JPS61280436A - 利尿剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は懸壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　
Ｆａｃｔｏｒ。

以下ＴＮＦと略記することもある。）又は癌壊死因子様
物質を有効成分とする利尿剤に関する。

ＴＮＦは癌細胞を選択的に傷害する生理活性因子として
、１９７５年カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）らによ
って発見された［　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ、７２゜３０００（１９７５）］　、それ以
来この種の因子を抗癌剤として臨床に応用すべく広汎な
研究がなされている。

本発明者らは、この種の因子に関し、別の角度からその
薬理作用について研究を続けていたところ、意外にも、
　ＴＮＦ及びＴＮＦ様物質が極めて優れた利尿作用を有
することを見い出し、本発明を完成した。

本発明の対象物質としては下記のアミノ酸配列を有する
ヒト由来のＴＮＦポリペプチド。

Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　丁ｈｒ　　
Ｐｒｏ　　Ｓｃｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　
Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　ＡｌａＧｌ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ
　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡｉａ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ
　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ
　　Ｖａｌ　　ＧｌｕＬｅｕ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　
Ａｓｎ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　
Ｐｒｏ　　５ｅｒＧｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙ
ｒ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ
ｎ　　ＶａｌＬｅｕｒ’ｈｅＬｙｓＧｌｙＧｌｎＧｌｙ
ＣｙｓＰｒｏＳｅｒＴｈｒＨｉｓ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ
　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ
　　Ｓｅｒ　　ＡｒｇＩＩｅ　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｃ　Ｌｙｓ　　Ｖａ
ｌ　　ＡｓｎＬｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　
　Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒａ　　Ｃｙｓ　
　ＧｌｎＡｒｇ　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｌｙ
ｓＰｒｏ　　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　
Ｉｌｅ　　丁ｙｒ　　Ｌｃｕ　　Ｇｌｙ　　ＧｌｙＶａ
ｔ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　ＬｅｕＳｅｒ　
　Ａｌ！Ｌ　Ｇｌｕ　　Ｉｌｃ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　
ｌ’ｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　ＬｃｕＡｓｐ　　Ｐ
ｈｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｓｃｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇ
ｉｎ　　Ｖａｔ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｃＧｔｙ　　Ｉｌｅ
　　Ｉｌｅ　　ＡｔＩＬ　Ｌｅｕおよびその利尿活性部
位を有するポリペプチド（例えばＮ末端より４又は５個
のアミノ酸残基が欠失したポリペプチド）が挙げられる
。また、これらポリペプチドの生理的に許容される塩。

例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルギニン
、カフエイ／、プロ力イン、塩酸、グル：７ノ酸等との
塩或いはこれらポリペプチドの会合体も本発明の対象物
質に含まれる。

１　本発明の対象物質であるＴＮＦ又はＴＮＦ様物質は
参考例に記０した方法、更には公知のポリペプチド又は
ペプチド合成法に従い、それぞれの対象物質を製造する
ことができる。

以下に本発明の対象物質であるヒトＴＮＰポリペプチド
の利尿作用につきデータを挙げて説明する。

尚、下記実験においては、参考例３で得たヒ）ＴＮＦポ
リペプチド（ａｌ剤Ａと記す。）を用いた。

利尿作用 尿量および尿中電解質排泄に対する効果Ｉ８時間絶食し
たウィスター系雄性ラット（体重的２００ｇ）を代謝ケ
ージに収容し、コーニツシ（Ｃｏｒｎｉｓｈ）の方法［
Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１８，０５（
１９ＧＧ）］に準じ実験を行った。エーテルを用い軽度
の麻酔下で、ラットの腹部を圧迫し、膀胱内に残留する
尿を排泄させた。その直後、１％ゼラチンを含む生理食
塩水に溶解した試験薬（ｐＨ７，４）を静脈内投与し、
ただちに生理食塩水（２５ｍ１／　ｋｇ）を経口投与し
て代謝ケージに戻した。自然に排尿される尿量を２時間
毎に分取し、６時間後には再びエーテルを用い軽度の麻
酔下に上記に窄じ膀胱中の尿を完全に排泄させ、その尿
量をおよび排泄された尿中電解質（Ｎａ＋、　Ｋ”　）
を測定した。

対照実験としては試験薬を含まない」−記の生理食塩水
を与えて同様に操作した。

その結果を次表に示した。

（以下余白） 上記の実験結果から明らかなように本発明の対象物質は
低用量にて極めて優れた尿量および尿中電解質俳７４＋
を増加作用を示し、利尿剤として使用され得る物質であ
る。更に体液量の増加に起因して発症する各種循環器系
疾患の治療剤にも使用され得る。

本発明の対象物質の投与形態としては非経口投与が好ま
しい。その投与量は症状１年令により異なるが、ＩＯ〜
６００μｇ／ｋｇ／日好ましくは２０〜２００μｇ／　
ｋｇ／日である。

本発明の対象物質の製剤化にあたっては、溶液又は凍結
乾燥品が好ましい。その際に、賦形剤や安定化剤を添加
するのが好ましい。安定化剤としては１例えばアルブミ
ン、グロブリン、ゼラチン。

プロタミン、プロタミン塩、グルコース、ガラクトース
、キジローズ、マンニトール、グルクロン酸、トレハロ
ース、デキストラ／Ｉ　ヒトａキンエチルデンプ／、非
イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル
、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエ
チレンアルキルフェ二ルエーテル、ポリオキシエチレン
ンルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセ
リン１１ｔｔ　Ｕｉ　Ｍ＆エステル、ポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ浦、ポリオ
キシエチレンポリオキンプロビレ／アルキルエーテル。

