KR102083009B1

KR102083009B1 - Ａｂｃ 트랜스포터를 통한 아라자임 분비 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법

Info

Publication number: KR102083009B1
Application number: KR1020150080156A
Authority: KR
Inventors: 엄경태; 송재광; 제갈종건; 송봉근
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2020-02-28
Also published as: KR20160143435A

Abstract

본 발명은 재조합 플라스미드 벡터, 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 ABC 트랜스포터를 이용하여 아라자임을 효율적으로 수득할 수 있으며, 원균주의 체외로 아라자임이 배출되므로 별도로 원균주를 분쇄하지 않고 아라자임을 수득할 수 있어, 매우 경제적이며 수득률도 높아 아라자임의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＡＢＣ 트랜스포터를 통한 아라자임 분비 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법{Genetically modified Arazyme-producing microorganisms using ABC transporter-mediated secretion system and the method for preparing Arazyme using the same}

본 발명은 재조합 플라스미드 벡터, 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법에 관한 것이다.

아라자임(Arazyme)은 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 중장(midgut)으로부터 분리한 장내세균인 세라티아 프로테아마큘런스(Serratia proteamaculans) HY-3(또는 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus) HY-3)에서 생산되는 고효율의 단백질분해효소이다. 아라자임은 저온과 높은 염농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 넓은 기질특이성을 나타내고, 인체의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보였다. 또한 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

그래서 아라자임은 세제, 피혁, 식품, 사료, 화장품 및 의약품 등 다양한 분야에서 폭넓게 이용되고 있다. 또한 강력한 항균 및 항생효과로 인해 가축의 질병예방제나 성장촉진제로 이용할 수 있고, 아라자임의 유방암 및 폐암 억제 활성과 간기능 보호 활성 등도 보고되었다.

아라자임은 현재 원균주인 세라티아 프로테아마큘런스에서 유전자가 분리되어 코딩된 유전자의 서열이 알려져 있다(1515bp, GeneBank accession no. AY818193).

ABC 트랜스포터(ABC transporter)는 ATP와 결합하는 카세트(ATP-binding cassette)를 가지고 있고 여기에 결합한 ATP를 분해하면서 발생한 에너지에 의해 목적단백질을 세포 밖으로 분비시키기 때문에 명명된 이름이다.

ABC 트랜스포터의 목적단백질은 고유의 ABC 트랜스포터와 함께 미생물 균주에서 재조합 발현함으로써 높은 분비생산을 나타내는 보고들이 상당수 있다(Ahn et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 5506-5511, 2001, Idei et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 58: 322-329, 2002, Eom et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16: 1422-1428, Song et al., J. Biotechnol. 130: 311-315).

그러나 현재까지 아라자임 고유의 ABC 트랜스포터는 보고되지 않고 있는 상태여서, 보다 경제성 있는 고효율의 아라자임 분비 생산에 한계가 있다.

대한민국 공개특허 제10-2008-0088216호

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 그람 음성균에서 분리된 ABC 트랜스포터(ABC transpoter) 및 아라자임(arazyme)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합　 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 유전자 재조합 방법에 의한 아라자임 생산방법을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 그람 음성균에서 분리된 ABC 트랜스포터(ABC transpoter) 및 아라자임(arazyme)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 상기 그람 음성균은 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens), 세라티아 프로테아마큘런스(Serratia proteamaculans) 및 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)일 수 있다.

본 발명에서 상기 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)는 슈도모나스 플루오레슨스 SIK WI (KCTC 7689)일 수 있다.

본 발명에서 상기 ABC 트랜스포터는 ATP와 결합하는 카세트(ATP-binding cassette)를 가지고 있고 여기에 결합한 ATP를 분해하면서 발생한 에너지에 의해 목적단백질을 세포 밖으로 분비시킨다. 그람음성균의 경우, 세포 내막과 세포 외막을 통과할 때 ABC 트랜스포터 중 한 단백질과 분비하게 되는 단백질이 부분적으로 융합되어 단백질이 두 개의 생체막을 동시에 통과하게 된다. 따라서, 그람음성균의 경우, ABC 트랜스포터에 의한 분비 시스템은 간단하고 효과적인 방법으로 단백질을 세포 밖으로 분비하게 할 수 있다.

본 발명에서 상기 ABC 트랜스포터는,

(a) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(b) 서열번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질;

(c) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및

(d) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 ABC 트랜스포터는 상기 서열번호 1 및 2의 서열과 상동성이 매우 높은 서열을 갖는 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 서열 변이체는 서열번호 1 및 2로 표시되는 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열이 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 2와 동일한 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 ABC 트랜스포터를 코딩하는 유전자는 이에 한정되는 것은 아니지만, tliDEF 일 수 있으며, 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 tliDEF 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1(KCTC 7689)에서 분리된 tliDEF 일 수 있다.

본 발명에서 상기 아라자임(arazyme)은 글리신-리치 박스(Glycine-rich box(-G-G-X-G-X-D)), 암피필릭 알파-헬릭스(Amphiphilic α-helix) 및 익스트림 C-말단 모티프(extreme C-terminal motif)를 포함하는 카르복시 말단 신호서열을 가지는 것을 특징으로 하며,

상기 글리신-리치 박스; 암피필릭 알파-헬릭스; 및 익스트림 C-말단 모티프는 각각

(a) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(b) 서열번호 6에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질; 서열번호 7에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질; 및 서열번호 8에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질,

(c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및 서열번호 5 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 5 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질, 및

(d) 서열번호 6 기재된 염기서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 서열번호 8에 기재된 염기서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 아라자임은,

(a) 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(b) 서열번호 10에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질;

(c) 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및

(d) 서열번호 10에 기재된 염기서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 상기 아라자임(arazyme)은 상기 서열번호 9 및 10의 서열과 상동성이 매우 높은 서열을 갖는 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 서열 변이체는 서열번호 9 및 10으로 표시되는 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열이 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 9 및 10의 동일한 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "상동성"이란 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명에서, 상기 아라자임은 세라티아 프로테아마큘런스(Serratia proteamaculans) HY-3 또는 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus) HY-3의 배양액에서 분리될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 아라자임의 아미노산 서열의 분석 결과, 그람음성균의 type I 분비시스템인 ABC 트랜스포터(ABC transporter)에 의해 분비되는 목적단백질(target protein)들이 가지고 있는 카르복시말단 신호서열(C-terminal signal sequence)을 함유하고 있음을 밝혀내었다. 상기 분비시스템에 의하여 분비되는 목적단백질들은 절단되지 않는 카르복시 말단 신호서열을 가지고 있고, 이 신호서열이 ABC 트랜스포터에 의해 인지되어 세포 밖으로 분비되며, 대다수 목적단백질의 카르복시 말단 신호서열은 글리신-리치 박스(Glycine-rich box(-G-G-X-G-X-D)), 암피필릭 알파-헬릭스(Amphiphilic α-helix), 익스트림 C-말단 모티프(extreme C-terminal motif)라는 공통의 아미노산 서열을 가진다(도 1). ABC 트랜스포터는 ATP 결합 카세트(ATP-binding cassette, ABC) 단백질, 막융합 단백질(Membrane Fusion Protein, MFP), 외막 단백질(Outer Membrane Protein, OMP)의 3개의 단백질로 구성되는 데, 그람음성균의 내막과 외막에 걸쳐 채널을 형성하여, 목적단백질을 세포 내에서 세포 밖으로 단지 한 단계에 의해 분비할 수 있게 한다.

