CN112680398A - 用于可室温保存类器官的培养基及维持类器官生长活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种用于可室温保存类器官的培养基及维持类器官生长活性的方法。本发明用于可室温保存类器官的培养基包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、抗生素、Matrigel、添加剂、TGF‑β抑制剂和Wnt信号通路激活剂，在用于可室温保存类器官的培养基中，所述Matrigel的体积分数为20％‑25％。本发明的培养基可以提高类器官保存的生物活性，并且本发明维持类器官生长活性的方法可以保证类器官在室温下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，将类器官转移至细胞培养箱内活性可以快速恢复，且继续生长，不会出现解离现象。
Description
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种用于可室温保存类器官的培养基及维持类器官生长活性的方法。
背景技术
类器官是将具有干性潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的部分组织，类器官能准确模拟体内上皮结构并能长期传代培养。这些模型的目的是为了从分子水平到细胞、组织、器官或整个有机体来阐述身体的功能。目前已成功建立了人与鼠胃、小肠、肝脏、胰腺、前列腺等类器官模型，这些类器官模型均能进行长期培养，且具有稳定的表型和遗传学特征。类器官的培养可以建立可靠的疾病模型，也可以作为筛选药物的新途径。类器官的培养不仅开发了一种检测细胞介导和药物引起的疾病模型新方法，也开辟了基因和干细胞治疗疾病的新途径。
目前，有关于类器官的运输并无明确的方法，大多以普通细胞的形式进行运输。现有细胞运输的方法主要有以下两种：(1)液氮或干冰冻存法运输。该方法是将细胞至于盛有干冰或是液氮的塑料泡沫盒中运输，一般可以保存7-8天。(2)活细胞运输。该方法适用于处在对数生长期早期或是中期且生长状态良好的细胞，将成旧的培养基除去，加入新鲜的培养基至培养瓶的瓶颈处，拧紧瓶盖，并用胶带密封，用棉花等做减震处理再进行运输。但是采用液氮或干冰的冷冻运输法成本过高，且细胞冻存和复苏分别涉及到细胞内外液体结晶和细胞内外晶体化为液体的过程，会不可避免地造成细胞损伤，鉴于类器官的多细胞构成，这种损伤更甚，因此会使得冻存复苏后的活性无法估计。而活细胞运输法只适合短途运输，当细胞长满培养瓶或是培养皿后，细胞的状态会随时间的增加而不断变差；并且细胞运输可维持细胞活性的时间很短，原则上需要不超过2天的即时处理。目前关于类器官的培养基配方也尚无太多报道，关于维持类器官生长活性的方法的研究及报道也较少。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于可室温保存类器官的培养基及维持类器官生长活性的方法，本发明的培养基可以提高类器官保存的生物活性，并且本发明维持类器官生长活性的方法可以保证类器官在室温下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，将类器官转移至二氧化碳培养箱内活性可以快速恢复，且继续生长，不会出现解离现象。
本发明提供了一种用于保存类器官的培养基，为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种用于可室温保存类器官的培养基，包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、抗生素、Matrigel、添加剂、TGF-β抑制剂和Wnt信号通路激活剂，在用于可室温保存类器官的培养基中，所述Matrigel的质量分数为20％-25％。
本发明人经过大量研究及试验配制出特定的培养基配方，可以维持类器官的生长活性，由试验例一和试验例二观察本发明培养基培养小鼠肝脏类器官在室温环境中培养24小时的生物活性变化，当Matrigel的质量分数为20％-25％时，类器官的生长活性不会下降，生长较好；当类器官细胞长满培养瓶或是培养皿后，细胞的状态不会随时间的增加而不断变差。
本发明在不影响类器官活性的情况下，可以在室温条件下长时间保存类器官，当类器官运输到达异地后，通过直接置于细胞培养箱培养，即可恢复类器官的生长。
其中，添加HEPES促进可以类器官的生物活性，并且还能防止培养基pH波动对细胞生长不利的影响，由试验例二可知，HEPES对类器官生长活性的保存效果明显，有效保存或者提高了类器官的生长活性。
本发明添加TGF-β抑制剂，其作用是抑制细胞的凋亡信号，以保持类器官长期的生长维持。
本发明添加Wnt信号通路激活剂，其作用是促进和维持类器官形成的相关通路激活，以保证类器官恢复的速度和状态。
本发明的培养基通过DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、抗生素、Matrigel、添加剂、TGF-β抑制剂和Wnt信号通路激活剂等材料复配，使得类器官的保存效果更佳，其类器官的生长活性也较佳。