ポリオキシエチレンポリオキシプロビレ／ブロックポリ
マー、ソルビタン脂肪酸エステル、シコ糖脂Ｒｎ　ａエ
ステル、グリセリン脂肪酸エステル）等が挙げられる。

また、本発明の対象物質は、物質により或いは製剤上の
工夫をすることにより、経口投与も可能である。

製剤例 ヒトＴＮＦポリペプチドを適量の８％食塩水（１０％ヒ
ト血漿アルブミン及び２０％Ｄ−マンニトール含有）に
溶かし、この溶液のｐＨを６゜８に調整する。

この溶液を除閉濾過し、バイアルに充填後凍結乾煙して
、注射用粉末を製する。

参考例１ 参考例５で得たウサギ癌壊死因子をコードするクローン
化ＤＮＡを制限酵素１１ａｅ■及びＡｖａ　Ｉを用いて
切り出し、それぞれ第３３〜１２０番の８８　ｂｐから
成るＤＮＡ断片と第２８５〜５８３Ｎの２９９　ｂｐか
ら成るＤＮＡ断片を得た。制限酵素＾ｖａＩで彷り出し
た２９９　ｂｐのＤＮＡ断片はウサギ癌壊死因子をコー
ド、する領域であり、１ｌａｅｎで切り出した８８ｂｐ
のＤＮＡ断片はウサギ癌壊死囚子前駆体をコードする領
域に相当する部分である。

この２ａのＤＮＡ断片を２２　ｐで標識して、ヒト癌壊
死囚子ｃ　ＤＮＡのクローニングのためのプローブとし
、（８）　Ｉｎで使用した。

■ヒト肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ画分の単離 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ア１−ジを採取した。この肺胞マクロア１−ジを■０％
牛脂児血清含「のＲＰＭＩ−ＩＥ１４０培地にセ濁させ
てペトリディフシュ（直径８　ｃ−）に１枚当たりＯＸ
　１０６個となるように播き、３７℃で前培養した。１
時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸閉山来のりボ
ボリサブカライド）、　ＴＩ’Ａ（ホルボール−１２−
ミリステート−！３−アセテート）及びシクロヘキシミ
ドをそれぞれＲ終ｔ５度がＩＯｕｇ／ｍｌ。

１０ｎｇ／ｍ＋及び１μｇ／ｍｌとなるように添加混和
し、更に培養を継続した。４〜４．５時間後に培養液を
吸引除去し、ディツシュ−Ｌに残ったマクロファージを
０．６％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムとＯｍＭク
エン酸ナトリウムを含む５Ｍグアニジルチオシアネート
液で溶解し、ホモジナイズした。−このホモジネートを
Ｏ，ＩＭ　ＥＤＴＡ含有５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上
にｆｆｆ層し、超遠心分離機（ＲＰＳ２７−２１一ター
１日立製作所）を用い２０，５００　ｒｐ■で２０時間
遠心し、全ＲＮＡ画分をベレットとして得た。これを０
．３５Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ及び２
０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し、エ
タノール沈殿として回収した。

この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＩＯｍＭ
Ｔｒ　ｉ　５−１１ＣＩ８１衝液（ＰＩ＋７．４）（以
下ＴＥ液という）１ｍｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。これにＮａＣＨ１ｉ液を０．５Ｍとなるように加
えた後、あらかじめ０，５ＭＮａＣ１を含むＴＥ液で平
衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着
したｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出することに
より、８μｇのｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを得た。

（３）ｃＤＮＡの合成 （２）項で得られたｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを鋳型とし
てＧｕｂｌｅｒらの方法［Ｇｅｎｅ、２５，２８３（１
９８３）］に従ってｃＤＮＡを合成した。

反応液量；４０μｒ ５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ１ｍｍ液液ｐＨ８，
３＞　：　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩ２；１０ｍＭジチオスレ
イトール；　４　ｍＭピロホスフェートナトリウム；１
．２５ｍＭｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ；０．５ｍＭ
　ｄｃＴＰ；０．１０７μＭ　ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ（比
活性３０００Ｃ！／ｍｍｏｌｅ）　；　４μｇオリゴ（
ｄＴ）＋＊−＋ａ：　６μｇ　ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ
　；　１２０単位トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写
酵素。

４３℃で３０分間反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反応
を停止させ、フェ／−ルークロロホルム混液（１：　１
）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終０度２
．５Ｍになるように加え、エタノールにより反応生成物
（単鎖ｃＤＮＡ　−ＲＮＡ複合体）を沈殿させた。この
単鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡ　７６合体を下記組成の反応′ａ
衝液１００μ２に溶解した。

反応緩衝液組成： ２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１１ｃ　１１ｉ１衝液（
ｐＨ７，５）　；　５　ｍＭ　ＭｇＣＩ２；１０ｍＭ　
　（Ｎｔｌａ）　２３０４　；　１００ｍＭ　ＫＣ１；
　Ｑ、１５ｍＭβ−ニコチンアミド　アデニ／　ジヌク
レオチド；５０／１ｇ／ｍｌ’ｔ　ン血Ｉｎ　７　ルフ
ミ７　；　４０ＰＭ　ｄＧＴＰ、　ｄＡＴｒ’、　ｄＴ
ＴＩ’。

ｄＣＴＰ；　０．９単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ；２
３単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■。

１２℃で００分間、続いて２２℃で６０分間反応させた
後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、上記と同様にフ
ェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノールによ
り沈殿させて二重鎖ｃ　ＤＮＡを得た。

（４）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの調製（３）
項で得られた二重鎖ｃＤＮＡに次の組成の反応緩衝液１
００μｊを加え、３７℃で３０分間反応させ、二重鎖ｃ
　ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。

反応緩衝液； ２　ｍＭ　ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ　ａ−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性３　Ｃｉ
／ｍｍｏｌｅ＞及びＩＯ単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼを含をする１００ｍＭカコ
ジル酸ナトリウム（ｐｌ＋７．２＞。

反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェ／−ル
ークロロホルム混液で抽出し、オ・リボ（ａＣ）テール
付加ｃ　ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。

これを１０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−１−ＩＣＩ緩衝液
（ｐＨ７，４）。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む水
溶液に１１当たり２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ
ＤＮＡを含むように溶解した。

