JPH1052280A - 新規プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えタンパク質産生の発現ベクターに使用
できる新規なプロモーターを提供する。 【解決手段】 ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始点とＳＶ４
０初期領域プロモーターとを含むＳＲαプロモーターで
あって、前記ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期複製
開始点のＸｈｏＩ部位においてＨＴＬＶ（Ｉ）レトロウ
イルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の一部を
含み、該一部は、完全なＲ領域およびＲ／Ｕ５境界から
最初の下流のＴａｑＩ部位までのＵ５領域の一部を含む
セグメントを含むことによってさらに特徴づけられる、
上記ＳＲαプロモーター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は組換えタンパク質の
宿主細胞中での産生に用いる発現ベクター用の新規なプ
ロモーターに関する。

【０００２】

【従来技術】循環血液細胞は、恒常的に新しく分化した
細胞に置換されている。置換する血液細胞は造血と呼ば
れる過程によって形成され、そこで以下の少なくとも８
種の成熟細胞系列が作られる：赤血球、マクロファージ
（単球）、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球（肥満細
胞）、Ｔリンパ球、そしてＢリンパ球（Ｂｕｒｇｅｓｓ
およびＮｉｃｏｌａ，「成長因子と幹細胞（Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ｓ）」（アカデミックプレス，ニューヨーク，１９８
３）。血液細胞産生の制御の多くは、コロニー刺激因子
（ＣＳＦ）と呼ばれる一連の活性糖蛋白質によって媒介
される。これらの糖蛋白質はその存在を検出するための
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および試験管内（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ）のアッセイ法から命名されている。半固体培地
中での造血細胞のクローン培養技術は、試験管内アッセ
イ法の発展に特に重要な役割を果たした。このような培
養系では、それぞれの前駆細胞（即ち、発生学的に一つ
の細胞系に分化が決定されているが、まだ増殖能を有す
る細胞）は本質的に生態内における相同のプロセスと同
一と考えられている様式で増殖し、成熟細胞のコロニー
を作ることができる。造血におけるＣＳＦの働きは、最
近多くの総説で取り上げられている。例えば、メトカル
フ（Ｍｅｔｃａｌｆ）「造血系コロニー刺激因子（Ｔｈ
ｅ Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ）」（エルシーバー，
ニューヨーク，１９８４）；メトカルフ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２９，１６−２２（１９８５）；ニコラ（Ｎｉｃ
ｏｌａ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，５，
７６−８０（１９８４）；ウェットン（Ｗｈｅｔｔｏ
ｎ）ら，ＴＩＢＳ，１１，２０７ ：２１１（１９８
６）；およびクラーク（Ｃｌａｒｋ）とカーメン（Ｋａ
ｍｅｎ）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６，１２２９−１２３７
（１９８７）。

【０００３】これらの因子の検出、単離および精製は、
以下の理由によりしばしば非常に困難である。それらが
典型的に存在する細胞上清の複雑さ，混合物中のさまざ
まの成分の活性の多様性および重複、それらの因子の成
分を確認するために使われるアッセイ法の感度（あるい
は感度の欠如）、それらの因子の分子量の範囲やその他
の性質が屡類似していること、そして自然の上体では因
子の濃度が非常に低いことである。

【０００４】主として遺伝子クローニングによって多く
のＣＳＦが入手可能になるにつれ，その臨床応用法の開
発への興味が増していた。ホルモン（例えば可溶性因
子，成長メディエーター，細胞リセプターを介した作
用）との生理学的な類似性のため、ＣＳＦの使用の可能
性は、現在のホルモンの使用法から類推されている；例
えば、デキスター（Ｄｅｘｔｅｒ），Ｎａｔｕｒｅ，３
２１，１９８（１９８６）。これらの因子の使用は、腫
瘍の化学療法または放射線療法後の回復治療、造血形成
不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移植後の造血系
再生の促進のための治療、および慢性の感染症に対する
宿主の抵抗性を増すための治療等のように、血球産生の
刺激が必要となるいくつかの臨床の場で、示唆されてい
る。例えばデキスター（上述）、メトカルフ（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ上述）およびクラークとカーメン（上述）。

【０００５】非組換えＧＭ−ＣＳＦは、Ｍｏ細胞株の培
養上清から精製され（米国特許４，４３８，０３２号に
記載）、Ｎ末端から１６アミノ酸残基が配列決定された
（ガッソン（Ｇａｓｓｏｎ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２
６，１３３９−１３４２（１９８４））。顆粒球および
マクロファージの成長および分化を支える因子であるＧ
Ｍ−ＣＳＦの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は最近いくつかの
研究室で数種類クローニングされ、配列決定された；例
えばゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９，７
６３−７６７（１９８４）（マウス）；リー（Ｌｅｅ）
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２，４３６０−４３６４（１９８５）（ヒト）；ウォ
ン（Ｗｏｎｇ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，８１０−
８１５（１９８５）（ヒトおよびテナガザル）；および
カントレル（Ｃａｎｔｒｅｌｌ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６２５０−６２
５４（１９８５）（ヒト）を参照。

【０００６】ヒトＧＭ−ＣＳＦ等のリンホカインをコー
ドするＤＮＡ配列を含むプラスミド中で頻繁に使用され
ているプロモーターは、ＳＶ４０プロモーターである。

【０００７】

【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、ＳＲαプロ
モーターと命名された顆粒球−マクロファージコロニー
刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの組換えタンパク質の産
生に有用な新たなプロモーターを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＳＶ４０ＤＮ
Ａの複製開始点とＳＶ４０初期領域プロモーターとを含
むＳＲαプロモーターを提供するものであり、前記ＳＲ
αプロモーターは、ＳＶ４０初期複製開始点のＸｈｏＩ
部位においてＨＴＬＶ（Ｉ）レトロウイルスのロングタ
ーミナルリピート（ＬＴＲ）の一部を含み、該一部は、
完全なＲ領域およびＲ／Ｕ５境界から最初の下流のＴａ
ｑＩ部位までのＵ５領域の一部を含むセグメントを含む
ことによってさらに特徴づけられる。

【０００９】本発明はさらに、ＳＲαプロモーターを含
む発現ベクターを適当な宿主細胞中で培養することを特
徴とする、宿主細胞中でのタンパク質の産生方法を提供
する。宿主細胞としては哺乳動物宿主細胞が好ましく、
特にＣＯＳサル細胞，ＣＶ１サル細胞、マウスＬ細胞及
びチャイニースハムスター卵巣細胞が好ましい。

【００１０】

【発明の実施の態様】本発明は哺乳類宿主細胞中でのヒ
ト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子などの組換
えタンパク質産生のための発現ベクターに使用できる新
規なプロモーターを提供するが、その発現ベクターは以
下のもの：ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始点とＳＶ４０初期
領域プロモーターとを含むＳＲαプロモーター；スプラ
イスジャンクションおよびヒト顆粒球−マクロファージ
コロニー刺激因子などの組換えタンパク質をコードする
能力をもつヌクレオチド配列；ならびにポリアデニル化
部位；をこの順でセンス方向に含み、前記ＳＲαプロモ
ーターは、ＳＶ４０初期複製開始点のＸｈｏＩ部位にお
いてＨＴＬＶ（Ｉ）レトロウイルスのロングターミナル
リピート（ＬＴＲ）の一部を含み、該一部は、完全なＲ
領域およびＲ／Ｕ５境界から最初の下流のＴａｑＩ部位
までのＵ５領域の一部を含むセグメントを含むことによ
ってさらに特徴づけられる。

【００１１】また、ＳＲαプロモーターはＡＴＣＣ６７
３１８として寄託されたプラスミドからも得られる。

【００１２】本発明のプロモーターを含む発現ベクター
は好ましくは上記ＳＶ４０ポリアデニル化部位の後に更
に順に以下のものを含む：上記発現ベクターをバクテリ
ア宿主中でクローニング可能にする、バクテリアの複製
開始点；および上記発現ベクターによって形質転換され
たバクテリア宿主を識別するための選択可能なマーカ
ー。

【００１３】本発明のプロモーターを含む発現ベクター
によって産生されるヒトＧＭ−ＣＳＦなどの組換えタン
パク質は、宿主の性質及びそのグリコシル化に影響を与
える能力によって、グリコシル化されたりされなかった
りする。

【００１４】図１に示されたクローンｐｃＤ−ｈｕｍａ
ｎ−ＧＭ−ＣＳＦは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション，１２３０１ パークローンドライブ，
ロックビル，ＭＤ ２０８５２，米国に寄託番号３９９
２３で寄託されている。

【００１５】本発明のプロモーターを含む発現あるいは
クローニングベクターの１例は、以下の要素を順にセン
ス方向に有する。

【００１６】ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始点、ＳＶ４０初
期領域プロモーター及びＨＴＬＶ（Ｉ）のＬＴＲを含む
ＳＲαプロモーター スプライスジャンクション ＧＭ−ＣＳＦコード領域 ポリＡサイト 〔ベクターの輪は、上記ＳＶ４０ｏｒｉとつながって閉
じる〕。

【００１７】好ましくは、以下に示すように、この発現
および／またはクローニングベクターはさらにＳＶ４０
ｏｒｉとポリＡサイト間に挿入されたバクテリア複製
開始部位（バクテリアｏｒｉ）および選択可能なマーカ
ー遺伝子を含む： ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始点、ＳＶ４０初期領域プロモ
ーター及びＨＴＬＶ（Ｉ）のＬＴＲを含むＳＲαプロモ
ーター スプライスジャンクション ＧＭ−ＣＳＦコード領域 ポリＡサイト バクテリアｏｒｉ 選択可能なマーカー 〔ベクターの輪は上記ＳＶ４０ｏｒｉとつながって閉じ
る〕。

【００１８】さらに好ましくは、選択可能なマーカー遺
伝子は、宿主バクテリアにネオマイシン、アンピシリ
ン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、カナマイ
シン、ヒグロマイシンあるいはその類似物に対する抵抗
性等の薬剤耐性を与える。最も好ましくは、バクテリア
ｏｒｉはｐＢＲ３２２ ｏｒｉである。

【００１９】全般にわたって、アミノ酸、ヌクレオチ
ド、制限エンドヌクレアーゼ等を示すために標準的略号
が使用されている；例えばコーン（Ｃｏｈｎ），「α−
アミノ酸の命名および記号（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍｏｆ α−Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，１０６，３−１７（１９８４）；ウッド（Ｗ
ｏｏｄ）ら，「生化学：問題へのアプローチ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）」，第２版（ベンジャミン，メンロパーク，１
９８１）；およびロパーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），制限エ
ンドヌクレアーゼの目録（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
ｓ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，６８，２７−４０（１９７９）。

【００２０】本発明における発現ベクターによって産生
されるヒトＧＭ−ＣＳＦは血液細胞の再生刺激が可能で
あり、癌治療、特定の血液疾患の治療および慢性の感染
の治療において有用であろう。

【００２１】本発明によって産生されたＧＭ−ＣＳＦは
ヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を示す、グリコシル化または非グ
リコシル化ポリペプチドを含む。

【００２２】本発明はまたはここで開示されたＳＲαプ
ロモーターを用いて、グリコシル化または非グリコシル
化ポリペプチドを作る方法を含む。

【００２３】本発明に従って産生されたヒトＧＭ−ＣＳ
Ｆの作製、使用、同定の技術は以下の一般的な項目中で
説明される。その後、一般的な技術が特殊な細胞種、ベ
クター、試薬等に適用された、いくつかの具体例を示
す。