본 발명에서 ABC 트랜스포터인 TliDEF는 이에 한정되는 것은 아니지만, 각각 ATP 결합 카세트(ATP-binding cassette, ABC) 단백질, 막융합 단백질(Membrane Fusion Protein, MFP), 외막 단백질(Outer Membrane Protein, OMP)인 TliD, TliE, 및 TliF 의 3가지 구성요소로 구성될 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터는 pDSK519, pACYC184, pKK223-3 및 pHCE 를 포함하는 광-숙주-범위(broad-host-range) 플라스미드 벡터일 수 있다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 도 2의 개열 지도를 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 균주는 그람음성균일 수 있으며, 상기 그람음성균은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomanas aeruginosa), 어위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 세라티아 프로테아마큘런스(Serratia proteamaculans)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 그람음성균 중에서 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)를 바람직하게 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1(KCTC7689)일 수 있다.

본 발명자들은 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1 균주에 tliDEF 및 아라자임 유전자가 pDSK519에 도입된 재조합 플라스미드로 형질전환한 균주인 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1 [pTliDEFSPP-519]를 2015년 5월 20일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC18388P를 부여받았다.

본 발명에서 상기 균주는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1[pTliDEFSPP-519](KCTC18388P)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하고, 배양물로부터 아라자임을 분리하는 단계를 포함하는 아라자임 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유전자 재조합 방법에 의한 아라자임 생산방법을 제공한다:

S1) 벡터에 그람 음성균에서 분리된 ABC 트랜스포터(ABC transporter) 및 아라자임(arazyme)을 코딩하는 유전자를 도입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

S2) 상기 재조합 벡터를 숙주에 형질전환하여 재조합 균주를 제조하는 단계;

S3) 상기 형질전환된 재조합 균주를 배지 내에서 배양하여 아라자임의 세포 외 분비를 유도하는 단계; 및

S4) 상기 형질전환된 재조합 균주의 배양액으로부터 아라자임을 회수하는 단계.

본 발명에서, 상기 S1) 단계는 재조합 벡터를 제조하는 단계로서, 상기 벡터는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, pDSK519, pACYC184, pKK223-3 및 pHCE 를 포함하는 광-숙주-범위(broad-host-range) 플라스미드를 이용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 S2) 단계는 상기 S1) 단계에서 제조된 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제조하는 단계로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 통상의 재조합 플라스미드 벡터를 통해 원균주를 형질전환하는 방법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 전기충격을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 S2) 단계에서 제조된 재조합 균주를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 재조합 균주 선별 단계에서는 시험관에서 재조합 균주를 배양하여 원심분리를 통해 상등액을 회수하였고, 이 상등액의 아라자임 활성 조사를 통하여 아라자임 활성이 높은 재조합 균주를 선별하였다.

상기 S3) 단계는 상기 S2) 단계에서 제조된 상기 형질전환된 재조합 균주를 배지 내에서 배양하여 아라자임의 세포 외 분비를 유도하는 단계로서, 배양조건 등은 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 배양될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 아라자임의 생산량을 극대화 시키기 위하여 신규한 배지를 제조하였으며, 상기 배지는 1~3 중량%의 이스트 추출물(yeast extract), 0.5~1.5 중량%의 덱스트린(dextrin), 0.1~0.3 중량%의 (NH₄)₂SO₄, 0.1~0.3 중량%의 KH₂PO₄, 및 0.01~0.1 중량%의 MgSO₄·7H₂O 를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성에 0.001~0.1% CaCl₂·2H₂O, 0.0001~0.01% FeSO₄·7H₂O 를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 배양은 배치(batch) 발효를 포함하여 수행할 수 있다. 상기 배치 발효는 밀폐된 시스템으로, 여기서 배지의 조성물은 발효 시작 시에 세팅되고, 발효 동안에 인위적으로 변경되지 않는다. 따라서, 발효 시작 시에, 배지는 목적하는 개체(들)와 함께 인큐베이션된다. 상기 방법에서, 발효는 시스템에 임의의 성분을 첨가하지 않으면서 발생하게 된다. 전형적으로, 배치 발효는 탄소원의 첨가에 관해 "배치"로서 간주되고, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 조절하려는 시도가 종종 이루어진다.

본 발명에서는 상기 배치 발효를 20~50%의 용존산소량(dissolved oxigen level) 하에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 20~40%의 용존산소량 하에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 25~35%의 용존산소량 하에서 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 재조합 균주는 전체 배양액을 기준으로 10 U/ml 이상의 프로테아제 활성을 보일 수 있으며, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 U/ml 이상의 프로테아제 활성을 보일 수 있다. 본 발명에서 1 U(Unit)의 프로테아제 활성은 1분당 흡광도 0.01을 증가시키는데 필요한 효소의 양으로 정의될 수 있다.

본 발명에서 상기 회수된 아라자임의 순도는 90% 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 S4) 단계의 아라자임은 700~900 ㎍/㎖ 로 회수될 수 있으며, 바람직하게는 750~850 ㎍/㎖ 로 회수될 수 있다.

본 발명을 통해 ABC 트랜스포터를 이용하여 아라자임을 효율적으로 수득할 수 있으며, 원균주의 체외로 아라자임이 배출되므로 별도로 원균주를 분쇄하지 않고 아라자임을 수득할 수 있어, 매우 경제적이며 수득률도 높아 아라자임의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 아라자임과 다른 메탈로프로테아제(metalloprotease)들 간의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 비교한 도면이다. PrtA: Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래 메탈로프로테아제; SPP: Serratia proteamaculans 유래 메탈로프로테아제(아라자임); SMP: Serratia marcescens 유래 메탈로프로테아제; AprA: Pseudomonas aeruginosa 유래 메탈로프로테아제; PrtB: Erwinia chrysanthemi 유래 메탈로프로테아제.
도 2는 재조합 플라스미드 제조방법에 대한 모식도이다. Km_r: 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자.
도 3은 Skim milk 플레이트에서 세포 외 프로테아제 활성을 확인한 사진이다. pTliDEFSPP-519를 함유한 대장균 주위의 투명환은 아라자임이 공발현된 TliDEF 트랜스포터에 의해 성공적으로 분비되었음을 보여준다. 1. E.coli[pDSK519]; 2. E.coli[pSPP-519]; 3. E.coli[pTliDEF-519]; 4. E.coli[pTliDEFSPP-519].
도 4는 P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]의 균주생장(open symbols)과 아라자임 분비생산량 (closed symbols)을 시간별로 측정한 그래프이다. 균주는 60mL LB 배지(circles)를 포함한 250mL 플라스크와 60mL SPP배지(inverted triangles)를 포함한 250mL 플라스크에서 각각 배양하였다. 실험데이터는 3번의 독립된 실험결과의 평균값을 나타낸다.
도 5는 P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]의 균주생장(open symbols)과 아라자임 분비생산량(closed symbols)을 시간별로 측정한 그래프이다. 균주는 60mL SPP 배지(circles)를 포함한 250mL 플라스크와 900mL SPP 배지(inverted triangles)를 포함한 2.5L 발효기(용존산소량 30%로 유지)에서 각각 배양하였다. 실험데이터는 3번의 독립된 실험결과의 평균값을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제조예와 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 제조예와 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 제조예와 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 제조예와 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1>

