KR100909998B1

KR100909998B1 - 아라자임을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용약학적 조성물

Info

Publication number: KR100909998B1
Application number: KR1020070030856A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 신동하; 정규식
Original assignee: 주식회사 인섹트 바이오텍
Priority date: 2007-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2009-07-29
Also published as: KR20080088216A

Abstract

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임을 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 처리하면, 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 p21, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2), p-p38, PKC(Protein Kinase C) 및 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1)의 발현을 감소시키며 종양 발생을 억제하는 역할을 하는 카탈라제(catalase)의 발현은 증가시키는 아라자임을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus), 아라자임(arazyme), 유방암

Description

아라자임을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물{pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention and treatment of breast cancer}

도 1은 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231)에서 아라자임(arazyme, 60 ㎍/㎖) 처리에 의한 종양 세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 단백질의 발현 변화를 관찰한 면역블랏팅(immunoblotting) 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231)에서 아라자임(60 ㎍/㎖) 처리에 의한 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 단백질의 발현변화 정도를 상대적 비율로 나타낸 그래프이다.

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임을 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 처리하면, 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 p21, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2), p-p38, PKC(Protein Kinase C) 및 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1)의 발현을 감소시키며 종양 발생을 억제하는 역할을 하는 카탈라제(catalase)의 발현은 증가시키는 아라자임을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

종양은 비정상적이고 비제어성이며 무질서한 세포증식의 산물이다. 이러한 종양이 파괴적인 성장성, 침습성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 침습성이란 주위 조직을 침윤 또는 파괴하는 성질로서, 일반적으로 조직의 경계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며, 종종 체내의 순환계로도 유입된다. 전이란 일반적으로 림프관(lymphotic) 또는 혈관에 의해 원발 위치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한다.

현재, 암은 주로 3가지 치료법, 즉 외과적인 수술, 방사선조사 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함한다. 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예컨대 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데에는 효과적이지만, 척추와 같이 일부 구역에 있 는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 분산성 종양 질환을 치료하는 데는 사용할 수 없다.

화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며, 흔히 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 많이 사용되는데, 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 순응성을 급격하게 변화시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 주용량 제한 독성(DLT)이 있다. 예를 들어, 점막염은 여러 항암제, 예컨대 항대사물질 세포 독소제인 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 메토트렉세이트(metotrexate) 및 항종양 항생제(예, 독소루비신) 등에 대한 주용량 제한 독성이다. 이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치 시 주요 문제가 되고 있다. 또한, 종래의 항암제들은 정상세포까지 죽이는 경우가 많았기 때문에, 최근에는 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 작용할 수 있는 새로운 기전의 항암제에 대한 연구가 진행되고 있다.

국내의 경우 유방암의 발병 빈도는 1984년 여성 암 중 8.7%에 불과하던 유방암이 2000년 조사에서는 여성암의 15.1%로 15.6%의 위암 다음으로 많은 암이 되고 있다. 단지 숫자상으로 증가했다는 정도 뿐만 아니라 그 증가 속도가 빠르기에 더욱 우려가 되는 실정이다. 불과 15년 사이에 그 발생률이 50%이상 증가하였다. 멀지 않은 시기에 유방암이 여성 암 중 제일 많은 비중을 차지하는 암이 될 전망이다. 동양인은 서구인에 비해 대체적으로 유방암 발생빈도가 낮은 편이다. 2000년 통계를 보면, 한국인의 유방암 발생률이 23명/100,000명, 일본인이 20~30명/100,000인 것에 비해, 미국(백인) 111.8명/100,000명, 미국(흑인) 95.4명/100,000명의 수준이다. 서구인들은 나이가 많아짐에 따라 유방암 발생빈도가 증가하는 것에 반해 국내의 유방암은 40대에서 가장 많은 빈도이고 그 다음이 50대, 60대 그리고 30 대의 순이다.

유방암의 발생 원인에는 여러가지가 있겠지만 가장 중요하게 작용하는 것은 여성 호르몬이다. 이 외에도 유전적인 영향이 크다. 가족 중에 유방암이 있는 경우 유전자 검사를 통하여 일부 유전자의 변형이 있는 경우 그 발생률이 높은 것을 확인할 수 있다. 그 외에도 지방식이 많은 음식 등이 또 하나의 원인으로 인식되고 있다.

