JPH04505008A - 避妊ワクチン用ヒト精子先体内抗原 - Google Patents

避妊ワクチン用ヒト精子先体内抗原

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JPH04505008A JP2504410A JP50441090A JPH04505008A JP H04505008 A JPH04505008 A JP H04505008A JP 2504410 A JP2504410 A JP 2504410A JP 50441090 A JP50441090 A JP 50441090A JP H04505008 A JPH04505008 A JP H04505008A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 避妊ワクチン用ヒト精子先体内抗原 発明の背景 本願は、１９８９年３月３日に提出された関連出願第３１８．５５１号の一部継 続出願である。該関連出願は、本明細書内に参考文献として言及している。
本発明は、避妊用ワクチン、特に避妊用ワクチンとして用いられる光体内人体精 子抗原類、抗原に対するモノクローン及びポリクローン抗体、及び生体外での抗 原生成のためのｃＤＮＡ表現システムを含む抗体及び抗原の生成及び使用方法に 関する。
精子に対する抗体は人の不妊に影響を及ぼす。精子または成熟精巣抽出物により 動物を意図的に免疫化すると、極めて効果的に受胎が抑制される。従って、避妊 用ワクチンの免疫源として使用し得る性細胞特殊抗原をめて、精子抗原の研究が 専門家によって進められてきた。生殖体特殊抗原を識別するアプローチは、ＨＣ Ｇワクチン等他のアプローチに比べて、前受胎ワクチンであるという点で優れて いる。すなわち、初期受精卵を攻撃するよう対抗して受胎を阻止する免疫を誘起 する。
安全且つ効果的な避妊ワクチンは、極めて好ましい受胎調節方法である。なぜな ら、婦人体内に一部ワクチンを注射すれば、その受胎阻止効果は数年間も継続す るからである。しかし、比較的最近におけるバイオテクノロジー及び免疫学上の 進歩に至るまで、このような避妊用ワクチンに適した抗原は、特に人体からは極 めて小量しか識別及び純粋化することができなかった。更に、人体タンパク質は 、大部分のウィルス性またはバクテリア性タンパク質に比して生成が格段に困難 且つ高コストとなり、しかも免疫源性ではない。ハイブリドーマ及び組み換えＤ ＮＡ技術の出現により、新規なワクチンの研究及び潜在用途を目的とした、生殖 細胞の特殊抗原の＝別及びこのようなタンパク質抗原の人体形態を大量生産する ことが可能となった。
アンダーソンとアレキサングーによる「好性と不妊性Ｊ　４０：５５７−５７１ （１９８３）には、不妊用ワクチン開発のための遺伝子工学及びモノクローン抗 体工学の一般的適用について言及されている。この著作にはまた、そのようなワ クチンの候補として、精子抗原プロタミン、乳酸塩デバイドロゲナーゼＣ４（Ｌ ＤＩ−Ｃ４）　、ＲＳＡ−１、及びヒアルロニダーゼが挙げられている。著者等 は、ＬＤＨ−Ｃ４を純粋化し、アミノ酸シーケンス情報を得た旨記している。ま た、更に単クローン抗体（ＭＡＢｓ）が新たに生じたとしている。加えて、著者 は５６１頁で、（１）精子原形質膜自己抗原が不妊用抗体効果のベストターゲッ トとなったこと、及び（２）アクロシン及びヒアルロニダーゼ等の内部光体膜へ の抗体は殆どその候補となり得ないこと、を記述している。
最近数年間において、多くの異なるモノクローン抗体が人体及び他の動物精子抗 原に対して生成されてきた。例えば、本記載に参考文献として記したＬｅｅｅｔ 　ａｌ、による「ジャーナル　オブ　レブロダクテイブ　インムノロジー」４： １７３−１８１　（１９８２）には、人体精子の光体領域に存在する抗原と反応 するマウスＭＡＢｓが開示されている。これらの抗原は、明らかに精子表面に存 在しており、約１０．０００の分子重量を持つ。
他の例として、光体抗原に対してＣ１１）１と指定されたマウスＭＡＢがある。
「インターナショナル　ジャーナル　オブ　アンドクロジーＪ７：２８３−２９ ６　（１９８４）（カラジョーキ、スミネン）；「インターナショナル　ジャー ナル　オブ　アンドクロジーＪ　９：１８１−１９４　（１９８６）（カラジョ ーキ他）：　及び「インター六ンヨ六ル　ジャーナル　オブ　アンドクロジー」 １０ニア３１−７３９　（１９８７）（サロネン、カラジョーキ）１＃照。これ ら全ては、参考文献として本明細書に記載している。上記１９８４年版には、Ｃ ＩＩＨの準備、及び５０，０００分子重量の抗原と共に２４，０００−３４，０ ００分子重量の他の構成要素を明らかにしている。この抗原は、人体及び或種の 動物の精子中で発見された。この筆者等は、この抗原はアクロシンであるとの確 信を示しており、またこの抗原が光体内に存在するのか、光体膜内に存在するの かは不明だとしている。上記１９８６年版には、更に抗体及び抗原に関する情報 を記している。その筆者等は、抗体がアクロシンと反応したこと、及びアクロシ ンが光体のマトリックス内に存在することを述べている。彼らは、アクロシンの 殆ど全てが光体反応中に遊離する旨示唆している。更に、それは５０Ｋｄ抗原、 及び２４−３４Ｋｄ範囲内の幾つかの他の抗原と反応する旨記述している。最後 に、ＭＡＲは、光体反応精子のためのスクリーンを行う為に使用することができ る。１９８７年版には、Ｃ１１Ｈがゾーンフリーハムスター卵の精子侵入を禁止 することが明らかにされた実験が開示されている。
参考文献として記載した「インターナショナル　ジャーナル　オプ　アンドクロ ジーＪｌｌ：１３−２４（１９８７）（Ｈｕｎｅａｕ　ｅｔ　ａｔ、）Ｉ：は、 ａ−Ｉｓ　１１８　１Ｅ、１と指定されたマウスＭＡＢが開示されている。この ＭＡＢは、光体膜の均等領域（ｅｑｕｉｔｏｒｉａｌ　ｒｅｇｉｏｎ）内の人体 精子と反応する。この文献の図２は、ＭＡＢが外部光体膜と反応することを示し ている。対応する抗原は、５３Ｋｄに等しいかそれ以上の分子重量を有する。
このような抗体は、少なくとも理論上、避妊用ワクチンとして有用であろう生殖 細胞特殊抗原を識別、分離及び特徴化できる可能性を抱かせた。しかし、これま で尽くされた努力の結果は、その期待を裏切るものであった。
参照文献として本明細書に記載した「ジャーナル　オブ　レブロダクテイブイン ムノロジーＪ　１０：２３１−２５７　（１９８７）（アンダーソン他）には、 力な人体精子及び事大生殖細胞反応を示し、しかも多くの他の成熟組織とは交差 体精子表面抗原へ向かい、１４．０００と３０．０００との間の分子重量を持つ 試験のための必要性を強調（予告）しているのであるとの結論に至った。
少なくとも成る最近の研究は、避妊用の抗原は精子表面に現れるはずであるとい う従来の学理を反映している。本明細書に参考文献として記載したｒＮａｔｕｒ ｅＪ　３５５：５４３−５４６　Ｃｌ９８Ｂ）（ブリマコア他）の記事には、Ｐ Ｈ−２０として指定されたａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄギネア豚精子タ ンパク質が報告されている。これは、雄及び雌のギネア豚の受胎を阻止するため の免疫源として使用された。分子重量が６４．０００を持つ抗原が、ギネア豚精 子の原形質膜及び内部光体膜双方に存在していた。記事の最終バラグラフで、著 者等は抗原の高度な避妊効果は、それが精子表面に存在していること等、複数の 特殊性質に依存していると述べている。更に、ＰＨ−２０の人体作用アナログは 、効果的な避妊免疫源の候補となろうとも述べている。
ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｄｒｏ１ｏｇｙＪ９：４２（１９８８）（Ｈｅｒ ｒ他）は、ＭＢ３−１０によって識別された抗原上のデータを報告した要約であ る。特に、抗原は人体精子内の先住上構造に存在し、そのペプチドは分子重量が ２２−３８ｋＤの７ｍの主要ｉｓｏｆｏｒｍを持つ旨開示している。
ＭＳＨ−１０及びその対応抗原、人体光体精子抗原１０　（ＳＰ−１０）は、今 実質上純粋化され、本発明者等によって特徴づけられた。
本発明者等は、驚くべきことに、従来の学理に反して、光体内人体精子抗原の一 種は、ヒトの女性の避妊用ワクチンにおける免疫源として使用すると、不妊作用 を果たすことを発見した。また、発明者等は、５Ｐ−１０抗原用のｃＤＮＡコー ディングを分離した。これによってワクチンの免疫源として極めて有用な形態の 抗原を生成するために遺伝子工学方法を使用することが可能になった。
発明の要約 本発明は、避妊用ワクチンに使用される実質的に純粋化された光体内部人体精子 抗原を供給することを目的とする。本発明の他の目的は、避妊用ワクチンとして 使用される構成を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、抗原を生成するための方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、本発明の光体内部人体精子抗原と反応する単クローン 及び多クローン抗体を提供すると共に、該抗体を生成するための方法を提供する ことにある。
本発明の更に他の目的は、人体精子を検出または分離するための構成及び方法を 提供することにある。
本発明の更に他の目的は、人体精子の生化学的、免疫学的、作用的、または他の 研究分析のための方法及び構成を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、精液中の未熟生殖細胞を検出する方法を提供すると共 に、該方法の不妊研究へや応用を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、本発明の抗原のためにコードするＤＮＡ配列及び表示 ベクトルを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、抗原を生成する変換（変質）された微細組織を提供す ることにある。
本発明の更に他の目的及び利点の一部は以下に記述され、また一部はこの記述よ り自明であり、或いは本発明の実施により理解されることとなろう。本発明の目 的及び利点は、特に添付クレームに記した手段及び組み合わせによって達成され ることになる。
上記各目的を達成するために本発明は、本明細書に実施例として幅広く記載した ように、光体反応後に精子に付着して残存するほぼ純粋化された光体内人体精子 抗原を開示している。
好ましくは光体反応後に抗原は精子頭に付着して残存し、最も好ましくは光体内 膜の外面または精子の赤道セグメントに付着することが好適である。
本発明の他の実施例として、この抗原に対して実質的な同族（相同）性を示す純 粋ポリペプチドが示されている。このポリペプチドは、或いはまた変性されるこ とで、非変性ポリペプチドと比較して向上した避妊免疫源性を有することになる 。
また本明細書には、本発明に係るネイティブ抗原を生成する方法が開示されてい る。成熟人体精子が均質化され、可溶性タンパク質が抽出される。この抽出物は 、不動態化されたモノクローン抗体と接触される。該抗体は、本発明に係る抗原 から反応し、これによって抗体と抗原との不動態複合物が形成されることになる 。抗原は、その後モノクローン抗体から分離され、実質上純粋化された形態で再 生される。
また、本明細書には、人体精子からネイティブ抗原を生成するための他の方法が 記載されている。射出された精子は均質化され、可溶性タンパク質は、逆相高圧 液体クロマトグラフィーによって分離される。５Ｐ−１０ペプチドは、その後見 に準ｌ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって純粋化される。
本発明はまた、光体内部人体精子抗原へモノクローン抗体を供給するものである 。抗体は、はぼ全ての人体組織と交差反応を生じず、ハムスター卵侵入テストに おいて精子−卵子相互反応を禁止する。
単クローン抗体は、哺乳動物を光体反応人体精子または光体反応した人体精子を 遠心分離機にかけることによって得られた上清によって免疫化することによって 生成される。哺乳動物からの抗体生成細胞が得られ、これが主要細胞と融合して ハイブリドーマを生成する。ハイブリドーマは、光体反応人体精子またはこの精 子を遠心分離することによって得られた上清によってスクリーンされ、これによ って内部光体人体精子抗原と反応する抗体を生成するハイブリドーマを識別する ことができる。抗体は、その後識別されたハイブリドーマから再生される。
本発明に係る抗原の純粋化に加え、本明細書に開示された単クローン抗体は、光 体反応を受けた人体精子を検出または分離するために有用である。この抗体は、 抗体及び任意の光体反応精子が抗原−抗体複合体を形成するのに十分な条件下で 、所定時間人体精子サンプルと接触される。この複合体は、その後該サンプルか ら検出あるいは除去される。後者の場合、精子細胞は、その後複合体から分離さ れて隔離集団として再生される。
他の好適な実施例において、本発明の抗原は、変性された微細組織における抗原 を表現する表現ベクトルによって変性されたホスト細胞を培養することによって 生成される。この表現ベクトルは、適切な調節制御核酸シーケンスに抗原を作用 可能に連結するためにコードするｃＤＮＡシーケンスを含む組み換えＤＮＡシー ケンスを含む。
本明細書に組み込まれその一部を構成する添付の各図面は、本発明の実施令を描 いたものであり、本明細書と共に本発明の原理説明に使用されるものである。
図面の簡単な説明 図１＝　人体組織の精細管内の５Ｐ−１０の免疫組織化学的位置を示すものであ る。図ＩＡは、ＭＨ５〜１０モノクローン抗体（１：１０００）と反応する精細 管の断面であり、アトルミナルコンパートメント中の暗反応生成物を１８０倍で 示す。図ＩＢは、三日月形および小型粒状反応生成物（謙）が単一の精細管内に おける類似膜生殖細胞群として、７２０倍の拡大状態で観察された図である。
図ＩＣは、制御はっかねずみＩｇＧ１で処理されたＭ１繊部分が染色されていな いことを１８０倍で示したものである。
図２＝　射出された人体精子中における５Ｐ−ＩＱを配置した免疫蛍光性光マイ クロ写真である。図２Ａは、組み合わせ位相コントラスト及び蛍光像が精子頭の 全部にわたってキャップ状蛍光を示している２８７０倍の図である。図２Ｂは、 カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７との光体反応の人工誘起後の精子を示し た図である。上記写真を撮影した実験において、精子の４７．５％が完全賃光性 キャップを示し、２０．３％が微弱なキャップを示しく湾曲矢印）、２２．４％ が赤道バーを示しく直矢印）、そして９．９％が無染色のままで残った。倍率３ ３５０倍。
図３：　モノクａ−ン抗体ＭＨ５−１０及びブａティン−Ａ金との反応後におけ る人体精子の電子マイクロ写真である。金分子が光体コンパートメント中に確認 されている。先住が精子アペックスにおけるように斜めに区分けされた領域では 、金分子が２層分布を続ける。鎌は、光体膜の位置を示す。光体膜は、この非オ スミウム化物質内で輝く電子である。倍率９８３００倍。
図４：　アミドブラック（Ａ）により染色された工次元５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１ ０９６アクリルアミド）ニトロセルロースエレクトロプロット、及びＭＢ２−１ ０ｍＡｂ　（Ｂ）または制御１ｇＧ１（Ｃ）と反応した同一のニトロセルロース シート。Ｂ−メルカプトエタノール（レーン記号Ｒ−減少）を含有したまたはこ れを含まない（非減少−Ｎ）６人のドナーがらの抽出精子。各レーン毎に２５ｕ ｇのタンパク質が存在している。５Ｐ−１０免疫反応性ペプチドのパターンは、 各ドナー間及び減少−非減少抽出物間で同一である。
図５二　人体精子から抽出されたタンパク質上のＭＢ６−１０ｍＡｂを用い、銀 色に着色された２次元ゲル（Ａ）及び免疫プロット（Ｂ）。精子抽出物の鍛着Ｐ 〜１０ペプチドは、のｐｌは４，９であり、ｐｌ中の１８ｋｄスポツト範囲は５ 、　１−５．　４である。
図６：　アミドブラック（Ａ）及びＭＨＳ−１０抗体（Ｂ）により染色された１ 次元ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　（１６ｃｍ　ゲル）。レーンＩＡ及びＢは２０ｕｇの人 ン（レーン４Ｂ）と交差反応はしなかった。コントロールレーン１−４０は、他 その後０．０５ＤＡＢ及び水素ベロクシドで、それぞれ培養される。左側のレー 各レーンには、１０　ｇのプロティンが装荷される。このプロティンは、５ＤＳ −ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロースへ転送される。各レーンは、図示 のように、アミドブラック、ＭＨＳ−１０腹水の１　：　２０００希釈液、また は空（ｎｕｌｌ）腹水の１　：　２０００希釈液で染色される。腹水で培養され たレーンは、次いで０．０５％ＤＡＢ及び二酸化水素によりフォローされるＨＲ Ｐラベルされたヒツジ抗マウスＩｇＧ副抗体により培養される。
図９：　ヒト、ヒト（パビオ　バピオ、バビオ　シノセファルス　アヌビス）、 アカゲザル（マカカ　ファシクラリス）、イヌ、ネコの精巣、そして人体胎盤及 び肝臓から分離したポリＡ＋ＲＮＡのノーザンプロット。プロットは、ヒト５Ｐ −１０に対する開放読み出しフレームのＰ３２でラベルされたプローブ６２８ｂ ｐと混成される。１．３５ｋｂ　ｒＲＮＡは、ヒト、ヒト、及びアカゲザルのポ リＡ十精巣ＲＮＡ中に観察される。
図１０：　ヒトの精巣、肝臓、及び胎盤から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザン プロット分析。ｌｏｇのヒト精巣ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、２ｕｇの肝臓及び胎盤ポ リ（Ａ）＋ＲＮＡ５は、１％のフォルムアルデヒドアガローゼゲル上で電気泳動 され、バイオトレース膜へ転送され、そしてｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ６ ３４ｂｐ　５Ｐ−１０−５７ラグメントで検査される。５Ｐ−１０ｍＲＮＡは、 長さ約１．３５ｋｂである。
図１１　図１１Ａは、重複５Ｐ−１０−５及び５Ｐ−１０−１０ｃＤＮＡｓから 派生した完全ヌクレオチド及び予想プロティン配列である。プロティン配列に対 する単一文字アミノ酸コードは、ヌクレオチド配列の下方に示した。各配列対に おける頂部ラインは、図に示すように、５Ｐ−１０−５ｃＤＮＡから派生したも のであり、底部ラインは５Ｐ−１０−１０ｃＤＮＡから派生したものである。
右方へのナンバリングは、ヌクレオチド及びアミノ酸の位置を示すものである。
５Ｐ−１０−１０配列ｓｐａｎｎｉｎｇヌクレオチド５５４−６１０中の実線は 、５Ｐ−１０−１０の交互に結合した推定領域を表す。１．２、及び３の繰り返 されたモチーフは、単一、２重、及び３重の下線が引かれた配列によってそれぞ れ在０結合グリコシレージ５ンの位置は記号（＋＋十）によってアンダースコア さ一ジョンコドン５°は、ＴＥＲとして示されている。内部ＥｃｏＲ１位置は、 矢−１０−２１４ｃＤＮＡがプロット下方に示されている。ｂｐ６９５における 内レーン２であり、空腹水レーンが３である。５Ｐ−１０ポリクローン抗血清で 培７７５倍で示したのが（Ｃ）、または空腹水を１７７５倍で示したのが（Ｄ） で図１４二　図１４Ａは、免疫組織化学精細胞及び成熟精子（頂不右手側角）を 示すヒト精巣のＣｒｙｏｓｔａ’を部（ＭＨＳ−１０，ＳＢＰ、　ヘマトキシリ ン９６４倍）。図１４Ｂは、光体形成に先立つ精液中における初期段階精細胞で あは、完全免疫ａ織着色光体を示す精液スミア中の成熟精子である（ＭＨＳ−１ ０、フまたは免疫反応性物質を示す精液スミア中の精細胞を示す（ＭＨＳ−１０ 、ＳＢＰ，ヘマトキシリン　２３６８倍）。図１５Ｌは、抗−ＨＬｅ−１で染色 された精液スミア中の白血球を示す。同領域における精細胞及び成熟精子の免疫 組織着色の欠乏にも着目（抗　ＨＬ３−１、ＳＢＰ，ヘマトキシリン　８４５倍 ）。
好適な実施例の説明 以下、現時点における本発明の好適な実施例を詳細に参照してみる。次に説明す る各実施例により、本発明の原理が明らかとなろう。
本発明は、先体反応後にヒト精子に付随して残存する先体内ヒト精子抗原に関す る。先体反応に先立ち、抗原が先体内に観察される。抗原は、先体反応に先だっ て先体マトリックス内で溶解することができる。先体反応後、抗原は、精子頭状 に現れる。好適な実施例において、抗原は、非接触且つ非先体反応性精子中で内 部先体膜の外面及び外部先体膜の内面と対応し、また先体反応後はこれら各膜と 対応状懸で残存する。最も好適には、抗原は、先体反応ヒト精子中の内部先体膜 及び赤道セグメントに付随して保持される。ここで使用される用語「付随して」 またはその関連表現は、膜内へ挿入された疎水性尾との結合または静電相互反応 により緩く結合することを意味し、且つ先体反応前における先体マトリックス中 において遊離していることも含む。
本発明の抗原は、精巣特異性であり、ヒトの集団中に保持されている。これは、 精子発生中に発生する分化抗原であり、先体反応に先だって未熟ヒト精子の先体 マトリックス中に位置している。
抗原は、実質的に純粋化されることが望ましい。ここに開示に抗原に関する用語 「実質的に純粋」及び「実質的に純枠化された」及びその関連表現は、先体内ヒ ト精子抗原ではないプロテインまたはポリベブチドからフリーの抗原を意味する 。好ましい抗原即ち実質的な純粋手段の文脈においては、純粋化された抗原が７ ミノ端末アミノ酸配列によって配列された時、結果として生じる配列がｃＤＮＡ のオープン読み出しフレームから得た誘起アミノ酸配列と比較する。本発明に係 る実質上純粋な抗原は、重量で少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ま しくは９８％が純粋である。即ち、本発明に係る実質上純粋な抗原は、抗原では ないタンパク質またはポリベブチドの重量で１０％だけ、好ましくは５％だけ、 最も好ましくは２％だけを示す。この純度は、純化ｓｐ−ｉｏ抗原を含有するア ミノブラックで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定走査により、及び純 化タンパク質のＮＨ２端を配列するアミノ酸によって決定される。
特に好適な実施例において、抗原は実質上純粋化され、ソジウムドデシルサルフ ェート（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されるように、約 １１３−３４キロダルトンの分子重量を持つプロテインまたはポ゛リベブチドの 族を含む。分子重量が２４　３４ｋＤａの免疫反応性ポリペプチドは、約４．９ の等重点を持ち、一方１８ＫＤａ範囲中の免疫反応性ベブチドは、等電フォーカ スで決定されるように、５．　１−５．　４のｐｕｓを持つ。免疫反応性ペプチ ドは、単鎖として現れる。二硫化物結合が減少しても、見かけ分子重量が変化す ることはないからである。特に好適な実施例において、抗原は、ＡＴＣＣ　ＨＢ 　１００３９として指定される細胞ライン、突然変異体またはその変化体によう て生成されたモノクローン抗体と反応する。
本発明に係る抗原は、周知のタンパク質抽出技術によって、ほぼ純粋化された形 態で得られる。この技術は、本明細書に記載の発見及び技術に従って改良された 。成熟ヒト精子が収集及び均質化される。抗原を含む可溶性タンパク質が、周知 のタンパク質抽出技術によってホモジネートから抽出される。抽出物は、その後 抗原と反応するモノクローン抗体と接触する。抗体及び抗原が反応し、複合体を 形成する。通常、モノクローン抗体は固体基板への対合等によって不動態化され 、この結果抗原が抽出物から除去される。好ましくは、抗原一抗体複合物を含有 する固体基板は、その後洗浄されて他のタンパク質や汚染物が除去される。抗原 はその後周知の技術でモノクローン抗体から分離され、ほぼ純粋化した形態で再 生される。
他の実施岡では、抗原と反応するポリクローン抗体が抗原の純粋化のために使用 される。
好適な実施例では、抗原はＣｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：４４９− ４５６　（１９８２）（ｆｓｏｊ　ｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）及びＩｍｍｕｎｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　 Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（Ｔａｌｗａｒ　Ｅｄ．）（同 ）、３２３−３３３（Ｐｌａｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　１９８６）に開示 されている技術により純粋化される。これら両引例は、本明細書に参考文献とし て記した。均質化された精子抽出物は、免疫親和性クロマトグラフィーコラムを 通される。このコラムは、固体支持体上で不動態化されたセファローゼ４Ｂ等の モノクローン抗体を含む。抗原は、ｐＨを低下させることによってその後コラム から抽出される。
他の実施例において、抽出物は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） コラム中を走行する。コラムから溶解したフラクシランは再生される。種々のフ ラクシランのタンパク質要素は、２次元ゲル電気泳動によって分離される。抗原 を含む要素は、ゲル上のじみをモノクローン抗体と反応させ、免疫化学技術によ ってどの要素が抗原を含有するのか決定することによって識別される。抗原は、 その後周知の技術によってほぼ純粋化した形態で再生される。この方法は、純粋 化されたべブチドのアミノ端をミクロ配列することによって証明（確立）された ．また、アミノ酸配列は、遺伝子クローニングから誘起されたアミノ酸配列と重 畳することが示され、こうして本方法の有用性が確認された。
本発明におけるほぼ純粋化された抗原は、種々のタンパク質純粋化技術によって 更に純粋化される。タンパク質純粋化技術には、上記確認されたものや、本明細 書に参考文献として記した米国特許第４．４４６，１２２号（１９８４年５月１ 日登録：　発明者：　Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ．）に記載のものが含まれる。好まし くは、抗原は５ｌ製電気泳動または親和性純粋化によって純粋化される。
また他の実施例において、本発明の抗原は当該技術分野における専門家によって 周知の一般技術によって分離及び純粋化でき、そして本記載の発見及び技術によ って改良及び応用されることができる。このような技術としては、電気泳動、遠 心分離、ゲル濾過、沈澱、透析、クロマトグラフィ−（イオン交換クロマトグラ フィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着性親和性クロマトグラフィー、逆 相高性能液体クロマトグラフィー、及びゲル浸透性高性能液体クロマトグラフィ ー）、等電性フォ一カシング、及びこれらの変更及び組み合わせを含む）を含む 。
これらの技術の−または複数が、その物理的及び化学的特性に応じて、分子を分 離するための処理に順次使用される。これらに特性には、疎水性、電荷、結合可 能性、及び抗原の分子重量が含まれる。各技術の使用によって得られた物質の種 々のフラクシッンは、ＡＴＣＣ　ＨＢ１００３９により生成された単クローン抗 体ＭＨＳ−１０との反応性が試験される。このような活性を示すフラクションは 、その後順次の処理における次技術を受け、新たなフラクシミンが再びテストさ れる。この処理は、ＭＨＳ−１０と反応するフラクションが一個だけ残存した状 態になるまで繰り返され、、このフラクションがポリアクリルアミゲル電気泳動 を受けた時に単一バンドを生成する。
