DE69931363T2

DE69931363T2 - Sp22, ein mit fruchtbarkeit assoziiertes protein aus spermien, und ein verfahren zum abschätzen und beeinflussen der männlichen fruchtbarkeit durch dessen gebrauch

Info

Publication number: DE69931363T2
Application number: DE69931363T
Authority: DE
Inventors: Gary Fuquay-Varina KLINEFELTER
Original assignee: US Environmental Protection Agency
Current assignee: US Environmental Protection Agency
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: DE69931363D1; WO1999054354A9; AU3646099A; EP1071712B1; EP1071712A1; WO1999054354A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Spermaprotein, das verwendet werden kann zum Evaluieren, Inhibieren, und/oder Verstärken männlicher Fertilität sowie Antikörper gegen das Spermaprotein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Spermienproduktion im Hoden menschlicher Männer ist weit weniger effizient, als Spermienproduktion in anderen Säugetieren, wie Ratte, Kaninchen, und Affe (Amann, 1970) aufgrund einer erhöhten Rate an Keimzellatresie. Hinzu kommt die Tatsache, dass eine große Anzahl von Spermien im Ejakulat eines fertilen Mannes morphologisch abnormal ist (Wyrobek et al., 1982). Daher gibt es ein verstärktes Bewusstsein für die Möglichkeit, dass die Quantität und Qualität von Spermien in den Ejakulaten von Männern abnehmend sind aufgrund von Umwelteinflüssen (Sharpe, 1993). Eine Gift-Induzierte Veränderung im Prozess der Spermienreifung während des Spermiendurchgangs durch den Nebenhoden, das Organ in welchem das Sperma die fertilisierende Fähigkeit erwirbt, kann einen Mann infertil machen. Es wurde angenommen, dass spezifische Proteine im Nebenhoden zum Sperma zugegeben werden, welche Fertilität verleihen. Kürzliche zeigten Klinefelter et al., im Journal of Andrology 15 (4) 318–327, (1994), dass ein 18kD Nebenhodensperma-Oberflächenprotein vermutlich ein Plasmamembranprotein gut mit Fertilität korreliert war, obwohl nicht geglaubt wurde, dass dieses Protein Fertilität voraussagen kann.
Es besteht weiter ein großes Interesse im Entwickeln neuer und verbesserter Kontrazeptiva. Neue Kontrazeptiva sollten besser als bereits existierende Produkte sein z. B. orale Kontrazeptiva, die von Millionen von Frauen über die letzten 30 Jahre verwendet wurden sind nicht nur sicher und wirksam, sondern schützen Frauen sogar gegen manche Krebsarten. Dennoch werden andere Verfahren der Verhütung noch immer von vielen Teilen der Weltbevölkerung benötigt, da viele Frauen keinen verlässlichen Zugang zu oralen Kontrazeptiva haben, oder an Nebenwirkungen der Hormone, die in oralen Kontrazeptiva verwendet werden, leiden.
Zusätzlich wird der Fertilitätstest immer weiter verbreitet, da zunehmende Anzahlen von anscheinend infertilen Paaren medizinische Hilfe bei der Empfängnis suchen.
Da reproduktive Abnormalitäten beider Geschlechter die Fertilität beeinflussen können, wird üblicherweise die männliche Fertilität in Fertilitätsevaluierungen bestimmt. Während der Hauptstartpunkt für die Evaluierung der männlichen Fertilität die Bestimmung der Spermienzahl in der Samenflüssigkeit ist, ist die Spermienbeweglichkeit ebenfalls wichtig für die Fertilität. Daher ist in männlichen Fertilitätsanalysen die Spermienbeweglichkeit ebenfalls ein Faktor gewesen.
Zur Zeit verfügbare Techniken zum Messen der Spermienzahl und Spermienbeweglichkeit sind mikroskopischer Natur. Eine quantitative Evaluierung der Spermienmorphologie und -beweglichkeit erfordert im Wesentlichen Erfahrung seitens des Labortechnikers. Der hohe Level an Erfahrung, der von Labortechnikern verlangt wird, schließt eine gewöhnliche Amtsevaluierung von Spermaproben aus und erfordert üblicherweise eine ärztliche Überweisung an ein spezialisiertes Labor. Selbst mit adäquaten Mitteln können Fremdkörperpartikel in Spermaproben fehlerhafte und inkonsistente Ergebnisse verursachen.
Versuche biochemische Spermaassays zu entwickeln, haben nicht zu einfachen Prozeduren geführt, die entweder im Sprechzimmer gemacht werden können oder einem zugehörigen Spermaevaluierungslabor. Die meisten biochemischen Marker waren nicht erfolgreich darin, Korrelationen mit Spermienanzahl, -beweglichkeit oder -fertilität zu zeigen. Bezüglich der Aktivität der Fumarase, ein Enzym, das im Samen vorhanden ist, wurde herausgefunden sowohl mit der Spermienzahl als auch mit prozentualer Beweglichkeit zu korrelieren, Crabbe J. Reprod. Fert. 51: 73–76 (1977). Crabbe hat Fumaraseaktivität über spektophotometrische Messungen gemessen. Unglücklicherweise sind spektophotometrische Assays nicht allgemein geeignet für Amtsprüfungen aufgrund der Kosten dieser speziellen Geräte sowie die Schulung, die erforderlich ist für eine akkurate und reproduzierbare Bedienung.
Dorian baute in U.S.-Patent Nr. 5,434,057 Crabbe's Verfahren weiter aus, durch das Zur-Verfügungstellen von Geräten zum Bestimmen der Spermienzahl und -beweglichkeit in Spermaproben, die einen festen Träger umfassen, mit einer Trägermatrix, die ein Fumarasesubstrat und Malatdehydrogenase enthält. Die Probe wird auf die Trägermatrix gegeben und ein optisches Signal, das aus dem Metabolismus des Fumarasesubstrats durch die Fumarase in der Probe resultiert, wird vom festen Träger detektiert. Während dieser Assay bewegliche Spermien in einer Spermaprobe detektiert, gibt es weder ein Verfahren zum Inhibieren der Fertilität noch zum Ausselektieren der fertilsten Spermien in einer Probe. Feuchter et al., offenbaren in U.S.-Patent Nr. 5,250,417 ein Verfahren zum Detektieren der Fähigkeit von Spermien, sich der Akrosomreaktion zu unterziehen, um die Bestimmung der Fertilität von männlichen Säugetieren zu ermöglichen. Die Akrosomreaktion ist ein Prozess, bei dem Spermien hydrolytische Enzyme freisetzen, die die Zona pellucida auflösen, die durchdrungen werden muss, um es Spermium und Ovum zu ermöglichen, in Kontakt zu kommen, zu verschmelzen und den Fertilisationsprozess zu vervollständigen.
In jüngsten Jahren haben andere Studien verschiedene Proteine die mit Spermien assoziiert sind anvisiert in einem Versuch, neue Kontrazeptiva-Alternativen bereitzustellen. Bedeutende Forschungsanstrengungen beinhalten immunologische Ansätze zur Fertilitätskontrolle. Die Entwicklung von empfängnisverhütenden Impfstoffen ist auf die Immunneutralisation von reproduktiven Prozessen hin gerichtet oder stört die Befruchtung durch Einbringen von Antikörpern gegen Oozyten und Spermatozoen. Mehrere Spermienantigene für die gezeigt war, dass sie hohes immunkontrazeptives Potential besitzen, sind das humane Spermienmembranantigen (SP-10) und Meerschweinchen-Spermienmembranprotein (PH-20). SP-10 ist ein Spermienmembran-spezifisches Antigen von 24–34 kD, das unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (MHS-10) isoliert wurde, der kreuzreagiert mit dem gesamten akrosomalen Bereich. Es ist assoziiert mit der Außenpartie der inneren Akrosommembran und der Innenseite der äußeren Akrosommembran vom reifen humanen Spermium. Es ist rekombinant in einem Escherichia coli Expressionssystem reproduziert worden.
PH-20, ein Meerschweinchen-Spermiumprotein von 64 kD ist sowohl in der Plasmamembran als auch der inneren Akrosommembran des Spermiums vorhanden. Es ist essentiell für die Adhäsion des Spermiums an die Zona pellucida, den ersten Schritt im Befruchtungsprozess. Aktive Immunisierung mit PH-20 verursacht Unfruchtbarkeit sowohl in männlichen als auch weiblichen Meerschweinchen für einen Zeitraum im Bereich von sechs bis fünfzehn Monaten.
O'Rand et al., offenbaren in U.S.-Patent Nr. 5,175,148 ein Spermienantigen, das einem autoantigenen Epitop des Spermiums entspricht, das als immunkontrazeptiver Wirkstoff, sowie zum Diagnostizieren autoimmuner Unfruchtbarkeit verwendet werden kann. Das synthetische Peptid entspricht einem autoantigenen Epitop eines Kaninchenspermienmembran-Autoantigens.
Einige andere Antigene mit gutem immunkontrazeptivem Potential sind identifiziert und in Versuchstieren untersucht worden, einschließlich Lactatdehydrogenase-x, ein auf männliche Keimzellen beschränktes Isoenzym der Lactatdehydrogenase. Für ein synthetisches Peptid basierend auf einem Teil dieses Antigens wurde gezeigt, dass es Fertilität in Versuchstieren reduziert. Unglücklicherweise stellten die meisten Studien fest, dass das Maß und die Dauer der immunkontrazeptiven Wirkungen weniger als akzeptabel sind. Ein Problem bei immunologischen Ansätzen zur Antifertilitätsforschung ist die Notwendigkeit eines sicheren, wirksamen Adjuvans' und geeigneter Tiermodelle zum Evaluieren der Wirksamkeit und Sicherheit von Verfahren.
Obwohl die meiste Kontrazeptivumforschung auf die Verwendung in Frauen gerichtet war, gibt es ein Interesse an der Kontrolle der männlichen Fertilität, sowohl von einem wissenschaftlichen, als auch einem biologischen Standpunkt. Viele Verbindungen sind identifiziert worden, als solche, die männliche Antifertilitätswirkung haben, in verschiedenen Spezies, z. B. Gossypol, 5-thio-D-Glucose und 6-chloro-deoxyglucose. Studien wurden ebenfalls durchgeführt hinsichtlich der Verwendung von Androgenen, um männliche Fertilität zu kontrollieren. Unglücklicherweise erscheinen die meisten Verbindungen die als nützlich für die Kontrolle von männlicher Fertilität identifiziert wurden, irreversible Antifertilitätswirkungen zu haben, gänzlich toxisch zu sein, oder die Libido zu beeinflussen. Es ist gezeigt worden, dass die Spermienzahl in Männern, denen hohe Dosen an Androgenen injiziert wurden, gesenkt werden konnte. Dennoch herrschen noch immer Zweifel an dem potentiellen Nutzen von Androgenen als männliche Antifertilitätswirkstoffe. Das ideale männliche Kontrazeptivum würde Azoospermien produzieren, ohne die Libido oder sexuelle Potenz zu beinträchtigen, und wäre reversibel.
Während zahlreiche Spermiumproteine (Primakoff et al., 1997; Burks et al., 1995; Wei et al., 1994; O'Rand et al., 1984; Lea et al., 1996; O'Rand et al., 1996; Amman et al., 1998a, b; Hammerstedt et al., 1997; Cohen et al., 1996) sowie Spermaproteine (Killian et al., 1993; Killian et al., 1996; Peknicova et al., 1997) über die Jahre hin mit Fertilität in Verbindung gebracht wurden, wurden sie in den meisten Fällen identifiziert aufgrund des Beweises der Spermium-Ei-Bindung in vitro, ein System, das sich beträchtlich von der natürlichen Umgebung der Spermien unterscheidet.
In den letzten Jahren wurden einige Proteine in der einen oder anderen Art mit der Befruchtungskapazität von Spermien in Verbindung gebracht. Während die meisten dieser Proteine mit der Spermiummembran assoziiert sind, sind manche im Spermaplasma identifiziert worden. Zwei der Spermiumproteine sind recht groß. Das erste von diesen ist ein 64 kD Spermiummembranprotein (PH-20), das über dem Arosom von Meerschweinchenspermien lokalisiert, und von dem angenommen wird, während der Befruchtung zu wirken (Hunnicutt et al., 1996). Für den Antikörper gegen PH-20 ist gezeigt worden, dass er die Bindung von Spermien an die Zona pellucida verhindert, und Männer wurden unfruchtbar gemacht, wenn PH-20 als ein Immunimpfstoff verabreicht wurde (Primakoff et al., 1997). Dennoch ist PH-20 lediglich im Meerschweinchen beschrieben worden und der PH-20-Impfstoff beeinträchtigt schwer die Spermatogenese in älteren Tieren, was die Wirkung irreversibel macht. Zusätzlich wurde ein 95 kD-Mausspermiumprotein identifiziert als ein Phosphothyrosin-Proteinligand für ZP3, ein Glykoprotein in der extrazellulären Matrix des Eis (Burks et al., 1995). Spezifische Peptidfragmente dieses Proteins hemmten die Bindung von Sperma an die Zona pellucida in vitro, jedoch ist keine Inhibierung der Fertilität in vivo gezeigt worden.
Einige kleine Spermienproteine sind mit Fertilität in Verbindung gebracht worden. Kaninchenspermium-Auotantigen I (RSAI), jetzt bezeichnet mit SP-17 (Lea et al., 1996) ist ein auf den Hoden beschränktes 24 kD-Protein. Dieses Protein scheint Kaninchen, Maus und Mensch zu Eigen zu sein, wie durch cDNA-Sequenzhomologie bewiesen. Monospezifische Antikörper gegen dieses Protein sind nicht verwendet worden, um die Antifertilitätswirkung in vivo zu demonstrieren. Es gibt keinerlei Proteinhomologie basierend auf cDNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen zwischen SP-17 und SP-22.
