CN117603323A - 一种肉毒毒素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种肉毒毒素的制备方法。包括以下步骤：合成编码肉毒毒素前体蛋白的多核苷酸序列；将核苷酸序列克隆到含有表达载体中，构建得到重组表达载体；将表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌工程菌，大肠杆菌选自可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌，培养重组大肠杆菌工程菌，诱导表达肉毒毒素前体蛋白，经水解得到肉毒毒素。本发明未对肉毒神经毒素轻重链的序列进行任何优化和改动，将其完整序列全部插入表达质粒中，随后转化特定的大肠杆菌进行可溶性表达，保证了肉毒毒素的活性，简化了制备步骤。

Description

一种肉毒毒素的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种肉毒毒素的制备方法。
背景技术
梭菌(Clostridium botulinum)是一种土壤腐生性细菌，通常以芽孢形式广泛分布于自然界和动物肠道，在适当环境条件下(湿度、营养和厌氧)，芽胞发芽形成繁殖体，生长繁殖并产生包括肉毒毒素在内的多种毒素，而肉毒毒素是人类迄今为止发现的最强神经毒素，其血清型包括A、B、C、D、E、F和G等型别。肉毒神经毒素蛋白主要由重链(Heavy Chain，HC约100kDa)和具有酶活性的轻链(Light Chain，LC约50kDa)两部分组成，两者通过一个二硫键(S-S)链接，形成大小约150kDa有活性的肉毒神经毒素。其中神经毒素的重链负责与神经细胞表面受体结合，而轻链具有酶活性，在进入神经细胞后可特异性切割由蛋白质和神经元形成的复合体，从而阻断神经传导。
1989年，美国批准了世界上首个注射用A型肉毒毒素产品。随后，包括中国在内的其它国家相继批准了此类产品可用于人体疾病治疗。这些国内外已上市A型肉毒毒素均由致病性A型肉毒杆菌培养获得，安全生产风险较高。通过重组蛋白技术路线生产肉毒毒素不仅可以显著降低安全风险，还可以大幅提高毒素产量和纯度。迄今为止，全球仅有极少数公司实现了重组肉毒毒素的生产。
经过文献和专利检索，通常使用大肠杆菌高效表达外源蛋白质这一方法来制备重组肉毒杆菌神经毒素蛋白。为了在大肠杆菌体内表达肉毒神经毒素蛋白质，有研究者尝试采用密码子优化，在蛋白N末端或C末端加入硫氧还蛋白促进可溶性表达等方法来改进，也有研究者将肉毒神经毒素蛋白依据其功能人为分为两段或三段分开表达，再将表达获得的两段或三段蛋白在菌体内或体外拼接，从而获得完整的肉毒神经毒素蛋白。这些表达获得的蛋白质均为包涵体形式，即蛋白质已变性，往往需要将其复性并拼接的操作才能部分恢复其活性及功能。导致重组肉毒神经毒素蛋白质生产制备工艺复杂，成本高，产量低，质量不好控制。相比传统的经培养肉毒杆菌获得神经毒素方法没有显著优势，仅提供了一个不同于传统肉毒神经毒素生产制备的替代方法。
此外，肉毒杆菌分泌的神经毒素蛋白成熟过程包括：完整表达为一条肉毒神经毒素蛋白肽链经过其体内的激酶切割为轻链和重链两条链，同时经由二硫键将轻链和重链连接起来，形成具有活性的肉毒神经毒素。但目前表达所用的大肠杆菌，例如BL21感受态细胞，经过基因删除或插入等操作，去掉或抑制了大肠杆菌体内的消化类激酶(例如10N和/或ompT)，从而可在其体内大量表达异源蛋白而不被大肠杆菌体内激酶所切割，而这些激酶对于表达成功的肉毒神经毒素蛋白获得毒力非常重要，因此需要在体外应用激酶再次酶切才可以获得有活性神经毒素蛋白。
再者，通常大肠杆菌的细胞质为还原状态，不仅不利于二硫键的形成，还可以将已经组装好的蛋白质多肽链间的二硫键断开，因而在大肠杆菌体内无法直接获得具备二硫键连接的肉毒神经毒素蛋白。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肉毒毒素的制备方法。
本发明提供了一种肉毒毒素的制备方法，包括以下步骤：
S1、合成编码肉毒毒素前体蛋白的多核苷酸序列；
S2、将核苷酸序列克隆到含有表达载体中，构建得到重组表达载体；
S3、将表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌工程菌，冻存备用；大肠杆菌选自：可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌；