유방암 발병률이 높은 여성이 가장 효과적인 예방치료 방법을 선택하는 문제는 그리 단순하지 않다. 어떤 여성들은 양쪽 가슴을 예방차원에서 제거(양쪽유방절제술)하기도 한다. 이 수술이 유방암이 발생할 확률을 크게 낮추기는 하지만 완전한 것은 아니다. 유방절제술을 받고 난 후에도 남아 있는 소량의 유방조직에서 암이 발생하는 여성들도 있기 때문이다. 이러한 방법 대신에 정기적인 전문의의 진찰과 유방조영술 등을 포함한 면밀한 감시 프로그램을 선택하는 여성들도 있다.

한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미(Nephila clavata)로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(수탁번호 : KCTC 0268BP; WO 01/57222호)를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임(arayzme)을 분리한 바 있다. 아라자임(arazyme)은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라 사람의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하였으며 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인한 바 있다(WO 01/57222호).

본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주에서 유래한 아라자임(arazyme)의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231)에서 p21, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2), p-p38, PKC(Protein Kinase C) 및 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1)의 발현은 감소시키고 카탈라제(catalase)의 발현은 증가시키는 것을 확인하고 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius)가 생산한 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius)의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방용 건강식품을 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 p21 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen) 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2) 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 p-p38 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 PKC(Protein Kinase C) 발현 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1) 발현 억제제를 제공한다.

아울러, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 카탈라제(catalase) 발현 촉진제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주가 생산하는 효소로서, 1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; 2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및 3) 상등액내 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다. 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(WO 01/57222호).

본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하는 것이 바람직하며, 하기와 같은 방법으로 생산된 아라임을 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주의 배양을 위해서 사용하는 원료는 순수 정제시 보다 편하고 고순도의 결과물이 나올 수 있는 의약품 수준의 것이 바람직하며, 배양 후, 암모늄설페이트 침전(또는 아세톤 침전)을 수행한다. 이러한 암모늄설페이트 또는 아세톤 침전 후, 원심분리 및 여과를 통하여 아라자임만을 회수한다. 이는 미생물에서 생산이 되는 다른 대부분의 단백질은 아라자임과 침전 농도가 다른 것을 이용한 것이다. 아라자임을 회수한 후, 막여과를 이용한 1차 불순물의 정제 및 한외 여과기를 이용하여 마지막으로 순수 분리 정제하고 이렇게하여 수득된 용액 상태의 고농도 아라자임을 동결 건조기를 통해 파우더 타입으로 제조한 것을 이용한다.

또한 1) 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열의 DNA를 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 클로닝된 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 단계; 및 4) 상기 3)에서 선별된 숙주 세포에서 발현된 아라자임을 수득하는 단계를 통하여 아라자임을 제조할 수 있다.

상기 단계 1)에서 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열은 서열번호 2에 기재된 것, 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA라면 바람직하다. 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된 다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6× SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2× SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50℃에서 0.2× SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2× SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1× SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.

또한 발현 벡터로는 당업계에 널리 알려진 그람 음성세균 또는 그람 양성세균 등, 상업적으로 이용가능한 벡터를 이용할 수 있으며 스크리닝을 위한 약제 내성 유전자가 도입되면 바람직하다. 아라자임 유전자에 어떤 영향을 주지 않는 다면, 어떠한 벡터라도 무방하다.

상기 단계 2)의 숙주 세포로는 세균인 E. coli 및 Bacillus subtilis 등이 있으며, 효모인 Saccharomyces cerevisiae, Candia 및 Phicia로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 3)의 형질전환된 숙주 세포의 선별은 벡터로 도입한 약제 내성 유전자를 이용한 스크리닝과 서던 블랏팅(Southern blotting) 또는 PCR을 이용한 스크리닝을 병용하여 선별하는 것이 바람직하다.

상기 단계 4)에서 수득된 아라자임은 단백질의 어떠한 정제 방법에 따라서 정제된 것이더라도 실질적으로 정제된 단백질이라면 포함된다. 이러한 정제된 단 백질의 예를 들자면, 상술의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석 또는 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합하여 실질적으로 정제된 단백질을 예로 들 수 있지만, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다.