■オリゴ（ｄａ）テール付加プラスミドｐＴＩＲ３２２
ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−１−ＩＣ１ｍ緩衝液ＰＩＩ
７．４＞、　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩ２．’５０ｍＭ　（Ｎ
Ｈ４）　２ＳＯａ及び１■１当たり０．１■のウシ血ｔ
ｌ　フルプミ／を含む水溶液１００μＪｋ：　ｐｒ３Ｒ
３２２ヲ１０μｇ溶解し、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉエンドヌ
クレアーゼ１５！ｎ位を加え、３７℃で１時間反応させ
た。反応終了後、反応液を７エ７−ルークロロホルム混
液で抽出し、水層からエタノール沈殿によってＤＮＡを
回収した。得られたＤＮＡを前述のオリゴ（ｄＣ）テー
ル付加に用いた水溶液（但し”Ｉ’−ｄＣＴＰの代わり
にＩ′ｌ−１−ｄＧＴＩ’を含む）２００μｊに溶解し
、ターミナルデオキシヌクレオチラルトランスフェラー
ゼ８０単位を用いて３７℃で２０分間反応させ、約１０
〜１５個のｄＧ残基を取り込ませた。反応液をフェノー
ル−クロロボルム混液で抽出し、水層からエタノール沈
殿によってオリゴ（ｄＣ）テール付加プラスミドｐＨＲ
３２２ＤＮＡを回収した。これをオリゴ（ｄＣ）テール
付加ｃ　ＤＮＡの場合と同様の緩衝液に１１当たり２０
Ｐｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加プラスミドｐＩ３Ｒ３
２２ＤＮＡを含むように溶解した。

（６）組換え体プラスミドの作製 （４）項で得られたオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ
溶液１２０μｅを、（５）項で得られたオリゴ（ｄａ）
テール付加ｆ）Ｉ３Ｒ３２２ＤＮＡ溶液１２０ｕｌト混
合し、６５℃で５分間、５７℃で１２０分間インキュベ
ートしてアニーリングを行い、紐換え体プラスミド溶液
を調製した。

（２）形質転換体の選択 （６）項″ｒ！得られた組換え体プラスミド溶液を用い
、Ｅ、ｃｏｌｉχ１７７６株を形質転換させた。即ち、
Ｅ、ｃｏ目χ１７７６株を、ジアミノピメリ７　ｍ　１
００μｇ１１及びチミジン４０μｇ１ｍｌを補ったし一
プロス２０１中、３７℃で吸光０１１’（０００ｎ■）
が０．５となるまで培養し、菌体を４℃で遠心して集め
、５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ含＜ＴＩＯｍＭＴｒｊｓ−１１
ＣＩＩＩ衝液（ｐＨ７，３）　ｌ０ｍ１に分散し、４℃
で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩衝液２
−１に分散し、０℃で５分間静置した。この分散液０．
２１１に（６）項で得られた組換え体プラスミド溶液０
．１　ｍｌを添加混合し、０℃で１５分間静置し、更に
４２℃で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一
組成のし一グロス０．５脂ｌを加えて１時間振丑培養を
行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテ
トラサイクリン１５μｇｌｕｔを含むＬ−ブロス寒天平
板に広げ、３７℃で約１２時間項五し、テトラサイクリ
ン酎性菌を選択してｃＤＮＡうイブラリ−を作製した。

（８）クローニング （７）ＪＪＩで得られたｃ　ＤＮＡライブラリーについ
て、ヒト癌壊死因子をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラ
スミドを持つ形質転換体をスクリーニングするため、０
）項で得られたウサギ癌壊死因子をコードするＤＮＡの
制限酵素＾ｖａｌで切り出した断片（２９９ｂｐ）の”
Ｉ’５ｍ物をプローブとし、コロニー・ハイブリダイゼ
ータ１ン試験を１ｌａｎａｈａｎらの方法［Ｇｅｎｅ、
　１０゜０３（１９８０）］に従って行った。約２万個
のコロニーから、この標識プローブと強（結合する塩基
配列を含む組換え体プラスミドを持つ形質転換体４３個
を選び出した。

更に、この４３個のコロニーについて、制限酵素１１ａ
ｅｌｌで切り出したウサギ癌壊死因子フード領域の上流
に相当するＤＮＡ断片（８８ｂｐ）のｆｆ２１）標識物
をプローブとし、二次スクリーニングを行い、このプロ
ーブと強くハイブリダイズする６個のコロニーを選び出
した。この２回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死
因子をコードするＤＮＡ塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むＤＮＡを得た。

（９）クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定（８）項で選
択され°た組換え体プラスミドの中からｐ１夏ＴＮＦ−
１３を選び、そのクローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列をＭ
ａｘａ■−Ｇ＋Ｉｂｅｒｔ法により決定した。

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第１表の通りである。ヒト癌壊死因子のポリペプ
チドをコードする領域は、第３表に示したウサギ癌壊死
因子をコードする塩基配列との相同性に基づいて推定し
た。即ち、ヒト癌壊死囚子ポリペプチドは、第１表の第
２３５〜２３７番のＴＣＡのコド７Ｃ８ｅｒに対応）か
ら始まり、第６９７〜６９９番のＣＴＧ（Ｌｅｕに対応
）で終わり、１５５残基のアミノ酸から成っている。塩
基配列第１〜２３４番はヒト癌壊死因子の前駆体部分を
コードするために必要な配列である。

（以下余白） 第１表　ヒト癌壊死因子をコードする塩基配列及び塩基
配列から推測されるアミノ酸配列４０　　　　　　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　ＧＯＣＡＴＧＴＴ
ＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＨ
３ｓＶａｌＶａｌＡ１ａＡｓｎＰｒｏＧ１ｎＡＩａＧｌ
ｕＧＩｙ４３０　　　　　　　　　　　ｕｏ　　　　　
　　　　　　４５０６１０Ｇ２０（ｉ３０ ＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧ
ＧＧＡＴＣＡ１ａＧ１ｕＳｅｒＧ１ｙＧ１ｎＶａｌＴｙ
ｒＰｈｅＧＩｙｌ　ＩｅＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＣＴ
ＣＣＣＣＴＧＣ（本本本）は終止コド／を示す。