Protein D und E werden von dem Epithelium des Nebenhodens sekretiert. Diese Proteine sind mit Fertilität in Verbindung gebracht worden, da die P[lasmamembran der Oozyte Protein D/E bindende Domänen während der Spermium-Ei-Fusion exponiert (Cohen et al., 1996). Antikörper, gerichtet gegen den D/E-Komplex, inhibierte signifikant die Spermienpenetration von Zona-freien Eiern in vitro (Cuasnicu et al., 1990), jedoch wurde noch keine Fertilitätsaufgabe in vivo gezeigt. Während diese Proteine Molekulargewichte von 26 beziehungsweise 32 kD aufweisen, ist die Sequenz von SP-22, das Protein der vorliegenden Erfindung, nicht verwandt mit der der Proteine D oder E.
Wei et al, 1994 gewannen ein 17 kD-Protein aus einem Detergenz-Extrakt von humanen Spermien. Antikörper gegen dieses Glykoprotein lokalisierte über den Kopf des Spermiums von zahlreichen Spezies aber Anfärbung war über der eintreten Kopf des Spermiums, sowie über den Hauptteil des Schwanzes des Spermiums lokalisiert, was ein Fehlen an Spezifität andeutet. Daher, während der Antikörper in vivo Fertilität verhinderte, scheint vieles dieser Inhibierung aus nicht spezifischer Bindung zu resultieren. Unglücklicherweise wurden adäquate Kontrolldaten nicht gezeigt. Das von Wei et al. (1994) beschriebene 17 kD Protein, wurde niemals im Profil der Proteine in dem Originaldetergenzextrakt identifiziert. Daher ist es unmöglich, die Beziehung von diesem Protein im Bezug auf andere in der Literatur beschriebene zu bestimmen. Es scheint, dass dies ähnlich zu dem kürzlich beschriebenen SP-17 ist, beschrieben von Lea et al., 1996, aber das ist unmöglich zu bestimmen, da Wei et al. keine Aminosäuresequenzdaten zur Verfügung stellten.
Zwei in der Samenflüssigkeit, der spermienfreien Fraktion des Samens, identifizierte Proteine wurden mit Fertilität in Verbindung gebracht. Das erste ist ein 17 kD-Protein, bezeichnet als ACR.3 (Capkova und Peknicova, 1997). Dieses Protein ist eher ein Hüllprotein, als ein integrales Membranprotein und ist offensichtlich involviert im Vermitteln der Spermienbindung an die Zona pellucida, da Zugabe von gereinigtem ACR.3 zu normalen Spermien tatsächlich deren Kapazität an die Zone zu binden, vermindert. Die Funktion dieser Spermaplasmaproteine könnte sein unreife Kapazitation, und das Binden von Spermien an das Ei zu verhindern. Solche Membranstabilisatoren können entscheidend für normale Fertilisation in vivo sein, sind aber nicht diagnostisch für das Befruchtungspotential. Tatsächlich inhibiert der Antikörper gegen ACR.3 nicht die Befruchtung. Das zweite Samenplasmaprotein, das mit der Fertilität von Bullenspermien in Verbindung gebracht wurde ist ein 265 kD-Protein (Killian et al., 1996), mittlerweile bekannt als Prostaglandin-D-Synthase (Gerena et al, 1998). Dieses Protein kann einen direkteren Einfluss auf die Fertilität nehmen, da die Zugabe von Samenplasma von Bullen höherer Fertilität, die Fähigkeit von Spermien von Bullen geringerer Fertilität das Ei zu penetrieren in vitro erhöhte. Dennoch sind weder die direkte Zugabe von aufgereinigtem 26 kD-Protein, noch in vivo Funktionstests durchgeführt worden.
WO 97/27218 offenbart allgemein die Reinigung eines Polypeptids bezeichnet als SP-22 und die Reinigung von Antikörpern gegen Peptidfragmente von SP-22. Dies steht im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, die Antikörper offenbart, hergestellt gegen spezifische Peptidfragmente von SP-22, die nützlich für Fertilität sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die vorstehend erwähnten Defizite im Stand der Technik zu überwinden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel bereit zu stellen, zum Vorhersagen männlicher Fertilität in Tieren, sowie in menschlichen Männern.
Es wird beschrieben, nach umgebungsbedingten endokrinen Inhibitoren zu screenen, da endokrine Störung zu Mann-vermittelter Unfruchtbarkeit führen kann.
Es wird beschrieben, Tiere und Menschen zu screenen, die bekannten oder verdächtigten endokrine Inhibitoren für die Fertilität ausgesetzt waren.
Es wird beschrieben, Zuchttiere für künstliche Insemination auszuwählen, die gute Kandidaten zum Bereitstellen von Spermien für die Insemination sind.
Es wird beschrieben, humanes Sperma vor dem Anwenden assistierter Reproduktionstechnologietechniken auf Fertilität hin zu screenen, um den Erfolg dieser Techniken zu verbessern.
Es wird weiter beschrieben, die Fertilität in Männern zu verbessern, die es nicht schaffen eine ausreichende Menge an SP-22, früher bekannt als SP-16, in Spermien zu exprimieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein reversibles Kontrazeptivum für Männer bereitzustellen.
Mittlerweile wurde gefunden, dass ein 22 kD-Spermiumprotein, SP-22, früher identifiziert als SP-16, noch signifikant mit der Fertilität (p < 0.0001; N = 52) korreliert ist, und voraussagend ist für die Fertilität. Wenn ein Antikörper gegen dieses Protein hergestellt wird, würde der Grad an Antikörpererkennung durch Spermien in einer Nebenhoden-Spermaprobe oder Ejakulat die Fertilität der Probe widerspiegeln. Dieser Antikörper kann als ein Kontrazeptivum verwendet werden, um die Expression von SP-22 zu hemmen und Spermien unfruchtbar zu machen, hinsichtlich Toxizität zu screenen, bessere Zuchttiere für künstliche Insemination auszuwählen, und Männer für assistierte Reproduktionstechnologien auszuwählen. Das Protein selbst kann verwendet werden als ein Kontrazeptionsimpfstoff, inaktiviert durch Gen-Knockout, oder das Protein kann zu Spermien von unfruchtbaren Männern zugegeben werden, um Fertilitätstechniken durchführbarer zu gestalten
SP-22 ist einzigartig verglichen mit allen früher, entweder in Spermien oder im Spermaplasma identifizierten, mutmaßlichen Fertilitätsproteinen. Darüber hinaus war eine Suche in der Gendatenbank nicht erfolgreich, irgendein früher identifiziertes Protein zu ermitteln in männlicher Reproduktionsbiologie, das irgendeine Homologie zu SP-22 hat. Sowohl die Aminosäure-, als auch Nukleotidsequenzdaten zeigten an, dass SP-22 hoch homolog zu DJ-1 ist (Nagakubo et al., 1997), ein Protein für welches eine Onkogen-Rolle vermutet wurde. Diese Forscher haben seither diese Vorstellung aufgegeben und bis heute existiert keine definitive Rolle für DJ-1.
Basierend auf anfänglichen Elektrophoreseläufen, wurde für das Protein SP-22 ursprünglich angenommen, dass es ein 16 kD-Protein ist mit einem pI von 5.5, und so wurde es in der "Großelternanmeldung", Seriennr. 08/593,677, bestimmt. Dennoch wurde nach Vergleichen mehrerer Typen von Molekulargewichtsstandards das Molekulargewicht dieses Proteins übereinstimmend als ein apparantes Molekulargewicht von 22 kD in 11%-igen Acrylamidgelen gefunden. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird dieses Protein als SP-22 identifiziert, obwohl in der "Großelternanmeldung" USSN 08/593,677 das Protein als SP-16 identifiziert wurde.
In Übereinstimmung mit einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der eine Peptidsequenz bindet, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 33–48 in 1B gezeigt ist, enthalten ist. In einer Ausführungsform ist der Antikörper polyklonal, aber vorzugsweise monoklonal. Vorzugsweise bindet der Antikörper weiter eine Peptidsequenz, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 149 bis 156 in 1B gezeigt ist, enthalten ist. In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ebenfalls bereit einen Antikörper der eine Peptidsequenz bindet, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 149 bis 156 in 1B dargestellt ist, enthalten ist. Diese Antikörper können vorteilhafterweise zur Inhibierung der Fertilität verwendet werden. In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zum Vorhersagen der Fertilität, umfassend die Schritte von In-Kontaktbringen einer Spermienprobe mit einem Antikörper des ersten Aspekts unter Bedingungen, die geeignet sind, für das Komplexieren des Antikörpers mit SP-22, und Detektieren der relativen Menge des Antikörper-SP-22-Komplexes, wobei eine verringerte Menge des Antikörper-SP-22-Komplexes in der Spermienprobe im Vergleich zu normal anzeigt, dass das männliche Subjekt unfruchtbar ist. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zum Vorhersagen der Fertilität, umfassend die Schritte von In-Kontaktbringen einer Spermienprobe mit einem Antikörper des zweiten Aspekts unter Bedingungen, die geeignet sind für das Komplexieren des Antikörpers mit SP-22, und Detektieren der relativen Menge des Antikörper-SP-22-Komplexes, wobei eine verringerte Menge des Antikörper-SP-22-Komplexes in der Spermienprobe im Vergleich zu normal anzeigt, dass das männliche Subjekt unfruchtbar ist. Ebenfalls bereitgestellt in einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Peptide, an welche die erfindungsgemäßen Antikörper binden. Daher umfasst die Erfindung in Übereinstimmung mit diesem weiteren Aspekt, jedes Peptid, das aus Aminosäuren 33–48 in 1B besteht, ein Peptid, das aus Aminosäuren 90–93 in 1B besteht, ein Peptid, das aus Aminosäuren 124–130 in 1B besteht, oder ein Peptid, das aus Aminosäuren 149–156 in 1B besteht. Diese Peptide können vorteilhafterweise verwendet werden in der Herstellung eines Impfstoffes entweder allein oder in Kombination mit einem Adjuvans zur Stimulierung der SP-22-Antikörperproduktion in Säugetieren.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1A stellt die über Edman-Abbau identifizierten Sequenzen der SP-22-Peptide dar.
1B ist die Volllängen-Aminosäuresequenz von humanem DJ-1. SP-22-Peptide sind unterstrichen.
2 zeigt SP-22, kodiert durch alternativ gespleißte mRNAs, dargestellt als A, B, und C.
3 zeigt die Homologie zwischen dem humanen DJ-1-Protein und Ratten-SP-22.
4 zeigt Northern-Blotting von Gesamt-mRNA aus Rattenhoden, -nebenhoden, -hirn, -leber und -niere.
5 zeigt silbergefärbte Proteine aufgelöst durch 2D Gel-Elution.
6 zeigt silbergefärbte Proteine, linke Spalte, und den entsprechenden Immunobolt (rechte Spalte) SP-22 ist mit einem Pfeil angezeigt.
7 zeigt die Immunlokalisation von SP-22 auf frischen Spermien des Nebenhodenschwanzes der Ratte.
8 zeigt Fertilitätsdaten unter Verwendung von Affinitätsgereinigtem anti-SP-22-Peptid IgG.
9 zeigt die Beziehung zwischen Fertilität und SP-22 nach Exposition sowohl gegenüber Nebenhoden-, als auch Hodentoxinen.
10 zeigt die Sequenz von SP-22A.
11 zeigt die Sequenz von SP-22B.
12 zeigt die Sequenz von SP-22C.
13 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von SP-22.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
SP-22 ist durch die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in 13 gekennzeichnet.
Wie früher angemerkt, lokalisieren etliche mit der Spermienmembran assoziierte Proteine, einschließlich PH-20, ZP3, SP-17 und Proteine D und E, sowie das Wei 17 kD-Protein nicht. Im Gegensatz dazu lokalisiert der Antikörper gegen SP-22-Peptide über einen sehr diskreten Bereich des Spermienkopfs, d.h. die ventral-anteriore Oberfläche des äquatorialen Segments. Allerdings noch wichtiger wurde das von Wei et al., (1994) beschriebene 17 kD-Protein niemals im Profil der Proteine im Originaldetergenzextrakt identifiziert. Daher ist es unmöglich, die Beziehung von diesem Protein im Bezug auf andere in der Literatur beschriebene zu bestimmen. Es scheint, dass dies ähnlich zu dem kürzlich beschriebenen SP-17 ist (Lea et al., 1996), was aber unmöglich zu bestimmen ist, da Aminosäuresequenz ein Daten nicht von Wei et al. (1994) zur Verfügung gestellt wurden.
Es ist klar bewiesen, dass SP-22 einzigartig ist im Vergleich zu allen früher, entweder in Sperma oder Samenplasma, identifizierten mutmaßlichen Fertilitätsproteinen. Darüber hinaus war eine Suche in der Gendatenbank nicht erfolgreich, irgendein früher identifiziertes Protein zu ermitteln, in männlicher Reproduktionsbiologie, das irgendeine Homologie zu SP-22 hat.
Das Vorhandensein von SP-22-Sequenzen mit unterschiedlichen 5'-Enden war nicht unerwartet. Northern-Blotting von RNAs aus Rattengewebe, einschließlich Hoden, detektierte in allen Geweben eine 1 kB-mRNA und ein zusätzliches 1,5 kB-Transkript, das nur im Hoden gefunden wurde. Während zu diesem Zeitpunkt nicht jeder Sequenz ein spezifisches Gewebe von Zelltypen zugeordnet wurde, zeigt die einzigartige 5' untranslatierte Region von SP-22 einige Ähnlichkeit zu der 5' untranslatierten Region somatisch exprimierter tag-Sequenzen von Maus, homolog zu SP-22 aus Ratte und würde nahe legen, dass SP-22B, gezeigt in 11, das somatische Transkript von 1 kB repräsentiert. In ähnlicher Weise deuteten die längeren 5' untranslatierten Regionen von SP-22A, gezeigt in 10 an, dass es die mRNA von 1,5 kB kodiert. Diese einzigartige untranslatierte Sequenz kann dazu dienen, mRNA Stabilität zu verleihen für die anschließende Expression von SP-22 im Hoden. Die zusätzlichen Aminosäuren kodiert durch SP-22C, gezeigt in 12, können eine Proteinvariante von SP-22 darstellen. Dies kann ebenfalls für Hoden-spezifische Expression von SP-22 sprechen, sowie für die Tatsache, dass das Molekulargewicht von SP-22 größer als das für DJ-1 beschriebene ist, d.h. 22–26 kD im Vergleich zu 20.5 kD. Northern-Blotting mit sequenzspezifischen Sonden ist nötig, um die unterschiedlichen SP-22-Sequenzen mit ihren jeweiligen mRNAs und ihren relativen Gewebshäufigkeit in Bezug zu setzen.