재조합 플라스미드의 제조

1-1 본 발명에 사용된 균주, 유전자, 플라스미드 벡터

본 발명에 사용한 균주는 대장균(Escherichia coli) XL1-Blue{recA1 endA1 gyrA96 thi -1 hsdR17 supE44 relA1 [F' proAB lacI ^q ZΔ15 Tn10 (Tet^r)]}와 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1(KCTC 7689)이다. 대장균 XL1-Blue는 플라스미드 제작 용도와 유전자 발현용도로 사용하였고, 슈도모나스 플루오레슨스 SIK W1은 유전자 발현용도로 사용하였다. 아라자임의 유전자(1,515bp) 서열은 GeneBank(Accession no. AY818193)에서 확보하였고, 이를 토대로 recursive PCR (바이오니어, 대한민국)를 통해 유전자를 합성하였고, 이를 spp-syn으로 명명하였다. 슈도모나스 플루오레슨스 SIK W1 유래 ABC 트랜스포터 유전자인 tliDEF는 pTOTAL(Ahn et al., J. Bacteriol. 181: 1847-1852, 1999)을 주형으로 중합효소연쇄반응으로 확보하였다. 플라스미드 pDSK519는 broad-host-range용 플라스미드로서 대장균과 슈도모나스 플루오레슨스에서 유전자 발현용 벡터로 이용하였다.

1-2 pTliDEF -519의 제조

pTliDEF-519는 tliDEF 유전자가 pDSK519에 도입된 재조합 플라스미드로서, tliDEF 유전자를 확보하기 위해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하였으며, pTOTAL을 중합효소연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 사용된 프라이머는 포워드 (Forward) 프라이머 (TliDF1X)로서 5'- GCTCTAGAAACTATTGCGTGTCGTTTGG-3'(서열번호 11)및 리버스 (Reverse) 프라이머 (TliDR1B)로서 5'-ATAGGATCCCGGAGATTGTGTGGTTTTATTG-3'(서열번호 12) 이고, 포워드 프라이머에는 XbaI 인식부위가, 리버스 프라이머에는 BamHI 인식부위가 존재한다. 증폭된 유전자를 한천 겔 전기영동법 (agarose gel electrophoresis)을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 유전자 단편을 XbaI과 BamHI으로 절단한 후에, 동일한 제한효소로 절단된 pDSK519와 접합시켜 도 2에 표시된 재조합 플라스미드를 제조하였다.

1-3 pSPP -519의 제조

pSPP-519는 spp (아라자임) 유전자가 pDSK519에 도입된 재조합 플라스미드로서, spp 유전자를 확보하기 위해 중합효소연쇄반응을 이용하였으며, spp-syn을 중합효소연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 (SPPF1X)로서 5'-CGTCTAGAACAAGAGAGACAAGACAATGCAA-3'(서열번호 13) 및 리버스 (Reverse) 프라이머 (SPPR1B)로서 5'-ATTGGATCCTTAAACGATAAAGTCAGTGGCG-3'(서열번호 14) 이고, 포워드 프라이머에는 XbaI 인식부위가, 리버스 프라이머에는 BamHI 인식부위가 존재한다. 증폭된 유전자를 한천 겔 전기영동법 (agarose gel electrophoresis)을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 유전자 단편을 XbaI과 BamHI으로 절단한 후에, 동일한 제한효소로 절단된 pDSK519와 접합시켜 도 2에 표시된 재조합 플라스미드를 제조하였다.

1-4 pTliDEFSPP -519의 제조

pTliDEFSPP-519는 tliDEF와 spp (아라자임) 유전자가 pDSK519에 도입된 재조합 플라스미드로서, spp 유전자를 확보하기 위해 중합효소연쇄반응을 이용하였으며, spp-syn을 중합효소연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 (SPPF1B)로서 5'-ATAGGATCCACAAGAGAGACAAGACAATGCAA-3'(서열번호 15) 및 리버스 (Reverse) 프라이머 (SPPR1K)로서 5'-ATGGTACCTTAAACGATAAAGTCAGTGGCG-3'(서열번호 16) 이고, 포워드 프라이머에는 BamHI 인식부위가, 리버스 프라이머에는 KpnI 인식부위가 존재한다. 증폭된 유전자를 한천 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 유전자 단편을 BamHI과 KpnI으로 절단한 후에, 동일한 제한효소로 절단된 TliDEF-519와 접합시켜 도 2에 표시된 재조합 플라스미드를 제조하였다.

< 실시예 2>

재조합 균주의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 3종의 재조합 플라스미드 (pTliDEF-519, pSPP-519, pTliDEFSPP-519)와 pDSK519를 대장균 XL1-Blue와 슈도모나스 플루오레슨스 SIK W1을 전기적 형질전환(electroporation)용 세포 형태로 제조한 후, 세포 내로 도입하였다. 전기적 형질전환용 세포는 다음과 같은 과정을 통해 제조하였다. 대장균 XL1-Blue(혹은 슈도모나스 플루오레슨스 SIK W1)을 LB(Luria-Bertani) 플레이트(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1,5% agar)에 도말하여 25℃ 정치배양기에서 24시간 동안 배양하였다. LB 플레이트에서 자란 균주의 콜로니를 LB 액체배지 200mL에 접종하고, 25℃ 교반배양기에서 150rpm으로 OD(600nm)가 0.6(분광광도계(spectrophotometer)로 측정)이 될 때까지 배양하였다. 원심분리를 통해 배양액과 균주 세포를 분리하고 배양액을 버린 후 균주 세포를 10% 글리세롤 30mL에 풀어서 세척하였다. 원심분리를 통해 10% 글리세롤과 균주세포를 분리하고, 분리된 10% 글리세롤은 버렸다. 위 과정을 3번 반복하였고, 원심분리를 통해 얻은 세척된 균주세포를 10% 글리세롤 3mL에 풀어주었다.

상기 4종의 플라스미드를 미생물 세포에 전기적 충격으로 도입할 때에는 전기 충격 형질전환용 큐벳에 상기 전기적 형질전환용 세포 80ul와 플라스미드 5ul를 넣고, 1.8kV 전압을 5ms 동안 가한 후, SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 0.0186% KCl, 0.095% MgCl2, 0.6% glucose) 1ml을 첨가하여 25℃ 교반배양기에서 100rpm으로 1시간동안 배양하여 재조합 균주를 제조하였다. 제작된 재조합 균주는 LB 플레이트에 도말해 25℃에서 배양하였다.

