.
Ein rekombinantes SP-10-Fusionsprotein wurde in einem E. coli-Expressionsvektor produziert und verwendet, um ein polyklonales Antiserum zu erzeugen. Dieses Antiserum färbte die akrosomale Kappe in-situ an und reagierte mit einem ähnlichen Satz von Peptiden auf Western-Blots, wie dieses ein monoklonaler Antikörper gegen SP-10 tat.

Beispiel 12

Chromosomale Lage

Genomische Blots, welche Mäuse/Humanzellen-Hybrid-DNAs enthielten, wurden mit dem 5'-634 bp-Teil von SP-10-5 hybridisiert. Tabelle I zeigt die Hybride, die positiv waren, wenn auf das SP-10-Gen gescreent wurde, und zeigt, welche Besetzung von Chromosomen in diesen Hybriden enthalten war.
Diese Tabelle ist aus 33 Zellhybriden zusammengestellt, welche 16 nichtverwandte humane Zellinien und 4 Mäusezellinien betreffen. Siehe Shows et al., Advances in Human Genetics, Band 12, Herausg. H. Harris und K. Hirschhorn (Plenum Press, New York und London), 1982, Seiten 341-452; Shows et al., Somat. Cell Mol. Gen. 10: 315-318 (1984); und Shows et al., Cytogenet. Cell Genet. 21: 99-104 (1978), auf welche sämtlich hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die Hybride wurden durch eine karyotypische Analyse und durch kartierte Enzymmarker charakterisiert. Siehe Shows, TB. 1983, Isozymes: Current Topics in Biological and Medical Research, Band 10, Seiten 323-339, Herausg. M. C. Rattazzi, J. G. Scandalios und G. S. Whitt, Alan R. Liss, New York, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Das "t" in der Tabelle zeigt eine Chromosomentranslokation für ein bestimmtes Chromosom an, aber es ist kein intaktes Chromosom vorhanden. (Siehe unter Translokationen).
Die DNA-Sonde für die DNA-Sonde SP-10 wurde mit Southern-Blots hybridisiert, welche mit EcoRI verdaute DNA aus den Human-Mäuse-Hybriden, die in der Tabelle aufgelistet sind, enthielten. Die Bewertung für die Sonde SP-10 wurde durch das Vorliegen (+) oder Fehlen (-) von humanen Banden bei den Hybriden auf den Blots bestimmt. Die übereinstimmenden Hybride haben entweder die humanen Banden zusammen mit einem bestimmten humanen Chromosom beibehalten oder verloren. Nicht übereinstimmende Hybride haben entweder die humanen Banden beibehalten, nicht aber ein spezifisches Chromosom, oder umgekehrt. Der Prozentsatz der Diskordanz zeigt den Grad der diskordanten Entmischung für einen Marker und ein Chromosom an. Eine Diskordanz von 0% ist die Basis für die Bestimmung eines Chromosoms.
Die DNA-Sonde für SP-10 wurde durch somatische Zellhybride auf dem humanen Chromosom 11 kartiert. Das Hybrid XER-7 mit der 11/X-Translokation: 11p12 oder 11p11 → 11gter::Xq11 → Xqter und das Hybrid EXR-SCSAZ mit der X/ 11- Translokation: Xpter → Xq22::11g13 → 11qter würde das SP-10 auf dem P12 → q13-Bereich des humanen Chromosoms 11 lokalisieren.
Das Chromosom 11 ergab eine Übereinstimmung von 31 und eine Diskordanz von X. Das Chromosom 16 ergab die nächsthöchste Übereinstimmung und Zahlen für eine Diskordanz von 23 bzw. 13. Diese Daten zeigen, daß das genomische Gen für SP-10 auf dem Chromosom Nr. 11, wahrscheinlich in dem Bereich der 11q2-Bande, lokalisiert ist.

Beispiel 13

Differentialdiagnose von unreifen Keimzellen im Samen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers MHS-10

