CN101663045B - 一种用于预防和治疗癌症的包含蜘蛛酶的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的含有活性成分蜘蛛酶的药物组合物。更确切地说，当将从Aranicolaproteolyticus中制备的蜘蛛酶给予用人肺癌细胞株移植的裸小鼠时，观察到裸小鼠的体重增加、肿瘤细胞的生长和浸润受到抑制，以及MMP-9、NF-κB和PCNA的下调。此外，当用蜘蛛酶处理人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)时，观察到参与肿瘤细胞生长、分化、增殖和转移的p21、PCNA(增殖细胞核抗原)、VEGF(血管内皮生长因子)、PKC(蛋白激酶C)和MMP-1(基质金属蛋白酶-1)的下调，以及抑制肿瘤发展的过氧化氢酶的上调。因此，蜘蛛酶可被有效地用作预防和治疗癌症的药物组合物。

Description

一种用于预防和治疗癌症的包含蜘蛛酶的组合物
本申请要求2007年12月28日提交的PCT/KR2007/006938的权益，其内容通过引用的方式全文并入于此。
技术领域
本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的包含活性成分蜘蛛酶(arazyme)的组合物，更确切地，涉及一种预防和治疗癌症的包含由Aranicolaproteolyticus制备的蜘蛛酶的组合物。
背景技术
肿瘤是由不可控的无序异常细胞增殖发展而来。如果该肿瘤表现出破坏性的生长、侵入和转移，则被视为是一种恶性肿瘤。侵入的特性是浸润或破坏周围组织，特别是，形成组织边界的基底层被该特性破坏，导致肿瘤的局部扩散，且有时会导致肿瘤通过循环系统流入。转移指肿瘤细胞通过淋巴或血管从原发地扩散至其它区域。从广义上说，转移还指肿瘤细胞通过浆液性体腔或其它空间的直接扩散。
遗传因素以及后天的环境因素均可导致癌症。而且发达国家具有更高的癌症发病率。原因可能是食品中残留的农药和杀虫剂量的增加；包含食品保鲜剂、防腐剂和着色剂的加工食品的消耗量的增多；水、油和空气污染的增多；现代人压力的增大；活动的减少；以及丰富饮食的生活导致的肥胖(Kim HJ等Liv Sci of Tj Univ.3：99-130，1997；Jacobs MM，Nutr Tod，28(3)：19-23，1993)。
血管增生对于肿瘤的生长和转移是必需的(Folkman J，J NatlCancer Inst，82：4-6，1990)。血管增生可为生长的肿瘤提供营养和氧气，且使得肿瘤细胞能够从原发性损伤处通过血管壁渗透和转移至远端的器官(Kim KJ等，自然，362：841-844，1993)。
迄今为止，外科手术、放疗和化疗已被单独或联合用于治疗癌症。外科手术是一种清除病变组织的方法。因此，特定区域例如胸腔、结肠和皮肤的肿瘤可以通过外科手术得到有效清除。然而，脊椎骨中的肿瘤或者像白血病这样的分散性的肿瘤不能通过外科手术合适地治疗。
化疗阻断细胞的复制或新陈代谢，且已经用于治疗乳腺癌、肺癌和睾丸癌。然而，通过化疗进行治疗的癌症患者遭受了严重的全身化疗的副作用。晕动病和呕吐是其中常见但严重的实例。化疗的副作用可能使患者的适应性迅速下降，因此甚至可以影响患者的生活。此外，DLT(剂量限制性毒性)也是化疗的主要副作用之一，其引起了医学管理界的密切注意。粘膜炎是针对抗癌剂(例如作为反新陈代谢的细胞毒性剂的5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤以及抗癌抗生素，例如阿霉素)的DLT的一个实例实例。如果患者遭受化疗的这种严重副作用，他或她应该就医，并服用止痛药以减少疼痛。因此，化疗和放疗的副作用是治疗癌症患者的最大问题。传统的抗癌剂不仅杀死肿瘤细胞，还杀死普通细胞。因此，最近的研究已经关注于开发可只杀死肿瘤细胞，而不触及普通细胞的新型抗癌剂。
本发明人试图开发一种新型蛋白酶。结果，发明人从Nephilaclavata中分离了这种新型微生物Aranicola proteolyticus HY-3(保藏号：KCTC 0268BP；WO 01/57222)。并且从该菌株中分离了一种新型蛋白酶，蜘蛛酶(arazyme)。蜘蛛酶在低温和高盐度时表现出高的酶活性；尤其在人体温度37℃时表现出最高活性，且在宽的pH范围内表现出稳定的酶活性。因此，本发明人鉴定了这种具有前景的新型蛋白酶的基因(WO 01/57222)。
本发明人研究了来自于Aranicolaproteolyticus的蜘蛛酶的作用。结果，发明人发现蜘蛛酶增加用人肺癌细胞株(A549)移植的裸小鼠的体重，但抑制该裸小鼠中的肿瘤细胞增长、降低MMP-9，NF-κB和PCNA表达、降低p21、PCNA(增殖细胞核抗原)、VEGF(血管内皮生长因子)、p-p38，PKC(蛋白激酶C)和MMP-1(基质金属蛋白酶-1)表达，但增加在人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中过氧化氢酶的表达。基于这个发现，本发明人通过确认蜘蛛酶可以被有效用于预防和治疗癌症的组合物完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于预防和治疗癌症的包含从Aranicolaproteolyicus中产生的蜘蛛酶的组合物，以及使用该组合物预防和治疗癌症的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于预防和治疗癌症的包含活性成分蜘蛛酶的药物组合物。
本发明还提供用于预防癌症的包含Aranicola proteolycius培养基或者从其中分离的活性成分蜘蛛酶的保健食品。
本发明还提供一种包括给予癌症患者药学上有效剂量的蜘蛛酶的步骤的癌症治疗方法。
本发明还提供一种包括给予癌症患者药学上有效剂量的蜘蛛酶的步骤的癌症预防方法。
另外，本发明提供蜘蛛酶在用于制备预防和治疗癌症的药物中的应用。
有益效果
本发明的从Aranicola proteolycius中产生的蜘蛛酶减少参与肿瘤细胞的生长、变异、增殖和转移的MMP-9、NF-κB、p21、PCNA(增殖细胞核抗原)、VEGF(血管内皮生长因子)、BC12(B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤2)、p-p38、PKC(蛋白激酶C)以及MMP-1(基质金属蛋白酶-1)表达，但增加起抑制肿瘤发展作用的过氧化氢酶的表达。
附图说明
参考附图，本发明的优选实施方案的应用可以被很好地理解，其中：
图1示出了对用人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给予蜘蛛酶之后观测到的体重变化：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；以及
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图2示出了对用人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测的肿瘤大小：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
*：p＜0.05；以及**：p＜0.01。
图3是一组图示在对用人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的病理变化的照片(x13和x33)：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图4是一组图示在对按人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的MMP-9的免疫组织学变化的照片(x33和x66)：
对照实验：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图5是示出在对按人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的MMP-9的免疫组织学表达水平的图表：
对照实验：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图6是一组图示在对按人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的NF-kB的免疫组织学变化的照片(x33和x66)：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图7是示出在对按人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的NF-kB的免疫组织学表达水平的图表：