作为本发明所述用于可室温保存类器官的培养基的优选实施方式，所述添加剂包括B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸、Nicotinamide、[Leu15]-gastrin I human、生长因子、Forskolin中的至少一种。
作为本发明所述用于可室温保存类器官的培养基的优选实施方式，所述Wnt信号通路激活剂包括R-spondin-1。
作为本发明所述用于可室温保存类器官的培养基的优选实施方式，所述Matrigel的质量分数为20％或25％。
在本发明的技术方案中，当培养基中Matrigel的质量分数为20％或25％时，可以长期维持类器官的生长活性，尤其当Matrigel的质量分数为20％时，长期维持类器官生长的效果更为明显。
作为本发明所述用于可室温保存类器官的培养基的优选实施方式，所述添加剂为B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸、Nicotinamide、[Leu15]-gastrin I human、生长因子和Forskolin。
作为本发明所述用于可室温保存类器官的培养基的优选实施方式，所述生长因子包括EGF、FGF10和HGF。
在本发明的技术方案中，B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸和Nicotinamide作为类器官生长的必要补剂；[Leu15]-gastrin I human和Forskolin可以维持长时间的类器官活性；EGF、FGF10和HGF可以促进类器官的生长。
本发明的培养基中的组分相互协同，使得在不影响类器官活性的前提下，本发明的培养基可以长时间在室温条件下保存类器官，并且当类器官异地运输后，通过直接置于细胞培养箱培养，即可恢复类器官的生长。
本发明还提供了一种维持类器官生长活性的方法，包括以下步骤：
S1.类器官的预处理：重悬类器官，加入Matrigel混匀得类器官悬液；
S2.类器官的培养：在室温下，使用上述用于保存类器官的培养基培养步骤S1制备的类器官悬液，然后进行孵育；
S3.密封与保护：使用孔板封膜密封上述步骤S2孵育的类器官悬液，然后转入浓度为5％的二氧化碳培养箱继续培养。
在本发明的技术方案中，由试验例一，类器官在室温环境下，无孔板封膜，培养24小时，类器官的生长活性下降约为初始的33％；说明使用孔板封膜密封类器官悬液，可以提高类器官的生长活性，在室温培养24小时，类器官的生长活性依然保持在原水平的96％-125％。
并且类器官经过处理后可以在室温环境下培养72小时，其类器官生长活性和形态不受影响；当类器官转移到培养箱后，类器官在第2天可以快速恢复，并继续生长3天而不会解离；在不更换培养基或传代的情况下，类器官可以在转到培养后连续生长5天，在第5天时，类器官会破碎解离，更换培养基即可延长类器官的生存时间。
在培养箱中的生长期间，类器官的直径会在第3天达到最大，且主要集中在100-200μm，然后类器官会出现解离现象。
作为本发明所述维持类器官生长活性的方法的优选实施方式，所述步骤S2中孵育时间为15-20min。
作为本发明所述维持类器官生长活性的方法的优选实施方式，所述步骤S2中使用上述用于保存类器官的培养基培养步骤S1制备的类器官悬液3-5天。
使用本发明的培养基培养类器官悬液3-5天，保持了类器官的生长活性，提高了类器官的数量。
作为本发明所述维持类器官生长活性的方法的优选实施方式，所述步骤S1中将混合好的类器官悬液加入至96孔板进行孵育。
本发明在96孔板室温保存的另一个意义在于，可以直接用于药物筛查产品，即作为药筛板直接加药并使用，可使得没有条件培养类器官的单位无需培养类器官，直接药物处理，得到类器官相关数据，作为一次性的快速的实验试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种用于可室温保存类器官的培养基，组分简单，且组分相互协同，使得在不影响类器官活性的前提下，本发明的培养基可以长时间在室温条件下保存类器官，有效保持了类器官的生长活性，提高了类器官的数目；
2、本发明还提供了一种维持类器官生长活性的方法，可以保证类器官在室温下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，通过孔板封膜密封类器官悬液，可以提高类器官的生长活性，在室温培养24小时，类器官的生长活性依然保持在原水平的96％-125％，并且当类器官转移到培养箱后，类器官在第二天可以快速恢复，并继续生长3天而不会解离。
附图说明
图1为实施例1的培养基在室温环境中培养24小时后小鼠肝脏类器官的生物活性图；
图2为实施例2的培养基在室温环境中培养24小时后小鼠肝脏类器官的生物活性图；
图3为在实施例1的培养基条件下，100％，50％，25％三个密度的类器官在室温保存过程中活性变化情况图；
图4为实施例1或实施例3的培养基在6小时室温保存或6小时37度保存下对小鼠肝脏类器官(20000/孔)生物活性的影响图I；
图5为实施例1或实施例3的培养基在6小时室温保存或6小时37度保存下对小鼠肝脏类器官(10000/孔)生物活性的影响图II；
图6为实施例1或实施例3的培养基在6小时室温保存或6小时37度保存下对小鼠肝脏类器官(5000/孔)生物活性的影响图III；
图7为小鼠肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中培养对类器官的数量及直径的影响图I；
