CN112553083B - 一种金针菇菌株及其鉴定和选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种金针菇菌株选育和鉴定的方法。该菌株选育方法包括分别以栽培菌株的原生质体单核菌株为单核亲本、野生菌株为双核亲本进行双单杂交，鉴定杂交子的真实性，进一步对杂交子的菌丝阶段和出菇阶段进行筛选得到优良杂交子，最后对筛选得到的杂交子进行单孢自交和组织分离及出菇筛选，获得优良金针菇菌株。杂交菌株的鉴定方法包括对金针菇亲本菌株及其原生质体单核菌株进行菌丝培养后提取DNA、ITS序列扩增及测序、SNP位点分析、特异性引物设计及筛选，亲本菌株及杂交菌株的AS‑PCR扩增及电泳检测；该菌株的菌盖呈金黄色、颜色亮丽，菌柄纤细、菌柄颜色为黄白色且不易褐变，菌柄基部绒毛少且不黏连。

Description

一种金针菇菌株及其鉴定和选育方法
技术领域
本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种金针菇菌株及其鉴定和选育方 法。
背景技术
金针菇(Flammulina filiformis)属于冬菇属，中文学名为丝盖冬菇，之前一 直使用F.velutiper(Fr)Sing这个拉丁学名，直到2018年中国科学院昆明植物 研究所的杨祝良及其团队对中国金针菇进行了正名，研究证明我国的金针菇不 同于欧美的F.velutiper，是一个新物种，应该采用F.filiformis这个拉丁学名。金 针菇富含多种营养物质，因其富含“赖氨酸”，也被成为“益智菇”。金针菇是我国 工厂化发展最快的食用菌种类，目前我国已成为世界上金针菇日产量最大的国 家。双单杂交技术是金针菇常用的一种育种手段。
中国专利文献CN102177810B公开了一种早熟白色金针菇菌株的创制方法， 该方法中对于金针菇双单杂交种的鉴定方法为采用“显微镜检初步确认+拮抗再 鉴定”，具体为显微镜观察将有锁状联合的菌种初步确定为杂交种，再与亲本 菌株进行拮抗试验，凡是与两亲本菌株之间出现沟状、或隆起、或隔离现象的 确定为杂交种。但在具体操作中，菌丝培养耗时且显微镜检容易发生人为因素 误检，而且有些金针菇双核菌株间拮抗特征不明显，尤其是亲缘关系较近的杂 交子与双核亲本的菌落形态十分相似，很难正确判断，因此，需要开发一种准 确可靠的方法进行鉴定。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中不能对金针菇的单核、 双核以及杂交菌株进行快速准确鉴定等缺陷，从而提供一种金针菇菌株及其鉴 定和选育方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
本发明提供了一种金针菇菌株，所述金针菇菌株的ITS序列包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两种DNA序列。
本发明还提供了一种金针菇菌株，保藏号为CGMCC No.19644。
此外，本发明提供了一种上述金针菇菌株的鉴定方法，包括对所述金针菇 的亲本菌株及其原生质体单核菌株进行菌丝培养后提取DNA、ITS序列扩增及 测序、SNP位点分析、特异性引物进行AS-PCR扩增以及电泳检测；
所述特异性引物包括四组引物，分别是P178-G和P178-A，P217-C和P217-T， P482-C和P482-T，P619-C和P619-T，具体核苷酸序列如下：
引物P178-G正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCG，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；
引物P178-A正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCA，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；
引物P217-C正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAC，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；
引物P217-T正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAT，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；
引物P482-C正向序列为：GCTGGCGGATTGTAC，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；
引物P482-T正向序列为：GCTGGCGGATTGTAT，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；
引物P619-C正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCG；
引物P619-T正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCA。
