CN110592022A - 一种肺肿瘤类器官专用培养基及无支架3d培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺肿瘤类器官专用培养基及无支架3D培养方法，该专用培养基由以下成分组成：FBS、双抗、N‑2、Noggin、B‑27、EGF、FGF‑10、Y‑27632、A 83‑01、SB202190、N‑乙酰半胱氨酸、HEPES、Glutamax、IGF‑1、氢化可的松和Advanced DMEM/F12。培养方法是将肿瘤细胞加入低血清培养基重悬，纯化后接种至培养器皿中，加入上述专用培养基，每天换一次专用培养基，培养至形成类器官。本发明培养基及培养方法可实现肿瘤类器官的快速生成，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官细胞球球形规则，且大小均一可控，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。

Description

一种肺肿瘤类器官专用培养基及无支架3D培养方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域的细胞培养或组织培养技术，特别是一种肺肿瘤类器官专用培养基及无支架3D培养方法。

背景技术

由于肿瘤细胞的异质性、多变性等特点，肿瘤对各种化疗药物的敏感性存在着明显的个体差异。许多肿瘤患者对化疗药物不敏感，或者在化疗过程中逐渐对药物产生耐受性，从而导致肿瘤的复发或患者的死亡。而且这种耐药性在化疗前是很难预知的，化疗失败和各种化疗方案的不断尝试，会导致患者身体受损、经济浪费和治疗时机的丧失。Shi JF等人最近报道了一项多中心的肺癌回顾性研究，结果表明我国在2005年至2014年的10年间，肺腺癌和肺鳞癌仍然为肺癌的主要类型，占比接近90％，治疗手段仍为手术和化疗，但是晚期的肺癌病人的占比从2005年的41.9％增加至2014年的47.4％，60岁以上的高龄患者的发病率和女性病人患病比例增加，平均每个患者的医疗支出从4.05万增加至6.6万。高龄和晚期病人比例增加，对目前临床上这种不同化疗方案尝试的治疗方法提出了挑战，病人由于体质及经济承受能力的影响，往往还未找到有效的化疗方案，其身体状况或家庭经济承受能力已经不允许其再进行尝试，最终导致治疗的失败，患者家庭人财两失。合理化疗是有效抑制肿瘤发展，提高患者生命质量、延长生存期的重要途径。然而，目前这种以肺癌患者作为“小白鼠”的化疗方案选择已经不能满足临床治疗需求，广大医务工作者及科研人员已经深刻认识其弊端，致力于寻找有效的体外药敏筛选模型和方法，替代患者进行试药。

肿瘤类器官又被称为“癌症替身”、“类肿瘤”等，主要是利用患者的肿瘤组织进行体外3D培养用于模拟体内肿瘤组织的生物学特征。而癌前病变(如上皮内瘤变)来源的类器官则主要用于模拟肿瘤的发生发展以及分析肿瘤相关的组学改变。肿瘤类器官高度概括了来源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的异质性，因而具有转化医学的应用价值，可用于功能性的测试如进行高通量的药物筛选，甚至个体化治疗方案的制定。

类器官技术研究文章最早发表于2009年，荷兰CLEVERS团队^[1]将小鼠肠段中分离出的隐窝细胞培养在含有EGF、Noggin和R-Spondin的三维matrigel中，形成类似于肠的微型结构，即隐窝-绒毛复合体。该技术被Science杂志评选为2013年科技发展的十大突破之一^[2]。此后，类器官技术逐渐引起学术界的关注，成为研究热点。类器官技术被NatureMethod杂志评为2017年生命科学领域的年度技术(Method of the Year 2017)。

2018年，VLACHOGIANNIS等^[3]利用参加4项Ⅰ/Ⅱ期临床试验的71名转移性结肠癌和胃食管癌患者建立了类器官库。试验共纳入21对肿瘤和肿瘤类器官的药敏数据，用药方案包括紫杉醇单药、5-Fu/顺铂双药、EGFR靶向治疗等。综合这21对患者/肿瘤类器官药敏数据，研究者计算出了类器官预测临床药敏的统计结果：敏感性100％，特异性93％，阳性预测值88％，阴性预测值100％。该研究首次证实肿瘤类器官药敏与患者真实药敏具有高度一致性，表明肿瘤类器官可以用于肿瘤患者的用药指导。