Der menschliche Samen enthält zusätzlich zu Spermatozoen eine Population von runden, kernhaltigen Zellen, die vorwiegend aus Keimzellen zusammengesetzt sind, welche aus dem Testis stammen, und Entzündungszellen (Leukozyten). Obwohl die runden Zellen bei fruchtbaren Individuen weniger als 5% der gesamten Anzahl an Zellen im Samen ausmachen, sind sie in Fällen von Unfruchtbarkeit, welche mit einer Infektion oder hormonellen Änderungen der normalen Spermatogenese verbunden sind, erhöht. Keimzellen, die in Samen angetroffen werden, umfassen Spermatiden und Spermatozyten. Die Differenzierung zwischen den verschiedenen Stadien der Spermavorläufer und Leukozyten durch Lichtmikroskopie von Samenabstrichen unter Verwendung von herkömmlichen Anfärbungstechniken hat sich aufgrund der morphologischen Ähnlichkeit in der Größe als nicht zuverlässig erwiesen und setzt für eine genaue Diagnose ein in hohem Maße trainiertes Auge voraus. Runde Spermatiden und Spermatozyten konnten fälschlicherweise für Lymphozyten gehalten werden, während nichtgetrennte Spermatiden, welche ein gemeinsames Zytoplasma aufweisen, fälschlicherweise für polymorphe nukleäre Leukozyten gehalten werden konnten.
Monoklonale anti-Leukozyten-Antikörper wurden kürzlich in immunzytochemischen Techniken eingesetzt, um Leukozyten und ihre Subpopulationen in Samenabstrichen zu definieren. Eine Identifizierung von Spermavorläufern unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die gegen humane Keimzellen und Sperma hervorgerufen wurden, ist ebenfalls versucht worden, indem Immunfluoreszenztests verwendet wurden, worauf ein Anfärben mit Toluidinblau folgte; die Auswertung war aber schwierig und benötigte die nachfolgende Verwendung der Elektronenmikroskopie für eine positive Identifizierung. Siehe Jassim und Festenstein, J. Reprod. Immunol. 11: 77 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Dieses Beispiel zeigt ein einfaches und verläßliches Verfahren für die Differentialanalyse von unreifen Keimzellen in Samenabstrichen unter Verwendung einer monoklonalen Antikörper(mAb)sonde, MHS-10 (IgG&sub1;). Dieser Antikörper erkennt ein Humanspermaprotein, (SP-10), welches immunzytochemisch durch Elektronenmikroskopie in den Golgi-Phasen- Spermatiden und allen nachfolgenden Phasen der Spermiogenese lokalisiert wurde.
In diesem Beispiel wurde der MHS-10-Antikörper verwendet, um histochemisch Samenabstriche anzufärben, indem eine standardmäßige Immunperoxidasetechnik verwendet wurde. Um eine potentielle Kreuzreaktivität mit Leukozyten auszuwerten, wurde ebenfalls anti-HLe-1 (eine Pan-anti-Humanleukozyten-mAb-Sonde) verwendet. Die Ergebnisse zeigen, daß Populationen runder Zellen, welche mit anti-SP-10 angefärbt wurden, mit anti-HLe-1 nicht angefärbt wurden. Spermatiden in unterschiedlichen Stadien der Akrosomenentwicklung konnten durch den monoklonalen anti-SP-10-Antikörper nachgewiesen werden. Die Verwendung dieser Antikörpersonde erlaubt ebenfalls eine rasche Identifizierung von verschiedenen Typen von morphologisch abnormen Keimzellen in Samenabstrichen.

Materialen und Methoden

1. Samenproben

Samenproben wurden von 34 Personen erhalten. Sieben davon stammten von fruchtbaren Männern, was so definiert wurde, daß diese wenigstens Vater von einem Kind waren und im Verlauf ihrer jüngeren Krankheitsgeschichte keine venerische Infektion aufwiesen. Drei waren von Patienten mit schwerer Oligospermie (< 10 · 10º Spermien/ml Ejakulat). Fünf waren von Patienten mit Azoospermie. Acht, waren von Patienten mit Polyspermie (> 250 · 10º Spermien/ml Ejakulat). Sechs waren von Patienten, bei denen eine erhöhte Anzahl von runden Zellen in ihrem Samen festgestellt wurde, und fünf waren von Patienten nach einer Vasektomie. Die unfruchtbaren Patienten kamen aus dem Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Eine routinemäßige Samenanalyse wurde durchgeführt, wie in Hill et al., Fertil. Steril. 47: 460 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben wird.

2. Präparation der Samenabstriche

Verflüssigter Samen wurde für 10 Minuten bei 600 · g zentrifugiert. Das Samenplasma wurde abgesaugt und das zelluläre Pellet wurde zweimal mit phosphorgepufferter Salzlösung (PBS: 0,01 M, pH 7,2) gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in PBS auf ungefähr 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert, und 5 ul dieser Suspension wurden auf jeden Punkt von mit Teflon beschichteten Mikroskopobjektträgern mit 8 Punkten (Roboz Surgical, Washington, D. C.) aufgetragen. Die Objektträger wurden getrocknet und für 10 Minuten in Aceton fixiert und bei -70ºC eingefroren.

3. Monoklonale Antikörper

Die MHS-10-Zellinie (IgG&sub1;) wurde zweimal subkloniert und als Aszitestumoren wachsen gelassen. Balb/c-Mäuse (Charles River, Boston, Ma) wurden in 2 Wochen-Intervallen mit zwei i.p.-Injektionen von 0,5 ml sterilem Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) sensibilisiert. Eine Woche nach der zweiten Injektion wurden 10~ Hybridomzellen i.p. in 0,5 ml serumfreiem, sterilem RPMI-1640-Medium (Gibco, Grand Island, NY) injiziert. Das Aszitesfluid wurde gesammelt und durch Zentrifugation (1.000 · g) von den zellulären Trümmern befreit und bis zur Verwendung bei -60ºC gelagert. Anti-HIe-1 wurde von Becton Dickinson, Mountain View, CA gekauft.