【００２４】I．ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのｄｅ ｎｏ
ｖｏ調製 ｃＤＮＡのｄｅ ｎｏｖｏ調製およびクローニング及び
ｃＤＮＡライブラリーの構築のための種々な手法が現在
使用可能である。対応した文献の総説は、詳細な手法と
ともにＷＯ８７／０２９９０として国際公開されている
ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２４６４の２９頁２２行〜３２頁
下５行に述べられている。本発明におけるポリペプチド
をコードするｍＲＮＡの好ましい由来は次節で議論され
ている。ＰＣＴ／ＵＳ ８６／０２４６４中の開示は、
ここでＧＭ−ＣＳＦの産生、特にその３１頁と関連して
読まれたい。

【００２５】目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
の好ましい由来は、Ｔリンパ球など、その上清が本発明
におけるポリペプチドに伴う活性の一つを含む細胞であ
る。それに由来するＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのためのＲ
ＮＡは米国特許４，４３８，０３２号に開示され、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１２３０
１ パークローンドライブ，ロックビル，ＭＤ ２０８
５２，米国に寄託番号ＣＲＬ８０６６で寄託されている
Ｍｏ細胞株より得られる。一般的には適当なＴ細胞はヒ
ト脾臓、扁桃腺および末梢血等、様々な由来から得られ
る。末梢血Ｔ細胞より単離されたＴ細胞クローン等も使
用可能であろう（「免疫学での研究論文（Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）」，フォン・デーマー（ｖｏｎＤｏｅｈｍｅｒ）
およびハーフ（Ｈａａｆ）編集，「ヒトＴ細胞クローン
（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅｓ）」，第８
巻，２４３−３３３頁，エルシーバー・サイエンス・出
版社，ニューヨーク（１９８５）を参照）。

【００２６】II．開示されたｃＤＮＡ由来のハイブリダ
イゼーションプローブを用いたＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ
の調製 同一の生物学的活性を持つ近縁の蛋白質がしばしば存在
する。多く研究されている例は、以下のものである： いわゆるアロザイムで、電気泳動的に区別される、
一種の酵素のアレル型である；例えばセンザバウ（Ｓｅ
ｎｓａｂａｕｇｈ），法医学での多様性酵素の利用（Ｔ
ｈｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ＦｏｒｅｎｓｉｃＳ
ｃｉｅｎｃｅ）」，Ｉｓｏｚｙｍｅｓ，１１，１３７−
１５４（１９８３）およびレウォンティン（Ｌｅｗｏｎ
ｔｉｎ），「進化学上の変化の遺伝学的基礎（Ｔｈｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎａｒｙ Ｃｈａｎｇｅ）」（コロンビア大学出版，ニ
ューヨーク、（１９７４）の第３章を参照のこと； いわゆるアロタイプで、免疫グロブリンの定常領域
の多形性をいい、例えばフッド（Ｈｏｏｄ）ら，「Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ」，２３１−２３８頁（ベンジャミン
／カミングス，メンロパーク，１９７８）および ヘモグロビン、例えばディッカーソン（Ｄｉｃｋｅ
ｒｓｏｎ）およびガイス（Ｇｅｉｓ），「Ｈｅｍｏｇｌ
ｏｂｉｎ」（ベンジャミン／カミングス，メンロパー
ク，１９８３）である。このような多形性はリンホカイ
ンにも存在すると考えられている：（i）ＰＣＴＷＯ８
６／００６３９中では二種のヒトＧＭ−ＣＳＦが報告さ
れており，（ii）ウォン（Ｗｏｎｇ）らはＳｃｉｅｎｃ
ｅ，２３５，１５０４−１５０８においてカワサキ（Ｋ
ａｗａｓａｋｉ）らによってＳｃｉｅｎｃｅ，２３０，
２９１−１９６（１９８５）に報告されたものとは異な
る型のヒトＣＳＦ−Iを報告している。

【００２７】IV．ＧＭ−ＣＳＦ活性のアッセイ ＧＭ−ＣＳＦ活性を決定するために、造血系細胞、例え
ば骨髄細胞あるいは胎児の臍帯血細胞が、遊離細胞浮遊
液とされた。バラバラの細胞を栄養および多くの場合ウ
シ胎児血清を含む半固体（寒天）または粘性の高い（メ
チルセルロース）培地中に固定する。適切な刺激因子の
存在下では個々の細胞は増殖して分化する。個々の細胞
は固定されているため、細胞が増殖および成熟するにつ
れ、コロニーが形成される。これらのコロニーは、７−
１４日後に計数可能となる。ＧＭ−ＣＳＦアッセイを行
うための詳細な解説は、バージェス（Ｂｕｒｇｅｓｓ，
Ａ．），「成長因子および幹細胞（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ），５２−５
５頁（アカデミックプレス，ニューヨーク，１９８
４）、およびメトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）「造血系コ
ロニー刺激因子（ＴｈｅＨｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏ
ｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ
ｓ）」（エルシーバー，ニューヨーク，１９８４）の１
０３−１２５頁に示されており、両文献の当該部分も本
明細書に含まれるものとする。必要に応じてコロニーを
単離し、スライドグラスに載せて固定して、ライト／ギ
ムザ染色することができる（トッド−サンフォード（Ｔ
ｏｄｄ−Ｓａｎｆｏｒｄ）「実験室法による臨床診断
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｂｙ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，１５版，デビ
ッドソンおよびヘンリー（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ
Ｈｅｎｒｙ）編，１９７４）。このようにして、個々の
コロニーについての細胞種の形態学的な解析が可能であ
る。

【００２８】血液疾患ではない患者から集めた骨髄細胞
をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（タイプ４００，シグマ
・ケミカル社、セントルイス，ＭＯ）上に重層し、遠心
分離（６００×ｇ，２０′）、界面の細胞を除去した。
これらの細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイ
スコフの改変ダルベッコ培地で２度洗浄し、同じ培地中
に再度懸濁し、プラスチックのペトリ皿への接着によっ
て、接着性細胞を除去した（接着性細胞は、しばしばＧ
Ｍ−ＣＳＦ産生細胞である：メトカルフ，上記）。非接
着性細胞を２０％ＦＣＳ，５０μM の２−メルカプトエ
タノール，０．９％メチルセルロースおよび種々の濃度
のコロニー刺激因子を含むことが知られている培養上清
または試験サンプル上清を含む、イスコフの培地に１０
⁵ 細胞／mlとなるように添加した。１mlの分画を３５mm
のペトリ皿に添加し、３７℃、飽和水蒸気、６％ＣＯ₂
下で培養した。培養開始後、３日目に１ユニットのエリ
スロポエチンを各皿に加えた。顆粒球−マクロファージ
のコロニーおよび赤血球バーストを１０−１４日後に倒
立顕微鏡を用いて計数した。

【００２９】ヘパリン中に集めた臍帯血液細胞は、６０
０×ｇで６分間遠心分離した。血漿と赤血球のピークの
間の界面に存在する白血球を、０．１７Ｎ塩化アンモニ
ウムおよび６％ＦＣＳを含む試験管に移した。５分間氷
上に放置した後、懸濁液を４mlのＦＣＳの下層になるよ
うに重層し、６分間６００×ｇで遠心分離した。骨髄細
胞について述べた方法と同様にして細胞塊をダルベッコ
の生理食塩水で洗浄し、フィコール、プラスチック接着
を行った。低密度の非接着性細胞を回収し、上述の方法
で半固体培地中に１０⁵ 細胞／培養皿でまいた。

【００３０】アッセイ終了後、個々のコロニーをスライ
ドグラスに載せ、ライト・ギムザ染色をして、細胞成分
を決定した。好酸球はルクソールファストブルー（Ｌｕ
ｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ）染色によって決定した
（ジョンソンおよびメトカルフ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．
ａｎｄ Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．），Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ
ｏｌ．，８，５４９−５６１（１９８０）を参照）。

【００３１】V．精製および薬剤組成物 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母または他の細胞中で発現
される本発明のヒトＧＭ−ＣＳＦは硫安沈澱、分画カラ
ムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾
過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー
等）、そして最後に結晶化（一般的には「酵素精製およ
び関連技術（Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），
Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２，２
３３−５７７（１９７７）、およびスコープス（Ｓｃｏ
ｐｅｓ，Ｒ．），「蛋白質の精製：原理と実際（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，スプリンガー
・フェアラーク，ニューヨーク，１９８２を参照）を含
む当業者に一般的な手法によって精製できる。詳細な精
製方法は主に使われた発現宿主によって決定される。例
えば、哺乳類発現宿主（細胞）は、しばしば培地中に血
清が必要であるが、そのために血清蛋白質を除去する余
分な段階が必要となってくる。一方、成分既知の培地で
生育する酵母やバクテリアではたいていの場合、分泌産
物の分離はより単純である。いくつかの発現宿主は発現
産物を分泌しないこともあり、このような場合、発現宿
主の破砕物あるいは抽出物から産物を精製しなければな
らない。これらの全ての場合において予想される精製上
の問題は、生化学的な精製法の標準的な手法によって解
決可能である。

【００３２】部分精製あるいは完全精製されると、本発
明のヒトＧＭ−ＣＳＦは、以下の研究の目的で使用でき
る。例えば、細胞用培地（例えば、イーグルの最小培
地、イスコフの改変ダルベッコ培地または ＲＰＭＩ１
６４０，シグマ・ケミカル社（セントルイス，ＭＯ）お
よびＧＩＢＣＯ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（シャグリンフォー
ルス，オハイオ）から入手可能）の強化物質の研究、お
よび免疫アッセイ，免疫蛍光染色等に使う特異的な免疫
グロブリンを誘導するための抗原物質の研究（一般的に
は、「免疫学的手法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ）」，第IおよびII巻，レフコビッツおよ
びパーニス（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．ａｎｄ Ｐｅｒ
ｎｉｓ，Ｂ．）編，アカデミックプレス，ニューヨーク
（１９７９および１９８１），および「実験免疫学のハ
ンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，ワイア（Ｗｅ
ｉｒ，Ｄ．）編，ブラックウェル・サイエンティフィッ
ク・パプリケーションズ，セントルイス，ＭＯ（１９７
８）を参照）。

【００３３】本発明におけるヒトＧＭ−ＣＳＦは、例え
ば慢性の感染症に対する自然の抵抗性を増加させる、血
液細胞の再生を促す、等の薬剤組成物中にも使用される
であろう。故に、移植の必要なリュウマチ性関節炎、癌
の化学療法、高齢、免疫抑制剤等による免疫不全症の患
者は、直接このようなポリペプチドを用いて治療でき
る。あるいは、ある人の造血細胞を体外で維持および／
または増殖または分化させ、同一固体あるいは別の固体
に再導入して治療効果を高めることが出来るであろう。
これらの組成物は、免疫系の様々な成分を選択的に単独
でまたはよく知られた他の薬剤とともに刺激することが
できる。特にこの組成物は、リンホカイン等他の免疫反
応性物質（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ
−４、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）を含むであろう。