所述ITS序列扩增的反应体系包括：3μL含量为100ng的DNA，2.5μL引 物ITS1(10μM)，2.5μL引物ITS2(10μM)，25μL Es Taq MasterMIX(2×， 含染料，购自康为世纪生物有限公司)，17μL ddH2O；
所述ITS的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火 30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。
所述AS-PCR扩增的反应体系包括：1μL含量为100ng的DNA，1μL上游 引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，10μL Es Taq MasterMIX(2×，含染 料，购自康为世纪生物有限公司)，7μL ddH2O；
所述AS-PCR的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火 30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。
所述引物P178-G的退火温度为68.4℃；引物P178-A的退火温度为68℃； 引物P217-C的退火温度为68.5℃；引物P217-T的退火温度为66.7℃；引物P482-C的退火温度为63.1℃；引物P482-T的退火温度为62.9℃；引物P619-C 的退火温度为67.4℃；引物P619-T的退火温度为66.4℃。
本发明还提供了一种上述金针菇菌株的选育方法，包括如下步骤：
(1)金针菇菌株进行原生质体单核体制备与再生，得到原生质体单核菌株；
(2)以所述原生质体单核菌株为单核亲本，以野生金针菇菌株为双核亲本， 双单杂交，得到双核杂交菌株；
(3)杂交子经鉴定、筛选后，双核杂交菌株单孢自交，筛选后得到菌株， 命名为冀金12。
进一步地，还包括对所述步骤(2)中的双核杂交菌株进行出菇试验，具体 步骤包括：将双核杂交菌株接种到出菇袋中，在18-22℃，空气相对湿度为40-60％ 的条件下发菌；待菌丝长满袋后，在10-15℃，空气相对湿度为80-90％的条件 下促进菇蕾形成；子实体的高度生长至2-3cm后，套袋，待子实体的高度生长 至20-25cm、菌盖直径生长至2-3cm时，采收、测产筛选；
所述筛选的子实体的性状包括菌盖颜色介于浅黄色和金黄色之间，菌盖为 半圆形，菌柄介于白色和浅黄色之间、纤细、基部绒毛少、不黏连、不易发生 褐变，产量高于亲本。
更进一步地，所述步骤(2)中，双单杂交的具体步骤包括，原生质体单核 菌株的菌丝块接种在培养基平板的一侧，培养至菌落直径为1.5-3.0cm，在平板 另一侧接种野生金针菇菌株的活化菌丝块，对峙培养直至两种菌丝接触，再在 单核菌株一侧取直径为0.3-0.5cm的菌丝块接种到斜面培养基上，暗光培养，得 到双核菌株。
所述步骤(1)中，金针菇菌株进行原生质体单核体制备与再生的步骤包括， 取菌丝体接种于液体培养基中，静置培养8-10天，每隔23-25h摇动液体培养基； 在无菌条件下，收集液体培养基中的菌丝，经酶解，过滤、洗涤、稀释，在再 生培养基中培养，得到原生质体单核菌株。
所述液体培养基的原料包括质量比为(2-4):(14.5-15.5):(0.45-0.55): (0.02-0.03):(0.07-0.09):(0.04-0.06)的玉米粉、马铃薯、葡萄糖、磷酸二 氢钾、磷酸一氢钾和硫酸镁；
所述再生培养基的原料包括(180-220):(3-4):(22-24)和(200-210)的 马铃薯、蛋白胨、琼脂和蔗糖。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的金针菇菌株冀金12，保藏号为CGMCC No.19644，该菌株 的菌盖呈金黄色、颜色亮丽，菌柄纤细、平均直径在0.25cm左右，菌柄颜色为 黄白色且不易褐变，菌柄基部绒毛少且不黏连；经测定菌柄的平均木质素含量 为2.50×103A280nm/kg显著低于传统品种的木质素含量(3.05×103A280nm/kg)，商 品菇适口性好适合鲜食，生物学效率高。
2.本发明提供的金针菇菌株的鉴别方法，采用等位基因特异PCR (Allele-specific PCR,AS-PCR)分子鉴定方法替代传统的显微镜检+拮抗方法， 可以快速准确的鉴别同一菌株不同细胞核的基因型，从而对金针菇的单核和双 核菌株进行快速准确的鉴别。同样，不同金针菇菌株之间也存在等位基因变异， 尤其是栽培菌株和野生菌株之间存在多个碱基差异，这些变异位点主要位于ITS1和ITS2区域，基于这些SNP位点开发的AS-PCR技术可以对栽培菌株和 野生菌株杂交获得的新菌株进行准确鉴别，此外，该方法具有操作简便、耗时 短等优点。AS-PCR是基于PCR过程中引物3’端碱基对扩增反应的开关作用来 对SNP进行检测，当引物3’端存在错配时，PCR反应将无法延伸，本发明提 供的鉴别方法可以快速准确地鉴别不同菌株的基因型。
3.本发明提供的金针菇的选育方法，通过双单杂交、单孢自交的方法得到的 金针菇的性状稳定，菌盖呈金黄色、颜色亮丽，菌柄纤细、平均直径在0.25cm 左右，菌柄颜色为黄白色且不易褐变，菌柄基部绒毛少且不黏连，木质素含量 低。