4. Immunhistologische Anfärbung von Sperma und runden Zellen

Samenabstriche wurden immunhistochemisch angefärbt, indem das Streptavidin-Biotin-Peroxidasesystem (SBP) (Histostain SP-kit, Zymed Laboratories South San Francisco, CA) wie in Wolfund Anderson, Fertil. Steril. 49: 497 (1988), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, beschrieben verwendet wurde. Nach einer Sättigung der nichtspezifischen Bindungsstellen mit Nichtimmunkaninchenserum für 10 Minuten wurden 10 ul mAb auf einzelnen Punkten der Objektträger für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurde für 10 Minuten ein biotinylierter sekundärer Antikörper zugegeben (10 ul), worauf 10 ul Streptavidin-Peroxidasekonjugat für 5 Minuten folgten. Das Immunreaktionsprodukt wurde mit dem Chromogen Aminoethylcarbazol in Gegenwart des Substrates Wasserstoffperoxid für 5 Minuten bei 37ºC entwickelt. Die Abstriche wurden mit Hematoxylin gegengefärbt und durch ein wäßriges Fixierungsmedium fixiert.
Jeder Probenobjektträger wies einen Punkt auf, zu welchem 10 ul PBS anstelle des primären Antikörpers als eine Kontrolle zugegeben wurden. Zusätzlich wiesen sie jeweils alle einen Punkt auf, zu welchem MHS-10-Aszitesfluid (verdünnt 1/1000) zugegeben wurde, einen Punkt, zu welchem anti-HLe-1 (verdünnt 1/20) zugegeben wurde, einen Punkt, zu dem eine Mischung von MHS-10 (verdünnt 1/250) und anti-HLe- 1 (verdünnt 1/20) zugegeben wurde. Alle Verdünnungen wurden mit PBS durchgeführt.
Die Auswertung der mit Immunperoxidase angefärbten Abstriche wurde mit einem Differentialinterferenzkontrastmikroskop durchgeführt, wobei ein Leitz 100/1,32-DIC-Objektiv auf einem Leitz-Ortholux-Mikroskop verwendet wurde, welches mit einer Leitz-Vario-Orthomat-Kamera ausgerüstet war. Photographien wurden mit einem Ektachrom-160-Wolframfilm gemacht.