Ein kurzes fünf-Tage-Expositionsmuster und multiple Nebenhodentoxine wurden in einer ersten Studie verwendet, die SP-22 identifizierte (Klinefelter et al., 1997). Dennoch veranlasste die Entdeckung, dass SP-22 im Hoden entsteht, eine Studie, in der Tiere für 14 Tage einem testikulären Toxin, Bromchloressigsäure, ausgesetzt wurden, welches ein Nebenprodukt der Trinkwasserdesinfektion ist, für welches die US-Umweltbundesbehörde Studien angefordert hat, da es eines der am meisten vorkommenden Desinfektionsnebenprodukte in Trinkwasser ist. Frühere Studien für Dibromessigsäure (Linder et al, 1995, 1997) und Dichloressigsäure (Linder et al., 1997) ergaben, dass die disubstituierte Haloessigsäuren die Spermatogenese störte, und dass innerhalb von 14 Tagen Defekte (d.h. Veränderungen in Spermienbewegung und -morphologie) in Nebenhodenspermien festgestellt wurden. Daher wurde angenommen, dass Bromchloressigsäure ähnlich wirkt.
Die SP-22-Levels für Spermien wurden nicht in frühen Haloessigsäurestudien evaluiert. Sowohl eine quantitative Evaluierung von SP-22 in Extrakten von Nebenhodenspermien als auch Fertilität im Anschluss an in utero-Insemination wurde in eine kürzliche Studie von Bromchloressigsäure mit eingeschlossen. Es wurde beobachtet, dass SP-22-Levels in Detergenz-Extrakten von Nebenhodenspermien in einer Dosis-bezogenen Art und Weise beeinträchtigt waren, mit Signifikanz, die sogar bei der geringsten Dosis erreicht wurde. Darüber hinaus war die Fertilität von Sperma von den behandelten Ratten signifikant verringert und hoch korreliert mit den SP-22-Levels (r² = 0.90).
Daher ist jetzt erfolgreich dargelegt worden, dass SP-22-Levels bei Nebenhodenspermien beeinträchtigt sind durch Chemikalien die sowohl die Hoden- als auch die Nebenhodenfunktion unterdrücken. Das begründete die Machbarkeit von und einen SP-22-basierten Assay von Nebenhoden- und ejakulierten Spermien als ein diagnostischer Indikator von beeinträchtigter Spermienqualität, d.h. Fertilität in entweder toxikologischen oder epidemiologischen Rahmen. Zusätzlich begründete die Existenz von SP-22 in ejakulierten Spermien von verschiedenen Spezies (d.h. Bulle, Hengst, Mensch) die Machbarkeit der Verwendung solch einer SP-22-basierten diagnostisch, um die Fertilität von Spermien dieser Spezies zu evaluieren, wenn künstliche Züchtung, Herdenzuchttiere und assistierte Reproduktionstechnologien (in vitro-Fertilisation im Vergleich zu in utero-Insemination) in Betracht gezogen werden.
Wie oben angegeben, während der Besprechung des 95 kD-Phosphotyrosin-Proteins, entdeckt auf der Maus-Spermienmembran, waren spezifische Peptide die Teil dieses Proteins sind in der Lage, das Binden von Spermien an die Zona pellucida des Eis zu blocken. Wahrscheinlich konkurrierten diese Peptide um das Binden von nativem Spermienprotein. Kürzlich haben Amann et al. (1998a, b) kleine Peptide verwendet, welche die Saposin-Untereinheiten des Prosaposins oder SGP-1-Proteins umfassen, um das Binden von Spermien an ein Eimembran-Substrat zu verstärken. In diesem Assay zeigte erhöhte Spermienbindung erhöhte Fertilisationsfähigkeit an.
In den vorliegenden Studien wurde hoch spezifisches SP-22 IgG verwendet, um die Fertilität von Spermien in vivo zunichte zu machen. Da das Epitop, das durch dieses IgG erkannt wird, 15- und 8-Aminosäurepeptidsequenzen von SP-22 darstellt, kann schlussgefolgert werden, dass ähnlich ortsgerichtet die Erkennung kleiner Moleküle erreicht worden ist. Darüber hinaus scheint es, dass ein oder beide dieser Peptidtargets entscheidend sein können für die Funktion von SP-22. Dies, diese und andere ortsgerichtete Antagonisten oder Agonisten können dazu dienen, die Fertilität von Spermien zu modulieren (d.h. vermindern oder verstärken).
Das Spermienprotein SP-22 ist vollständig neu im Bereich der Reproduktionsbiologie. SP-22 wird im Hoden synthetisiert und kann aus Hodenspermien gewonnen werden, bevor sie in den Nebenhoden eintreten. SP-22 ist eine integrale Komponente der Spermienmembran und ist eine Komponente von ejakulierten Spermien anderer Spezies einschließlich Bulle, Hengst, und Mensch. SP-22 ist hoch korreliert mit Fertilität im Anschluss an Exposition gegenüber Hodentoxinen sowie Nebenhodentoxinen. Darüber hinaus ist SP-22 ein kausaler Modulator der Fertilität, da anti-SP-22-Peptid IgG wirksam die Fertilität von Spermien hemmen kann.
Seit kennzeichnende Sequenzen von SP-22 bekannt sind, in 1, ist es möglich ebenfalls funktionelle Derivate von SP-22 herzustellen. Mit "funktionellem Derivat" ist ein Fragment, Variante, Analogon, Agonist oder chemisches Derivat von SP-22 gemeint, Begriffe, die nachfolgend definiert werden.
Ein "funktionelles Derivat" behält weiterhin mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz von SP-22 was seinen erfindungsgemäßen Nutzen ermöglicht, nämlich das Bestimmen oder Beeinflussen männlicher Fertilität. Ein "Fragment" von SP-22 betrifft eine Teilmenge des SP-22-Moleküls, das heißt, ein kürzeres Peptid. Die Fragmente von Interesse sind diejenigen, die verwendet werden können, um männliche Fertilität zu bestimmen oder zu beeinflussen.
Eine "Variante" von SP-22 betrifft ein Molekül, das im Wesentlichen ähnlich zu entweder dem gesamten SP-22-Protein oder Fragmenten davon ist. Variante Peptide können kovalent hergestellt werden durch direkte chemische Synthese des varianten Peptids unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren.
Alternativ können Aminosäuresequenzvarianten von SP-22 hergestellt werden durch Mutation in den DNAs, die das synthetisierte SP-22 kodieren. Solche Varianten schließen zum Beispiel ein, Deletionen von, oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Endkonstrukt zu erlangen, vorausgesetzt dass das Endkonstrukt die gewünschte Aktivität besitzt. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die in der DNA gemacht werden, die das variante Peptid kodiert, nicht das Leseraster verändern, und schaffen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die sekundäre mRNA-Strukturen hervorrufen (vgl. Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 75, 444 ).
Auf der genetischen Ebene werden diese Varianten gewöhnlicherweise hergestellt durch ortsgerichtete Mutagenese wie in Adelman et al., DNA 2: 183, 1983 beispielhaft erläutert, von Nukleotiden in der DNA, die das Peptidmolekül kodieren, und dabei DNA produzieren, die die Variante kodiert, und anschließend Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur. Die Varianten weisen typischerweise dieselbe qualitative biologische Aktivität wie die nicht-varianten Peptide auf.
Ein "Analogon" von SP-22 betrifft ein Molekül, das im Wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnlich ist. Das Analogon kann durch chemische Synthese hergestellt werden.
Ein "chemisches Derivat" von SP-22 enthält zusätzlich chemische Reste, die normalerweise nicht Teil der SP-22-Aminosäuresequenz sind. Kovalente Modifikationen der Aminosäuresequenz sind im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen. Solche Modifikationen können in SP-22 eingebracht werden durch Zur-Reaktionbringen anvisierter Aminosäurereste des Peptids mit einem organischen derivatisierenden Agens, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren.
Aminoterminale Reste können mit Bernstein- oder anderen Karbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht werden. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von alpha-Amino-enthaltenden Resten schließen Amidester ein, wie zum Beispiel Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion, und Transaminase-katalysiert zur Reaktion gebracht mit Glyoxylat.
Spezifische Modifikationen von Tyrosylresten an sich sind ausgiebig untersucht worden, mit besonderem Interesse am Einführen spektraler Markierungen in die Thyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am geläufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-Tyrosyl-Spezies beziehungsweise 3-Nitroderivate zu bilden.
Carboxylseitengruppen, wie Aspartyl oder Glutamyl werden selektiv modifiziert durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'N-C-N-R'), wie 1-Cyclohexyl-3-[2-Morpholinyl-(4-Ethyl)]Carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-Azonia-4,4-Dimethylpentyl)Carbodiimid. Weiterhin werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Muteine" oder "Varianten" Analoga von SP-22, in denen eine oder mehrere der Aminosäurereste des natürlichen SP-22, vorzugsweise 1–10, stärker bevorzugt 1–5 Reste, oder sogar nur ein einziger Rest durch verschiedene Aminosäurereste ersetzt sind oder deletiert sind, oder ein oder mehrere Aminosäurereste wie 1–10, 1–5, oder nur ein Rest zu der natürlichen Sequenz von SP-22 addiert sind. Diese Muteine werden hergestellt durch bekannte Synthesetechniken und/oder ortsgerichtete Mutagenesetechniken, oder durch eine andere bekannte hierfür geeignete Technik. Die Substitutionen sind vorzugsweise konservativ, siehe z. B. Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; und Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 198.
Die Arten solcher Substitutionen, die in dem Protein- oder Peptidmolekül der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, können auf Analyse der Häufigkeiten von Aminosäureaustauschen zwischen einem homologen Protein von unterschiedlichen Spezies wie solche, dargestellt in Tabelle 1–2 von Schulz et al., op. cit., und 3–9 von Creighton, op. cit. basieren. Basierend auf solcher Analyse können konservative Substitutionen hierin definiert werden als Austausche innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen:

I. Kleine aliphatische, unpolare oder schwach polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. Polare, negativ geladene Reste und ihre Amide: Asp, Asn, Glu, Gln
III. Polare, positive geladene Reste: His, Arg., Lys
IV. Große, aliphatische unpolare Reste: Met, Leu, Ile, Val, Cys
V. Große aromatische Reste: Phe, Try, Trp

Innerhalb der vorstehenden Gruppen werden die folgenden fünf Substitutionen als "hoch konservativ" angesehen:
Asp/Glu
His/Arg/Lys
Phe/Tyr/Trp
Met/Leu/Ile/Val
Semikonservative Substitutionen sind definiert als Austausche zwischen zwei der obigen Gruppen (I)–(V), die beschränkt sind auf Supergruppe (A), umfassend obige (I), (II), und (III), oder auf Supergruppe (B), umfassend obige (IV) und (V). Substitutionen sind nicht auf die genetisch kodierte oder sogar die natürlich vorkommenden Aminosäuren beschränkt. Wenn das Epitop durch Peptidsynthese hergestellt wird, kann die gewünschte Aminosäure direkt verwendet werden. Alternativ kann eine genetisch kodierte Aminosäure modifiziert werden durch Zur-Reaktionbringen dieser mit einem organischen derivatisierenden Agens, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren.
Screenen mit SP-22-Antikörper
Von der vorstehenden Beschreibung von SP-22-Antkörpern ist es ersichtlich, dass unter Verwendung der Antikörper der Erfindung eine breite Vielfalt diagnostischer Tests möglich ist. Mit dem Ziel, die Gründe für Unfruchtbarkeit zu diagnostizieren ist ein Immunoassay, um verringerte Levels von SP-22 auf Spermien zu detektieren, eine nützliche Beihilfe zum bekannten Hormonassay. Weitere Verwendungen der Antikörper schließen ein, das Testen von Zuchtvieh im Hinblick auf Kandidaten zur künstlichen Insemination: Je höher die Levels von SP-22 im potentiellen Donor, desto wahrscheinlicher ist die künstliche Insemination erfolgreich. Isolierung von SP-22 erlaubt die Produktion von Antiseren, die Antikörper gegen SP-22 enthalten für mögliche Kreuzreaktion mit anderen Spezies, einschließlich humanes SP-22. Dieser Antikörper ermöglicht die Erstellung eines enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Zum Beispiel, um Antikörperbindung zu evaluieren, werden Polystyrol-micro-Wells mit einem Extrakt einer bestimmten Nebenhodenspermien- (Ratte) oder Ejakulatprobe (Pferd, Bulle, Mensch) vorbeschichtet, die eine unbekannte Menge an SP-22 enthält. Als nächstes wurde SP-22-Antikörper zugegeben, gefolgt von der Zugabe eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes. Es bildete sich ein Präzipitat wenn ein Substrat, wie DAB durch die Peroxidase in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oxidiert wird. Eine Standardkurve wurde für SP-22 erstellt unter Verwendung zunehmend bekannter Mengen an SP-22. Die Menge an SP-22 in einer Probe wird dann bestimmt durch die optische Dichte des gefärbten Präzipitats in der Probe und der aus der Reihe von SP-22-Richtwerten erhaltenen linearen Regression.
Neben ELISA kann die Menge von SP-22 die auf der Oberfläche von Spermien in einer Probe vorhanden ist (Nebenhoden oder Ejakulat, Tier oder Mensch) bestimmt werden unter Verwendung von quantitativer Fluoreszenzspektroskopie oder Fluoreszenzlichtmikroskopie. Hierfür werden Spermien mit SP-22-Antikörper, und anschließend mit markiertem Rhodamin oder FITC-konjugiertem Zweitantikörper inkubiert. Zuerst ist es notwendig, das Verhältnis zwischen Fluoreszenz einer Probe in einem Fluorometer oder einem Mikroskopbild und der optischen Dichte von SP-22 aufgetrennt durch zweidimensionale Gelelektrophorese zu bestimmen. Ist dies einmal ermittelt, kann die Fluoreszenz im Bezug zur Fertilität gesetzt werden.