对照实验：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图8是一组图示在对用人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的PCNA的免疫组织学变化的照片(x66和x132)：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图9是示出在对用人肺癌细胞株A549移植的裸小鼠给药之后观测到的PCNA的免疫组织学表达水平：
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
图10示出了免疫印迹法检查在用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理的人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中参与肿瘤细胞的生长、变异、增殖和转移的蛋白质的表达变化的的结果。
图11是图示在用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理的人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)中参与肿瘤细胞的生长、变异、增殖和转移的蛋白质的表达变化，该变化用比率表示。
本发明详述如下。
本发明的蜘蛛酶可通过包括以下步骤的方法制备：
1)通过培养Aranicolaproteolycius得到培养液；
2)过滤上述培养液得到上清液；以及
3)使用树脂从该上清液中纯化出蜘蛛酶。
在该方法中，产生蜘蛛酶的微生物优选为Aranicola proteolycius，特别是，更优选于1996年7月29日在KRIBB(韩国生命工学研究院)KCTC(韩国典型菌种保藏中心)(保藏号KCTC0268BP)保存的Aranicola proteolyticus HY-3，但不总是限于此。Aranicola proteolyticusHY-3是从棒络新妇(Nephila clavata)的肠中分离的革兰氏阴性(Gram-negative)好氧菌，大小为0.5～0.8mm，圆形，能够自己移动，其对过氧化氢酶表现阳性但对氧化酶(WO 01/57222)表现阴性。
在本发明中，优选使用从以上微生物中获得的蜘蛛酶，并优选通过以下方法得到。尤其是，培养Aranicola proteolyticus的基本材料优选药品级，这有利于轻松地纯化，并得到高纯度产品。在培养之后，用硫酸铵进行沉淀(或丙酮沉淀)，然后进行离心和过滤，回收蜘蛛酶。大多数从该微生物中制备得到的其它蛋白质与蜘蛛酶的沉淀物浓度不同。在回收蜘蛛酶之后，通过膜过滤进行第一次纯化，以除去杂质，最后使用超过滤系统进行最后的纯化，以得到纯蜘蛛酶。将所获得的高浓度的蜘蛛酶溶液冻干，得到蜘蛛酶粉末。
本发明的蜘蛛酶可以通过以下方法制备：
1)将包含蜘蛛酶的编码区的核苷酸序列的DNA克隆至表达载体；
2)将步骤1)的表达载体引入宿主细胞；
3)选择步骤2)中被转化的宿主细胞；以及
4)获得从步骤3)中选取的从宿主细胞中表达的蜘蛛酶。
在该方法中，包含步骤1)的蜘蛛酶的编码区的核苷酸序列优选为序列号2所示的DNA或者在严格条件下用含有序列号2所示的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。该严格条件在混合之后的冲洗期间确定。例如，该严格条件表示在室温下用6×SSC，0.5％SDS冲洗15分钟、在45℃用2×SSC，0.5％SDS冲洗30分钟，并在50℃用0.2×SSC、0.5％SDS冲洗30分钟，上述冲洗过程重复两次。更优选地，该严格条件表示，在更高温度下进行冲洗。特别地，除了最后两次冲洗是在60℃用0.1×SSC，0.5％SDS冲洗30分钟或者在65℃用0.1×SSC，0.1％SDS冲洗30分钟，在与上述条件相同的条件下进行冲洗，。这种严格的条件可以由本领域的技术人员确定或调整。本发明的表达载体优选为本领域的技术人员所熟知的传统革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌。也可以使用商用载体，该载体优选包括便于更好地筛选的耐药基因。只要不影响蜘蛛酶基因，可以使用任何载体。
在上述方法中，步骤2)的宿主细胞可选自细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)和酵母(例如酿酒酵母、Candia和Phicia)的组合中选取，但不总是限于此。
在上述方法中，通过使用引入到载体的耐药基因单独筛选或与使用萨瑟恩印迹技术或者PCR的筛选联用，对在步骤3)中成功转化的宿主细胞进行选择。
在上述方法中，步骤4)中的蜘蛛酶可以通过任意蛋白质纯化方法获得。例如，蛋白质纯化的实例是柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀法、溶剂萃取法、蒸馏法、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点电泳、透析或重结晶，但不总是限于此。由DNA编码的蜘蛛酶可以通过本领域的技术人员所熟知的常规的蛋白质表达系统获得。蜘蛛酶也可以通过回收和纯化过程从细胞培养中获得。
本发明的蜘蛛酶优选从以下蛋白质中选择，但不总是限于此：
(a)包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b)由包含序列号2所示的核苷酸序列的编码区的DNA所编码的蛋白质；
(c)由序列号1所示的氨基酸序列通过替换和/或删除其中一种或多种氨基酸，插入和/或添加一种或多种氨基酸突变得到的氨基酸序列组成的的蛋白质，该蛋白质功能上等同于包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质。
(d)由在严格条件下与包含序列号2所示的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的蛋白质，该蛋白质功能上等同于包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质。
在严格条件下的杂交得到具有高的核苷酸序列同源性的DNA，这一点表明，很可能这种分离的蛋白质具有与蜘蛛酶功能相同的蛋白质。该具有高同源性的核苷酸序列表明该核苷酸序列与序列号2所示的核苷酸序列具有超过70％的同源性，与序列号2所示的核苷酸序列具有优选超过80％、更优选超过90％且最优选超过95％的同源性。可以使用与序列号1所示的氨基酸序列具有超过70％同源性、与序列号1所示的氨基酸序列具有优选超过80％、更优选超过90％且最优选超过95％的同源性的氨基酸序列。同源性的比率可以由本领域技术人员选择常规算法来确定。可以通过在本领域的技术人员所熟知的严格条件下的DNA-DNA杂交来进行杂交，如前所述，涉及到杂交后的冲洗步骤(英国，IRL Press，Hames和Higgins，Eds.(1985)Nucleic AcidHybridization)。
本发明提供一种用于预防和治疗癌症的包含活性成分蜘蛛酶的药物组合物。
此处的癌症可以选自肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、脑瘤、胰腺癌、胰头癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食道癌、小肠肿瘤、肛门癌、输卵管癌、内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、盆腔癌和CNS(中枢神经系统)肿瘤。
为了研究蜘蛛酶的抗癌效果，本发明人将人肺腺癌细胞株(A549)移植到裸鼠，将裸鼠分成4组：对照组(用0mg/kg的蜘蛛酶处理)、T1(用150mg/kg的蜘蛛酶处理)、T2(用300mg/kg的蜘蛛酶处理)、以及T3(用600mg/kg的蜘蛛酶处理)。将蜘蛛酶重复地进行口服给药(参见表1)。蜘蛛酶被溶于用于注射的消毒液，通过使用针(zonde)将该消毒液按每周6次口服给药。在给予蜘蛛酶后观察体重变化和其它的常规症状。并一周一次观察肿瘤的发展情况，如果证实，则测量其大小。在给予蜘蛛酶12周之后，进行尸体解剖。通过肉眼和显微镜，所有器官均没有观察到病理变化。在分别给予了300mg/kg和600mg/kg的蜘蛛酶的T2和T3中证实了体重的增加(参见表2和图1)。测量从人肺癌细胞株(A549)移植裸小鼠中得到的肿瘤的大小，并使用苏木素一伊红染色染色法进行免疫组织学观测。结果，在T2(用300mg/kg的蜘蛛酶处理)和T3(用600mg/kg的蜘蛛酶)中证实了蜘蛛酶剂量依赖性抑制肿瘤作用和肿瘤细胞浸润抑制作用(参加图2和3)。