图8为小鼠肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中培养对类器官的数量及直径的影响图II；
图9为在室温静置处理情况下，不同浓度的类器官在室温下保存不同天数后活性的检测图；
图10为在室温摇床晃动处理情况下，不同浓度的类器官在室温下保存不同天数后活性的检测图；
图11为试验例五中人肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中对类器官的数量及直径的影响图I；
图12为试验例五中人肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中对类器官的数量及直径的影响图II。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，培养基中成分的来源与型号如下表1所示。
表1
| 成分 | 来源 | 型号 | 储存温度 |
| Advanced DEME/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (4℃) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | (-20℃) |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | (4℃) |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | (-20℃) |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | (-20℃) |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | (-20℃) |
| N-乙酰-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | (-20℃) |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | (-20℃) |
| [Leu15]-gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | (-20℃) |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | (-20℃) |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | (-20℃) |
| HGF | Peprotech | 100-39 | (-20℃) |
| Forskolin | SelleckChem | S2449 | (-20℃) |
| A83-01 | sigma-Aldrich | SML0788 | (-20℃) |
| R-spondin-1 | Peprotech | 120-38 | (-20℃) |
| Matrigel | Corning | 356231 | (4℃) |
实施例1-3、一种用于可室温保存类器官的培养基
本发明用于可室温保存类器官的培养基的成分如表2所示。
表2
实施例4、一种维持类器官生长活性的方法
一种维持类器官生长活性的方法，包括以下步骤：
S1.类器官的预处理：在生物安全柜内将24孔板中肝脏类器官的培养基吸弃，每孔加入900μl提前预冷的PBS缓冲液，在24孔板中用1ml枪吸取预冷的PBS缓冲液将含类器官的基质胶吹散，并转移至1个15ml离心管中，加入预冷的PBS缓冲液定容至10ml，333g，0℃离心5分钟；吸弃上清液，加入胰蛋白酶消化成为单个细胞，加入0.2ml FBS溶液中止消化，333g，0℃离心5分钟后，吸弃上清液，用500μl培养基重悬沉淀，通过扩增培养基稀释重悬后的类器官，类器官被分为100％，50％，25％等三个密度，加入等体积的Matrigel混匀得类器官悬液，将混合好的类器官悬液加入96孔板，体积为10μl，放于培养箱中固定15分钟；
S2.类器官的培养：在室温下，向相应的96孔板中沿壁加入实施例1-3的用于可室温保存类器官的培养基分别培养步骤S1制备的类器官悬液，然后置于培养箱中孵育，孵育15分钟；
S3.密封与保护：将孔板封膜膜铺在96孔板上，以密封上述步骤S2孵育的类器官悬液，用锡箔纸包裹96孔板，避免有害光线的照射，然后转入浓度为5％的二氧化碳培养箱继续培养。
其中扩增培养基的组成为：45.827ml Advanced DEME/F12、395μl(100X)Glutamax、895μl(1M)HEPES、395μl(100X)Penicillin/streptomycin、790μl(50X)B27、395μl(100X)N2、39.5μl(1M)N-乙酰-半胱氨酸、987.5μl(400mM)Nicotinamide、39.5μl(10μM)[Leu15]-gastrin I human、39.5μl(50μg/ml)EGF、39.5μl(100μg/ml)FGF10、39.5μl(25μg/ml)HGF、39.5μl(10mM)Forskolin、39.5μl(5mM)A83-01和39.5μl(500μg/ml)R-spondin-1。