Ebenfalls wichtig ist es, das Verhältnis zwischen der Anzahl von Spermien in einer Probe, die SP-22 exprimieren (d.h. fluoreszieren), den Grad der Expression oder Fluoreszenz und Fertilität zu bestimmen. Dies ist besonders zutreffend für Männer, die assistierte Reproduktionstechnologien in Betracht ziehen. Zum Beispiel, wenn lediglich eine kritische Anzahl (X) von Spermien benötigt wird, um für einen erfolgreichen Fertilitätsversuch eine Schwellwertmenge (Y) von SP-22 zu exprimieren, ist es möglich selektiv diese Spermien, die SP-22 nicht im Ejakulat exprimieren, zu entfernen, und lediglich diejenigen Spermien zu verwenden, die eine ausreichende Menge an SP-22 exprimieren für die assoziierte Reproduktionstechnologie, wie intra-uteriner Transfer oder IVF im Anschluss an die Trennung von SP-22-exprimierenden Spermien von dem SP-22-Antikörper.
Um zu bestimmen, ob es eine Beziehung gibt zwischen der Anzahl von Spermien, die SP-22 exprimieren und dem Grad bis zu welchem sie es exprimieren, werden Spermien-bindender SP-22-Antikörper oder Agonist über quantitative indirekte Fluoroszenzmikroskopie evaluiert. Hierzu wird Rhodamin oder FITC-Immumarkierung durchgeführt in einem Aliquot von Spermien, äquivalent zu dem für in utero-Insemination verwendeten, und die Anzahl von Spermien, die fluoreszieren, wird bestimmt zusammen mit dem relativen Fluoreszenzgrad individueller Spermien in einer Probe. Die resultierenden Fluoreszenzhistogramme werden im Bezug gesetzt zu Fertilität, die über künstliche (in utero) Insemination beurteilt wurde. Um zu bestimmen, ob eine kritische Anzahl von SP-22-exprimierenden Spermien für die Fertilität erforderlich ist, wird ein Aliquot equivalent zu dem für in utero-Insemination verwendeten, der Immunabsorption unterzogen. Polystyrol Mikro-Wells werden mit SP-22-Antikörper vorbeschichtet, und Spermien im Ejakulat dürfen binden. Diejenigen Spermien, die nicht binden, werden weggewaschen, Antikörper-gebundene Spermien werden im Anschluss an die Abtrennung des Antikörpers mit Inkubation in 0.1 M Lithiumdiiodsalicylat gewonnen, und steigende Zahlen von diesen SO-22-exprimierenden Spermien werden in utero inseminiert.
Konservative erfindungsgemäße Aminosäuresubstitutionen, z. B. wie oben dargestellt, sind im Stand der Technik bekannt und es würde erwartet werden, dass sie die biologischen und strukturellen Eigenschaften der Polypeptide nach solchen Aminosäuresubstitutionen beibehalten. Die meisten erfindungsgemäßen Deletionen, Insertionen und Substitutionen sind solche, die keine radikalen Veränderungen in den Eigenschaften des Proteins oder Peptidmoleküls hervorrufen. Der Fachmann wird schätzen, dass die Wirkung von Substitution durch routinemäßige Screeningassays, entweder Immunoassays oder Bioassays, evaluiert werden kann. Zum Beispiel wird eine Mutante typischerweise hergestellt durch ortsspezifische Mutagenese der Peptidmolekül-kodierenden Nukleinsäure, Expression der mutanten Nukleinsäure in rekombinanter Zellkultur, und, gegebenenfalls, Reinigung von der Zellkultur, oder einer biologischen Probe, die SP-22 enthält, zum Beispiel durch Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers auf einer Säule, um die Mutante durch Bindung an mindestens ein Epitop zu absorbieren.
SP-22-Aminosäuresequenzierung
Spermien der Cauda epididymis wurden für eine Stunde wie früher beschrieben (Klinefelter et al., 1997) unter Verwendung von 80 mM n-Octyl-β-Glucopyranosid (OBG) in 10 mM Tris, pH 7.2, zu welchen 0.2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid frisch zugegeben wurde, extrahiert. Der Extrakt wurde dann aufkonzentriert, entsalzt, und vor HPLC-Auftrennung auf Protein hin untersucht. Fraktionen, hoch angereichert an SP-22, wurden über Reverse-Phase-C4-HPLC erhalten unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20–80% Acetonitril in Wasser, mit 0.1% TFA. SP-22-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und Aliquots, die 60 μg an Protein entsprechen, wurden zur Auftrennung auf zweidimensionale 14%-ige SDS-PAGE geladen. Die Gele wurden anschließend mit Coomassie Blue gefärbt, und die SP-22-Spots ausgestanzt, und zur Verwendung in anschließender Peptidsequenzierung eingefroren. Isoliertes SP-22-Protein wurde dann tryptischer Verdauung unterzogen und das resultierende Peptidgemisch wurde über HPLC aufgetrennt. Peaks die homogene Peptide repräsentieren, wurden für die Sequenzbestimmung durch Edman Abbau ausgewählt, und die resultierenden Peptidsequenzen wurden unter Verwendung des BLAST-Programms mit NCBI GenBank Proteinsequenzen abgeglichen.
1A zeigt die über Edman Abbau identifizierten SP-22-Peptide. 1B zeigt die Volllängenaminosäuresequenz von humanem DJ1. In der Figur zeigt * an, dass eines der Threonine (T) in Peptid #3 ein Serin (S) in SP-22 ist. * zeigt an, dass die ursprüngliche Aminosäure nach der Lysin (K)-Spaltstelle, d.h. Valin (V) beim Sequenzieren mehrdeutig war.
Methoden
Spermien der Cauda epididymis wurden für eine Stunde wie früher beschrieben (Klinefelter et al., 1997) unter Verwendung von 80 mM n-Octyl-β-Glucopyranosid (OBG) in 10 mM Trispuffer, pH 7.2, zu welchem 0.2 mM Phenylmethylsufonylfluorid frisch zugegeben wurde, extrahiert. Der Extrakt wurde dann aufkonzentriert, entsalzt und vor HPLC-Auftrennung auf Protein hin untersucht. Fraktionen, hoch angereichert an SP-22, wurden über Reverse-Phase-C4-HPLC erhalten unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20–80% Acetonitril in Wasser mit 0.1% TFA. SP-22-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und Aliquots, die 60 μg an Protein entsprechen, wurden zur Auftrennung über zweidimensionale 14%-ige SDS-PAGE aufgetragen. Gele wurden anschließend mit Coomassie Blue gefärbt, und die SP-22-Spots ausgestanzt, und zur Verwendung in anschließender Peptidsequenzierung eingefroren.
Isoliertes SP-22-Protein wurde dann tryptischem Verdau unterzogen und das resultierende Peptidgemisch über HPLC aufgetrennt. Peaks, die homogene Peptide repräsentieren, wurden für die Sequenzbestimmung durch Edman Abbau ausgewählt und die resultierenden Peptidsequenzen wurden unter Verwendung des BLAST Programms mit den NCBI GenBank Proteinsequenzen abgeglichen.
Sequenzierung der SP-22 cDNA und Northern Blotting
Die für SP-22 identifizierten Teil-Aminosäuren, waren im Wesentlichen homolog zu humanem DJ-1 (Nagakubo et al., 1997), und eine Rattenhoden-cDNA-Bibliothek (Stratagene, LaJolla, CA) wurde mit einer EST-cDNA (Zugangsnr. AA388672) gescreent, die ein Maus-DJ-1-Homolog kodiert. Eine DJ-1-cDNA-Sonde wurde hergestellt über zufällige Primermarkierung mit [³²P]-dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) unter Verwendung eines "Prime-It II Kits" (Stratagene). Bibliothekscreening eine Bakteriophagenisolation wurde durchgeführt unter Verwendung des Verfahrens von Benton und Davis (1977).
SP-22-Insert-DNA wurde sequenziert unter Verwendung des Didesoxynukleotid-Terminationsverfahrens von Sanger et al., 1977, unter Verwendung des SequiTherm Excel Kits (Epicenter Technologies, Madison, WI). Die Sequenzdaten wurden zusammengestellt unter Verwendung des MacVector-Analysepakets (Oxford Molecular Products, Oxford, England).
Um die Gewebespezifität von SP-22 zu evaluieren, wurde Gesamt-RNA aus verschiedenen reproduktiven und somatischen Geweben isoliert. Northern-Blotting bis 10 μg Gesamt-RNA wurde durchgeführt wie von Welch et al., 1992 beschrieben, mit einer stringenten Waschtemperatur von 60°C und einer Expositionszeit von 20 Stunden.
Position der SP-22 Peptidantikörper
Die durch Edman Abbau erhaltenen Peptide #1 und #4 (1A), wurden zusammen als Antigen verwendet, um polyklonale Antikörper herzustellen. Hierzu wurde jedes Peptid synthetisiert, an ein Trägerprotein konjugiert, und die zwei Peptidträgerproteinkonjugate wurden verwendet, um zwei vier-Jahre-alte weibliche Broder Leicester Merinoschafe zu immunisieren (Dienst geleistet von Chiron Technologies, Raleigh, NC). Speziell wurde jedes Konjugat in 1ml von vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert (ungef. 0.3 mg pro Peptid), gefolgt von intramuskulärer Injektion. Ähnliche Injektionen wurden zwei und sechs Wochen später verabreicht, unter Verwendung von unvollständigem Freund'schen Adjuvans. Das Serum wurde zwei Wochen nach der letzten Injektion entnommen.
Die Peptide #1 und #4 (jeweils 2 mg) wurden ebenfalls an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt und zur Affinitätsreinigung von anti-SP-22-Peptid IgG verwendet. Kurz, 10 ml des Immunserums wurden mit 1 ml Peptid-gebundener Thiopropylsepharose 6B über Nacht bei 4°C vermischt. Gebundenes anti-SP-22-Peptid IgG wurde mit 0.1 M Glycin-HCL, pH 2.5 eluiert. IgG wurde anschließend neutralisiert, entsalzt, aufkonzentriert und untersucht.
Affinitätsgereinigtes anti-SP-22-Peptid IgG (2mg/ml) wurde verwendet, um SP-22 sowohl in zweidimensionalen Gelen, als auch auf Spermien zu lokalisieren. Für Immunblotting wurden Proteine in Spermienextrakten zunächst über zweidimensionale Mini-Gelelektrophorese aufgelöst und anschließend auf PVDF-Membranen transferiert. Die geblotteten Membranen wurden für eine Stunde bei 34°C in DPBS mit 1% BSA, das 10% normales Kaninchenserum enthält, inkubiert. Als Nächstes wurde affinitätsgereinigtes anti-SP-22-Peptid IgG (1:1000) zugegeben, und die Blots durften über Nacht bei 4°C schütteln. Biotinylierte Kaninchen-anti-Schaf IgG und ABC-Reagenzien wurden zugegeben gemäß den Vectastain-Anweisungen und das Peroxidasereaktionsprodukt wurde sichtbar gemacht unter Verwendung des VIP-Substratkits. Um auf unspezifische Bindung hin zu kontrollieren, wurde Präimmunserum anstelle des affinitätsgereinigten anti-SP-22-Peptids IgG verwendet.
Für Immunzytochemie wurden Spermien der Cauda epididymis (Ratte) oder ejakulierte Spermien (Bulle, Mensch) zweimal mit DPBS gewaschen und entweder für eine Stunde bei 4°C in Zamboni's Fixiermittel fixiert, das 0.1% Triton X-100 enthält oder für eine Stunde bei 34°C direkt im Blockingpuffer (DPBS, das 1% BSA und 10% normales Kaninchenserum enthält) inkubiert. Fixierte Spermien wurden nach Fixierung im Blockingpuffer inkubiert. Blockingpuffer wurde nach Zentrifugation entfernt und Spermien (10 × 10 μl (20 μg) affinitätsgereinigtes anti-SP-22-Peptid IgG (1:100) für eine Stunde. Nach dem Waschen wurde FITC-markiertes Kaninchen-anti-Schaf IgG (1:25) für eine Stunde zugegeben. Spermien wurden erneut gewaschen und eingedeckt unter Verwendung von antibleich-Eindeckmedium. Die Spezifität der Immunfärbung wurde durch Zugeben von 20 μg der Peptide #1 und #4 (je 10 μg) n in Verbindung mit dem affinitätsgereinigten anti-SP-22- Peptid-IgG verifiziert, was zeigte, dass kleine molekulare Antagonisten zu SP-22 in einer Art verwendet werden können, ähnlich wie Antikörper gegen SP-22, d.h. die Aktivität stören.
Die funktionellen Bereiche von SP-22 wurden als die folgenden Peptide identifiziert:
VTVAGLAGKDPVOCSR;
EILK
TSGPLAK
DGLILTSR
Es stellte sich heraus, dass diese Peptide direkt die Fertilität an sich beeinflussen können. Wenn eines von diesen Peptiden zu Spermien zugegeben wird, zusammen mit einem Antikörper gegen SP-22, beeinflusst der Antikörper nicht die Fertilität, d.h. Fertilität bleibt normal.
Modulation der Fertilität mit SP-22-Peptid-Antikörper
Künstliche (in utero)-Insemination in der Ratte wurde wie früher beschrieben, durchgeführt (Klinefelter et al., 1997). Kurz, 10 × 10⁶ Spermien der Cauda epididymis wurden für fünf Minuten bei 34°C entweder mit oder ohne 10 μl des affinitätsgereinigten anti-SP-22-IgG inkubiert, und 5 × 10⁶ wurden unter Halotananästhesie in jedes Uterushorn von LHRH-synchronisierten, zervikalstimulierten, erwachsenen Weibchen injiziert. Neun Tage später wurden die inseminierten Weibchen getötet und die Anzahl von Einnistungen, sowie Corpora lutea wurden ausgezählt. Fertilität wurde ausgedrückt, als die Anzahl von Einnistungen im Vergleich zu der Anzahl von Corpora lutea.