本発明の抗原は、周知のタンパク質変換技術によって変換される。これらには、 本明細書に参考文献として記された米国特許第４．３０２．３８６号（１　９　 ８　１年１１月２４日発行：　出願人：　Ｓｔｅｖｅｎｓ）に開示の技術を含む 。このような改良は、抗原の免疫遺伝性または避妊性活動を高める作用を果たし 、或いはそのような活動に対する何等の影響も持たない。例えば、若干のアミノ 酸残基が変化または除去される。或いはまた、本発明の抗原はーまたは複数のア ミノ駿配列を含む。これらの配列は、その免疫遺伝性または避妊性活動に必要と はされない。例えば、抗原の特定エピトーブ（抗原決定基）のアミノ酸配列のみ が免疫遺伝作用に必要となる場合である。必要とはされない配列は、当該技術分 野において周知の技術によって除去可能である。例えば、不必要なアミノ酸配列 は、トリブシンまたはババインまたは関連タンパク質分解酵素等の制限されたタ ンパク質分解消化によって除去される。或いはまた、ＳＰ−１０の種々の免疫遺 伝性エピトーブに対応するポリベブチドは、当該技術分野において周知の方法に よって化学的に合成することができる。これらには、本明細書に参考文献として 記した米国特許第４．２９０，９４４号（１９８１年９月２２日発行；　出願人 　ＧＯｌｄｂｅｒｇ）に記載の方法が含まれる。
このように、本発明の抗原は改良されたポリベブチドの類を含む。この類には、 合成によって派生したポリペプチドまたは抗原のフラグメントを含む。これらは 、期限、構造、避妊作用等の作用メカニズムに関し、本発明の範囲内にある共通 の要素を持つ。なぜならば、それらは、本発明の教示内容が与えられれば、当業 者によって準備できるものだからである。これには、図１１Ａの誘起アミノ酸配 列及び該配列のフラグメント及び変化体から派生したあらゆるポリペプチドが含 まれる。この配列は免疫遺伝性であり、避妊性を持つ。例えば、図１１Ａに示し た７１６１のアミノ酸（図１１Ａにおけるアミノ酸１４３−２１３）を含有する ５Ｐ−１０の−のペプチドフラグメントがＭＨＳ−１０単クローンフラグメント と反応することを我々は明らかにした。５Ｐ−１０は、ＭＨＳ−１０と反応する 他のエピトープを含む。この他のエピトープは、当業者によって決定され得る。
従って、このようなポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、本発明の範囲 内にある。更に、それらが免疫遺伝性でありヒトまたは他の霊長類や哺乳類にお ける避妊性または不妊性を持つとすれば、当業者はこのようなエピトープの改良 及び派生物を生成できるので、これらの改良及び派生は本発明の範囲内にある。
生体内抗原を確認し、特徴化し、そして純粋化するために使用される単クローン 抗体は、本発明の範囲内にある。これはほぼ純粋化された生体内ヒト精子抗原と 反応する。この抗原は、先体反応御に精子に付随した状態で残存する。好ましく は、抗体は、生体反応に先だって成熟ヒト精子の生体マトリックス中に位置し、 先体反応御に生体内部膜または赤道セグメントに付随して見いだされるヒト精子 抗原と反応する。
本発明のモノクローン抗体は、はぼ全てのヒト精子組織に対して、交差反応しな い。更に抗体は、ハムスター卵侵入試験で、精子−卵相互反応を禁止する。これ らの性質は、本発明の抗原またはその活性部は、ヒト女性に注入された後に避妊 作用を持つということを期待することができる。
特に好適な実施例において、本発明の単クローン抗体は、ハイブリドマ細胞ライ ンＡＴＣＣＨＢ　１００３９またはその突然変異体または変化体により生成され たマウス単クローン抗体の特性を持つ。ＡＴＣＣＨＢ　１００３９は、アメリカ 合衆国２０８５２メリーランド　ロックビル　バークロニン　ドライブ１２３０ １所在のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ　ｉｏ ｎ　（ＡＴＣＣ）の永久コレクシジンから得られる生物学的純粋培養であり、１ ９８９年２月２８　Ｅｌｌこ堆積された。このノ＼イブリドマによって生成され た免疫グロブリンは、１ｓｏｔｙｐｅアツセイ試薬を用いた特定酵素連結免疫吸 着アッセイにより示されるように、ＩｇＧ１　１ｓｏｔｙｐｅである。
本発明の単りａ−ン抗体は、単クローン抗体及びハイブリドーマの準備のための 周知技術の改良によって準備される。この改良は、本発明者等による次の発見を 反映している。即ち、本発明に係る避妊性抗原は、生体反応に先だって先体真ト リックス内に存在するが、これ該反応後は内部及び外部生体膜に付随して見いだ される。この知識により、従来の技術の改良が、生体反応後に内部及び外部生体 膜に付随して見いだされる避妊抗原に対する単クローン抗体を再生的に供給する ことができる。
従って、ホスト動物は、生体反応後ヒト精子または遠心分離された生体反応後の ヒト精子から得られた上清の何れかと免疫化される。第１の場合では、精子抗原 は内部生体膜に付随して残存するので、精子抗原は精子表面上に存在する。第２ の場合では、上清は高濃度の抗原を含む。というのは、それはまた抗原を含む外 部生体膜の残部を含むからである。上清もまた、溶液中に遊離した幾つかの抗原 を含む。理由は、抗原もまた生体反応に先だって生体マトリックス中の溶液中で 遊離することが示されるからである。両鍔において、ホストへ注入された物質は 濃縮された対象免疫源濃度を持つ。このように、抗体生成細胞の大フラクシ３ン が本発明の単クローン抗体を生成するものと期待される。
抗体を生成するあらゆるホストが使用され得る。従来使用されていた動物には、 兎や、ラットまたはマウス等のげっ噛動物を含む。本発明の場合では、マウスが 好適である。
一旦動物が免疫化され、抗体生成を開始するために十分な時間が経過すると、抗 体生成細胞が再生される。あらゆる抗体生成細胞を使用可能であるが、動物０臓 から得たＢ白血球が好ましい。
抗体生成細胞は腫瘍細胞と融合され、ハイブリドーマを生成する。ここでは、「 腫瘍細胞」なる用語は、ハイブリッド「不死」細胞を生成する抗体生成細胞と融 合可能な細胞を含む。即ち、実験によって連続的に成長可能な細胞である。好適 な腫瘍細胞は、変質され免疫プロプリン生成能力を喪失した抗体生成細胞である 。このような細胞には、ラット骨髄腫細胞またはマウス形質腫細胞が含まれる。
特に好ましいのは、酵素ヒポタシンークアニンフオスフオリボシルトランスフエ ラーゼ（ＨＧＲＰＴ）が欠落（不全）のマウス形質細胞腫細胞である。このトラ ンスフェラーゼは、ヒポキサジン、アミノプテリン、及びチミジンを含む媒体上 に成長した時に非融合抗体生成細胞または形質細胞腫細胞からのハイブリドマの 選択を可能にする。
抗体生成細胞及び腫瘍細胞は異なる動物種からのものを使用することに留意され なければならない。例えば、本明細書に参考文献として記したｒＳｃｉｅｎｃｅ 　２１０：　５３４　（１９８０）（筆者：　Ｎｏｗｉｎｇｋｉ　ｅｔ　ａｌ、 ）参照。
ハイブリドーマは、生体反応を受けたヒト精子または周知の免疫アッセイにおけ る遠心分離された生体反応性ヒト精子から得た上清を用いてスクリーンされる。
これによって、所望のモノクローン抗体を生成するーまたは複数のハイブリドー マが識別される。一旦単クローン抗体生成ハイブリドーマが選択されると、抗体 は周知の技術によってこのようなハイブリドーマから再生される。一般的に、− または複数の単クローン抗体生成ハイブリドーマをクローンすることが有用であ る。これによって、それを連続細胞ラインへ拡張することができる。このライン は、本発明の単クローン抗体を量産するために使用することができる。
先に述べた本発明に係る単クローン抗体生成方法は、実験室内方法である。本発 明はまた、精子抗原に対する単クローン抗体を生体上で生成する方法も含む。
このような抗体は、本発明のハイブリドーマを腹膜内で組織互換可能または免疫 抑制動物ホストへ注入することによって生成される。そのような動物ホストとし ては、例えば小咄乳動物、最も好適にはマウスである。これによってホスト中に 腹水腫が発生し１．この腫瘍がハイブリドマにより生成された単クローン抗体を 含む液体を生成する。十分な量の抗体が生成されるに十分な時間が経過した後、 二体を準備するのに特に有用である。
本発明はまた、本発明の単クローン抗体を生成するハイブリドマ及び連続細胞ラ インを含む。好ましくは、ハイブリドーマ及び細胞ラインは生体内部抗原に対す る単クローン抗体を生成する。この抗原は、生体反応後、内部及び外部生体膜中 に付随して残存する。最も好ましくは、連続細胞ラインは、ＡＴＣＣ超過Ｎｏ。
ＨＢ１００３９またはその突然変異または変化体を有するノーイプリドマ細胞ラ インの特性をもつ。本発明はまた、これらの細胞ライン内で個々の細胞を包囲す る。
当該技術分野における専門家であれば、ＡＴＣＣＨ８１００３９の突然変そのよ うなモノクローン抗体及びハイブリドーマそしてこれらを生成する細胞ラインは 、本発明の範囲内にある。特に好適な実施例において、ＡＴＣＣＨＢ１００３９ により生成されたモノクローン抗体は、そのようなモノクローン抗体−ン抗体を 生成するための方法において述べたように、ホストへ注入するための方法、また はその生成に使用されるハイブリドーマの特定タイプに拘りな（行わアンモニウ ム等のフラクション物質と混合され、これによって本発明のモノクローン抗体を 含む免疫グロブリンを沈澱させる。この沈澱は、分離され、溶液中に再懸濁され る。溶液は膜を介して透析され、これによってフラクション物質が除去され、モ ノクローン抗体を含有する透析物が生成される。この透析物は、その後プロティ ンＡセファローゼビードコラム等の親和性コラムを通過する。このコラムは洗浄 され、抗体は適切なバッファを使用してｐＨを下げることによって溶出される。
本発明はまた、ヒト光体内部精子抗原に対するポリクローン抗体をも含む。これ らの抗体は、本明細書に記載の教示内容の下に適切に改良された周知技術により 生成される。抗原の適切な量が動物ホストへ投与されることにより、免疫源応答 が生じる。抗体を生成するあらゆるホストを使用することができる。従来使用さ れてきた動物には、兎や、ラットまたはマウス等のげっ噛類動物が含まれる。
一旦動物が免疫化され、抗体生成のための十分な時間が経過すると、ポリクロー ン抗体が当該技術分野において周知の技術によって再生される。一般的方法には 、動物から血液を除去し、この血液から血清を分離する。抗原に対する抗体を含 有する血清は、抗血清として使用することができる。或いはまた、血清から抗体 を再生することもできる。親和性純粋化は、本発明のヒト精子抗原に対する純粋 化されまたはほぼ純粋化されたポリクローン抗体を再生するための好適な技術で ある。
本発明の抗原を生成するための好適な方法は、プロイカリオチック細胞を培養す ることである。このような細胞には、ＤＮＡを含有する発現ベクトルまたはビー ルスにより変換されたバクテリア、菌、または他の微生物、またはイーストまた は哺乳類細胞等のエウカリオチック細胞または細胞ラインが含まれる。このＤＮ Ａは、抗原またはその任意部分に対してコード化する。好ましくは、変換細胞は 、Ｅ、ｃｏｌｔまたはチャイニーズハムスター卵細胞ラインからの細胞である。
発現ベクトルは、抗原またはその任意部分に対してコード化するＤＮＡ配列を含 む。これら抗原またはその部分は、適切な調整制御核酸配列に機能的に結合され る。これにより、ＤＮＡ配列は、選択された変換細胞中に発現することになる。
本発明のＤＮＡは、本発明の抗原を含むポリペプチドをコード化する、分離され またはほぼ純粋化されたＤＮＡ配列（即ち、ポリデオキシリボ核酸）である。
本明細書における「分離された」なる用語及びそのバリエージジンは、ＤＮＡが 通常この抗原を伴うタンパク質をコード化するＤＮＡから分離されたものである ということを意味する。従って、本発明のＤＮＡは、このＤＮＡがプラスミド等 のバクテリアベクトル、またはバクテリオファージにより寄生されるウィルスベ クトルヘクローンされた時に抗原をコード化するＤＮＡを含むこととなる。これ らのクローンは、通常抗原を伴う他のプロティンをコード化するＤＮＡを含むク ローンから分離されたものとする。本明細書における「はぼ純粋」なる用語及び そのバリエーションは、ＤＮＡが、本発明の抗原をコード化しないＤＮＡ及びＲ ＮＡからほぼフリーであるという意味である。即ち、本発明の抗原をコード化す るＤＮＡを含有するあらゆるサンプルにおける他のＤＮＡ及びｉＮＡの約５％、 好ましくは１％のみである。好ましくは、本発明のＤＮＡは、コンプリメンタリ −ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）である。
本発明のｃＤＮＡは、周知の技術及び本明細書の開示内容を用いて、精巣ｃＤＮ Ａ発現ライブラリーから分離されたものである。本明細書に参考文献として記し たｒＳｃｉｅｎｃｅ、２４０：３２４−３２６　（１９８８）Ｊ　（筆者：　Ｃ ｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、）参照。このようなライブラリーの例としては、ｃｌｏ ｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃから市販されているｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ　ｔｅｓｔｅ ｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃＤＮＡ　ライブラリーがある。このようなライブラリ ーは、周知の免疫化学技術を用いて本発明の単クローン抗体とスクリーンされ得 る。これにより、ｃＤＮＡの識別、続いて行われる分離、純粋化、及び配列が可 能となる。５Ｐ−１０−５Ａ　ｃＤＮＡは、Ｓａｎｇｅｒ　ｄｉｄｅｏｘｙ　ｔ ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒ。
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４：５４６３−５４６７（１９７７）、本 明細書に参考文献として記載）を用いた５ｅｑｕｅｎａｓｅ　配列キット（Ｕ。
Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｔｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）により配列される。
本発明のゲノムＤＮＡは、本明細書に含まれる教示内容の下に、周知の技術を適 用することによって得られる。種々の制限酵素によって消化されるヒトゲノムＤ ＮＡを含有するプロットは、５Ｐ−１０−５ｃＤＮＡの５゛及び３′端を含むフ ラグメントで別個にプローブされた。５°　５Ｐ−１０−５プローブは、５ｋｂ の単一バンドヘハイブリダイズされ、一方３′プローブは１．５ｋＢバンドにハ イブリダイズされた。この単純なりｉｎｄｉｎｇパターンにより、５Ｐ−１０が 単一コピー遺伝子またはタンデムリピートとして配列された一以上のコピーのた めにコード化される。
ヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）は、５Ｐ−１０−５ の６３４ｂｐフラグメントとスクリーンされた。５ｘ１０５個のプラク（血小板 ）の内５個が５ｐ−ｉｏ−ｓに対する強いハイブリゼーションを示した。これら の血小板は純粋化され、また５Ｐ−１０−５の３゛端にもハイブリゼーションさ れる。これは、これらのクローンが５Ｐ−１０の全コード化領域を含むことを示 唆している。染色体位置の研究によれば、５ｐ−ｔｏの遺伝子は、染色体１１上 、おそらくは１１ｑ２バンドの領域に存在することが示されている。
本発明の特に好適な実施例において、ｃＤＮＡは約１．３５Ｋｂを含有し、図１ １Ａに示したヌクレオチド配列を含む。図１１Ａは、また本発明の特に好適な抗 原である５Ｐ−１０の予想アミノ酸配列を示している。特に好適な実施例におい て、ｃＤＮＡは、抗原のコード化のための遺伝子の２１４個のベース対フラグメ ントを含む。このフラグメントは、ＡＴＣＣＨＢ　１００３９により生成される ＶＨ５−１０モノクロ一ン抗体により認識されるエピトープを含むと考えられて いる。ＭＭＳ−１０エピトープを含むペプチドは、アミノ酸１４３からアミノ酸 ２１３へ伸長する７１個のアミノ酸から成る。このペプチドは、疎水特性ヲ持つ 複数の繰り返しモチーフを含むタンパク質の領域にわたっている。
好適な抗原のｃＤＮＡが、本明細書の開示内容の下に周知の技術によってモディ ファイされ得ることが、当業者により認識されよう。例えば、異なるコドンを、 原コドンとして同じアミノ酸に対してそのコードを交換することができる。或い はまた、交換コドンを異なるアミノ酸に対してコードするこさができる。このア ミノ酸は、抗原の不妊作用または免疫遺伝性に対して影響を及ぼさないか、また は抗原の避妊作用または免疫遺伝性を改善する。例えば、本明細書に参考文献と して記されたｒｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１９３−１２ｆＯ（ＩＬ８５）　−５ ｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎ　Ｖｉｔ ｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ’　（筆者：　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｓｈ 。
ｒ　ｔ　ｌ　ｅ）　Ｊに記載のように、突然変異誘発が行われる位置、または置 換、挿入、欠落、及び転位等の単一または複数の突然変異を生成する他の技術が 使用され得る。このような改良されたＤＮＡは、周知の技術を本明細書に記載の 技術に応用することによって得られるから、このようなりＮＡはクレーム発明の 範囲内にある。
更に、当業者であれば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーから得たＣＤＮＡ配列、また は本発明の抗原に対してコードする分離メツセンジャーＲＮＡから準備されたＣ ＤＮＡ配列が、各個体中に見いだされた天然アレイツク変化体を示す。このよう な変化体ＣＤＮＡ配列は、本明細書に記載の教示内容により得られるものである から、これらは本発明の範囲内にある。
最後に、当業者であれば、本発明のＣＤＮＡ配列（またはそのフラグメント）は 、他のＣＤＮＡ配列を得るために使用可能であることが理解される。該他のＣＤ ＮＡ配列は、当該技術分野における一般技術を用いて高厳密性の条件下で前記ｃ ＤＮＡと混成する。また、高厳密性の条件下でｃＤＮＡとハイブリダイズするあ らゆるＤＮＡを得るために使用することもできる。そのようなりＮＡには、任意 にゲノムＤＮＡが含まれる。従って、本発明のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに対して 、少なくとも７５％好ましくは９５％の相同性を示すＤＮＡを含む。この相同Ｄ ＮＡが本発明の抗原をコード化するとすれば、ゲノムＤＮＡは、図１１の抗原５ Ｐ−１０またはｃＤＮＡに対してコード化する。
本発明のＤＮＡは、本明細書の記載内容に基づいて適切に改良した周知の技術に 従って使用し、発現ベクトルを構成することができる。この発現ベクトルは、本 発明の抗原の発現及び生成のために微生物を変質させるために使用される。この ような技術には、本明細書に参考文献として記した以下の各引例に開示のものが 含まれる：　米国特許第４，４４０．８５９号（１９８４年４月３日発行；出願 人：　Ｒｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）；　同第４．５３０．９０１　（１９８５ 年７月２３日発行；　出願人：　Ｗｅｉｓｓｍａｎ）；　同第４．　５８２．　 ８００号（１９８６年４月１５日発行；　出願人：　Ｃｒｏｗｌ）；　同第４， ６７７．０６３号（１９８７年６月３０日発行：　出願人：　Ｍａｒｋ　ｅｔ　 ａ１、）；　同第４，６７８．７５１　（１９８７年７月７日発行；　発明者： 　Ｇｏｅｄｄｅｌ）；　同第４．７０４．３６２号（１９８７年１１月３日発行 ：発明者１ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、）；　同ｊ＠４，７１０．４６３号（１ ９８７年１２月１日発行；　発明者：　ＭｕｒｒｌｔＹ）；　同第４．７５７． ００６号（１９ｇ！１年７月１２日発行；　発明者：　Ｔｏｏｌｅ、Ｊｒ、、ｅ ｔ　ａｌ。
）；　同１１４，７６６．０７５号（１９８８年８月２３日発行；　発明者：　 Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）；　同第４，８１０，６４８号（１９８９年３ 月７日発行；　出願人：５ｔａｌｋｅｒ）。
本発明のＤＮＡは、適切なホストへ導入するために、幅広く種々の他のＤＮＡ配 列に結合することができる。コンパニオンＤＮＡは、ホストの性質、ホストへの ＤＮＡ導入方法、及びｅｐｉｓｏｍａｌメンテナンスまたはインチグレーシラン のいずれが望ましいか、等に依存する。
通常、ＤＮＡ　（好ましくはｃＤＮＡ）は、プラスミド等の発現ベクトルへ挿入 され、発現のための適切な方向及び正しい読み出しフレームに置かれる。必要な 場合には、ＤＮＡＨは所望のホストにより認識される、適切な転写及び翻訳調整 ｌｊＱｍヌクレオチド配列にリンクしてもよい。ただ、このような制御は、通常 は発現ベクトルにおいて可能である。その後、ベクトルは標準技術によって、ホ スト中へ導入される。一般には、あらゆるホストがベクトルによって変換される わけではない。従って、変換されたホスト細胞に対してそれを選択する必要があ る。
一旦選択技術がＤＮＡ配列を、必要な制御要素と共に発現ベクトルへ組み込むこ とを含むならば、それは、抗生物質抵抗等の変換された細胞中における選択可能 特性に対してコードする。或いはまた、そのような選択可能な特性に対する遺伝 子は、所望のホスト細胞を共変換するために使用される他のベクトル上に置かれ ることもできる。本発明における使用に好適な発現ベクトルは、ｐＷＲ５９０及 びｐＧＥＸである。
本発明の抗原またはその免疫性フラグメントは、ヒト及び他の霊長類、及び他の 哺乳類における避妊ワクチンの免疫原としての有用性を持つものと期待されてい る。このようなワクチンは、当該技術分野における当業者によって周知に技術に よって準備することができ、例えば、抗原、薬理学的に受容可能なキャリア、適 切な補助剤、及びワクチン中に伝統的に見いだされる他の物質を含む。その抗原 またはそのフラグメントの免疫学的有効量は、当該技術分野において周知の手段 によって決定される。
Ｅ、ｃｏ１目＝おけるエウカリオチックタンパク質の発現及びスケールアップの コスト効率は、これを５Ｐ−１０組み替えワクチンの初期発現のための選択モデ ルとする。Ｅ、ｃｏｌｉ中に発現する多くの低分子重量タンパク質は、これらの タンパク質が大Ｅ、ｃｏｌｔタンパク質へ融合されない限り、急速に劣化する（ 我々は、ｐＷＲ５９Ｇ発現システム（本明細書に参考文献として記載したＧｕｏ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２９　（１９８４）、２５１−２５４）を用いた。
これは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌａｃ　プロモータ及びベータガラクトシダーゼに対す るコード化配列の部分を含む。ベータガラクトシダーゼは、約５９０個のアミノ 酸をコードすることができる。この減衰されたベータ　ガラクトシダーゼに結合 された５Ｐ−１０タンパク質の注入は、ウサギに対して強力に免疫原性を発揮す ることが証明された）。好適な実施例において、５Ｐ−１０タンパク賀のための 完全オーブン読み出しフレームの部分をコード化する遺伝子は、強力プロモータ 及びバクテリア遺伝子またはその部分を含むバクテリアプラスミドに挿入される 。
５Ｐ−１０タンパク質の発現は、バクテリアタンパク質と連結して行われ、２個 のタンパク質は、アミノ酸結合を介して結合される。バクテリアの溶解（リーシ ス）及び調製　５ＤＳ−ＰＡＧＥまたは他の方法を用いた結果生じる融合タンパ ク質の純粋化が行われた後、そのような「融合タンパク質」は、バクテリアタン パク質がホストの組み替えエウカリオチック抗原に対する免疫応答性を高めるた めの補助剤として機能するという利点が得られる。
本発明の抗原はまた、光体反応後の精子を検出するための本発明のモノクローン 抗体に対する量子的アッセイに使用することもできる。純粋化された抗原は、標 準（スタンダード）またはコントロールとして使用することができる。直接的ま たは間接的免疫蛍光を、サンプル中のヒト精子が光体反応を受けた程度と相関さ せるために使用することができる。このデータは、標準曲線を発展させるために 使用可能である。これにより、サンプル中のヒト精子が光体反応を受けた程度は 、５Ｐ−１０または光体反応後の精子の培養上清から得られ、ラジオ免疫アッセ イまたは酵素結合免疫アッセイによりアッセイされた他の光体内部抗原の競合ま たは直接免疫アッセイにより決定することができる。
本発明の抗原は、抗精子抗体を検出及び測定するために使用される。抗精子抗体 の検出は、長年にわたってアッセイ方法のアレイを証明してきた。それには、精 子細胞の凝集に基づくアッセイ（Ｋｉｂｒｉｃｋ　ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡま たはＲＩＡフォーマットまたはクラス特定免疫ビードの結合を用いた精子表面（ 障害）性及び不動態化（Ｉｓｏｊｉｍａ）等が含まれる。これらのアッセイは、 細胞全体を対象としているという事実によって区別される。これまでは、単一の 分子対象抗原または該対象抗原群を使用する抗精子抗体用として広く用いられて るアッセイは存在しなかった。組み換え技術の出現により、特定の精子抗原を抗 精子抗体の測定用対象として使用できるかもしれないという可能性が開かれた。
５Ｐ−１０は、この面で作用する抗原の例である。
図１１におけるｃＤＮＡによりコード化されたポリペプチド、そのフラグメント 、改良及び派生物を含む本発明の抗原もまた、ヒトの妊娠及び不妊をよりよくた めの周知の免疫アッセイにおける試薬として使用することができる。このようも ちろん、これらに限定されることはない。このアプローチの応用例として、性的 暴行証拠における精子の確認が挙げられる。　“本発明に係るヒト精子の存在ま たは密度の決定、或いは精子評価のための構成には、そうした物質の存在検出ま たはその量の特定に有効な抗体の密度が含まれる。抗体は、ラテックス粒子、プ ラスチックビード、またはプラスチックマイクロタイタープレート等の適切なキ ャリアに混合または付着されている。それはまた、酵素または染料と接合され、 或いは放射線標識される。これは、使用されるローン抗体は、受容可能なマトリ ックスまたは混合物上に受容可能なキャリアとの分野における現在の問題点の一 つは、性的暴力犠牲者から得た他の細胞物質からの精子ＤＮＡの分離である。細 胞（バクテリア、イーストまたは頚部、肛門または口腔上皮細胞は、試料を汚染 する可能性がある。ビードに接合された本発明のモノクローン抗体またはポリク ローン抗体は、そのような混合物における精子細胞を濃縮するために使用され、 これによってヒト精子ＤＮＡを選択的に抽出する事が可能になる。
生体反応は、妊娠のための必要な前提条件である。生体反応を経た精子のみが卵 を受精させることができるのであると考えられている。本発明に係る抗原は、生 体反応後の内部生体膜上に表示されるので、抗体ビード接合は、ビードまたは適 切な細胞親和性マトリックス上へ生体反応後の精子を選択的に吸収するために使 用される。精子は、その後ビードから除去されるかビード上で用いられ、ヒト卵 と反応し受精させる。