S4、培养重组大肠杆菌工程菌，诱导表达肉毒毒素前体蛋白；
S5、水解肉毒毒素前体蛋白，得到肉毒毒素。
可选的，可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌选自基因型为F-ompT hsdSB(r- B m- B)gal dcm lacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)的大肠杆菌。
可选的，S1中，多核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选的，S2中，表达载体采用含有T7启动子的pET质粒。
可选的，S4中，培养的温度为25～37℃，培养的条件为250～300转/分震荡培养。
可选的，S4中，培养采用的培养基为：1L超纯水中，含有蛋白胨10～20克，酵母提取物5～15克，氯化钠2～7克，磷酸二氢钾1～3克，磷酸氢二钾10～15克，甘油2～8毫升，氨基葡萄糖0.1～0.5％(质量百分比含量)，氯化锌0.1～0.4微摩尔。
可选的，S4中，诱导的条件为：培养至OD600达到1～10时，降低培养温度后添加IPTG进行诱导表达。
可选的，降低培养温度至18℃～25℃。
可选的，添加IPTG后诱导表达时间为24～36小时。
可选的，IPTG的终浓度为25μmol/L～1mmol/L。
可选的，水解所采用的酶为胰蛋白酶。
可选的，胰蛋白酶与肉毒毒素蛋白的质量比为1：100～1000，水解时间为20～30分钟，水解温度为25～37℃。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明通过一步法重组表达获得肉毒毒素蛋白前体，且该蛋白前体在上清液中，非包涵体表达，也不需要多次拼接组装。
为了解决肉毒神经毒素在大肠杆菌体内可溶性表达及形成正确二硫键，本发明选用了特定的大肠杆菌：可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌进行表达，从而实现了肉毒毒素前体蛋白的可溶性表达，并且所表达得到的肉毒毒素前体蛋白的轻链和重链之间的二硫键已形成完毕。
在优选的技术方案中，本发明还可以通过采用pET系列表达载体及适宜的表达条件提高了大肠杆菌体内肉毒神经毒素产量。经过解决上述技术问题，本发明可以在大肠杆菌体内完整表达包括A型肉毒毒素在内的所有血清型别的肉毒杆菌神经毒素蛋白并将可在体外将其轻重链精准切割开，从而与肉毒杆菌来源的神经毒素蛋白完全一致，并具有神经毒性等生物学活性。
附图说明
图1为电泳和蛋白免疫印迹检测的结果图；
图2为蛋白电泳的实验结果图；
图3为A型肉毒毒素的标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出一种肉毒毒素的制备方法，包括以下步骤：
S1、合成编码肉毒毒素前体蛋白的多核苷酸序列；
S2、将核苷酸序列克隆到含有表达载体中，构建得到重组表达载体；
S3、将表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌工程菌，冻存备用；大肠杆菌选自：可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌；
S4、培养重组大肠杆菌工程菌，诱导表达肉毒毒素前体蛋白；
S5、水解肉毒毒素前体蛋白，得到肉毒毒素。
本发明实施例制备方法可以可溶性表达肉毒毒素前体蛋白，非包涵体表达，仅需要水解即可完成制备，因此显著提高了生产效率，降低了成本。
作为本发明实施例一种改进的技术方案，可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌选自基因型为F-ompT hsdSB(r- B m- B)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)的大肠杆菌。本发明经过多轮筛选优化比较，终于获得了完整表达并可溶的肉毒神经毒素蛋白质，从而彻底摆脱了依赖肉毒杆菌才能大量获取神经毒素这一限制，为快速获得不同型别的肉毒神经毒素蛋白及对所获神经毒素蛋白进行多种修饰提供了可能。在该大肠杆菌中，二硫键异构酶有利于蛋白形成正确的二硫键，并具有分子伴侣的功能，帮助未形成二硫键的神经毒素蛋白正确折叠，促进肉毒神经毒素蛋白可溶性表达。突变失活trx B和gor两个还原酶，其细胞质内由还原状态变为非还原状态，从而非常有利于正确折叠的神经毒素蛋白质形成二硫键，进一步增强了肉毒神经毒素蛋白的可溶性表，所表达得到的肉毒毒素前体蛋白的轻链和重链之间的二硫键已形成完毕。