< 실시예 3>

상기 재조합 균주를 이용한 아라자임의 생산

3-1 TliDEF 트랜스포터에 의한 아라자임의 분비 확인

상기 실시예 2에서 제조한 재조합 균주들 중에서 4종의 재조합 대장균 균주 (E.coli[pDSK519], E.coli[pSPP-519], E.coli[pTliDEF-519], E.coli[pTliDEFSPP-519])를 이용해서 TliDEF 트랜스포터가 아라자임을 세포 밖으로 분비할 수 있는지 확인하였다. 재조합 대장균 균주들을 skim milk agar(3% skim milk, 0.1% peptone, 0.5% NaCl, 2% agar) plate에 스트리킹(streaking)하여 25℃ 정치배양기에서 48시간 동안 배양한 결과, E.coli[pTliDEFSPP-519] 만이 배지의 카제인(casein) 분해에 의한 투명환이 형성되었다(도 3). 이에 반해 E.coli[pSPP-519]는 투명환을 형성하지 못했다. 즉 아라자임(SPP)은 대장균에서 이종의 ABC 트랜스포터인 TliDEF exporter에 의해서 세포 밖으로 분비가 성공적으로 이뤄짐을 확인하였다.

E.coli[pTliDEFSPP-519]의 아라자임 분비생산량을 측정하기 위해, 60mL LB배지를 포함하는 250mL 플라스크에서 균주를 도입한 후, 25℃, 교반배양기에서 250rpm으로 82시간 동안 배양하였다. 배양상등액에 존재하는 아라자임의 프로테아제 활성을 다음과 같이 측정하였다. 배양상등액 100ul를 50mM potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 azocasein(2.4%) 용액 600ul에 넣고, 혼합용액을 37℃에서 30분간 반응하였다. 10% trichloroacetic acid 600ul를 혼합용액에 넣어 반응을 중지시키고, 25℃에서 1시간 동안 방치하였다. 13,000×g에서 10분간 원심분리 후, 800ul의 상등액을 확보하고, 10N NaOH 300ul를 섞고, 420nm 파장의 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 프로테아제 활성을 측정하였다. 1 Unit의 프로테아제 활성은 1분당 흡광도 0.01을 증가시키는 데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

이와 같은 방법으로 E.coli[pTliDEFSPP-519] 배양상등액의 프로테아제 활성을 측정한 결과, 분비생산량은 1.2U/mL에 불과하였다. 이는 대장균은 아라자임의 대량 분비생산에는 부적합한 균주임을 보여준다.

3-2 재조합 슈도모나스 플루오레슨스 균주를 이용한 아라자임의 분비 생산량 증가

슈도모나스 플루오레슨스의 경우, 고유의 리파제인 TliA와 TliDEF 트랜스포터를 재조합 발현시 TliA 리파제의 분비생산량이 원균주에 비해 월등히 높아지는 결과가 보고되었다 (Ahn et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 5506-5511, 2001). 그러므로, 슈도모나스 플루오레슨스를 이용해서 TliDEF 트랜스포터를 통해 아라자임의 분비생산량을 증가시키고자 하였다. E.coli[pTliDEFSPP-519]와 4종의 슈도모나스 플루오레슨스 재조합 균주들(P.fluorescens[pDSK519], P.fluorescens[pSPP-519], P.fluorescens[pTliDEF-519], P.fluorescens[pTliDEFSPP-519])을 60mL LB 배지를 포함한 250mL 플라스크에 각각 도입하여 25℃, 250rpm으로 교반배양기에서 82시간 동안 배양한 후, 아라자임의 분비생산량을 상기 프로테아제 활성측정 방법으로 측정해 비교하였다(표 1). P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]는 41.8U/mL의 아라자임 생산량을 나타내었는데, 이는 E.coli[pTliDEFSPP-519]에 비해 약 34.8배 증가된 값이다. 반면, P.fluorescens[pSPP-519]는 아라자임을 거의 분비하지 않았다. 이는 아라자임과 TliDEF 트랜스포터를 슈도모나스 플루오레슨스 균주에서 재조합 발현하는 것이 아라자임의 분비생산량 증가에 큰 효과를 나타냄을 보여준다.

균주	프로테아제 활성(U/ml)
E.coli [pTliDEFSPP-519]	1.2±0.06
P.fluorescens [pDSK519]	0.1±0.06
P.fluorescens [pSPP-519]	0.5±0.06
P.fluorescens [pTliDEF-519]	0.4±0.06
P.fluorescens [pTliDEFSPP-519]	41.8±0.06

세라티아 마르세선스(Serratia marcescens)에서 고유의 ABC 트랜스포터인LipBCD 트랜스포터와 고유의 리파제인 LipA를 재조합 발현해서 LipA 리파제를 생산하는 연구에서, 균주의 생장량을 증가시키면 LipA 리파제의 분비생산량이 증가되는 연구결과가 보고되었다(Idei et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 58: 322-329, 2002). 그래서 P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]의 생장량 증가를 통한 아라자임의 분비생산량 증가를 위해서 재조합 세라티아 마르세선스 균주를 이용한 LipA 리파제 생산에 이용한 배지조성을 수정해 SPP 배지(2% yeast extract, 1% dextrin, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 0.2% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.01% CaCl₂·2H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O)를 제작하였다. P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]를 각각 60mL LB 배지를 포함한 250mL 플라스크와 60mL SPP 배지를 포함한 250mL 플라스크에서 도입하여 25℃, 250rpm으로 교반배양기에서 82시간동안 배양한 후, 균주의 생장량 (OD(600nm))과 아라자임 분비생산량을 시간별로 측정하였다(도 4). LB 배지에서 배양한 P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]에 비해 SPP 배지에서 배양한 P.fluorescens[pTliDEFSPP-519]가 OD(600nm)는 약 4.1배(4.3에서 17.6으로 증가), 아라자임 생산량은 약 5.9배(41.8U/mL에서 245.4U/mL)로 증가하였다. 이는 ABC 트랜스포터를 이용해 목적단백질을 분비생산하는 재조합 균주의 경우, 균주의 생장량을 증가시키는 것 역시 목적단백질의 분비생산량을 증가시키는 하나의 방법이 될 수 있음을 보여준다.

마지막으로, 아라자임의 분비량을 더욱 더 증가시키기 위해 2.5L 발효기와 SPP 배지를 이용해 Batch 발효를 수행하였다. P.fluorescens는 절대 호기성 균주로 알려져 있기 때문에 적절한 O₂ 공급은 균주 생장량과 아라자임 분비생산량을 증가시키는 데 도움이 될 것으로 생각되었다. 발효는 900mL SPP배지를 포함한 2.5L 발효기에 균주를 도입해 25℃, 400rpm 조건으로 수행하였다. 발효과정 중에 용존산소량 (dissolved oxygen level)을 30%로 유지 시, 82시간 배양 후에는, 플라스크 배양법에 비해 OD(600nm)는 약 5%(17.6에서 18.5로 증가), 아라자임 생산량은 약 48%(245.4U/mL에서 365.2U/mL)로 증가하였다(도 5). 그리고, SDS-PAGE와 densitometry 분석법으로 세포 배양액의 전체 단백질 농도와 아라자임(예상분자량 51.2kDa)의 순도를 측정한 결과, 각각 854ug/mL과 92%를 나타내었다. 그러므로, 세포 배양액에서의 아라자임의 농도는 약 789ug/mL에 이르렀다.