상기와 같이 DNA로부터 코딩되는 아라자임은 당업자에게 널리 알려진 단백질 발현계를 이용하여 얻을 수 있다. 또한 아라자임을 발현하는 세포의 배양물로부터 회수·정제될 수 있다.

본 발명의 아라자임은, (a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; (b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질; (c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및 (d) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나이면 바람직하다.

상기 혼성화를 엄격한 조건하에서 실시하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA가 선별되어 결과적으로 분리되는 단백질에는 아라자임과 기능적으로 동일한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들면, 서열번호 2에 기재된 염기 서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직 하게 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 가진 서열을 의미한다. 또한 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 높은 상동성의 서열이라면 가능하다. 상기의 상동성 비율은 당업계의 당업자에 의해 선택된 보통의 알고리즘으로 결정될 수 있다.

상기 혼성화는 당해업계에 잘 알려진 엄격한 조건(Hames and Higgins, Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, U.K.)하의 DNA-DNA 혼성화로 제공되며 혼성화에서 엄격한 조건은 상기에서 언급하였듯이 혼성화 후 세정 시에 결정된다.

본 발명자들은 상기 아라자임의 유방암에 대한 항암 효능을 검정하기 위하여, 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 아라자임(60 ㎍/㎖)을 처리한 후 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. 상기의 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)는 인간의 유선종양 세포 중 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)를 갖고 있지 않는 악성 유방암 세포주이다(Liu Y, et. al., Biochem Biophys Res Commun. 2006;344: 1263-1270; Wyatt CA, et. al., Cancer Res. 2005;65: 11101-11108).

종양세포에 대한 아라자임의 적용은 CDK(Cyclin Dependent Kinase)의 저해제로서 사이클린(cyclin) A,D,E 등의 발현을 조절함으로써 종양세포의 성장, 분화에 관여하는 단백질로 알려진 p21(Westhof G, et. al., Tumour Biol. 2006, 27: 252- 60; Rayala SK, et. al., Cancer Res. 2006, 66: 5985-5988)의 발현을 현저하게 하향조절시킨다.

MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase) 세포내 신호 전달 과정(intracellular signaling pathway)에 속하는 p38은 스트레스-관련 메커니즘(stress-related mechanism)에 의해서 발현되는 단백질로 유방암 세포에서 세포 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있는데(Lowe LC, et. al., Biochem Biophys Res Commun. 2005,329: 772-779; Pettersson F, et. al., Oncogene. 2004, 23: 7053-7066), 인간 유방암 세포에 처리된 아라자임에 의해 p38의 발현이 억제된다.

또한 단백질 키나아제(protein kinase)로서 세포 성장/분화/유전자 발현에 관여하며, 악성 종양에서 상향조절되는 PKC(Protein Kinase C)(Pettersson F, et. al., Oncogene. 2004, 23: 7053-7066; Ribeiro-Silva A, et. al., Histol Histopathol. 2006, 21: 373-382; Tan M, et. al., Oncogene. 2006, 25: 3286-3295)의 발현도 인간 유방암 세포에 처리된 아라자임으로 하향조절함으로써 종양세포의 증식 억제에 영향을 주는 것으로 관찰되었다.

또한, 종양세포의 증식의 표지 마커 단백질인 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)(Kumaraguruparan R, et. al., Res Vet Sci. 2006, 81: 218-224; Lyzogubov V, et. al., Exp Oncol. 2005, 27: 141-144), 종양의 혈관 신생의 마커로 알려진 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)(Kou B, et. al., Oncol Res. 2005, 15: 239-247), 종양의 침습과 전이에 관여하는 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1)(Zhang C, et. al., Mol Ther. 2006, 13: 947-955; Wyatt CA, et. al., Cancer Res. 2005, 65: 11101-11108) 및 BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2)(Kumaraguruparan R, et. al., Res Vet Sci. 2006, 81: 218-224; Emi M, et. al., Breast Cancer Res. 2005, 7: R940-R952; Sirvent JJ, et. al., Histol Histopathol. 2004, 19: 759-770)의 단백질 발현이 아라자임을 처리하지 않은 대조군에 비해서 유의하게 억제된다.