如今，类器官在肿瘤研究中的应用已经如火如荼的开展起来，主流肿瘤的类器官均被成功建立。但是目前关于肺癌类器官的研究相对较少，2017年和2018年分别有一篇关于肺癌类器官建立的文献报道。Finnberg等人^[4]利用气液界面培养系统(air-liquidinterface culture system，ALI)建立了两例肺鳞状细胞癌和一例肺腺癌的类器官，虽然3例肺癌样本的类器官模型均建立成功，但是2例肺鳞癌患者肿瘤组织建立的类器官生长缓慢，两次传代后细胞凋亡，相反的1例肺腺癌患者肿瘤组织建立的类器官可以增殖传代至第8代，并且可以用于药物筛选实验。ZhangZL等人^[5]运用3D肿瘤类器官培养系统成功建立了3例非小细胞肺癌的肿瘤类器官，采用此种方法可使肿瘤原代细胞长期扩增培养(＞120天)，其细胞学特征和标志物与原发肿瘤一致。上述两篇文章采用了两种不同的类器官建立的3D培养体系。前者采用ALI技术，需引入外源性的matrigel；后者直接将细胞养在超低吸附的96孔细胞培养板中，虽无需引入外源的机制，但是类器官随机形成，其大小和形状不均一。两篇文章建立类器官的目的均涉及药物筛选和药效评价，但肿瘤类器官的大小和形状会影响药物的作用，势必影响实验结果的准确性。

参考文献：

[1]Abo A,Stange D E,Clevers H,et al.Single Lgr5 stem cells buildcrypt -villus structures in vitro without a mesenchymal niche[J].Nature,2009,459(7244):262-265.9.

[2]Breakthrough of the year 2013.Notable developments[J].Science,2013,342(6165):1435-1441.DOI:10.1126/science.342.6165.1444.

[3]VLACHOGIANNIS G,HEDAYAT S,VATSIOU A,et al.Patientderived organoidsmodel treatment response of metastatic gastrointestinal cancers[J].Science,2018,359(6378):920-926.DOI:10.1126/science.aao2774.

[4]Finnberg N K,Gokare P,Lev A,et al.Application of 3D tumoroidsystems to define immune and cytotoxic therapeutic responses based ontumoroid and tissue slice culture molecular signatures[J].Oncotarget,2017,8(40):66747.

[5]Zhang ZL,Wang HQ,Ding QF,et al.Establishment of patient-derivedtumor spheroids for non-small cell lung cancer.PLOS ONE,2018.

发明内容

本发明的目的是针对目前肺肿瘤类器官培养中无专用培养基，培养效果不好的缺陷，提供一种肺肿瘤类器官专用培养基。本发明的另一目的是针对肺肿瘤类器官培养方案的局限性，提供一种肿瘤类器官无支架3D培养方法。本发明中的“肺肿瘤”是指肺部恶性肿瘤，即肺癌。

本发明提供的肺肿瘤类器官专用培养基，由以下浓度或体积百分比的成分组成：

表1：肺肿瘤类器官专用完全培养基组成

本专利所发明的肺癌类器官无支架3D培养所用的培养基成分作用如下：胎牛血清是一种天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成份；双抗抑制细菌生长，避免细胞污染；EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，具有很强的生理活性，如能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；FGF-10是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类物质；B-27和N-2是无细胞血清培养添加剂；Noggin是一种重要的胚胎蛋白，在胚胎背腹轴模式形成、神经管发育及神经诱导方面有重要功能；Y-27632为ROCK抑制剂，具有防止细胞凋亡的作用；A83-01为TGF-β1受体抑制剂，加入培养基发挥维持细胞干性，抑制细胞分化的作用；SB202190是一种有效的p38 MAPK抑制剂；HEPES是一种缓冲液，用于维持培养基pH的稳定；GlutaMAX：其含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽，可以防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累；IGF-1可以促进细胞增殖，延长细胞寿命，促进重组蛋白质的表达；氢化可的松可促进表皮细胞的生长；N-acetylcysteine是一种抗氧化剂，可促进肺癌细胞增殖；Advanced DMEM-F12为基础培养基。

上述培养基成份为实验获取最佳组成，减少一种或几种成分后，细胞3D培养成球后的增长速度减慢，甚至出现细胞坏死和球体崩解，无法实现长期培养。

本发明提供的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，是将经消化分离的肿瘤细胞加入低血清培养基重悬，差速贴壁法进行细胞纯化，纯化后的细胞接种至培养器皿中，加入上述的肿瘤类器官专用培养基，每天更换一次专用培养基，培养至形成类器官。所述低血清培养基的血清体积含量低至0.5％-1.5％。