한국생명공학연구원

KCTC18388P

20150520

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Genetically modified Arazyme-producing microorganisms using ABC transporter-mediated secretion system and the method for preparing Arazyme using the same <130> P15-120 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1492 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 1 Val Ser Phe Gly Ser Arg Lys Ile Asn His Tyr Gly Gln Ala Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Gly Ala Phe Ile Gln Gly Val Gly Glu Tyr Lys Ser Ile Leu Ile 20 25 30 Ser Val Gly Cys Phe Thr Ala Leu Ile Asn Leu Leu Met Leu Val Pro 35 40 45 Ser Ile Tyr Met Leu Gln Val Tyr Asp Arg Val Leu Ser Ser Gln Asn 50 55 60 Glu Thr Thr Leu Val Met Leu Thr Leu Met Val Val Gly Phe Phe Ala 65 70 75 80 Phe Ile Gly Thr Leu Glu Val Ile Arg Ser Phe Ile Val Ile Arg Ile 85 90 95 Gly Ser Gln Leu Glu Arg Arg Phe Asn Leu Arg Val Tyr Lys Ala Ala 100 105 110 Phe Glu Arg Asn Leu Gln Arg Gly Gln Gly His Ala Gly Gln Ala Leu 115 120 125 Gly Asp Leu Thr Leu Leu Arg Gln Phe Ile Thr Gly Pro Ala Leu Phe 130 135 140 Ala Phe Phe Asp Ala Pro Trp Phe Pro Leu Tyr Leu Leu Val Ile Phe 145 150 155 160 Leu Phe Asn Val Trp Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Gly Ala Val Leu 165 170 175 Leu Ile Gly Leu Ala Cys Leu Asn Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Leu 180 185 190 Gly Glu Ala Gly Ala Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Leu Ala Thr Ser 195 200 205 His Leu His Asn Ala Glu Thr Ile Gln Ala Met Gly Met Leu Gly Ala 210 215 220 Leu Arg Lys Arg Trp Phe Ala Val His Ser Gln Phe Leu Gly Leu Gln 225 230 235 240 Asn Thr Ala Ser Asp Thr Gly Ser Val Ile Thr Ser Leu Ser Lys Thr 245 250 255 Leu Arg Leu Cys Leu Gln Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Ala Leu Leu 260 265 270 Val Ile Lys Gly Asp Met Thr Ala Gly Met Met Ile Ala Gly Ser Ile 275 280 285 Leu Met Gly Arg Val Leu Ser Pro Ile Asp Gln Leu Ile Ala Val Trp 290 295 300 Lys Gln Trp Ser Ser Ala Lys Leu Ala Tyr Gln Arg Leu Asp Asp Leu 305 310 315 320 Leu Arg Glu Phe Pro Pro Asp Ser Glu Pro Met Lys Leu Pro Ala Pro 325 330 335 His Gly Gln Val Ser Phe Glu Gln Val Ser Ala Gly Pro Pro Gly Arg 340 345 350 Arg Thr Pro Thr Leu His Gln Val Ser Phe Thr Leu Gly Ala Gly Glu 355 360 365 Val Leu Gly Val Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ala 370 375 380 Arg Val Leu Val Gly Val Trp Pro Thr Leu Gly Gly Thr Val Arg Leu 385 390 395 400 Asp Gly Ala Asp Ile His Arg Trp Asp Arg Glu Asp Leu Gly Pro His 405 410 415 Ile Gly Tyr Leu Pro Gln Asp Ile Glu Leu Phe Ser Gly Ser Ile Ala 420 425 430 Asp Asn Ile Ala Arg Phe Arg Gln Ala Asp Pro Ala Leu Val Val Gln 435 440 445 Ala Ala Gln Gln Ala Gly Val His Glu Leu Ile Leu Arg Leu Pro His 450 455 460 Gly Tyr Asp Thr Leu Leu Gly Asp Asn Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly 465 470 475 480 Gln Lys Gln Arg Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Gly Gly Pro Arg 485 490 495 Leu Ile Val Leu Asp Glu Pro Asn Ser Asn Leu Asp Thr Val Gly Glu 500 505 510 Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ile Val Gln Met Lys Ala Gln Gly Ser Ser 515 520 525 Val Val Leu Val Thr His Arg Ser Ser Ala Leu Ala Gln Ala Asp Lys 530 535 540 Leu Leu Val Leu Asn Glu Gly Arg Leu Gln Arg Leu Ala Arg Ala Arg 545 550 555 560 Arg Cys Cys Ala His Cys Pro Ala Ser Arg Lys His Arg Arg Lys Gly 565 570 575 Pro Val Met Ser Ser Leu Thr Phe Glu Gln Arg Asp Ala Arg Phe Phe 580 585 590 Val Arg Met Gly Trp Leu Leu Thr Val Val Gly Ala Gly Gly Phe Phe 595 600 605 Leu Trp Ala Ser Leu Ala Pro Leu Asp Gln Gly Ile Pro Val Gln Gly 610 615 620 Thr Val Val Val Ser Gly Lys Arg Lys Ala Val Gln Thr Phe Ser Pro 625 630 635 640 Gly Val Val Ser Arg Ile Leu Val Arg Glu Gly Glu Thr Val Lys Gln 645 650 655 Gly Gln Pro Leu Phe Arg Leu Asp Gln Thr Gln Asn Gln Ala Asp Val 660 665 670 Gln Ser Leu Gln Ala Gln Tyr Arg Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Arg 675 680 685 Trp Gln Ser Glu Arg Asp Asn Arg Ser Ser Ile His Phe Pro Ala Glu 690 695 700 Leu Ser Ser Asn Pro Asp Pro Ala Leu Ala Leu Val Leu Glu Gly Gln 705 710 715 720 Arg Gln Leu Phe Ser Ser Arg Arg Glu Ala Phe Ala Arg Glu Gln Ala 725 730 735 Gly Ile Arg Ala Asn Ile Asp Gly Ala Thr Ala Gln Leu Gly Gly Met 740 745 750 Arg Arg Ala Arg Ser Asp Leu Thr Ala Gln Ala Gln Ser Leu Arg Asp 755 760 765 Gln Leu Ser Asn Leu Gln Pro Leu Ala Asp Asn Gly Tyr Ile Pro Arg 770 775 780 Asn Arg Leu Met Glu Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Gln Val Gln Gln Asp 785 790 795 800 Leu Ala Gln Asn Thr Gly Glu Ser Gly Arg Val Glu Gln Gly Ile Leu 805 810 815 Glu Ser Arg Leu Lys Leu Gln Gln His Ser Glu Glu Tyr Gln Lys Glu 820 825 830 Val Arg Ser Gln Leu Ala Asp Ala Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Glu 835 840 845 Gln Gln Leu Thr Ser Ala Gly Phe Asp Leu Gln His Ser Glu Ile Asn 850 855 860 Ala Pro Ala Asp Gly Ile Ala Val Asn Leu Gly Val His Thr Glu Gly 865 870 875 880 Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Thr Leu Leu Glu Ile Val Pro Gln Gly 885 890 895 Thr Arg Leu Glu Val Glu Gly His Leu Pro Val His Leu Val Asp Lys 900 905 910 Val Gly Thr His Leu Pro Val Asp Ile Leu Phe Thr Ala Phe Asn Gln 915 920 925 Ser Arg Thr Pro Arg Val Pro Gly Glu Val Ser Leu Ile Ser Ala Asp 930 935 940 Gln Met Leu Asp Glu Lys Thr Gly Ala Pro Tyr Tyr Val Leu Arg Thr 945 950 955 960 Thr Leu Ser Asp Ala Ala Glu Gln Lys Leu Gln Gly Leu Val Ile Lys 965 970 975 Pro Gly Met Pro Ala Glu Met Phe Val Arg Thr Gly Glu Arg Ser Leu 980 985 990 Leu Asn Tyr Leu Phe Lys Pro Leu Leu Asp Arg Ala Gly Ser Ala Leu 995 1000 1005 Thr Glu Glu Met Arg Ser Leu Leu Ile Ala Val Leu Phe Ser Cys Ala 1010 1015 1020 Ser Ala His Ala Ala Met Gly Pro Phe Asp Val Tyr Glu Gln Ala Leu 1025 1030 1035 1040 Arg Asn Asp Pro Val Phe Leu Gly Ala Ile Lys Glu Arg Asp Ala Gly 1045 1050 1055 Leu Glu Asn Arg Thr Ile Gly Arg Ala Gly Leu Leu Pro Lys Leu Ser 1060 1065 1070 Tyr Asn Tyr Asn Lys Gly Arg Asn Asn Ser Gln Ala Thr Leu Pro Asp 1075 1080 1085 Gly Arg Gly Gly Asn Tyr His Asp Asp Arg Asn Tyr Asn Ser Tyr Gly 1090 1095 1100 Ser Thr Phe Ser