このように、本発明は、生体反応後のヒト精子細胞を分離するための手段を提供 するものである。本発明の不動態化されたモノクローンまたはポリクローン抗態 は、所定時間にわたって抗体が精子細胞に結合して抗体精子細胞複合体を形成す るのに和分な条件下でヒト精子細胞を含むサンプルと接触状態におかれる。この 複合体は、その後サンプルから除去される。好適には、結合複合体は、洗浄され る。精子細胞は、周知の技術によってその後抗体から分離され、これによって分 離体としての精子細胞が得られる。好ましくは、抗体は、免疫ビードへ付着され る。
このようなビードは、選択された数の生体反応後の精子を不妊女性の子宮または 卵管へ導入するための乗り物として使用され得る。該女性は、排卵は正常である が、「説明のつかない不妊症」　（おそらくは免疫性）を持つと診断された女性 である。これにより、実験室の技術者は、生体上に受精能獲得を回避でき、女性 に対して生体反応後の精子の集団を与えることができる。更に、親和性ビードか ら分離された生体反応後の精子は、実験室におけるヒト卵への受精に使用するこ ともできる。
性的暴力の証拠として、若干の精子細胞が含まれることがある。これは、しばし ば証拠が体腔の乾燥スワブからの溶出液であるという事実に起因するもので、こ の結果、その尾から解離された精子頭となる。本発明のモノクローン抗体の精子 頭に対する特異性及びその多のヒト細胞タイプとの交差反応性の欠如により、精 子細胞の存在を証明するための性的暴力の証拠の分析に使用する事が可能となる 。
本発明のモノクローン抗体はまた、避妊ゲル、クリーム、または他の化合物にお ける活性成分としても有用である。ヒトまたは他の哺乳動物における避妊効果を 生成するために効果的な量が、薬理学的に受容可能なキャリアに混合または付加 される。このキャリアは１．その後避妊目的のために投与される。
本発明の技術を特定の問題または環境に応用することは、本発明の教示内容に照 らした当該技術分野における当業者の実施可能範囲内にあることが理解されなけ ればならない。本発明の生成物、その製造方法、及びその側角方法の例は、以下 の各実施例に記す。
例１ モノクローン抗体ＭＨ９−１０の準備 モノクローン抗体は、本明細書に参考文献として記したｒＮａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ 、２６６：５５０　（１９７７）Ｊ　（発明者：　Ｇａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、 ）！、−記載の方法を用いて生成される。Ｂａ１ｂ／ｃ雌マウスが、不完全なフ ロイントのアジュバント内で１ｘ１０７　スライス洗浄ヒト精子と４回にわたっ て免疫化された。
各免疫化において、各々がＯ，１ｍｌの筋肉内及び皮膚内注射が３回行われた。
精子は、血液形がＯのドナーから得た。マウスの肺臓細胞が骨髄腫瘍細胞ライン ５Ｐ２１０（ｒＮａｔｕｒｅ　２７９＋２６９（１９７８）Ｊ、筆者：　Ｓｃｈ ｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌｌ、本明細書に参考文献として記す）と融合した後、細 胞はＨＡＴ選択媒体を含む９６ウエルプレートへ分布された。ＨＡＴ選択媒体は 、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む。抗体に対してスクリ ーンする酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ウェル毎に１ｘ１０５精 子対象細胞を使用することによって、融合後１４−２１日間行われた。精子に対 して陽性結合を顕現したハイブリドマは、Ｇａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、の制限希 釈方法によって拡張されクローンされた。２５小の安定１ｎＧ分泌抗精子ハイブ リドマラインが設定された。
その後、抗体は、間接免疫蛍光によってそのヒト精子への結合性能が試験された 。射出ヒト精子上へのＭＭＳ−１０抗原の間接免疫蛍光配置が、本明細書に参考 文献として記したｒＢｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、、３２：６９５−７１１　（１９ ８５）Ｊ　（筆者：　Ｈｅｒｒ　ｅｔ　ａｌ、）の方法に従って行われた。これ らのハイブリドマの内の−であるＡＴＣＣＨＢ　１００３９は、サブクラスＩｇ Ｇ１における免疫グロブリンの抗体を生成した。これは、固定され、浸透化され たヒト精子の生体に向かう。
例２ ハムスター卵侵入試験 ＭＭＳ−１０抗体は、ヒト精子のｚｏｎａ　ｆｒｅｅノ−ムスター卵との反応を ブロックする作用を持つことが示された。本明細書に参考文献として記した「Ｊ 、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０：２３１　（１９８７）（筆者：　Ａｎ ｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａ！、）Ｊ及びｒＢｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 １５：４７１　（１９７６）（″Ｓ看者；　Ｙａｎｇｉｍａｃｈｉ　ｅｔ、ａｌ 、）参照。この試験では、ハムスター卵のｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａはプロ テアーゼとの処理によって溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｅ）され、ヒト精子はその後ｚ ｏｎａ　ｆｒｅｅ卵に付加された。精子が卵に結合し卵内に侵入する能力は、卵 細胞質的に存在する精子核を計数することによってスコアされた。この技術を用 いて、ＭＨＳ＝１０抗体は、多くの精子のハムスター卵との反応を阻止する作用 を持つことが見いだされた。
例３ ＭＭＳ−１０の純粋化 抗体は、まず次のように沈澱された。＄ｍｌｓのアイスコールド飽和硫酸アンモ ニウムをゆっくりと滴下撹拌しながら、３８０−４００ｍｇの総タンパク質を表 す１０ｍ１ｓの腹水に付加する。これが、コールド中で３時間にわたって撹拌さ れる。そして、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ中で１１０００Ｏｒｐで２０分にわ たり遠心分離する。約５ｍｌ　ｄＨ２Ｑにおいて、上滑及び再懸濁ペレットを廃 棄する。ｐＨ８，０でＰＢＳの４チエンジに対して４℃で４８時間にわたって透 析する。
タンパク質Ａコラムは、次のようにして準備された。約５０ｍ１ｓ　ＰＢＳｐＨ ８，０中で、２０分にわたって３ｇｍのタンパク質ＡセファローゼＣＬ−４Ｂ　 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を膨張する。膨張されたゲルを、テフロンサポート及び ３ウエイストツブコツクでフィツトされたディスポーザブルシリンジへ注ぐ。
全ての過剰バッファを重力によるコラムバックとして排除させる。全てのゲルが コラム中にある時、少なくとも５９ｍ１のバッファ（ＰＢＳ　ｐＨ８，０）で洗 浄する。使用可能状態となるまで、ＰＢＳ及び０．２％ソジウムアジ化物中に保 存する。
抗体は、次のようにしてタンパク質入コラム上で純粋化される。２ｍｌの透析さ れた飽和硫酸アンモニウム沈澱（４ｍｌの腹水を表す）をＰＢＳ　ｐＨ８，０中 のタンパク質セファローゼビードと混合し、４℃で一夜エンド　オーバ　エンド で撹拌する。ビードをコラムへ注ぎ、ＵＶモニタ上のベースラインがフラットに なるまで遊離物質を介してＰＢＳ　ｐＨ８，０で洗浄する。ＰＢＳ　ｐＨ５゜５ でバンブして、結合１ｇＧ１抗体を希釈する。抗体はこのｐＨでゆっくりと希釈 するので、０．６ｍｌ／ｍｉｎの低流率でコラムを介してポンプバッファする。
他の抗体のアイソタイプを含む残存結合物質のコラムを、０．８７％ＮａＣ１の ０．０１ＭシトレートバッファｐＨ３，０で清浄化する。最後に、ＰＢＳ８．０ でコラムを再平衡し、４℃で０，２％ソジウムアジ化物で保存する。典型的な純 粋化は、３８０−４００ｍｇ総タンパク質を表す１０ｍ１ｓの腹水液で開始する 。
ＳＡＳ沈澱が５ｍ１ｓｄＨ２０中に再懸濁して透析された後、総体積は約７ｒｎ ｌＳとなり、タンパク質濃度は１５ｍｇ／ｍｌとなる。
タンパク質入コラム上に純粋化された７５ｍｇの透析されたＳＡＳ沈澱中の、４ ３ｍｇがコラムに結合しないＩｇＧ以外のプロティンとなり（フラクションり、 ３２ｍｇがＩ）Ｈ５，５ＰＢＳで希釈する純粋ＩｇＧとなる（フラクションＩＩ ）。異なるサブクラスの免疫グロブリンの小量は、ｐＨ３，０シトレートでコラ ムからクリアされる（フラクションＩ　Ｉ　Ｉ）。
コラムへのフラクションＩの再ローディング及び再希釈化によっては、いかなる 付加１ｇＧも生じることはなかった。これは、コラムの結合容量が初期に７５ｍ ｇ５Ａｓ沈澱を越えるものでなかったことを示している。１０％のアクリルアミ ドゲルが、純粋化されたフラクションのアイデンティティを確認するために投与 された。開始腹水であるフラクション１、及びフラクションＩＩがらのタンパク 質１１００ｕがゲル上に投与され、Ｃｏｍａｓｇｉｅブルーによって染色された 時、２個の重チェーン及び軽チェーン抗体のみがフラクション１１中に存在し、 プロティンＡコラムに結合しなかった物質であるフラツジ」ン！中には極ゎずが または全く存在しなかった。
例４ モノクローン抗体の準備 光体反応精子の頭と反応するモノクローン抗体は、光体反応の生成物がらの光体 反応後の精子の分離から生じた上清でマウスを免疫化することによって得ること ができる。多くの方法が、光体反応ヒト精子に使用する事が可能である。これら にはイオン透過担体を用いた定温培養、フォリクラ及び卵管液、及び可溶性また はインタクトツナペルシダが含まれる。精子は、低速（５０ｘｇ）で遠心分離さ れ、これによって外部光体膜及び細胞質膜から成る可溶ハイブリッド小嚢から精 子細胞が分離される。この上清は、例１に概要を示した標準免疫化プロトコール に使用される。
例５ ＳＰ−１０の純粋化 親和性コラムは次のようにして準備された。シアノーゲンブロマイド活性化セフ ァローゼ４Ｂ（シグマケミカルカンパニー）がＭＭＳ−１０抗体用の不動悪相と して使用された。ビードを分離するため、３．Ｏｇのドライビードが１５分間に わたって１ｍＭ中に膨張され、その後同２００ｍ１中で洗浄された。膨張された 体積は約１０ｍ１である。ビードは、結合バッファ（０，ＩＭ　ＮａＨＣＯ３、 ｐＨ８，３ｗ１ｔｈ０．５ＮａＣ１）で洗浄され、速やかに接合バッファ中の３ ２ｍｇの純粋化されたＭＨＳ−１０の１５ｍ１の溶液に転送される。この混合物 は、４℃で一夜にわたり、５０ｍ１管中でエンド　オーバ　エンドに撹拌された 。
ビードは、その後１００ｍ１結合バッファであらゆる２１Ｍ物質がら開放されて 洗浄される。ビード上の非反応活性位置は、室温下で、０．１Ｍ）リス、０．　 １ＭグリシンｐＨ８，３と０．５ＭＮａＣ１を２−３時間低温培養することによ ってブロックされた。
コラムは、テフロンサポート及び３ウエイストツブコツクを持つの１２ｍ１シリ ンジ中で準備され、結合バッファで再び洗浄される。その後０．１Ｍ　アセテー トと０．５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ４，０とで交互に洗浄され、その後結合バッファが 続き、そしてアセテートバッファが行われ、そして最後に０．２％　アジ化物の ０．１Ｍ　Ｈｅｐｅａ　ｐＨ８，０で平衡化されて保存される。
ビードとは結合しなかった物質上のＢＣＡタンパク質アッセイにより、原３２ｍ ｇのうちの２ｍｇが結合しなかったことが示された。
精子は、次のようにして準備された。新鮮な射出物が１時間にわたり液化され、 その後６００ｘｇ　（重力加速度）で遠心分離して上清を廃棄することによって ヘペス　バッフｙ　ｐＨ８，０の４０ｍｌＨａｍ’　ｓ　ＦＩＧメディアで２度 洗浄された。精子ベレットは、プロテアーゼ抑制剤とともに、−８０℃で冷凍保 存された（５ｍＭ　ベンザミジン、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、２ｕｇ／ｍｌ　レウベブ チン、２　ｕｇ／ｍｌ　ペプスタチン）。
抗原の純粋化に先だって、精子ベレットが溶解され、内部でそれらが冷凍された バッファの最小体積中でダウンス均質化された。
可溶性タンパク質の抽出物は、マイクロフユージ中で１０．０００ｘｇで遠心分 離された。予備結果として、次のことが示された。即ち、抗原の生成は、１％Ｓ ＤＳにおけるベレットを再抽出し、最終ＳＤＳ濃度が０．２５％になるように初 期可溶抽出物とプーリングすることによって更に増大する。
抗原は、次のようにして親和性コラムで純粋化された。精子抽出物は、セファロ ーゼ４Ｂビードで１０ｍ１コラムを通過されるか、または４℃で一夜ビードと撹 拌されることによってビード自体に非特異的にに結合するあらゆるタンパク質を 前吸着させる。抽出物は、親和性コラムの頂部に装荷され、４℃で一夜０．６ｍ ｌ／ｍｉｎでポンピングすることによってコラムを再循環することになる。遊離 物質（フラクションＩ）は、ＵＶモニタ上のベースラインがフラットになるまで Ｏ，ＩＭへベス　バッファ　ｐ）Ｉｇ、０でコラムから洗浄される。濃縮された 抗原（フラクシヨンＩＩ）は、０．１Ｍ　グリシンバッファｐＨ２，２ｗ１ｔｈ ０．８７％ＮａＣ１でコラムからバンブされ、フラクションはベースラインが再 びフラットになるまで収集される。最後に、コラムはへベス　バッファ　ｐＨ８ で再平衡され、４℃で０．２％ソジウム　アジ化物で保存される。濃縮フラクシ ョンＩＩは、第３コラムを通過する。このコラムは、ヤギ抗マウスＩｇＧで準備 された親和性コラムである。これにより、ＭＨＳ−１０親和性コラムから解放さ れたあらゆるＭＭＳ−１０抗体が除去される。
ヤギ抗マウスＩｇＧ＠和性コラムは、上述したＭＨＳ−１０親和性コラムの場合 と全く同じ方法でＣＮＢｒ活性化セファローゼにて準備されるが、次の点に相違 を持つ。５ｍｌコラムを準備するには、１．５ｇの乾燥ビードが使用される。
それは、ヒト、ウマ、及びウシ血清タンパク質と最小交差反応性を持つ１．５ｍ ｇヤギ抗マウスＩｇＧと４℃で一夜にわたって定温培養された（ジャクソン　免 疫化学ラボラトリーズ　インコーホレイティラド）。
典型的抗原純粋化では、４０の精子サンプルが膨張され、上述のように抽出され た。総体積は７．３ｍｌで、１００ｕｌがタンパク質濃度の決定及びゲル電気泳 動のために除去された。総タンパク質は、ＢＣＡ処理によって６８ｍｇと決定さ れた。抽出物は、セファローゼ４Ｂ−２００ビードで前吸収され、その結果得ら れる体！３８ｍ１ｓがその後親和性コラムに結合されることになる。
親和性コラムに結合しなかったタンパク質は、０．１ＭＨｅｐｅｓｐＨ８，０で 希釈され、フラクションｌとして収集された。透析及び凍結乾燥後、このタンパ ク質は、１．０ｍ１ＰＢＳで再溶解され、総タンパク質は１６ｍｇに決定された 。
親和性コラムに結合しなかったタンパク質は、０．１Ｍグリシン　バッファドサ リン　ｐＨ２，２で希釈され、フラクションＩＩとして収集された。フラクショ ンＩＩの総体積は、２０ｍ１ｓであった。このフラクションの半分は、更にヤギ 抗マウスＩｇＧコラムに対して吸収され、こればよって親和性コラムから解放さ れるあらゆるマウス抗体が除去されることになる。透析及び凍結乾燥後、吸収さ れまたは吸収されなかったこの純粋化されたフラクションは、１００ｕｌＰＢＳ 中で再溶解された。フラクションの吸収された半分は、３９ｕｌのタンパク質を 含み、非吸収の半分は６４ｕｇのタンパク質を含んでいた。池の６５ｕｇのタン パク質は、コラムがヘペス　バッファ　ｐＨ８で再平衡した時に希釈されたフラ クシッンＩＩＩ中に存在する。
説明しなかった他のタンパク質は、システム及び種々のステップのいずれかで失 われたものである。このステップには、前コラムへの非特定吸収が含まれる。
この実験で計算しなかった量は、おそらくは処理手順数の増大に起因して以上に 高いようである。前コラムまたは抗マウスＩｇＧコラムを除く他の実験において は、１２の射出物から約１５０ｕｇの濃縮フラクシ岬ンＩＩ抗原の生成が一般的 である。
抗原の濃縮の段階を視覚化するには、１０％ｍｉｎｉｇｅｌが、２０ｕｇ／１ａ ｎｅの開始物質精子抽出物及び親和性コラムから収集された３フラクシヨンで通 された。ウェスタンブロッティングが行われると、コラムに結合しなかった物質 であるフラクション！中には抗原は存在しなかった。フラクションＩＩ及びワラ クシ５ン１１１双方は、抗原バンドの全アレイを明らかにした。明かにコラム自 体から解放されたマウスＩｇＧの結果である異常バンドは、フラクションＩＩ■ 及び非吸収のフラクションＩＩ中における空腹水制御プロット上に現れた。抗マ ウスＩｇＧコラムは、吸収されたフラクション中におけるこの汚染の殆どの部分 を除去した。
プロットのアミドブラック染色または濃縮フラクションＩＩのゲルの銀染色は、 一般に３０ｋＤ周辺のＭＨＳ−１０領域に２バンドの染色を明らかにし、５０ｋ Ｄ及び６６ｋＤの周囲の他のバンドを、そして７８ｋＤの周囲に極めて重いバン ドを、明らかにした。３０ｋＤよりも高いバンドは、汚染物質であると考えられ た。なぜならば、それらは非免疫反応性であったからである。
２−Ｄゲル上に分析された純粋化された５Ｐ−１０抗原は、分子重量形式が１８ −３４Ｋｄａのペプチドを表した。３４．２６．２４、及び１８Ｋｄのペプチド バンドは、その後シーケンシャル電気泳動及び電気希釈によって均質性（９〇− ９８％）にまで純粋化される。親和性コラムからの５Ｐ−１０フラクシヨンを含 むｌ０３ＤＳ　ＰＡＧＥゲルは、１次元中で電気泳動され、そして免疫反応性抗 原に対応するペプチドバンドは、免疫プロットによって確認された。５Ｐ−１０ ペプチドは、その後ゲルからストリップとして切断される。切断されたストリツ ブは、１２％ゲル中で電気泳動される。ペプチドは、純粋化のためにスキャンさ れる。ペプチドは、電気希釈によってニトロセルロース膜へ転送され、その後希 釈された接種または後段の生化学分析に供される。
例６ 逆相ＨＰＬＣによる抗原の純粋化 ヒト血清からの５Ｐ−１０の純粋化 ８−１２射出物からの血清は、それぞれが２５ｍ１のＨａｍ’　ｓ　ＦＩＱ　媒 体、ヘベス　バッファ　ｐＨ７，４で、１０分間にわたり５５０Ｘｇで２度洗浄 され、その後−２０℃で必要時まで冷凍保存される。精子は、膨張され、１−２ ｍ１の０６１％ＴＦＡ　（）リフルオロアセチック酸）中に再懸濁され、ダウン ス均質化されて可溶抗原が抽出され、１３．０００Ｘｇで２度マイクロフニージ され、その後０．２２ｕｍフィルタで濾過されて不溶性物質が除去される。５− １０ｍｇ総タンパク質を含有する可溶性抽出物は、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ｒｅｖｅ ｒａｇｅ　ｐｈａｓｅ　コラム、ｌ（１ｍｍ　ｘ　２５ｃｍ、ｐａｃｋｅｄ　ｗ ｆｔｈ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ−８，３００Ａ　ｐｏｒｅ　５ｉｚｅ、　７ｕｍ ｓｉｌｉｃａ　ｂｅａｄで、Ｇ１１ｓｏｎ　ＨＰＬＣ上にフラクショネートされ る。１．５ｍｌ／ｍｉｎの流率で、０−８０％５ｏｌｖｅｎｔ　Ｂのｇｒａｄｉ ｅｎｔが５０分にわたってｒｕｎされた。５ｏｌｖｅｎｔ　Ａはｄｉｓｔｉｌｌ ｅｄ水中で０．　１％ＴＦＡであり、５ｏｌｖｅｎｔ　Ｂは、２−プロパツール 中で０．１％ＴＦＡであった。各ピークに対応するフラクションは、２３０ｎｍ で検出され、マニュアルで収集された。
調製ゲル電気泳動 これらのフラクションは、５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ　Ｖａｃで凍結乾燥され、 Ｌａｅｍｍｌｉサンプル中で溶解され、そして１０％ポリアクリルアミドゲル上 で分離される。タンパク質は、５００ｍＡｍｐｓで４０分間にわたって電気プロ ットされる（１０ｍＭ　ＣＡＰＳ　バッファ、１０％メタノール、ｐＨ１１，０ ）。これは、第２ＰＶＤＦ膜及び第３ニトロセルロース膜でバックアップされた ＰＶＤＦ膜上に行われ、これによってＰＶＤＦを通過するタンパク質が捕捉され る。
ＰＶＤＦ膜はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーによって染色され、これによって各フラ クション中に存在するタンパク質が確認されると共に、ニトロセルロースがＭＭ Ｓ−１０抗体でプローブされ、これによってＰＶＤＦプロットから切断されるべ き抗原バンドを配列のために確認することができる。
アミノ酸配列 アミノ酸配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＶｉｒｇＬｎｉａ　Ｐｒｏｔｓ ｉｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｆａｃｉｌ ｉｔｙで行われた。Ｎ一端末アミノ酸配列は、Ａｐｐｌｆｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ　４７０　Ａ　Ｇａ、ｓ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅｒを用いて決定された。ＭＭＳ−１０免疫原の乾燥サンプルは、７５％ｆｏｒ ｍｉｃ酸中で取り出されポリブレーンで被覆されたグラスファイバフィルタへ適 用された。フィルタは乾燥され、シーケンサに適用された。エドマン　デグラデ ーションの一サイクルは、フェニルイソシオシネートなしで行われ、続いてＰＩ ＴＣが２０−３０サイクル行われた。Ｎ一端末アミノ酸の分裂は、気体相トリフ ルオロアセチック　アンハイドライドを介して達成され、この結果アニリノジア ゾリノン派生物が形成された。ＰＴＨ派生物またはＰＴＨスタンダードの混合物 は、ＩＢＭ　Ｃ１８逆相コラムを用いてＷａｔｅｒｓ　８４０　ＨＰＬＣシステ ム上で分析され、２５４及び３１３ｎｍの波長で検出される。３０ｋＤ及び１８ ｋＤ形式の２個の５Ｐ−１０ペプチドが分離され、アミノ酸マイクロ配列された 。
３０ｋＤバンドの最初の１２アミノ酸のＮ端末配列は、次のように見いだされた ：　ＸＴＶＡＥＸＴＳＧＥＸＡ、この配列は、アミノ酸番号７８で始まるｃＤＮ Ａから誘起された予想配列と揃えられる。１８ｋＤバンドの第１の７アミノ酸の Ｎ端末配列は、次のように見いだされた：　ＸＤＥＱＸＳＧ、この配列は、アミ ノ酸番号１４０で始まるｃＤＮＡｓから誘起された予想配列と揃えられる。
例７ 抗原５Ｐ−１０の特徴化 ５Ｐ−１０の生化学的及び形態学的特徴化は、酸性多形態タンパク質を示す。
このタンパク質は、ヒト集団中に保持される。発達中の精細胞の発生期光体中で 精子形成期間中に発生し、インタクト精子の光体中に位置する５Ｐ−１０はブラ ５Ｐ−１０は、このようにヒトにおける光体発達の分化記号であり、妊娠に先だ って露出された光体内部免疫原の例である。これにより、免疫避妊のポテンシャ ルターゲットが提供されることとなる。５Ｐ−１０は、避妊ワクチンに対する世 界保健機構タスクフォースによって「プライマリ　ワクチン候補」と名付けられ た。これは、その組織特異性及びＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体がハムスタ卵侵入 アッセイにおける精子／非反応を禁止するという証拠に基づく。
物質及び方法 工、ヒト精巣免疫細胞化学 精巣は、ステロイドで処置を受けていない患者から得た前立腺癌に対する選択オ ルキエトミーから得た。精巣は、０．１Ｍフォスフェート　バッファ中の２％フ ォルムアルデヒド中に固定され、パラフィン中に埋め込まれた。１０ミクロンの セクションがゼラチン被覆された顕微鏡スライド上に搭載され、エタノールのグ レーデッド　シリーズにデパラフイナイズされ、そしてフォスフェート　バッフ ァされたサリン（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中にレバイドレートされた。セクションは３０分 にわたって１０正常ヤギ血清で前処理され、ＰＢＳで３ｘ洗浄され、そして１％ 正常ヤギ血清中で３０分にわたり単クローン抗体ＶＨ５−１０または制御ＩｇＧ １の１　：　１０００希釈液で反応された。洗浄に引き続き、セクションは３０ 分間ヤギ抗抗マウスｇＧ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　 Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１：１００希釈液で処理さ れ、３度洗浄され、そして３０分間ＰＰＢＳ中１　：　２００のマウスペロキシ ダーゼ抗ペロキシダーゼで定温培養され、そしてＰＢＳ中で３度洗浄された。５ Ｐ＝１０抗原の位置を示すブラウン反応生成物は、０．０１５９６過酸化水素を 伴う０゜０５％ジアミノベンジジンでデベロップされた。
２、免疫蛍光顕微鏡 Ｍｏｔｉｌｅ　Ｓｐｅｒｍ　Ｌｉｖｅ　ｅｊａｃｕｌａｔｅｄ精子は、５％ＣＯ ２で３７℃で３．５％ＢＳＡのＲＰＭ１１６４０媒体中で１．５時間定温培養さ れた。１．５ｘ１０８精子は、ＲＰＭＩ中に希釈された１　：　１００のＭＭＳ −１０抗体と１時間にわたって、または同じ＜１：１００の制御１ｇＧ１と１時 間にわたって定温培養された。サンプルは媒体中で２ｘ洗浄され、ヤギ抗マウス ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１００希釈液と１時間にわたって反応に供された。
サンプルは、ウェットマウントとして観察された２Ｘで洗浄された。精子の内５ ０パーセントが、プライマリ抗体の付加時に運動性であり、また第２抗体付加時 の２５％そして約１０％が１０００運動性細胞をスコアするときに運動性であっ た。
Ｔｘ−１００またはメタノール透過性の効果３　ｘ　１０８精子が、２ｕＭフェ ニルメチルスルフォニルフルオライドを含有するフォスフェート　バッファ　サ リン（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で３Ｘ洗浄された。精子は、３％パラフォルムアルデヒド 中で３０分間固定された。部分が室温下で３０分にわたって０．　５％トリトン 　Ｘ１００または１００メタノールで透過化された。非透過化されたサンプルが 、ＰＢＳと処理された。２ｘ洗浄後、サンプルは１時間にわたって３７℃でＰＢ Ｓ中のＭＭＳ−１０のｌ　：　１００希釈液で培養された。その後、ヤギ抗マウ ス■ｇＧの１　：　１００希釈液によって培養された。プレバレージョンが２ｘ 洗浄され、９０％グリセロール、０．２５Ｍ）！Ｊス、ｐＨ７，５中にマウント され、そして試験された。
ＭＭＳ−１０染色及び光体反応精子をスコアするためのルーチン方法膜透過化が ５Ｐ−１０抗原を露出したという証拠（「結果」　参照）に基づき、次の標準方 法が開発された。液化精液サンプルからの精子が、０．１Ｍ　ヘペスでバッファ されたＨａｍ’５Ｆ１０媒体中で２度洗浄された。光体反応の誘起のため、精子 懸濁液は、Ｂｉｇｇｅｒｓ、Ｗｈｉｔｔｅｎ　＆　Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ　（ ＢＷＷ）媒体（Ｂｉｇｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭａｍｍ ａｌＬａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　（ｅｄ、Ｊ、Ｃ，Ｄａｎｉｅｌ）Ｉａｔ　 ｅｄ、、Ｐ、８Ｌ　（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ。