可选或优选的，上述肺肿瘤类器官无支架3D培养方法中，所述肿瘤细胞的分离消化方法是取肿瘤组织冲洗干净，剪成块，加入消化液进行消化，获得分离的肿瘤细胞；所述消化液由以下体积含量的成分组成：0.05-0.2％的Ⅰ型胶原酶，0.05-0.2％Ⅳ型胶原酶，Hank's溶液余量。

胶原酶是在细胞原代培养取材的时候用于降解细胞外基质成分，分离细胞。不同的组织类型需要不同的胶原酶。本研究所选用的组合为发明人根据原代细胞肿瘤的性质探索设定的，消化速度快，30分钟即可完成组织消化，极大减轻肿瘤组织消化过程对肿瘤原代细胞造成的损伤。

可选或优选的，上述肺肿瘤类器官无支架3D培养方法中，所述肿瘤细胞为原代肿瘤细胞，或传代扩增后的肿瘤细胞；

传代扩增的方法为：

①原代肿瘤细胞加入无血清培养基重悬，接种至培养器皿中，补充无血清培养基后在培养箱中培养；每2-3天更换一次无血清培养基，培养至贴壁细胞数量达到80％以上时，去除无血清培养基，加入TrypLE细胞消化液后轻轻晃动使其均匀覆盖孔底，再除去消化液，培养箱中孵育1-2min，然后在显微镜下观察细胞状态，发现其出现明显收缩时加入无血清培养基终止消化；

②终止消化的细胞转移至新培养器皿，重复步骤①的过程进行传代扩增，传代不超过10代。

可选或优选的，上述肺肿瘤类器官无支架3D培养方法中，所述原代肿瘤细胞来源于肿瘤患者手术切除或活检获取的肿瘤组织，该肿瘤患者未接受过任何抗肿瘤治疗。

可选或优选的，上述肺肿瘤类器官无支架3D培养方法中，所述肿瘤细胞由新鲜肿瘤组织或冻存复苏的肿瘤组织制备而成；

新鲜肿瘤组织的处理方法：新鲜肿瘤组织切成1.5-2.5cm³的块状，去除组织上的血块、坏死组织、脂肪及结缔组织，用预冷的含抗生素PBS溶液多次冲洗；

冻存复苏的肿瘤组织的处理方法：取出装有肿瘤组织的冻存管，立即放入37℃水浴加热，冻存液完全融化后立即转移至15mL离心管，加入含抗生素PBS溶液洗涤至PBS颜色清透；

所述含抗生素PBS溶液中含有500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素；或含有500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素、0.25-1μg/mL两性霉素B和1-5μg/mL甲硝唑。本专利优选含500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素的PBS溶液。

可选或优选的，以上任一所述肿瘤类器官无支架3D培养方法中，培养条件为温度37℃，CO₂体积浓度为5％。

可选或优选的，以上任一所述肺肿瘤类器官无支架3D培养方法中，纯化后的肿瘤细胞接种至培养器皿时，肿瘤细胞的接种密度为1000-12000cells/孔。更优选2000-5000cells/孔。初始细胞量太小不利于细胞聚集形成球体，而过大会影响细胞球的成球及生长，超过12000cells/孔的细胞密度接种时，易出现细胞求中心坏死，导致类器官成球失败。

可选或优选的，以上任一所述肿瘤类器官无支架3D培养方法中，所述肿瘤细胞为肺癌原代肿瘤细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

肿瘤只有在稳定生长状态下，药物敏感性测试才能准确预测体内药效，本发明的肺肿瘤类器官专用培养基可实现肿瘤类器官的快速生成，24h之内即可形成球体，并且可以长期稳定培养；且相较于传统2D培养，类器官3D细胞球内部细胞表现更强的细胞干性，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性；本发明无支架3D培养方法可以精准控制培养类器官球的生成，形成的肿瘤类器官细胞球球形规则，且大小均一可控，是体外药敏筛选的理想模型，使其在预测精准度上有质的飞越。

附图说明

图1为实施例1本专利建立类器官体系与ZhangZL等人建立的肿瘤类器官培养体系效果对比图，参考文献：Zhang ZL,Wang HQ,Ding QF,et al.Establishment of patient-derived tumor spheroids for non-small cell lung cancer.PLOS ONE,2018；