基质金属蛋白酶(MMPs)是一种蛋白酶，尤其用于分解细胞外基质(ECM)(Matrisan LM，Trends Genet，6：121-125，1990)。可以理解，当MMPs增加时，肿瘤浸润和转移伴随各种癌症的炎症而增加(Stearns MA等，癌症研究，53：878-883，1993)。分解IV型胶原是转移的第一步，该步骤使渗入血液流成为可能，所述IV型胶原是血管基底膜的最重要的结构。在众多MMPs中通过MMP-9和MMP-2分解IV型胶原(Liotta LA等，细胞，64：327-336，1991)。MMP被公认是血管内皮细胞的迁移和血管生成的发生所必需的一个重要因素(Fisher C等，Devel Biol，162：499-510，1994)。MMP的活性通过以下步骤调控：1)MMP基因的转录调控；2)前体活性；3)脂质特异性的差异；和4)MMP抑制剂，如α-巨球蛋白和组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)(Birkedal-Hansen.H，J periodontol，64：474-484，1993)。包括丝裂原活化蛋白(MAPKs)、细胞因子，和肿瘤激活子的生长因子参与调节MMP-9表达的更高信号转导机制。在这些因子中，p38激酶和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)被炎性细胞因子或细胞凋亡相关信号和生长因子激活。被激活的MAPKs转移到细胞核，与MMP来源周围的转录因子结合位点反应，激活各种转录因子以调节靶蛋白低表达。大多数癌症细胞通过基质浸润、通过血液系统从原发灶迁移到继发灶，以及产生继发瘤的过程，从原发灶转移到继发灶。对于癌症细胞浸润过程，细胞外基质必然被蛋白酶分解，这个时候MMPs在分解细胞外基质的过程中发挥了关键作用。在各种MMPs中，MMP-2和MMP-9分别是72和92kDa的胶原酶，该72和92kDa胶原酶分解形成细胞基底膜的胶原以加速癌症浸润和转移(Himelstein BP等，Invasion Metastasis，14：246-258，1994)。
本发明人使用人肺癌细胞株(A549)移植裸小鼠进行实验，结果证实，给予蜘蛛酶减少了MMP-9表达(参见图4和5)，这表明蜘蛛酶具有抗癌作用。
核转录因子-κB(NF-κB)是由各种环境刺激激活的转录因子诱导物(Baeuerle，PA和Baichwal，VR，Adv Immunol 65：111-137，1997；Auphan，N等，科学，270：286-290，1995)。在细胞质中，休眠的NF-κB结合到抑制剂蛋白I-κB上。各种NF-κB活化剂，如肿瘤坏死因子、IL-1、脂多糖和UV(紫外线)诱导I-κB通过磷酸化和泛素化降解。通过这个过程，NF-κB从I-κB分离，然后转移到原子核，与位于靶基因的促进剂区域的NF-κB结合位点结合，以激发靶基因表达(Baldwin，AS，Annu Rev Immunol，14：649-683，1996；Huxford T等，Cell，95：759-770，1998)。NF-κB也是关系药物耐熔性的一个重要因子。它在细胞因子的合成中起重要作用。当它作为引发参与免疫反应或炎症反应的各种基因的表达的转录因子而被激活时，它迁移到细胞核，并增加炎症反应相关基因的表达。
本发明人使用人肺癌细胞株(A549)移植裸小鼠进行实验，结果证实，给予蜘蛛酶减少了NF-κB表达(参见图6和7)，这表明蜘蛛酶具有抑制肿瘤生长的作用。
PCNA在细胞周期的G0期没有被发现，但在G1期开始增加，在S期表现出最高水平，并在G2期减少。PCNA是具有36kDA大小的细胞内DNA聚合酶δ的蛋白(coprotein)，它对于细胞内DNA合成和细胞增殖是必需的(Miyagawa S等，J Invest Dematol，93：678-681，1989)。通常，组织-免疫荧光法(histoimmunofluorescence)PCNA是一个重要的测试指标，能指示在什么区域、有多少PCNA参与肿瘤的生长。据称，PCNA表达与角化细胞增殖、胶质增生、染色皮肤病灶、以及非小细胞肺癌PCNA的病理分级有关(Underhill C，J Cell Sci，103：293-298，1992)。
本发明人使用人肺癌细胞株(A549)移植裸小鼠进行实验，结果证实，给予蜘蛛酶减少了PCNA表达(参见图8和9)，这表明蜘蛛酶具有抑制肿瘤生长的作用。
为了检验蜘蛛酶的抗癌效果，本发明人用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，然后观察参与肿瘤细胞生长、分化、增殖和转移的蛋白质水平。在所有的人乳腺癌细胞株中，人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)是没有雌激素受体的恶性癌细胞株(Liu Y等Biochem Biophys Res Commun.2006；344：1263-1270；Wyatt CA等Cancer Res.2005；65：11101-11108)。CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)抑制剂p21是通过调控细胞周期蛋白A、D和E的表达来参与肿瘤细胞生长和分化的蛋白质(Westhof G等Tumour Biol.2006，27：252-60；Rayala SK等Cancer Res.2006，66：5985-5988)。
本发明人证实，蜘蛛酶能够抑制人乳腺癌细胞中的p21表达。
P38参与MAPK(分裂原活化蛋白激酶)的细胞内信号转导通路，是通过压力相关机制表达的蛋白质，众所周知，它也能刺激乳腺癌细胞生长(Lowe LC等Biochem Biophys Res Commun.2005，329：772-779；Pettersson F等Oncogene.2004，23：7053-7066)。
本发明人证实，蜘蛛酶抑制人乳腺癌细胞中的p38表达。
蛋白激酶参与细胞的生长/分化/基因表达，且PKC(蛋白激酶C)在恶性肿瘤中被上调(Pettersson F等Oncogene.2004，23：7053-7066；Ribeiro-Silva A等，Histol Histopathol，2006，21：373-382；Tan M等，Oncogene.2006，25：3286-3295)。
本发明人证实，蜘蛛酶下调乳腺癌细胞中的PKC(蛋白激酶C)的，表明蜘蛛酶对肿瘤细胞增殖具有抑制作用。
本发明人还证实，与没有经过处理的对照组相比，蜘蛛酶显著抑制人乳腺癌细胞中参与肿瘤浸润和转移的PCNA(增殖细胞核抗原)(Kumaraguruparan R等Res Vet Sci.2006，81：218-224；Lyzogubov V等Exp Oncol.2005，27：141-144)、肿瘤细胞增殖的标记蛋白、VEGF(血管内皮生长因子)(Kou B等，Oncol Res.2005，15：239-247)、血管增生的标记蛋白、MMP-1(基质金属蛋白酶-1)(Zhang C等，MolTher.2006，13：947-955；Wyatt CA等，Cancer Res.2005，65：11101-11108)；和BC12(B-细胞CLL/淋巴瘤2)(Kumaraguruparan R等Res Vet Sci.2006，81：218-224；Emi M等Breast Cancer Res.2005，7：R940-R952；Sirvent JJ等Histol Histopathol.2004，19：759-770)的表达。
在肿瘤发展中，肿瘤细胞产生的ROS(活性氧)是肿瘤细胞增殖的关键因素(Tas F等Med Oncol.2005，22，11-15)。过氧化氢酶在消除ROS样过氧化氢时起作用，表明过氧化氢酶具有抑制肿瘤发展的作用(Tas F等Med Oncol.2005，22，11-15；Ozkan A等Exp Oncol.2006，28：86-88)。
本发明人观察到，蜘蛛酶上调入乳腺癌细胞中的过氧化氢酶表达的。以上结果表明，蜘蛛酶不仅抑制肿瘤细胞生长、增殖和分化，而且抑制MMP和PKC，这两者都参与恶性肿瘤的转移，因此蜘蛛酶对转移具有抑制作用。
本发明人对雌性Wistar大鼠口服给予蜘蛛酶，以研究毒性。结果，在0，1250，2500和5000mg/kg的浓度下通过肉眼没有观察到异常迹象或者病理症状。因此，在此次实验中口服给予的蜘蛛酶被评价为安全物质，因为在大鼠中，其估计的LD50值比5000mg/kg大得多。因此，本发明的蜘蛛酶可以被有效地用作预防和治疗乳腺癌的组合物。