１９７１）、本明細書中に参考文献として記載）中で、３．５％ヒト血清アルブ ミン（ＨＳ　Ａ）とともに３７　Ｃで３時間にわたって受精能獲得化された。サ ンプルは、０．３％ＨＳＡを含有するＢＷＷ中の１０ｕＭカルシウムイオン透過 担体　Ａ２３１８７中で３０分にわたって光体反応された。精子は、顕微鏡スラ イド上へ細胞遠心分離され、空気乾燥され、そして室温下で４５分間にわたって ３％バラフォルムアルデヒドの数滴で固定された。スライドは１００％メタノー ルで室温下で２０分間処理され、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で１５分間ブロ ックされた。スライドは、室温下で４５分間にわたって、０．０１Ｍフォスフェ ート　緩衝溶液サリン　ｐＨ７，４，１％ＮＧＳ中で単クローン抗体ＭＨ５−１ ０の１：１００希釈液で培養された。ＰＢＳ中のフルオレセイン　イソシオシネ ート　結合ヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ）の１／１００　希釈液が、第２抗体として使用された。試料は大きく洗 浄され、そして蛍光性の消滅を防止するために付加されたオルトフェニレン　ジ アミンと共に９０％グリセロール、１０％０．１Ｍトリス、ｐＨ７，５中にウェ ットマウントされた。
３、ＥＭＭ疫細胞化学 精巣組織は、ｐＨ７，３の０．ＩＭ力ココディレート緩衝溶液中２％グルタルア ルデヒド、２％フォルムアルデヒド中に固定された。一部は、２％オスミウムテ トロクンド中でポスト固定された。組織は、アラルダイト５０２中に埋設された 。全部分は、超マイクロドーム上で切断され、その後室温下で３０分にわたって ０．　２％オブアルブミンで培養され、これによって非特異位置がブロックされ る。単クローン抗体ＭＨＳ−１０または制御ＩｇＧ１は０．　２％オブアルブミ ン中で１：５０に希釈され、そして４℃でセクションで一夜反応された。ＰＢＳ の滴のエフジースト洗浄後、各セクションはタンパク質Ａゴールドの１：２５希 釈中で２時間にわたって培養された（Ｊａｎｎｓｅｎ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）ｏ各セクシジンがその後ＰＢＳ中で洗 浄され、５％ウラニルアセテート中で１０分にわたって着色され、そしてＪ　Ｅ ＯＬ１００ＣＸ電子顕微鏡中で観察された。
４、ウェスタンプロット ドナーの精子は、Ｈａｍｓ　Ｆ−１０媒体中で洗浄され、５ｍＭベンザミジン、 １ｍＭフェニルメチル−スルフォニルフルオライド、２　ｕ　ｇ　／　ｍ　１の １ｅｕｐｅｐｔ　ｉｎ、２ｕｇ／ｍｌのペプスタチンの存在下で一８０℃で冷凍 され、膨張され、そして１％ＳＤＳ中で抽出された。一部の抽出物が、Ｂ−メル カプトエタノールの存在または欠落下で一部２ＸＬａｅｍｍｌｌ　緩衝溶液（１ ，ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ）、２２７：６ｇＧ−８５（１９７ Ｇ）、本明細書に参考文献として記載）に付加された。タンパク質は、本明細書 に参考文献として記載したＯ’　Ｆａｒｒｅｌ　Ｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、２５０：４００７−２１　（１９７５）の処理に従つて１次元及び２次元の電 気泳動によって分析された。電気トランスファは、本明細書に参考文献として添 付したＴｏｗｂｌｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７６：４３５Ｇ−５４（１９７９）に従った。ニトロセルロースは、Ｐ ＢＳｌｏ、５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％ミルク中でブロー／りされ、ＰＢＳｌｏ 、５％Ｔｗｅｅｎ２０中のＭＨＳ−１０ｍＡｂ　（１／１０００）中で一夜４℃ で培養され、ヤギ抗マウスＩｇＧペロキシダーゼが１１５００　Ｇ希釈液で使用 された。制御１ｇＧ１単クローンもまた、１／１０００で希釈された。２−Ｄゲ ル上のタンパク質スポットの銀染色は、本明細書に参考文献として記載したＷｒ ａｙ　ｅｔ　ａｌ、。
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１８：１９７−２０３　（１９８１）の処理に 従って行われた。
結果 １．５Ｐ−１０は、精子発生の分化抗原である。
５Ｐ−１０は、ヒト精巣中の精子分化の特定段階で発現するものであることが見 い出された。ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体（アイソタイプ：　ＩｇＧ１）に露出 されたパラフィンに埋設された精巣（Ｎ−３）の免疫組織化学試験により、精細 管内におけるアトルミナル精細胞及び成熟精子への結合が明かとなった（図ＩＡ 、　Ｂ）。他のＩｇＧ１単クローり抗体（図ＩＣ）で培養されたヒト精巣の制御 セクションは、免疫反応生成物を示さなかった。球形精細胞内において、免疫着 色がしばしば成長整形構造及び小降粒子中で観察された（図ＩＢ、矢印頭）。成 長整形または粒状　免疫反応パターンのいずれかを示す同じように着色された精 細胞の群が、単−精細管の断面中に観察された。この発見は、分化における幾つ かの段階中での生殖細胞は精細管の任意の断面と共存するという以前の観察と軌 を−にする。精細上皮の全領域が染色を示したわけではなかった。これは、精子 発生のいずれかの段階で５Ｐ−１０の発現が欠落したか、或いはパラフィン埋設 物質中の精細管上皮からいくつかの細胞が解離した可能性のあることを示唆して いる。基礎精製細胞、セルトリ　細胞、精母細胞、及び精巣インチルステチウム 中の細胞は免疫反応性を示さなかりた。
２．５Ｐ−１０は、インタクト精子の光体中に存在している。
免疫蛍光顕微鏡により、５Ｐ−１０はヒト精子類に配置された。ＭＨＳ−１０単 クロ一ン抗体で培養され、蛍光副次抗マウス抗体と反応した運動性で非透過性の 精子（Ｎ−１０００）は、精子の免疫蛍光性着色を示さなかった（データネ図示 ）。これは、５Ｐ−１０が検出可能レベルにおけるインタクト精子の表面細胞質 膜上に存在しなかったことを表している。スライド上で空気乾燥され、３％バラ フォルムアルデヒドで固定され、０．５％トリトンＸ−１００またはメタノール で透過化され、そして単クローン抗体及び蛍光副次抗マウス抗体と反応した精子 は、キャップ状蛍光パターンに着色した。このパターンは、周知の光体形態学と 同様であり、各サンプルにおける精子の９０％以上に発生した（図２Ａ）。これ らの結果は、膜透過化処理が、抗体結合にアクセスできる５Ｐ−１０をつくりだ したことを示している。
３．５Ｐ−１０を示した超構造配置は、光体膜と付随している。
ファイン構造研究が、５Ｐ−１０を高分解能で位置決めするために行われた。
成熟射出精子が２％バラフォルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒド中で固 定され、電子顕＠鏡のために準備され、そしてＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体及び タンパク質Ａで被覆されたｌＱｎｍ金分子でプラスチックセクシジン状に免疫ラ ベルされた。金分子の密度は、光体コンパートメント上に観察された（図３）。
光体の一部が斜めにセクションされたセクションにおいて（図３の精子アペック スにおけるように）、金分子は２層アレイ中に観察された。このことは、成熟且 つインタクト精子中において５Ｐ−１０は光体中に不均一に分布しそして内部及 び外部光体膜に付随していることを示唆している。ファイン構造レベルにおける 抗原位置の正確なａアサインメントは、これらのブレ゛バレージョンにおいては 困囃である。というのは、細胞膜を形成するオスミウムテトロキシドにおけるポ スト固定化が抗原性を破壊することが見いだされたからである。しかし、非才ス ミ化免疫標識試料をオスミ化精子と比較することにより、光体膜の位置は、図３ の矢印頭でしめされた電子１ｕｃｅｎｔ　領域に対応するように定められた。こ れにより、５Ｐ−１０は、成熟且つインタクト射出精子における光体マトリック スに近接した内部及び外部光体膜双方の面状に位置することが結論された。
４、生化学的特徴化 ５Ｐ−１０の分子特徴は、１及び２次元ゲルのウェスタンプロットによって研究 された。これらゲル状には精子ホモゲネートが電気体動された。１０％アクリル アミド、１次元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンプロット上に観察された免疫 反応性精子タンパク質のパターンにより、少なくとも１４の異なるペプチドバン ドの分解能が可能となった（図４Ｂ）。このバンドは、１Ｂ−３４ｋＤａにわた っている。ＳＤＳ及び二硫化結合減少剤であるＢ−メルカプトエタノールで処理 された精子ホモゲネートは、減少剤に露出されなかったホモゲネートと比較され た（図４Ｂ）。免疫反応性ペプチドのパターンは、Ｂ−メルカプトエタノールが 存在しているか否かにかかわりなく同一であった。このことにより、２硫化結合 の減少は、免疫反応性ペプチドの見かけ分子重量を変化させないことが示された 。
２−Ｄゲル上に電気泳動された精子ホモゲネートの銀染色は、４．　３−６．　 ５のｐＨ範囲にわたる等電点を持つ多くのタンパク質スポットを示した。ＭＨＳ −１０モノクロ一ン抗体は、見かけ分子重量が１８−３４ｋＤａにわたる一連の ペプチドスポットで免疫反応した（図５Ｂ）。見かけ分子重量が２４−３４ｋＤ ａ５、全ての個々の精巣が５Ｐ−１０タンパク質を保有する。
図４Ｂは、異なる個体から得た免疫反応性５ｐ−ｉｏは、極めて近似しているこ とを示している。任意の位置のペプチドバンドに対する抗体反応の相対強度は、 異なる各個体間で等し力じた。これは、工４の異なる免疫反応性ペプチドバンド の完全コンブリメントの各精子ホモゲネートにおいても現れた。これまでは、免 疫蛍光性またはウェスタンプロット（Ｎ−５０）の何れかを用いた精子サンプル 試験で、ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体と反応しないものはなかった。これは、５ Ｐ−１０がヒト集団中に高い割合で保有されていることを示している。
６、光体反応後、５Ｐ−１０は精子類に付随して残存する。
生体マトリックスのある構成要素は、外部生体膜が精子ブラスマ膜と融合した時 に、生体反応期間中に先体から核酸することが周知である。図２Ｂは、ＭＨＳ− １０単クロ一ン抗体が精子サンプルと反応した時に得た免疫蛍光性染色パターン を示したものである。精子サンプルは、カルシウム　イオン透過担体　Ａ２３１ ８７で処理されている。該１２３１８７は、精子の内の幾つかを誘起して生体反 応を受けさせる。イオン透過処理された集団は、赤道バー（図２Ｂ、薄矢印頭） を示す増大した数の精子、及びフェイントキャップのみ、または赤道バー双方の いずれかを表す精子（図２Ｂ、厚矢印頭）を含む。
これらの光顕微鏡結果は、５Ｐ−１０は部分的に生体反応後の精子頭に付随して 残存することを示した。フェイントキャップは、５Ｐ−１０が内部生体膜上に存 続することを示唆した。内部生体膜は、生体反応後に精子頭において露出する。
一方、蛍光性赤道バーは、５Ｐ−１０が精子の赤道セグメントに付随して保持さ れることを示した。
議論 ＭＭＳ−１０クロ一ン抗体が球形精細胞及び精巣部における精子発生の次段階と のみ反応し、２Ｍレベルにおける生体内に位置するという観察は、体組織がＭＨ Ｓ−１０モノクロ一ン抗体とは非反応性であるというリポート（Ａｎｄｅｒｓｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１０：２３１−５７ （１９８７）、本明細書に参考文献として記載）と結びついて、共に５Ｐ−１０ は「分化抗原」であると分類できるかもしれないことを示している。即ち、ヒト 精子発生の正確な段階で発現した組織特定細胞であるということである。ＭＨＳ −１０免疫反応生成物は、球形精細胞の核に近接した小卵粒子として、精細管上 及中に明かに存在している。この着色は、５Ｐ−１０が検出可能な精子発生の最 初期段階を示すものであり、発生初期生体小嚢及び／または周辺核ゴルジ領域に 対応しているように思われる。このように、ＭＨＳ−１０モノクロ一ン抗体は、 ヒトにおける生体発達の有用なマーカを提供するものである。この抗体プローブ の臨床的応用の一例として、いわゆる「球形細胞症候群」を持つ精液サンプルに おける未成熟生殖細胞（ゴルジ相精細胞　及び以下の段階）の事例の診断におけ る応用が挙げられる。本明細書に参考文献として記したＪａｓｓｉｍ　ａｎｄＦ ｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１：　７７− ８９（１９８７）参照。
生殖細胞分化中においてその段階特定発現に結びついた体組織における交差反応 の欠如は、また、５Ｐ−１０の避妊ワクチン免疫原としての有用性に対して密接 な関係がある。もし共通体抗原がワクチン免疫原として使用された時に予測され ることになる、自己免疫の潜在的問題は、５ｐ−ｉｏに関しては見いだされなら れたドナーからの精子の９０％またはそれ以上の精子中における先体を全て包囲 するように現れるキャップ状免疫蛍光パターン中に配置されることが示された。
ＭＨＳ−１０抗体が、生体精子のプラスマレンマ上のその同族抗原を認識すると いう証拠はなかった。ＷＨＯワークショップ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 。
ｏｐ、ｃｔｔ、１９８７．　ｐ、２４９）の報告は、ＭＨ３＝１０抗体（Ｓ　２ ０）がｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　、、、ｗｉｔｈ　ａｂｕｎｄａｎｔ　５ｕｒｆ ａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｎ　ｍａｔｕｒｅ　ｓｐｅｒｍＪであることを示 したと結論している。本願における報告は、このＷＨＯのリポートの結論とはこ となり、集団から得た生体インタクト精子はわずかな光体反応後精子しか含有し ていない。
我々の結果では、イオン透過誘起生体反応後に蛍光性バーまたは蛍光性バーとフ ェインタ蛍光性キャップ双方を表す精子の数が増加していることが示されている 。我々は、減少したキャップ（フェイントキャップ）の免疫蛍光性は、生体反応 後に５Ｐ−１０はおそらくは内部生体膜に付随して精子膜上に表示残存すること を示しているのであると理解している。生体反応後にベルト上バー中に免疫蛍光 性が保持されているということは、赤道セグメント内に５Ｐ−１０が保持されて いることを表していると思われる。赤道バー免疫蛍光性は、蛍光性キャップより ははるかに小さな領域をカバーしているだけだが、完全キャップパターンと同等 の強度を示す。このことは、赤道セグメント内での５ｐ−ｉｏの量は生体反応の 前後でほぼ同じであることを示している。免疫蛍光性データは、５Ｐ−１０が内 部及び／または外部生体膜及び赤道セグメントまたはおそらくは生体反応後のこ れらサブドメインの全てに対して配置された状態に置かれているか、あるいは再 分布して赤道セグメント上方に位置するブラスマ膜を含むが、を決定するには十 分な解像度ではなかった。
ＷＨＯ後援のマルチセンター研究では、ＭＨＳ−１０抗体（Ｓ２０）がハムスタ 卵侵入試験における精子−卵相互反応を禁止するという証拠が提示された。この 結果を説明する我々のモデルは、インタクトな非生体反応精子における生体膜の 限界内にシーケンスターされているが、５Ｐ−１０抗原は生体反応後にＭＨＳ− １０抗体の作用にアクセス可能であるということを仮定している。
避妊ワクチン開発のための適切な精子免疫原の選択に関する共通推測は、対象分 子は体液または細胞免疫エフェクタにアクセス可能な表面要素であるべきだとい うことである。成熟且つ非生体反応精子中における５Ｐ−１０ペプチドの生体内 位置は一見この予告記載を満たしているとは思えないが、生体反応を伴う精子頭 膜の再モデリングは、次のような可能性を開いている。即ち、クラスとして先体 の構成物質はインタクト精子における免疫システムからシーケンスターされたが 、その生体反応後のフェートの検査なしに避妊ワクチン候補として却下されるべ きではないということである。
ギニア豚を用いた研究では、純粋化された精子タンパク質であるＰＨ−２０で雌 性動物を免疫化することにより、完全であるが可逆性避妊を達成できるという驚 異的証拠が提示された。本明細書に参考文献として記したＰｒｉｍａｋｏｆｆｅ ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：５４３−４６　（１９８８）参照。δ４、 ＯＯＯダルトンのこの分子が、ブラスマ膜に、そして生体反応後にはギニア豚精 子の内部生体膜部内に、それぞれ存在する。本明細書に参考文献として記載した 、ＰｒＬｍａｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、１０１：２ ２３９（１９８５）；　Ｍｙｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 。
９９：１５３４　（１９８４）；　Ｃｏｗａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ、、９９：１６３４　（１９８４）；　Ｃｏｗａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ 、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、１０３：１２８９　（１９８６）；　及びＰｒｉｍａ ｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｆｏｌ、Ｒｅｐｒｏ、、３１ｉ９２Ｉ　Ｃ１９８８ ）参照。
ＰＨ−２０は、精子中でシナベルシダに結合するという役割をはだし、生体反応 中はプロテオリシスを受ける。しかし、ギニア豚精子からのＰＨ−２０タンパク 質に対する抗血清は、ヒト精子とは交差反応しない（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ、ｐｅ ｒｓｏｎａｌ　ｃｏｍｍｕｎｌｃａｔｉｏｎＬ　５Ｐ−１０及びＰＨ−２０は、 ａｐｐａｒｅｎｔ重量及び免疫反応性の考慮に基づくことになる分子として現れ るが、これらは生体反応に引き続いて精子頭上の存続の特性を共有する。ギニア 豚中の避妊効果を発現するＰＨ２０の驚異的な効果は、ヒト５Ｐ−１０に対する 同様の避妊可能性を示している。
単クローン抗体及びレクチンプローブとともにマルチダイ技術を含む種々の方法 が生体反応をスコアするために使用されてきた。本明細書に参考文献として記し たＬｅｅ　ｅｔ　ａｔ、、Ｆｅｒｔｉｌ、５ｔｅｒｉ１．．４８：６４９−５８ 　（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＢＬｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、、４ ０：５２５−３０（１９８９）；　Ｃｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＧａｍｅｔｅＲ ｅｓ、、１５：２１３−２６　（１９８６）；　及びＷｏｌｆ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏ、、３２：１１５７−６２　（１９８５）参照。ＭＨＳ− １０単クロ一ン抗体は生体内部抗原へ向かい、該抗原は生体反応中にキャップ状 免疫蛍光性パターンからフェイントキャップ及び／またはバーに変化するので、 これは生体状態を検査するための臨床的有用性も持つ。
我々は、個体間において、ウェスタンプロット上の５Ｐ−１０の免疫反応性形式 及び各個体の精子上における一貫した免疫蛍光性位置において高度な近似性が存 在することを観察した。これは、５Ｐ−１０がヒト集団中で保持されていること を示している。この知識は、避妊ワクチン分子を選択する際に極めて重要なこと である。というのは、それはワクチンが最大幅の可能効果を奏するために、全部 とはいかなくても殆どの精子中に存在しなければ成らないものだからである。
ウェスタンブロッティングにより確認される５Ｐ−１０ペプチドのマルチ形態は 、翻訳後変更、生体中におけるタンパク質のプロテオリチック処理、マルチ遺伝 子生成物、または協働するこれらのいくつかの可能性を表す。ウェスタンプロッ ト上の個体間における高度な近似性は、抗原性ペプチドに多形態を生成するよう 作用しているのがこれらの選択枝のどれであろうとも、メカニズムは異なる個体 間で同様に作用していることを示唆している。減少が免疫反応性５Ｐ−１０ペプ チドのパターンを変えなかったという事実は、５Ｐ−１０中におけるインターチ ェーンの欠如、及びチェーン内二硫化結合がわずかまたは皆無であることを示唆 している。
インタクト且つ射出されたヒト精子における電子顕微鏡的位置は、５Ｐ−１０が 光体マトリックス内で非対称に配置されていることを示している。５Ｐ−１０は 、多くの精子において、光体マトリックスに近接した内部及び外部双方の光体膜 の面に付随している。５Ｐ−１０の多形態はアミノ酸配列レベルでは完全に理解 することができず、また５Ｐ−１０ポリペプチドに対する機能は未だ決定されて いないので、それらのワクチン免疫原としての可能性とは別に、５Ｐ−１０の見 かけ非対称の意義の理解に関しては、一般的な意味でしか議論できない。インタ クト且つ光体反応後の精子における光体マトリックス及び光体膜内での種々の分 子の空間構造の知識は、現在では未だその幼児期にあるといえる。証拠は、５Ｐ −１０がヒト精子におけるそのような光体「ラミナ」の構成要素であることを示 唆している。更に、先住マトリックス中におけるその非対称分布は、分子が、光 体膜内へ直接挿入する疎水性領域を含有していることを示している。
要約すれば、１次元または２次元免疫プロットにより、我々は射出ヒト精子から 抽出された５Ｐ−１０が、１ｇ−３４ｋＤａの免疫原性ペプチドの多形態を示す ことを明らかにした。そのパターンは、各個体内で保有され、媒体を減少させる ことによって変化しない。抗原性ペプチドの大部分は、約４．９の等電点を持つ 。ｔｅｓｔｉｓセクションにおける免疫化学は、精細管上皮のアトルミナルコン パートメント中の球形精細胞及び精子に位置している。免疫蛍光的には、５Ｐ− １０は光体インタクト射出精子の表面に付随していないことが示された。光及び 電子顕微鏡免疫化学は、５Ｐ−１０を光体をとおって配置し、ＥＭ証拠は２層ア レイが、外部光体膜の内部態様及び内部光体膜の外部態様に付随することを明ら かにした。イオン透過担体Ａ２３２１８７による光体反応誘起後、５Ｐ−１０は 内部光体膜及び赤道セグメントに付随して精子頭上に表示されて残存した。この 結果、ＭＨＳ−１０他クローンこう体はヒトにおける光体発達のマーカとして、 及び光体状態を評価するためのプローブとして、使用可能であることが示された 。
また、上記結果により、抗５Ｐ−１０単クローン抗体による精子−卵相互作用の 禁止は、光体反応御の抗原露出の結果発生するものであるという仮説が裏付けら れた。
精巣特異性及び５Ｐ−１０の段階特異発現、そのヒト集団中における保有、ＭＨ Ｓ−１０単クローンのハムスタ卵試験における受胎阻止能力、そして５Ｐ−１０ は光体反応御は精子頭に付随して残存することを示唆した予備証拠は、このヒト 精子分子が避妊ワクチンとして有用であることを示唆している。
例８ 霊長類及び豚におけるヒト光体抗原５Ｐ−１０の確認５Ｐ−１０の光体内部配置 は、分子機能に関するスベキュレーションを導いた。
アクロシン（本明細書に参考文献として記したＰｏ１ａｋｏｓｋｉ　ａｎｄ　Ｐ ａｒｒｉｓｈ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５２：１ｇ８ｇ−９４（１９７７ ）及びスペルミノーゲン（本明細書に参考文献として記したＳｉｅｇｅｌ　ｅｔ ａｔ、、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、、３６：１０６３−６８　（１９８８）のベ ータ及びガンマ形態の見かけ分子重量は、５Ｐ−１０の見かけ質量とオーバラッ プしている。このため、５Ｐ−１０とこれら２個の上述した光体内部分子との間 に類似性の問題が生じることになる。この研究においては、我々は、ブタアクロ シン及びスペルミノーゲン（ｇｉｆｔｓ　ｏｆ　Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｐｏ１ａｋｏ ｓｋｉ）の純粋化プレバレージョンを用いた。これにより、５Ｐ−１０はブタ中 に存在しているが、アクロシン及びスペルミノーゲンとは異なるものであること が証明された。
５Ｐ−１０は当初ヒト精子抗原として特定されたので、この分子の他の種におけ る識別ｎは、５Ｐ−１０−基礎避妊ワクチンの抗受胎能力を試験するためのモデ ルを確率することになる。ウェスタン及びノーザンプロットを用い、我々は霊長 類及びブタは５Ｐ−１０の研究のための潜在動物モデルであることを明かにした 。
物質及び方法 １、精子抽出 ヒト精子　ドナー射出物から得た精子は、Ｂａｍ’５Ｆ−１０媒体中で洗浄さｔ Ｌ、５ｍＭベンザミジン、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、２ ｕｇ／ｍｌレウペプチン、及び２ｕｇ／ｍｌペプスタチンの存在下で一８０℃で 冷凍される。１％ＳＤＳを膨張し抽出した後、抽出物の一部が、Ｂ−メルカプト エタノールの存在下または非存在下で一部の２Ｘ　１４ｅｍｍｌｉ緩衝溶液（Ｌ ａｅｍｍｌｉ　ｏｐ、ｃｔｔ、へ付加された。
霊長類精子　精子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒ ｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒにおいて、Ｍａｃａｃａ　ｍ ｕｌａｔｔａ、Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、及びＰａｐｉｏ　ｃ ｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｎｕｂｉｓのｃａｕｄａ　ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅ Ｓの犠牲によって得た。ｃａｕｄａｅは、１０ｍ１のヒトＴｕｂａｌ　Ｆｌｕｉ ｄ　（Ｉｒｖｉｎ’ｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）に置かれ た。
そして、精子がエスケープできるように小片にｍ１ｎｃｅされ、１５分間３７℃ で培養された。この結果得られた懸濁液は５分間にわたって１５ｍ１の円錐遠心 分離用管に配置され、これによって組織堆積物が確立される。精子を含む上滑は 、デカントされ、１．０００ｘｇで遠心分離された。ベレットは、Ｂ−メルカプ トエタノールなしの５００ｕｌのＬａｅｍｍｌＬ緩衝溶液中で懸濁され、そして 後の出荷のために速やかに冷凍される。受は取られたサンプルは、Ｂ−メルカプ トエタノールを含有した４ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝溶液中で２：１に希釈された 。
他種の精子、ウサギ精子は人口膣を介して得られ、Ｅｕｇｅｎｅ　０１ｉｐｈａ ｎｔのラボラトリ−からのギフトであった。電気射出により得たＢｕｌｌ精子も また、Ｄｒ、０１ｉｐｈａｎｔのラボラトリ−からのギフトであった。ネズミ、 ブタ、及びギニアブタ精子は、先に概要を述べたようにこれら種のｃａｕｄａｅ ｐｉｄｉｄｙｍｉｄｅｓから得られる。ただし、収集後の遠心分離に引き続き、 これらの精子プレパレーシッンが速やかに、１０８精子毎に１ｍｌの１％ＳＤＳ 及び１％のＢ−メルカプトエタノールで抽出される。
タンパク質決定は、本明細書に参考文献として記載したＴａｎ、Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、８６：３２７−３３１　（１９７８）の方法で行われた。レーン 毎に、ｌＯｕｇの精子抽出物と共にゲルが装荷された。