图2为实施例1原代肺癌细胞及类器官细胞球表面抗原荧光鉴定图(A：类器官3D细胞球CD133免疫荧光图；B：类器官3D细胞球TPA免疫荧光图；C：类器官3D细胞球CD133和TPA复合图；D：原代肺癌细胞2D培养CD133免疫荧光图；E：原代肺癌细胞2D培养TPA免疫荧光图)；

图3为实施例3A549细胞类器官细胞球形成过程照片。

具体实施方式

含抗生素的PBS溶液，抗生素浓度：500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素。

实施例1肺癌原代细胞类器官的制备

一、肺癌患者肿瘤组织获取

用于分离原代肿瘤细胞的组织主要来源于肺癌患者手术切除或者活检获取的肿瘤组织标本。要求患者未接受过任何抗肿瘤治疗。

对于手术切除的肿瘤标本，应从瘤体生长活跃、无坏死变性的部位取材，要剔除癌旁组织，因癌旁组织含所需肿瘤细胞较少，细胞活性较差，降低细胞的成活率。

(1)新鲜组织获取及处理方法：

手术取下的新鲜组织块或者活检获取的新鲜组织标本应立即处理分离，由于组织刚离开人体，细胞的形态、活力及代谢特点与体内相似，并且细胞内基因能进行高保留，无论是药敏实验、癌变分子机制研究等，最能反应体内癌细胞特点。并且新鲜组织提取细胞活性好，易于贴壁和增殖。

根据肿瘤大小切取1.5-2.5cm³大小的肿瘤组织，将组织标本上的血块、坏死组织、脂肪以及结缔组织等尽量去除干净，然后用预冷的含抗生素的PBS溶液多次冲洗。冲洗后的组织置于培养基(含1％青霉素/链霉素)中冰盒转移至实验室即刻进行原代肿瘤细胞分离。

(2)冻存组织处理方法：

若是由于受取材和培养条件的限制，无法立即对新鲜组织进行分离培养，可对组织进行液氮冻存。

液氮冻存的组织预处理方法如下：

①用含抗生素的PBS溶液冲洗好的新鲜组织，用组织剪将组织块剪至1mm³左右大小，越碎越好。

②向组织块中加入预冷冻存液，重悬后分装到冻存管中，采用梯度降温冻存盒降温后，冻存于液氮中保存。

上述过程在尽量短的时间内完成。

③冻存液的配制方法：10％DMSO+90％FBS。

二、原代癌细胞分离、纯化与接板

(1)癌细胞分离

新鲜组织细胞分离：冲洗干净的1mm³左右大小的新鲜癌组织块，根据组织量加入2倍体积的消化液(0.05-0.2％Ⅰ型胶原酶+0.05-0.2％Ⅳ型胶原酶+Hank's溶液)，充分混匀后放入细胞培养箱中37℃消化30分钟，每隔10分钟观察一次，并用力振荡，30分钟后即可观察到组织呈弥散状态，可进行收集细胞。

冻存组织细胞分离：从液氮罐中取出保存的癌组织块的冻存管，立即放入37℃水浴锅中水浴加热，待观察到其中的冻存液完全融化时，立即转移至15mL离心管，并加入5mL含抗生素的PBS洗涤2-3次，待PBS颜色清透时即可。然后按照新鲜组织分离的方式进行细胞分离。

(2)原代肿瘤细胞的纯化及接种培养生成类器官

表2：肺癌原代肿瘤细胞类器官培养体系专用培养基组成

方法一：直接接板进行类器官培养

分离的原代肿瘤细胞悬液1000rpm/min离心5分钟，除上清，收集沉淀，加入适量低血清培养基重悬，利用差速贴壁法进行细胞纯化。纯化后的细胞进行接种，按照5×10³个/mL的密度接种至超低吸附96孔板U形培养板中(SUMITOMO BAKELITE公司，或其他同类型市售产品)，每孔补充表2的专用培养基100μL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成类器官球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，5-6天之后达到稳定，体积开始增大。每天更换一次完全培养基。

方法二：扩增后进行类器官培养

如需要大量原代肿瘤细胞，可以对分离的原代肿瘤细胞进行纯化及扩增培养，达到需要的用量后进行类器官的形成和培养。

原则上肺癌原代肿瘤细胞纯化后传代不超过10代，第3-5代的肿瘤细胞用于类器官的生成效果最佳。

扩增后的原代肿瘤细胞进行计数，计数后的原代肿瘤细胞悬液按一定密度接种到自制96孔板中，接种密度1000-12000cells/孔，推荐2000-5000cells/孔。细胞接种后加入表2的专用培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成类器官球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，5-6天之后达到稳定，体积开始增大。每天更换一次完全培养基。