塩基８号１〜０９０ｍはヒト癌壊死囚子前駆体をコード
する領域を、〔〕で囲んだ部分はヒト癌壊死因子をコー
ドする領域を示す。

（以下余白） 参考例２　ヒト癌壊死囚子ポリペプチドの製造参考例１
の第（９）項で得たプラスミドＤＮＡから、制限酵素Ｐ
ｓｔ　Ｉでヒト癌壊死囚子前駆体をコードする領域を含
むダローン化ＤＮＡを切り出し、更に非翻訳領域の一部
を制限酵素ＥｃｏＲＩで分解し、約１、Ｉｋｂｐの断片
を得た。これをプラスミド１Ｒ３２２のＰｓｔ　Ｉ　−
ＥｃｏＲＩ断片（約３．［１ｋｂｐ）に組み込むことに
より再クローニングし、このプラスミドをｆ）ＩＩＴｒ
’ｌ１３と名づけた。

このプラスミドｐＨＴ１１３に制限酵素＾ｖａＩと５ａ
ｌＩを作用させることにより、３！ＨのＤＮＡ断片（そ
れぞれ約０．８ｋｂｐ、　１．３ｋｂｐ及び２．０ｋｂ
ｐ）が生じた。これらの断片のうち、ヒト癌壊死因子を
コードする領域の大部分とプラスミドｐｎＲ３２２のテ
トラサイクリン耐性逍伝子の一部を含む約１．３ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を分離精製した。この断片に、次の式で示
される合成オリゴヌクレオチド　アダプターをＴａ　Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得られたＤＮ
Ａ断片を、以下１１ＴＮＦ−アダプター断片という（第
１開弁１ｔ＜１　）。

一方、ｔｒｐプロモーター　ベクターｐＤＲ７２０［Ｒ
ｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２
０，２３１（１９８２）：　Ｐ−Ｌバイオケミカルス社
より購入］に制限酵素ＥｃｏＲＩと１１ｐａｌを作用さ
せ、ｔｒｐプロモーター領域の一部を含むＤＮＡ断片（
３５ｂｐ）を切り出し、これに次の式で示される合成オ
リゴヌクレオチド　アダプターをＴａ　ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させた。ここに得られたＤＮＡ断片を、以
下ｔｒｐプロモーター断片という。

別途に、プラスミドＰＢＲ３２２に制限酵素ＥｃｏＲＩ
とシリ−■を作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７ｋ
ｂｐ）を切り出した。これに、先に調製したＩＩＴＮＦ
−アダプター断片とｔｒｐプロモーター断片をＴ　ａ　
Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて結合させ、ヒト癌壊死囚子
発現プラスミドを構築し、このプラスミドを参考例１−
のに記載した方法に従いＥ、ｃｏｌｉ　Ｉｆ口１０１に
導入し、形質転換体を得た。形質転換体の選択はテトラ
サイクリア（１２，５μｇ　／ｍｌ）耐性で行った。こ
こで得た形質発現プラスミドをｐＨＴＲ９１、それによ
る形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ　ＩＩ［１ＩＯＩ／　ｐＩ
−ＩＴＲ９１と名づけた。

第２図はｔｒｐプロモーター付き形質発現プラスミドＰ
ＨＴＲ９１の構築工程を示す。

この形質転換体をテトラサイクリア（１２，５μｇ／−
１）を含むＬ１３ブロス（組成：１１当り、トリプトン
１０ｇ、酵母エキス５　ｇ、　ＮａＣ１１０ｇ；　ｆ）
Ｈ７，５）に−夜培養し、この培養液を１０倍ｎ０改良
ＭＯ培地（組成＝０．７％Ｎａ２Ｈｒ’０４’　１２Ｈ
ｚ０．０．３％ＫＨ２ｒ’０４゜０．０５％　ＮａＣ１
，０，１％　Ｎ１１ａＣ１’、　　２Ｂ／　　ｌ　　ビ
　タ　ミ　／Ｂ１゜０．４５％カザミノ酸、　　ＩｍＭ
　Ｍｇ５ｏ４．０．ＩｍＭ　Ｃａ（Ｊ’２゜０．５％ブ
ドウ糖、　　１２．５１ｘｇ／■１テトラサイクリ／）
に接種し、３７℃で１時間培養し、次いでインドール−
３−アクリル酸を最終ａ［ｆｌ’２０μｇ／欄１になる
ように加え、更に２４時間培養を継続したのち、遠心分
離により菌体を集めた。菌体を培地容量の１／　１０容
量の０．１％リゾチームと３０ｍＭ　ＮａＣ１を含む５
０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）に懸濁
させ、０℃で３０分間静置した。更にドライアイス／エ
タノール浴での凍結と３７℃での融解を繰り返した後、
遠心分離により菌体残渣を除いた上清液を粗抽出液とし
た。

参考例３　ヒト癌壊死因子ポリペプチドの精製＃名例２
で得られた粗抽出液から以下に示す工程にて、ヒト癌壊
死因子ポリペプチド（以下本ポリペプチドと略記する。

）を精製した。

２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，８＞であらかじ
め平衡化したＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ−
８１１（ファルマシア社）のカラム（５，０Ｘ　２０ｃ
ｍ）に、上記の粗抽出液を付し、次いで、同緩衝液でカ
ラムを洗浄した後、溶出溶媒の食塩濃度を０から０６３
Ｍまで連続的に上昇させ、流速１３３ｍ１／時で溶出し
た。溶出液は１０１ずつに分画し、各両分のＬ−Ｍ細胞
傷害活性を測定し、活性を有する両分を採取した。