除了蜘蛛酶，本发明的组合物还可以包括一种或多种具有与蜘蛛酶相同或相似功能的有效成分。本发明的组合物可以被口服或注射给药，并被用在通常的剂型中。可以通过将活性成分与通常使用的填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、稀释剂，如表面活性剂或赋形剂混合，将本发明的组合物制备为可用于口服或者注射给药。固体口服制剂有片剂、丸剂，粉剂和胶囊。这些固体制剂通过将活性成分与一种或多种合适的赋形剂如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等混合制备。除了简单的赋形剂，也可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁，滑石粉等。液体口服剂为悬浮液、溶液、乳剂和糖浆，而且除了常用的简单的稀释剂如水和液体石蜡之外，上述制剂还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂，芳香剂和防腐剂。注射剂为无菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮液，乳液和栓剂。除了活性化合物，水不溶性赋形剂和悬浮液还可以包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，像橄榄油，可注射酯，像ethylolate等。除了活性化合物，栓剂还可以包含半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可黄油、劳林黄油，甘油化明胶等。还可以根据各种疾病及成分，按照伊斯顿PA(Easton PA)的Mack出版社(Mack Publishing Company)出版的雷明顿药学(Remington’s Pharmaceutical Science)(最新版)中所示的方法将该组合物制备成合适的形式。
本发明用于预防和治疗癌症的的组合物可以被口服或者注射给予(例如静脉、皮下、局部或腹腔注射)。该组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法，排泄情况和疾病的严重程度来确定。蜘蛛酶的剂量为每天0.01～5000mg/kg，优选为每天0.01～10mg/kg，给药频率为一天一次或者优选一天几次。
本发明还提供一种癌症的治疗方法，包括给予癌症患者药学上有效剂量的蜘蛛酶的步骤。
另外，本发明还提供蜘蛛酶在用于制备预防和治疗癌症的药物中的应用。
如前所释，对人肺癌细胞株(A549)移植裸小鼠和乳腺癌细胞给予蜘蛛酶。结果，蜘蛛酶抑制参与肿瘤细胞生长、增殖和分化的MMP-1、MMP-9、NF-κB、p21、PCNA、VEGF、BC12，、p-p38和PKC表达，但刺激抑制肿瘤发生的过氧化氢酶的表达。因此，本发明的蜘蛛酶可以被有效地用于发展预防和治疗癌症的方法，该方法包括给予癌症患者蜘蛛酶，或用于制备癌症的预防和治疗药物。
本发明还提供用于预防癌症的保健食品，该食品包含Aranicolaproteolyticus培养基或者从该培养基中分离得到的活性成分-蜘蛛酶。
Aranicola proteolyticus培养基或者从该培养基中分离的蜘蛛酶可以用作食品添加剂。在这种情况下，Aranicola proteolyticus培养基或者从该培养基中分离的蜘蛛酶可以根据常规方法，直接添加或者与其他食品成分混合后添加。蜘蛛酶通过与前述相同的方法获得。活性成分的混合比率可以根据使用目的(预防、健康或治疗)调整。通常，如果生产食品或饮料，Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶优选以0.01～10重量份，更优选以0.05～1重量份添加。然而，如果为了健康和保健或者改善健康状况而需要长期给药，该含量可以少于上述，但是由于蜘蛛酶已经被证明非常安全，因此可以多于上述量。
本发明对食品没有限制。例如，Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶可以被添加到肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、饼干、比萨饼、拉面(ramyun)、面条产品、口香糖、乳制品包括冰淇淋，汤、饮料、茶叶、饮品、酒类饮品及维生素复合物等，事实上，几乎所有适用于保健食品生产的各种食品都被包括在内。
本发明用于健康饮料的组合物还可以包括各种香料或天然碳水化合物等，如其它饮料。上述天然碳水化合物可以是以下之一：单糖，如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及带糖份的酒精制品，如xilytole，山梨醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，天然甜味剂如沙马汀和甜叶菊提取物或人工甜味剂如糖精和阿斯巴甜都可以使用。天然碳水化合物与本发明的组成物的比率优选为每100ml 0.01～0.04g，更优选为每100ml 0.02～0.03g。
除了以上所述的成分以外，本发明的Aranicola proteolyicus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶可以包含于各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、精氨酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精，用于被添加到苏打中的碳酸盐等中。本发明的Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶也可以包括于天然果汁，水果饮料中和/或可添加到蔬菜饮料中的果肉中。所有提到的成分可以单独或一起添加。事实上那些成分的混合比率并不重要，但是一般来说，每100重量份的本发明的Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶，可以添加0.01～0.1重量份的每种成分。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明实用的和目前优选的实施方案进行详细说明。
然而，本领域的技术人员应能理解，在本发明公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内对之进行修改和改进。
实施例1：蜘蛛酶的制备
为了制备本发明的活性成分蜘蛛酶，将Aranicola proteolyticusHY-3(KCTC 0268BP)在培养基(细菌用胰蛋白胨0.5％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.1％，氯化钾0.05％，氯化钙0.02％，硫酸镁0.02％)中，于22℃下培养18个小时。对培养液进行膜过滤(美国，Satorius，2μm过滤器)，从细胞中分离出上清液。通过膜过滤(美国，Pall sept，PALL有限公司，10kDa膜过滤器)浓缩该上清液。本发明的蜘蛛酶具有阴离子的特性。因此，通过使用经50mM三(羟基)氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl)缓冲液(pH 7.6)预处理的二乙氨基乙基(DEAE)纤维素(Sigma，美国)的离子交换树脂和使用经20mM三(羟基)氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl)缓冲液(pH 7.6)预处理的葡聚糖G-75(美国，Sigma)的凝胶过滤交换树脂对蜘蛛酶进行纯化。将纯化的酶溶液在10％SDS-PAGE上(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)电泳，观察到了条带图案。结果，确认蜘蛛酶是一种不具有亚基的单体，显示的条带大小约为51.5kDa。可将Aranicolaproteolyticus HY-3(KCTC0268BP)在各种工业介质中进行培养，且它的培养液可以通过各种不同方法进行分离和纯化。本发明的蜘蛛酶具有序列号1所示的多肽序列以及序列号2所示的多核苷酸序列。
实施例2：实验小鼠的安置和给药
本发明中使用5周龄的无特定病原体(SPF)CAnN.Cg-Foxnlnu/CrljBgi系裸小鼠(韩国，Orient，15g)。
将这些小鼠在动物实验室中观察并适应7天。在适应期间，观察全身的症状，仅选取健康的动物用于实验。