作为本发明实施例一种改进的技术方案，多核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，为A型肉毒杆菌Hall株的肉毒毒素的原始基因，本发明未对肉毒神经毒的核酸序列进行任何优化和改动，将其完整序列全部插入表达质粒中，随后转化特定的大肠杆菌，保证了所制备的肉毒毒素的活性。
作为本发明实施例一种改进的技术方案，S2中，表达载体采用含有T7启动子的pET质粒，例如pET-45b(+)。为了提高肉毒神经毒素的产量，本发明实施例先后采用不同的表达策略和方法，经过对比和优化，最终选用了含有T7启动子的pET系列表达载体与上述大肠杆菌共同表达肉毒神经毒素。
由于肉毒毒素对大肠杆菌具有毒性，因此，对于培养和表达的条件也具有特殊的要求。具体的，在S4中，培养的温度为25～37℃，培养的条件为250～300转/分震荡培养。本发明通过研究发现，采用传统的LB培养基，重组大肠杆菌工程菌虽然可以存活，但肉毒毒素产量较低。针对于此，对所采用的培养基的配方进行了改进，改良的培养基为：1L超纯水中，含有蛋白胨10～20克，酵母提取物5～15克，氯化钠2～7克，磷酸二氢钾1～3克，磷酸氢二钾10～15克，甘油2～8毫升，氨基葡萄糖0.1～0.5％(质量百分比含量)，氯化锌0.1～0.4微摩尔。该改良的培养基条件下，重组大肠杆菌工程菌的生长状态良好，所收获的肉毒毒素产量获得极大的提升。作为本发明实施例一种改进的技术方案，S4中诱导的具体条件为：培养至OD600达到1～10时，降低培养温度后添加IPTG进行诱导表达，降低培养温度至18℃～25℃。
作为本发明实施例一种改进的技术方案，S4中，添加IPTG后终浓度为25μmol/L～1mmol/L。
作为本发明实施例一种改进的技术方案，S4中，诱导表达时间为24～36小时。
作为本发明实施例的一个具体实施方式，S4具体可采用：挑取冻存菌株加入5mLLB培养基中，37℃条件下250～300转/分震荡过夜，按照1/100的比例将过夜菌液加入到LB液体培养基中，OD600达到1～10时降低培养温度至18或25℃并加入IPTG，终浓度为25μm～1mM，250～300转/分震荡诱导表达24～36小时。待表达结束后，离心回收菌体，弃上清后加入细菌裂解液并超声破碎细菌，再次离心所获得的上清液即含有大小约150kD的肉毒毒素。作为本发明实施例一种改进的技术方案，在水解步骤前，将经IPTG诱导表达获得的大肠杆菌菌液离心后弃上清，离心的转速优选为4000～6000转/分。用PBS溶液洗涤并离心3次后，向沉淀加入细菌裂解液重悬沉淀超声破碎，超声后获得的溶液再次离心，离心的转速优选为8000～12000转/分。离心后获得的上清液即含有肉毒毒素蛋白质。
优选的，超声破碎的时间为20～40分钟，条件为：冰浴条件下，250～300W，破碎4～6秒停4～6秒；以破碎大肠杆菌，释放大肠杆菌体内表达成功的肉毒毒素蛋白质。
S5中，水解的所采用的酶为胰蛋白酶。胰蛋白酶与肉毒毒素蛋白的质量比为1：800～1000，水解时间为20～30分钟。
下面以A型肉毒杆菌Hall株的肉毒毒素基因为例，本发明在该毒素蛋白质天然切割位点处，将表达获得的大小约150kD的肉毒毒素前体蛋白切割为两条经由二硫键链接的具有生物学活性的蛋白质。
实施例1
本实施例用于说明A型肉毒毒素(BoNT-A)的制备方法：
(1)合成A型肉毒毒素Hall株基因序列(表达框序列)，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，SEQ ID NO.1是天然A型肉毒毒素Hall株完整的基因序列，具有天然的酶切位点，此基因序列未进行任何修改。
SEQ ID NO:1
>AF488749.1Clostridium botuLinum neurotoxin BoNT gene,complete cds