上記°の工程で得られた活性画分を分画分子量１０．０
００の分子篩膜（ＹＭ　Ｉ　Ｏアミコツ社）を続行した
限外濾過器を用いて、脱塩後、濃縮した。この濃縮液を
調製用ゲル等電点電気泳動に付した。ＬＫｎ社のイモビ
ラインを用いて、ｐｌ−１５，０からｐＨ０，１の固定
化ｐ　Ｉ−１勾配をもつゲル平板（２，０■ｍＸ　ｌｏ
ｃ■Ｘ１０ｃ■）を作製し、Ｍ濃縮液１．０１をこのゲ
ル平板上にのせた。電気泳動は１５℃、　２４００Ｖで
、１０時間行った。泳動終了後、ゲル平板上のＬ−Ｍ細
胞傷害活性を有する蛋白のバンドに相当する位Ｆ！！、
（ｐＨ５，９付近）を中心にして１０■■中でゲル断片
を切り出し、該物質を２０　ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，８）で抽出した。抽出液を集め、限外濾過で
濃縮し次いで旧ｏ−Ｇｅｔ　ｌ”０　（バイオラッド社
）のカラム（０゜７Ｘ　２５ｃｍ）でゲル濾過し脱塩し
た。

このようにして精製した本ポリペプチドについて０．１
％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
した。電気泳動後、クーマシー・ブリリアント自ブルー
で蛋白染色すると単一のバンドを示した。また同条件で
電気泳動を行い、泳動後、ゲルを３■■等間隔で切り出
し、各ゲルからの抽出液について、Ｌ−Ｍ細胞傷害活性
を測定した結果、その活性の最大を示すゲル位置は、蛋
白染色バンドの位置と一致した。

この精製した本ポリペプチドは蛋白質１＋＋ｇあたり、
２ＸＩＧ’単位のＬ−Ｍ細胞傷害活性を存していた。

本ポリペプチドの特性は以下の通りである。

０）　物理化学的並びに化学的特性 分子量 本ポリペプチドの分子量を、ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３００
０ＳＷカラム（７，５Ｘ　ＧＯＯｍｍ、東洋曹達工業）
を用い、ゲル濾過法により測定した。

その結果、本；１Ｓリペプヂドの分子量は尿素非存在下
では４５　、０００±５，０００ダルトン、尿素存在下
では１８．０００±３，０００ダルトンと求められた。

形質発現プラスミドＰＨＴＲ９１に組み込まれた本ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡから翻訳されるアミノＷｔ
残基数は１５５残基である。その配列から推定される分
子量は１７，０９７ダルトンである（ただし、開始コド
ンＡＴＧに由来するメチオニンを除（）。尿素存在下で
のゲル濾過分析で求められた本ポリペプチドの見かｉノ
の分子量はこの推定分子量とほぼ一致した。

この結果は、本ポリペプチドはサブユニット溝造をとり
、尿素存在下では解離し単量体となるが。

これら解離剤の非存在下では、すなわち自然吠面では会
合体を形成しでいることを示すものである。

等電点 本ポリペプチドの等電点をｐＨ範囲４．０〜６．５のフ
１ルマライト（ファルマシア社）と５％ポリアクリルア
ミドを含むフラットゲルを用いた等電点電気泳動法にて
測定した。その結果、本ポリペプチドの等電点は５．９
±０．３であった。

アミノ酸組成 本ポリペプチドを常法に従って塩酸加水分解した後、オ
ルトフタルアルデヒドを用いた蛍光法による微量アミノ
酸分析システム（８津製作所）により各アミノ酸を定量
し、アミノ酸組成を求めた。

その結果を第２表に示す。その分析値は、本ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの塩基配列から推測されたアミノ
酸組成とよく一致した。

第２表　本１′リベプチドのアミノ酸組成アミノ酸　　
　　　分析値（ｍａ＋）　　　　　塩ノλ配列より求め
たＴｈｒ　　　　　　　　　　　５．６　　　　　　　
　　　　　　０Ｓｃｒ　　　　　　　　　　１２．４　
　　　　　　　　　　　１３Ｐｒｏ　　　　　　　　　
　１０．３　　　　　　　　　　　　１０Ｇｌｙ　　　
　　　　　　　１０．６　　　　　　　　　　　　１１
Ａｌａ　　　　　　　　　　１３．０　　　　　　　　
　　　　　＋３Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　Ｉ・　５
２Ｖａｔ　　　　　　　　　　１２．１　　　　　　　
　　　　　１２Ｍｅ　ｔ　　　　　　　　　　　＜Ｏｌ
　１　　　　　　　　　　　　　　　０１１ｅ　　　　
　　　　　　　８．０　　　　　　　　　　　　　８Ｌ
ｅｕ　　　　　　　　　　１７．７　　　　　　　　　
　　　　ｌ１ｌＴｙｒ　　　　　　　　　　　８．８　
　　　　　　　　　　　　７Ｉ’　ｈ　ｅ　　　　　　
　　　　　３．９４＋１１ｓ　　　　　　　　　　　２
．８　　　　　　　　　　　　　３Ｌｙｓ　　　　　　
　　　　　［３，１６Ａｒｇ　　　　　　　　　　　７
．５　　　　　　　　　　　　　８Ｔｒｐ　　　　　　
　　　　　Ｉ・６２；　ン１１　　θ　）　　ア　ミ　
／　　　＋１３−＝２１１一本ポリペプチドのＮ末端部
分のアミノ酸配列はエドマン分解法［＾ｒｃｂ、旧ｏｃ
ｈｃｍ、［１ｉｏｐｈｙｓ、、２２，４７５（１９４９
）］により決定した。

その結果、本ポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸配列
は＋Ｓｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−３ｅｔ−Ａｓｐ−〜−一であった６ Ｃ末端部分アミノ酸配列 本ポリペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配列はカルボキ
シペプチダーゼを用いる酵素法により決定した。

その結果、本ポリペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配列
は＋−−−−ＴＶｒ−Ｐｂ６−ＧＩＶ−１１ｅ−１１０
−Ａｌｌ−Ｌ−ｅｕであった。