Ergebnisse

1. Immunfärbung von Samenabstrichen

In den Samenabstrichen konnten unreife Keimzellen, welche in unterschiedlichen Stadien der Ausbildung in dem Testis abgestoßen wurden, mit der MHS-10-Antikörpersonde gegen das intra-akrosomale Antigen SP-10 nachgewiesen werden. Die Beispiel der MHS-10-positiven Keimzellen sind gemäß den Stadien der Akrosomenentwicklung zusammengestellt (Fig. 14B-F). Fig. 14B stellt ein frühes Spermatidenstadium vor dem Beginn der Akrosomenbildung dar. Fig. 14C zeigt eine immunhistochemische Anfärbung eines sich entwickelnden Spermatids, welches ein ovoides MHS-10-positives Körnchen enthält, das in der Nähe des Kerns liegt. Diese Figur stellt wahrscheinlich ein frühes akrosomales Körnchen in einem Golgi-Phasen-Spermatid dar. Fig. 14D zeigt ein etwas größeres immunangefärbtes akrosomales Körnchen in der Golgi-Phase der Spermiogenese wie auch ein unvollständiges Flagellum.
Ein Spermatid, welches einen unkondensierten offenen Kern und einen immunreaktiven Halbmond zeigt, ist in Fig. 14E zu sehen. Dieses stellt ein weiter fortgeschrittenes Stadium der Akrosomenentwicklung dar, wahrscheinlich ein Spermatid in der Kappenphase. In dieser Figur befindet sich das abgeflachte Akrosom in einer Position nahe der Implantationsstelle des Flagellums, was ein Merkmal darstellt, das für die frühe Spermatidendifferenzierung charakteristisch ist, während welcher die Anlage des Flagellums an dem Kern implantiert wird. Reifes Sperma, welches in normalen Proben (Fig. 14F) häufig war, zeigte immungefärbte Akrosomen, welche den kondensierten Kern umgaben und sich in einer Position distal zu dem Flagellum befanden, was für eine abgeschlossene Akrosomenentwicklung typisch ist.
Anomale Keimzellenmorphologien, welche eine fehlerhafte Zytokinese anzeigen, wurden unter Verwendung des MHS-10-mAb beobachtet. (Fig. 15A-E). Diese umfaßten Spermatiden mit zwei Kernen (Fig. 15A), Spermatiden, welche zwei akrosomale Körnchen innerhalb derselben Zelle enthielten (Fig. 15B), und Spermien, welche zwei kondensierte Kerne enthielten, die von zwei Akrosomen innerhalb eines einzigen Spermakopfes umgeben waren (Fig. 15C Pfeile). Bilder wie bespielsweise jene, die man in den Fig. 15D-E sieht, wurden so interpretiert, daß sie intakte intrazelluläre Brücken darstellen, wo Tochterspermatiden aneinander haften blieben und scheinbar als eine Gruppe von Zellen abgestoßen wurden, die eine asynchrone Entwicklung zeigten. Von den vier aneinanderhaftenden Zellen, welche man in Fig. 15D sieht, befand sich eine Keimzelle in dem Stadium der Golgi-Phase der Spermiogenese (die Pfeile zeigen auf den akrosomalen Vesikel) und drei andere befanden sich in dem Stadium der Golgi-Phase der Entwicklung.
Andere anomale Spermaphenotypen wurden ebenfalls im Samen beobachtet, der unter Verwendung des monoklonalen Antikörper MHS-10 angefärbt wurde. Mit zwei Flagellen ver sehene Schwänze wurden in Keimzellen beobachtet, die immunreaktive Kappenphasenakrosomen und nichtkondensierte Kerne zeigten (Fig. 15F). Spermien, welche nichtkondensierte Kerne mit Mikroakrosomen zeigten (Fig. 15G), wie auch Kappenphasenspermatiden, denen die Flagellen fehlten (Fig. 15H), wurden ebenfalls beobachtet.
In einigen Fällen wurden reaktive akrosomale Überreste innerhalb von pleomorphen Strukturen beobachtet, die Fragmenten von Spermaköpfen ähnelten, welche Kernmaterial enthielten (Fig. 151). Es wurden ebenfalls Beispiele (Fig. 15J-K) mit einer peripheren Umhüllung des MHS-10-positiven Reaktionsproduktes unterhalb der begrenzenden Membran der Zelle beobachtet.
Bei den negativen Kontrollexperimenten, bei welchen PBS anstelle des mAb in den Samenabstrichen verwendet wurde, gab es kein rotbraunes Immunreaktionsprodukt aufgrund der Immunperoxidase, und nur die blaue Hämatoxylingegenfärbung der Spermien und runden Zellen wurde beobachtet (Daten nicht gezeigt). In Samenabstrichen, die mit dem monoklonalen anti-HLe-1-Antikörper behandelt wurden, reagierten nur die Leukozyten histochemisch, wie durch die rotbraune Anfärbung von AEC nachgewiesen wird. Reife Spermien und Spermatiden wiesen keine Kreuzreaktivität mit dem anti-HLe- 1-Antikörper auf und blieben blau (Fig. 15L).