此外，完全培养基中，GlutaMAX、胰岛素样生长因子(IGF-1)和氢化可的松的作用十分显著，缺少一种或者几种，类器官细胞球均很快出现生长停滞，并随着培养时间的增加，出现细胞坏死，球体崩解现象。

三、肺癌原代肿瘤细胞类器官的表面抗原鉴定

对培养稳定的类器官细胞球进行TPA(组织多肽抗原，肺癌中的首要肿瘤标志物)和肿瘤干细胞标志物CD133的表达分布鉴定。

鼠抗人单克隆TPA抗体购自EastCoast Bio公司；CD133兔抗人多克隆抗购自Abcam公司；二抗驴抗鼠594抗体、驴抗兔488抗体购自Southern Biotech公司；DAPI购自碧云天公司。

免疫荧光鉴定的简要过程如下：

(1)取出孔板，吸出上层培养基，用PBS洗涤细胞球；

(2)固定：室温下用4％多聚甲醛固定细胞球2h，随后PBS洗涤；

(3)透化：室温下用0.3％Triton X-100透化细胞球3h，随后PBS洗涤；

(4)封闭：室温下用5％BSA/PBS封闭细胞球3h，随后PBS洗涤；

(5)一抗孵育：用0.1％BSA/PBS按照1：100比例稀释兔抗CD133、鼠抗TPA抗体，4℃孵育细胞球过夜，随后PBS洗涤；

(6)二抗孵育：用0.1％BSA/PBS按照1：2000比例稀释驴抗鼠594抗体、驴抗兔488抗体，室温下避光孵育细胞球4h，随后PBS洗涤；

(7)成像：用双光子显微镜成像(物镜20×)。结果如图2所示。相较于传统的原代肺癌细胞2D培养，从3D细胞球免疫荧光结果来看，TPA抗原荧光信号分布于球体表面，CD133抗原荧光信号则蔓延至球体内部，且信号更强，表现更强的干细胞特性。这种结构特性，也可能是肿瘤类器官3D培养相较于肿瘤细胞2D培养药敏筛选结果更可靠的原因之一。

四、药敏筛选

比较肺癌原代细胞体外2D常规培养和采用本专利培养体系建立的肺癌原代细胞类器官3D细胞球对药物的敏感性。普通96孔板(平底)和类器官培养96孔板的接种密度均为：2500cells/孔；类器官培养96孔板接种后离心3min，1000rpm。化疗药选择治疗肺癌的一线用药顺铂和吉西他滨，给药浓度依据其血浆峰值浓度(PPC)进行设定，顺铂为6.3μg/mL，吉西他滨为25ug/mL。两种药物的给药浓度分别为0％PPC、25％PPC、50％PPC、100％PPC、200％PPC、400％PPC。分别再给药第3天和第7天进行细胞ATP测定，计算药物对细胞活性的抑制率，结果见表2(给药第7天)。

表2给药7天的细胞活性抑制率(％)

上表数据显示，相较于常规2D培养，肺癌原代细胞类器官3D培养的细胞球对药物具有更高的耐受性。肺癌原代细胞分离培养为类器官3D细胞球后，其球体结构更接近于体内癌组织，细胞球不同位置的细胞表现不同的肿瘤标志物强度，且细胞球内部的肿瘤细胞表现更强的细胞干性。因此，用该肺癌原代细胞类器官3D培养建立的细胞球进行药敏筛选，其结果更具有合理性，可为临床提供更为准确、科学的用药参考依据。

实施例2原代肿瘤细胞的冻存

实施例1中新鲜或者冻存复苏的原代肿瘤细胞，如果暂时不需要制备成类器官，在培养至贴壁细胞数量达到80％以上且生长状态良好时，可对其进行冻存。

吸去无血清培养基，随后每孔加入1mL TrypLE细胞消化液，轻轻晃动20s，使之均匀覆盖于孔底；20s后吸去TrypLE细胞消化液，将6孔板放入培养箱中孵育1-2min；然后在显微镜下观察细胞状态，发现其出现明显收缩时即可加入2mL无血清培养基终止消化；用移液枪轻轻吹打使细胞脱落(注意尽量减少气泡的产生)；而后将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm/min离心5min，去上清，收集细胞沉淀，根据沉淀量加入冻存液(10％DMSO+90％FBS)，用移液枪吹打均匀，然后转移至冻存管中；