한편, 종양의 발생에 있어서 종양세포가 산생하는 ROS(Reactive Oxygen Species)는 종양세포의 증식에 중요한 것으로 알려져 있는데(Tas F, et. al., Med Oncol. 2005, 22, 11-15), 과산화수소(hydrogen peroxide)와 같은 ROS를 제거함으로써 종양 발생을 억제하는 역할을 하는 카탈라아제(catalase)(Tas F, et. al., Med Oncol. 2005, 22, 11-15; Ozkan A, et. al., Exp Oncol. 2006, 28: 86-88)의 발현이 인간 유방암 세포에서 아라자임의 처리에 의해서 상향조절되는 것이 관찰됨으로써, 아라자임의 작용은 종양세포의 성장과 증식 그리고 분화를 억제할 뿐만 아니라, 악성 종양에 있어서 종양의 전이에 관여하는 MMP 및 PKC를 억제함으로써 종양세포의 전이 억제 효능을 나타내는 것으로 사료된다.

상기의 결과를 다시 한번 종합해보면 아라자임은 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)세포에서 p21, PCNA, VEGF, p-p38 및 PKC를 하향조절함으로써 종양세포의 성장, 분화 및 증식을 억제하고 것으로 종양세포의 침습성 및 전이와 관련된 BCl2 및 MMP-1의 발현을 억제하고, 종양 발생 억제 역할의 카탈라아제(catalase)를 증가시킨다(도 1 및 도 2 참조).

또한 아라자임을 암컷 위스터(Wistar) 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수 행한 결과, 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도에서 일반증상과 육안 병리 소견에서 아무런 이상 소견이 나타나지 않았다. 이상과 같이 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 5,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다. 그러므로 본 발명의 아라자임은 유방암 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투 여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 p21 발현 억제제, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen) 발현 억제제, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 발현 억제제, BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2) 발현 억제제, p-p38 발현 억제제, PKC(Protein Kinase C) 발현 억제제, MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1) 발현 억제제 및 아라자임을 유효성분으로 함유하는 카탈라제(catalase) 발현 촉진제를 제공한다.

본 발명의 아라자임은 상술한 바와 같이, 유방암 세포에서 실험한 결과, 종양 세포 성장, 증식 또는 분화에 관련된 p21, PCNA, VEGF, BCl2, p-p38 및 PKC의 발현을 저해하고, 종양 발생을 억제하는 카탈라제의 발현을 촉진하므로 각각의 발현 억제제 및 발현 촉진제로 이용될 수 있다.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. 유효 성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 아라자임 ( arazyme )의 제조

본 발명의 유효성분인 아라자임(arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius) HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화 나트륨 0.1 %, 염화 칼륨 0.05 %, 염화 칼슘 0.02 %, 황산 마그네슘 0.02 %)에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과(2 ㎛ filter, Satorius, USA)를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막여과(10 kDa Memebrane filter, Pall sept, PALL Corporation, USA)를 이용하여 농축하였다. 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose, Sigma, USA)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin, Sigma USA)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75, Sigma USA)를 이용한 젤 여과 교환 수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다. 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다. 단, 아라자임 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠수 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 가진다.

<실시예 2> 세포배양

본 발명에서는 에스트로겐 수용체에 음성(Estrogen receptor negative)인 인 간 유방암 세포주 MDA-MB-231(HTB-26)을 이용하였으며 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 분양받아 사용하였다.

<2-1> 세포배양 조건

본 시험에 사용된 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 암피실린(ampicillin )이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2 ~ 3일 마다 계대 하면서 배양하였다. 또한, 세포 배양용 디쉬는 모두 멸균된 제품을 사용하였다.

<2-2> 아라자임의 처리

인간 유방암 세포(MDA-MB-231)는 6웰에 각각 6×10⁵세포/웰의 세포를 접종한 후 37℃ 배양기에 하룻밤 동안 배양하였고 시험 물질 처리 전 4 시간 동안 1% FBS가 포함된 차단(starvation) 배지로 교체하여 배양함으로써 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유도하였다. 아라자임(arazyme)을 주사용 멸균주사용수에 희석한 후 60 ㎍/㎖의 농도로 조제하여 적용한 후 다시 24 시간 동안 37℃ 배양기에 배양하였다.