实施例5、一种维持类器官生长活性的方法
与实施例4相同，区别仅在于，实施例5不含有步骤S3，其余参数与制备方法相同。
试验例一、小鼠肝脏类器官在室温环境中培养24小时的生物活性变化
在实施例1和实施例2不同的培养基条件下，采用实施例5的培养方法观察不同培养基对小鼠肝脏类器官的影响。
采用CellTiter-Glo 3D发光法细胞活力检测试剂盒(该试剂盒通过对ATP的定量来测定3D培养细胞的细胞活力)测量步骤S2中的类器官悬液在0小时的生物活性；采用实施例1或实施例2的用于可室温保存类器官的培养基分别培养类器官24小时后，再次测量类器官悬液的生物活性，结果见表3、图1和图2。
表3
结果：类器官在室温环境下无孔板封膜，培养24小时后，类器官的生长活性下降约为初始的33％；其次类器官的生长活性下降比例与类器官的密度没有明显关系，均成比例下降；培养基中含有Matrigel的比例(20％和25％)，对类器官生长活性下降并无明显关系。
试验例二、在不同时间内，本发明培养基对提高肝脏类器官保存的生物活性的影响。
1、在本发明实施例1培养基的条件下，采用实施例4的培养方法观察三个密度的类器官在在6小时室温保存或6小时37度保存过程中活性变化情况。
并且用CellTiter-Glo 3D发光法细胞活力检测试剂盒测试在实施例2培养基的条件下96孔板内类器官在0小时、2小时、4小时、6小时、12小时和24小时的的生物活性。
结论：参照图3，在实施例1培养基的条件下，24小时内，类器官无论密度如何，活性都可保持。
2、在实施例1或实施例3培养基的条件下，采用实施例4的培养方法观察不同数量类器官(20000/孔、10000/孔和5000/孔)活性变化情况。
参照图4-6，从实施例2及实施例3的培养基对肝脏类器官生长活性的影响结果显示，实施例2(含有HEPES)的培养基对类器官生长活性的保存效果明显，有效保存或者提高了类器官的生长活性。
并且本发明使用孔板封膜可以有效保存类器官的生长活性，在室温培养24小时，类器官的生长活性依然保持在原水平的96％-125％。
试验例三、小鼠肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中培养对类器官的数量及直径的影响
在含有实施例1的培养基条件下，采用实施例4的培养方法培养类器官，将步骤S3培养好的类器官悬液分为两组，一组放入摇床40rpm室温摇动保存，一组置于生物安全柜中室温保存。
其中，将室温保存24小时不震荡的96孔板在24小时后放入培养箱作为A1组；将室温保存24小时震荡(40rpm)的96孔板在24小时后放入培养箱作为A2组；
将室温保存48小时不震荡的96孔板在48小时后放入培养箱作为B1组；将室温保存48小时震荡(40rpm)的96孔板在48小时后放入培养箱作为B2组；
将室温保存72小时不震荡的96孔板在72小时后放入培养箱作为C1组；将室温保存72小时震荡(40rpm)的96孔板在72小时后放入培养箱作为C2组。
将上述的孔板放入培养箱后，每天拍照并分别记录直径大于100μm以及小于100μm的类器官的数量和直径，观察记录持续6天。结果见图7和图8。
其中，类器官在同一天处理放置于室温，而后根据实验设计于不同室温放置小时数开始放置入培养箱，在放入培养箱后7天中，每天在镜下计算类器官数。
参照图7和图8，类器官经过处理后可以在室温环境下培养72小时，其生长活性和形态不受影响；是否震荡会对类器官生长产生不同影响。
类器官转移到培养箱后，类器官在第二天可以快速恢复，并继续生长3天而不会解离。在不更换培养基或传代的情况下，类器官可以在转到培养后连续生长5天，在第5天时，类器官会破碎解离，更换培养基即可延长类器官的生存时间。在培养箱中的生长期间，类器官的直径会在第3天达到最大，且主要集中在100-200μm，然后类器官会出现解离现象。
试验例四、小鼠肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中培养对类器官的生物活性的影响
方法：采用CellTiter测试A1组、A2组、B1组、B2组、C1组、C2组96孔板类器官的生物活性，用CellTiter-Glo 3D发光法细胞活力检测试剂盒测试保存0H的96孔板类器官的生物活性。,。
结果显示：参照图9，不同浓度的类器官在室温静置下保存不同天数后活性的检测；结果参照图10，不同浓度的类器官在室温摇床晃动下保存不同天数后活性的检测，当类器官密度为10000cells/ml时，小鼠肝脏类器官经过处理后可以在室温环境中保存4天，且维持正常的生物活性。
试验例五、人肝脏类器官在室温环境(静置与摇动)中培养不同时间后再转到培养箱中对类器官的数量及直径的影响
材料：A1组、A2组、B1组、B2组、C1组和C2组。
方法：将孔板分别放入上述组别的培养箱后，每天记录拍照类器官数目。
每个孔板上的类器官共有三行，每行有3个重复孔；第一行标记“0th”，第二行标记“4th”，第三行标记“5th”(“0th”表示类器官从室温环境转入培养箱后的第0天补加60μl培养基；“4th”表示类器官从室温环境转入培养箱后的第4天补加60μl培养基；“5th”表示类器官从室温环境转入培养箱后的第5天补加60μl培养基)；观察拍照并记录类器官的数量及直径，观察10天。参照图11和图12。