将这些小鼠在配置有自动温度/湿度调节器、温度设置在22±3℃，相对湿度被调整到55±10％，且灯光间隔被设置为12小时(08:00开灯，20:00关灯)的动物实验室中适应和饲养。经环境检查，没有检测到任何可能影响实验的环境的改变。在整个实验期间，将小鼠在聚碳酸酯笼中[240W×390L×175H(mm)]中饲养，每笼5只。通过使用油料记号和区分卡的皮肤标记进行个体识别。实验动物(美国，印第安纳47374，里士满北四街505，PMI国际营养组织)的固体饲料经过照射(13.2kGy)消毒之后可随意提供。自来水经过碳过滤器纯化之后可使用水瓶随意进行供给。
适应一周后，人肺腺癌细胞(A549)被移植到这些小鼠(对每只小鼠移植1×107个细胞)的左侧腋窝下，以形成肿瘤。将这些被移植的小鼠分成4组，每一组分别用0mg/kg的蜘蛛酶(对照实验)、150mg/kg的蜘蛛酶(T1)、300mg/kg的蜘蛛酶(T2)、及600mg/kg的蜘蛛酶(T3)处理12周(表1)。该处理为使用zonde进行口服给药，一周6次。在整个实验期间，观察体重变化和其它的一般症状。12周后，进行尸体解剖。
实验组的构成如表1所示。
【表1】
实验组的构成
  组   标记   异种移植物(S.C.)   口服给予蜘蛛酶
  对照   1-10   A5491×107个细胞/小鼠   0mg/kg
  T1   11-20   A5491×107个细胞/小鼠   150mg/kg
  T2   21-30   A5491×107个细胞/小鼠   300mg/kg
  T3   31-40   A5491×107个细胞/小鼠   600mg/kg
实施例3：细胞培养
在本发明中，使用从ATCC(美国标准生物品保藏中心)分配提供的雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(HTB-26)。
<3-1>细胞培养条件
每2-3天，在37℃、5％CO2培养箱中，将该人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)在辅以10％FBS(胎牛血清)和1％氨苄西林的DMEM中进行继代培养。
<3-2>蜘蛛酶处理
在6孔皿(6×105个细胞/每孔)中接种人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)，然后在37℃培养过夜。在用处理蜘蛛酶之前4小时用含有1％FBS的饥饿培养基代替该培养基，导致细胞周期阻滞。在60μg/Ml浓度的无菌注射液中稀释蜘蛛酶，处理后将其移至培养皿。在37℃的培养箱中将该培养皿再培养34小时。
实验例1：蜘蛛酶处理导致的体重变化
用与实施例2中描述的相同的方法将人肺癌细胞株(A549)移植到裸小鼠。一周测量一次体重，以记录体重变化，还研究其它的一般症状。
在整个实验周期(12周)中，经过蜘蛛酶处理的小鼠的体重增加，尤其是用300mg/kg蜘蛛酶(T2)和600mg/kg蜘蛛酶(T3)处理的实验组中的体重变化显著(表2和图1)。
【表1】
小鼠体重
对照：按0mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T1：按150mg/kg口服给予蜘蛛酶；
T2：按300mg/kg口服给予蜘蛛酶；和
T3：按600mg/kg口服给予蜘蛛酶。
实验例2：通过蜘蛛酶处理抑制肿瘤生长
将人肺癌细胞株(A549)移植到裸小鼠。从第5周开始，用裸眼观察肿瘤，从那以后用卡尺测量每只小鼠的肿瘤大小，一周一次，测量8周。根据以下公式1测量肿瘤的长轴和短轴，以计算肿瘤的体积。
<公式1>
肿瘤体积(mm3)＝(长轴×短轴)/2
结果，在整个实验周期中，与对照组相比，在用300mg/kg蜘蛛酶的实验组(T2)和用600mg/kg蜘蛛酶处理的实验组(T3)中观察到肿瘤大小显著减小(图2)。
实验例3：蜘蛛酶对肺癌组织的作用
将人肺癌细胞株移植到裸小鼠。12周以后，将这些小鼠用乙醚麻醉、杀死，取出肿瘤和器官。将肿瘤称重。取出心、肝、肺、胰脏，肾和脾。将肿瘤和器官固定在10％中性福尔马林中24个小时，并用自动组织处理器进行组织处理。将组织处理完成的肿瘤和器官包埋在石蜡中，并以4μm的厚度切片。将这些切片用苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察。
结果，与对照组相比，在用蜘蛛酶处理过的实验组中肿瘤细胞浸润进行缓慢(图3)。
实验例4：蜘蛛酶对MMP-9表达的作用
对于MMP-9的免疫组织学研究，将用福尔马林固定的石蜡包埋的组织以4μm的厚度切片，然后去石蜡。将切片用3％H2O2处理30分钟，以抑制内源性过氧化物酶的活性，然后用0.01M磷酸盐缓冲液盐水(PBS)冲洗。接着用0.01M柠檬酸缓冲液处理切片，以增加组织抗原表达，然后用微波热处理。为了抑制非特异性反应，在37℃，用20g/Ml的蛋白酶K处理切片10分钟，并用PBS冲洗，然后封闭1小时。在4℃，用抗兔一抗MMP-9(美国，Santa Cruz Bio，1∶100)处理切片过夜，并用PBS冲洗3次，共5分钟，然后和生物素偶合。将生物素偶合的一抗用缓冲液冲洗，与抗生蛋白链菌素的HRP(辣根过氧化物酶)结合，然后用Histostantin-plus bulk kit试剂盒(美国，ZymedLaboratories公司)在30℃下反应30分钟。在彻底冲洗之后，用DAB(3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐，美国Zymed Laboratories公司)溶液诱导显色。用蒸馏水冲洗之后，用Meyer的苏木精(美国遗传学研究公司(Research genetics，USA))进行复染，然后在光学显微镜下观察。
结果，与该对照组相比，用蜘蛛酶处理过的实验组中的MMP-9表达减少了(图4和5)。
随着MMPs(基质金属蛋白酶)的产生，肿瘤细胞浸润和转移也伴随各种癌症病例的炎症而增加。这个过程通过MMPs中的MMP-9和MMP-2实施。尤其，包括MAPKs、细胞因子和肿瘤激活子的生长因子参与调节MMP-9表达的更高信号转导机制。因此，MMP-9的下调表明了肿瘤浸润和转移得到抑制，
实验例5：蜘蛛酶对NF-κB表达的作用
通过与实验例4中描述的相同的步骤对NF-κB的进行免疫组织学观察。本发明的一抗是抗兔一抗NF-κB(美国，Cell SignalingTechnology公司，1∶200)，而不是MMP-9。
结果，与对照相比，用蜘蛛酶处理的实验组中的NF-κB表达减少(图6和7)。
NF-κB是由各种环境因素激活的转录因子诱导剂。它也是涉及药物耐熔性的重要因素。它在细胞因子合成中起重要作用。当其被激活作为转录因子，诱导参与免疫反应或炎症的各种基因表达时，它迁移到细胞核，并增加与炎症相关的基因表达。因此，NF-κB的上调表明癌症得到抑制。
实验例6：蜘蛛酶对PCNA表达的作用
通过与实验例5中描述的相同的步骤对PCNA的进行免疫组织学观察。此处的一抗是抗小鼠一抗PCNA(美国，Santa Cruz Bio，1∶800)，而不是MMP-9。
结果，与对照相比，用蜘蛛酶处理的实验组中的PCNA表达减少了(图8和9)。
PCNA是DNA聚合酶δ的蛋白(coprotein)。PCNA表达被认为与角质形成细胞增殖、胶质、染色皮肤损伤、以及非小细胞肺癌的病理分级有关。因此，对PCNA进行组织-免疫荧光法处理是一个重要的指标，表明在什么区域、有多少PCNA参与肿瘤的生长。
实验例7：蜘蛛酶对人乳腺癌细胞蛋白质表达的作用
通过免疫印迹法，使用在实施例3中用蜘蛛酶处理的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)研究参与肿瘤发展的蛋白质表达。将用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理的MDA-MB-231细胞在包含蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂(德国，曼海姆，罗氏)和0.1mM原钒酸钠(Na3VO4)的RIPA缓冲液中悬浮，然后在14000rpm，4℃下离心分离20分钟，以分离上清液。通过布拉德福法(布拉德福MM.Anal.Biochem.1977；72：248-254)测量被回收的胞浆蛋白的浓度，并将每个蛋白质样本(80g/孔)在8～12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电转移到PVDF薄膜(德国，Dassel，Schleicher和Chuell)上。进行考马斯亮蓝染色以确认是否加载了同等数量的蛋白质。在包含3％牛血清蛋白的封闭液中将该蛋白质封闭1小时，然后与一抗p-21(美国，圣克鲁斯生物技术公司)和β-肌动蛋白(美国，圣克鲁斯生物技术公司，1∶500)进行反应。接着，用含0.5％吐温(Tween)200的TBS缓冲液彻底冲洗，再与同该一抗对应的二抗-抗山羊HRP抗体(美国，圣克鲁斯生物技术公司，1∶1000～1∶2000)在室温下反应1小时。在用TBS缓冲液彻底冲洗后，将该蛋白质与化学发光底物(美国，PIERCE，super signal West DuraExtended Duration Substrate)反应，并在临床X-射线薄膜(日本，柯达)上曝光，以观察特异性反应。除了p-21，p-p38、PCNA(增殖细胞核抗原)、VEGF(细胞内皮生长因子)、BC12、MMP-1(基质金属蛋白酶1)和过氧化氢酶也被用作一抗。所有的抗体均由美国圣克鲁斯生物技术公司提供。选择与上述一抗相对应的二抗。与p-p38对应的二抗是抗兔HRP抗体，与PCNA对应的二抗是抗山羊HRP抗体，与VEGF对应的二抗是抗山羊HRP抗体，与BCl2对应的二抗是抗兔HRP抗体，与MMP-1对应的二抗是抗小鼠HRP抗体，与过氧化氢酶对应的二抗是抗山羊HRP抗体。所有这些抗体均由美国圣克鲁斯生物技术公司提供。
结果，用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)造成p21、PCNA、VEGF和BCl2显著下调。与未处理的对照组相比，p-p38，PKC和MMP-1表达也减少了。相反，用蜘蛛酶处理的实验组中的过氧化氢酶表达增加了(图1)。
测量用蜘蛛酶(60μg/Ml)处理的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中的肿瘤生长、分化、增殖和转移，并用相对比率表示(图2)。结果如图1所示。
实验例8：蜘蛛酶的急性毒性
进行以下实验以观察本发明的蜘蛛酶在大鼠中是否具有急性毒性。
在本次实验中使用将9周龄的无特定病原体(SPF)Wistar系雌性大鼠(韩国，Orient)。将这些鼠分为4组，每组四只，在22±3℃、55±10％的湿度，且12L/12D的光线条件下的动物实验室中饲养。这些大鼠在动物实验室中被观察和适应7天。在整个实验期间，将这些大鼠在聚碳酸酯笼[240W×390L×175H(mm)]中放置，每笼5只。通过使用油料记号和区分卡的皮肤标记进行个体识别。实验动物(美国，PMI国际营养组织)的固体饲料经过消毒之后在任何时间均可提供。自来水在任何时间使用水瓶进行供给。
将蜘蛛酶以0、1250、2500及5000mg/kg的不同浓度溶解在无菌注射液中。使用zonde对这些大鼠口服给予蜘蛛酶溶液(10ml/kg)一次。在1周的适应期之后，将这些大鼠分为4组，对那些10周龄的大鼠给予不同浓度的蜘蛛酶。24小时后，进行尸体解剖，以研究蜘蛛酶对每种器官的毒性。
研究大鼠的行为、外观和功能，根据蜘蛛酶的口服给药来评估毒性和观察雌性大鼠全身的症状。
结果，在给予蜘蛛酶后的动物中未观察到与姿态、行走、脾气和抽搐有关的异常症状。此外，在外观，包括毛皮、眼周区域、耳朵、外生殖器，四肢和尾巴处以及在例如呼吸，流涎，粪便，呕吐等功能方面均未检测到异常变化。通过解剖24小时之后的研究，也可以确认，在各器官中都没有由蜘蛛酶引起的任何异常症状。估计蜘蛛酶的LD50至少为5000mg/kg。在显微镜下，在肝、心、肺和脾中未观察到病理变化。
本发明组合物的制备实施例如下文所述：
制备实施例1：药物制剂的制备
<1-1>粉末的制备
蜘蛛酶       2g
乳糖         1g
按照常规的粉末制备方法，将上述组分混合并制成粉末，填充于密封袋内。
<1-2>片剂的制备
蜘蛛酶       100mg
玉米淀粉     100mg
乳糖         100mg
硬脂酸镁     2mg
按照常规的片剂制备方法将上述组分混合，制成片剂。
<1-3>胶囊的制备
蜘蛛酶      100mg
玉米淀粉    100mg
乳糖        100mg
硬脂酸镁    2mg
按照常规的胶囊制备方法将上述组分混合，填充于胶囊中，制成胶囊。
<1-4>丸剂的制备
蜘蛛酶    1g
玉米淀粉  1.5g
甘油      1g
木糖醇    0.5g
按照常规的丸剂制备方法，将上述组分混合，制成丸剂。每丸含有4g上述混合物。
<1-5>颗粒剂的制备
蜘蛛酶     150mg
大豆提取物 50mg
葡萄糖     200mg
淀粉       600mg
将上述所有组分混合，添加100mg的30％乙醇。在60℃干燥该混合物，并将所制备的颗粒剂填充于包装袋中。
<1-6>注射液的制备
蜘蛛酶               10μg/ml
稀盐酸BP             直到pH值为7.6
注射用的氯化钠BP     最大1ml
将蜘蛛酶溶解在适量注射用的NaCl BP中。用稀盐酸将所制备溶液的pH值BP调至7.6。使用注射用的NaCl BP调节溶液的体积。将该溶液充分混合后填入5ml I型透明玻璃安瓿瓶中。通过熔化玻璃嘴密封安瓿瓶，然后将安瓿瓶在120℃下高压灭菌至少15分钟。
制备实施例2：食品的制备
在制备实施例1中制备的粉末、片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以被应用于食品。包含Aranicolaproteolyticus培养基或者蜘蛛酶的食品制备如下。
<2-1>面粉食品的制备
向面粉中添加0.1～10.0重量份Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶。按照常规方法用该面粉混合物制备改善健康的食品，例如面包、蛋糕、曲奇、饼干和面条。
<2-2>汤和肉汤的制备
向汤和肉汤中添加0.1～1.0重量份本发明的Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶。按照常规方法用该混合物制备出改善健康的肉类产品、汤和肉汤。
<2-3>碎牛肉的制备
按照常规的方法将10重量份的Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶与碎牛肉混合，制备出改善健康的碎牛肉。
<2-4>乳制品的制备
向牛奶中添加0.1～1.0重量份Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶。按照常规的方法用该牛奶混合物制备乳制品，例如奶油和冰淇淋。
<2-5>Sunsik的制备
通过常规方法将糙米，大麦，糯米和薏米(薏苡job’s tear)凝胶化，然后进行干燥，并粉碎，得到60目大小的粉末。
用常规方法将黑豆，黑芝麻和紫苏蒸熟和干燥，并粉碎，得到60目大小的粉末。
将Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶减压浓缩，喷雾干燥，并粉碎，得到60目大小的干燥粉末。
将谷物、种子，和Aranicolaproteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶的干燥粉末按以下比率全部混合，制备出Sunsik。
谷物(糙米：30重量份、薏米：15重量份，大麦：20重量份，糯米：10重量份)，
种子(野生芝麻：7重量份、黑豆：8重量份，黑芝麻：7重量份)，
Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶的干燥粉末(1重量份)，
灵芝(0.5重量份)，
地黄(0.5重量份)。
制备实施例3：饮料的制备
包含Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶的饮料制备如下。
<3-1>健康饮料的制备
将Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶(0.5重量份)与液体果糖(0.5重量份)、低聚糖(2重量份)、糖(2重量份)，盐(0.5重量份)和水(75重量份)混合。在完全混合之后，立即进行消毒并填充于小容器例如玻璃瓶、保特瓶(pet bottle)等，制备出健康饮料。
<3-2>蔬菜汁的制备
按照常规方法将0.5g Aranicola proteolyticus培养基或者从其中分离的蜘蛛酶添加到1000ml的西红柿或胡萝卜汁中，制备得到改善健康的蔬菜汁。
<3-3>水果汁的制备
按照常规方法将0.1g Aranicola proteolyticus培养基或者与从其中分离的蜘蛛酶添加到1000ml的苹果或葡萄汁中，制备得到改善健康的水果汁。
本领域的技术人员应将理解，前述说明书中公开的概念和具体的实施方案可以被轻易地用作修改或设计可实现本发明的相同目的其它实施方案的基础。本领域的技术人员也将理解，这些等同的实施方案并未背离如所附的权利要求书中所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110>金英赛得科技有限公司
 