atgccatttgttaataaacaatttaattataaagatcctgtaaatggtgttgatattgcttatataaaaattccaaatgcaggacaaatgcaaccagtaaaagcttttaaaattcataataaaatatgggttattccagaaagagatacatttacaaatcctgaagaaggagatttaaatccaccaccagaagcaaaacaagttccagtttcatattatgattcaacatatttaagtacagataatgaaaaagataattatttaaagggagttacaaaattatttgagagaatttattcaactgatcttggaagaatgttgttaacatcaatagtaaggggaataccattttggggtggaagtacaatagatacagaattaaaagttattgatactaattgtattaatgtgatacaaccagatggtagttatagatcagaagaacttaatctagtaataataggaccctcagctgatattatacagtttgaatgtaaaagctttggacatgaagttttgaatcttacgcgaaatggttatggctctactcaatacattagatttagcccagattttacatttggttttgaggagtcacttgaagttgatacaaatcctcttttaggtgcaggcaaatttgctacagatccagcagtaacattagcacatgaacttatacatgctggacatagattatatggaatagcaattaatccaaatagggtttttaaagtaaatactaatgcctattatgaaatgagtgggttagaagtaagctttgaggaacttagaacatttgggggacatgatgcaaagtttatagatagtttacaggaaaacgaatttcgtctatattattataataagtttaaagatatagcaagtacacttaataaagctaaatcaatagtaggtactactgcttcattacagtatatgaaaaatgtttttaaagagaaatatctcctatctgaagatacatctggaaaattttcggtagataaattaaaatttgataagttatacaaaatgttaacagagatttacacagaggataattttgttaagttttttaaagtacttaacagaaaaacatatttgaattttgataaagccgtatttaagataaatatagtacctaaggtaaattacacaatatatgatggatttaatttaagaaatacaaatttagcagcaaactttaatggtcaaaatacagaaattaataatatgaattttactaaactaaaaaattttactggattgtttgaattttataagttgctatgtgtaagagggataataacttctaaaactaaatcattagataaaggatacaataaggcattaaatgatttatgtatcaaagttaataattgggacttgttttttagtccttcagaagataattttactaatgatctaaataaaggagaagaaattacatctgatactaatatagaagcagcagaagaaaatattagtttagatttaatacaacaatattatttaacctttaattttgataatgaacctgaaaatatttcaatagaaaatctttcaagtgacattataggccaattagaacttatgcctaatatagaaagatttcctaatggaaaaaagtatgagttagataaatatactatgttccattatcttcgtgctcaagaatttgaacatggtaaatctaggattgctttaacaaattctgttaacgaagcattattaaatcctagtcgtgtttatacatttttttcttcagactatgtaaagaaagttaataaagctacggaggcagctatgtttttaggctgggtagaacaattagtatatgattttaccgatgaaactagcgaagtaagtactacggataaaattgcggatataactataattattccatatataggacctgctttaaatataggtaatatgttatataaagatgattttgtaggtgctttaatattttcaggagctgttattctgttagaatttataccagagattgcaatacctgtattaggtacttttgcacttgtatcatatattgcgaataaggttctaaccgttcaaacaatagataatgctttaagtaaaagaaatgaaaaatgggatgaggtctataaatatatagtaacaaattggttagcaaaggttaatacacagattgatctaataagaaaaaaaatgaaagaagctttagaaaatcaagcagaagcaacaaaggctataataaactatcagtataatcaatatactgaggaagagaaaaataatattaattttaatattgatgatttaagttcgaaacttaatgagtctataaataaagctatgattaatataaataaatttttgaatcaatgctctgtttcatatttaatgaattctatgatcccttatggtgttaaacggttagaagattttgatgctagtcttaaagatgcattattaaagtatatatatgataatagaggaactttaattggtcaagtagatagattaaaagataaagttaataatacacttagtacagatataccttttcagctttccaaatacgtagataatcaaagattattatctacatttactgaatatattaagaatattattaatacttctatattgaatttaagatatgaaagtaatcatttaatagacttatctaggtatgcatcaaaaataaatattggtagtaaagtaaattttgatccaatagataaaaatcaaattcaattatttaatttagaaagtagtaaaattgaggtaattttaaaaaatgctattgtatataatagtatgtatgaaaattttagtactagcttttggataagaattcctaagtattttaacagtataagtctaaataatgaatatacaataataaattgtatggaaaataattcaggatggaaagtatcacttaattatggtgaaataatctggactttacaggatactcaggaaataaaacaaagagtagtttttaaatacagtcaaatgattaatatatcagattatataaacagatggatttttgtaactatcactaataatagattaaataactctaaaatttatataaatggaagattaatagatcaaaaaccaatttcaaatttaggtaatattcatgctagtaataatataatgtttaaattagatggttgtagagatacacatagatatatttggataaaatattttaatctttttgataaggaattaaatgaaaaagaaatcaaagatttatatgataatcaatcaaattcaggtattttaaaagacttttggggtgattatttacaatatgataaaccatactatatgttaaatttatatgatccaaataaatatgtcgatgtaaataatgtaggtattagaggttatatgtatcttaaagggcctagaggtagcgtaatgactacaaacatttatttaaattcaagtttgtatagggggacaaaatttattataaaaaaatatgcttctggaaataaagataatattgttagaaataatgatcgtgtatatattaatgtagtagttaaaaataaagaatataggttagctactaatgcgtcacaggcaggcgtagaaaaaatactaagtgcattagaaatacctgatgtaggaaatctaagtcaagtagtagtaatgaagtcaaaaaatgatcaaggaataacaaataaatgcaaaatgaatttacaagataataatgggaatgatataggctttataggatttcatcagtttaataatatagctaaactagtagcaagtaattggtataatagacaaatagaaagatctagtaggactttgggttgctcatgggaatttattcctgtagatgatggatggggagaaaggccactgtaa