Diskussion

Derzeit ist es während einer Samenanalyse schwierig, Leukozyten von Spermavorläufern unter Verwendung von herkömmlichen lichtmikroskopischen Verfahren zu unterscheiden. Die allgemeine Kategorie der "runden Zellen" dient oft dazu, alle anderen Zelltypen, welche im Samen vorhanden sind, von dem Sperma zu unterscheiden. Die herkömmlichen Färbungstechniken, welche in der Vergangenheit verwendet wurden, wie z. B. die Papanicolaou-Färbung oder eine Kombi nation der Leishman-Blutfärbung und der Bryan-Spermafärbung, vermitteln nur eine allgemeine morphologische Information über die zellulären Komponenten der Ejakulate. Eine Überlappung bei den Größen der "runden Zellen" ist ein Grund für die Schwierigkeiten bei einer definitiven Diagnose. Granuläre Leukozyten reichen in der Größe von 9-14 mm, während nichtgranuläre Leukozyten von 6-12 um reichen. Die durchschnittliche Größe eines Spermatids beträgt 5-6 um im Durchmesser. Eine Analyse von Samenabstrichen, welche Mischungen aus Keimzellen und Leukozyten enthalten, ist unter Verwendung von herkömmlichen Anfärbungen zeitaufwendig und erfordert eine sorgfältige Untersuchung der einzelnen runden Zellen, wobei eine Unterscheidung zwischen den Lymphozyten und unreifen Keimzellen besonders problematisch ist.
In der vorliegenden Untersuchung haben wir einen einzigarten monoklonalen Antikörper und eine standardmäßige Immunperoxidasetechnik, welche das Chromogen AEC einsetzt, verwendet, um die runden Zielzellen leicht sichtbar zu machen. Der MHS-10-Antikörper lokalisierte in Verbindung mit diesem Verfahren Spermavorläufer, beginnend mit der Golgi- und nachfolgenden Phasen der Spermiogenese. Gefrierschnitte des humanen Testis, welche unter Verwendung dieses mAb angefärbt wurden, haben gezeigt, daß dieser gegen ein entwicklungsstadienspezifisches Antigen, (SP-10), gerichtet ist, welches auf adluminalen Keimzellen und reifen Spermien, nicht aber auf Spermatogonien erscheint. Die intraakrosomale Lage des SP-10-Antigens wie auch seine Testisspezifität wurden festgestellt. Das Antigen fehlt auf Zellen aus den Nebennieren, dem Kolon, dem Gehirn, der Haut, den Mandeln, den Lungen, der Leber, der Niere, des Eierstocks und des Endometriums, und es reagiert nicht mit Serum und peripheren Blutleukozyten. Umgekehrt reagiert der Leukozytenantikörper HLe-1, wie in der vorliegenden Untersuchung bestätigt wurde, nicht mit Keimzellen oder reifem Sperma.
Die Anwendung der MHS-10-mAb-Sonde auf Samenabstriche erlaubt den Nachweis von Spermien wie auch von unreifen Keimzellen, die vorher von dem Testis in unterschiedlichen Stadien der Spermiogenese abgestoßen wurden. Jassim und Festenstein, op. cit., haben einen polyklonalen Mäuse-anti- Humansperma-Antikörper verwendet, um runde Zellen im Samen sichtbar zu machen. Eine immunologische Identifizierung der verschiedenen Stadien der Keimzellendifferenzierung war jedoch auf dem Niveau der Lichtmikroskopie in ihrer Untersuchung nicht möglich, da der verwendete Antikörper nicht akrosomenspezifisch war und mit der Zelloberfläche von allen Keimzellen reagierte. Ihre Untersuchungen auf dem Niveau der Elektronenmikroskopie zeigten jedoch das Vorliegen von Keimzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung. Diese Autoren haben ebenfalls das Vorliegen von Keimzellen mit anomaler Morphologie (wie z. B. Zellen mit zwei Kernen) im Samen gezeigt. Die Elektronenmikroskopie war das Verfahren der Wahl, durch welches dieses gezeigt werden konnte. Das letztere Verfahren ist jedoch, obwohl es eine hohe Auflösung der morphologischen Daten liefert, zeitaufwendig und würde bei den Ausstattungen in klinischen Labors eine geringe Anwendung finden. Das Immunreagenz des monoklonalen MHS-10-Antikörpers bietet die Vorteile einer konstanten Affinität und Klasse, Gleichmäßigkeit und Verfügbarkeit in praktisch unbegrenzter Menge, was eine Diagnose der MHS-10-positiven Untergruppe von Spermatiden einen Standard der Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit verleiht, welcher früher mit den polyklonalen Immunreagenzien schwer zu erreichen war.
Die immunhistochemische Anfärbung von Samenabstrichen unter Verwendung von MHS-10 erlaubte die Identifizierung von Clustern von Tochterspermatiden, die durch intrazelluläre Brücken verbunden waren. Solche Cluster konnten ein Anzeichen für eine Störung der Zytokinese sein. Teilweise Störungen des Testis bei dem Trennungsprozeß können für das Vorliegen von Sperma mit mehreren Kernen in dem Ejakulat verantwortlich sein. Wenn Gruppen von Keimzellen, die durch intrazelluläre Brücken verbunden sind, in dem Testis keinen erhöhten Zerreißkräften ausgesetzt werden, verschwinden schrittweise die Einschnürungen zwischen diesen und eine kugelförmige mehrkernige Masse wird gebildet, welche so viele Kerne enthält, wie in dem ursprünglichen Cluster von Zellen miteinander verbunden wurden. Obwohl das genaue Stadium und der Mechanismus (die Mechanismen) der Trennung der Spermatiden zu einzelnen Spermatozoen nicht bekannt sind, erlaubt die MHS-10-Sonde eine genaue Quantifizierung solcher Zellzusammenschlüsse.