【００３４】本発明のヒトＧＭ−ＣＳＦを含む薬剤組成
物は、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２４６４の４４頁２７行〜
４５頁２１行に記載されている方法で調製し、使用でき
る。特に、調製物単位量あたりの活性物質の量は、用途
および活性含有物の効力に応じて変化し、または１μg
から１００mgの値で調整されよう。

【００３５】VI．発現系 一旦本発明のｃＤＮＡがクローニングされると、幅広い
発現系（即ち、宿主−発現ベクターの組み合わせ）が、
その蛋白質の産生のために使用可能である。可能な宿主
種はバクテリア、酵母、昆虫、哺乳類類等を含むが、そ
れに限られるものではない。発現系の選択およびその蛋
白質産生の最適化は、以下の多くの要因の考慮とバラン
スが必要である。即ち、発現される蛋白質の性質、例
えば、発現蛋白質はいくつかの宿主生物に対して毒性を
持つことがあり、またそれは宿主プロテアーゼの分解を
受けることがあり、またはある宿主中では、不活性型や
不溶性型で発現されるかもしれない、目的の単に対応
するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の性質、例えば
そのｍＲＮＡが宿主エンドヌクレアーゼに特に切断され
やすい配列を持つことがあり、そのためにｍＲＮＡの機
能的な寿命が極端に短くなる、あるいはｍＲＮＡが二次
構造を取り、リボソーム結合部位もしくは開始コドンを
覆ってしまうことがあり、そのために或る宿主中では翻
訳の開始が阻害される、コード領域に隣接する３′−
および５′−領域中の宿主許容性発現抑制領域の選択、
入手可能性および配置−これはプロモーター、５′−お
よび３′−プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転
写終結因子、エンハンサー、ポリアデニル酸結合部位、
キャップ部位、イントロン−スプライス部位等を含む、
その蛋白質が宿主によって切断され得る分泌シグナル
配列を持つか、または宿主性のシグナル配列をコードす
る発現制御配列が成熟蛋白質をコードする領域中でスプ
ライスされないか、宿主の感染または形質転換の可能
な形態および効率、そして発現は一過性が好ましいか、
恒常的なものが好ましいか、蛋白質の発現のために必
要な宿主培養系の規模及び費用、転写後の修飾は必要
か、また必要ならどのような種類か；例えば必要なグリ
コシル化の程度と種類で宿主を選択しなければならない
（例えば、ウイおよびウォルド（Ｕｙ ａｎｄ Ｗｏｌ
ｄ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，８９０−８９６（１９
７７））、発現した蛋白質を宿主および／または培地
中の蛋白質および他の物質から分離する方法の用意さ、
例えばある場合には後の精製段階のために特殊なシグナ
ル配列を持つ融合蛋白質を発現することが望ましい、
選択された宿主中での当該ベクターの安定性およびコピ
ー数、例えばホフシュナイダー（ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ）ら編，「大腸菌以外の微生物での遺伝子クローニ
ング（Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎＯｒｇａｎｉｓ
ｍｓ Ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）」（スプ
リンガーフェアラーク，ベルリン，１９８２）、および
10一般に知られる類似の要因。

【００３６】上述の要因に着目した、ある発現系の選択
および／または修飾に関する指針を提供する多くの総説
が入手可能である：例えば、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）
編，「遺伝子：構造および発現（Ｇｅｎｅｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」の中
の、ドゥベールおよびシェパード（ｄｅ Ｂｏｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｈｅｐａｒｄ），「大腸菌での外来遺伝子の発
現を最適化する手段（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ
Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＧｅｎｅＥｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）」，２０５−２４７；（ジョンワイリー＆サン
ズ，ニューヨーク，１９８３）は、いくつかの大腸菌発
現系を総説しており、クッヒャーラパティ（Ｋｕｃｈｅ
ｒｌａｐａｔｉ）ら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６（４），３
４９−３７９（１９８４）およびバネルジ（Ｂａｎｅｒ
ｊｉ）ら，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
５，１９−３１（１９８３）は、哺乳類細胞の感染およ
び形質転換法を総説し；レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆ
ｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）編，「遺伝子発現の最
大化（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ）」（バターワーズ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ），ボストン，１９８６）は、大腸菌、酵母および哺
乳類細胞における遺伝子発現のトピックをいくつか総説
しており；スィリー（Ｔｈｉｌｌｙ），「哺乳類細胞工
学（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）」（バターワーズ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ），ボストン，１９８６）は、哺乳類発現系を総説し
ている。

【００３７】同様に、本発明における使用に適した発現
ベクターを作製および／または修飾するためのｃＤＮＡ
および発現抑制領域を結合および／または操作する方法
および条件を記載した多くの総説が入手可能である：例
えばマニアチスの「モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）」〔コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ），１９８２〕；グローバー（Ｇｌｏｖｅ
ｒ），「ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ（ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ），第IおよびII巻（ＩＲＬプレス、オック
スフォード，１９８５）；およびパーバル（Ｐｅｒｂａ
ｌ）「分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）」（ジョンワイリー＆サンズ，ニューヨ
ーク，１９８４）。

【００３８】一般的には、本発明のｃＤＮＡの挿入のた
め発現ベクター中に多くの部位を選択することが可能で
ある。このような部位は、通常それを切る制限エンドヌ
クレアーゼによって命名されており、当業者によって非
常によく知られている。組換えＤＮＡ分子を作製するた
め、このような部位へＤＮＡ配列を挿入する種々の方法
も非常によく知られている。これらは、例えば、ｄＧ−
ｄＣまたはｄＡ−ｄＴによるテーリング、直接のライゲ
ーション、合成リンカー、エキソヌクレアーゼおよびラ
イゲーションまたはＤＮＡポリメラーゼおよびライゲー
ションに引き続く適切な一本鎖鋳型によるＤＮＡ鎖伸長
に続くポリメラーゼを用いた修復反応を含む。

【００３９】宿主培養液中の細胞のトランスフェクショ
ンおよび／または形質転換を行う前にしばしば多量の本
発明のｃＤＮＡを含むベクターを得ることが必要とな
る。このために、ベクターはしばしば最終的に発現に使
用されるものとは別の生物（クローニング宿主）中で、
有意な発現を行わずに増幅される。そして増幅の後、標
準的な方法、例えばマニアチスら（上述）により記載さ
れた方法を用いて、ベクターはクローニング宿主より分
離される。

【００４０】ＤＮＡの消化とは多くの場合、ＤＮＡのあ
る領域にのみ働く酵素を用いたＤＮＡの触媒的切断を意
味する。殆どの場合、このような酵素は制限エンドヌク
レアーゼであり、それぞれが特異的に働くＤＮＡ上の部
位は制限サイトと呼ばれている。ここで用られる種々の
制限酵素は、市販品として入手可能なものであり、酵素
販売者によって確立されたそれらの反応条件、補助因
子、および他の条件が使用される。一般的には、約１マ
イクログラムのプラスミドまたはＤＮＡ断片が、約１ユ
ニットの酵素とともに、約２０マイクロリットルの緩衝
液中で使用される。特定の制限酵素に対する適切な緩衝
液および基質量は、製造者によって指定されている。通
常３７℃で１時間のインキュベーション時間が用いられ
ているが、販売者の説明に従って変化しうる。インキュ
ベーションの後、蛋白質はフェノールおよびクロロホル
ム抽出によって除去され、消化された核酸は水相からエ
タノール沈澱によって回収される。

【００４１】制限（酵素）（または他の）消化物からの
ＤＮＡ断片の抽出または精製とは、消化物のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による分離、既知分子量マーカー
ＤＮＡ断片との移動度の比較による目的の断片の同定、
目的の断片を含むゲル断片の切除およびＤＮＡからのゲ
ルの分離を意味する。抽出方法は、よくしられている。
例えばローン（Ｌａｗｎ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．，９，６１０３−６１１４（１９８１）；ゲデル
（Ｇｏｅｄｄｅｌｌ）ら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅ
ｓ．，８，４０５７（１９８０）およびマニアチスら
（上述）を参照。

【００４２】ライゲーションとは二つの二本鎖ＤＮＡ間
にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。ラ
イゲーションは１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼをラ
イゲーションするおおよそ等モル量のＤＮＡ断片０．５
マイクログラムに加えるというような既知の条件および
緩衝液で行われる。

【００４３】プラスミドの増幅とは、適切な宿主を形質
転換し、プラスミドの総数を増すために宿主を増殖させ
ることである。

【００４４】キナーゼ処理されたＤＮＡ断片とは、ポリ
ヌクレオチドキナーゼによってリン酸化された断片を示
す。このような処理は５′−リン酸基を欠くＤＮＡ断片
のライゲーションの効率を上昇させる。

【００４５】適切な発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）由来のプラスミド、例えば、Ｃｏｌ Ｅ１，ｐＣ
Ｒ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、
より広範な宿主のプラスミド例えばＲＰ４，ラムダファ
ージなどのファージＤＮＡおよびそのような誘導体，Ｍ
１３等を含む。原核細胞のポリペプチドを融合あるいは
非融合形で、真核細胞の蛋白質を発現するための、さら
なるＥ．ｃｏｌｉベクターは、マチアチスら（上述）の
第１２章に記載されている。また、リッグス（Ｒｉｇｇ
ｓ）は米国特許４，４３１，７３９号で、さらにＥ．ｃ
ｏｌｉ発現系を開示しており、これはこの参照によって
本明細書に含まれているものとする。

【００４６】一般的に使用されている原核生物のプロモ
ーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および
ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら，
Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５（１９７８）；イタクラ
（Ｉｔａｋｕｒａ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０
５６（１９７７）；ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，２８１，５４４（１９７９））；およびトリ
プトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系（ゲデルら，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，８，４０５７（１９８
０）；ヨーロッパ特許出願公開００３６７７６）を含
む。こられが最も一般的に用いられているものである一
方、他の微生物由来のプロモーターも発見され使用され
ており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が発表
されて、当業者がそれを機能的にプラスミドベクターと
ライゲートすることが可能になっている；例えばジーベ
ンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら，Ｃｅｌｌ，２
０，２６９（１９８０）。

【００４７】大腸菌中での高頻度発現に特に有用な原核
細胞性のプロモーターは、ｔａｃプロモーターであり、
ドウボア（ｄｅ Ｂｏｅｒ）によって米国特許４，５５
１，４３３号に開示されている。この参照によってこの
開示も本明細書に含まれる。大腸菌宿主のための分泌発
現ベクターも入手可能である。特にグライエブ（Ｇｈｒ
ａｙｅｂ）らによってＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３，
２４３７−２４４２（１９８４）に開示された、ｐＩＮ
−III−ｏｍｐＡベクターは有用であり、ここでは転写
されるｃＤＮＡはｏｍｐＡ蛋白質のシグナルペプチドを
コードするＥ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡ遺伝子の一部に融合
されており、このため、成熟した蛋白質はバクテリアの
細胞周辺腔に分泌される。同様に米国特許４，３３６，
３３６号および４，３３８，３９７号は原核生物のため
の分泌発現ベクターを開示している。この参照によっ
て、上記文献は本明細書に含まれる。