Leu Gln Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Glu Ala Tyr Ala 1105 1110 1115 1120 Asn Tyr Arg Lys Gly Val Ala Gln Ala Leu Phe Ala Asp Glu Ser Phe 1125 1130 1135 Arg Asp Lys Ser Gln Ala Leu Leu Val Arg Val Leu Thr Tyr Tyr Thr 1140 1145 1150 Gln Ala Leu Phe Ala Gln Asp Gln Ile Asp Ile Ala Arg Ala Lys Lys 1155 1160 1165 Lys Ala Phe Glu Gln Gln Phe Gln Gln Asn Arg His Leu Phe Glu Gln 1170 1175 1180 Gly Glu Gly Thr Arg Thr Asp Ile Leu Glu Ala Glu Ser Arg Tyr Glu 1185 1190 1195 1200 Leu Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Ala Leu Asp Glu Gln Asp Ala Ala 1205 1210 1215 Leu Arg Glu Leu Gly Ala Leu Ile Gly Val Gln Ser Val Asn Ile Asp 1220 1225 1230 Asp Leu Ala Pro Leu Ser Pro Gly Phe Ala Ala Phe Ser Leu Ser Pro 1235 1240 1245 Ala Asn Tyr Asp Thr Trp His Glu Leu Ala Ile Ser Asn Asn Pro Thr 1250 1255 1260 Leu Ala Ser Gln Arg Gln Ala Leu Glu Val Ala Arg Tyr Glu Val Glu 1265 1270 1275 1280 Arg Asn Arg Ala Gly His Leu Pro Lys Val Thr Ala Tyr Ala Ser Ser 1285 1290 1295 Arg Gln Gln Glu Ser Asp Ser Gly Asn Thr Tyr Asn Gln Arg Tyr Asp 1300 1305 1310 Thr Asn Thr Ile Gly Val Glu Val Ser Leu Pro Leu Tyr Ala Gly Gly 1315 1320 1325 Gly Val Ser Ala Ser Thr Arg Gln Ala Ser Arg Ala Met Glu Gln Ala 1330 1335 1340 Glu Tyr Glu Leu Glu Gly Lys Thr Arg Glu Thr Leu Ile Glu Leu Arg 1345 1350 1355 1360 Arg Gln Phe Ser Ala Cys Leu Ser Gly Val Ser Lys Leu Arg Ala Tyr 1365 1370 1375 Gln Lys Ala Leu Thr Ser Ala Glu Ala Leu Val Val Ser Thr Arg Gln 1380 1385 1390 Ser Ile Leu Gly Gly Glu Arg Val Asn Leu Asp Ala Leu Asn Ala Glu 1395 1400 1405 Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Arg Arg Asp Leu Ala Gln Ala Arg Tyr Asp 1410 1415 1420 Tyr Leu Met Ala Trp Thr Lys Leu His Tyr Tyr Ala Gly Asn Leu Arg 1425 1430 1435 1440 Asp Thr Asp Leu Ala Lys Val Asp Glu Ala Phe Gly Thr Lys Arg Ala 1445 1450 1455 Glu Pro Pro Ala Ala Asp Lys Pro Pro Val Ala Asn Lys Pro Pro Glu 1460 1465 1470 Ala Ser Arg Pro Pro Val Ala Ser Gly Leu Ala Pro Pro Trp Ala Ala 1475 1480 1485 Gln Gln Pro Gln 1490 <210> 2 <211> 4485 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <400> 2 gtgtcgtttg gttcaaggaa gataaaccac tatggccaag cctattgccg tggcgccttt 60 attcaaggcg tgggtgaata caagagcatc ctgatcagtg tcggctgttt taccgcgctg 120 attaacctgt tgatgctggt gccgtcgatt tacatgctgc aagtgtatga ccgcgtgctg 180 tcctcgcaga atgaaaccac cctggtcatg ttgacgctga tggtcgtggg gttctttgcg 240 tttattggca cactggaagt tatccgcagt tttatcgtga tccgtattgg cagccagttg 300 gaacgccgtt tcaacttgcg cgtgtacaag gccgcctttg aacgcaacct gcaacgcggc 360 caggggcatg ccggccaggc gctgggcgac ttgaccctgt tgcgccagtt catcaccggc 420 ccggcgctgt tcgcgttttt cgatgcgccg tggtttcccc tctacctgct ggtgattttc 480 ctcttcaacg tgtggctcgg ggtcctggcc acggcgggtg cggtgctgct gatcggcctg 540 gcgtgcctca acgaatacct gactaaaaag cccttgggcg aagccggcgc ctattcccag 600 caatcgagcc aactggccac cagccatttg cacaacgccg agaccatcca ggccatgggc 660 atgctcggtg ccctgcgcaa acgctggttt gccgtgcatt cgcaatttct ggggttgcag 720 aacaccgcca gcgacaccgg ttcggtgatc acgtccttga gcaaaaccct gcgcctgtgc 780 ctgcagtcac tggtgttggg cctgggcgca ttgctggtga tcaagggcga tatgactgcc 840 gggatgatga tcgcaggctc catcctgatg ggccgcgtat tgagccccat cgaccagttg 900 atcgcggtgt ggaaacagtg gagttcggcc aagttggcct accagcgcct ggacgatctg 960 ctgcgtgaat tccctcccga cagcgagccg atgaaactcc cggcgcccca cggccaggtg 1020 agcttcgagc aggtcagcgc ggggccgccc gggcggcgca cgccgaccct gcatcaggtc 1080 agcttcaccc tgggcgccgg cgaagtcctc ggcgtgctcg gtgcctccgg ttccggcaaa 1140 tccaccctgg cccgcgtgct ggtgggggtg tggccaaccc tgggcggcac cgtgcgcctg 1200 gatggcgccg acatccatcg ctgggaccgc gaagacctcg gcccgcacat tggctatctg 1260 ccccaggaca tcgaattgtt cagcggcagc atcgccgaca acatcgcgcg ttttcgccag 1320 gccgatccgg ccttggtcgt gcaggctgcg caacaggccg gcgtacatga gctgattctg 1380 cggctgccgc acggctacga cacgctgctc ggcgacaacg gcggcggcct ctctggtggg 1440 cagaagcagc gggtggccct ggcccgcgcc ctgtatggcg ggccgcgcct gatcgtgctg 1500 gatgagccca actccaacct cgacaccgtc ggcgaagcgg ccctggccag cgccattgtg 1560 cagatgaaag cccaaggcag cagcgtggta ctggtcaccc atcgctcttc ggcattggcc 1620 caggccgaca aattgctggt gctcaacgaa ggccgcctgc agcgtttggc ccgagccagg 1680 aggtgttgcg cgcattgtcc ggccagccgg aagcaccgaa ggaaaggccc ggtgtgaatg 1740 agcagtctca cttttgaaca acgtgacgcg cggttcttcg tgcgcatggg ctggttgctg 1800 accgtggtcg gcgccggtgg atttttcctc tgggccagcc tggcgccgct ggaccagggc 1860 attccggtgc aaggcaccgt cgtggtctcg ggcaagcgca aagcggtgca aaccttcagc 1920 ccgggcgtgg tcagccggat tctggtgcgc gagggcgaaa cggttaaaca aggccagccg 1980 ctgtttcgcc tcgaccagac ccagaaccag gctgatgtgc agtcgctgca agcccagtac 2040 cgcctggcct gggccagcgt ggcgcgttgg cagagcgagc gcgacaaccg ttccagcatc 2100 cactttcccg ccgagctgag cagcaacccc gatccggccc tggccctggt gctggaaggc 2160 cagcgccaac tgttcagcag ccgccgcgaa gcctttgccc gtgagcaggc ggggatccgc 2220 gcgaacatcg acggcgctac tgcgcaactc ggcggcatgc gccgggcccg cagcgacctg 2280 accgcccagg cccaatccct gcgtgatcaa ctgagcaacc tgcagccgct ggccgacaat 2340 ggctacatcc cgcgcaaccg cctgatggag taccagcgcc agctgtccca ggtgcagcag 2400 gacctggcgc agaacaccgg tgaaagcggc cgcgtcgagc agggcattct cgaatcgcgc 2460 ctgaaactgc agcagcacag cgaggaatat caaaaggaag tgcgcagcca attggccgac 2520 gctcaactgc gcagcctcac gctggaacag caactcacct cggccgggtt cgacttgcaa 2580 cacagtgaaa tcaacgcgcc ggccgatggt attgccgtca acctcggcgt gcacaccgaa 2640 ggcgccgtgg tgcgcgccgg tgaaaccctg ttggaaatcg tgccccaggg cacgcgcctg 2700 gaagtcgagg ggcacttgcc ggtgcacctg gtggacaagg tcggcacgca cctgccggtc 2760 gacatcctgt tcaccgcctt caaccagagc cgcacaccac gcgtgccggg ggaggtcagc 2820 ctgatctccg ccgaccagat gctcgacgaa aaaaccggtg cgccgtatta cgtgctgcgc 2880 accacgctca gcgacgcggc cgagcaaaaa ctgcagggcc tggtgatcaa gccgggcatg 2940 ccggccgaga tgttcgtgcg caccggcgag cgctcgctgc tcaattacct gttcaagccg 3000 ctgctggacc gcgccggctc cgcgctgacc gaggaatgaa tgagatcgct gcttattgcc 3060 gtgttattca gctgcgccag cgctcatgcc gccatgggcc cgttcgacgt ctacgagcag 3120 gccctgcgca acgatccggt gtttctcggc gccatcaagg agcgcgatgc cggcctggag 3180 aaccgcacca tcggccgcgc cgggctgctg cccaagctgt cctacaacta caacaagggc 3240 cgcaacaatt cccaggccac cttgcctgac gggcgcggcg gcaattatca cgacgaccgc 3300 aactacaaca gttacggctc