Spermatiden, welche durch intrazelluläre Brücken miteinander verbunden angetroffen werden, treten wahrscheinlicher in einer synzytischen Beziehung auf, und bei der normalen Spermatogenese wird eine Koordination der Entwicklung durch eine gleichmäßige Verteilung von chemischen Faktoren erreicht, die eine Differenzierung steuern. Somit ist nicht klar, warum Gruppen von miteinander verbundenen Spermatiden, die mit MHS-10 angefärbt wurden, in unterschiedlichen Stadien der Akrosomenbildung beobachtet wurden (Fig. 15D- E). Dym und Fawcett, Biol. Reprod. 4: 195 (1971), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, berichteten von dem Auftreten von mehreren transversalen Zisternen in den Brücken, welche beim Widder und der Ratte sich teilende Spermatogonien verbanden. Das Vorliegen dieser membranartigen Strukturen unterbrach zeitweise die Kontinuität zwischen den Zellkörpern der miteinander verbundenen Zellen, was zu einer leichten Asynchronität ihrer zellulären Entwicklung führte. Die von Membranen begrenzten Zisternen bestanden nur für eine kurze Zeit nach der Rekonstitution der Kerne der Tochterzellen, obwohl durch Scheidewände abgeteilte Brücken ebenfalls in Verbindung mit postkaryokinetischen Spermatidenkernen beobachtet wurden. Beobachtungen wie diese waren auf den Testis von Versuchstieren beschränkt und wurden nie vom menschlichem Samen berichtet. Die MHS-10-Antikörpersonde hat somit zum ersten Mal eine Dokumentation des Auftretens von asynchronen Gruppen von Spermatiden im menschlichen Samen erlaubt.
Unser Verständnis all der Faktoren, welche die Zytokinese in dem Testis steuern, und der Mechanismus, durch welchen Keimzellen entweder in Clustern oder einzeln in das Ejakulat abgegeben werden (Spermiation), wird kaum verstanden. Weitere Untersuchungen über die Bedeutung der Keimzellen im Samen müssen unternommen werden. Die MHS-10-Sonde kann sich beim Definieren des relativen Anteils von spezifischen Untergruppen von Keimzellen als nützlich erweisen, welche, bevor sie reif sind, in bestimmten Stadien ihrer Entwicklung abgegeben werden, was eine Kategorisierung ist, die helfen könnte, verschiedene Typen der testikulären Pathologie, welche der Ursache des "Rundzellen"-Syndroms zugrunde liegen, zu klären. Soderstrom und Suominen, Arch. Pathol. Lab. Med. 104: 476 (1980), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, haben durch Elektronenmikroskopieuntersuchungen an testikulären Biopsien gezeigt, daß ein Anhalten der Meiose mit einer Akkumulierung von pachytänen Spermatozyten und einem Fehlen von Spermatiden in den Tubuli seminiferi verbunden ist. Diese Zunahme würde sich wahrscheinlich in dem Samen solcher Patienten widerspiegeln, so daß die Verwendung eines stadienspezifischen mAb, welcher mit den pachytänen Spermatozyten reagiert, ein nützlicher Marker für die schnelle Identifizierung von Patienten mit einer abgebrochenen Meiose wäre. Auf demselben Weg könnte eine zelluläre Akkumulation im Samen eines spezifischen Stadiums der Spermatidenentwicklung, das durch MHS-10 identifiziert wird, Licht auf eine Pathologie werfen, die eine verminderte Fruchtbarkeit oder eine Unfruchtbarkeit von Männern mit "Rundzellen"-Syndrom bewirkt.
Zusammengefaßt, wurden mit Aceton getrocknete Abstriche von gewaschenem menschlichem Samen, welche signifikante Mengen an runden Zellen enthielten, mit dem mAb MHS-10 sondiert. Mit monoklonalem Antikörper markierte Zellen wurden durch ein standardmäßiges Streptavidin-Biotin-Immunperoxidaseverfahren sichtbar gemacht, wobei ein Lichtmikroskop verwendet wurde. Der MHS-10-mAb ging mitreifem Sperma und mit einer Untergruppe der runden Zellen, welche als sich entwickelnde Spermatiden diagnostiziert wurden, die in unterschiedlichen Stadien der Akrosomenbildung von dem Testis abgestoßen wurden, eine Immunreaktion ein. Um eine mögliche Kreuzreaktivität des mAb mit Leukozyten im Samen auszuschließen, wurde ein Leukozytenoberflächenmarker (anti-HLe-1) in Verbindung mit MHS-10 verwendet. Populationen runder Zellen, die mit MHS-10 angefärbt wurden, wurden mit anti-HLe-1 nicht angefärbt. Der IMIHS-10-mAb stellt ein einzigartiges Immunreagenz zur differentiellen Diagnose einer Untergruppe von unreifen Keimzellen während einer Samenanalyse zur Verfügung. Der mAb MHS-10 ist somit eine vielversprechende Sonde für die Identifizierung und Quantifizierung von unreifen Keimzellen im menschlichen Samen.