【００４８】Ｅ．ｃｏｌｉ株例えばＷ３１１０（ＡＴＣ
Ｃ ２７３２５）、ＪＡ２２１，Ｃ６００，ＥＤ７６
７，ＤＨ１，ＬＥ３９２，ＨＢ１０１，Ｘ１７７６（Ａ
ＴＣＣ３１２４４），Ｘ２２８２，ＲＰ１（ＡＴＣＣ
３１３４３），ＭＲＣＩ；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｕｓ）の株；およびサルモネラ・チフィム
リウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ）またはセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の他の腸内細菌、および
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の
種を含めて、各種バクテリア株は原核生物の発現ベクタ
ーの適切な宿主である。真核細胞の蛋白質の発現に有用
なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｘ１７７６等のバクテリア株の
誘導法は、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）により米国特許
４，１９０，４９５号に開示されている。従ってこの特
許の内容は本明細書に含まれる。

【００４９】酵母等の真核微生物も本発明における蛋白
質の発現に使用可能である。サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａ
ｅ）、即ち一般的なパン酵母は真核微生物の中で最も一
般的に使われているが、多くの他の株も一般的に量可能
である。サッカロミセス中での発現にはプラスミドＹＲ
ｐ７が使用される。例えばスティンコーム（Ｓｔｉｎｃ
ｈｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２，３９（１９７
９）、キングスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、Ｇｅｎ
ｅ，７，１４１（１９７９）、およびチェンパー（Ｔｓ
ｃｈｅｍｐｅｒ）ら，Ｇｅｎｅ，１０，１５７（１９８
０）。これらのプラスミドは、既にトリプトファン中で
生育出来ない酵母の変異株の選択マーカーを提供するｔ
ｒｐ１遺伝子を含んでいる。例えば、ＡＴＣＣ ４４０
７６またはＰＥＰ４０−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅ
ｓ），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５，１２（１９７７））。
これによって酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１障害があ
る場合、トリプトファン不存在下で生育させることによ
り形質転換を検出するための有用な環境が提供される。
さらなる酵母のためのベクターは、ミヤジマ（Ｍｉｙａ
ｊｉｍａ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，
６３９７−６４１４（１９８４）によって開示されたｐ
ＧＡＬプラスミド、およびベグス（Ｂｅｇｇｓ），Ｎａ
ｔｕｒｅ，２７５，１０４−１０９（１９７８）によっ
て開示された２μmプラスミドを含む。

【００５０】酵母ベクター中の適切なプロモーター配列
は以下のものを含む：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
のプロモーター（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，２０７３（１
９８０））またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン
酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセル
リン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン
酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよび
グルコキナーゼ等の解糖系の酵素のプロモーター（ヘス
（Ｈｅｓｓ）ら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅ
ｇ．，７，１４９（１９６８）；ホランド（Ｈｏｌｌａ
ｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７，４９００
（１９７８））。適当な発現プラスミドを構築する際に
は、発現してポリアデニル化および転写終結をするため
に、配列の３′−末端に隣接してこれらの遺伝子に関す
る終結配列が、発現ベクター中にライゲーションされ
る。生育条件によって転写が制御される付加的な利点を
持つ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代
謝にかかわる消化酵素、および前述のグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよ
びガラクトースの利用に関する酵素（ホランド，前述）
のプロモーター領域である。また更に他の制御可能なプ
ロモーターは、メタロチオネインプロモーター系であ
り、フォーゲル（Ｆｏｇｅｌ）らによって米国特許４，
５１１，６５２号に開示されている。この米国特許の内
容も本明細書に含まれる。事実上、酵母に使用可能なプ
ロモーター、複製開始点および転写終結配列を含むプラ
スミドベクターは全て適当である。

【００５１】サッカロミセス・セレビシエ宿主のための
分泌発現ベクター、例えばミヤジマ（Ｍｉｙａｊｉｍ
ａ）らによってＧｅｎｅ，３７，１５５−１６１（１９
８５）に開示されたｐＭＦα８；ヒッツェマン（Ｈｉｔ
ｚｅｍａｎ）らによってＳｃｉｅｎｃｅ，２１９，６２
０−６２５（１９８３）に開示されたＹＥｐＩＰＴ；ブ
レイク（Ｂｒａｋｅ）らによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４６４２−４６４６
（１９８４）およびブレイクによりヨーロッパ特許出願
０１１６２０１号に開示されたｐＹαＥＧＦ−２１；お
よびシン（Ｓｉｎｇｈ）によりヨーロッパ特許出願０１
２３５４４号およびカッジャン（Ｋｕｒｊａｎ）らによ
り米国特許４，５４６，０８２に開示されたプラスミド
等は利用可能である。

【００５２】原核および真核の微生物に加え、多細胞生
物由来の細胞よりなる発現系が本発明における蛋白質を
産生するために使用される。特に興味が持たれるのは、
その翻訳後のプロセッシング機構が、より生物学的に活
性のある哺乳類の蛋白質を作りやすいと考えられる哺乳
類発現系である。哺乳類の宿主に対しては、ベクターと
していくつかのＤＮＡ腫瘍ウイルスが用られる：例えば
トゥーズ（Ｔｏｏｚｅ）編，「ＤＮＡ腫瘍ウイルス（Ｄ
ＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ）」，第２版（コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー，Ｎ．Ｙ．，１９
８１）をその生物学の総説として参照。特に重要なもの
は、バクテリアの複製制御配列と結合したＳＶ４０複
製、転写、および／または翻訳制御配列を含む種々のベ
クターである。例えば、オカヤマおよびバーグ（Ｏｋａ
ｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ）によって開発され、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０（１９８
２）およびＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２８０−
２８９（１９８３）に開示されているｐｃＤベクター
（参照により本明細書に含まれる）；ハマー（Ｈａｍｅ
ｒ）によりＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
１２，８３−１００（１９８０）および米国特許４，５
９９，３０８に開示されているＳＶ４０ベクター（参照
により本明細書に含まれる）；カウフマンおよびシャー
プ（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ）によりＭｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１３０４−１２１９（１
９８２）におよびカウフマンらによりヨーロッパ特許出
願８４０６１０７号に開示された、付加的にアデノウイ
ルスの制御領域を含むベクター（参照により本明細書に
含まれる）。サルの細胞は多くの場合上述のベクターに
望ましい宿主である。このようなＳＶ４０ｏｒｉ配列と
完全なＡ遺伝子を含むベクターはサルの細胞中で（非自
律的に増幅するプラスミドよりも高いコピー数および／
またはより安定なコピー数を与えて）自律的に増幅する
ことができる。その上、ＳＶ４０ｏｒｉ配列を含み、完
全なＡ遺伝子を持たずＣＯＳ７サル由来細胞中で高コピ
ー数に自律的（然し安定ではない）に増幅できるベクタ
ーがグルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）によりＣｅｌｌ，２
３，１７５−１８２（１９８２）に記載されており、Ａ
ＴＣＣ（寄託番号ＣＲＬ １６５１）から入手可能であ
る。上述のＳＶ４０を基本とするベクターはまた、宿主
細胞のＤＮＡに組み込まれることにより、マウスＬ細胞
等の他の哺乳類細胞を形質転換できる。

【００５３】ＳＶ４０を基本とするベクターの他に、本
発明における使用に適切な哺乳類発現系は以下のものを
含むが、これらに限られるものではない；（i）サーバ
ー（Ｓａｒｖｅｒ）らによりＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，５，１７３−１９０（１９８３）に開
示されたＢＰＶ−ｐＢＲ３２２ハイブリッドおよびディ
マイオ（ＤｉＭａｉｏ）らによってＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４０３０−４０
３４（１９８２）にウシおよびマウスの細胞を形質転換
するために開示されたもののようなウシパピローマウイ
ルス（ＢＰＶ）配列を含むベクター；（ii）エプスタイ
ン−バールウイルス（ＥＢＶ）配列を含むベクター、例
えばヒトおよびサルの細胞を含む種々の哺乳類細胞の安
定な形質転換のためＥＢＶ ｏｒｉＰ配列（核抗原ＥＢ
ＮＡ−１のコード配列を含む）を持つプラスミドで、イ
エーツ（Ｙａｔｅｓ）らによりＮａｔｕｒｅ，３１３，
８１２−８１５（１９８５）に、ライスマン（Ｒｅｉｓ
ｍａｎ）らによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８
２２−１８３２（１９８５）に、イエーツらによりＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３
８０６−３８１０（１９８４）に、およびサグデン（Ｓ
ｕｇｄｅｎ）らによりＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
５，４１０−４１３（１９８５）に開示されているも
の；（iii）マウスおよびハムスターの細胞を形質転換
するためのネズミ類ポリオーマウイルス配列を含むベク
ター。例えば、オハラ（Ｏ’Ｈａｒａ），Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ.,１５１，２０３（１９８１）；（iv）ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を持つベクタ
ー；例えば、アルト（Ａｌｔ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２５３，１３５７−１３７０（１９７８）で、
これはメトトレキセート処理によりネズミ類ゲノム（例
えばｄｈｆｒ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞株）に共に組み込まれた隣接するコー
ド領域とともに複製される。これは例えば、アーラム
（Ｕｒｌａｍｂ）らにより、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）に
記載されている；および（v）アクセル（Ａｘｅｌ）ら
により米国特許４，３９９，２１６に開示されている共
形質転換系。入手可能なＤＮＡ腫瘍ウイルスおよびレト
ロウイルス由来の種々な要素、例えば複製開始点、エン
ハンサー配列（ラウス肉腫ウイルス由来のロングターミ
ナルリピート（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅ
ａｔ）配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）等で、ゴーマン（Ｇｏｒ
ｍａｎ）らにより、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７９，６７７７−６７８１（１９８２）
に開示されている）、イントロン−スプライス部位、ポ
リアデニル化部位等を用いることによりさらなる哺乳類
発現ベクターを構築、あるいは既存のものを改変するこ
とが出来る。

【００５４】無脊椎動物の発現系も本発明における使用
のために構築できる。例えばカイコ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍ
ｏｒｉの幼虫にバキュロウイルスベクター、ＢｍＮＰＶ
を感染させる。これはマエダ（Ｍａｅｄａ）らによりＮ
ａｔｕｒｅ，３１５，８９２−８９４（１９８５）に、
また細胞工学（Ｓａｉｂｏ Ｋｏｈａｋｕ），４，７６
７−７７９（１９８５）に記載されている。

【００５５】実施例 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。ｃ
ＤＮＡライブラリー、ベクター、および宿主の選択、ま
た試薬の濃度、温度、および他の変数の値は、単に本発
明の適用を例示するためのものであり、これがその製薬
であると考えられるものではない。

【００５６】実施例は成熟ＧＭ−ＣＳＦ（１２７アミノ
酸残基）の産生および精製について記述する。

【００５７】実施例I． 末梢血リンパ球及びＴ細胞ク
ローンからのＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡクロ
ーンの単離及びＣＯＳ７サル由来細胞中での発現 ｃＤＮＡライブラリーは、Ｔ−７と命名されたヒトのク
ローン化Ｔ細胞株およびヒトの末梢血リンパ球（ＰＢ
Ｌ）から単離したｍＲＮＡより構築した。ライブラリー
はｐｃＤプラスミド中でオカヤマおよびバーク（上述）
の方法に従って構築した。Ｔ−７ライブラリーから単一
のクローンを単離した後、ＰＢＬライブラリー中に同一
のクローンの存在を確認した。