以上のことより、本ポリペプチドは第１表の〔〕で囲ん
だアミ７段配列を仔するポリペプチドであることが明ら
かである。

参考例４ 参考例３で得られたポリペプチド５００μｇにＴＩ’Ｃ
Ｋ処理トリプシン（シグマ社、　ｔｙｐｅＸＩＩＩ）　
２０℃ｇを５ｍＭ）リスー塩Ｍｌｆｉ衝液（ｐＬＩ　７
．８＞中、室温で５時間反応させた。この反応液を調製
用等電点電気泳動に（１１シた。泳ｖＪｔＩ！了後、ク
ーマシーーブリリアント・ブルーによる蛋白染色と、３
ｍｍ巾で切り出したゲル片からの抽出液（２０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液、ｐｌ！７．８にて抽出）中のＬ−Ｍ細
胞傷害活性の測定を行った。その結果、本ポリペプチド
の泳動位置（ｐＨ５，９付近）よりｒ）ＩＩが約０．３
程酸性側の位置に蛋白のバンドと一玖するＬ−Ｍ細胞傷
害活性を認めた。

この物質（分解産物という）について、Ｎ末端部分及び
Ｃ末端部分のアミノ酸配列１をそれぞれエドマン分解法
とカルボキシペプチダーゼを用いる方法にて解析した。

その結果、この分解産物のＮ末端部分及びＣ末端部分の
アミノ酸配列は、それぞれＴｈｒ−Ｐｒｏ−３ｃｒ−Ａ
ＩｉＰ−−−−＋　及び−−−−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕであった。すなわち、この分解産物は本ポリペプチド
のＮ末端部分の５ｅｒ−８ｃｒ−５ｅｒ−Ａｒｆｆの４
残基が欠失したアミノ酸配列をもつポリペプチドである
。

尚、上記参考例３．４及び５で用いた生物活性の評価法
は次の様にして行なった。

生物活性はｉｎ　ｖｉｔｒＯにおけるり、−Ｍ細胞傷害
活性で評価した。

その測定法はＲｕｒｒの方法［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
＋２（ｉ、２３５（１９Ｂ＋）］に準じ、改良した方法
を用いた。すなわち、検体を順次培地で希釈した試料０
．１ｍＪとＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬｌ、２）のｌ
Ｘｌ０’個／１の懸濁＃Ｏ，Ｉ＋＋ｌを９６穴の組織培
養用マイクロプレート（７０−参ラボラトリ−社）に加
えた。培地はＩ　Ｖ／Ｖ％のウシ胎児血清を含むイーグ
ルのミニマム・エッセ／シャル培地（その組成は、例え
ば、「組織培養」中外を之助他編集、朝倉吉店、１９６
７年に紀αされている）を用いた。マイクロプレートを
５％の炭酸ガスを含む空気中、３７℃で４８時間培養し
た。

培養終了後、グルタルアルデヒド２０μ！を加え、生き
残った細胞を固定した。固定後、マイクロプレートを洗
Ｉ争、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶液を０．
１１加え、固定された細胞を染色した。余分なメチレン
ブルーを洗い流し、乾燥した後、固定された細胞に付着
したメチレンブルーをＯ，：ｌＯＮ塩酸で抽出し、その
ＧＯ５ｎｍにおける吸光度をタイクーチツク・マルチス
キャン（フロ一台うボラトリー社）で測定した。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の５
０％を殺すために必要な生理活性量を１単位／■１と定
義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当
する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によって求め
、その届釈率の逆数を試料の生理活性量（単位／園１で
表記する）とした。

尚、蛋白濃度はＬｏｗｒｙ法［Ｊ、［＋ｉｏ１．Ｃｈｅ
ｍ、、１９３，２０５（＋９５１）］により測定した。

（以下余白） 参考１９寸′５ （１）ウサギ肺胞マクロファージからのｍ！≧ＮＡＪＪ
＞画の単離精製 ウサギ（体重的２．５ｋｇ）にｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃ
ｔｃＮｕｌａｃｎｅｓ死菌体を１羽当り１００■の投与
量で静脈内に注入し、８日後に屠殺した。直ちに間物気
管切開し、気管内に挿入したチューブを介してリン１１
１２１１Ｈ街化生理食塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞
マクロファージを採取した。この肺胞マク「１フアージ
をｌθ％牛脂児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸
濁させてベトリゾイブシュ（直径８　Ｃ＠　）に１枚当
り２　Ｘ　１０７個となるように播き、３７℃で５％炭
酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００％で前培養した。

１時間の前培養の後、工／トドキシン、　ＴＰＡ及びシ
クロへキシミドをそれぞれ最終濃度がｌＯμｇ／■１゜
１０ｎｇ／■１及び１μｇ／■Ｉとなるように添加混和
し、更に培養を継続した。４〜４．５時間後に培養液を
吸引除去し、ディツシュ上に残ったマクロア１−ジから
参考例１−■項に示した方法に従ってｐｏｌｙ（＾）ｍ
ＲＮＡを得た。ここで得たｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡをア
ガロースゲル電気泳動（ゲルＯ度１％、ｆ１Ｍ尿素存在
下、ｐｌ＋４）に付し、その分子サイズに従って７つの
両分に分け、ゲルを融解（７０℃、１０分間）させた後
、水飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽
出ののち、エタ／−ルにより沈殿させて各両分よりｐｏ
ｌｙ（＾）ｍＲＮＡを回収した。各両分のｐｏｌｙ（＾
）ｍＲＮＡについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用
いる方法でウサギ癌壊死囚子ｍＲＮＡ量を測定し、分子
サイズとして１．０〜２．７ｋｂに相当する両分にウサ
ギ癌壊死因子ｍＲＮＡを高濃度に回収した。

ここで得られた精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを以下の実
験に用いた。

（２）ｃ　ＤＮＡの合成 精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ　４μｇを用い以下に示す
条件でｃ　ＤＮＡを合成した。