Zusammenfassung der experimentellen Ergebnisse

Die obigen Beispiele zeigen, daß das Humanspermaprotein, SP-10, ein Differenzierungsantigen ist, welches in runden Spermatiden in der Golgi-Phase und nachfolgenden Stufen der Spermiogenese nachgewiesen wird. SP-10 ist innerhalb des entstehenden akrosomalen Vesikels der Spermatiden lokalisiert, ist in reifem Sperma ein intra-akrosomales Protein und scheint testisspezifisch zu sein. Das Protein bleibt mit dem äquatorialen Segment und/oder den inneren akrosomalen Membranen von mit einem Ionophor induzierten Spermien, die eine Akrosomenreaktion durchlaufen haben, assoziiert.
Diese Beobachtungen haben zu dem Vorschlag geführt, daß SP-10 und sein entsprechender monoklonaler Antikörper MHS- 10 ein nützliches Marker/Sonden-System zur Verfügung stellen für: a) ein Diagnostizieren von unreifen Keimzellen im Samen; und b) ein Auswerten der Akrosomenreaktion. Weiter hin wurde SP-10 von der Projektgruppe der Weltgesundheitsorganisation über Empfängnisverhütungsimpfstoffe aufgrund seiner Gewebespezifität und dem Beweis, daß der monoklonale MHS-10-Antikörper die Befruchtung in dem Hamstereieindringtest hemmt, als ein "primärer Impfstoffkandidat" bezeichnet.
Auf Immunoblots von Humanspermaextrakten wird ein Polymorphismus der immunreaktiven SP-10-Peptide beobachtet, die von 18 bis 34 kDa reichen. Es wurde gezeigt, daß dieses Muster der Immunreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10 von Individuum zu Individuum konserviert ist und daß es durch Reduktionsmittel nicht beeinflußt wird. Western- Blots auf 2-D-Gelen haben gezeigt, daß die antigenen Peptide mit 24-34 kD einen pI von 4,9 aufweisen, wogegen die Peptide mit ungefähr 18 kD basischer sind, mit pls, die von 5,1-5,4 reichen.
cDNAs, welche für das intra-akrosomale Protein SP-10 codierten, wurden kloniert und charakterisiert. Drei überlappende SP-10-spezifische cDNAs wurden aus einer cDNA- Expressionsbibliothek des humanen Testis isoliert. Diese cDNAs hybridisierten mit einer 1,35 kb-mRNA, welche in den humanen Testes vorhanden war, nicht aber in der Leber oder Plazenta gefunden wurde. Eine vollständige Sequenzierung dieser cDNAs lieferte eine 1117 bp-Sequenz, welche einen Codierungsbereich für das SP-10-Protein von 265 Aminosäuren enthielt. SP-10 hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 28,3 kD. Hydrophobizitätsplots, welche aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz erzeugt wurden, zeigten einen sehr hydrophoben Aminoterminus, was für ein Signalpeptid charakteristisch ist. Basierend auf den früheren immunhistologischen Daten und auf der Beobachtung, daß die SP-10-cDNA-Sequenzen keine signifikante Homologie zu anderen Sequenzen zeigten, die in drei Datenbanken gefunden wurden, scheint SP-10 ein einzigartiges akrosomales Protein zu sein.
Ein rekombinantes 5P-10-Fusionsprotein wurde in einem E. coli-Expressionsvektor produziert, und dieser Prototyp eines rekombinanten Impfstoffes wurde verwendet, um in Kaninchen ein polyklonales Antiserum zu erzeugen. Dieses Kaninchenantiserum färbte die akrosomale Kappe in-situ an und reagierte mit einer ähnlichen Gruppe von Peptiden auf Western-Blots, wie es ein monoklonaler Antikörper gegen SP- 10 tat. Die Kaninchen schienen nicht unter dem Impfstoff zu leiden. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein rekombinanter SP- 10-Impfstoff in der Lage ist, in Säugetieren eine Immunreaktion hervorzurufen, welche das native Humansperma-SP-10 erkennt.

Claims

1. Im wesentlichen gereinigtes intra-akrosomales Humanspermaantigen, das nach der Akrosomenreaktion mit dem Humansperma assoziiert bleibt, wobei das im wesentlichen gereinigte Antigen mit dem monoklonalen Antikörper MHS-10, der durch die nach dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 10039 hinterlegte Hybridomzellinie exprimiert wird, zu reagieren vermag.

2. Antigen nach Anspruch 1, wobei das Antigen vor der Akrosomenreaktion mit der äußeren Fläche der inneren Akrosomenmembran und der inneren Fläche der äußeren Akrosomenmembran von reifem Humansperma assoziiert ist.

3. Antigen nach Anspruch 2, wobei das Antigen nach der Akrosomenreaktion mit der inneren Akrosomenmembran assoziiert bleibt und in dem äquatorialen Segment des Spermas festgehalten wird.

4. Antigen nach Anspruch 2, wobei das Antigen ein testisspezifisches Differenzierungsantigen, das während des Spermatogeneseprozesses entsteht, ist und in der menschlichen Bevölkerung konserviert ist.

5. Antigen nach Anspruch 3, wobei das Antigen eine Familie von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 18 bis etwa 34 Kilodalton umfaßt, wobei die Polypeptide isoelektrische Punkte im Bereich von etwa 4, 9 bis etwa 5, 4 besitzen.