【００５８】Ａ．クローン化ヘルパーＴ細胞 Ｔ−７と命名したヒトのＴ細胞クローンは、「Ｔリンパ
細胞クローンの単離、同定および利用（Ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕ
ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅ Ｃｌｏｎｅｓ）」，ファスマンおよびフィッチ（Ｆ
ａｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｆｉｔｃｈ）編，アカデミック
プレス，ニューヨーク（１９８２）の第３６および３７
章に記載されている方法に従って単離した。細胞株は、
１０％の熱非働化ウシ胎児血清、５×１０^-5Ｍの２−Ｍ
Ｅ、２mMのグルタミン、非必須アミノ酸および必須ビタ
ミン類を含むダルベッコの改変イーグル（ＤＭＥ）培地
に、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したヒト末
梢血リンパ球の培養上清を３０％添加したもので０．５
×１０⁵ 細胞／mlの濃度で継代培養した。

【００５９】Ｂ．ＧＭ−ＣＳＦ産生の誘導 Ｔ−７細胞を５×１０⁵ ／mlで４％熱非働化ウシ胎児血
清、５×１０^-5Ｍの２−ＭＥ、２mMのグルタミン、非必
須アミノ酸および必須ビタミン類および４μg／mlのコ
ンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むＤＭＥ中で培養し
た。３７℃、１０％ＣＯ₂ 下４〜６時間の培養後、細胞
浮遊液を１５００rpm で１０分間遠心分離した。細胞塊
を回収し、直ちに−７０℃に凍結した。培養上清は濾過
し（ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）−０．２２ミクロ
ン）、増殖因子源として−８０℃で保存した。上清の一
部は、ＣｏｎＡ処理による細胞株の誘導を確認するため
ＣＳＦ活性をアッセイした（後述）。

【００６０】ＰＢＬは７μg ／mlのＣｏｎＡを用いた以
外は同じ条件で誘導した。

【００６１】Ｃ．ｍＲＮＡの抽出 細胞の全ＲＮＡをチャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，
Ｊ．）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４
−５２９９（１９７９））のグアニジンイソチオシアネ
ート法により抽出した。ＣｏｎＡで誘導したＴ−７細胞
またはＰＢＬ（刺激後４時間）の凍結した細胞塊をグア
ニジンイソチオシアン酸溶解溶液に懸濁した。１．５×
１０⁸ 個の細胞に対し、２０mlの溶解溶液を用いた。細
胞塊をピペットで再懸濁し、注射器を用いて１６ゲージ
の注射針に４回通すことによりＤＮＡ切断した。溶解液
を４０mlのポリアロマー遠心管中、２０mlの５．７Ｍ
ＣｓＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ上に重層した。この溶液を
ベックマン（Ｂｉｃｋｍａｎ）社ＳＷ２８ローター（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、２５０００rpm ，１
５℃で４０時間遠心分離した。ＤＮＡを含むグアニジン
イソチアン酸の層を上部から界面まで吸い出した。管壁
および界面を２〜３mlのグアニジンイソチオシアン酸溶
解溶液で洗浄した。遠心管をはさみを用いて界面の下で
切断し、ＣｓＣｌ溶液を排出した。ＲＮＡ塊を冷却した
７０エタノールで２回洗浄し、５００μl の１０mM ト
リス塩酸，pH７．４，１mM ＥＤＴＡ，０．０５％ＳＤ
Ｓに再懸濁した。５０μl の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加
し、ＲＮＡを１mlのエタノールで沈澱させた。遠心分離
によって０．３mgの全ＲＮＡが得られ、ＲＮＡ塊を冷エ
タノールで１回洗浄した。

【００６２】洗浄し、乾燥した全ＲＮＡを９００μl の
オリゴ（ｄＴ）溶出緩衝液（１０mMトリス塩酸，pH７．
４，１mM ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ）に再懸濁した。
ＲＮＡは３分間６８℃で加熱しその後氷上で冷却した。
１００μl の５Ｍ ＮａＣｌを添加した。ＲＮＡ試料を
結合緩衝液（１０mM トリス塩酸，pH７．４，１mMＥＤ
ＴＡ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＳＤＳ）で平衡化
した１．０mlのオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（タイ
プ３，コラボラティブリサーチ，ウォルサム，ＭＡ）に
添加した。カラムの流出液は更に２回カラムに添加し
た。次にカラムを０mlの結合緩衝液で洗浄した。溶出緩
衝液で洗浄し、ポリ（Ａ）⁺ のｍＲＮＡを回収した。Ｒ
ＮＡは通常溶出緩衝液の最初の２mlで溶出した。ＲＮＡ
を０．１１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH６）および２容
のエタノールで沈澱した。ＲＮＡ塊を遠心分離によって
回収し、冷エタノールで２回洗浄して乾燥させた。ＲＮ
Ａ塊を水に再懸濁し、一部を希釈して２６０nmの吸光度
を測定した。

【００６３】Ｄ．ｐｃＤ ｃＤＮＡライブラリーの構築 １）部および２）部，段階１）〜５）はＰＣＴ／ＵＳ８
５／０２４６４の５６〜６０頁に開示されているように
して行った。ただしｐｃＤＶ１ ＤＮＡ（５７頁，３〜
４行目）はＮｓｉIエンドヌクレアーゼを用いて消化し
た。

【００６４】（ｃＤＮＡライブラリー調製の）第６段
階： Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換。形質転換はコーエン（Ｃｏｈ
ｅｎ）らによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０−２１１４（１９７２）に
記載された手段を若干改変して行った。カサバダンおよ
びコーエン（Ｃａｓａｂａｄａｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ，Ｓ．）によってＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.,１３８，
１７９−２０７（１９８０）に記載されたＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株，ＭＣ１０６１を３７℃で２０mlのＬ−ブ
ロス中、６００nmの吸光度が０．５になるまで培養し
た。細胞を遠心分離して集め、５０mM ＣａＣｌ₂ を含
む１０mMトリス塩酸（pH７．３）１０mlに懸濁し、０℃
で５分間遠心分離した。細胞を再び上記の緩衝液２ml中
に懸濁し、再び０℃で５分間インキュベートした；次に
０．２mlの細胞懸濁液を第５段階のＤＮＡ溶液０．１ml
と混合し、これを０℃で１５分インキュベートした。次
に細胞を３７℃に２分間置き、次に室温に１０分置い
た；次に０．５mlのＬ−ブロスを加え、３７℃で３０分
間インキュベートし、その後２．５mlのＬ−ブロス軟寒
天と４２℃で混合し、１mlあたり５０μg のアンピシリ
ンを含むＬ−ブロス寒天上に広げた。３７℃で１２〜２
４時間インキュベートした後、個々のコロニーを滅菌爪
楊枝を用いて単離した。全体で約５×１０⁴ の独立した
ｃＤＮＡクローンが生産された。

【００６５】Ｅ．ＤＮＡトランスフェクション（感染）
によるヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ １０⁴ の独立したクローンを任意にＴ細胞ｃＤＮＡライ
ブラリーから抽出し、マイクロタイター培養皿のウエル
で５０μg ／mlのアンピシリンおよび７％のジメチルス
ルホキシドを含むＬ−ブロス２００μl 中で増殖させ
た。マイクロタイター培養皿より４８のｃＤＮＡクロー
ンが調製され、プールされた。このプールから４０のク
ローンを１００μg ／mlアンピシリンを含むＬ−ブロス
中で１リットルまで増殖させた。各培養物からプラスミ
ドＤＮＡを単離し、ＣｓＣｌグラジエントを２回通して
精製した。各プール由来のＤＮＡ配列以下の方法でＣＯ
Ｓ７サル細胞に感染（トランスフェクション）させた。

【００６６】感染の前日、約１０⁶ のＣＯＳ７サル細胞
を別々の６０mmプレートに、１０％ウシ胎児血清および
２Ｍグルタミンを含むＤＭＥ中で播種した。感染のた
め、各プレートから培地を吸引し、５０mmトリス塩酸
（pH７．４），４００μg ／mlＤＥＡＥ−デキストラン
および１５μg の被検プラスミドＤＮＡを含むＤＭＥ
１．５mlで置換した。プレートを３７℃で４時間インキ
ュベートし、ＤＮＡを含む培地を除去、プレートを２ml
の無血清ＤＭＥで２回洗浄した。プレートに１５０μM
クロロキンを含むＤＭＥを加え、さらに３７℃で３時間
インキュベートした。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、
４％のウシ胎児血清、２mmグルタミン、ペニシリン、ス
トレプトマイシンを含むＤＭＥを添加した。こののち、
細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。培養上清
を集め、上述の方法でＧＭ−ＣＳＦの活性をアッセイし
た。

【００６７】４つのプール（グループ１Ａ、３Ｂ、７Ａ
および１４Ａ）がヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を示した（下記
第I表を参照）。各グループをさらに、それぞれ、もと
もとプールされたクローンのうち８つを含むような６つ
のプールに分割した。各々のプール由来のサブプールの
うち１つが感染アッセイで陽性であった。但し７Ａは２
つの陽性なサブプールを産生した。４または５つのサブ
プールの中の各プラスミドを別々にＣＯＳ７細胞に感染
させた。３−８ａ、７−１ａ、７−４ｄ、および１４−
１ｅと名付けられた４つの独立したクローンがＧＭ−Ｃ
ＳＦ活性を有した。制限エンドヌクレアーゼ解析によっ
てこれらのクローンの全てが実質的に同じ構造を有する
ことが示された。

【００６８】第II表は２点の臍帯血アッセイにおける各
感染サンプルによって刺激された造血コロニーの数を示
す。クラスターは２０から５０細胞を意味し、小コロニ
ーは５１から１５０細胞、そしてコロニーは１５０以上
の細胞を示す。

【００６９】 第II表 プラスミドＤＮＡプールの感染によるコロニー刺激活性の アッセイ 第１スクリーニング ４８クローン中４０プール （１−２０，Ａ＋Ｂ） 偽感染ＣＯＳ７ ７＋１２クラスター プール１Ａ： ２９＋２５クラスター プール３Ｂ： ３８＋２０クラスター プール７Ａ： ２２＋１９クラスター プール１４Ａ： ２６＋３２クラスター 他の全てのプール ２０クラスター以下 第２スクリーニング ８クローンのサブプール 偽感染ＣＯＳ７ ９＋１５クラスター サブプール１−５： ５６＋５４クラスター サブプール３−８： ９８＋５２小コロニー サブプール７−１： ２９＋４１小コロニー サブプール７−４： １００＋９３小コロニー サブプール１４−１： ４０＋７３小コロニー 他の全てのサブプール ２０クラスター以下 第３スクリーニング 個々のクローン クローン３−８ａ： １２０＋１２７小コロニー クローン７−１ａ： １９８＋１６４小コロニー クローン７−４ａ： １７６＋１６０小コロニー クローン１４−１ｅ： ６２＋６７ 小コロニー 他の全てのクローン ２０クラスター以下

【００７０】実質的に完全長ｃＤＮＡ挿入物を持つプラ
スミド（ｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−ＣＳＦ）は第２図
に示されており、このプラスミドを持つＥ．ｃｏｌｉバ
クテリア（ＭＣ１０６１）はＡＴＣＣに寄託された（寄
託番号３９９２３）。第２図ではｐｃＤ発現ベクターに
含まれる７７６bpのｃＤＮＡ挿入物のＳＶ４０早期プロ
モーターからの転写を矢印で示した。スプライスの供与
および受容部位が示されている。ＳＶ４０由来のポリア
デニル化シグナルは、ｃＤＮＡ挿入の３′−末端に位置
する。ｃＤＮＡ挿入物中のＧＭ−ＣＳＦコード領域が濃
い影の部分で非コード領域は薄い影の部分である。β−
ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^r ）および複製開始点を含
むベクター配列の残りの部分はｐＢＲ３２２由来であ
る。