gaccttcagc ctgcagcagc cgctgttcga ctacgaggcc 3360 tacgccaact accgcaaagg cgtggcccag gcgttgttcg ctgatgaaag ctttcgcgac 3420 aagagccagg cgctgctggt gcgagtgctg acctattaca cccaggcgct gtttgcccag 3480 gaccagatcg acatcgcccg cgccaagaag aaggccttcg aacagcagtt ccagcagaac 3540 cggcacctgt tcgagcaggg cgagggcacc cgcaccgata ttctcgaagc cgagtcgcgt 3600 tatgagctgg ccacggccga ggagatcgag gcgctggacg agcaggacgc cgccctgcgc 3660 gagctggggg cgttgatcgg agtacagagc gtcaacatcg acgacctggc gccgctgagt 3720 cctggcttcg ccgccttcag cttgagcccg gccaactacg acacctggca cgagctggcg 3780 atcagcaata accccacgct ggcatcccag cgccaggccc tggaagtggc gcgctatgaa 3840 gtggagcgca accgcgccgg gcacctgccg aaagtcaccg cctatgcgag ttcgcgccag 3900 caggagtcgg acagcggcaa cacctacaac cagcgctatg acaccaacac catcggcgtc 3960 gaagtcagcc tgccgttgta tgccggtggc ggcgtctcgg cgtccactcg ccaggccagc 4020 cgcgccatgg agcaggccga gtacgagctg gaaggcaaga cgcgcgagac cttgatcgaa 4080 ctgcgtcgcc aattcagcgc gtgcttgtcc ggggtgagca agttgcgcgc gtaccagaag 4140 gcgctgacgt cggccgaagc gttggtggtg tctacccggc aaagcatcct tggcggtgag 4200 cgggtcaatc ttgatgcgtt gaatgccgag cagcagctgt acagcacacg ccgagacctg 4260 gcccaggcgc ggtatgacta cttgatggcc tggaccaagc tgcattacta cgccggcaat 4320 ttgcgcgaca ccgacctggc caaggtagac gaagccttcg ggaccaagag ggccgagcct 4380 cccgctgcag acaagccccc tgttgcaaac aaaccgcctg aggcaagccg accccctgtg 4440 gcgagcgggc ttgccccgcc ttgggctgcg caacaacccc aataa 4485 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> glycine-rich box <400> 3 Gly Gly Ser Gly Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val 1 5 10 15 Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala 20 25 30 Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp 35 40 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> amphiphilic a-helix <400> 4 Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala 1 5 10 15 Leu Asn Ile Gly 20 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> extreme C-terminal motif <400> 5 Asp Phe Ile Val 1 <210> 6 <211> 126 <212> DNA <213> glycine-rich box <400> 6 ggcggttcag gcaatgacgt gatcgtcggc aatgcggcca acaacgtgct gaaaggtggc 60 gcgggcaacg acgtgctgtt cggcggtggt ggggctgatg agctgtgggg cggtgcgggc 120 aaagac 126 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> amphiphilic a-helix <400> 7 gaagccttgc tgtcttacaa tgcgtcgaat aacgtcagcg atctggccct gaatatcggc 60 60 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> extreme C-terminal motif <400> 8 gactttatcg tt 12 <210> 9 <211> 487 <212> PRT <213> arazyme <400> 9 Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His 20 25 30 Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr 35 40 45 Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly 50 55 60 Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp 100 105 110 Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr 130 135 140 Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn 165 170 175 Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His 180 185 190 Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala 195 200 205 Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Arg Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser 245 250 255 Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly 290 295 300 Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val 325 330 335 Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly 355 360 365 Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln 420 425 430 Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu 435 440 445 Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly 450 455 460 Gly His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp 465 470 475 480 Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 485 <210> 10 <211> 1464 <212> DNA <213> arazyme <400> 10 atgcaatcta ctaaaaaggc aattgaaatt actgaatcca gccttgcggc tgcgagctcc 60 gcttacaatg cagtagatga tttgctgcat tatcatgagc gaggcaacgg gattcaggtt 120 aatggcaagg actcattttc taccgaacaa gccgggctgt ttattacccg cgagaaccaa 180 acctggaacg gttataaagt ttttggccaa ccggttaaat taacgttctc tttcccggat 240 tataaattct cttccaccaa cgtcgccggc gataccggac tgagcaaatt cagcgcggaa 300 cagcagcagc aggctaagct gtcgctgcag tcctggtctg acgtggccaa tatcaccttt 360 accgaagttg gtgccggcca gaaggccaat atcaccttcg gtaactacag ccaggatcgt 420 cccggccatt atgactacga tacccaggct tacgccttcc tgccgaacac catttatcag 480 ggccaaaacc tgggcgggca gacttggtac aacgtcaacc agtccaacgt gaaacatccg 540 gccagcgaag actacggccg ccagaccttt acccacgaga ttggccatgc gttgggcttg 600 agccatccgg gcgattacaa cgccggcgaa ggcaacccga cttacagaga tgccagctac 660 gccgaagata ctcgtgagtt cagcctgatg agttactgga gcgaaaccaa caccggtggc 720 gacaacggcg ggcactacgc tgcggcgcca ctgctggatg acatttccgc tattcagcat 780 ctgtatggtg ccaaccagac cacccgtacc ggcgataccg tgtatggctt caactcaaat 840 accggacgtg acttcctcag taccaccagc aatccgcaaa aagtgatctt tgcggcctgg 900 gatgcgggtg gtaatgacac cttcgatttc tccggttaca ccgctaacca gcgtattaat 960 ctgaacgaga aatctttctc cgacgtgggt gggctgaaag gcaacgtgtc cattgccgca 1020 ggtgtgacca tcgagaacgc gattggcggt tcaggcaatg acgtgatcgt cggcaatgcg 1080 gccaacaacg tgctgaaagg tggcgcgggc aacgacgtgc tgttcggcgg tggtggggct 1140 gatgagctgt ggggcggtgc gggcaaagac acctttgtct tctctgcggt cagcgattct 1200 gcgccgggtg cctccgactg gatcaaggat ttccagaaag gcatcgataa aatcgacctg 1260 tcattcttca atcagggcgc gcagggtggc gatcagatcc acttcgtcga tcatttcagt 1320 ggcgcagcgg gcgaagcctt gctgtcttac aatgcgtcga ataacgtcag cgatctggcc 1380 ctgaatatcg gcggccatca ggccccggac atcctggtga agatcgtcgg ccaggttgat 1440 gtcgccactg actttatcgt ttaa 1464 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 11 gctctagaaa ctattgcgtg tcgtttgg 28 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 12 ataggatccc ggagattgtg tggttttatt g 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 13 cgtctagaac aagagagaca agacaatgca a 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 14 attggatcct taaacgataa agtcagtggc g 31 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 15 ataggatcca caagagagac aagacaatgc aa 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 16 atggtacctt aaacgataaa gtcagtggcg 30