Quantifizierung von SP-22, um Veränderungen in der Fertilität aufgrund von Hodentoxinen zu bestimmen
Bromchloressigsäure (BCA), ein natürlich vorkommendes Nebenprodukt der Trinkwasserdesinfektion wurde in Wasser über Sondenfütterung in abgestuften Dosen an erwachsene männliche Ratten verabreicht, d.h. 0, 8, 24 und 72 mg/kg Körpergewicht. Den Ratten wurde es täglich für vierzehn Tage verabreicht. An Tag 15 wurden die Spermien der proximalen Cauda epididymis für künstliche Insemination wie oben beschrieben, aufbereitet. Die Spermien, die nach der Insemination zurückblieben, wurden gewaschen und mit 80 mM n-Octyl-β-Glukopyranosid (OBG) in 10 mM Tris, pH 7.2 extrahiert. Der Extrakt wurde dann aufkonzentriert, entsalzt, und die Proteinkonzentration wurde vor der Auftrennung auf 14%-igen zweidimensionalen Mini-SDS-PAGE-Gelen bestimmt. Das silbergefärbte SP-22-Protein wurde bezüglich des Hintergrunds korrigiert und die integrierte optische Dichte wurde mit der Fertilität dieser Spermien korreliert.
SP-22-Aminosäuresequenzierung
Vier Peptide wurden wie in 1 gezeigt erhalten. Jedes Peptid war vergleichsweise kurz in der Länge, und jedes wurde von Trypsin-Spaltstellen bei Lys (K) oder Arg (R) flankiert. Die Peptide #1, 2, und 4 entsprachen Sequenzen in dem kürzlich in humanen HeLa-Zellen beschriebenen DJ-1-Protein (Nagakubo et al., 1997). Darüber hinaus entsprachen fünf von sieben Aminosäuren die innerhalb des Peptids #3 enthalten waren im Anschluss an Edman Abbau der DJ-1-Sequenz. Von den zwei Aminosäuren in Peptid #3, die nicht der DJ-1-Sequenz entsprachen, ist eine mittlerweile als fehlerhaft bekannt (d.h. G sollte H sein), und die andere stellt eine T (humanes DJ-1)-nach-S (Ratten SP-22)-Substitution in der DNA-Sequenz dar (2). Vergleiche von humanem DJ-1 mit "expressed sequence tagged"-Klonen von Maus, zeigten an, dass diese Peptide ebenfalls perfekt zwischen Mensch und Maus konserviert waren.
1A zeigt die über Edman Abbau identifizierten SP-22-Peptide, und 1B zeigt die Volllängenaminosäuresequenz von humanem DJ-1. * zeigt an, dass eines der Threonine (T) im Peptid #3 ein Serin (S) in SP-22 ist. * zeigt an, dass die erste Aminosäure nach der Lysin (K)-Spaltstelle, d.h. Valin (V), beim Sequenzieren mehrdeutig war.
Klonieren und Sequenzieren der SP-22 cDNA
Sequenzieren der SP-22 cDNAs, erhalten von einer Rattenhoden-cDNA-Bibliothek, zeigten an, dass SP-22 durch drei unterschiedliche mRNA-Sequenzen (SP-22A, SP-22B, SP-22C) kodiert wurde, mit voneinander abweichenden 5'-Sequenzen (2). Während fast der gesamte kodierende Bereich konserviert war, wird für das SP-22C-Transkript vorausgesagt, mindestens 13 zusätzliche Aminosäuren am 5'-Terminus zu kodieren, und ein Protein von 202 Aminosäureresten herzustellen. Die anderen zwei Transkripte, SP-22A und SP-22B, kodieren 189 Aminosäuren, die mit den verbleibenden SP-22 C-Resten identisch sind.
Von den vier Peptiden, die durch direktes Peptidsequenzieren von gereinigtem SP-22 erhalten wurden, 1, hatten sich die Peptide #1, 2 und 4 als exakt der vorhergesagten SP22-Aminsäuresequenz entsprechend herausgestellt. Für Peptid #3 stellte sich heraus, dass es eine einzige Abweichung enthält, wo eher Glycin als Histidin vorhergesagt wurde. Die 3'-untranslantierte Region der SP-22-cDNAs enthielt ein typisches Polyadenylierungssignal (AATAAA), obwohl drei separate Polyadenylierungsstellen beobachtet wurden. Datenbanksuchen unter Verwendung der SP-22-Sequenz zeigten eine wesentliche Homologie (91% Identität) zu dem humanen DJ-1-Protein an (3) und deuten darauf hin, dass SP-22 und DJ-1 Mitglieder derselben Proteinfamilie sind. Das gesamte Übereinstimmen mit DJ-1 war beschränkt auf die 189 Aminosäurereste, die den drei SP-22-Transkripten gemeinsam sind.
2 zeigt, dass SP-22 durch alternativ gespleißte mRNAs kodiert wird. Die voneinander abweichenden 5'-Enden von drei SP-22-cDNAs bezeichnet mit A (einfacher Text), B (kursiv), und C (unterstrichen,) sind dargestellt mit den verbleibenden Sequenz-repräsentierenden Nukleotiden, die zwischen allen drei Sequenzen konserviert sind. Mögliche kodierende Sequenzen sind fett dargestellt. Für die SP-22-Sequenz wird vorausgesagt, 13 zusätzliche Aminosäuren kodierender Sequenz zu haben, die in der Sequenz SP-22-A oder SP-22-B nicht vorkommen. Aminosäuresequenzen, die vom Sequenzieren des SP-22-Peptids stammen, sind unterstrichen. Die Ergebnisse der Peptidsequenzierung passten perfekt, mit der Ausnahme von Peptid #4, wo ein Histidin (H*) anstelle eines Glycins (G) beobachtet wurde. Das kanonische Polyadenylierungssignal (AATAAA) ist unterstrichen. Beobachtete, multiple Polyadenylierungsstellen sind durch Sternchen gekennzeichnet.
3 stellt die wesentliche Homologie von Ratten-SP-22 zu humanem DJ-1-Protein dar. Die 189 Aminosäuren von SP-22, die zwischen allen SP-22-Sequenzen (oberen) konserviert sind, werden verglichen mit der vollständigen DJ-1-Sequenz (unten). Sequenzidentitäten sind durch ausgefüllte Balken dargestellt, konservative Substitutionen sind dargestellt durch einen Doppelpunkt, und voneinander abweichende Reste sind durch Lücken dargestellt. Alle Peptidsequenzen sind zwischen SP-22 und DJ-1 identisch, mit der Ausnahme von Peptid #3, wo der beobachtete Austausch von Threonin (T) zu Serin (S) sowohl in den gerichteten als auch vorausgesagten Aminosäuresequenzen beobachtet wurde. Der hohe Grad an Identität denkt an, dass SP-22 und DJ-1 zu derselben Familie von Proteinen gehören.
4 zeigt, dass Northern-Blotting von Gesamt-RNA aus Hoden (T), Nebenhoden (E), Hirn (B), Leber (L), und Niere (K) der Ratte, die Anwesenheit einer 1.0 kb-mRNA in allen Geweben aufwies. Dennoch erschien ebenfalls ein 1.5 kb-Transkript in der Hoden-Spur, was das Vorhandensein einer Hoden-spezifischen SP-22-mRNA anzeigt.
Peptidantikörperlokalisierung
Affinitätsgereinigtes anti-SP-22-Peptid-IgG erkannte SP-22 im Detergenzextrakt von Spermien der Cauda epididymis, solubilisierten Membranen, die von Spermien der Cauda epididymis isoliert wurden, und einem Detergenzextrakt von Spermien, zurückgewonnen aus dem Rattenhoden 18 Stunden nach Abbinden des Drüsenausführungsgangs (5). Es wurde kein Signal auf Blots detektiert, die mit Präimmunserum inkubiert wurden. Die Tatsache, dass ein leicht basischeres Protein desselben apparenten Molekulargewichts ebenfalls von dem affinitätsgereinigten anti-SP-22-Peptid-IgG erkannt wurde legt nahe, dass posttranslational modifizierte Varianten von SP-22 existieren. Wenn affinitätsgereinigtes anti-SP-22-Peptid-IgG verwendet wurde, um Immunblots von Detergenzextrakten von Bullen-, Kaninchen-, Hengst- und humanen Spermien zu sondieren, war ein Muster der Immunerkennung, das identisch war mit dem das für die Ratte gesehenen wurde, offensichtlich (6), was nahelegt, dass SP-22 und seine Isoform(en) in der Spermienmembran unabhängig von der Spezies vorhanden sind.
Affinitätsgereinigtes anti-SP-22-IgG lokalisierte über den Spermakopf, sowohl von fixierten, als auch frischen Spermien der Cauda epididymis aus der Ratte (7). Fluoreszenzfärbung war spezifisch für die anteriore Seite des äquatorialen Abschnitts des Kopfes. Die Färbung wurde durch Co-Inkubieren von anti-SP-22-IgG mit SP-22-Peptiden vollständig entfernt. Die Färbung des äquatorialen Abschnitts des humanen Spermienkopfes war ebenfalls offensichtlich.
Modulation der Fertilität mit SP-22-Peptid Antikörper
Wenn Spermien der Cauda epididymis für fünf Minuten mit anti-SP-22-Peptid-Antikörper kurz vor der Insemination in die Uterushörner von empfangenden Weibchen inkubiert wurde, war die Fertilität signifikant reduziert (8). Tatsächlich, während die Fertilität von Spermien, die nicht mit Antikörper inkubiert wurden, durchschnittlich 83% betrug (sich erstreckend von 64 bis 100%), hatte nur eines von den sechs Weibchen, die mit Spermien, die mit Antikörper inkubiert wurden, inseminiert wurden, überhaupt Einnistungen. Die Fertilität von diesem einen Weibchen war unterhalb von normal (44%).
Korrelation von SP-22 mit Unfruchtbarkeit induziert durch ein Hodentoxin
Die Fertilität von Spermien der proximalen Cauda epididymis von Ratten, die dem häufigen Nebenprodukt der Trinkwasserdesinfektion, BCA, ausgesetzt waren, war signifikant erniedrigt, bei selbst der geringsten getesteten Dosis, d.h. 8 mg/kh. Die bezüglich des Hintergrunds korrigierte integrierte optische Dichte von SP-22 in silbergefärbten zweidimensionalen Mini-Gelen von Protein aus Detergenzextrakten von Spermien der proximalen Cauda, war stark korreliert (r² = 0.90) mit der Fertilität der Spermien aus diesen Ratten (9). Die Dosisantwort zwischen der Menge an SP-22 in einem Detergenzextrakt von Nebenhodenspermien und der Fertilität dieser Spermien war nicht-linear, d.h. schwellwertartig.
5A zeigt silbergefärbte Proteine (links) und Immunlokalisation mit affinitätsgereinigtem anti-SP-22-Peptid-IgG (rechts). Die Pfeile zeigen die Positionen von SP-22 an.
5B zeigt silbergefärbtes Protein in einer Plasmamembranpräparation von Spermien der Cauda epididymis (links) und Immunlokalisation des SP-22-Peptids (rechts).
5C zeigt silbergefärbte Proteine in einem Detergenzextrakt von Rattenhodenspermien (links) und Immunlokalisation von SP-22 (rechts). Migration der Molekulargewichtsmarker ist links angezeigt. Das apparente Molekulargewicht von SP-22 beträgt in diesen 14%-igen Acrylamidgelen 28 kD. Es sollte erwähnt werden, dass zwei weniger reichlich vorhandene leicht saurere Proteinvarianten, und eine gleich reichlich vorhandene leicht basischere Variante, alle mit demselben apparenten Molekulargewicht ebenfalls durch das affinitätsgereinigte anti-SP-22-Peptid-IgG erkannt werden, was nahelegt, dass andere geladene Varianten von SP-22 existieren.
6 zeigt silbergefärbte Proteine (linke Spalten), in Detergenzextrakten von frischen Ratten-, Kaninchen-, Pferd-, Bullen-, und humanen Spermien, und der entsprechende Immunoblot (rechte Spalten) unter Verwendung von affinitätsgereinigtem anti-SP-22-Peptid-IgG. Die Pfeile zeigen die Lokalisation von SP-22 an. Es sollte erneut angemerkt werden, dass geladene Varianten von SP-22 ebenfalls durch das anti-Peptid-IgG erkannt werden.
7A zeigt Immunlokalisation von SP-22 auf frischen Spermien der Cauda epididymis aus Ratte unter Verwendung des affinitätsgereinigten anti-SP-22-Peptid-IgGs. Es herrschte eine intensive Färbung über der ventral-anterioren Oberfläche des Spermakopfes.
7B zeigt, dass Fluoreszenzfärbung durch Co-Inkubation von affinitätsgereinigtem anti-SP-22-Peptid-IgG mit SP-22-Peptid vollständig entfernt wird.
7C zeigt die Immunlokalisation von SP-22 auf frischen humanen Spermien. Es herrschte eine intensive Färbung über dem anterioren Bereich des Kopfes.
8 zeigt Fertilitätsdaten unter Verwendung des affinitätsgereinigten anti-SP-22-Peptid-IgGs. Wenn Spermien der Cauda epididymis von der Ratte inseminiert wurde ohne Präinkubation mit affinitätsgereinigtem anti-SP-22-Peptid-IgG, betrug die Fertilität, ausgedrückt als die Anzahl von Einnistungen über die Anzahl von Corpora lutea am Tag 9 der Schwangerschaft im Durchschnitt 83% (N = 6). Im Gegensatz hierzu, wenn die Spermien kurz, d.h. für ungefähr fünf Minuten mit anti-SP-22-Peptid-IgG induziert wurden, unmittelbar vor der Insemination in utero, war die Fertilität signifikant verringert (p < 0.05) auf lediglich 7% (N = 6). Tatsächlich hatte nur ein Empfänger überhaupt Einnistungen. Inkubation wird vorzugsweise induziert mit 25–200 mg von affinitätsgereinigtem Peptid Ig G/50 × 10⁶ Spermien, oder 0.5–5 mg/Millionen Spermien.
Gleichzeitige Zugabe von einem der Peptide mit dem Antagonisten oder Antikörper machten die Antikörperwirkung zunichte, d.h., die Fertilität war nicht beeinträchtigt.
9 (oben) zeigt die Beziehung zwischen Fertilität und SP-22 nach Exposition sowohl gegenüber Nebenhoden- als auch Hodentoxinen. Bisher war gezeigt (Klinefelter et al., 1997), dass die Fertilität von Spermien der Cauda epididymis aus Ratte stark korreliert war (r² = 0.83) mit der bezüglich des Hintergrunds korrigierten, integrierten optischen Dichte von SP-22, silbergefärbt in zweidimensionalen Gelen von Detergenzextrakten im Anschluss an Exposition gegenüber einer Vielzahl von Nebenhodentoxinen.