【００７１】Ｍ１３ダイデオキシ チェーンターミネー
ター法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４
６３−５４６７（１９７７））および改変マクサム−ギ
ルバート法（ルビンおよびシュミット（Ｒｕｂｉｎ，
Ｃ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄＲｅｓ．，８，４６１３−４６１９（１９８１））の
双方を用いて３−８ａの配列を決定した。ｃＤＮＡ挿入
物は唯一つの読み枠を持つ。最初のＡＴＧは５′−末端
から３３−３５ヌクレオチドに存在し、ヌクレオチド２
６５−４６７の終結暗号（ＴＧＡ）までの間に１４４コ
ドンを持つ。

【００７２】第III表はクローン３−８ａ、７−１ａ、
７−４ｄ、および１４−１ｅのそれぞれの影響下で培養
された約６０のヒト骨髄および臍帯血液コロニーの細胞
組成物の崩壊の割合をパーセント表示したものである。
好酸球および他の細胞種の混合コロニーが存在するの
は、コロニーが一緒に生育したためであろう。

【００７３】 第III表 ヒト骨髄コロニーの細胞組成 Neu Mφ Eos Neu/Mφ Mφ/Eos Neu/Mφ/Eos 15% 30% 7% 37% 2% 9%

【００７４】実施例II ＳＲαプロモーターを用いた哺
乳類細胞中でのＧＭ−ＣＳＦの発現上昇 しへ４０早期複製開始点のＸｈｏI切断部位にＨＴＬＶ
（Ｉ）レトロウイルスのロングターミナルリピート（Ｌ
ＴＲ）の断片を挿入して構築されるプロモーター（ＳＲ
αと名付ける）を用いて様々な哺乳類細胞中でのＧＭ−
ＣＳＦの発現上昇がなされる。ＬＴＲ断片が存在すると
ＣＯＳサル細胞（例えば寄託番号ＣＲＬ１６５０または
ＣＲＬ １６５１としてＡＴＣＣより入手可能）および
ＣＶ１サル細胞（例えば寄託番号ＣＣＬ ７０としてＡ
ＴＣＣより入手可能）およびマウスＬ細胞（例えば、Ｌ
−Ｍ（ＴＫ^- ）はＡＴＣＣより寄託番号ＣＣＬ １．３
として入手可能）中でＧＭ−ＣＳＦの発現は２０−５０
倍に上昇する。合成ＤＮＡ断片よりＳＲαプロモーター
を構築する方法を以下に示す。ＳＲαはＡＴＣＣ寄託番
号６７３１８のプラスミドｐｃＤ−ｈｕＩＬ−３−２２
−１からも得られる。

【００７５】レトロウイルスのＬＴＲはいろいろな系で
発現を上昇させることが示されている：例えばチェン
（Ｃｈｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２，７２８５−７２８８（１９８５）；
ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６７７７−６７８１
（１９８２）；テミン（Ｔｅｍｉｎ），Ｃｅｌｌ，２
７，１−３（１９８１）；およびルシウ（Ｌｕｃｉｗ）
ら，Ｃｅｌｌ，３３，７０５−７１６（１９８３）があ
る。ｐＬ１のＸｈｏI切断部位に挿入されたＨＴＬＶ
（Ｉ）ＬＴＲ断片は、完全なＲ領域およびＲ／Ｕ５境界
から最初の下流のＴａｑI切断部位まで（全部で３９塩
基）のＵ５領域の一部（第３図でＵ５′と命名されてい
る）を含む２６７塩基部分を含む。ＨＴＬＶ（Ｉ）ＬＴ
Ｒの配列は、ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）らによりＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１５，１５７
−１７５（１９８５）に開示されている。

【００７６】ＨＴＬＶ（Ｉ）ＬＴＲは、実施例IVに記載
した方法を用い、４段階でプラスミドｐＬ１に挿入さ
れ、第３図に示す改変プラスミド，ｐＬ１′が作られ
た。まずｐＬ１をＢｇｌIおよびＸｈｏIで消化し、大き
い断片を単離する。次に大きい断片を合成した１Ａ／Ｂ
および２Ａ／Ｂ（以下で定義する）と標準的なライゲー
ション混合物中で混合する。合成物１Ａ／Ｂおよび２Ａ
／Ｂは共に５′→３′の順に以下の者を含む；ＳＶ４０
ｏｒｉのＢｇｌI／ＸｈｏI断片，ＬＲＴのＲりのの２６
７塩基の５′−断片およびＳｍａI、ＳａｃI、Ｎａｅ
I、およびＸｈｏIの順にそれぞれの切断部位を含むポリ
リンカー。

【００７７】 (BglI) TCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGA- CGGAGCCGGAGACTCGATAAGGTCTTCATCACTCCTCCGAAAAAACCT- GGCCTAGGCTTTT CCGG 合成物１Ａ／Ｂ SmaI SV40ori-->R----> R-----> SacI GCAAAAAGCTCGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGGGGAG- ATCCGAAAACGTTTTTCGAGCCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCCCCTC- NaeI XhoI CTCGCCGGCC GAGCGGCCGGAGCT 合成物２Ａ／Ｂ

【００７８】ライゲーションの後、第一段階より得られ
るプラスミドを増幅、抽出し、ＳｍａIおよびＳａｃIで
消化して大きい断片を抽出した。大きい断片を次に合成
物３Ａ／Ｂおよび４Ａ／Ｂ（以下に定義する）と、標準
的なライゲーション混合物中で混合した。

【００７９】

【００８０】ライゲーションの後、第二段階より得られ
るプラスミドを増幅、単離し、ＳａｃIおよびＮａｅIで
消化し、大きい断片を単離した。大きい断片を合成物５
Ａ／Ｂ（以下に定義する）と標準的なライゲーション混
合物中で混合した。

【００８１】 CAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCT- TCGAGTCCAGCTCTGGCCCGGAAACAGGCCGCGAGGGAACCTCGGATGGA- NaeI AGACTCAGCC TCTGAGTCGG 合成物５Ａ／Ｂ

【００８２】ライゲーションの後、第三段階より得られ
るプラスミドを増幅、単離し、ＮａｅIおよびＸｈｏIで
消化し、大きい断片を抽出した。大きい断片を合成物６
Ａ／Ｂおよび７Ａ／Ｂ（以下に定義する）と標準的なラ
イゲーション混合物中で混合し、ｐＬ１′と名付けた改
変ｐＬ１プラスミドを作製した。

【００８３】 NaeI GGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACG CCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAG 合成物６Ａ／Ｂ XhoI TCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATC TTGAGATGCAGAAACAAAGCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTCTAGAGCT 合成物７Ａ／Ｂ

【００８４】増幅の後、ｐＬ１′を精製し、ＨｉｎｄII
IおよびＸｈｏIで切断し、ＳＶ４０ｏｒｉおよびＲ−Ｕ
５′を含む小さい断片を単離した。また別にプラスミド
ｐｃＤＶ１（第４図に図示する）を精製し、ＨｉｎｄII
IおよびＸｈｏIで消化し、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉおよび
Ａｍｐ^r遺伝子を含む大きい断片を単離した。ｐＬ１′
の小さい断片とｐｃＤＶ１の大きい断片をライゲーショ
ンし、そこから得られるプラスミドｐｃＤ（ＳＲα）を
増幅した。また、別にプラスミドｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−
ＧＭ−ＣＳＦをＸｈｏIで消化し、ＧＭ−ＣＳＦのコー
ド領域を含む小さい断片を単離し、ＸｈｏIで消化した
ｐｃＤ（ＳＲα）とライゲーションした。これらより得
られる組換え体は、例えば細胞株ＨＢ１０１またはＭＣ
１０６１等の大腸菌にトランスフェクションさせ、培養
皿にまいた。アンピシリン抵抗性のコードのバクテリア
を無作為に選び、別々に増幅させた。プラスミドを抽
出、精製し、そして上述の方法でＣＯＳ７サル細胞を感
染させるために用いた。その培養上清のアッセイで、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ活性が陽性なＣＯＳ７培養物は、目的のｐｃ
Ｄ（ＳＲα）−ｈＧＭ−ＣＳＦプラスミドを持つ。

【００８５】実施例III．パン酵母中でのＧＭ−ＣＳＦ
の発現 天然のヒトＧＭ−ＣＳＦのシグナルペプチドのコード領
域を除去し、プラスミドｐＭＦα８の酵母α−因子接合
フェロモンのシグナルペプチドのコード領域と置換し
た。パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｃｉａｅ）は、ｐＭＦα８によって形質転換され、
接合因子／ＧＭ−ＣＳＦ融合蛋白質を発現し、成熟ＧＭ
−ＣＳＦを培地中に分泌する。この実施例の結合はミヤ
ジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）らによりＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ，５，１１９３−１１９７（１９８６）にも記載
されている。

【００８６】パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）は接合型に特異的なオリゴペプ
チドのフェロモンを分泌する。Ｍａｔα細胞はα−因子
を分泌し、これはＭａｔα細胞の生育を細胞周期のＧ₁
期で停止する（ソーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．），
「パン酵母の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ），コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー，ニューヨーク（１９８１）；特に１４３−
１８０頁を参照）。α−因子は２０アミノ酸のＮＨ₂ −
末端シグナル配列、それに続くさらなる６０アミノ酸の
リーダー配列、および最後に成熟α−因子の配列の４回
の同一な繰り返しからなる大きい前駆体として最初は合
成される。この繰り返しはお互いから６または８個のア
ミノ酸のスペーサーにより隔てられている（Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＡｌａおよびＬｙｓ−
Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ〔またはＡｓｐ〕−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）。このプレプロα因子はいくつ
かの特異的な部位で切断を受ける。最初のプロセッシン
グは、ＫＥＸ２産物によって触媒される。スペーサー配
列中のＬｙｓ−ＡｒｇペアのＣＯＯＨ−末端の結合であ
る：ジュリウス（Ｊｕｌｉｕｓ）ら，Ｃｅｌｌ，３７，
１０７５−１０８９（１９８４）。カルボキシペプチダ
ーゼＢ様の酵素がＬｙｓ−ＡｒｇペアのＮＨ₂ −末端側
で切断する。最終の段階はＳＴＥ１３によってコードさ
れるジアミノペプチダーゼによるＧｌｕ−Ａｌａまたは
Ａｓｐ−Ａｌａペアの除去である。ブレイク（Ｊ．Ｂｒ
ａｋｅ）らは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８１，４６４２−４６４６（１９８４）で
成熟ヒト蛋白質をコードする配列と第一プロセッシング
部位の融合によってこのような蛋白質が分泌されること
を示した。