(2)质粒构建：
通过Nde1及Xho1位点，将构建的表达框序列插入原核表达质粒pET-45b(+)质粒中并测序验证，得到重组表达质粒。
(3)重组工程菌构建：向30μL基因型为F-ompT hsdSB(r- B m- B)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)的大肠杆菌中加入构建的重组表达质粒，冰浴30min，42℃热激30s～90s，冰浴2min后加入500μL LB培养基，37℃220转/分震荡培养1小时，离心弃部分上清后重悬沉淀并将溶液涂至氨苄霉素抗性的LB固体培养板上，37℃静置过夜培养，挑取单克隆加入5mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃300转/分震荡过夜，取500μL过夜菌液，加入500μL 50％的甘油菌混匀，得到甘油冻存菌，-80℃保存。
(4)蛋白表达
挑取冻存菌株加入5mL的LB培养基中，37℃300转/分震荡过夜，按照1/100的比例将过夜菌液加入到改良培养基中，OD600达到1-10时降低培养温度至18℃并加入的IPTG，终浓度为1mM，300转/分震荡诱导表达36小时。
改良培养基为：1L超纯水中，加入蛋白胨16克，酵母提取物10克，氯化钠5克，磷酸二氢钾2.31克，磷酸氢二钾12.54克，甘油4毫升，氨基葡萄糖0.2％(质量百分比含量)，氯化锌0.25微摩尔。
待表达结束后，以5000转/分离心回收菌体，弃上清。用PBS溶液洗涤并离心3次后，加入细菌裂解液并超声破碎细菌(冰域，300W，破碎5秒、停5秒)30分钟，10000转/分离心收集上清，得到的样本为样本1。样本1中含有大小约150kD的肉毒毒素前体蛋白。该前体蛋白具有部分生物学活性。
(5)电泳和蛋白免疫印迹检测表达
a.NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(20×)或类似缓冲液。
b.清洗缓冲液：含0.1％(v/v)Tween-20的1X PBS溶液，现用现配。
c.封闭液：即为含5％(w/v)脱脂奶粉的清洗缓冲液，称取5g脱脂奶粉充分混匀于100mL清洗缓冲液中，4℃保存，现用现配。
d.SDS-PAGE：使用蛋白预制胶NuPAGE Novex 4-12％ Bris-Tris Gel进行蛋白电泳。加样时，在同一块胶上按顺序重复做一份点样，电泳结束后，一份用于蛋白染色，另一份用于免疫检测，以利于相互对比分析。
f.转膜：转膜前，从胶板上取出凝胶，去除浓缩胶并在分离胶的右上角切去一小块作为标记。使用转膜试剂盒2PVDF Mini Stacks，快速转膜仪器iBlot2和蛋白胶电泳用电源/>300W进行转膜；
h.封膜：膜用封闭缓冲液浸湿后，转移至含有封闭液的器皿中，室温条件下将含有封闭液和膜的器皿于摇床上缓慢地振摇封闭2小时或4℃静置过夜。
i.一抗孵育：从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液(不必洗涤)。将膜正面朝上放入杂交袋中，加入一抗稀释液(1：2000)，在摇床上室温孵育1小时后，在平皿中用清洗缓冲液洗膜3次，15分钟/次。
j.二抗孵育：将膜正面朝上放入另一杂交袋中，加入二抗稀释液(1：10000)，在摇床上室温孵育1小时，在平皿中用清洗缓冲液洗膜3次，15分钟/次。取出膜，在滤纸上沥干清洗缓冲液。
k.ECL发光：将发光底物工作液滴加在膜上，确保工作液覆盖整张膜，吸去多余的工作液。将膜放入化学发光成像仪内，曝光照相及图像分析。如图1所示。
在图1中：左图为蛋白电泳结果，右图为蛋白免疫印迹试验结果，箭头所指处为加入诱导剂后诱导表达的毒素蛋白。其中，M泳道：蛋白Marker；1泳道：未加入诱导剂后裂解的大肠杆菌上清；2泳道：加入诱导剂后表达一段时间后裂解的大肠杆菌上清。
该肉毒毒素前体蛋白(A型肉毒毒素Hall株)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:2：
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
(6)水解