反応液量；Ｉ００μ！ ５０ｍＭＴｒｉｓ−１−ＩＣ！緩衝液（ｐＨ８，３）：
ｌ０ｍＭＭｇＣ１２；７０ｍＭ　ＫＣ１；　１　ｍＭジ
チオスレイト−７１／　；　０．５ｍＭｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＡＴＩ’、ｄＧＴＰ（但しｄＣＴＩ’は３２　
ｐで標識、比活性４．４Ｘ　１０’　ｃｐｓ／　ｎｍｏ
ｌａ）　；　３μｇオリゴ（ｄＴ＞　１２−Ｉｍ、　８
０単位トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素。

４３℃で９０分間反°応させた後、ＥＤＴＡ水溶液で反
応を停止させた。フェノール−クロロホルム混液（１：
１）によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を油出し、エタノ
ールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処理
することによりｍＲＮＡを分解除去した後、合成された
単鎖ｃ　ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。

この単鎖ｃ　ＤＮＡの沈殿を下記組成の反応援衝液４０
μｒに溶解した。

反応緩衝液； ０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ＋　ｄＴＴＩ’、　ｄＧＴＰ、　
ｄｃＴＰ；　５　ｍＭＭｇＣＩ２：　７０ｍＭ　ＫＣＩ
　；　１．５ｍＭβ−メルカプトエタノール；８単位大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■（ラージフラグメント）を含
イｒするＯ、ＩＭ　ｌ１ａｐｃｓ　緩衝液（ｐＨ０，９
）。

１５℃で２０時間反応させ二重鎖ｃ　ＤＮＡを合成した
。

反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を
停止させ、二重鎖ｃｌ）ＮＡをフｙ、　／　−ルーりｌ
＋　Ｉｔホルムｉｆｉ’、　液で抽出し、エタノールに
より沈殿させ回収した。

得られた二重鎖ｃＤＮＡの沈殿を、５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウｔ、　（ｐＨ４，５＞、　１　ｍＭ　ＺｎＳＯ４，２
００ｍＭ　ＮａＣＩ、　０．５％グリセ１−ル及びＳ１
ヌクレアーゼ０．５単位を含イｒする水溶１１００μ２
に溶解し、３７°Ｃで２０分間反応させてヘアピン構造
を開裂させた。反応はＥＤＴＡ水溶液をＩＫ加して停止
させ、フェノール−クロロホルム混液で抽出し、更にエ
ーテルで再抽出した後、エタノールにより沈殿させｃ　
ＤＮＡを回収した。

（３）オリゴ（ｄＣ）チー・ル付加ｃｌ）ＮＡの調製」
ユ記により得られた二重鎖ｃＤＮＡの３′末端に参考例
１−　（４１項に示した方法に準じて、オリゴ（ｄＣ）
テールを付加させ、これを１０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｇ−
ＨＣ１ｍｍ液液ｐＨ７，４）、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及
び１００ｍＭ　ＮａＣ１を含む水溶液に１ｍｌ当り０．
２ｔｔＢのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡを含む
ように溶解した。

（４）オリゴ（ｄＣ）テール付加プラスミドＩ）ｎＲ３
２２１）　Ｎ　Ａ　０）調製 オリ：ｆ　（ｄｃ）　ｆ　−ｉしく・Ｔ　７／ＴＩシラ
スミＦ　ｐＤＲ３２２は参考例１−　（５１項の方法に
学じて調製した。これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤ
ＮＡの場合と同様の緩衝液に１１当り２μｇのオリゴ（
ｄＣ）テール付加プラスミドｆ）［３Ｒ３２２ＤＮＡを
含むように溶解した。

ら）組換え体プラスミドの作製 オリゴ（Ｃ＋Ｃ）テール付加ｃＤＮＡ溶液５０μ！をオ
リゴ（ｄａ）テール付加ｐ　１１　Ｒ３２２ＤＮＡ溶液
５０μｌと混合し、６５℃で１０分間、５７℃で１２０
分間、４５°Ｃで６０分間、３５℃で６０分間及び室温
で６０分間インキュベートしてアニーリングを行い、組
換え体プラスミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択 上記で得られた組換え体プラスミドｔＢ液を用い、参考
例１−（７）項の方法に従ってＥ、ｃｏｌｉχ１７７６
株を形質転換・させ、ｃＤＮＡライブラリーを作製した
。

■ハイブリダイゼーション試験 前記のｃＤＮＡライブラリーについて、ウサギ癌壊死因
子をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため３２　ｐ標Ｊｉａｃｌ
）ＮＡプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョン試験をｌ１ａｎａｈａｎらの方法［Ｇｃｎｅ、　Ｉ
Ｏ，０３（＋９８０＞］に従って行った。３２　ｐ標識
ｃＤＮＡプローブは、：ｆ６’Ｏプラス及びマイナス肺
胞マクロファージより」−記ｆ１１項の方法で得たｍＲ
ＮＡを鋳型として、■項の方法で合成した。但し、”　
Ｐ　−ｄＣＴＰは高放射能比活性のものを用い、高濃度
に標識した。

この試験により誘導プラスのプローブと強く結合し、誘
導マイナスのプローブとはハイブリダイズしない塩基配
列を含む組換え体プラスミドを有する形質転換体を選別
した。約２万個のコロニーから５０個のコロニーが造び
出された。

次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーション・トランスレージ、ン試験をＭａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄ）　”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”。