<실험예 1> 아라자임 처리가 단백질의 발현에 미치는 영향 조사

상기 실시예 2에서와 같이 아라자임(arazyme)을 처리한 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 있어서 종양 발생과 관련 있는 단백질들의 발현 양상을 관찰하기 위하여 면역블랏팅(immunoblotting)을 실시하였다. 0.1 mM 나트륨오르토바나드산염(sodium orthovandate, Na₃VO₄)과 단백질분해효소 억제제 칵테일 타블렛(protease inhibitor coctail tablet, Roche, Germany)을 용해시킨 RIPA 완충액에 아라자임(60 ㎍/㎖)을 처리한 MDA-MB-231 세포를 융해시킨 후 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 수득하였다. 수득된 세포질 단백질 시료를 브래드포드(Bradford) 방법(Bradford MM. Anal. Biochem. 1977;72: 248-254)에 따라서 단백질 농도를 측정한 후 각각의 단백질 시료를 80 g/웰로 8 ~ 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용해서 전기영동을 수행하였다. 전기영동된 겔 내의 단백질을 PVDF 막(PVDF membrane ; Schleicher & Chuell, Dassel, Germany)에 전기이동(electro-transfer)을 수행하였다. 같은 양의 단백질이 로딩된 것을 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통해 확인하였다. 3% 우혈청 알부민(Bovine serum albumin)을 인산완충식염수에 용해시킨 차단용액(Blocking solution)에 1 시간 동안 차단 과정 후, 1차 항체인 p-21(Santa Cruz Biotechnology Inc, USA), β-Actin(1:500 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)에 반응시켰다. 0.5% 트윈(Tween) 200이 용해된 TBS 완충액에 충분히 세척하고 1차 항체에 대응하는 2차 항체인 항-염소-HRP-항체(Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 1:1,000 ~ 1:2,000의 비율로 희석하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 다시 TBS 완충액으로 충분히 세척 후 특이적인 반응을 관찰하기 위해 화학발광기질(Super signal West Dura Extended Duration Substrate, PIERCE, USA)과 반응시키고 의학용 X-ray 필름(Kodak, Japan)에 노출시켰다. p-21 이외의 1차 항체로는 p-p38, PCNA(proliferating cell nuclear antigen), VEGF(vascular endothelial growth factor), BCl2, MMP-1(matrix metalloproteinase 1) 및 카탈라아제(catalase)를 사용하였으며 상기 항체의 제조사는 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA이다. 상기의 1차 항체에 해당하는 각각의 2차 항체를 이용하여 상기와 같은 방법으로 수행하였다. p-p38에 대응하는 2차 항체는 항-토끼-HRP-항체, PCNA에 대응하는 2차 항체는 항-염소-HRP-항체, VEGF에 대응하는 2차 항체는 항-염소-HRP-항체, BCl2에 대응하는 2차 항체는 항-토끼-HRP-항체, MMP-1에 대응하는 2차 항체는 항-마우스-HRP-항체, 카탈라아제(catalase)에 대응하는 2차 항체는 항-염소-HRP-항체로 하였으며, 상기 2차 항체의 제조사는 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA이다.

그 결과, 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 아라자임(60 ㎍/㎖)의 적용은 p21, PCNA, VEGF 및 BCl2의 현저한 억제 효능을 나타내었으며, 또한, 아라자임을 처리하지 않은 대조군에 비해 p-p38, PKC 및 MMP-1의 발현이 감소한 것이 관찰되었으며, 카탈라아제에 있어서는 아라자임 처리군에서 발현 양이 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 1).

또한, 상기의 결과를 바탕으로 하여 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)에 아라자임(60 ㎍/㎖)을 처리한 후 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 단백질의 발현변화 정도를 상대적 비율로 나타내었으며(도 2), 결과는 도 1과 같다.

<실험예 2> 아라자임의 급성 독성실험

본 발명의 아라자임의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

위스터(Wistar) 계통의 9주령 특정병원체부재(SPF) 암컷 랫트((주)오리엔트, 대한민국, 서울)에 대해 각각 4마리씩 4개군으로 나누어, 온도 22± 3℃, 습도 55± 10%, 조명 12L/12D 조건의 동물실 내에서 사육하였다. 랫트 입수 후 동물실에서 1 주일간 검역 및 순화과정을 거쳤다. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자(240W X 390L X 175H mm)에서 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. 실험 동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 미국)는 멸균하였으며, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취시켰다.