２、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ 精子抽出物は、１０％ＰＡＧＥ−５ＤＳゲル上で電気泳動され、そしてＴｏｗｂ ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｏｐ、ｃｉｔ、の方法に従って、１２時間にわたって１０ ０ｍＡｍｐｓでｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒされる。ニトロセルロースは、 ５％ミルク、２，５％　Ｔｗｅｅｎ−２０；　１％ＢＳＡ、０．５％ヤギ血清及 び０．１５％ゼラチン（ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液）中で３０分間にわたって室温下 でブロックされた。ニトロセルロースストリップは、ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ｉ ｎｃｕｂａｔｉｏｎ　溶液）の１１５希釈液中で、ＭＨＳ−１０ｍＡｂ　（１／ １０００または１／２０００）または制御ＩｇＧ１　（１／１００Ｇ）中で１ｎ ｃｕｂａｔｅされる。Ｌｎｃｕｂａｔ　ｔｏｎ溶液中における３Ｘ洗浄の後、副 次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ−ベロキシダーゼが、１／１０，０００の希釈 でプロット上に室温下で２時間にわたって使用された。ｂｌｏｔｔ＋は、その後 ＰＨ５中で３Ｘ洗浄され、０．０５％ＤＡＢ及び０．０１％Ｈ２Ｏ２でｄｅＶｅ ｌｏｐされた。
３、Ｎｏｔｈｅｒｎ　Ｂ１ｏｔｓ ラベルされたプローブ　５Ｐ−１０に対するオープンリーディングフレームは、 まずｔｅｓｔｉｓ発現ライブラリーをＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体でスクリーン してヒトｔｅｓｔｉｓからクローンされた２個のオーバラップｃＤＮＡを組み立 てることによって決定された。例９参照。オープンリーディングフレームは、２ ６５のアミノ酸をコード化した７９５のヌクレオチドから成る。内部ＥｃｏＲ１ 位置に起因して生成された５Ｐ−１０に対するオープンリーディングフレームの ６３４ｂｐから成るフラグメントは、Ｐ３２ｄｃＴＰでｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌ ａｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、ＲｏｃｋｖＬｌｌｅ 。
ＭＤ）され、そしてＮｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上のｐｏｌｙ　Ａ＋　ＲＮＡを プローブするために使用された。
精巣ＲＮＡ　ヒトｔｅｓｔｅｓは、前立腺癌治療のために外科ｏｒｃｈＬｅｃｔ ｏｍｙを受けた患者から得た。Ｂａｂｏｃ＋１（Ｐａｐｉｏ　ｐａｐｉｏ、及び Ｐａｐｉｏ　ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｕｂｔｓ）及びｒｈｅｓｕｓ　（Ｍ ａｃａｃａ　ｆａｓｃＬｃｕｌａｒｉｓ）ｔｅｓｔｅｓは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒから冷凍したものを得た。Ｐｏ１ｙ　Ａ＋　ＲＮＡが、 ０１ｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｔｙｐｅ３（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてこれら 組織から分離された。１マイクログラムのヒトｔｅｓｔｅｓ、２ｕｇのヒト肝臓 及び胎盤、そしてＩＱｕｇのｂａｂｏｏｎ、ｒｈｅｓｕｓ、ｄｏｇ、及びネコｔ ｅｓｔｉｓ　ｐｏｌｙ　Ａ＋　ＲＮＡは、１％ｆ　ｏ　ｒｍａ　ｌ　ｄｅｈｙｄ ｅ−ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ上で電気泳動された。これらは、本明細書に参考文 献として記したＬｅｈｒａｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６：４７ ４３−５１（１９７７）及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７７：５７９４−９８　（１９８０）の開示に従って行われた。最終膜 洗浄は、０．１　Ｘ　５ＳＰＥ、０．５％　ＳＤＳで６５　Ｃで行ｂｈｔ：、。
結果 ｂｏａ　ｒ精子から抽出されたタンパク質の免疫ｂｌｏｔｓは、ＭＨＳ−１０単 クロ一ン抗体がこの種牛に幾つかの精子タンパク質を認識したことを示した（図 ６、レーン２Ｂ）、３４ｋＤａ、２９ｋＤａのペプチド及び幾っがのｆａｉｎｔ ｅｒ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　バンドは、ＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体によ ってｂｏａ　ｒ精子及びヒト精子双方において認識された。興味深いことに、ｂ 。
８「精子たんばく質抽出物の免疫ｂｌｏｔｓは、２９ｋＤａ以下のペプチドの幾 つかを示さなかった。このことは、ヒト精子抽出物の免疫ｂｌｏｔにおいて明が となった。
以前の研究では、ｂｏａ　ｒ光体タンパク質ａｃｒｏｓ　１ｎＳＰｏｌａｋｏｓ ｋｉ及びＰａｒｒｉｓｈ、ｏｐ、ｃｉｔ、、及びｓｐｅｒｍｉｎｏｇｅｎｓ　Ｓ ｉｅｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ｏｐ、ｃｉｔ、の純粋化が報告されている。Ｄｒ、 Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｐｏ１ａｋｏｓｋｉの御厚意により提供して頂いた純粋化され たｂｏａｒ　ｇｐｅｒｍｉｎｏｇｅｎ及びｂｏａｒ　ａｃｒｏｓｉｎにより、我 々はＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体がこれらの以前に記述されている生体マトリッ クス構成物と交差反応するかどうかを尋ねることが可能となった。図６より明か なように、ｂｏａ　ｒ精子抽出物（レーン２Ｂ）は明らかに免疫反応性タンパク 質を含有していたが、純粋化されたｓｐｅｒｍｉｎｏｇｅｎ及びａｃｒｏｓｉｎ 　Ｉａ１１ｅｓ３＋４の単一バンドは、ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体とは反応し なかった。
加えて、ａｃｒｏｓｉｎの純粋化されたｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎは、５ｐ−ｉ。
よりも極めて高いａｐｐａｒｅｎｔ分子重量を保有していた。ｓｐｅｒｍｉｎ。
ｇｅｎの純粋化されたｐｐｒｅｐａｒａｔ　ｔｏｎは２９ｋＤにおける５Ｐ−１ ０の主要免疫反応性ペプチドと同様のａｐｐａｒｅｎｔ分子重量であったが、Ｍ ＨＳ二１０単クローン抗体は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ上のｓｐｅｒｍｉｎｏ ｇｅｎタンパク質バンドを認識しなかった。
ｂｕｌｌ、ラット、及びウサギを含む数種の精子抽出物のＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ ｏｔｔｉｎｇでは、単クローン抗体ＭＭＳ−１０（図７）と免疫反応するタンパ ク質の存在は示されなかった。図７に示された種に加えて、ギニアブタ及びネコ の精子抽出物は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上のＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体 とは反応性をもたないことが観察された。
ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体と免疫反応性を持つペプチドは、Ｐａｐｉｏ　ｃｙ ｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｎｕｂｉｓ、Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ、及びＭ ａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの精子抽出物を含むＷｅｓｔｅｒｎｂｌ ｏｔ上で検出された（図８）。これらの霊長類の各々は、ヒト精子抽出物上で観 察されＩ；免疫反応性のｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃパターンに類似の免疫反応性の ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎを示した。しかしながら、これら各霊 長類からの精子抽出物は、ヒト精子抽出物におけるよりも低い約１４ｋＤａにお けるバンドを含むａｐｐａｒｅｎｔ　ｍａｓｓの免疫反応性ペプチドを示した。
Ｐａｐｉｏ　ｐａｐｉｏ、Ｐａｐｉｏ　ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ、ａｎｕｂｉ ｓ、及びＭａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのｔｅｓｔｅｓから純粋化さ れたポリＡ＋ＲＮＡが装荷されたＮｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ、（図９）が行わ れた。これによッテ、これらの種のｔｅｓｔｅｓは、６２８ｂｐ　５Ｐ−１０プ ローブでハイブリダイズされた１、３５ｋｂ　ｍＲＮＡを含有することが証明さ れた。この１．３５ｋｂ　ｍＲＮＡは、ヒトｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｍＲＮＡと同 じサイズであった（図９）。イヌ及びネコｔｅａｔｅａからのポリＡ＋ＲＮＡは 、プローブでハイブリダイズせず、またヒト胎盤または肝臓から得たポリＡ＋Ｒ ＮＡともハイブリダイズしなかった（図９）。
議論 ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体と免疫反応を行うと共に、ヒト５Ｐ−１０に近いａ ｐｐａｒｅｎｔ分子重量を持つブタ精子抽出物中のペプチドの１ｄｅｎｔｉｆｉ ｃａｔｉｏｎは、ブタ精子が５Ｐ−１０を含有することを示した。ａｃｒｏｓｉ ｎまたはｓｐｅｒｍｉｎｏｇｅｎの純粋化されたｐｒｅｐａｒａｔｔｏｎｓの免 疫反応性の欠如は、ブタ精子抽出物が免疫反応性を持つという事実にも拘らず、 ５ｐ−ｉｏとこれら先述した生体内構成要素との間の相違を指し示している。こ のことは、５Ｐ−１０タンパク質が新規な生体内構成物であることを示唆してい る。
ヒト精子抽出物のＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上に観察される５Ｐ−１０ペプチ ドのｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃパターンもまた、ｂａｂｏｏｎ及びｒｈｅｓｕｓか ら得た精子ペプチド上に観察された。これらのｍａｓｓの変化するマルチプル免 疫反応性ペプチドが何故ヒト及び他の霊長類精子中に現れるのかについての見解 は、未だ定まっていない。ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体は５Ｐ−１０のためのｌ ａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ　発現ライブラリーをスクリーンするために使用して成功 しているので、ＭＨＳ−１０！ピトーブがｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅではなくｐ ｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓである可能性が高い。ヒト５Ｐ−１０に対するオーブ ンリーディングフレームは、２８．３ｋＤＡのｍａｓｓの２６５アミノ酸のタン パク質をｐｒｅｄｉｃｔｓＬ、ている。Ｎ９参照。２個のｃａｎｏｎｉｃａｌＮ −結合　ｇｌ’）ＩＣＱＳｙｌａｔｉＯｎ　位置がヒト５Ｐ−１０上で１ｄｅｎ ｔｉｆｙされたので、２８．３ｋＤａ以上のａｐｐａｒｅｎｔ分子重量を持ツ５ Ｐ−１０の形態は、ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄの５Ｐ−１０を表すと思われる。
霊長類精子の各Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔは、約２９ｋＤａにおｌするパターン の上位範囲において免疫反応性バンドを示した。これらのバンドは、はぼｇｌｙ ｃ。
５ｙｌａｔｉｏｎを持たないヌクレオチド配列からｐｒｅｄｉｃｔされるｍａｓ ｓを持つ。ヒト精子抽出物同様、２９ｋＤａ以下のマルチプル免疫反応性形態は 、他の霊長類において観察された。ヒト、ｂａｂｏｏｎ、及びｍａｃａｑｕｅの ５Ｐ−１０間におけるこの近似性は、５Ｐ−１０のｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの 発生を担うメカニズムは、それらがｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ％ｐｏｓｔ−ｔｒａ ｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎ ｅｐｒｏｄｕｃｔｓ、またはこれらの原因の組み合わせの何れかであるとすると 、ヒト精子におけると同様にｂａｂｏｏｎ及びｍａｃａｑｕｅ精子においても作 用する。
一方、ブタ５Ｐ−１０は、霊長類精子抽出物に見られる２９ｋＤＡ以下のマルチ プル免疫反応性ペプチドを示さなかった。ヒト５Ｐ−１０同様、ブタ精子免疫プ ロットは、約２９ｋＤａにおける主要免疫反応性バンドと共に、約３４ｋＤａに おけるバンドを示した（ヌクレオチド配列からｐｒｅｄｉｃｔされたタンパク質 に対して約’１９，３ｋＤａのｍａｓｓ）ｏ現在のところ、このｈｅｔｅｒｏｇ ｅｎｅｉｔｙがアミノ酸配列、ポストｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆ ｉｃａｔｉｏｎにおける相違を反映しているのか、或いは精子ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎにおけるｖｉａｂｉｌｉｔｙ及びｐｒｏｔｅｏｌｙｓＬｓにおける変化か ら生じたものなのかは明確でない。
１ｏｎｏｐｈｏｒｅ誘起先体反応及び証拠に続く精子頭に付随して残存する５Ｐ −１０が、ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体がハムスタ卵侵入試験における精子／卵 相互反応を禁止したことを示したので、卵管内に十分なレベルの抗体が誘起され るとしたならば、５ｐｉｏが生体において妊娠を１ｎｔｅｒｄｉｃｔする抗体を 誘起するための有効な免疫原となることになる。５Ｐ−１０に対する１、３５ｋ ｂ　ｍＲＮＡがｂａｂｏｏｎｓ、ｍａｃａｑｕｅｓ、及びヒトに対して共通であ るという見解は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上で観察された免疫反応性５Ｐ− １０におけるヒト、ｂＢｂｏｏｎｓ、及びｍａｃａｑｕｅｓ間に観察される類似 性を裏付けるものである。これらのデータは、全体として、ｍａｃａｑｕｅｓ及 びｂａｂｏｏｎｓは組み替え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＳＰ−１０ワクチンの 避妊能力を試験するための適切な霊長類モデルであることを示している。
要約すれば、現在の研究では、５Ｐ−１０（ＭＨＳ−１０）に対する単クローン 抗体は、ｂａｂｏｏｎ（Ｐａｐｉｏ　ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｎｕｂｉＳ ）及び２個のｍａｃａｑｕｅｓ　（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ　ａｎｄ　Ｍ ａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）からの精子抽出物における免疫反応性 ５Ｐ−１０を１ｄｅｎｔｉｆｙするためにＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ上で使用さ れた。これら霊長類の各々において、ＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体は、ヒトパタ ーンに類似した免疫反応性ペプチドのｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃパターンを認識し た。免疫反応性５Ｐ−１０もまた、ブタ精子中に現れた。上述したブタにおける 光体内部分子ａｃｒｏｓｆｎ及びｇｐｅｒｍｉｎｏｇｅｎの純粋化したｐｒｅｐ ａｒａｔｔｏ口３を用いて、我々はＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体がこれらのタン パク質と反応せず、５Ｐ−１０はこれら周知の光体構成要素とは異なることを観 察した。ウサギ、ｂｕｌｌ、ラット、ギニアブタ及びネコを含むいくつかの共通 種からの精子は、ＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体とは免疫反応しなかった。Ｍａｃ ａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｐａｐｉｏ　ｐａｐｉｏ、及びｐａｐｉ。
ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｎｕｂｉｓのｔｅｓｔｅｓから得たｐｏｌｙＡ＋ 　ＲＮＡのＮｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上の５Ｐ−１０に対するオーブンリーデ ィングフレームの６２８ヌクレオチドにわたる放射能プローブを用い、ヒトｔｅ ａｔｅａからのｍＲＮＡと同じ大きさの１．３５ｋｂメツセンジヤーＲＮＡが確 認された（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）ａこれらの結果は、ｂａｂｏｏｎｓ、ｍａｃａｑ ｕｅｓ、及びブタは５ｐ−ｔｏに基づく避妊ワクチンの試験のための適切なモデ ルとなることを示している。
例９ ヒト先体内抗原５Ｐ−１０に対するｃＤＮＡコーディングのクローニング及び配 列　本例では、ヒト精子光体タンパク質である５Ｐ−１のためのｃＤＮＡの特徴 化について説明する。５Ｐ−１０のためのｃＤＮＡコーディングが分離され、配 列され、そして誘起された（ｄｅｄｕｃｅｄ）ＳＰ−１０アミノ酸配列が分析さ れた。この作業により、５Ｐ−１０タンパク質の幾つかの基本的特徴が１ｄｅｎ ｔｉｆｙされ、またＳＰ−１０ｍＲＮＡの別のｓｐｌｉｃｉｎｇが示唆された。
５Ｐ−１０ｃＤＮＡ及びＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体を用い、ｔｒａｎｓｃｒｉ ｐｔｉｏｎａｌ及びｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌレベルでのｓｐ ｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ中における５Ｐ−１０の発現を研究することが可能 となった。５Ｐ−１０ｃＤＮＡを用いた５Ｐ−１０の過発現により、我々はその 避妊ワクチン免疫原としての価値を調べることが可能となる。組み替え（ｒｅｃ ｏｍｂｉｎａｎｔ）方法を用いた幾つかの５Ｐ−１ペプチドの免疫遺伝性を調べ ることもまた、５Ｐ−１０ｃＤＮＡをクローンし配列することによって可能とな った。
物質及び方法 １、ｃＤＮＡクローンの分離及び分析 ＭＭＳ−１０単クローン単体ローン抗体ｅｓｔｉｓ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１１発 現ライブラリーをプローブするために使用された。ライブラリーは、ＪｏｓｅＭ ｉｌｌａｎからの贈り物である。本明細書に参考文献として記載されたＭｉｌｌ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４： ５３１１−１５　（１９８７）参照。ライブラリーは、１５０ｍｍ　Ｐｅｔｒｉ 　ｄｉｓｈ　ｗｉｔｈ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０毎に５ＸＩＱ４ｐｌａｑｕｅ −ｆｏｒｍｉｎｇユニットの密度で、ホストｂａｃｔｅｒｉｕｍとしてｐｌａｔ ｅされた。４２℃で成長し、１ｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｂ−Ｄ　ｔｈｉｏｇａｌａｃ ｔｏｓｉｄｅでの誘起後、ニトロセルロースフィルタは５％ミルク及び５％ヤギ 血清で前１ｎｃｕｂａｔｅされ、ＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体の１：１０００希 釈液でスクリーンされた（ｉｓｏｔｙｐｅ　ＩｇＧ１）、Ｂｏｕｎｄ　ＭＭＳ− １０は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅに結合されたヤギ抗マ ウスＩｇＧを使用することで検出された（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ｐｕｔａｔｉｖｅクローンが、発現 ライブラリーからの５０．０００ｐｆｕをスクリーンすることによって１ｄｅｎ ｔｉｆｙされた。このファージは、ＭＭＳ−１０を用いてｐｌａｑｕｅ純粋化さ れ、他のＩｇＧ１単クローンまたはヤギ抗マウスＩｇＧに対する反応性は示さＮ ）でｎ１ｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｓ）され、付加クローンを１ｄｅｎｔｉｆｙするためのｇｔｌｌライブラリー を再プローブするために使用される。これは、本明細書に参考文献として記載さ れたＢｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０−Ｉ Ｂ２Ｃ１９７７）の方法に従って行われる。５個の付加クローンが１ｄｅｎｔｉ ｆｙされた。
２１４ｂｐクローンに対してｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓな３個のｐｌａｑｕｅが純粋 化され、ファージＤＮＡが分離された。これらのファージＤＮＡ５はＥｃｏＲｌ で消化され、１％アガローゼゲル上にｒｕｎされた。ＥｃｏＲ１消化は、全ての ３ｉｓｏｌａｔｅａに対して、約６５０ｂｐ及び４００ｂｐのｃＤＮＡ挿入バン ドを生成した。プローブとしてｃＤＮＡＳＰ−１０−５の６５０ｂｐまたは４０ ０ｂｐｉｎｓｅｒｔを用いて行われたＮｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔは、同一結果を 表した（データネ図示）。全３フアージ１ｓｏｌａｔｅａに対する６５０ｂｐ及 び４００ｂｐｉｎｓｅｒｔｓが分離され、ｐＧＥＭ３Ｚｆ　（ＰｒｏＭｅｇａ） へサブクローンされた。５ｐ−ｉｏ−ｓと命名されたｃＤＮＡは、プラスミドｐ ＧＥＭ−５Ｐ−５−６５０及びｐＧＥＭ−５Ｐ５−４００に含有されたｃＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｓのｃｏｍｐｏｓｉｔｅである。５Ｐ−１０−８及び５Ｐ−１０− １０と命名されたｃＤＮＡもまた、その各６５０ｂｐ及び４００ｂｐｃＤＮＡフ ラグメントのｃｏｍｐｏｓｌｔｅである。Ｎｅ５ｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓは 、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ　システム（ＰｒｏＭｅｇａ）を用いたｐＧＥＭ− ５Ｐ−５−６５０及びｐＧＥＭ−ＳＰ−５−４００中におけるｃＤＮＡフラグメ ントの各末端から生成された。そして、各１ｎｓｅｒｔの両ｓ　ｔ　ｒａｎｄは 、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａＩｓ）を用いて５ｅｑｕｅｎｃｅされた。Ｎｅ５ｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏ ｎｓは、ｐＧＥＭ−５Ｐ−１０−６５０中の６５０ｂｐ　５Ｐ−１０−１０ｃＤ ＮＡフラグメントから生成され、−のｓ　ｔ　ｒａｎｄが５ｅｑｕｅｎｃｅされ た。ｐＧＥＭ−ＳＰ−１０−６５０中の４００ｂｐＳＰ−１０−１０７ラグメン トは、両端部からｐｒｉｍｆｎｇすることによって配列された。５Ｐ−１０に対 する全オープンリーディングフレームは、５Ｐ−１０−５及び５Ｐ−１０−１０ ｃＤＮＡからｃｏｍｐｏｓｉｔｅｌｌ成される。
２、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ分析 Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　５ｗ１ｓｓＰｒ ｏｔｅｉｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｄａｔａｂａｓｅｓは、Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ 　Ｌｉｐｍａｎ　ＦＡＳ″ｔＡ　ａｎｄ　ＬＦＡＳＴＡプログラムを用いて行わ れた。本明細書に参考文献として記載したＰｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　ＬＬｐｍａ ｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：２４４４−４８（ １９８ｇ）参照。１と２のｋｔｕｐで比較が行われた。
３、ＲＮＡ分離及びＮｏｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓヒトｔｅｓｔｅｓをステロイド 処置を受けていない患者からの前立腺ｃｎ　ｒｃｉｎｏｍａに対するｅｌｅｃｔ ｉｖｅ　ｏｒｃｈｉｅｃｔｏｍｉｅｓから得て、液体窒素内で凍結された。その 後、組織がドライアイス上のパウダーへｇｒｏｕｎｄされ、ＲＮＡがグアニジン 　イソシオシネートを用いて分離され、その後にＣｓＣ１遠心分離が行われた。
本明細書に参考文献として記載したＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４−９９　（１９７９）参照。Ｐｏｌ　ｙ　（ Ａ）＋ＲＮＡは、本明細書に参考文献として記載したＢａｎｔｌｅ　ｅｔ　ａｔ 、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７２：４１３−４２７（１９７６）に記載さ れたようにｏ　ｌ　Ｌ　ｇｏ　（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｉｌａｂｏｒａｔｉ ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を用いて分離された。
−アガローゼゲル上で電気泳動された。本明細書に参考文献として記載したＬｅ ｈｒａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６：４７４３−５１　（１９ ７７）ｌ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ。