9 (unten) zeigt, dass die Fertilität von Spermien der Cauda epididymis aus Ratte, die ebenfalls stark korreliert war (r² = 0.90) mit der korrigierten, integrierten optischen Dichte von SP-22 im Anschluss an Exposition gegenüber dem Hodentoxin Bromchloressigsäure. Wieder einmal war die Beziehung nicht-linear, d.h. schwellwertartig.
Antikörper gegen SP-22
Antikörper gegen SP-22 können durch jedes konventionelle Mittel hergestellt werden, und sie können entweder polyklonal oder monoklonal sein. Sie können erzeugt werden in Kaninchen, Mäusen, oder anderen Tieren oder Gewebekulturzellen, die daher stammen, oder können Produkte oder Zellen humanen Ursprungs sein. Sie können ebenfalls über rekombinante DNA-Technologien hergestellt werden, entweder in einer Form die identisch zu der des nativen Antikörper ist, oder als chimäre Moleküle, hergestellt durch Rekombination von Antikörpermolekülen, humanen oder tierischen Ursprungs, oder in anderen Formen, gewählt um die Antikörper in höchstem Maße geeignet für die Verwendung in der Therapie zu machen.
Zur Herstellung der Antikörper kann entweder aufgereinigtes SP-22 oder ein Peptid verwendet werden, das identisch zu den bekannten Sequenzen von Fragmenten davon ist, z. B. zur N-terminalen Proteinsequenz, um Tiere zu immunisieren. Eine weitere Möglichkeit ist eine der Nukleotidsequenzen, die ein aktives Fragment von SP-22 kodiert, an das Gen, das für Protein A kodiert, zu fusionieren um den Antikörper zu exprimieren. Der Antikörper wird anschließend über Affinitätschromatographie auf einer Sepharosesäule gereinigt und verwendet, um Tiere zu immunisieren.
Herstellung von Antikörpern gegen SP-22
Antikörper (sowohl polyklonal als auch monoklonal) gegen SP-22 können für diagnostische und therapeutische Verwendungen hergestellt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Fertilitätskontrolle (Empfängnisverhütung) und Fertilitätsbeurteilung (Screening).
"Antikörper" betrifft in diesem Zusammenhang ein synthetisches Protein, das SP-22 bindet, und seine biologische Funktion zunichte macht. Antikörper gegen SP-22 werden entweder über polyklonale oder monoklonale Techniken hergestellt:
A. Polyklonale Antikörperproduktion
Zur polyklonalen Antikörperproduktion werden erwachsene Mäuse oder Kaninchen mit 25 oder 100 mg von SP-22, welches in Freund'schem vollständigem Adjuvans gelöst ist, immunisiert. Dieses Präparat wird subkutan injiziert und ist gefolgt von Booster-Injektionen von SP-22 vermischt mit vollständigem Adjuvans. Die nach der letzten Booster-Injektion erhaltenen Seren werden hinsichtlich Titer, Affinität, und Spezifität getestet.
Speziell für Kaninchen wurden 100 μg des SP-22-Proteins, das wie oben beschrieben erhalten wurde, oder Peptide, die Analoga von SP-22 sind, in 0.5 ml physiologischer Saline solubilisiert und mit einem gleichgroßen Volumen von Freund'schem Adjuvans emulgiert, um Impfstoff-Stellen im Rücken vorzubereiten. Zwei weißen weiblichen Neuseeländer-Kaninchen, Gewicht 2.5–3.5 kg, wurde für das Präimmunserum Blut über die marginale Ohrvene abgenommen. Passenderweise wurden 50 μl des Impfstoffs in 20 Stellen innerhalb des rasierten Bereichs injiziert. Die Kaninchen wurden in ähnlicher Art und Weise vier Wochen später geboostet. Zwei Wochen später wurden die Kaninchen wieder über die marginale Ohrvene zur Ader gelassen und man erhält Serum, das die polyklonalen Antikörper enthält.
Um Antiserum gegen SP-22 herzustellen, wurde ein Detergenzextrakt von Spermien der Cauda epididymis über Reverse-Phase HPLC chromatographiert, und Fraktionen, die angereichert waren an SP-22, wurden in analytischen zweidimensionalen Gelen laufen gelassen. Coomassiegefärbte SP-22-Stanzer wurden anschließend einer Elektroelution unterzogen und das elektroeluierte Material wurde entsalzt, aufkonzentriert, und auf Protein untersucht. Nach Verifizieren, dass das aufkonzentrierte elektroeluierte Material SP-22 war, wurden 25 Mikrogramm mit vollständigem Freund'schem Adjuvans vermischt, und subkutan in jede der sechs Mäuse injiziert. Vier andere Mäuse erhielten lediglich Adjuvans.
Nach vier Wochen wurde jede Maus mit 12.5 Mikrogramm von SP-22, vermischt mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans, geboostet. Nach weiteren 10 Tagen wurde ein letzter ähnlicher Booster gegeben. Die Mäuse wurden an Tagen nach dem letzten Booster eingeschläfert und das Serum wurde entnommen.
B. Monoklonale Antikörperproduktion
Monoklonale BALB/c Mäuse werden mit SP-22-Protein oder im Wesentlichen ähnlichen aktiven Fragmenten oder Analoga davon durch intraperitoneale Injektion mit 50 Mikrogramm Immunogen immunisiert. Danach werden die Milzen entnommen und Zellsuspensionen werden durch Perfusion mit DMEM hergestellt. Die BALB/c-Milzzellen werden mit SP 2/0-Ag 14 Maus-Myelomzellen über PEG fusioniert, und die resultierenden Hybridome in HAT-selektiertem Gewebekulturmedium, plus 20% fötales Kälberserum, gezüchtet. Die überlebenden Zellen dürfen bis zur Konfluenz wachsen. Das verbrauchte Kulturmedium wird hinsichtlich Antikörpertiter, Spezifität, und Affinität getestet.
Im Besonderen werden die Mäuse mit oben beschriebener SP-22-Adjuvansemulsion immunisiert. Jede Maus erhielt zuerst intraperitoneal 0.2 ml dieser Emulsion und wird dann in ähnlicher Art und Weise re-injiziert mit 0.1 ml sechs Wochen später. Mausserum wird 10 Tage nach der zweiten Injektion entnommen und dann über ELISA auf anti-FRP-Aktivität getestet. Die Maus, die die höchste absolute anti-FRP-Aktivität zeigt, wird zur Zellfusion ausgewählt.
Milzzellsuspension, die B-Lymphozyten und Makrophagen enthält, wird über Perfusion der Milz hergestellt. Die Zellsuspension wird gewaschen und über Zentrifugation gesammelt; Myelomzellen werden ebenfalls in dieser Art und Weise gewaschen. Lebende Zellen werden gezählt und die Zellen in ein 37°C Wasserbad platziert. Ein ml an 50% Polyethylenglykol in DMEM wird langsam zugegeben. Die Zellen werden in dem PEG für bis zu 1.5 Minuten bei 37°C inkubiert, wonach das PEG durch die langsame Zugabe von Medium verdünnt wird. Die Zellen werden pelletiert und 35 bis 40 ml von DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthält, wird zugegeben. Die Zellen werden dann in Gewebekulturplatten dispensiert und über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert.
Am nächsten Tag werden DMEM-FCS, das Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin enthält (HAT-Medium) zu jeder Well zugegeben. Die Konzentration an HAT im zuzugebenden Medium betrug das Zweifache der nötigen Endkonzentration, d.h., HEnd = 1 × 10–4 M AEnd = 4 × 10–7 M, und TEnd = 1.6 × 10–5 M.
Anschließend werden die Platten mit HAT-Medium alle drei bis vier Tage für zwei Wochen inkubiert. Fusionierte Zellen werden danach in DMEM-FCS, das Hypoxanthin und Thymidin enthält, gezüchtet. Wenn Zellwachstum 1/2 bis 3/4 konfluent auf dem Boden der Wells wird, wird die überstehende Gewebekulturflüssigkeit entnommen, und über ELISA auf SP-22-spezifischen Antikörper getestet. Positive Wells werden kloniert durch limitierende Verdünnung über Makrophagen- oder Thymozyten Nährplatte, und in DMEM-FCS kultiviert. Klonierte Wells werden getestet und dreimal re-kloniert bevor ein statistisch signifikanter monklonaler Antikörper erhalten wird. Verbrauchtes Kulturmedium der ausgewählten Klone enthält Antikörper, der SP-22 in allen getesteten Verdünnungen bindet.
C. Antikörper gegen SP-22-Peptide
SP-22 wird identifiziert über seine hierin dargestellten biologischen Funktionen und Aktivitäten, sowie über seine Größe von ungefähr 22 kD, und isoeletrischen Punkt von 5.25. Dennoch werden Veränderungen der Form und die Substitution von Fragmenten oder Äquivalenten in Betracht gezogen, sofern Umstände es nahelegen oder sinnvoll machen können, einschließlich Variationen der Verfahren zur physikalischen Kennzeichnung des Proteins. Zum Beispiel kann es notwendig sein, polyklonale Antikörper gegen Peptidfragmente von SP-22 herzustellen, wenn ausreichende Mengen von gereinigtem SP-22 nicht vergleichsweise leicht erhalten werden können.
Zusätzlich zu den Antikörpern, die identisch zum natürlich vorkommenden SP-22-Peptid-Antikörper sind, umfasst die vorliegende Erfindung Epitope, die im Wesentlichen homolog zu diesen Antikörpern sind.
Der Ausdruck "Antikörper" ist so zu verstehen, dass er polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, anti-idiotypische Antikörper gegen Antikörper, die in flüssiger oder gebundener Form markiert werden können, sowie aktive Anteile davon, hergestellt durch jede bekannte Technik, wie, jedoch nicht beschränkt auf, enzymatische Spaltung, Peptidsynthese, und rekombinante Techniken, umfasst.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antkörpermolekülen, erhalten aus den Seren von mit einem Antigen immunisierten Tieren. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern, spezifisch gegen Antigene, wobei die Population im Wesentlichen ähnlichen Epitop-bindenden Bereichen besteht.
Chimäre Antikörper sind Moleküle, in denen verschiedene Proteine von verschiedenen Tierspezies stammen, wie solche, die die variable Region haben, die von einem monoklonalen Antikörper der Ratte stammt, und eine konstante Region des Immunoglobulins aus Mensch. Chimäre Antikörper werden hauptsächlich verwendet, um die Immunogenezität bei der Verabreichung zu reduzieren und die Ausbeute bei der Produktion zu erhöhen, zum Beispiel wo murine monoklonale Antikörper hohe Erträge von Hybridomen ohne höhere Immunogenizität in Menschen haben, so dass monoklonale human-murine chimäre Antikörper verwendet werden.
Chimäre Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung sind im Stand der Technik bekannt [Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984); Boulilanne et al., Nature 312: 643–646 (1984); Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung 125023; Neiberger et al., Nature 314: 2680279 (1985); Taniguchi et al., Europäische Patentanmeldung 171496; Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494; Neuberger et al., PCT Patentanmeldung WO 8601533; Kudo et al., Europäische Patentanmeldung 184187; Sahagah et al., J. Immunol. 137: 1066–1074; Robinson et al., PCT Patentanmeldung WO 8702671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218 (1987); Better et al., Science 240:1041–1043 (1988); und Harlow und Lane, Antibodies, a Laboratory Manual.
Ein anti-idiotyper Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten erkennt, die allgemein mit der Antigenbindestelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein anti-idiotyper Antikörper kann hergestellt werden durch Immunisierung eines Tieres derselben Spezies und genetischen Typs (z. B., ein Mausstamm) als die Quelle des monoklonalen Antikörpers mit dem monoklonalen Antikörper, gegen den ein anti-idiotyper Antikörper hergestellt wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf antworten, durch Produzieren eines Antikörpers gegen diese idiotypen Determinanten, d.h. die anti-idiotypische Aktivität. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4,699,880.
Der anti-idiotype Antikörper kann ebenfalls verwendet werden als ein Immunogen, um eine Immunantwort in noch einem anderen Tier hervorzurufen, produzierend einen so genannten anti-anti-idiotypen Antikörper. Der anti-anti-idiotype Antikörper kann epitopisch identisch zu dem ursprünglichen monoklonalen Antikörper sein, welcher den anti-idiotypen Antikörper induziert. Daher ist es durch Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypen Determinanten eines monoklonalen Antikörpers möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper identischer Spezifität exprimieren.
Dementsprechend können monoklonale Antikörper, die gegen SP-22 erzeugt wurden, und verwandte Proteine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um anti-idiotype Antikörper in geeigneten Tieren, wie BALB/c-Mäusen, zu induzieren. Milzzellen von solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um anti-idiotype Hybridome herzustellen, die anti-idiotype monoklonale Antikörper sekretieren. Weiterhin können die anti-idiotypen monoklonalen Antikörper an einen getragen wie Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) gekoppelt werden, und verwendet, um zusätzliche BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Seren von diesen Mäusen werden anti-anti-idiotype Antikörper enthalten, die die Bindeeigenschaften des ursprünglichen monoklonalen Antikörpers spezifisch für SP-22 oder Epitope davon haben.
Der Ausdruck "Antikörper" ist ebenfalls so zu verstehen, sowohl intakte Moleküle, sowie auch aktive Anteile davon einzuschließen, wie zum Beispiel solche, die fähig sind, Antigen zu binden. Fab und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment intakter Antikörper, scheiden schneller aus dem Kreislauf aus, und können weniger unspezifische Gewebebindung haben, als ein intakter Antikörper, vgl. Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325, 1983.
Der Ausdruck "Antagonist" schließt Antikörper ein, komplementäre Peptide oder Fragmente davon, oder andere kleine Moleküle, die die Aktivität des Proteins inhibieren.
Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog", wenn er im Zusammenhang mit Aminosäuresequenzen verwendet wird, betrifft Sequenzen, die im Wesentlichen identisch mit oder ähnlich in der Sequenz miteinander sind, was zu einer Homologie der Konformation führt, und daher zur Aufrechterhaltung, bis zu einem nützlichen Grad, von einer oder mehrerer biologischen (einschließlich immunologischen) Aktivitäten. Der Ausdruck ist nicht vorgesehen, eine gemeinsame Evolution der Sequenzen zu implizieren.
Im Wesentlichen homologe Peptidepitope können durch eine Vielzahl von Techniken identifiziert werden. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass man alle möglichen Einzelsubstitutionsmutanten eines bekannten Peptidepitops synthetisieren kann, Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18: 3998–4002 (1984). Während die Effekte verschiedener Substitutionen nicht immer additiv sind, ist es begründet zu erwarten, dass zwei vorteilhafte oder neutrale Einzelsubstitutionen, an verschiedenen Positionen des Restes in dem Epitop, in den meisten Fällen sicher kombiniert werden können.
Man kann ebenfalls eine Familie von verwandten Einzel- oder multiplen Substitutionsmutanten synthetisieren, die in der Mischung von einer Zelllinie vorhanden sind, fähig, die gewünschten Epitope zu präsentieren, und die Zellen geeigneten begrenzten Antigenen auszusetzen. Wenn die Zellen lysiert werden, können wirksame Epitope identifiziert werden, entweder über direkte Gewinnung aus den Zellen, oder über einen progressiven Prozess des Testens von Teilmengen der wirksamen Peptidmischungen. Verfahren zur Herstellung von degenerierten Peptiden sind beschrieben in Rutter, U.S.-Patent Nr. 5,010,175; Haughter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82: 5131–5135 (1985); Geysen et al., op. cit.; WO86/06487; und WO86/00991.
Beim Entwerfen einer multiplen Mutagenese-Strategie würde der Durchschnittsfachmann selbstverständlich die Einzelsubstitutionsmutanten-Daten gewichten, beim Bestimmen sowohl welche Reste zu variieren, als auch welche Aminosäuren oder Klassen von Aminosäuren geeignete Austausche sind.
Es ist ebenfalls möglich, im Wesentlichen homologe Epitope vorauszusagen, durch In-Betrachtziehen von Studien von Sequenzvariationen in Familien von natürlich vorkommenden homologen Proteinen. Bestimmte Aminosäuresubstitutionen werden öfter toleriert als andere, und diese sind oft korreliert mit Ähnlichkeiten in Größe, Ladung, etc., zwischen der Originalaminosäure und ihrem Austausch. Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren können ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Klone
Ist einmal ein Antikörper gegen, oder Teile der Sequenz von SP-22 erhältlich, ist es notwendig, cDNA-Bibliotheken zu screenen, um die cDNA-Klone, die SP-22 produzieren, zu identifizieren. SP-22 kann durch andere Verfahren als Gewinnung aus männlichen Tieren hergestellt werden. Insbesondere wird eine cDNA-Sonde gegen eine Teilsequenz von SP-22 hergestellt, und verwendet, um das SP-22-Genom in Zellen einer Säugetierspezies zu identifizieren. Das identifizierte Genom wird dann in ein Plasmid insertiert, was dann dazu verwendet wird, rekombinantes SP-22 in proliferierenden Bakterien oder anderen Wirten gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren zu produzieren. Dies ist nützlich, in den hierin beschriebenen Methodiken, z. B. Immunkontrazeption, Zugabe zu Spermien. Dennoch erfordern diese Verwendbarkeiten nicht nur große Mengen von SP-22, sondern sie erfordern ebenfalls große Mengen von dem SP-22-Antikörper. Dies wird in einer Batch-Kultur von Hybridomazellen unter Verwendung von bereits bewährten Verfahren erreicht. Dieselben Prozesse können verwendet werden, um Antagonisten von SP-22 und Fragmente und Derivate davon zu identifizieren.
Empfängnisverhütung
Antikörper gegen SP-22 können verwendet werden, zur Empfängnisverhütung sowie zum Untersuchen der Fertilität. Ein reversibler empfängnisverhütender Impfstoff wird bereit gestellt durch Verabreichen von SP-22 an ein Tiersubjekt, wie oben beschrieben in einer Menge, die wirksam ist, die Fertilität dieses Subjekts über die Erzeugung von Antikörpern gegen SP-22 zu reduzieren. Teilweise Reduktion der Fertilität, d.h. Wirkungen, die sich als eine Reduktion der Fertilität in einer Population von Subjekten widerspiegeln sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Jedes Tier, das Spermienoberflächen-SP-22 exprimiert, kann mit dem immunkontrazeptiven Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden, einschließlich sowohl Vögel als auch Säugetiere. Exemplarische Säugetiere schließen ein Mäuse, Kaninchen, Hunde, Katzen, Kühe, Schweine, Schafe, Pferde, und Menschen. Säugetiersubjekte sind bevorzugt. Der Impfstoff kann auf eine geeignete Weise, einschließlich durch intramuskuläre Injektion entweder an Frauen oder Männer verabreicht werden. Der Antikörper kann topisch verabreicht werden, wie über Vaginalschaum oder über ein geeignetes topisches Verfahren in einem geeigneten Träger, z. B. über Nasenspray.
Der Ausdruck "Schutz" wie hierin verwendet, soll die Prävention oder Unterdrückung der Produktion fertiler Spermien einschließen.
Es versteht sich, dass es in der Medizin nicht immer möglich ist, zwischen Verhindern und Unterdrücken zu unterscheiden, da das endgültige, induktive Ereignis oder die Ereignisse unbekannt, verborgen sind, oder der Patient nicht ermittelt wird bis er nach dem Auftreten des Ereignisses oder der Ereignisse genesen ist. Der Ausdruck "Schutz" wie hierin verwendet, soll Prophylaxe mit einschließen.
Die Form der Verabreichung kann systemisch oder topisch sein. Zum Beispiel kann die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung über verschiedene parenterale Wege, wie subkutan, intravenös, interdermal, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, transdermal, vaginal, oder bukkal erfolgen. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung über den oralen Weg erfolgen. Parenterale Verabreichung kann entweder über Bolusinjektion oder schrittweise Freisetzung über die Zeit erfolgen.
Es versteht sich, dass die geeignete Dosis einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung von dem Alter, Gesundheit und Gewicht des Empfängers abhängt. Dennoch kann die meistbevorzugte Dosierung auf das individuelle Subjekt zugeschnitten werden, wie vom Fachmann verstanden wird und ohne unzumutbares Experimentieren bestimmbar ist. Dies schließt typischerweise die Abstimmung einer Standarddosis ein, z.B. Reduktion der Dosis, falls der Patient ein geringes Körpergewicht hat.
Vor der Verwendung in Menschen, wird das Medikament zuerst in Versuchstieren bezüglich Sicherheit und Wirksamkeit evaluiert. In humanen klinischen Studien beginnt man mit einer Dosis, die als im Menschen sicher angenommen wird, basierend auf den präklinischen Daten für das fragliche Medikament, sowie auf herkömmlichen Dosen für analoge Medikamente, falls vorhanden. Falls diese Dosis wirksam ist, kann die Dosis erniedrigt werden, um, falls beabsichtigt, die minimale wirksame Dosis zu bestimmen. Falls diese Dosis unwirksam ist, wird sie vorsichtig erhöht, wobei die Patienten beobachtet werden, hinsichtlich Anzeichen von Nebenwirkungen. Siehe, z. B., Berkow et al., eds. The Merck Manual, 15th edition, Merck und Co., Rahway, NJ, 1987; Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY, 1990; Avery; s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams und Wilkins, Baltimore, MD, 1987; Ebadi, Pharmacology, Little Brown und Co., Boston, MA, 1985;.
Die geeignete Dosierungsform hängt von der verabreichten Zusammensetzung ab, d.h. dem für den Antikörper verwendeten Träger, sowie die Art der Verabreichung. Arten der Verabreichung schließen ein Tabletten, Kapseln, Pastillen, Zahnpasten, Zäpfchen, Inhalationsmittel, Lösungen, Salben, und parenterale Depots. Siehe, z. B., Berker, supra, Goodman, supra, Avery, supra, und Ebadi, supra.
Zusätzlich zum Protein oder Antigen der Erfindung, kann eine pharmazeutische Impfstoffzusammensetzung geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger beinhalten, wie Arzneiträger, Träger und/oder Zusätze, die das Weiterverarbeiten der aktiven Verbindungen zu Präparaten, die pharmazeutisch verwendet werden können, vereinfachen. Die Menge von verabreichtem Antigen hängt von Faktoren, wie Weg der Verabreichung, Spezies, und der Verwendung von Booster-Verabreichung ab. Generell kann eine Dosis von ungefähr 0.1 bis ungefähr 100 Mikrogramm pro 100 kg Körpergewicht verwendet werden. Das Antigen gegen SP-22 kann sowohl als humane als auch Tierimpfstoffformulierungen hergestellt werden. Impfstoffformulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen das Antigen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Das Antigen ist in dem Träger eingeschlossen, in einer Menge, die wirksam ist, die Fertilität des zu behandelnden Subjekts zu reduzieren. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind vorzugsweise flüssig, besonders wässrige Träger, wie Natriumphosphat-gepufferte Saline. Die Impfstoffformulierungen können in einem sterilen Glasbehälter, verschlossen mit einem Gummistöpsel aufbewahrt werden, durch welchen Flüssigkeiten injiziert, und Formulierungen über eine Spritze entnommen werden können.
Impfstoffformulierungen der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls ein oder mehrere Adjuvantien enthalten. Jedes geeignete Adjuvans kann verwendet werden, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, pflanzliche oder tierische Öle, und Ähnliches, wobei die Menge an Adjuvans von der Natur des speziell verwendeten Adjuvans abhängt. Zusätzlich können die Impfstoffformulierungen ebenfalls mindestens einen Stabilisator enthalten, wie Carbohydrate, wie Sorbitol, Mannitol, Stärke, Saccharose, Dextrin und Glukose, sowie Proteine, wie Albumin oder Casein, und Puffer, wie Alkalimetallphosphate und Ähnliches.
Zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil, d.h., zum Antigen oder Antikörper gegen SP-22, oder SP-22 an sich, können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, die das Weiterverarbeiten der aktiven Bestandteile zu Präparaten zur pharmazeutischen Verwendung vereinfachen. Vorzugsweise enthalten die Präparate von ungefähr 0.1 bis ungefähr 99 Prozent, vorzugsweise von ungefähr 25 bis 85 Prozent an aktivem Bestandteil zusammen mit den Arzneimittelträgern. Die Arzneimittelträger können beliebige pharmazeutisch verträgliche Arzneimittelträger oder Träger sein, die mit dem Antigen oder Antikörper verwendet werden können.
Geeignete Arzneimittelträger sind im Besonderen Füllstoffe, wie Zucker einschließlich Laktose, Saccharose, Mannit und Sorbit, Zellulosepräparate und Derivate, und/oder Kalziumphosphate. Ebenfalls nützlich als Arzneimittelträger sind Bindestoffe wie Stärke, Gelatine, Gummis, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, und/oder Polyvinylpyrrolidon. Gleitmittel wie Silica, Talk, Stearinsäure oder Salze davon, und/oder Polyethylenglykol können ebenfalls verwendet werden.
Zur vaginalen Applikation können Zäpfchen, Lotionen, Cremes, Sprays, oder Schäume verwendet werden, um die aktiven Bestandteile zu inkorporieren. Geeignete Zäpfchengrundlagen sind, zum Beispiel, natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyethylenglykole, oder höhere Alkanole. Schaumformulierungen können ölige Suspensionen oder wässrige Lösungen des aktiven Bestandteils mit geeigneten Schaummitteln enthalten. Andere topische Träger zur vaginalen Applikation schließen pharmazeutisch verträgliche Flüssigkeiten ein, in welchen der aktive Bestandteil suspensiert oder gelöst ist.
Für die Verabreichung über Nasenspray wird der aktive Bestandteil in eine pharmazeutisch verträgliche Flüssigkeit inkorporiert, die in die Nase gesprüht werden kann.
SP-22 kann ebenfalls verwendet werden, um männliche Tiere zu identifizieren, die gute Kandidaten zum Liefern von Spermien für künstliche Inseminationen sind. Da Zuchttiere über künstliche Insemination oder Embryotransfer reproduziert werden können, ist es wichtig in der Lage zu sein, Männchen zu identifizieren, die fertil sind, sowie erstrebenswerte Eigenschaften besitzen, um sie an die nächste Generation weiterzugeben. Techniken zum Reproduzieren von Tieren über Embryotransfer sind in den U.S.-Patenten 3,854,479; 4,816,257; und 4,326,505 beschrieben. Durch Bestimmen der Menge von SP-22 in Spermien eines Versuchstieres kann die Fertilität des Tiers vorhergesagt werden.
Es ist bekannt, dass Spermienproteine von Toxinen und Umweltgiften beeinflusst werden. Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden die Veränderungen im SP-22-Level kalibriert, um die Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, dass das Sperma infertil gemacht wurde, aufgrund der Exposition gegenüber dem Toxin.
In Klinefelter et al., 1996 wurde gezeigt, dass endokrin-störende Chemikalien die Fertilisierungsfähigkeit der Spermien der Cauda epididymis in vier Tagen verringerte. Tests wurden durchgeführt um zu bestimmen, ob diese Infertilität zusammenhing mit der Abnahme an mit dem Sperma assoziierten SP-22.
Mit dem Ziel, die Wirkungen der Exposition gegenüber Toxinen die den androgenen Status des Tiers, wie EDS, stören, zu evaluieren, wurden Spermien Analysen auf SP-22 hin unterzogen. Erwachsene (90 bis 120 Tage alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zu zwei bis drei Tieren pro Käfig gehalten mit Kieferspänen der Laborgüteklasse als Lagerstreu. Die Ratten wurden unter Bedingungen kontrollierter Temperatur (22°C) und Feuchtigkeit (40–50%) gehalten und ihnen wurde Purinal Laborrattenfutter und Leitungswasser ad libitum gegeben. Die Männchen wurden in einem 14-Stunden Licht, 10-Stunden dunkel Rhythmus gehalten. Jedes Männchen wurde nummeriert und willkürlich einer Behandlungsgruppe zugewiesen. Das Test-Toxin wurde entweder als eine einzelne intraperitoneale Injektion verabreicht oder als vier tägliche Injektionen. Nach vier Tagen wurden die Ratten getötet, und die kaudalen Nebenhoden (Caudal epididymes) von jeder Ratte in eine 35-mm Kulturschale gegeben, die 2 ml von Medium 199 enthielt. Detergenzextrakte, die 10–40 × 10⁶ Spermien repräsentieren, abhängig von der Behandlung, wurden präpariert und Aliquots die 30 Mikrogramm entsprachen wurden zur quantitativen Analyse von SP-22 in einem zweidimensionalen Mini-Elektrophoresesystem (BioRad) elektrophoretisiert.