<120>一种用于预防和治疗癌症的包含蜘蛛酶的组合物
 
<130>9fpo-06-27
 
<150>KR102006136707
<151>2006-12-28
 
<150>KR10200730856
<151>2007-03-29
 
<150>PCT/KR2007/006938
<151>2007-12-28
 
<160>2
 
<170>KOPATIN 1.5
 
<210>1
<211>487
<212>PRT
<213>Aranicola proteolyticus
 
<220>
<221>结合
<222>(192)
<223>Zn结合位点
 
<220>
<221>结合
<222>(196)
<223>Zn结合位点
 
<220>
<221>结合
<222>(323)
<223>Zn结合位点
<400>1
Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala
  1            5               10                  15
Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His
           20               25                   30
Glu  Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr
       35               40               45
Glu  Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly
    50               55              60
Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp
 65               70              75                80
Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys
              85              90                95
Phe  Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp
          100             105               110
Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys
      115               120              125
Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr
   130              135              140
Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln
145              150             155               160
Gly  Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn
             165              170              175
Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His
          180              185              190
Glu  Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala
      195              200              205
Gly  Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr
  210               215              220
Arg  Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser
                245                 250                 255
Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp
            260                 265                 270
Thr  Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr
        275                 280                 285
Thr  Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly
    290                 295                 300
Asn  Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn
305                 310                 315                 320
Leu  Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val
                325                 330                 335
Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly
           340                 345                 350
Asn  Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly
        355                 360                 365
Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp
    370                 375                 380
Gly  Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser
385                 390                 395                 400
Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp
                405                 410                 415
Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln
            420                 425                 430
Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu
       435                 440                 445
Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly
    450                 455                 460
Gly  His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp
465                 470                 475                 480
Val Ala Thr Asp Phe Ile Val
                485
 