７７　：　５７９４−９８　（１９８０）参照。ＲＮＡは、バイオトレース膜（ Ｇｅｌｍａｎ）へｂｌｏｔされ、そのｔｎｔｅｇｒｔｔｙは紫外線で１８Ｓ及び ２８ＳのりボゾームＲＮＡバンドをｂａｃｋｓｈａｄｏｗｉｎｇすることによっ て判断された。膜はｐｒｅｈｙｂｒｔｄｉｚｅｄされ（５０％フォルムアミド、 １％ミルク、５ＸＳＳＰＥ、１％　ＳＤＳ及び１１００ｕ／ｍｌサーモン精子Ｄ ＮＡ）、その後５Ｐ−１０〜５　（ｂｐｓ　６７−６９５）からのコーディング 領域の部分１．５Ｐ−１０ｃＤＮＡの特徴化 ヒトｔｅｓｔｉｓｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体を 用いてスクリーンされた。−のＭＨＳ−１０反応性ｐｌａｑｕｅのｃＤＮＡｉｎ ｓｅｒｔが純粋化され、配列され、そして長さが２１４ｂｐであることが見いだ された。この１ｎｓｅｒｔは、その後、５Ｐ−１０−５，５Ｐ−１０−８、及び ５Ｐ−１０−１０として命名されたより長い３個のｃＤＮＡｗｏ分離するための プローブとして使用された。ｃＤＮＡ　５Ｐ−１０−５の６３４　ｂｐフラグメ ントは、 ヒトｔｅｓｔｅｓ、１ｉｖｅｒ、及び胎盤からのｐｏ　Ｉ　Ｖ　（Ａ）＋ＲＮＡ を含有するｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔをプローブするために使用された（図１ ０）。
１．３５ｋｂにおけるーのバンドがｔｅｓｔｅｓＲＮＡ中に存在したが、Ｌｉｖ ｅｒにも胎！ｌＲＮＡレーンにも存在しなかった。
配列分析によれば、ｃＤＮＡｓ　５Ｐ−１０−５及び５Ｐ−１０−１０が大きく オーバラップしていることが明らかになった（図１１人）。５Ｐ−１０−５及び ５Ｐ−１０−１０に対する配列を組み合わせることにより、７９５ベース、２６ ５アミノ酸のオーブンリーディングフレームを持つ１１１７ｂｐの部分ｃＤＮＡ が５Ｐ−１０タンパク質に対して１ｄｅｎｔｉｆｙされた。　５Ｐ−１０−１０ における５７ｂｐ（１９アミノ酸）のｉｎ−ｆｒａｍｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎを除 き、５Ｐ−１０−５及び５Ｐ−１０−１０に対する残存オーバラップ配列は同一 であった。５Ｐ−１０−８配列の５°及び３°端部は、５Ｐ−１０−５及び５Ｐ −１０−１０ｃＤＮＡ配列と同一であった。該配列において、これらはオーバラ ップしているが、５Ｐ−１０−５のように５Ｐ−１０−１０配列中に存在する５ ７ｂｐｄｅｌｅｔｉｏｎは持たなかった。
配列分析ではまた、ＴＡＧｔｅｒｍｉｎａｔｆｏｎ　ｃｏｄｏｎの工０９４．２ ３６ｂｐ３’位置においてコンセンサスｐｏｌｙａ、ｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ配列 が１ｄｅｎｔｉｆｙされ、ストップコドンの７１ｂｐ３’にはｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｍＲＮＡ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　配列がｔｄｅｎｔ ｉｆｙされた。１ｎｉｔｊａｔｏｒメチオニンをｆｌａｎｋｌ、た５°配列（Ｃ ＣＡＧ）は、殆どのｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　５ｔａｒｔ　ｃｏｄｏｎｓへのコン センサスｆｏｕｎｄ５’　に類似している。
ｃＤＮＡ配列からｄｅｄｕｃｅされた５Ｐ−１０に対するアミノ酸配列は、２８ ．３ｋＤのタンパク質をｐｒｅｄｔｃｔした。３個の個となる繰り返しアミノ酸 モチーフが１ｄｅｎｔｉｆｙされた（図１１Ａ）。第１モチーフ（Ｓｅｒ、Ｇｌ ｙ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、ＣＰｒｏ　ｏｒ　Ａｌａ））は、７回生じた。第１リピー トの２個の付加ｖａｒｉａｎｔが存在する（Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ。
Ｐｒｏ）及び（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ）。これらは、相互に −のアミノ酸だけ異にする。第２のモチーフ（Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、（Ｇｌ ｙまたはＡｌａ）、５ｅｒ）は３回繰り返され、第３のモチーフ（Ｓｅｒ、Ｇｌ ｙ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ）は、４回繰り返された。これらの３個のモチーフは、アミ ノ酸６６と１７４との間の１０８のアミノ酸の内の７６個を含む。
５Ｐ−１０アミノ酸配列の疎水性プロットは、信号ペプチドの疎水性アミノｔｅ ｒｍｉｎｕｓ特性を示した。繰り返しモチーフを含むプロティンの中央部は、幾 つかの親水性領域を持ち、一方ｃａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｒｐｉｎｕｓは極めて疎 水性であった。２個のＮ結合ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ配列（Ａｓｐ−Ｘ−５ ｅｒ（Ｔｆｉｒ））がアミノ酸４８及び３５８に存在し、一方アミノ酸８０で開 始する５ｅｒｉｎｅとｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓのストレッチは、０結合ｇｌｙｃｏ ｇｙｌａｔｉｏｎ位置の可能性を示唆した。ｒｅｓｉｄｕｅ１４０で生じる配列 （Ｓｅｒ−（ＡｓｐまたはＧ　ｌ　ｕ）　−Ｘ−Ｘ−Ｐ　ｒ　ｏ）もまた、Ｏ結 合ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎのための可能対象位置として示唆された（Ｇｅｒ ｒｙ　Ｈａｒｔ、ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。
２、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　５ｅａｒｃｈｅｓ完全５Ｐ−１０ｃＤＮＡ及びアミノ酸 配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＢＲＦ。
及び１ｉｂｒａｒｙ　５ｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　Ｆａｓｔａ　ａｎｄｔ Ｆａｓｔａ　ａｔ　ｋｔｕｐｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　１ａｎｄ　２を用いた５ｗ１ ｓｓ配列ｂａｎｋｓに比較された。５Ｐ−１０ｎｕｃ　１　ｅ　ｉ　ｃ酸も、ア ミノ酸配列も、ｂａｎｋｓ中の配列とのｈｏｍｏｌｏｇｙは示さなかった。３個 の繰り返しアミノ酸モチーフはまた、同じ配列ｂａｎｋｓに比較された。幾つか のタンパク質は−のモチーフの単一コピーを含有していたが、任意のモチーフの ｍｕｌｔｉｐｌｅコピーを含有するものはなかった。
議論 我々は、ヒト精子光体タンパク質５ｐ−ｉｏに対するｃＤＮＡコーディングのク ローニング及び初期特徴化について述べてきた。５Ｐ−１０ｃＤＮＡの配列分析 によって、５Ｐ−１０タンパク質の幾つかの興味深い特徴が明らかにされた。
ｄｅｄｕｃｅｄアミノ酸配列から発生した疎水性プロットは、信号ペプチドの強 疎水性ｔｅｒｍｉｎｕｓ特徴を含むことが示された。更に、アミノ端末２０アミ ノ酸がチャージ及び疎水性が個々に分析された時、それらは信号ペプチドの特徴 によく合致していた。信号ペプチドは、５Ｐ−１０タンパク質をｅｎｄｏｐ　Ｉ 　ａｓｍＬｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍの膜を介して、Ｇｏｌｇｉ　ｖｅｓｉｃｌｅ へ搬送されなければならない、Ｇｏｌｇｉ　ｖｅｓｔｃｌｅは、ｃｏａｌｅｓｃ ｅして発達光体を形成する。
信号配列後、幾つかの親水性領域を持つ中央ペプチドコアは、３個の繰り返しペ プチドモチーフのほぼ全て含有していた。１９のアミノ酸ｄｅｌｅｔｉｏｎによ り、ｃＤＮＡｓＰ−１０−１０は２個のモチーフの自車−のコピーだけを喪失し ている。これらのユニーな繰り返しが５Ｐ−１０の機能中て果たす役割りについ ては、尚不明である。理由は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＢＲＦ、及びモチーフのｍｕ ｌｔｉｐｌｅコピーを含む５ｗ１ｓｓ配列ｂａｎｋには、タンパク質は全く見い だされなかったからである。
ｃＤＮＡ配列の分析では、２個のポテンシャルＮ結合ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔ　ｉ ｏｎ位置及び可能Ｏ結合ｇｌｙｅｏｓｙｌａｉｔ　ｔｏｎ位置が明らかにされた 。これらの位置における炭水化物によって、ｄｅｄｕｃｅされたアミノ酸配列か ら演算された２８．３ｋｄ　ペプチド（信号ペプチド除去後、２６ｋｄ）及びＷ ｅｓｔｅｎ　ｂｌｏｔ中に観察された３４ｋｄ　５Ｐ−１０種間の大きさに相違 があることに説明がつく。この大きさのばらつきは、予想されたことである。と いうのは、他の光体タンパク質が、ウサギ、ｂｏａｒ、及びヤギのａｅｒｏｓｉ ｎを含むｇｌｙｅｏｓｙｌａｔｅｄであるということが示されているからである 。例えば、ヒト及びｂａａ　ｒのｐｒｏａｃｒｏｓｉｎはＳＤＳ　ＰＡＧＥによ って約５５１ｃｄ′Ｔ！ｍｉｇｒａｔｅＬ、たが、こわらは約４５ｋｄのみのペ プチドに対してコードしたｍＲＮＡから合成された。
５ｐ−ｉｏタンパク質に対して以前観察された大きさの違いは、図１２に明らか にされている。ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔ　ｔｏｎの程度の差は、Ｗｅｓｔｅｒｎｂ ｌｏｔ上のｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｔｔｙの幾つかを説明するものである。５ｐ− １０−１０ｃＤＮＡ中の内部ｄｅｌｅｔｉｏｎは、５Ｐ−１０ｔｒａｎｓｃｒｉ ｐｔのＭｓｇｌｉｃｉｎｇもまたｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ　ｔｙの幾つかを説明 するものであることを示唆している。１９アミノ酸ｄｅｌｅｔｉｏｎを持つ５Ｐ −１０−１０ｍＲＮＡは、ＳＰ−１０−５ｍＲＮＡにより生成されたものよりも 小さいタンパク質２ｋｄに対してコードする。しかし、ａｌｔｅｒｎａｔｆｖｅ 　ｓｐｌｉｃｉｎｇがｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙの主原因であるとは考え難い 。というのは、５Ｐ−１０ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔは、Ｎｏｔｈｅｒｎ　ｂｌ。
を上において比較的ｄｉｓｃｒｅｔｅなバンドだったからである。精子の成熟及 び保存中における５Ｐ−１０タンパク質のＰｒｏｔｅｏｌｙｓ　ｉｓもまた、お そらくその大きさのｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ　ｔｙに関与しているものと思われ る。
これまで分離された全３個の５Ｐ−１０ｃＤＮＡが、それらがオーバラップした 同じ３”　ｕｎｆｒａｎｓｌａｔｅｄ配列を共有しているという事実は、ｍｕｌ ｔｉｐｌｅｓＰ−１０ゲノム遺伝子がお・Ｂらくはｈｅｔｅｒｃｒｇｅｎｅｉｔ ｙの原因ではないことを示唆している。
原２１４ｂｐｃＤＮＡからのＭＩ５−１０免疫反応性融合タンパク質の生成は、 ＭＩ５−１０エピトープを５Ｐ−１０タンパク質の７１アミノ酸ペプチドに配置 した。この７１のアミノ酸ペプチドのアミノ端末３４アミノ酸は、完全に全体３ タイプの親水性モチーフの内の２個からなり、一方ｅａｒｂｏｘｙ　ｔｅｒｍ＋ ｒｌａｌ　３７アミノ酸は、極めて疎水性であ・フた（図１１Ｂ）、ＭＨＳ−１ ０は、５Ｐ−１０ペプチドの親水性領域に生成される可能性が極めＣ高いので、 この３４アミノ酸ストレツチ中の−または複数のモチーフがおそら＜ＭＨＳ−１ ０エピトープを含むか、或いはＭＩ（Ｓ−１０に寄り１〜でいるど思われる。
ｃＤＮＡｓの有用性によって、我々は大皿の５Ｐ−１を融合タンパク質として発 生させることが可能となった。組み替え抗原によって、我々は２つの仮説をテス トすることができた・　１）ＳＰ−１０が避妊用ワクチン免疫原として効果的で ある；　及び２）抗精子抗体を持つヒトからの５ｅｒａは組み替え５ｐ−ｉ。
を認識する。もし後者が事実であるならば、不動態化された組み替え５Ｐ−１０ は抗精子抗体を測定するための有用な対象抗原として供され得る。
要約すると、光体内タンパク質５Ｐ−１０のためのｃＤＮＡｓコーディングが九 ローンされ、そしてｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ中におけるこの抗原の発現 を理解するための第１段階として特徴化された。３個のオーバラップした５Ｐ− １０特定ｃＤＮＡは、ヒトｔｅｓｔｅｓｃＤＮＡ発現ライブラリーから分離され た。これらのｃＤＮＡは、１．３５ｋｂ　ｍＲＮＡにハイブリダイズされた。
このｍＲＮＡは、ヒトｔｅｓｔｅｓ中に存在するが、１ｉｖｅｒまたは胎盤には 見いだされなかった。５Ｐ−１０−５，５Ｐ−１０−８，５Ｐ−１０−１０と命 名されたこれらｃＤＮＡの完全配列は、１１１７ｂｐ配列を生成した。この配列 は、５Ｐ−１０タンパク質のための２６５アミノ酸コーデイング領域を含む。ｄ ｅｄｕｃｅｄアミノ酸配列から発生した疎水性ｐｌｏｔは、信号ペプチドの特徴 である弧線水性アミノ端末を示した。配列データは、３個の個となるアミノ陵線 　、り返しが、５Ｐ−１０タンパク質のｃｅｎｔｒａｌ　ｔｈｉｒｄ中に総計１ ６回発生した。興味深いことに、ｃＤＮＡＳＰ−１０−１０は、内部５７ｂｐ（ １９ａａ）フレーム内ｄｅｌｅｔｉｏｎを持つ。このｄｅｌｅｔｉｏｎは、５Ｐ −１０−５中には存在していない。このことは、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐ ｌｉｃｉｎｇが一以上のＳＰ−１０ｍＲＮＡを発生することを示唆している。５ Ｐ−１０タンパク質は、前免疫組織データ、及び５Ｐ−１０ｃＤＮＡ配列がＧｅ ｎｂａｎｋ、ＮＢＲＦ、または５ｗ１ｓｓ配列ｂａｎｋに見いだされる他の配列 への何等の意義あるｈｏｍｏｌｏｇｙも示さなかったという観察に基づくユニー クな光体タンパク質である。
例１０ 変質微生物による抗原の生成 ５Ｐ−１０−５Ａ　ｃＤＮＡ　１ｎｓｅｒｔは、ＫＰＮ　Ｉ及び５ＳＴＩを持つ ｐＧＥ−５Ｐ−１０−５からｅｘｃｉｓｅされる。端部は、Ｔ４　ＤＮＡリガー ゼで結合されたＭｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼ及びＮｃｏｌリンカ−を用いて ｂｌｕｎｔされる（ＳＰ−１０−５ｃＤＮＡは内部ＮｃｏＩ位置を含まない）。
リンカ−は、その後、アガローゼゲル電気泳動及びフラグメントのｅｌｅｃｔｒ ｏｅｌｕｔｉｏｎによってｕｎｌｉｇａｔｅｄリンカ−から分離されたＮｅ。
Ｉ及びｃＤＮＡとでＣ１ｅａｖｅｄされる。ｃＤＮＡは、その後Ｅ、ｃｏｌｔ発 現ベクトルｐＫＫ２３３−２のＮｃｏ１位置へｌｉｇａｔｅされる（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）。このベクトルは、ＩＰＴＧ　（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｂ−Ｄ−ｔｈ ｉｏｇａｌａｃｔｏ−ｐｙｒａｎｏｓＬｄｅ、Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓＣｏｒｐ、）ｉｎｄｕｃｉｂｌｅプロモータ及びｃＤＮＡ挿入位置への１ａｃ ２　リボゾーム結合位置５゛及びｃＤＮＡ挿入位置へのコンセンサスｔｒａｎｓ ｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ配列３゛を含む。ｃＤＮＡへ結合さ れたリンカ−は、３ＮｃｏＩリンカの混合である。各リンカ−は、３個のリーデ ィングフレームの内の−に、ＡＵＧスタートコドンを含む。ｐＫＫ２３３−２へ 結合されたｃＤＮＡは、Ｅ　ｃｏｌｉへ変換される。この結果生じるコロニーは 、ニトロセルロースに転送され、５Ｐ−１０−５Ａタンパク質の生成を誘起する ために、２ｍＭ　ＩＰＴＧを含むａｇａｒプレート上へフィルタが４時間にわた って３７　Ｃで配置される。その後、フィルタは５％ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃ ｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ　（ＳＤＳ）中でｉｏｏ　ｃで１ｎｃｕｂａｔｅされ、乾 燥され、そしてＭＭＳ−１０ＭＡＢ及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉ ｄａｓｅ−１ａｂｅｌｌｅｄ　ヤギ抗マウスａｎｔｉｓｅｒａで１ｎｃｕｂａｔ ｅされる。５Ｐ−１０ＭＡＢと陽反応を示すコロニーが分離され、２ｍＭＩＰＩ Ｇの存在下で１ｍｌのｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　ｃｕｌｔｕｒｅがｇｒｏｗｎした。
組み替えＥ、ｃｏｌｉは、遠心分離によって収集され、そして４Ｘ　タンパク質 装荷バッファ中で１ｙｓｅされる（４％　ＳＤＳ、２０ｍＭ　ＴＲｌ５　（ｐＨ ８゜０）、０．５Ｍ　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏＬ　２０％グリセロー ル）。
これらのサンプルが煮沸され、本明細書に参考文献として記載したＬａｅｍｌ　 ｉ。
Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ）２２７：６８０　（１９７０）に従ってＩＤ　５Ｄ ＳＰＡＧＥを受け、そしてＭＨ５Ｏ−１０ＭＡＢ及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈペ ロキシダーゼラベルされたヤギ抗マウスａｎｔｉｓｅｒａでＷｅｓｔｅｒｎ　ｂ ｌｏｔされる。約２７ｋＤのＭＭＳ−１０反応バンドを示すこれらのコロニー（ ２２６アミノ酸に対する５Ｐ−１０−５ｃＤＮＡコード）は、組み替え５ｐ−１ ０−５タンパク質の分離のためのｌａｒｇｅ　ｃｕｌｔｕｒｅを開始するために 使用される。ｌａｒｇｅ　ｐｒｅｐｓから収集された組み替えＥ、ｃｏｌｉは１ ｙｓｅされて５Ｐ−１０−５タンパク質を解放する。細胞ｄｅｂｒｉｓを除去す るための遠心分離後、５Ｐ−１０−５タンパク質は、イオン交換クロマトグラフ ィー、ＭＭＳ−１０ＭＡＢ　親和性クロマトグラフィー、及びｐｒｅｐａｒａｔ ｉｖｅ電気泳動を用いて純粋化される。
ｐＧＥＸにおける発現 ｐＧＥＸシステムは、「純粋」　（非融合）組み替えタンノくり質を生成する。
この　タンパク質は、単独で、そして免疫システムを向上する他のタンノくり質 とのｃｏｎｊｕｇａｔｅとして、ワクチン免疫原に使用することを我々が意図し ているものである。我々は、５Ｐ−１０−５ｃＤＮＡ　５Ｐ−１０−５をプラス ミド発現ベクトルｐＧＥＸ−２７及びｐｃｉ：ｘ−３ｘにｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅ ｒした。本明細書に参考文献として記載したＳｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏ ｎ。
Ｇｅｎｅ６７：３１−４０　（１９８ｇ）参照。我々は、組み替え５Ｐ−１０の 過発現を観察した。これらの構造は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃ ｕｍ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−トランスフェラーゼ　タンノくり質のｃａ ｒｂｏｘｙｌ　ｔｅｒｍｉｎｕｓとの融合ポリペプチドを付与する。本明細書に 参考文献として記載したＳｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ８３：８７０３− ８７０７（１９８６）参照。このシステム中で生成された殆どの融合タンパク質 ｉｔ、水性溶液中に可溶であり、不動態化されたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ上への親 和性クロマトグラフィーにより、非ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ条件下で、ｃｒｕｄｅ 　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１ｙｓａｔｅｓから純粋化される。ｂａｔｃｈ洗浄処理 を用（１て、幾つかの融合タンパク質が、ｃｕｌｔｕｒｅの最大１５ｍｇタン／ ＜り質／１ｉｔｅｒの出力で２時間にわたって平行に純粋化される。純粋５Ｐ− １０は、トロンビン（ｐＧＥＸ−２７に対して）及び血液凝固因子Ｘａ　（ｐＧ ＥＸ−３Ｘに対して）等の位置特定プロテアーゼによる消化によって、グルタチ オエンＳ−トランスフェラーゼ　キャリアからのｃｌｅａｖａｇｅによって準備 される。消化後、キャリア及び任意のｕｎｃ　１ｅａｖｅｄ融合タンノくり質が 、グルタチオニンアガローゼ上で吸収によって除去される。
例１１ ウサギにおける免疫遺伝性のためのプロトタイプ組み換えワクチンの試験物質及 び方法 １．５Ｐ−１０ウサギ　ポリクローンａｎｔｉｓｅｒａの発生Ａ　ＥｃｏＲ１端 を持つ６３４ｂｐ　５Ｐ−１０−５ＥｃｏＲ１フラグメント（ｂｐｓ６７−７０ １．２０２ａａ）及び原２１４　ｂｐＳＰ−１０ｃＤＮＡ（ｂｐｓ４８７−７０ １．７１ａａ）は、それぞれＥ、ｃｏｌｉ発現ベクトルｐＷＲ５９０及びｐＷＲ ５９１にそれぞれ挿入された。本明細書に参考文献として記載されたＧｕｏ　ｅ ｔ　ａｌ、、ＧＥＮＥ、２９：２５１−２５４　（１９ｇ４）参照。６３４ｂｐ 挿入に起因する５Ｐ−１０／Ｂ−ガラクトシダーゼ融合タン／くり質は、Ｇｕｏ 　ｅｔ　ａｌ、に従って分離され、そしてＳＤＳ　ＰＡＧＥを受けた。５Ｐ−１ ０／Ｂ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質バンドは、ゲルからｅｘｃｉｓｅされ 、冷凍され、パウダーにｇｒｏｕｎｄされ、そしてＰＢＳ中にｒｅｓｕｓｐｅｎ ｄされた。
ウサギは、ゲル５ｌｕｒｒｙ及びＦｒｅｕｎｄ’　ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄ ｊｕｖａｎｔ　（Ｇｉｂｃｏ）のｅｑｕａｌ　ｖｏｌｕｍｅｓで皮膚下注射され 、その後さらに２週間のインターバルでＦｒｅｕｎｄのＩｍｃｏｍｐｌｅｔｅ　 Ａｄｊｕｖａｎｔ中にゲル　５ｌｕｒｒｙで２回注射された。ウサギはｂｌｅｄ され、そして血液は硫酸アンモニウム沈澱を用いてＩｇＧのために処理された。
２、プロトタイプ組み換えワクチンに発生したポリクローンＡｎｔｉｓｅｒａに よるＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ及び免疫蛍光性ドナーの精子は、Ｈａｍ’　ｓの Ｆ−１０媒体中で洗浄され、水中で−８００で冷凍された。ｔｈａｗされｖｏ　 ｒ　ｔ　ｅｘされた後、サンプルは３０秒にわたって１０．０００ｘｇで遠心分 離され、一部の上清がＢ−ｍｅｒｃａｐｔｏｔｈａｎｏｌと共に一部の２ＸＬａ ｅｍｍｌｉ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉ、ｏｐ。
ｃｉｔ、）に付加された。タンパク質は、ＳＤＳ　ＰＡＧＥを受け、ニトロセル ロースに転送され（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、ｏｐ、ｃｔｔ、）、そしてＰ ＢＳｌｏ、５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で５％ミルク中でブロックされ、そしてＭＭ Ｓ−１０の１：１０００ｄｉｌｕｔｉｏｎ、ｎｕｌｌ　１ｓｃｉｔｉｅｓ％５Ｐ −１０ウサギｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、またはＰＢＳｌｏ、５％　Ｔｗｅｅｎ　２ θ中のウサギｐｒｅｉｍｍｕｎｅ　５ｅｒａ、１％ミルク中で２時間にわたり室 温下で１ｎｃｕｂａｔｅされた。ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎ。
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）またはヤギ抗ウサギ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）ＩｇＧ− ｈｏｒｓｅｒａｄｌｓｈベロキシダーゼは、１　：　５０００ｄＬ　ｌｕｔ　ｉ ｏｎで使用され、そして反応生成物は０．０１５％ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏ ｘｉｄｅで０．０５％ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅでｄｅｖｅｌｏｐされ た。抗体１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ間の全ての洗浄は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／１％ミ ルクで行われた。
免疫蛍光性研究に対して、精子は上述のように洗浄され、ＰＢＳ中にｒｅｓｕｓ ｐｅｎｄされ、そしてスライド上で空気乾燥された。スライドは３％バラフォル ムアルデヒド中で３０分にわたってｓｕｂｍｅｒｇｅされ、メタノール中で３０ 分にわたってｓｕｂｍｅｒｇｅされて精子が固定及びｐｅｒｍｅａｂｔｌｉｚｅ される。それらはＰＢＳ中の１０％ヤギ血清中で１５分間にわたってｐｒｅｉｎ ｃｕｂａｔｅされ、その後半クローン抗体ＭＨＳＩＯ，ｎｕｌｌ　ａｓｃｉｔｉ ｅｓ、ｒａｂｂｉｔ　５Ｐ−１０ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｌｓｅｒａ。
または１：５００ｄｉｌｕｔｔｏｎののウサギｐｒｅｉｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｓ ｅｒａ中で、加湿室中で室温下で１時間にわたって１ｎｃｕｂａｔｅされる。ス ライドはＰＢＳ中で５ｘ洗浄され、そして加湿室中で室温下で１　：　５００ｄ ｉ　１ｕｔｉｏｎで１時間にわたってｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎラベルされたヤギ 抗マウスａｎｔｉｓｅｒａ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ）（ｆ。
ｒ　ＭＨＳ−１０及びｎｕｌｌ　ａｓｃｉｔｉｅｓ）またはｆ　１ｕｏｒｅｓｃ ｅｉｎ　１ａｂｅｌｌｅｄ　ヤギ抗ウサギａｎｔ　１ｓｅｒａ　（ＨｙＣｌｏｎ ｅ）（ｆｏｒ　５Ｐ−１０ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａ　ａｎｄ　 ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｓｅｒａ）中で１ｎｃｕｂａｔｅされる。スライ ドはその後ＰＢＳ中で５ｘ洗浄され、２５ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８，０） 中で９０％グリセロールでｍｏｕｎｔｅｄされ、そしてｅｐｉｆ　１ｕｏｒｅｓ ｅｎｃｅを備えたＺｅｉｓｓ　ｐｈａｓｅｌｉｌ微鏡下で観察された。