３２９（１９８０）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、に記俄の方法に従って行った。そ
れぞれの形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ニ
トロセルロースフィルター上に加熱変性させたのち固定
し、これに上記（１）項で得たウサギ癌壊死囚子ｍＲＮ
Ａを含むｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡ画分を加え、ｓｏ’ｃ
で１８０分間反応させ、ハイブリダイゼーションを行っ
た。結合したｍ　ＲＮ　Ａを溶出回収した後アフリカッ
メガエルの卵母細胞に注入し、回収さＫたｍＲＮＡがウ
サギ癌壊死囚子ｍＲＮＡであるか否かを検定した。乙の
試験により、上記で選択された２０個の形質転換体より
ウサギ癌壊死囚子ｍＲＮＡと強くハイブリダイズするｃ
　ＤＮＡを含むプラスミドを持つ菌株３個を見いだした
。そのうち最も長いｃＤＮＡ（約７５ｏｂｐ）を仔する
プラスミドより、ル１限酵索Ｏｄｅ　ＩでＤＮＡ断片を
切り出し、二次スクリーニング用のプローブとした。こ
のＤＮＡ断片を１２　ｐで標識し、上記（６）項で得た
ｃＤＮΔライブラリーについて再度コロニー・ハイブリ
ダイゼーション試験を行い、標識プローブと強く結合す
るｃ　ＤＮＡを含むプラスミドをｔ′Ｎつ形質転換体を
選んだ。ｃＤＮΔライブラリーの約６万個の７１に一の
うち９８個が陽性コロニーであった。これらからｃ　Ｄ
ＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切り出し、そのサイズをポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で調べ、１ｋｂｐ以上のサ
イズを仔する１７個のクローンを選び出した。これらの
うち最も大きなｃＤＮＡを含む形質転換体（菌体番号：
　ＲＴＮＦ８０２．クローン化ＤＮＡ番号：　ｆ）ＲＴ
ＮＦ８０２）について、クローン化ＤＮＡを単離し、塩
基配列を決定した。

（８）クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定（７項で選択
された組み換え体プラスミド（ＰＲＴＮＦ８０２）から
分離したクローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列をＭａ＋＋ａ
ｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で決定した。

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第３表の通りである。

ウサギ癌壊死因子をコードする領域は、ｖ５３表の第２
７７〜２７９番のＴＣＡ−７ドン（Ｓｅｔに対応）から
始まり、第７３０〜７３８番のＣＴＧコドン（Ｌｅｕに
対応）で終わり、１５４残基のアミノ酸から成っている
。

（以下余白） 第３表 ウサギ癌壊死因子をコードする塩基配列及び塩基配列か
ら推測されるアミノ酸配列（ｊ１１／Ｖａ１１’ｔｌｅ
（ｊｌｎＬｅｕ（二１ｌｕＬｙｓ（二ｉｌｙＡｌｌ）Ａ
ｒｇｎｏ　　　　　　　　　　　Ｏｇｏ　　　　　　　
　　　　ｃ９゜ＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣ
ＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ
ＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧ（〕で囲んだ部分はウサギ癌壊死
因子をコードする傾城を示す。

（以下余白） 本明細書では３Ｌ　４’５−の簡略化のために以）の略
ｔ」を使用した。

Ａ　　　　　アデニ７ Ｃシトシン Ｇ　　　　　グア二ノ Ｔ　　　　チミン Ａｌａ　　　　　アラニア Ａｒｇ　　　　　アルギニノ ΔＳｎ　　　　　アスパラギ／ Ａｓｐ　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　　システィ／ Ｇｉｎ　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　　グリシン ＩＴ　ｉ　ｓ　　　　　　ヒスチジン １１ｃ　　　　　　イソロイシン Ｌｃｕ　　　　　　ロイシン Ｌｙｓ　　　　　　リジン Ｍｅｔ　　　　　　メチオニン Ｐ　ｈ　ｅ　　　　　フェニルアラニン１）「ｏ　　　
　　ブ１．Ｊリン Ｓｃｒ　　　　　セリノ Ｔｂｒ　　　　　　スレオ；ン Ｔｒｐ　　　　　）リプトフ！ン Ｔｙｒ　　　　　チ［Ｊジノ Ｖａｌ　　　　　バリン １）ＮＡ　　　　　　デ第１・ンリボ咳酸ｃＤＮＡ　　
　　　相補ＤＮＡ ５　ｃ；　ｃ　ＤＮＡ　　　　、！ｌ’−Ｓｌ’ｌ　ｃ
　１）ＮＡｄｓｃｌ）ＮＡ　　　二重鎖ｃｌ）ＮＡＲＮ
Δリボｆ亥酸 ｍ　ＲＮ　Ａ　　　　　伝令ＲＮＡ ｄＡＴＩ”　　　　　デ第１−７アデノンン三り／酸ｄ
　ＣＴ　Ｉ）　　　　　デオｔシンチジン三り／酸ｄ　
Ｇ　Ｔ　Ｉ）　　　　　デオキシグリシンフ三リン酸ｄ
ＴＴＰ　　　　　デオキンチミジン三リン酸オリゴ（ｄ
Ｔ）　　　オリゴデオ↑・シチミジル酸ポリ（Ａ）　　
　　ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ）　　　　　ポリ・ンリジル酸ポリ（ｄＣ）　
　　　ポリデオキシンヂジル酸ｊ″す（ｄ　Ｇ　）　　
　　＋ｌ！リデオ↑、ングアニル酸１＞　Ｉ）　Ｔ　Ａ
　　　　　エヂレ／ジアミン四酢酸ｋｂｐ　　　　　：
）［＋塩基対 １、＋　ｐ　　　　　　塩基対 ４図（ｒηの訝ｊ１１な説明 第１図は参考例３のＩＩＴＮＦ−アダプター断片の横築
工程を示し、第２図は参考例３のｔｒｐブロモ−クー付
形質発現プラスミドｐＨ丁Ｒ９１の横築工程を示すもの
である。

１１ｉ許出願人　大［１本製蘂株式会社代　　理　　人
　　坪　　井　　イ１　　四　　部属１困 ＨＴＮＦ−アラ゛う’７４１Ｗ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）癌壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆ
   ａｃｔｏｒ）又は癌壊死因子様物質を有効成分とする利
   尿剤。
2. （２）下記のアミノ酸配列もしくはその利尿活性部位を
   有するポリペプチド又はその生理的に許容される塩を有
   効成分とする特許請求の範囲第１項記載の利尿剤。 【アミノ酸配列があります】
3. （３）下記のアミノ酸配列において、そのＮ末端の４ア
   ミノ酸残基又は５アミノ酸残基が欠失しているアミノ酸
   配列を有するポリペプチド又はその生理的に許容される
   塩を有効成分とする特許請求の範囲第１項記載の利尿剤
   。 【アミノ酸配列があります】