结果显示：人肝脏类器官在室温环境(静置和摇动)中培养24小时、48小时、72小时、96小时后转到培养箱中培养，通过添加培养基的方法，均可以正常生长。
人肝脏类器官室温摇动的环境中4天后，转入培养箱，可以维持正常的生长情况，达到模拟4天运输的目的；人肝脏类器官在转入培养箱后，通过补充更换培养基，可以达到维持类器官生长的目的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于可室温保存类器官的培养基，其特征在于，包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、抗生素、Matrigel、添加剂、TGF-β抑制剂和Wnt信号通路激活剂，在用于可室温保存类器官的培养基中，所述Matrigel的质量分数为20％-25％。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加剂包括B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸、Nicotinamide、[Leu15]-gastrin I human、生长因子、Forskolin中的至少一种。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述Wnt信号通路激活剂包括R-spondin-1。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述Matrigel的质量分数为20％或25％。
5.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述添加剂为B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸、Nicotinamide、[Leu15]-gastrin I human、生长因子和Forskolin。
6.如权利要求2或5所述的培养基，其特征在于，所述生长因子包括EGF、FGF10和HGF。
7.一种维持类器官生长活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.类器官的预处理：重悬类器官，加入Matrigel混匀得类器官悬液；
S2.类器官的培养：在室温下，使用如权利要求1-5任一所述的用于保存类器官的培养基培养步骤S1制备的类器官悬液，然后进行孵育；
S3.密封与保护：使用孔板封膜密封上述步骤S2孵育的类器官悬液，然后转入浓度为5％的二氧化碳培养箱继续培养。
8.如权利要求7所述的维持类器官生长活性的方法，其特征在于，所述步骤S2中孵育时间为15-20分钟。
9.如权利要求7所述的维持类器官生长活性的方法，其特征在于，所述步骤S2中使用权利要求1-6任一所述的用于保存类器官的培养基培养步骤S1制备的类器官悬液1-4天。
10.如权利要求7所述的维持类器官生长活性的方法，其特征在于，所述步骤S1中将混合好的类器官悬液加入至96孔板进行孵育。
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Legal Events
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Effective date of registration: 20231013 Address after: Room 393, building a, Zhongdan Ecological Life Science Industrial Park Phase I, No. 3-1, xinjinhu Road, Jiangbei new area, Nanjing, Jiangsu 210000 Patentee after: Nanjing Aorui Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 330000 floors 1-2 of plant 10, Zhongxing Nanchang Software Industrial Park, No. 688, aixihu North Road, Nanchang high tech Industrial Development Zone, Nanchang City, Jiangxi Province Patentee before: NANCHANG FIVE ELEMENTS BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: Culture medium for room temperature preservation of organoids and methods for maintaining organoid growth activity Granted publication date: 20230317 Pledgee: Bank of Nanjing Jiangbei District branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Nanjing Aorui Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2024980011466 |