【００８７】アルファ因子プロモーターおよび下流のリ
ーダー配列を他の要素とともに含む、ｐＭＦα８と名付
けられた一般的な酵母の発現ベクターは、ＡＴＣＣに寄
託番号４０１４０で寄託されている。これは以下のよう
にして構築することができる：ＭＦα１遺伝子を持つ
１．７kbのＥｃｏＲI断片（カージャン（Ｋｕｒｊａ
ｎ，Ｊ．）およびヘルショウィッツ（Ｈｅｒｓｈｏｗｉ
ｔｚ，Ｉ．），Ｃｅｌｌ，３０，９３３−９４３（１９
８２））をＭ１３ｍｐ８（ビエラおよびメッシング（Ｖ
ｉｅｒａ，Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．），Ｇｅ
ｎｅ，１９，２５９−２６８（１９８２））中にクロー
ニングした。第一スペーサー領域のリジンコドンのあと
にＨｉｎｄIII切断部位を導入するため、合成オリゴヌ
クレオチドＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣ
を単鎖Ｍ１３−ＭＦα１ ＤＮＡとハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡポリメラーゼI
クレノー断片を用い伸長した。Ｓ１ヌクレアーゼ処理
の後、ＤＮＡをＥｃｏＲIで切断し、ＭＦα１プロモー
ターおよびリーダー配列を含む断片をｐＵＣ８（ビエラ
およびメッシング，上述）のＥｃｏＲIおよび埋められ
たＨｉｎｄIII制限酵素切断部位にクローニングした。
望ましい構造のプラスミドが一つ単離された（ｐＭＦα
４Δ１と命名した）。ｐＭＦα４Δ１をＨｉｎｄIIIに
よって切断し、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ存在下でＤＮＡ
ポリメラーゼIクレノー断片を用いて部分的に補足し
た。ＤＮＡをヤエナリのヌクレアーゼで処理し、オリゴ
ヌクレオチドリンカー（ＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣ）を結合
した。得られたプラスミド（ｐＭＦα５と命名した）
は、アルギニンコドンの直後にＳｔｕI切断部位、また
その後にＸｈｏI制限酵素切断部位を持つ。Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｃｉａｅ−Ｅ．ｃｏｌｉのシャトルベクター（ｐ
ＴＲＰ５８４）は以下のようにして構築される。２μm
プラスミドの複製開始点（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ，
Ｊ．），上述）を含むＰｓｔI−ＸｂａI断片をｐＴＲＰ
５６（ミヤジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４，４０７−４１４（１９８４）の
ＣｌａＩ制限酵素切断部位にクローニングし、ＴＲＰ１
−ＡＲＳ１断片中のＳｔｕI制限部位をＰｖｕIIリンカ
ー挿入によってＰｖｕII制限部位へ変換した。基本とな
るｐＴＲＰ５６のＫｐｎI制限部位はＸｈｏIリンカー挿
入によりＸｈｏIに転換した。そしてｐＴＲＰ５８４の
ＢａｍＨＩ−ＸｈｏI制限部位にｐＭＦα５のＢｇｌII
−ＸｈｏI断片を挿入することにより、一般的な分泌ベ
クターｐＭＦα８を得た。

【００８８】ｐＭＦα８にクローニングする前に、ゾラ
ー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）により
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０
０，４６８−５００（１９８３）に開示された方法を用
い、Ｍ１３ｍｐ８中のオリゴヌクレオチド特異的突然変
異誘発により、ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ中にＦｓｐI制
限部位を導入した。導入したＦｓｐI部位によってｐＭ
Ｆα８への挿入前に内因製のシグナルペプチドのコード
領域および成熟蛋白質をコードする領域の中間でｃＤＮ
Ａ挿入物を切断することができる。

【００８９】簡単に述べると、完全なｃＤＮＡ挿入物
（図２のＡを参照）を含むｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−
ＣＳＦのＢａｍＨＩ断片をＭ１３ｍｐ８の複製型にクロ
ーニングし、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１を
形質転換した。挿入物を含むＭ１３ｍｐ８はイソプロピ
ル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）および
５−プロモ−４−クロロ−３−インドイル−ベータ−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む寒天上で透明なプ
ラークより選択した。それぞれ選ばれたプラークに対応
する８つのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１培養物から標準的
な技術（遠心分離、上清よりポリエチレングリコールを
用いたファージ粒子の除去、ファージのコート蛋白質か
らＤＮＡを分離するためのフェノール抽出、およびエタ
ノール沈澱）を用いて、それぞれ単鎖のＭ１３ｍｐ８Ｄ
ＮＡを調製した。

【００９０】クロスハイブリダイゼーションおよびゲル
電気泳動を用いて決定したｃＤＮＡ挿入物の方向に従っ
て、８セットのＤＮＡを２つのサブセットに分類した。
各サブセットの単鎖ＤＮＡに対してそれぞれオリゴヌク
レオチド特異的突然変異誘発を行った。逆に２つのサブ
セット中のＤＮＡを配列決定し、正しい方向でｃＤＮＡ
挿入物を含む単鎖ＤＮＡを決定することもできる。

【００９１】以下の配列を持つ（ミスマッチ（不一致）
を下線で示した）２０残基のオリゴヌクレオチドプライ
マーを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．，モデル３８０Ａ，フォスターシティー，
ＣＡ）： ＧＴＣＧＴＡＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＧ

【００９２】３−リン酸化の後、２０残基のオリゴヌク
レオチドプライマーを約３０倍過剰の単鎖ＤＮＡ（約１
μg ）と混合し、５μl 容の０．５Ｍ ＮａＣｌ中で６
５℃で５分間加熱し、室温で１時間放置した。緩衝液お
よび塩類の濃度は以下のように調製した。１００mM Ｎ
ａＣｌ，２０mMトリス塩酸でpH７．５，１０mMジチオス
レイトール，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，４種のデオキシヌク
レオシド３リン酸を約４００μM ずつ，ＡＴＰを約５０
０μM 。ＤＮＡポリメラーゼI（クレノー断片）および
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、反応液を１２℃でインキュ
ベートした。二重鎖環状ＤＮＡをアルカリ蔗糖密度勾配
遠心法によって単離し、ＣａＣｌ₂ 処理した大腸菌ＪＭ
１０１を形質転換するのに用いた。プライマーで使用し
たものと同じ配列を持つ³²Ｐ標識したオリゴヌクレオチ
ドプローブでハイブリダイゼーションを行い、変異Ｃ−
ＤＮＡを含む大腸菌ＪＭ１０１のコロニーをスクリーニ
ングした。

【００９３】増幅の後、変異を含むＭ１３ファージをＥ
ｓｐＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、（ＢａｍＨＩ
切断部位の突出端を平にするために）ＤＮＡポリメラー
ゼIクレノー断片で処理し、ゲル電気泳動にかけた。最
後に抽出されたＧＭ−ＣＳＦを含む断片をｐＭＦα８の
ＳｔｕＩ切断部位に挿入した。

【００９４】サッカロミセス・セレビシエ２０Ｂ−１２
（ＭＡＴα ｔｒｐ１ ２８９ ｐｅｐ４−３）酢酸リ
チウム法（イトウ（Ｉｔｏ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））によりｐ
ＭＦα８で形質転換し、０．６７％のアミノ酸を含まな
い酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸および２％グルコ
ースを含む培地で培養した。

【００９５】臍帯血を用いたコロニーアッセイにより、
酵母培養液中に分泌されたＧＭ−ＣＳＦを確認した。

【００９６】実施例IV．大腸菌中でのＧＭ−ＣＳＦの発
現 成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦのコード領域をｏｍｐＡ蛋白質の
シグナルペプチドコード領域を含むベクターｐＩＮ−II
I−ＯｍｐＡ２に挿入した。ｐＩＮ−III−ＯｍｐＡ２は
グライェブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによりＥＭＢＯ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ，３，２４３７−２４４２（１９８４）に、
およびマスイ（Ｍａｓｕｉ）らによりＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，２，８１−８５（１９８４）に開示されて
いる。これらの文献の内容は参照により本明細書に含ま
れる。

【００９７】この挿入は３段階で行った。最初に成熟Ｇ
Ｍ−ＣＳＦコード領域を含むｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ
−ＣＳＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片をＭ１３ｍｐ１０
の複製型（ＲＦ）のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ消化物に挿入
し、点特異的突然変異誘発により、成熟ＧＭ−ＣＳＦの
基礎と成るコドンに隣接して、そよびその５’−末端
に、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。第２に変異したＭ１３
ｍｐ１０のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＩＮ−III
−ＯｍｐＡ２のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化物に挿入し
た。最後にｐＩＮ−III−ＯｍｐＡ２中のＯｍｐＡシグ
ナルペプチドコード領域および成熟ＧＭ−ＣＳＦコード
領域間の余分な９塩基対の配列を点特異的突然変異誘発
により除去した。全ての場合においてＭ１３の変異型は
合成プライマーをプローブとして検出した。

【００９８】全ての制限酵素消化、ＤＮＡポリメラー
ゼ、キナーゼおよびリガーゼの反応は、本質的にマニア
チスらにより記載された方法にしたがって行った。酵素
はニューイングランドバイオラボ社およびベーリンガー
マンハイム社より購入した。プラスミド抽出はアルカリ
法（小規模：マニアチスら，上記）またはその変法（大
規模：ツラウスキ（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）ら，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１３７，３３５４−３３６０（１９８
６））で行った。点特異的突然変異誘発は、Ｍ１３ｍｐ
１０ベクターにサブクローニングされたＤＮＡ断片を用
いて行った。１０ngのキナーゼ処理したプライマーＤＮ
Ａを５０〜１００ngの単鎖鋳型ＤＮＡとリガーゼ緩衝液
４０μl 中で混合した。この混合物に１００ngの直鎖Ｍ
１３ＲＦを添加した。反応混合物は９５℃で１０分間加
熱した。アニーリングは室温で３０分、次に４℃で１５
分おいて行った。ｄＮＴＰ（５０μM ）、リガーゼ（４
００Ｕ）およびクレノー（５Ｕ）を加え（総量５０μl
）、混合物を３０分間４℃で、次に１時間１２℃でイ
ンキュベートした。混合物をＪＭ１０１細胞中に形質転
換し、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬ−ブロス（Ｌ
Ｂ）プレートに接種した。白色のプラークをマイクロタ
イター培養皿の１５０μl Ｌ−ブロス中に楊子で移し
た。Ｍ１３感染細胞をＬＢプレート上のＪＭ１０１細胞
層上に接着法を用いて移した。３７℃で１６時間のイン
キュベーションの後、予め湿らせたニトロセルロース紙
をプラーク上に１分間接着させた。フィルターを０．０
５Ｍ ＮａＯＨに３分間、中和緩衝液（３Ｍ Ｎａｃ
ｌ，０．５Ｍ トリス塩酸，pH７．５）に１５分間浸し
た。再度１５分間新しい中和緩衝液に浸した後、フィル
ターを２×ＳＳＣ中に移した。フィルターを乾燥し、８
０℃で１．５時間加熱した。フィルターの前−ハイブリ
ダイゼーション処理は、０．０９Ｍトリス塩酸，pH７．
５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，０．９Ｍ ＮａＣｌ，
０．１Ｍ ＡＴＰ，１mM Ｐｉ，１mM ＰＰ，０．５％
ＮＰ４０，６mM ＥＤＴＡおよび０．２mg／mlの大腸菌
ｔＲＮＡ中、室温で３時間行った。³²Ｐで標識したプロ
ーブを加え、更に室温で１６時間インキュベートした。
フィルターは加熱しながら、オートラジオグラフィーで
背景のカウントが検出されなくなるまで６×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。必要に応じて、ＳＳＣの
濃度を下げた。陽性プラークより単鎖ＤＮＡを単離し配
列決定を行った。