经IPTG诱导表达获得的大肠杆菌菌液离心后弃上清，随后向沉淀加入细菌裂解液重悬沉淀并冰上施行超声破碎，超声后获得的溶液再次离心，离心后获得的上清液即含有肉毒毒素蛋白质。按照水解酶(例如胰酶，肠激酶)使用说明书，将水解酶与肉毒毒素蛋白按照质量比为1：800、1：1000在37℃孵育30分钟后，与上样缓冲液混合并加入或不加入DTT，经蛋白电泳实验来确定肉毒毒素蛋白水解情况。
结果如图2所示。其中：M为蛋白Marker；1、2泳道为胰蛋白酶与肉毒毒素蛋白的比例为1：800进行水解，1泳道没有加入DTT，2泳道加入DTT；3、4泳道为胰蛋白酶与肉毒毒素蛋白的比例为1：1000进行水解，3泳道没有加入DTT，4泳道加入DTT。
实验例1
依据并采用生物制品检定的质反应平行线原理，将一系列稀释的待检品与已知效价的对照品同时作用于小鼠，以小鼠毒性(致死)反应为观察终点，将死亡率经适当变换后(如转换为概率单位)，可得到质反应强度与剂量的直线关系。当待检品与对照品的反应曲线平行时，可根据对照品的效价推算出待检品的效价值。
首先，从冰箱中分别取出实施例1制备的表达样品和对照品，置室温下平衡10～60分钟。随后用无菌生理盐水分别稀释待检品和对照品，在室温下静置10分钟。最后，将各稀释液立即注射小鼠(KM，♀，18～20g)，每稀释度腹腔注射6只小鼠，0.1mL/只。从样品复溶到小鼠注射不超过3小时。每天记录动物死亡情况，连续观察3天，以注射后第71～73小时的动物死亡情况作为结果判定依据。
经与对照品比较，实施例1制备的肉毒毒素效力为55000U/mL。
实验例2
采用实施例1方法对重组大肠杆菌进行培养，区别在于：采用LB培养基(1L超纯水中，加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克)。表达结束后，采用相同的方法回收菌体，收集上清，得到样本为样本2。
将样本1和样本2进行酶联免疫吸附试验进行检测。
实验方法包括：使用试剂盒(Botulinum Neurotoxin Type A货号：DY4489-05)，并按照试剂盒的使用说明书进行操作。
首先用PBS溶液将针对A型肉毒毒素特异性的捕获抗体(试剂盒自带)用于可与A型肉毒毒素蛋白质特异性结合，稀释至工作浓度可参见试剂盒说明书，随后立即包被96孔板，每孔加入100μL稀释后的捕获抗体溶液，封板膜封闭后室温过夜孵育；随后，吸走捕获抗体溶液，并用PBST洗液连续三次洗涤，最后一次洗后拍干板内残留液体；每孔加入300μL封闭液(BlockTMBSA(2％)in PBS)室温1小时封闭96孔板；封闭结束后，吸走板内溶液，并用PBST洗液连续三次洗涤，每次使用洗液300μL；洗涤结束后，每孔加入100μL表达上清溶液和试剂盒自带的标准品，封板膜封闭后室温孵育2小时。使用双复孔模式加入标准品和样品；孵育结束后，吸走板内溶液，并用PBST洗液连续三次洗涤，每次使用洗液300μL；洗涤后，每孔加入100μL检测抗体(试剂盒自带)，封板膜封闭后室温孵育2小时；孵育结束后，吸走板内溶液，并用PBST洗液连续三次洗涤，每次使用洗液300μL；随后，每孔加入100μL链霉亲和素溶液(试剂盒自带)，封板膜封闭后室温孵育20分钟。吸走板内溶液，并用PBST洗液连续三次洗涤，每次使用洗液300μL。最后，每孔加入100μL底物溶液(试剂盒自带)后室温孵育20分钟，结束后每孔加入50μL终止溶液(试剂盒自带)并混匀。使用波长为450nm的酶标仪读取每孔内的吸光度数值。标准曲线结果如表1所示，得到标准曲线如图3所示：
表1
样品检测结果：样品1吸光度值是0.53；样品2吸光度值是0.143；经过计算，样品1中肉毒毒素含量约为3000pg/mL，样品2中肉毒毒素含量约为200pg/mL。
实验例3
大肠杆菌的筛选实验：
为了获得可高产且稳定表达肉毒毒素蛋白的大肠杆菌，先后尝试了多种大肠杆菌表达菌株。
首先，将构建好的质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态，随后涂琼脂培养皿并于37℃孵育过夜。第二天，从琼脂培养皿中挑选若干单菌落加入含有氨苄青霉素的LB培养液进行扩增。待培养液的OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达肉毒毒素蛋白，结果显示，与对照相比较，没有肉毒毒素蛋白表达。分析原因，可能是诱导表达的参数不适宜，需要优化才能表达肉毒毒素蛋白所致。后续又多次调整了大肠杆菌的OD600值，表达温度，表达时间及IPTG浓度，均未成功表达肉毒毒素蛋白。