<210>2
<211>2481
<212>DNA
<213>Aranicola proteolyticus
 
<400>2
cgagcgcgaa  agacccggaa ggcacgaggt gattagtcaa aaaaagaaaa tgttattcct 60
gcgggaacta  aaaagtaccg gcggctaata ataaagagtt attaatctat aacgctttag 120
ccaaatttaa  cttttagccg tctaaatccc agcacgattc gcttggctct gcaggccgca 180
tttttgttgg  agtttgttac caactcatgg catttaagtt tcattaatat tgtaaataat 240
gcaaaaaacc  agcataaatc cccttcgtaa cgataataaa tggctgatta ttttatgtgc 300
agttttacac  cgctgcctat aattggaatc gattaccatt tatggtggta atcttatttg 360
ctgatatata  tgcattaatt ctctctaaca cactgccggt ancggcgcat aaactccttc 420
ccgtaagcgt  gcggttcgtt ctccgtggct tcctggcagg ttatgtctat ctgtctgatt 480
gaaaccaatc  agctaatgag tggaatcgaa ccaatgcaat ctactaaaaa ggcaattgaa 540
attactgaat  ccagccttgc ggctgcgagc tccgcttaca atgcagtaga tgatttgctg 600
cattatcatg  agcgaggcaa cgggattcag gttaatggca aggactcatt ttctaccgaa 660
caagccgggc  tgtttattac ccgcgagaac caaacctgga acggttataa agtttttggc 720
caaccggtta  aattaacgtt ctctttcccg gattataaat tctcttccac caacgtcgcc 780
ggcgataccg  gactgagcaa attcagcgcg gaacagcagc agcaggctaa gctgtcgctg 840
cagtcctggt  ctgacgtggc caatatcacc tttaccgaag ttggtgccgg ccagaaggcc 900
aatatcacct  tcggtaacta cagccaggat cgtcccggcc attatgacta cgatacccag 960
gcttacgcct  tcctgccgaa caccatttat cagggccaaa acctgggcgg gcagacttgg    1020
tacaacgtca  accagtccaa cgtgaaacat ccggccagcg aagactacgg ccgccagacc    1080
tttacccacg  agattggcca tgcgttgggc ttgagccatc cgggcgatta caacgccggc    1140
gaaggcaacc  cgacttacag agatgccagc tacgccgaag atactcgtga gttcagcctg    1200
atgagttact  ggagcgaaac caacaccggt ggcgacaacg gcgggcacta cgctgcggcg    1260
ccactgctgg  atgacatttc cgctattcag catctgtatg gtgccaacca gaccacccgt    1320
accggcgata  ccgtgtatgg cttcaactca aataccggac gtgacttcct cagtaccacc    1380
agcaatccgc  aaaaagtgat ctttgcggcc tgggatgcgg gtggtaatga caccttcgat    1440
ttctccggtt  acaccgctaa ccagcgtatt aatctgaacg agaaatcttt ctccgacgtg    1500
ggtgggctga  aaggcaacgt gtccattgcc gcaggtgtga ccatcgagaa cgcgattggc    1560
ggttcaggca  atgacgtgat cgtcggcaat gcggccaaca acgtgctgaa aggtggcgcg    1620
ggcaacgacg  tgctgttcgg cggtggtggg gctgatgagc tgtggggcgg tgcgggcaaa    1680
gacacctttg  tcttctctgc ggtcagcgat tctgcgccgg gtgcctccga ctggatcaag    1740
gatttccaga  aaggcatcga taaaatcgac ctgtcattct tcaatcaggg cgcgcagggt    1800
ggcgatcaga  tccacttcgt cgatcatttc agtggcgcag cgggcgaagc cttgctgtct    1860
tacaatgcgt  cgaataacgt cagcgatctg gccctgaata tcggcggcca tcaggccccg    1920
gacatcctgg  tgaagatcgt cggccaggtt gatgtcgcca ctgactttat cgtttaacag    1980
tgcaggtgct  aacgcccggc gccggttggc cgggcgttat acaggagacg atatgaaggg    2040
cagcttagcg  cacgccgcct tagtggcagg cggcatgatg gttacggggg cagttatggc    2100
cagcagtttg  gttcttccca gcgcgcaatc attggcgggg caatggctgg tcgccaatgc    2160
cgaacaacaa  tgtcagattg agtttttggc cggtgaacag agtgaaatca acggctactc    2220
attggttgat  cggcagcact gtttggaaaa ggtgttaacc gccgaggtgg tcggttggcg    2280
ccctgcaccg  gacggcatcg ctttgctgcg ggcggatggc agtacgctgg cgttcttctc    2340
gcgcgatggc  gatatttacc gcaaccagct tggcgcggat gacggactga cgctgaaagc    2400
gctggtataa  caacagcggg ttcggcagtc gaacccgccc tgagcagcct tacagataca    2460
gcgaacgtac  gatcaggaaa t                                              2481

Claims (15)

1.蜘蛛酶在制备预防或治疗肺癌和乳腺癌的药物中的应用，
其中，所述蜘蛛酶是下列蛋白质中的一种：
（a）由序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质；和
（b）由序列号2所示核苷酸序列的编码区组成的DNA编码的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶从培养Aranicola proteolyticus获得的培养基中分离得到。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述Aranicola proteolyticus为Aranicola proteolyticus HY-3，保藏号为KCTC0268BP。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制MMP-9即基质金属蛋白酶-9的表达。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制NF-κB即核因子-κB的表达。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制PCNA即增殖细胞核抗原的表达。
7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制p21的表达。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制VEGF即血管内皮生长因子的表达。
9.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制BC12即B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤2的表达。
10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制p-p38的表达。
11.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制PKC即蛋白激酶C的表达。
12.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶抑制MMP-1即基质金属蛋白酶-1的表达。
13.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蜘蛛酶刺激过氧化氢酶的表达。
14.蜘蛛酶在制备预防和改善肺癌和乳腺癌的保健食品中的应用，所述保健食品包含培养Aranicola proteolycius获得的培养基或者从所述培养基中分离的蜘蛛酶作为活性成分，
其中，所述蜘蛛酶是下列蛋白质中的一种：
（a）由序列号1所示氨基酸序列组成的蛋白质；和
（b）由序列号2所示核苷酸序列的编码区组成的DNA编码的蛋白质。
15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述Aranicolaproteolyticus为Aranicola proteolyticus HY-3，保藏号为KCTC0268BP。
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