結果 １、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓ及び免疫蛍光性配置Ａ　６３４　ｂｐ　５ｒ− １０−５７ラグメント（ｂｐｓ　６７−７０１゜２０２ａａ）及び原２１４ｂｐ 　５Ｐ−１０ｃＤＮＡ　（ｂｐｓ　４８７−７０１．７１ａａ）がｌ：、ｃｏｌ ｉ　発現ベクトル　ｐＷＲ５９０へ挿入され、モしてＢ−ガラクトシダーゼ融合 タンパク質として発現する。ｐＷＲＳＰ−２１０及びｐＷＲＳＰ−７１として１ ｄｅｎｔｉｆｙされる２つの構造は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上のＭＥＩＳ −１０と反応する融合タンパク質を生成した（データは不図示）。ｐＷＲｓＰ− ２１０融合タンパク質は、２匹のウサギにおいてポリクローンａｎｔｉｓｅｒａ を発生させるために使用された。ａｎｔｉｓｅｒａは、ＳＤＳ溶解精子抽出物（ 図１２）を含有するＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓをプローブするために使用され た（２匹のウサギにより生成されたａｎｔｉｓｅｒａは、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ ｏｔ上で免疫蛍光性位置研究において同一に反応した：従って、ここではウサギ Ｎｏ、１からのデータのみを示した）。ｐｏｌｙｃｌ。
ｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａは、ｍＡＢ　ＭＨＳ−１０におけると同様、ヒト精子 抽出物レーン上における同じシリーズのバンド（１７−３４ｋｄ）と反応する。
５Ｐ−１０ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａと他の非５Ｐ−１０精子タ ンパク質との間には交差反応は見られなかった。ウサギ前免疫５ｅｒａは、如何 なる精子タンパク質バンドとも反応性を示さなかった。
バラフォルムアルデヒド固定ヒト精子は、まず５Ｐ−１０ポリクローンａｎｔｉ ｓｅｒａと反応し、次いでｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ａｂｅｌｌｅｄヤギ抗ウ サギ副次抗体つ反応した。光体に対する形態学と同様、精子頭上のキャップのみ がｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａとのあらゆる反応性を示した（図１ ３Ａ）。このキャップ上免疫蛍光性イメージは、単クローン抗体ＭＨ８−１０で 染色されたものと同じであった（図１３０）。前免疫ａｎｔｉｓｅｒａ及びｎｕ ｌｌ　ａｓｃｉｔｅｓは、精子の染色は全く見せなかった（図１３Ｂ及び１３Ｄ ）。
議論 ポリクローンａｎｔｉｓｅｒａが５Ｐ−１０／Ｂ−ガラクトシダーゼ融合タンパ ク質にｒａｉｓｅしたという観察は：　１）単クローン抗体ＭＨ５−１０におけ る場合同様、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ上で同一の一連のペプチドと反応した ；　２）精子光体キャップの正確な免疫蛍光性染色を示し、分離されたｃＤＮＡ が５Ｐ−１０タンパク質をコードする２個の相互に支持するブルーフを提供する 。５Ｐ−１０ｃＤＮＡが、ＭＨＳ−１０エピトープを共有するだけの非５Ｐ−１ ０タンパク質に対してコードされたとすれば、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ及び免 疫蛍光性データは、ＭＨＳ−１０と５Ｐ−１０ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ ｓｅｒａに対しては同一ではない。１ｎｎｏｃｕｌａｔｅｄウサギは、ｓｐ−１ ０ｍみ換えワクチンを受けて、明かな悪作用を示すということはなかった。この ことは、組み換えワクチンが安全であり、ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓであることを 示唆している。組み換えワクチンが、ｎａｔｉｖｅ　５Ｐ−１０が組み換えワク チンがｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓであるという更なるプルーフを提供することを認 識するというｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅをｅｖｏｋｅした。
組み換え５Ｐ−１０融合タンパク質はＥ、ｃｏｌｉ発現ベクトル中で生成され、 そしてｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａを発生させるために使用された 。
このａｎｔｉｓｅｒａは、その位置で光体キャップを染色し、そして５Ｐ−１０ への単クローン抗体の場合同様、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ上で同様の−組みの ペプチドと反応した。
例１２ 染色体位置 マウス／ヒト細胞ハイブリッドＤＮＡを含むゲノムｂｌｏｔは、５Ｐ−１０−５ の５’　６３４ｂｐ部とハイブリダイズされた。テーブル１は、５Ｐ−１０遺伝 子に対してスクリーンされたときのハイブリッドポジティブを示すもので、染色 体のどのｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔがこれらのハイブリッド中に含まれているのかが 表されている。
このテーブルは、１６のｕｎｒｅｌａｔｅｄヒト細胞ライン及び４のマウス細胞 ラインを含む３３の細胞ハイブリッドからｃｏｍｐｉｌｅされている。本明細書 に参考文献として記載したＳｈｏｗｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｌｎ 　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ　１２．Ｅｄｓ、Ｈ，Ｈａｒｒ ｉｓ　ａｎｄ　Ｋ、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ、（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ）、１９８２．　ｐｐ、３４１−４５２； Ｓｈｏｗｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、２１ ：９９−１０４　（１９７８）参照。ハイブリッドはｋａｒｏｔｙｐｉｃ分析及 びｍａｐｐｅｄ酵素マーカによって特徴化された。本明細書に参考文献として記 載したＳｈｏｗｓ、ＴＢ、１９８３．Ｉｓｏｚｙｍｅｓ：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔ ｏｐＬｃｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ　１０．ｐｐ、３２３−３３９．Ｅｄｓ、Ｍ、Ｃ，Ｒａ ｔｔａｚｚｉ、Ｊ、Ｇ、５ｃａｎｄａｌｉｏｓ、ａｎｄ　Ｇ、Ｓ、Ｗｈｉｔｔ。
Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ参照。テーブル中のｒｔＪは、特定 染色体に対する染色体ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎを示しているが、１ｎｔａｃ ｔ染色体は存在していない（ｕｎｄｅｒ　Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ参照） 。
ＤＮＡプローブ５Ｐ−１０に対するＤＮＡプローブは、テーブル中にリストされ たヒト−マウスハイブリッドからのＥｃｏＲＩ消化されたＤＮＡを含む５ｏｕｔ ｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｓにハイブリダイズされた。プローブ５ｐ−ｉｏに対するス コアリングは、ｂｌｏｔ上のハイブリッドにおけるヒトバンドの存在（＋）また は欠如（−）によって決定された。Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔハイブリッドは、特定 ヒト染色体と共に、ヒトバンドを保持するか喪失する。ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔハ イブリッドは、ヒトバンドを保持するが特定の染色体ではないか、或いはその逆 である。Ｐｅｒｃｅｎｔ　ｄｉｓｃｏｒｄａｎｃｙは、マーカ及び染色体に対す るｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎの程度を示している。０％の ｄｉｓｅｏｒｄａｎｃｙは、染色体ａｓｓｔｇｎｍｅｎｔの基礎である。
５Ｐ−１０に対するＤＮＡプローブは、体細胞ハイブリッドによってヒト染色体 １１を７７プした。１１／Ｘ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎとのｈｙｂ　ｒ　ｉ 　ｄＸＥＲ−７：　１１ｐ１２または１ｉｐＨ−＞ｌｌｇｔｅｒ：　：Ｘｇｌｌ −＞Ｘｑｔｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｙｂｒｉｄ　ＥＸＲ−５Ｃ９ＡＺ　ｗｉｔ ｈｔｈｅ　Ｘ／１１　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ：　Ｘｐｔｅｒ−＞Ｘｑ２２ ：：　１１Ｑ１３−＞ｌ１ｑｔｅｒは、５Ｐ−１０をヒト染色体１１のＰＩ３− ＞ｑ１３領域へ配置する。
染色体１１は、３１のｅｏｎｃｏｒｄａｎｃｙ及びＸのｄｉｓｃｏｒｄａｎｃｙ を与える。染色体１６は、図２３及び１３のそれぞれ次ぎの最高ｃｏｎｃｏｒｄ ａｎｃｙ及びｄＬｓｃｏｒｄａｎｃｙを与える。このデータは、５Ｐ−１０に対 するゲノム遺伝子が染色体Ｎｏ、１１上に、おそらくは１１ｑ２バンドの領域中 に配置されることを示している。
例１３ 単クローン抗体ＭＨＳ−１０を用いた精液中の未成熟生殖細胞のディフエレンシ ャル診断ヒト精液は、精子の他に、ｔｅｓｔｉｓから発生した生殖細胞がら主に 成るｒｏｕｎｄ　ｎｕｃｌｅａｔｅｄ細胞、及び膨張細胞（白血球）を含む。受 精可能な個体においては、球形細胞は精液中の全細胞数の５％以下を占めるに過 ぎないが、それらは感染または正常ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓのホルモン 異常などによる不妊の場合に増加する。精液中に見いだされる生殖細胞は、ｓｐ ｅｒｍａｔｉｄｓ及びｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓを含む。従来の染色技術を用 いた精液ｓｍｅａｒの光顕微鏡による精子前駆体及び白血球の異なる段階間にお ける分化は、信頼性が低かった。これは大きさが形態学的に近似していること、 及び正確な診断のためには高度に熟練した視力が要求されたがらである。球形ｓ ｐｅｒｍａｔｉｄｓ及びｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓはリンパ細胞と間違われる ことがあり、一方非分離ｓｐｅｒａｍａｔｉｄｓはｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｎ ｕｃｌｅａｒ　１ｅｕｃｏｃｙｔｅｓとｃｙｔｏｐｌａｓｍが同一であるために 間違われることがある。
抗白血球モノクローン抗体は、近年免疫化学技術分野において、精液スミア中の 白血球及びその副次集団を特定するために使用されてきた。ヒト生殖細胞及び精 子に対してポリクローン抗体を用いた精子前駆体の識別もまた、免疫蛍光アッセ イ及びトルジンブルー染色を用いて試みられてきた。しかし、その評価は難しく 、また陽性５別のためには電子顕微鏡を用いなければならなかった。本明細書に 参考文献として記したＪａｓｓｉｍ　ａｎｄ　Ｆｅ５ｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ。
Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１　：　７７　（１９８７）参照。
この例は、モノクローン抗体（ｍＡｂ）プローブ、ＭＨＳ−１０（ＩｇＧ１）を 用いた精液スミア中における未成熟生殖細胞の分化分析のための簡単且つ信頼性 高い方法を示すものである。この抗体はヒト精子タンパク質（ＳＰ−１０）を認 識する。該タンパク質は、電子顕微鏡によって免疫細胞化学的に、ゴルジ相及び 精子発生の全ての副次相に配置された。
この例において、ＭＨＳ−１０抗体は、標準免疫ペロキシダーゼ技術を用いて精 液ｓｍｅａｒを組織化学的に染色するために使用された。白血球との潜在交差反 応性を評価するため、抗ＨＬｅ−１（ａ　ｐａｎ−抗ヒト白血球　ｍＡｂ　プロ ーブ）もまた使用された。その結果、抗５Ｐ−１０で染色する球形細胞集団は、 抗Ｈ１ｅ−１では染色しなかった。光体発達の異なる段階におけるｓｐｅｒｍａ ｔｉｄｓは、抗５Ｐ−１０モノクローン抗体によって検出可能である。この抗体 プローブの使用によって、精液スミア中における種々の形態学的に異常な生殖細 胞を速やかに識別できる。
物質及び方法 １、精液サンプル 精液サンプルは、３４の主体から得た。これらの内、７個は、少なくとも子供が 一人いて、最近性病感染していない生殖可能な男性からのものである。３個は、 極めて過少精子症患者からのものであった（＜１０　ｘ　１０　精子／ｍ＋　射 出物）。５個は、アゾ精子症患者からのものであった。８個は、過多精子症患者 からのものであった（〉２５０　ｘ　１０　精子／ｍｌ　射出物）。６個は、そ の精液中の球形細胞数が増大していると診断された患者からのものであり、また ５個は、ｖｅｓｅｃｔｏｍ［ｚｅされた患者からのものであった。不妊患者は、 マサチューセッツ州ボストン所在のＢｒｉｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｗｏｍｅｎ’　ｓ 病院からであった。ルーチンな精液分析は、本明細書に参考文献として記したＨ ｉｌｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｆｅｒｔｊｌ、５ｔｅｒｉｌ７，４７：４６０　（１９ ８７）に開示のようにして行われた。
２、精液スミアの準備 液化精液は、６００　ｘ　ｇで１０分間にわたって遠心分離された。セミナルブ ラスマがアスピレートされ、そして細胞ペレットがフォスフェート緩衝溶液サリ ンで２回洗浄された（ＰＢＳ：　ｏ、ＯＩＭ、ｐＨ７，２）。最終ペレットは、 ＰＢＳ中で約１０７ｃｅ　１１　ｓ／ｍｌにまで再懸濁され、そしてこの懸濁液 の５ｕｌが８−スポット　テフロン被覆顕微鏡スライドの各スポットに適用され た（Ｒｏｂｏｚ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，）ｏスラ イドは乾燥され、１０分間にわたってアセトン中で固定され、そして−７０’Ｃ で冷凍された。
３、単クローン抗体 ＭＨＳ−１０細胞ライン（ＩｇＧｌ）は、２回サブクローンされ、腹水腫瘍とし て成長された。Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、Ｂｏｓｔｏ ｎ、Ｍａ）は、２週間のインターバルで０．５ｍｌ　５ｔｅｒｉｌｅ　Ｐｒ１ｓ ｔａｎｅ（２，６，１０％　１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａ ｎｅ：ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）の１ ゜ｐ、注射でｐｒｉｒｎｅされた。第２注射の一週間後、１０７ハイブリドーマ 細胞はｓ　ｉ、ｐ、０．５ｍｌ　ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ、５ｔｅｒｉｌｅ　ＲＰ ＭＩ−１６４０媒体中に注射された（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ）。
ａｓｃｉｔｅｓ液体は収集され、遠心分離によって細胞破壊から解放され（１， ０００ｘ　ｇ）、そして必要とされるまで一６０℃で保存された。抗Ｈ１ｅ−１ は、カリフォルニア州マウンテンビュー所在のベクトン　デイッキンソンがら購 入された。
４、精子及び球形細胞の免疫組織学的染色精液スミアｒは、５ｔｒｅｐｔａｖｉ ｄｉｎｂｆｏｔｆｎ−ペロキシダーゼシステム（ＳＢＰ）＜Ｈｉｓｔｏｓｔａｉ ｎ　５Ｐ−ｋｆｔ、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　５ｏｕｔｈ　Ｓａ ｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を用いて免疫組織化学的に染色される。本明細 書に参考文献として記したＷｏｌｆａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｆｅｒｔｉｌ、 ５ｔｅｒｉ！、、４９：４９７　（１９８８）参照。非免疫ウサギ血清で非特定 結合位置を１０分間にわたって飽和させた後、１０ｕｌのｍＡｂがスライドの個 々のスポットへ３７℃で３０分にわたって培養された。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅ ｄ副次抗体は、その後１ｏ分間にわたって付加（１０ｕ　ｌ）され、そして１０ ｕｌのストレブタビジン　ペロキシダーゼｃｏｎｊｕｇａｔｅが５分間にわたっ て付加された。免疫反応性生成物は、サブストレート過酸化水素の存在下でクロ モーゲンアミノエチル力ルバゾルを用いて３７　Ｃで５分間にわたってデベロッ プされた。スミアはへマドキシリンにょってカウンタ染色され、水性マウンティ ング媒体によってマウントされた。
各試料スライドは、制御としての主抗体の代わりに、１０ｕｌＰＢＳが付加され たーのスポットを持つ。更に、それらの各々は、ＭＨＳ−１０腹水液（１／１０ ００希釈）液が付加されるーのスポット、抗ＨＬｅ−１（１／２０希釈）が付加 される−のスポット、ＭＨＳ−１０（１／２５０希釈）の混合物が付加されるー のスポット、そして抗ＨＬｅ−１（１／２０希釈）が付加される−のスポットを 持つ。全ての希釈は、ＰＢＳで生成された。
免疫ペロキシダーゼ染色スミアの評価は、Ｌｉｅｔｚ　Ｖａｒｉｏ　Ｏｒｔｈｏ ｍａｔ　ｃａｍｅｒａを装備したＬｅｉｔｚ　０ｒｔｈｏｌｕｘ　顕微鏡上のＬ ｅｉｔｚ　１００／１．３２　ＤＩＣｏｂｊｅｃｔｉｖｅを用イｆ：Ｄ　ｉ　ｆ 　ｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ　顕微鏡 により行われた。Ｅｋｔａｃｈｒｏｍｅ　１６０　タングステンフィルムを用い て撮影が行われた。
結果 １、精液スミアの免疫染色 精液スミア中において、精巣中における成長の種々の段階で廃棄された未成熟生 殖細胞は、光体内抗原５Ｐ−１０に対するＭＭＳ−１０抗体プローブで検出され ることができる。ＭＨＳ−１０ポジテイブ生殖細胞の例は、光体発達の段階に従 って組み立てられた（図１４８−Ｆ）。図１４Ｂは、光体形成のオンセットに先 立つ初期段階の精細胞を描いたものである。図１４Ｃは、核近傍に位置する卵Ｍ Ｈ５−１０ポジティブ粒子を含む発達中の精細胞の免疫組織化学的染色を示した ものである。この図は、ゴルジ相精細胞における初期光体粒子を表している。
図１４は、精子発生のゴルジ相におけるやや大きな免疫染色された光体粒子及び 不完全鞭毛を示したものである。
非濃縮、オーブン核及び免疫反応性成長を表示する精細胞は、図１４Ｈに明らか である。これは、光体発生のより進んだ段階、おそらくはキャップ相精細胞を表 している。この図において、平坦な光体が鞭毛の植え付は位置近傍の位置に存在 している。これは、鞭毛アンラーゲが核に植え付けられる初期精細胞分化期間に おける特徴である。正常試料（図１４Ｆ）中に豊富に存在する成熟精子は、濃縮 された核を包囲する免疫染色された先体を示した。これは、先住発生が完了した 時点では鞭毛の先端に位置している。
サイトキネシス不全を示すアベラント生殖細胞形態は、ＶＨＳ−１０ｍＡｂを用 いて観察された（図１５Ａ−Ｅ）。これらは、双核精細胞を含む（図１５Ａ）。
双核精細胞は、同じ細胞中に２個の光体粒子を含む精細胞であり（図１５Ｂ）。
また単一の精子頭巾において２個の先体によって包囲された濃縮核を含む精子で ある（図１５Ｃ矢印）。図１５Ｄ−Ｅ中に見られるようなイメージは、インタク ト細胞内ブリッジを表すものと解釈される。このブリッジにおいて、娘精細胞は 付着状態で残存すると共に、細胞の集団として明らかに廃棄され、非同期な発達 を示した。図１５Ｄにおける４個の付着細胞の内、−の生殖細胞がｓｐｅｒｍｉ ｏｇｅｎｅｓｉｓのゴルジ相段階にあり（光体小嚢への矢印点）、他の３個は発 達のゴルジ相段階にある。
他の異常精子フェノタイプもまた、単クローン抗体ＭＭＳ−１０を用いて染色さ れた精液中に観察された。双鞭毛尾が、免疫反応性キャップ相光体及び非濃縮核 を示す生殖細胞中に観察された（図１５Ｆ）。微小光体を持つ非濃縮核及び鞭毛 が欠落したキャブブ相ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓを示す精子もまた、観察された。
いくつかの場合では、反応性光体ｒｅｍｎａｎｔｓは、核物質を含む精子頭の７ ラグメントに似たｐｌｅｏｍｏｒｐｈｆｃ　構造中に観察された（図１５■）。
細胞の制限膜下方におけるＭＨＳ−１０ポジティブ反応生成物の周辺カフの例も 観察された（図１５Ｊ−Ｋ）。
ＰＢＳが精液ｓｍｅａｒにおいてｍＡｂの代わりに使用されたネガティブ制御実 験においては、免疫ベロキシダーゼによるレッド−ブラウン免疫反応生成物は存 在せず、わずかに精子及び球形細胞のブルーへマドキシリン　カウンタスティン のみが観察された（データは不図示）。抗−Ｈｌｅ−１単クロ一ン抗体で処理さ れた精液ｓｍｅａｒにおいては、ＡＥＣのレッド−ブラウン染色によって証明さ れるように、白血球のみが組織化学的に反応した。成熟精子及びｓｐｅｒｍａｔ 　ｉｄｓは、抗ＨＬｅ−１抗体と交差反応せず、ブルーのままで残存した（図１ ５Ｌ）。
議論 現在のところ、精液分析中に、従来の先顕微鏡方法を用いて精子前駆体から白血 球を識別することは困難である。「球形細胞」の一般的範鴫は、精液中に存在す る全ての他の細胞形態を精子から識別するために使用されることがある。Ｐａｐ ａｎｉｃｏｌａｏｕ染色、またはＬｅｉｓｈｍａｎ’　ｓ　血液染色とＢｒｙａ ｎ’　ｓ精子染色との組み合わせ、等の過去使用されてきた従来の染色技術は、 ｅｊａｃｕｌａｔｅｓの細胞構成要素上に一般的な形態情報を与えるに過ぎない 。
「球形細胞」の大きさにおけるオーバラップは、決定的診断を困難にしている一 つの理由である。Ｇｒａｎｕｌａｒ白血球は９−１４ｍｍの大きさの範囲にあり 、一方非ｇｒａｎｕｌａｒ白血球は、６６−１２ｕの大きさの範囲にある。ｓｐ ｅｒｍａ　ｔ　ｉ　ｄの平均的サイズは、直径５５−６ｕである。従来の染色を 用いた生殖細胞及び白血球の混合物を含む精液ｓｍｅａｒの分析は、長時間を要 すると共に、リンパ細胞と未成熟生殖細胞とを区別して個々の球形細胞を注意深 く調べなければならないなど、問題が多かった。
現在の研究では、我々はユニークな単クローン抗体及びクロモーゲンＡＥＣを使 用した標準免疫ペロキシダーゼ技術を採用した。これにより、対象球形細胞を容 易に視覚化することができた。この方法に係るＭＨＳ−１０抗体は、ｓｐｅｒｍ ｉ　ｏｇｅｎｓ　ｉ　ｓのゴルジ相及び以降の相で開始する精子前駆体を配置し た。
このｍＡｂにより染色されたヒト精巣のｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓは、それを発 達段階特定抗原（ＳＰ−１０）を対象とすることを示した。これは、ａｄｌｕｍ ｉｎａｌ生殖細胞及び成熟精子に現れるが、ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａには現 れなかった。５Ｐ−１０抗原の光体内１ｏｃｕｓ及びその精巣５ｐｅｃｉｆｉｃ ｉｔｙが確率された。抗原は、副腎、大腸、脳、皮膚、ｔｏｎｓｉｌｇ、肝臓、 腎臓、卵巣、及びｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍからの細胞上には存在せず、また血清 及び周辺血液白血球と反応しなかった。ｃｏｎｖｅｒｓｅｌｙ、本研究で確認さ れたように、白血球抗体ＨＬｅ−１ｈａ、生殖細胞または成熟精子とは反応しな い。
精液ｓｍｅａｒにＭＨＳ−１０ｍＡｂを適用することによって、ｓｐｅｒｍｉｏ ｇｅｎｅｓｉｓの種々の段階において精巣から前もってｓｌｏｕｇｈオフされた 未成熟生殖細胞及び精子の検出が可能となった。Ｊａｓｓｉｍ　ａｎｄ　Ｆｅ５ ｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｏｐ、ｃｉｔ、は、精液中の球形細胞を視覚化するためにマ ウス抗ヒト精子ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体を使用した。しかし、生殖細胞分化の 種々の段階の免疫学的１ｄｅｎｔ　ｉ　ｆ　１ｃａｔ　ｉｏｎは、その研究にお いて光顕微鏡レベルでは不可能であった。というのは、使用される抗体は先棒特 定ではなく、そして全ての生殖細胞の細胞表面と反応したからである。しがし、 電子顕微鏡レベルでの研究では、分化の種々の段階で生殖細胞の存在が示された 。これらの著者は、精液中に異常形ｆｉ（ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ細胞）の生殖 細胞が存在することを示した。電子顕微鏡は、これを証明することができるもの として選択された方法である。後者の方法は高分解能形態データを提供できるも のであるが、時間が掛かると共に、臨床実験セツティングにおいて応用面が少な い。ＭＭＳ−１０単クロ一ン抗体免疫ｒｅａｇｅｎｔは、はぼ無制限的供給にお いてコンスタントな親和正、クラス、均−性及び有用性という利点を提供する。
これにより、以前はｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ免疫ｒｅａｇｅｎｔでは達成困難であ った均一性とｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉ　ｌ　ｉ　ｔｙの標準をｓｐｅｒｍａｔｉ ｄｓのＭＨＳ−１０ポジテイブ５ｕｂｓｅｔの診断に付与できる。
ＭＨＳ−１０を用いた精液ｓｍｅａｒの免疫組織化学的染色により、細胞内ブリ ッジによって結合された娘ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓのクラスタを１ｄｅｎｔ　ｉ　 ｆｙすることができる。このようなりラスタは、ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓの失敗 を示すものである。ｄｉｓｊｕｎｃｔｉｏｎプロセスにおける精巣の部分的失敗 は、ｅｊａｃｕｌａｔｅにおけるｍｕｌｔｉｃｌｅａｔｅｄ精子の存在を説明す るものである。細胞内ブリッジによって結合された生殖細胞群が精巣内の付加ｄ ｉｓｒｕｐｔｉｖｅ力を受けない時、それらの間のｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ は除徐に消滅してゆき、そして球形ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ　ｍａｓｓが 形成される。このｍａｓｓは、細胞の原クラスタにおいてｃｏｎｊｏｉｎされた 時同様の多数のｎｕｃｌｅｉを含む。ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓの個々のｓｐｅｒｍ ａｔｏｚｏａへの分離の正確な段階及びメカニズムは知られていないが、ＭＨＳ −１０プローブは、そのような細胞ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのｒｉｇｉｄ　ｑｕ ａｎｔｉｔａｔｔｏｎを可能にする。