鉴于上述不成功的经验，先后尝试将表达质粒转化BL21(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、BL21Codon Plus及Rosetta-gami pLysS大肠杆菌感受态，均未成功表达肉毒毒素蛋白。
经仔细分析肉毒毒素蛋白的基因序列，氨基酸组成和蛋白空间结构等多方面信息并结合上述试验结果，可能的原因是肉毒毒素蛋白的轻链和重链之间通过一个二硫键链接为一个150kD左右的蛋白质，而上述大肠杆菌感受态的细胞质均为还原环境，因而导致大肠杆菌合成的肉毒毒素在细胞质内无法形成二硫键并随后被降解，所以无法获得可溶表达的肉毒毒素蛋白。为此，尝试选用F-ompT hsdSB(r- B m- B)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)的大肠杆菌感受态，该大肠杆菌是在BL21(DE3)基础上，突变失活trxB和gor两个还原酶，将细胞质内由还原状态变为非还原状态，从而非常有利于正确折叠的肉毒毒素蛋白质形成二硫键。将表达质粒转化该大肠杆菌后，即成功表达了肉毒毒素蛋白，再经过培养温度，培养基等多个参数的优化，从而获得了可溶表达且高产的肉毒毒素蛋白。
实验例4
应用同样的试验条件和参数，使用pQE-80作为表达载体进行肉毒毒素蛋白表达，无法检测出肉毒毒素蛋白的表达量。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种肉毒毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、合成编码所述肉毒毒素前体蛋白的多核苷酸序列；
S2、将所述核苷酸序列克隆到含有表达载体中，构建得到重组表达载体；
S3、将所述表达载体转化所述大肠杆菌，得到重组大肠杆菌工程菌，冻存备用；所述大肠杆菌选自：可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌；
S4、培养所述重组大肠杆菌工程菌，诱导表达所述肉毒毒素前体蛋白；
S5、水解所述肉毒毒素前体蛋白，得到肉毒毒素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌选自基因型为F-ompT hsdSB(r- Bm- B)gal dcm lacY1 ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)的大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述多核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述表达载体采用含有T7启动子的pET质粒。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述培养的温度为25～37℃，所述培养的条件为250～300转/分震荡培养。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述培养采用的培养基为：1L超纯水中，含有蛋白胨10～20克，酵母提取物5～15克，氯化钠2～7克，磷酸二氢钾1～3克，磷酸氢二钾10～15克，甘油2～8毫升，氨基葡萄糖0.1～0.5％，氯化锌0.1～0.4微摩尔。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述诱导的条件为：培养至OD600达到1～10时，降低培养温度后添加IPTG进行诱导表达。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，降低培养温度至18℃～25℃；
优选的，添加IPTG后诱导表达时间为24～36小时；IPTG的终浓度为25μmol/L～1mmol/L。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解所采用的酶为胰蛋白酶。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，胰蛋白酶与肉毒毒素蛋白的质量比为1：100～1000，水解时间为20～30分钟，水解温度为25～37℃。
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