상기 실시예의 아라자임을 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도로 주사용 멸균주사용수에 용해하여 10 ㎖/㎏의 용량으로 조재하여 랫트에 경구투여용 존데(zonde)를 이용하여 단회 경구 투여하였다. 일주일간의 순화 기간을 거쳐서 4개의 그룹으로 분리 한 후 10 주령의 랫트에 아라자임 농도별로 투여한 후 일반 증상 관찰을 실시하였다. 이 후 아라자임의 실질 장기에 대한 독성을 평가하기 위해서 24 시간 후 부검을 실시하였다.

암컷 랫트에 아라자임을 경구 투여한 후 시험물질 투여에 따른 일반증상을 정확하게 관찰하고 독성을 평가하기 위해서 동물의 행동, 외관, 기능에 대한 관찰을 실시하였다.

실험결과, 아라자임 투여 후 동물의 활동성, 보행, 기질, 경련 등에 있어서 는 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았으며, 피모 상태, 안구주변, 귀, 생식기, 사지 상태, 꼬리 상태 등의 동물의 외관 관찰 및 호흡 상태, 타액분비, 분변, 구토 등의 기능 관찰에서도 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았다. 아라자임 투여 24 시간 후에 부검을 실시한 결과, 육안부검 소견에서도 전장기에서 아라자임 투여에 의한 아무런 이상도 관찰되지 않았다. 아라자임 치사량(LD₅₀)은 5000 ㎎/㎏이상의 고농도인 것으로 판단된다. 현미경학적 관찰에 있어서 간, 심장, 폐 및 췌장 등의 실질 장기에서는 아무런 병리학적 이상 소견이 관찰되지 않았다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

아라자임 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

아라자임 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

아라자임 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 주사액제의 제조

아라자임 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

<제제예 2> 식품의 제조

상기 제제예 1의 산제, 정제, 캡슐제, 환 및 과립을 식품에 응용하여도 무방하며, 상기의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품(dairy products)의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

<제제예 3> 음료의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임(0.5 중량부)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 야채쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<3-3> 과일쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