Claims

서열번호 2로 이루어진 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)에서 분리된 ABC 트랜스포터(ABC transporter)의 tliDEF 유전자 및 서열번호 10으로 이루어진 아라자임(arazyme)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터.
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제1항에 있어서,
상기 아라자임은 글리신-리치 박스(Glycine-rich box(-G-G-X-G-X-D)), 암피필릭 알파-헬릭스(Amphiphilic α-helix) 및 익스트림 C-말단 모티프(extreme C-terminal motif)를 포함하는 카르복시 말단 신호서열을 가지는 것을 특징으로 하며,
상기 글리신-리치 박스; 암피필릭 알파-헬릭스; 및 익스트림 C-말단 모티프는 각각
(a) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 및 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
(b) 서열번호 6에 기재된 염기 서열의 코딩 영역으로 이루어진핵산에 의해 코딩되는 단백질; 서열번호 7에 기재된 염기 서열의 코딩 영역으로 이루어진 핵산에 의해 코딩되는 단백질; 및 서열번호 8에 기재된 염기 서열의 코딩 영역으로 이루어진 핵산에 의해 코딩되는 단백질,
인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
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제1항에 있어서,
상기 아라자임은 세라티아 프로테아마큘런스(Serratia proteamaculans) HY-3 또는 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus) HY-3의 배양액에서 분리된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합벡터는 pTliDEFSPP-519이며, 도 2의 pTliDEFSPP-519 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주.
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제9항에 있어서,
상기 균주는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1[pTliDEFSPP-519](KCTC18388P)인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
제9항의 재조합 균주를 배양하고, 배양물로부터 아라자임을 분리하는 단계를 포함하는 아라자임 생산방법.
하기 단계를 포함하는 아라자임 생산방법:
S1) 벡터에 서열번호 2로 이루어진 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)에서 분리된 ABC 트랜스포터(ABC transporter) 의 tliDEF 유전자 및 서열번호 10으로 이루어진 아라자임(arazyme)을 코딩하는 유전자를 도입하여 재조합벡터를 제조하는 단계;
S2) 상기 재조합벡터를 숙주에 형질전환하여 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1[pTliDEFSPP-519](KCTC18388P)인 재조합균주를 제조하는 단계;
S3) 상기 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1[pTliDEFSPP-519](KCTC18388P)를 배지 내에서 배양하여 아라자임의 세포 외 분비를 유도하는 단계; 및
S4) 상기 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) SIK W1[pTliDEFSPP-519](KCTC18388P)의 배양액으로부터 아라자임을 회수하는 단계.
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제14항에 있어서,
상기 S3) 단계의 배지는 1~3 중량%의 이스트 추출물(yeast extract), 0.5~1.5 중량%의 덱스트린(dextrin), 0.1~0.3 중량%의 (NH₄)₂SO₄, 0.1~0.3 중량%의 KH₂PO₄, 및 0.01~0.1 중량%의 MgSO₄·7H₂O 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아라자임 생산방법.
제14항에 있어서,
상기 S3) 단계의 배양은 배치(batch) 발효를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 하는 아라자임 생산방법.
제14항에 있어서,
상기 재조합 균주는 전체 배양액을 기준으로 10 U/ml 이상의 프로테아제 활성을 보이는 것을 특징으로 하는 아라자임 생산방법.