Im Besonderen wurden Spermien in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und zweimal durch Zentrifugation (3000 × g, fünf Minuten) in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline, pH 7.2 mit frisch zugegebenem 0.2-extrahiertem Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden die Spermien extrahiert für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 1 ml von 40 extrahiertem n-Octyl-β-Glucopyranosid in 10 ml extrahiertem Tris, pH 7.2, das frisch zugegebenes PMSF enthält. Im Anschluss an eine letzte Zentrifugation bei 3000 × g wurde der Überstand abgenommen und bei –70°C eingefroren.
Nach Auftauen wurde jeder Extrakt in 1 extrahierten Trispuffer durch zwei Zentrifugationen (3000 × g für 45 Minuten bei 4°C) in Centricon-10-Einheiten (Amincon) aufkonzentriert. Proteinkonzentration wurde bestimmt unter Verwendung eines Pierce-Proteinassaykits. Probenvolumen, die 30 μg Protein enthielten, wurden lyphilisiert und das Protein wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 45 μl Probenpuffer solubilisiert, der aus 5.7 g Harnstoff, 4 ml 10% NP-40, 0.5 ml Ampholyte (70% 3–10, 30% 5–7) und 0.1 g Dithiothreitol pro 10 ml Bestand. Isoelektrisches Fokussieren (750 V, 3.5 Stunden) wurde in Gelen durchgeführt, die aus 6.24 g Harnstoff, 1.5 g Acrylamid (30% Acrylamid, 1.2% Bisacrylamid), 2.25 ml 10% NO-40, und 0.65 ml Ampholyte (60% 3–10, 40% 5–7) pro 10 ml bestanden. Die Trennung nach dem molekularen Gewicht wurde in 11% Methanol durchgeführt und silbergefärbt. Ein zweidimensionales Kepler-Gelanalysesystem (Large Scale Biology Corp., Rockville, MD) wurde zur Hintergrundkorrektur, Spotabgleich und Spotbereichquantifizierung verwendet. Bilder wurden mit einer Durchlässigkeit von 80 μm räumlicher Auflösung und 4096 Graustufen auf einem Ektron-1412-Scanner erworben und in 256 Graustufen umgewandelt. Quantifizierung wurde durchgeführt durch Fitten zweidimensionaler Gaussverteilungen gegen die Dichteverteilung der Spotbereiche im Anschluss an den Abzug des Hintergrunds. Von den 124 Proteinen (Spots), die in dem 50 Gel-Datenset identifiziert wurden, waren 22 gleich für die Gel-Vertreter der Spermienextrakte von mit Trägern behandelten Tieren. Von diesen 22 Proteinen wurde nur SP-22 von allen Testchemikalien in einer dosisabhängigen Art und Weise betroffen. Tatsächlich war SP-22 das einzige der 124, die identifiziert wurden, das sich entweder in Dosis- oder Behandlungsabhängiger Art und Weise veränderte.
In konnte bestimmt werden, dass Insemination (in utero) von 5 × 10⁶ Nebenhodenspermien von einer Kontrollratte in ungefähr 75% Fertilität resultierte, dadurch bereitstellend eine verhältnismäßig größere Empfindlichkeit als Insemination von etlichen Spermien, die in 100% Fertilität resultieren würde.
Die verschiedenen Daten (Fertilität und SP-22, sowie andere Endpunkte, wie Beweglichkeitsparameter und Testosteronkonzentrationen) wurden zusammengetragen und analysiert unter Verwendung einer zwei-Wege-Analyse der Varianz sowohl für hemmende als auch Behandlungswirkungen. Eine erste Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen ob die experimentellen hemmenden Unterschiede die gemessenen Parameter beeinflussten. Wo gesamthemmende Wirkungen signifikant sind (p < 0.05), wurden die Mittelwerte der kleinsten Quadrate verglichen hinsichtlich signifikanter Behandlungsunterschiede (p < 0.05). Ein Korrelationsanalyse wurde durchgeführt um zu bestimmen, ob signifikante (p < 0.01) Korrelationen bestehen zwischen jedem der gemessenen Endpunkte, und Fertilisierungsfähigkeit und Pearson-Korrelationskoeffizienten (R) wurden berechnet.
In einer Studie, beschrieben in Klinefelter et al., Journal of Andrology 15 (4): 318-322227, 1994, verwendeten die Autoren in utero-Insemination von Nebenhodenspermien und Exposition gegenüber einer Chemikalie die den androgenen Status des Nebenhodens stört, Ethandimethansulfonat, EDS, um die Hypothese zu untersuchen, dass EDS die Befruchtungsfähigkeit von Spermien beeinträchtigt durch direktes Beeinflussen der Nebenhodenfunktion. Befruchtungsfähigkeit, Spermienbeweglichkeit, Serumtestosteron, und Gewebetestosteron wurden evaluiert. Zusätzlich wurden Spermienproteine extrahiert und über quantitative zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert. Ein 18 kD-Protein wurde gut mit Fertilität korreliert. Dennoch herrschte der Eindruck, dass Veränderungen in diesem Protein nicht ausreichend waren, entweder bezogen auf EDS selbst von der Dosis die getestet wurde.
In einer nachfolgenden Studie wurde die Inseminationsprozedur modifiziert, um eher die Beurteilung der Fertilität (Einnistungen/Corpora lutea) als die der Befruchtungsfähigkeit (Prozentsatz von befruchteten Eiern) zu erlauben. In dieser Studie wurden mehrere Chemikalien getestet, die den endokrinen Status stören. Erwachsene Männchen wurden entweder 25 oder 50 mg/kg EDS, Epichlorhydrin, 3 oder 6 mg/kg, oder Hydroflutamid, 12.5 oder 25.0 mg/kg. oder Chlorethymethansulfonat 12.5 oder 18.75 mg/kg ausgesetzt. Jede dieser Verbindungen stört das endokrine Gleichgewicht des männlichen Reproduktionssystems. Die Tiere, die dem bekannten anti-androgenen Hydroglutamat ausgesetzt waren, wurden kastriert und ihnen wurden Testosteronimplantate implantiert, direkt vor der ersten Injektion. Die Träger-Kontrollen für alle Behandlungen außer Hydroxyflutamid erhielten tägliche Injektionen von 30% DMSO in Wasser. Die Träger-Kontrollen für die Hydroxyflutamid-Tiere wurden kastriert, ihnen wurden Testosteronimplantate implantiert und sie bekamen tägliche Injektionen von 15% Ethanol. Vier Tage nach Beginn des dosierten Verabreichens wurden die Männchen getötet und die Nebenhoden wurden entfernt. Der Caput/Corpus wurde für nachfolgende Steroidextraktion und Testosteronassay in Trockeneis eingefroren. Die Spermien wurden aus dem Nebenhodenröhrchen in Inseminationsmedium entlassen und in einem CO₂-Inkubator bei 34°C für nicht mehr als 15 Minuten bis zur Insemination gehalten. Erwachsene Östrussynchronisierte weibliche Ratten wurden hinsichtlich Lordoseverhalten überwacht direkt nachdem die Lichter aus waren, am Tag der Insemination. Weibchen, die Paarungsverhalten zeigten, wurden zervikal stimuliert entweder mit vasektomierten Lockmännchen mindestens 15 Minuten vor der Insemination. Ein Volumen, das 5 × 10 Spermien entspricht, wurde in jedes Uterushorn am Tag 0 inseminiert. Am Tag 9 wurden die Weibchen getötet und die Fertilität wurde bestimmt. Ein zweidimensionales Kepler-Gelanalysesystem (Large Scale Biology Corp., Rockville, MD) wurde verwendet zur Hintergrundkorrelation, Spotabgleich und Spotbereichquantifizierung. Bilder wurden mit einer Durchlässigkeit bei 80μm räumlicher Auflösung und 4096 Graustufen erworben. Quantifizierung wurde durchgeführt durch Fitten zweidimensionaler Gaussverteilungen gegen die Dichtverteilung der Spotbereiche nach Abzug des Hintergrunds. Von den 125 Proteinen (Spots), die im 50 Gel-Datenset identifiziert wurden, waren 22 gleich für die Gelvertreter der Spermienextrakte von mit Trägern behandelten Tieren. Von diesen 22 Proteinen wurde lediglich SP-22 von alle Testchemikalien in einer dosisabhängigen Art und Weise betroffen. Tatsächlich war SP-22 das einzige von den 124, die identifiziert wurden, das sich entweder in Dosis- oder Behandlungsabhängigen Art und Weise veränderte.
Messungen von Spermienbewegung und Spermienmorphologie waren durch keine der Behandlungen signifikant betroffen. Basierend auf einem Scatter-Plot der Daten, welcher die Menge von SP-22 mit Fertilität (häufig) in Verbindung setzt, wurden Fertilitätsklassen größer und weniger als n 50% gewählt. Dann wurden Variablen in den Diskriminanzanalysten eingegeben, um die Fertilität über die Klasse vorherzusagen wie in Tabelle 1 gezeigt. Da in dieser Studie Fertilität für die Kontrolltiere bei 68% bestimmt wurde ± einer Standardabweichung von 18%, repräsentierten 50% eine angemessene Ausschlussgrenze für die fertile Klasse.
Tabelle 1 Unterscheidungsanalyse basierend auf SP-22
Eine Regressionsanalyse zeigte, dass die Menge an SP-22 signifikant korreliert war mit der Fertilität (p < 0.0001; r² = 0.83). Ein nicht-linearer Fit der Daten war angebracht, da ein Schwellwert von 10.000 integrierten optischen Dichteeinheiten von SP-22 nötig war, um eine Fertilität von größer als 50% zu erreichen.
Daher, durch Eingabe des Levels von SP-22 einer Spermienprobe in ein geeignetes mathematisches Modell ist es möglich, die Fertilität der Spermienprobe mit einem angemessen hohen Grad (d.h., > 90%) an Erfolg vorauszusagen. Ein Antikörper gegen SP-22 kann verwendet werden, um die Fertilität von Spermien in einer Nebenhodenspermienprobe oder einem Ejakulat zu evaluieren. Da der Antikörper gegen SP22 ein einziges Protein auf Immunoblots von Zellen sowohl von humanen, als auch Hengstspermienextrakten erkennt, wird dieser Antikörper am wahrscheinlichsten anwendbar sein, für die Evaluierung von Tieren in welchen maximale Fertilität wichtig ist, z. B. Rind, Pferde, Hunde, und Menschen, unter anderen Tieren.
Die oben getesteten Toxine stören das endokrine Gleichgewicht des männlichen Reproduktionssystems. Andere umweltrelevante endokrin störende Substanzen wie Dioxin können ebenfalls die Expression von SP-22 beeinträchtigen. Die vorliegende Erfindung umfasst daher ebenfalls ein Screening-Kit, um solche Chemikalien zu testen.
Die vorangegangene Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen zeigt daher vollständig das generelle Wesen der Erfindung, welches Andere, durch Anwenden des derzeitigen Wissens, in geeigneter Weise modifzieren, und/oder adaptieren können, hinsichtlich vielfältiger Anwendungen solcher spezifischen Ausführungsformen, ohne vom generischen Konzept abzurücken, und daher solche Adaptierungen und Modifikationen vorgesehen sind, in Sinn und Umfang von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen erfasst zu sein. Es versteht sich, dass die Phraseologie oder Terminologie hierin zum Zwecke der Beschreibung und nicht der Beschränkung ist.
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Claims

Antikörper der eine Peptidsequenz bindet, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 33–38 in 1B dargestellt ist, enthalten ist.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper weiter eine Peptidsequenz bindet, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 109–156 in 1B dargestellt ist, enthalten ist.
Antikörper der eine Peptidsequenz bindet, die innerhalb der Peptidsequenz, die als Aminosäuren 149–156 in 1B dargestellt ist, enthalten ist.
Antikörper nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antiköper ist.
Antikörper nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1, in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Fertilität.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 5 in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Fertilität.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 in Kombination mit einem Gleitmittel in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Fertilität.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 5 in Kombination mit einem Gleitmittel in der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Fertilität.
Verfahren zur Vorhersage von Fertilität umfassend die Schritte von In-Kontaktbringen einer Spermaprobe mit einem Antikörper nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die geeignet sind für die Komplexierung des Antikörpers mit SP-22, und Detektieren der relativen Menge an Antikörper-SP-22-Komplex, wobei eine verringerte Menge an Antiköper-SP-22-Komplex in der Spermaprobe im Vergleich zu normal anzeigt, dass das männliche Subjekt unfruchtbar ist.
Verfahren zur Vorhersage von Fertilität umfassend die Schritte von In-Kontaktbringen einer Spermaprobe mit einem Antikörper nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die geeignet sind für die Komplexierung des Antikörpers mit SP-22, und Detektieren der relativen Menge an Antikörper-SP-22-Komplex, wobei eine verringerte Menge an Antiköper-SP-22-Komplex in der Spermaprobe im Vergleich zu normal anzeigt, dass das männliche Subjekt unfruchtbar ist.
Peptid, das aus Aminosäuren 33–38 in 1B besteht.
Peptid, das aus Aminosäuren 90–93 in 1B besteht.
Peptid, das aus Aminosäuren 124–130 in 1B besteht.
Peptid, das aus Aminosäuren 149–156 in 1B besteht.
Verwendung des Peptides nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in der Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung der Produktion von SP-22-Antikörpern in Säugetieren.
Verwendung des Peptides nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in Kombination mit einem Adjuvans in der Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung der Produktion von SP-22-Antikörpern in Säugetieren.