冻存管采用梯度降温法或直接采用梯度降温盒逐级降低温度，最终长期保存于液氮中。

实施例3 A549细胞类器官的制备

将培养到80％融合的A549细胞消化，计数后按一定的比例接种到超低吸附96孔板U形培养板中96孔板中，接种密度1000-10000cells/孔，推荐2000-5000cells/孔。细胞接种后加入表2的专用培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成类器官球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，5-6天之后达到稳定，体积开始增大。每天更换一次完全培养基。

图3为A549细胞形成的类器官及培养过程形态变化，图中可以看出接种后30min细胞已经聚集，接种1天后聚集程度增加，接种10天后形成较为紧实的球形类器官。

本研究所建立的类器官培养体系不仅适用于肺癌原代肿瘤细胞，同样适用于肺肿瘤相关细胞系，以A549细胞为例进行介绍。将培养到80％融合的A549细胞消化，计数后按一定的比例接种到自制96孔板中，接种密度1000-10000cells/孔，推荐2000-5000cells/孔。细胞接种后加入完全培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成类器官球，之后细胞球开始组装，体积稳定增大。每天更换一次完全培养基。图3为A549细胞形成的类器官及培养过程形态变化。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肺肿瘤类器官专用培养基，其特征在于：由以下浓度或体积百分比的成分组成：

Advanced DMEM/F12补充至所需体积。

2.一种肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：是将经消化分离的肿瘤细胞加入低血清培养基重悬，差速贴壁法进行细胞纯化，纯化后的肿瘤细胞接种至培养器皿中，加入权利要求1所述的肿瘤类器官专用培养基，每天更换一次专用培养基，培养至形成类器官。

3.根据权利要求2所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：所述肿瘤细胞的分离消化方法是取肿瘤组织冲洗干净，剪成块，加入消化液进行消化，获得分离的肿瘤细胞；所述消化液由以下体积含量的成分组成：0.05-0.2％的Ⅰ型胶原酶，0.05-0.2％Ⅳ型胶原酶，Hank's溶液余量。

4.根据权利要求2所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为原代肿瘤细胞，或传代扩增后的肿瘤细胞；

传代扩增的方法为：

①原代肿瘤细胞加入低血清培养基重悬，接种至培养器皿中，补充低血清培养基后在培养箱中培养；每2-3天更换一次低血清培养基，培养至贴壁细胞数量达到80％以上时，去除培养基，加入TrypLE细胞消化液后轻轻晃动使其均匀覆盖孔底，再除去消化液，培养箱中孵育1-2min，然后在显微镜下观察细胞状态，发现其出现明显收缩时加入低血清培养基终止消化；

②终止消化的细胞转移至新培养器皿，重复步骤①的过程进行传代扩增，传代不超过10代。

5.根据权利要求4所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：所述原代肿瘤细胞来源于肿瘤患者手术切除或活检获取的肿瘤组织，该肿瘤患者未接受过任何抗肿瘤治疗。

6.根据权利要求2所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：所述肿瘤细胞由新鲜肿瘤组织或冻存复苏的肿瘤组织制备而成；

新鲜肿瘤组织的处理方法：新鲜肿瘤组织切成1.5-2.5cm³的块状，去除组织上的血块、坏死组织、脂肪及结缔组织，用预冷的含抗生素PBS溶液多次冲洗；

冻存复苏的肿瘤组织的处理方法：取出装有肿瘤组织的冻存管，立即放入37℃水浴加热，冻存液完全融化后立即转移至15mL离心管，加入含抗生素PBS溶液洗涤至PBS颜色清透；

所述含抗生素PBS溶液中含有500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素；或含有500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素、两性霉素B和甲硝唑。

7.根据权利要求2-6任一所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：培养条件为温度37℃，CO₂体积浓度为5％。

8.根据权利要求2-6任一所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：纯化后的肿瘤细胞接种至培养器皿时，肿瘤细胞的接种密度为1000-12000cells/孔。

9.根据权利要求2-6任一所述的肺肿瘤类器官无支架3D培养方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为肺癌原代肿瘤细胞。

10.权利要求2-9任一方法获得的肺肿瘤类器官。