【００９９】ＤＮＡの配列分析は標準的なダイデオキシ
法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３−５４６７
（１９７７））を使用した。ＤＮＡのオリゴヌクレオチ
ドは、アプライドバイオシステムズ社３８０Ａ合成機を
用いて、ホスホルアミダイト化学法によって合成した。

【０１００】ｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−ＣＳＦのＰｓ
ｔＩ／ＢａｍＨＩ断片をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消
化したＭ１３ｍｐ１０ＲＦにクローニングした。標準的
な技術（メッシング，上述）を用い、この組成物の単鎖
ＤＮＡを調製し、図１に示されているＧＭ−ＣＳＦのC-
DNA 配列の８３と８４塩基対の間にＥｃｏＲＩ切断部位
（ＧＡＡＴＴＣ）を導入するために点と特異的突然変異
誘発を行った。下記の合成プライマーを使用した： 5'-CTGCAGCATCTCTGAATTCGCACCCGCCCGCT-3' ＥｃｏＲＩ切断部位を下線で示した。挿入変異体の配列
を決定した後、ＧＭ−ＣＳＦC-DNA を含むＭ１３のＥｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消
化したｐＩＮ−III−ＯｍｐＡ２に挿入して、大腸菌Ｊ
Ｍ１０１中で増幅、単離し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ
で消化した。ＧＭ−ＣＳＦ C-DNA を含むＸｂａＩ／Ｂ
ａｍＨＩ断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化したＭ１３
ｍｐ１０ＲＦに挿入した。単鎖ＤＮＡを標準的な方法を
用いて単離し、下記の合成プライマーを用いて点特異的
突然変異誘発を行った： プライマーの配列の間隙および下段の下線を付した配列
は、９塩基対の欠失およびその欠失した配列を示す。欠
失変異体の配列を確認した後、そのＸｂａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ断片を単離し、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＩ
Ｎ−III−ＯｍｐＡ２とライゲーションして、大腸菌Ｊ
Ｍ１０１を形質転換するために用いる最終的な構築物を
得た。

【０１０１】実施例V．大腸菌中で発現したＧＭ−ＣＳ
Ｆの精製 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の可溶性抽出物から順に、陰イ
オン交換、色素−リガンドアフィニティー、ゲル漉過、
および逆相クロマトグラフィーを行って、ＧＭ−ＣＳＦ
を精製した。望ましくは一連のクロマトグラフィーはＱ
ＡＥ（第四アミノエチル）カラムクロマトグラフィー、
マトレックス（Ｍａｔｒｅｘ）ゲルＲｅｄ Ａカラムク
ロマトグラフィー、限外漉過による濃縮および／または
硫酸アンモニウム沈澱、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）Ｇ−１００ゲル漉過、およびＦＰＬＣまたはＨＰ
ＬＣ逆相クロマトグラフィーのいずれかを含む。この操
作による最終生成物は、特異性の高い生物学的活性、９
５−１００％の電気泳動的純度、低量の発熱物質そして
低量の大腸菌由来の夾雑物またはＧＭ−ＣＳＦの誘導物
を示した。

【０１０２】特に示さない限り、全ての操作は２−１５
℃で行った。各段階でクーマシーブルー結合アッセイに
より蛋白質濃度を決定した。pH測定は＋０．２単位で、
誘電率測定は＋３ｍＳの巾で変化し得る。どのクロマト
グラフィー操作においても、期待される精製度が得られ
ない場合、溶出過区分を集め、同じカラムで再クロマト
グラフィー、または以前の操作、または以前の一連の操
作を再び行った。硫酸アンモニウム沈澱および／または
限外漉過法は、蛋白質を濃縮および／または保存するた
めに行った；例えばステップＣの操作である。カラムの
平衡化および溶出に使用するものを含む全ての溶液は、
使用前に０．２μ膜で漉過した。ステップＤ以降の全て
の溶液の調製にはＵＳＰXIX 級の水を使用した。

【０１０３】Ａ．細胞の殺滅および蛋白質の抽出 ８５％のリン酸を加えてpHを４．５に、次に５０％トリ
クロロ酢酸を加えてpHを２．０に調節し、細胞を殺し
た。０．２μ膜で漉過した後、水を加えて誘電率を１５
−２０ｍＳに調節した。低い誘電率は、ＧＭ−ＣＳＦを
ＱＡＥカラムに結合させるために必要な希釈を最小限に
抑えるために必要である。

【０１０４】Ｂ．第四アミノエチル（ＱＡＥ）カラムク
ロマトグラフィー 必要に応じて中和した抽出物を、水酸化ナトリウムまた
は塩酸で適切なpH７．５に調節した。中和した抽出物の
誘電率は、脱イオン水を加えて５−１０ｍＳに調節し
た。ＱＡＥカラムは少なくとも２〜３倍のカラム容の２
０mMトリス塩酸，pH７．５で平衡化した。ＧＭ−ＣＳＦ
を含む抽出物は、１mlの樹脂あたり２０mg以下でカラム
に添加した。カラムは平衡化に用いたものと同じ緩衝液
に溶かした塩化ナトリウムの濃度勾配で０−０．５Ｍの
巾で、１０−２０倍のカラム容で溶出した。溶出分画を
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基づいて集め、ステップＣ
のクロマトグラフィーを行った。

【０１０５】Ｃ．色素アフィニティークロマトグラフィ
ー ＱＡＥカラムからの溶出分画は、誘電率５−１０ｍＳま
で脱イオン水で希釈し、２〜３カラム容の２０mMトリス
塩酸，pH７．５で平衡化したＲｅｄアフィニティーカラ
ム（例えばアガロース支持体に結合したプロシオンレッ
ド（Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｒｅｄ）ＨＥ３Ｂに添加した。カ
ラムに加える蛋白質の量は１mlのゲル当たり１０mgを越
えてはならない。カラムは３〜４カラム容の平衡化緩衝
液で洗浄した。溶出は５〜１５容の２０mMトリス塩酸，
pH７．５に溶かした０〜０．７５Ｍの塩化ナトリウムの
濃度勾配で行った。ステップＤで用いる分画はＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果に基づいて集められた。

【０１０６】Ｄ．限外漉過および／または硫酸アンモニ
ウム沈澱による濃縮 前の操作で回収された分画の蛋白質濃度が１．０mg／ml
以下である場合、排除分子量３０００−５０００の分離
膜を用い、限外漉過で濃縮した。最終の蛋白質濃度は
１．０mg／ml以上とする。硫酸アンモニウムを最終濃度
６０〜７０％になるように加えた。沈澱を遠心によって
回収し、沈澱に用いた濃度の硫酸アンモニウムを含む、
２０mMトリス塩酸（pH７．５）で一回洗浄した。沈澱を
遠心によって集め、２０mMトリス塩酸，pH７．５に溶解
した。

【０１０７】Ｅ．セファデックスＧ−１００カラムクロ
マトグラフィー 再度溶解した硫酸アンモニウム沈澱は、必要に応じて遠
心して不純物を除去した。溶液を０．２μフィルターで
漉過し、２０mMトリス塩酸，pH７．５で平衡化したセフ
ァデックスＧ−１００カラムに添加した。カラムに添加
される蛋白質の量は、ゲル１mlあたり３mgを越えてはな
らない。カラムは同じ緩衝液を用いて溶出した。ステッ
プＦで用いる分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて
回収した。

【０１０８】Ｆ．逆相カラムクロマトグラフィー 回収したセファデックスＧ−１００溶出液を０．２μフ
ィルターで漉過し、ＦＰＬＣ（高速蛋白質液体クロマト
グラフィー）およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ
ィー）カラム等の逆相カラムに添加した。カラムは０．
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化し、溶出は
０．１％ＴＦＡ中に溶解した０−１００％のアセトニト
リル濃度勾配で行った。分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
に基づいて回収した。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末を２
０mMリン酸ナトリウム、pH７．２に溶解した。

【０１０９】Ｇ．精製したＧＭ−ＣＳＦの透析 ステップＦの溶液は２０mMリン酸ナトリウム、pH７．２
に対して透析した。最低４〜５時間の間隔をおいて緩衝
液を２回交換した。必要に応じて、排除分子量３，００
０〜５，０００の限外漉過膜を用い、透析した溶液を蛋
白質濃度が最低１．０mg／mlになるまで濃縮した。精製
したＧＭ−ＣＳＦ溶液は０．２μフィルターを通し、−
２０℃あるいはそれ以下で凍結保存した。

【０１１０】上述の本発明における態様は、例解および
解説の目的で行った。これらは網羅的なものではなく、
また、本発明をここで開示された詳細な形式に限定する
ものでもない。そして、以上の既述に照らして明らかに
多くの改変や変形が可能である。本明細書における態様
は、当業者が種々の態様で、また、個々の使用状況に適
切な種々の改変を用いて本発明を最適に使用できるため
に、本発明の原理とその実際の適用法を最もよく解説す
る目的で選択、記載された。本発明の範囲は請求の範囲
によって定められる。

【０１１１】特許出願人はｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−
ＣＳＦをＡＴＣＣに寄託番号３９９２３で寄託した。こ
の寄託はブタペスト条約の要求を満足する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡ挿入のヌクレオチド配列および対応し
たアミノ酸配列を示す。

【図２】Ａは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ挿入を持つプラスミド，ｐｃＤ
−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−ＣＳＦを示す。Ｂは、Ａ図のｃＤ
ＮＡ挿入の制限酵素地図である。

【図３】プラスミドｐＬ１の制限酵素切断部位および主
要なコード領域を模式的に示す。

【図４】プラスミドｐｃＤＶ１の制限酵素切断部位およ
び主要なコード領域を模式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＸ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｃ０７Ｋ 14/53 ＡＤＸ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リー，フランク・ディー アメリカ合衆国カリフォルニア州94301, パロ・アルト，リンコナダ・アベニュー 212 (72)発明者 レニック，ドナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，アーモンド・アベニュー 601 (72)発明者 アライ，ケンイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，ジョージア・アベニュー 648 (72)発明者 アライ，ナオコ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，ジョージア・アベニュー 648

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始点とＳＶ４０
   初期領域プロモーターとを含むＳＲαプロモーターであ
   って、前記ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期複製開
   始点のＸｈｏＩ部位においてＨＴＬＶ（Ｉ）レトロウイ
   ルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の一部を含
   み、該一部は、完全なＲ領域およびＲ／Ｕ５境界から最
   初の下流のＴａｑＩ部位までのＵ５領域の一部を含むセ
   グメントを含むことによってさらに特徴づけられる、上
   記ＳＲαプロモーター。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＳＲαプロモーターを含
   む発現ベクターを適当な宿主細胞中で培養することを特
   徴とする、宿主細胞中でのタンパク質の産生方法。
3. 【請求項３】 宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請
   求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 宿主細胞がＣＯＳサル細胞，ＣＶ１サル
   細胞、マウスＬ細胞及びチャイニースハムスター卵巣細
   胞から選択されることを特徴とする、請求項３記載の方
   法。