인간 유방암 세포에 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(arazyme)을 처리하면 종양세포의 성장, 분화, 증식 및 전이에 관련된 p21, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2), p-p38, PKC(Protein Kinase C) 및 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1)의 발현은 감소되며 종양 발생을 억제하는 역할을 하는 카탈라제(catalase)의 발현은 증가되므로, 본 발명의 아라자임은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Insect Biotech <120> pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention and treatment of breast cancer <130> 7p-03-04 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Aranicola proteolyticus <220> <221> BINDING <222> (192) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (196) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (323) <223> Zn binding site <400> 1 Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His 20 25 30 Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr 35 40 45 Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly 50 55 60 Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp 100 105 110 Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr 130 135 140 Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn 165 170 175 Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His 180 185 190 Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala 195 200 205 Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Arg Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser 245 250 255 Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly 290 295 300 Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val 325 330 335 Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly 355 360 365 Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln 420 425 430 Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu 435 440 445 Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly 450 455 460 Gly His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp 465 470 475 480 Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 485 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Aranicola proteolyticus <400> 2 cgagcgcgaa agacccggaa ggcacgaggt gattagtcaa aaaaagaaaa tgttattcct 60 gcgggaacta aaaagtaccg gcggctaata ataaagagtt attaatctat aacgctttag 120 ccaaatttaa cttttagccg tctaaatccc agcacgattc gcttggctct gcaggccgca 180 tttttgttgg agtttgttac caactcatgg catttaagtt tcattaatat tgtaaataat 240 gcaaaaaacc agcataaatc cccttcgtaa cgataataaa tggctgatta ttttatgtgc 300 agttttacac cgctgcctat aattggaatc gattaccatt tatggtggta atcttatttg 360 ctgatatata tgcattaatt ctctctaaca cactgccggt ancggcgcat aaactccttc 420 ccgtaagcgt gcggttcgtt ctccgtggct tcctggcagg ttatgtctat ctgtctgatt 480 gaaaccaatc agctaatgag tggaatcgaa ccaatgcaat ctactaaaaa ggcaattgaa 540 attactgaat ccagccttgc ggctgcgagc tccgcttaca atgcagtaga tgatttgctg 600 cattatcatg agcgaggcaa cgggattcag gttaatggca aggactcatt ttctaccgaa 660 caagccgggc tgtttattac ccgcgagaac caaacctgga acggttataa agtttttggc 720 caaccggtta aattaacgtt ctctttcccg gattataaat tctcttccac caacgtcgcc 780 ggcgataccg gactgagcaa attcagcgcg gaacagcagc agcaggctaa gctgtcgctg 840 cagtcctggt ctgacgtggc caatatcacc tttaccgaag ttggtgccgg ccagaaggcc 900 aatatcacct tcggtaacta cagccaggat cgtcccggcc attatgacta cgatacccag 960 gcttacgcct tcctgccgaa caccatttat cagggccaaa acctgggcgg gcagacttgg 1020 tacaacgtca accagtccaa cgtgaaacat ccggccagcg aagactacgg ccgccagacc 1080 tttacccacg agattggcca tgcgttgggc ttgagccatc cgggcgatta caacgccggc 1140 gaaggcaacc cgacttacag agatgccagc tacgccgaag atactcgtga gttcagcctg 1200 atgagttact ggagcgaaac caacaccggt ggcgacaacg gcgggcacta cgctgcggcg 1260 ccactgctgg atgacatttc cgctattcag catctgtatg gtgccaacca gaccacccgt 1320 accggcgata ccgtgtatgg cttcaactca aataccggac gtgacttcct cagtaccacc 1380 agcaatccgc aaaaagtgat ctttgcggcc tgggatgcgg gtggtaatga caccttcgat 1440 ttctccggtt acaccgctaa ccagcgtatt aatctgaacg agaaatcttt ctccgacgtg 1500 ggtgggctga aaggcaacgt gtccattgcc gcaggtgtga ccatcgagaa cgcgattggc 1560 ggttcaggca atgacgtgat cgtcggcaat gcggccaaca acgtgctgaa aggtggcgcg 1620 ggcaacgacg tgctgttcgg cggtggtggg gctgatgagc tgtggggcgg tgcgggcaaa 1680 gacacctttg tcttctctgc ggtcagcgat tctgcgccgg gtgcctccga ctggatcaag 1740 gatttccaga aaggcatcga taaaatcgac ctgtcattct tcaatcaggg cgcgcagggt 1800 ggcgatcaga tccacttcgt cgatcatttc agtggcgcag cgggcgaagc cttgctgtct 1860 tacaatgcgt cgaataacgt cagcgatctg gccctgaata tcggcggcca tcaggccccg 1920 gacatcctgg tgaagatcgt cggccaggtt gatgtcgcca ctgactttat cgtttaacag 1980 tgcaggtgct aacgcccggc gccggttggc cgggcgttat acaggagacg atatgaaggg 2040 cagcttagcg cacgccgcct tagtggcagg cggcatgatg gttacggggg cagttatggc 2100 cagcagtttg gttcttccca gcgcgcaatc attggcgggg caatggctgg tcgccaatgc 2160 cgaacaacaa tgtcagattg agtttttggc cggtgaacag agtgaaatca acggctactc 2220 attggttgat cggcagcact gtttggaaaa ggtgttaacc gccgaggtgg tcggttggcg 2280 ccctgcaccg gacggcatcg ctttgctgcg ggcggatggc agtacgctgg cgttcttctc 2340 gcgcgatggc gatatttacc gcaaccagct tggcgcggat gacggactga cgctgaaagc 2400 gctggtataa caacagcggg ttcggcagtc gaacccgccc tgagcagcct tacagataca 2460 gcgaacgtac gatcaggaaa t 2481

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 갖는 DNA에 의해 코드되는 단백질인 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 갖는 DNA에 의해 코드되는 단백질인 아라자임을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방용 건강식품.
제 5항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 유방암 예방용 건강식품.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 p21 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 BCl2(B-cell CLL/lymphoma 2) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 p-p38 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 PKC(Protein Kinase C) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1(Matrix MetalloProteinase-1) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 카탈라제(catalase) 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.