細胞内ブリッジによって互いに結合されたｓｐｅｒｍａｔｆｄｓは５ｙｎｃｙｔ ｉａｌ関係においてより発生しやすく、正常なｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉＳ では、発達のｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎは分化を制御する化学的因子の均一分布 によって達成される。このように、ＭＭＳ−１０で染色された結合ｓｐｅｒｍａ ｔｉｄｓのｃｏｈｏｒｓが何故光体形成の異なる段階で観察されるのかは明確で ない（図１５Ｄ−Ｅ）。本明細書に参考文献として記したＤｙｍ　ａｎｄ　Ｆａ ｗｃｅｔｔ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、、４：１９５　（１９７１）は、ｒａｍ とラットの分１１ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａを結合するブリッジにおけるｍｕ ｌｔｉｐｌｅ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｃｉｓｔｅｒｎａｅの発生を報告してい る１、これらの膜構造の存在は、ｃｏｎｊｏｉｎｅｄ細胞の細胞体間の連続性を 一時的に中断し、これによってその細胞発達の若干のａｓｙｎｃｈｒｏｎｙが現 れる。分離ブリッジもまたｐｏｓｔｋａｒｙｏｋｉｎｅｔｉｃ　ｓｐｅｒｍａｔ ｉｄ　ｎｕｃｌｅｉに付随して観察されるが、膜制限ｃｉｓｔｅｒｎａｅは娘細 胞のｎｕｃ　ｌ　ｅ　ｉのｒｅｃｏｎｓｔｕｔｕｔｔｏｎ後短時間でｐｅｒｓｉ ｓｔする。
このような観察は、実験動物の精巣に制限され、ヒト精液中では報告されること はない。ＭＨＳ−１０抗体プローブは、このようにまずヒト精液中におけるｓｐ ｅｒｍａｔｉｄｓのａｓｙｎｃｈｒｏｍｏｕｓ　ｃｏｈｏｒｓの発生のｄｏｃｕ ｍｅｎｔａｔｉｏｎを可能とした・ 精巣中におけるｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ及び生殖細胞がクラスタまたは個々に５ ｅｊａｃｕｌａｔｅへ５ｈｅｄ　（Ｓｐｅｒｍｉａｔｉｏｎ）されるメカニズム は、わずかしか理解されていない。精液における生殖細胞の意義に関しては、一 層の研究が必要である。ＭＭＳ−１０プローブは、その発達における特定段階に おいてｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙに５ｈｅｄされた生殖細胞の特定５ｕｂｓｅｔの 相対割合の決定において極めて有用であることが判明した。このｃａｔｅｇｏｒ ｉｚａｔｉｏｎは「球形細胞」症候群の原因を持つｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ病理の 異なるタイプを明かにするのに有用である。本明細書に参考文献として記したＳ ｏｎｄｅｒｓｔｒｏｍ　ａｎｄ　Ｓｕｏｍｉｎｅｎ、Ａｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ。
Ｌａｂ、Ｍｅｄ、、１０４；４７６　（１９８０）は、ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ　 ｂｉｏｐｓｉｅｓに対する電子顕微鏡研究により、ｍｅｉｏｔＬｃ　ａｒｒｅｓ ｔはｐａｃｈｙｔｅｎｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓの蓄積及びｓｅｍｉｎｉ ｆｅｒｏｕｓ　ｔｕｂｕｌｅｓにおけるｓｐｅｒｍａｔＬｄｓの欠落に付随する ものであることが証明された。この増加は、そのような患者の精液において、ｐ ａｃｈｙｔｅｎｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓと反応する段階特定ｍＡｂの使 用がｍｅｉｏｔｉｃ　ａｒｒｅｓｔを持つ患者を迅速に突き止めるための有用な マーカとなるように、反映しているようである。同様に、ＭＭＳ−１０によ、て １ｄｅｎｔ　ｉ　ｆｙされたｓｐｅｒｍａｔｉｄ発達の特定段階の精液中におけ る細胞蓄積は、「球形細胞」症候群を持つ患者の５ｕｂｆｅｒｔｉｌｉｔｙまた は不妊性を引き起こす病理を明らかにした。
要約すると、かなりの数の球形細胞を含有する洗浄されたヒト精液からのアセト ン乾燥ｓｍｅａｒが、ｍＡｂ　ＭＨＳ−１０によってプローブされた。単クロー ン抗体標識細胞は、光顕微鏡を用いた標準５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉ。
ｔｉｎ免疫ベロキシダーゼ方法によって視覚化された。ＭＨＳ−１０ｍＡｂは、 成熟精子及び発達中ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓと診断された球形細胞のサブセットと 免疫反応した。このサブセットは、光体形成の異なる段階における精巣から８１ ｏｕｇｈ　ｏｆｆされたものである。精液中の白血球とｍＡｂとの可能交差反応 をｒｕｌｅ　ｏｕｔするため、白血球表面マーカ（抗ＨＬｅ−１）がＭＨＳ−１ ０と結合して使用された。ＭＨＳ−１０と染色する球形細胞ｐｏｐｕｌａｔｉ。
ｎは、抗ＨＬｅ−ｉとは染色しなかった。ＭＭＳ−１０ｍＡｂは、精液分析中に 、未成熟生殖細胞のサブセットの分化診断のためのユニークな免疫ｒｅａｇｅｎ ｔを提供するものである。ｍＡｂ　ＭＨＳ−１０は、このように、ヒト精液中に おける未成熟生殖細胞のｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ及び１ｄｅｎｔｉｆｔｃａｔ ｉｏｎのためのプローブを約束するものである。
実験結果の要約 上記例は、ヒト精子タンパク質である５Ｐ−１０が分化抗原であることを示した 。該分化抗原は、ゴルジ相及びｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓ　Ｉｇの以降の段階に おける球形ｓｐｅｒｍａｔＬｄｓ中に検出された。５Ｐ−１０は、ｓ　ｐ　ｅ　 ｒｍａｔｉｄｓのｎａｃｅｎｔ先体ｖｅｓ光体ｌｅ中に存在し、成熟精子中の先 体内タンパク質であり、そしてｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃである。タンパ ク質は、１ｏｎｏｐｈｏｒｅ誘起先体反応精子のｅｑｕａｔｏｒｉａｌセグメン トまたは内部光体膜に付随して残存する。
これらの観察は、５Ｐ−１０及びそのｃｏｇｎａｔｅ単りａ−ン抗体ＭＨ５−１ ０が、次のａ）及びｂ）のために有用なマーカ／プローブシステムを提供すると いう示唆を導いた：　ａ）精液中における未成熟生殖細胞の診断；　及びｂ）先 住反応のスコアリング。更に、５Ｐ−１０は、ＷＨＯの避妊ワクチンタスクフォ ースによりｒｐｒｉｍａｒｙ　ワクチン候補」と指定された。これは、その組織 ５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ及び、ＭＨＳ−１０単クロ一ン抗体がハムスタ卵侵入試 験における受胎を阻止するという証拠に基づくものである。
ヒト精子抽出物の免疫ｂｌｏｔにおいて、免疫反応性５Ｐ−１０ペプチドのｐｏ ｌｙｍｏｒｐｈｔｓｍは、１８−３４ｋＤａにわたる範囲に観察された。単クロ ーン抗体ＭＨＳ−１０とのこの免疫反応性バクーンは、各個体中に保持され、ｒ ｅｄｕｃｉｎｇ　ａｇｅｎｔによって影響を受けることはない。２−ＤゲルのＷ ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔは、２４−３４ｋＤの抗原ペプチドが４．９のｐｉを持 ち、一方約１８ｋＤのペプチドは５．　１−５．　４の範囲のｐｉを持ち、より 基本的である。
先体内タンパク質５Ｐ−１０のためのｃＤＮＡコーディングはクローンされ、特 徴化された。３個のオーバラップ５Ｐ−１０特定ｃＤＮＡは、ヒト精巣ｃＤＮＡ 発現ライブラリーから分離された。これらのｃＤＮＡは、１．３５ｍＲＮＡにハ イブリダイズされた。この１．３５ｍＲＮＡは、ヒト精巣中に存在するが、肝臓 または胎盤には存在しない。これらｃＤＮＡの完全配列は、５Ｐ−１０タンパク 質のための２６５アミノ酸コーデイング領域を含む１１１７ｂｐ配列を生成した 。５ｐ−ｉｏは、２８．３ｋＤのｐｒｅｄｉｃｔｅｄ分子重量を持つ。ｄｅｄｕ ｃｅｄアミノ酸配列から発生した疎水ｐｌｏｔは、信号ペプチドを特徴とする極 めて疎水性の強いアミノ端末を示した。５Ｐ−１０は、前免疫組織データ、及び ５Ｐ−１０ｃＤＮＡ配列は３個のデータベースに見いだされる他の配列に対して 何等の意義あるｈｏｍｏ　ｌｏｇｙも示さなかったという観察に基づくユニーク 光体タンパク質として現れる。
組み換え５Ｐ−１０融合タンパク質は、Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクトル中で生成され 、このプロトタイプ組み換えワクチンは、ウサギ中でｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎ ｔｔｓｅｒａを発生するために使用された。このウサギａｎｔｔｓｅｒａは、先 住キャップをその位置で染色し、５ｐ−１ｏへの単クローン抗体の場合同様、Ｗ ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ上で類似のペプチド組と反応した。ウサギは、ワクチン の影響を受けなかった。これらの結果は、組み換え５Ｐ−１０ワクチンが、哺乳 動物中において、ｎａ　ｔ　ｔ　ｖｅヒト精子５Ｐ−１０を認識する免疫応答を ｅｖｏｋｅすることが可能なことを示した。
当業者であれば、本発明の生成物及び方法に対して種々の変更や改良を施すこと が可能であることは明白である。このように、本発明は、以下に記した各クレー ム及びその相当内容の範囲内であれば、そのような変更や改良を包含するもので ある。
ＮＦＩ　ＮＲＮ　ＲＮ　・ＲＮＦＩＮＲπ・ 一　〇 ′　禰−１８，０ ＡＢ　ＡＢＡＢＡＢＣＣＣＣ ＨＢ　Ｒｔ　Ｒｂ ＾−゛Ｃ＾゛畠Ｃ＾−ＣＡ・Ｃ Ｌｌｆｍ　エ ρ０１ソＡ＋　ＲＮＡ ０．２４− Ｋｂ ４．４− ２．３− ｌｌｌ０ ｄ ７一 国際調査報告 ｍ６陶ｔｃｙｌｕｓｓｏｚｏｏｑｔｓ ｍｎ”ｔ”ｅ”１ａ６Ｄ”ｔ’ｓ−”Ｎ・ｒ／ＩＩ＜ＱＯ１０Ｏ’＋７９ＰＣＴ １０８９０１００９フＢ ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ　Ｔｏ　ＦＯＲＭ　ＰＣＴ／ＩＳＡ　２１０．ＰＡＲＴ　 Ｖｌ、ｌ。
ｔ、Ｃｌａｉｍｓ　１−１８．４４　ａｎｄ　４６　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ 　ａ　５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｔｆｉｅｄ　１ｎｔｒａ−ａｃｒｏｓ ｏｒｎａｌ　ｈｕｍａｎ　５ｐｅｔｌｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ、　ａｎ　ｉｍｍｕ ｎｏｇｅｎｉｃｐｏｌｙｐ＠ｐｔｉｄｅ、ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　 ｍａｔｔｅｒ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｐｕｒ＠　 ｐｏｌｙｐ＠ｐｔＬｄｅｓｅ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｅｐａｒｚｎｇ　 ５ａｉｄ　Ｌｎｔｒａ−ａｃｒｏｓｏｍａｌｈｕｌｌｌａｎ　５−ｒＴＩＩａｎ ｔｌＱＩＩＩｎ、ａ　ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ　ＶａｅＣｉｎ’ｌｌ＋　ａ 　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆＣｏｎＬｒａｃｌｌｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　Ｃ０ｎｔｒ ａＣｅｐｔｉＶ４１　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ＋　ｃｌａｓ！１ｉｆｉｅｄ　１ ｎｃｌａｓｓｅｓ＋　４３５，５ｕｂｃｌａｓｓ　２１　４２４，５ｕｂｃｌａ ｓｓ　８Ｊ　５１４＃　ｓｕｂｃｌａｇｓ　２ａｎｄ　５３０．ｇｕｂｃｌａｓ ｓｅｓ　３５０，４１３，４１７，８０１１゜Ｉｌ、Ｃｌａｉｍｓ　１９−２７ １　２９．３１１　３３．３４　ａｎｄ　４７　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｒ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａＬ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａし　ｒｅａｃｔｓ　ｗｔセｈｔｈｅ　ｉｎｔｒａ−ａｃｒ ｏｓａｍａｌ　ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍ　ａｎｔｉｇｅｎ、δｍｅ乞ｈｏｄ　ｏ ｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎすｍｏｎｏｃｉｏｎａＬ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａｎ　 ｉｎ　ｖＬｖｏ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍｏｎｏ−ｃ、Ｌ ｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｅｌｌ　Ｌｉ ｎｅ、ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｄｅｔｅｃ七ｉｎｇ　ａｃｒｏｓｏｍａｌ　ａｂ ｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａ　ｈｕｍａｎ　５ｐｓｎ＋＋、　ａｎｄ　ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 ａｎｔｉｌ）Ｏｄｙ＋　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎｃＬａｓｓｅｓ＋　４２４ ＋　５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ　８５．Ｌ８５．９＋　４３５．５ｕｂｃｌａｓｓｅ ｓ　７，１７２．２゜２４０．２７１　４３６ｔ　５ｕｂｃｌａｓｓ＠ｓ　６３ ，５０１，５４８，８１１１　５３０．　５ｕｂｃｌδｓｓ　３８７　ａｎｄ９ ３５＋　５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ　９５＋１０３＋１０６ＪＩＯ。
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ＰＣＴ／ＬＩＳ９０１００９７８ ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ　Ｔｏ　ＦＯＲＭ　ＰＣＴ　ＩＳＡ　２１０　ＰＡＲＴ　 ＩＩ。
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Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. １．先体反応後、ヒト精子に付随して残存するほぼ純粋化された先体内ヒト精子 抗原。
  2. ２．請求項１に記載の抗原において、前記抗原は、先体反応に先立ち、成熟ヒト 精子の外部先体膜の内面及び内部光体膜の外面に付随することを特徴とする。
  3. ３．請求項２に記載の抗原において、前記抗原は先体反応後に内部失体膜に付随 して残存すると共に、前記精子の赤道セグメント中に保持されることを特徴とす る。
  4. ４．請求項２に記載の抗原において、前記抗原は、精子発生の過程で発生する精 巣特定分化抗原であり、ヒト集団中に保持されることを特徴とする。
  5. ５．請求項３に記載の抗原において、前記抗原は、約１８−３４キロダルトンの 分子重量を持つポリペプチド族であり、該ポリペプチドは、約４．９−５．４の 範囲にわたる等電点を持つことを特徴とする。
  6. ６．請求項５に記載の抗原において、該抗原は前記ポリペプチドの内の一のフラ グメントを含み、該フラグメントはヒトまたは他の霊長類に対して避妊作用を持 つことを特徴とする。
  7. ７．請求項１に記載の抗原において、前記抗原は、図１１Ａに示したアミノ酸配 列を持つことを特徴とする。
  8. ８．請求項７に記載の抗原から派生した免疫原ポリペプチドにおいて、前記ポリ ペプチドは、哺乳動物へ注射されたときに避妊効果を発揮することを特徴とする 。
  9. ９．図１１Ａにおいて６１−８５５と指定されたヌクレオチドによりコード化さ れる免疫原ポリペプチド。
  10. １０．図１１Ａにおいて、ヌクレオチド４８７−８５５によりコード化される免 疫原ポリペプチド。
  11. １１．請求項５のポリペプチドに対して実質的な相同性を示すほぼ純粋なポリペ プチドを含む化合物。
  12. １２．請求項５のポリペプチドの内の一または複数が変質されて−または複数の ポリペプチドを形成し、該ポリペプチドは前記変質前のポリペプチドに比較して 向上した避妊作用を持つ化合物。
  13. １３．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１００３９と指定される細胞ライン、または該細胞ラ インの突然変異、変化体によって生成される単クローン抗体と反応するほぼ純粋 化されたヒト精子抗原。
  14. １４．請求項１に記載の抗原を準備する方法であって、以下の各ステップを含む ことを特徴とする； 成熟ヒト精子を均質化するステップ； 前記均質化された精子から可溶タンパク質を抽出して、請求項１の抗原を含む抽 出物を得るステップ； 前記抽出物を請求項１の抗原と反応する不動態化された単クローン抗体と接触さ せ、これによって前記単クローン抗体と前記抗原との不動態化された複合体を形 成するステップ； 前記抗原を前記単クローン抗体から分離させて前記抗原をほぼ純粋化した状態で 再生するステップ。
  15. １５．請求項１に記載の抗原を準備するための方法であって、以下の各ステップ を含むことを特徴とする； 成熟ヒト精子を均質化するステップ； 前記均質化した精子から可溶タンパク質を抽出して請求項１の抗原を含む抽出物 を得るステップ； 前記抽出物を逆相ＨＰＬＣコラムへ適すステップ；前記コラムからフラクション を再生するステップ；１次元または２次元電気泳動によって前記フラクションの 各々のタンパク質構成物を分離させるステップ； 全構成物を前記抗原と反応するモノクローン抗体と反応させることによって請求 項１の抗原を含む構成物を識別すると共に、免疫化学技術により前記抗原を含む 構成物を検出するステップ；及び 前記抗原をほぼ純粋状態で再生するステップ。
  16. １６．請求項１５の方法によって生成されたほぼ純粋化されたヒト精子抗原。
  17. １７．免疫化学的に有効な量の請求項１の抗原を薬理学的に受容可能なキャリア 中に含むことを特徴とする避妊用ワクチン。
  18. １８．免疫学的に有効な量の請求項１の抗原を女性に対して薬理学的に受容可能 なキャリア中に投与することを含む避妊方法。
  19. １９．請求項１のヒト精子抗原と反応するモノクローン抗体またはポリクローン 抗体。
  20. ２０．請求項１９に記載のモノクローン抗体において、前記抗体は、ほぼ全ての ヒト体組織と交差反応をせず、ハムスタ卵侵入試験における精子−卵相互反応を 禁止することを特徴とする。
  21. ２１．先体反応後に成熟ヒト精子の内部及び外部先体膜に付随する先体内ヒト精 子抗原と反応するモノクローン抗体を生成するための方法であって、以下の各ス テップを含むことを特徴とする； 哺乳動物を先体反応後のヒト精子または先体反応後のヒト精子を遠心分離するこ とによって得られた上清で免疫化するステップ；前記哺乳動物から抗体生成細胞 を得るステップ；前記細胞を種瘍細胞を融合させてハイブリドーマを生成するス テップ；前記ハイブリドーマを先体反応後のヒト精子または先体反応後のヒト精 子を遠心分離することによって得られた上清でスクリーンすることによって、先 体反応後に成熟ヒト精子の内部及び外部先体膜に付随する先体内ヒト精子抗原と 反応する抗体を生成する少なくとも一のハイブリドーマを識別するステップ；及 び前記識別されたハイブリドーマから前記抗体を再生するステップ。
  22. ２２．請求項１のヒト精子抗原と反応するモノクローン抗体を生成する方法であ って、以下の各ステップを含むことを特徴とする；ＡＴＣＣＨＢ１００３９また はその突然変異または変化体の特徴を持つハイブリドーマを培養媒体中で培養す るステップ；及び前記媒体から前記モノクローン抗体を再生するステップ。
  23. ２３．請求項１９のモノクローン抗体を生体内で生成する方法であって、以下の 各ステップを含むことを特徴とする； 組織互換可能または免疫抑制動物ホストへ前記抗体を生成するハイブリドーマを 皮膚内へ配置するステップ；及び 前記ホストの腹水液から生成された抗体を再生するステップ。
  24. ２４．請求項２１に記載の方法において、更に前記識別されたハイブリドーマを クローン拡張して前記モノクローン抗体を生成する連続細胞ラインを生成するス テップを含むことを特徴とする。
  25. ２５．請求項２１に記載の方法において、更に前記モノクローン抗体を純粋化す るステップを含み、該純粋化ステップは以下のサブステップを含むことを特徴と する； 前記モノクローン抗体を含むサンプルをフラクションされた物質と混合して前記 サンプル中に免疫グロブリンを沈澱させ、前記免疫グロブリンに前記モノクロー ン抗体を含むようにするステップ； 前記沈澱した免疫グロブリンを前記サンプルから分離させるステップ；前記免疫 グロブリンを溶液中へ配置し、該溶液を透析して前記フラクション物質を除去し 、これによって前記モノクローン抗体を含有した透析物を生成するステップ； 前記透析物に免疫親和性クロマトグラフィーを施し、これによって前記モノクロ ーン抗体を前記免疫グロブリン結合物質から分離して前記モノクローン抗体を純 粋な状態で再生するステップ。
  26. ２６．請求項２１に記載の方法によって生成されたモノクローン抗体。
  27. ２７．請求抗２４の方法によって生成された連続細胞ライン。
  28. ２８．霊長類中の抗精子抗体を測定する方法であって、以下の各ステップを含む ことを特徴とする； 請求項１の抗原を前記霊長類からの組織サンプルと接触させるステップ；及び抗 原−抗体複合体が形成されたかどうかを決定するステップ。
  29. ２９．先体反応を受けるヒト精子を検出する方法において、以下の各ステップを 含むことを特徴とする； 請求項１８のモノクローン抗体を、前記抗体と任意の先体反応後の精子とが抗原 −抗体複合体を形成するに十分な条件下で所定時間にわたってヒト精子のサンプ ルと接触させるステップ；及び 前記抗原−抗体複合体を検出するステップ。
  30. ３０．先体反応後のヒト精子細胞を分離するための方法であって、以下の各ステ ップを含むことを特徴とする； 請求項１９の不動態化されたモノクローン抗体を、前記抗体が前記精子細胞と結 合して抗体−精子細胞複合体を形成するに十分な条件下で所定時間にわたってヒ ト精子細胞を含むサンプルと接触させるステップ；前記サンプルからの前記複合 体を除去するステップ；及び前記抗体から前記精子細胞を分離して前記精子細胞 を分離体として再生するステップ。
  31. ３１．ヒト精子中または該精子中の先体発達段階における先体異常を検出する方 法出会って、以下の各ステップを含むことを特徴とする；ヒト精子を含むサンプ ルを請求項１９のモノクローン抗体と接触させ、前記抗体が検出可能媒体によっ て標識されるステップ；前記検出可能に標識された抗体によって形成された像を 評価するステップ；及び 前記像をヒト精子の種々の発達段階における周知または標準の像と比較するステ ップ。
  32. ３２．サンプル中のヒト精子を検出または分離する方法であって、以下の各ステ ップを含むことを特徴とする； サンプルを、前記抗体が前記サンプル中の任意の不動態化された精子と反応して 抗体−抗原複合体を形成するのに十分な条件下で所定時間にわたって請求抗１９ のモノクローン抗体と接触させるステップ；及び前記複合体を検出しまたは前記 複合体からの精子を除去するステップ。
  33. ３３．ヒト精子を生化学的、免疫学的、機能的、または他の研究のために分析す るための方法であって、該方法は、請求項１９のモノクローン抗体を前記分析を 行うのに効果的な量だけ用いることを特徴とする。
  34. ３４．ヒト精子を生化学的、免疫学的、機能的、または他の研究のために分析す る方法ための化合物であって、受容可能な固体支持体上または受容可能なキャリ アとの混合物中に不動態化された請求項１９のモノクローン抗体の効果的量を含 むことを特徴とする。
  35. ３５．請求項１の抗原をコード化する分離されまたはほぼ純粋化されたＤＮＡ配 列。
  36. ３６．請求項３５に記載のＤＮＡ配列において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡであるこ とを特徴とする。
  37. ３７．請求項３６に記載のｃＤＮＡ配列において、前記配列は、図１１Ａに示さ れたヌクレオチド配列であることを特徴とする。
  38. ３８．請求項３６に記載のｃＤＮＡ配列において、前記配列は、個体中に見いだ される天然対立変化体を示すことを特徴とする。
  39. ３９．単一またはマルチ突然変異によって請求項３５のｃＤＮＡ配列から派生し た分離されまたはほぼ純粋化されたＤＮＡ配列。
  40. ４０．高厳密性の条件下で請求項３６のｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮ Ａ配列。
  41. ４１．前記ＤＮＡ配列の発現を変換されたホスト中に発効させることのできる適 切な調整制御核酸配列に機能的に連結された請求項３５のＤＮＡ配列を含む組み 換えＤＮＡ配列。
  42. ４２．請求項１の抗原に対してコード化するＤＮＡを互換ホスト中に発現させる ための発現ベクトルであって、プロカリオチックまたはエウカリオチック細胞及 び前記ベクトルへ挿入された請求項３５のＤＮＡを適切な方向及び発現のための 正しい読み出し方向へ変換させることのでくｒ発現ベクトルを含むことを特徴と する。
  43. ４３．請求項３５の組み換えＤＮＡ配列で変換されたホスト細胞。
  44. ４４．請求項４３の変換された細胞により生成された抗原。
  45. ４５．請求項１の抗原を生成するための方法であって、以下の各ステップを含む ことを特徴とする； 変換された細胞中に前記ｃＤＮＡ配列を発現させることのできる適切な調整制御 核酸配列に機能的に結合される請求項１の抗原に対してコード化するｃＤＮＡ配 列を含む組み換えＤＮＡ配列によって変換されたホスト細胞を培養するステップ ；及び その発現が前記配列によってコード化されたポリペプチドを再生するステップ。
  46. ４６．請求項１の抗原を含む融合タンパク質を含む免疫原ポリペプチド。
  47. ４７．請求項１９のモノクローン抗体を薬理学的に受容可能なキャリア中に含有 した避妊用化合物。
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