6. Antigen nach Anspruch 5, das ein Fragment eines der Polypeptide enthält, wobei das Fragment in einem Men schen oder anderen Primaten eine befruchtungsverhütende Aktivität besitzt.

7. Antigen nach Anspruch 1, wobei das Antigen die in Fig. 11A dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.

8. Immunogenes Polypeptid, das von dem Antigen nach Anspruch 7 abgeleitet ist, wobei das Polypeptid bei einer Injektion in ein Säugetier eine befruchtungsverhütende Wirkung besitzt.

9. Immunogenes Polypeptid, das entweder durch die Nukleotide mit der Bezeichnung 61-855 oder 487-855 in Fig. 11A codiert wird.

10. Empfängnisverhütungsimpfstoff, der eine immunologisch wirksame Menge des Antigens nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.

11. Verfahren zur Empfängnisverhütung, welches die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge des Antigens nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger an einen weiblichen Menschen umfaßt.

12. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, die für ein Antigen gemäß der Definition in Anspruch 1 codiert.

13. DNA-Sequenz nach Anspruch 12, wobei die DNA eine cDNA ist.

14. cDNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei die Sequenz die in Fig. 11A dargestellte Nukleotidsequenz ist.

15. cDNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei die Sequenz die natürlichen, bei Individuen festgestellten Allelvariationen zeigt.

16. Isolierte oder im wesentlichen gereinigte DNA-Sequenz, die von der cDNA-Sequenz nach Anspruch 13 durch eine einzelne oder mehrfache Mutation(en) abgeleitet ist.

17. DNA-Sequenz, die mit der cDNA-Sequenz nach Anspruch 13 unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert.

18. Rekombinante DNA-Sequenz, die die DNA-Sequenz nach Anspruch 12 in operativer Verknüpfung mit geeigneten regulatorischen Steuernukleinsäuresequenzen umfaßt, die in der Lage sind, die Expression der DNA-Sequenz in transformierten Wirten zu bewirken.

19. Expressionsvektor zum Exprimieren von DNA, welche für das Antigen nach Anspruch 1 codiert, in einem kompatiblen Wirt, der einen Expressionsvektor mit der Fähigkeit zur Transformation einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle umfaßt, und wobei die DNA nach Anspruch 12 in geeigneter Orientierung und im richtigen Leseraster zur Expression in den Vektor insertiert ist.

20. Wirtszelle, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz nach Anspruch 12 transformiert ist.

21. Verfahren zur Herstellung des Antigens nach Anspruch 1, welches die folgenden Schritte umfaßt:

Kultivieren von Wirtszellen, die durch eine rekombinante DNA-Sequenz transformiert sind, die eine cDNA- Sequenz, welche für das Antigen nach Anspruch 1 codiert, in operativer Verknüpfung mit geeigneten regulatorischen Steuernukleinsäuresequenzen umfaßt, die in der Lage sind, die Expression der cDNA-Sequenz in den transformierten Zellen zu bewirken; und

Gewinnen des Polypeptids, dessen Expression durch die Sequenz codiert wurde.

22. Immunogenes Polypeptid, das ein das Antigen nach Anspruch 1 enthaltendes Fusionsprotein umfaßt.

23. Verhütungsmittel, das einen mit dem Antigen nach Anspruch 1 reaktionsfähigen monoklonalen Antikörper in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

24. Monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antikörper, der mit dem Humanspermaantigen nach Anspruch 1 reagiert.

25. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 24, wobei dem Antikörper eine Kreuzreaktivität mit im wesentlichen allen menschlichen somatischen Geweben fehlt und der Sperma-Ei-Wechselwirkungen bei dem Hamstereieindringtest hemmt.

26. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit dem Antigen nach Anspruch 1 reagiert, welches die folgenden Schritte umfaßt:

Immunisieren eines Säugetiers mit Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder mit dem Überstand, der durch Zentrifugieren von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wurde;

Gewinnen von antikörperproduzierenden Zellen aus dem Säugetier;

Fusionieren der Zellen mit Tumorzellen zur Herstellung von Hybridomen;

Screenen der Hybridome mit Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, oder dem Überstand, der durch Zentrifugieren von Humansperma, das eine Akrosomenreaktion durchlaufen hat, erhalten wurde, zur Identifizierung mindestens eines Hybridoms, das einen Antikörper produziert, der mit einem intra-akrosomalen Humanspermaantigen, das mit der inneren und äußeren Akrosomenmembran von reifem Humansperma nach der Akrosomenreaktion assoziiert ist, zu reagieren vermag; und

Gewinnen des Antikörpers aus dem identifizierten Hybridom.

27. Zusammensetzung für eine biochemische, immunologische, funktionale oder andere überprüfende Analyse von Humansperma, die eine wirksame Menge des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 24 in auf einem akzeptablen festen Träger immobilisierter Form oder im Gemisch mit einem akzeptablen Träger umfaßt.