通过对双单杂交的方法进行具体的限定，得到的双核菌株具有双亲的优良 性状，经单孢自交、多个栽培季节的出菇试验以及组织分离等步骤最终获得性 状优良且稳定遗传的新菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见 地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中经特异引物P178-G的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图2是本发明实施例1中经特异引物P178-A的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图3是本发明实施例1中经特异引物P217-C的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图4是本发明实施例1中经特异引物P217-T的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图5是本发明实施例1中经特异引物P482-C的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图6是本发明实施例1中经特异引物P482-T的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图7是本发明实施例1中经特异引物P619-C的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱；
图8是本发明实施例1中经特异引物P619-T的AS-PCR扩增的产物的电泳 图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实 施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或 是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近 似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常 规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种金针菇菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为 CGMCCNo.19644，保藏日期2020年5月26日，命名为冀金12；分类命名： 丝盖冬菇Flammulinafiliformis。
一种金针菇菌株的鉴定方法，双单杂交子的两个细胞核一个为受体核来源 于单核亲本的细胞核，另一个为供体核来源于双核亲本的其中一个细胞核。冀 金12的亲本包括单核菌株亲本和双核菌株亲本，单核菌株亲本是金针菇菌株 HUANG1经原生质体单核体制备与再生后得到的，双核亲本是野生金针菇菌株 JHH的子实体经组织分离方法获得的纯菌丝，首先对冀金12的两个亲本进行基 因型鉴定，建立AS-PCR方法，然后利用该方法对冀金12的基因型进行鉴定， 从而判定其作为杂交子的真实性，具体步骤如下：
在鉴定前，需要采用与制备单核菌株亲本相同的步骤对双核亲本进行原生 质体单核体制备与再生，具体为，取菌株的菌丝体接种于盛有液体培养基的三 角瓶中，25℃静止培养8天，每隔24h手摇一次三角瓶，在无菌条件下，收集 液体培养基中的菌丝，用质量浓度为2％溶壁酶酶液(购于广东省微生物研究 所)，在30℃下酶解4h，过滤掉断裂的菌丝，用0.6M蔗糖溶液洗涤3次，得 到春华的原生质体悬液，用0.6M蔗糖溶液稀释至浓度为300个/ml，吸取0.2ml 涂布在再生培养基上，在25℃下培养8天，挑取单个菌落于试管斜面上保存，在在25℃下培养4天，取菌丝体制片，在显微镜下观察是否有锁状联合，若无 锁状联合，则说明得到原生质体单核体，保存，备用。
(1)提取DNA：选取冀金12的亲本及其原生质体单核菌株，进行菌丝培 养，待菌落生长至其直径1±0.2cm时，用灭菌的黄色枪头挑取少量菌丝，将其 悬浮于装有50μL TEbuffer的0.2mL离心管中，放到PCR仪，在98℃处理5min 后立即置于冰上冷却，提取得到DNA，备用。为保证DNA的最佳使用状态， 要求DNA即制即用。
(2)ITS序列扩增及测序：以步骤(1)中的DNA为模板，利用ITS1(SEQ ID NO:5)和ITS4(SEQ ID NO:6)为正反向引物进行ITS序列扩增，其扩增 的反应体系包括：3μL含量为100ng的DNA，2.5μL引物ITS1(10μM)，2.5μL 引物ITS2(10μM)，25μL Es Taq MasterMIX(2×，含染料)，17μL ddH2O； 扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s， 32个循环；72℃再延伸5min。ITS扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公司进行测序，对于出现双峰的样本进一步采用克隆测序 的方法获得ITS序列的基因型序列，单核菌株亲本的ITS序列包括两种基因型， 分别以HUANG1-Y-1(Hap1)和HUANG1-Y-2(Hap2)来表示。双核菌株亲本 的ITS序列也包括两种基因型，分别以JHH-Y-1(Hap3)和JHH-Y-2(Hap4) 为代表，具体序列见表1。
表1不同菌株的ITS序列
菌株名 ITS序列基因型类型 序列
HUANG1 Hap1+Hap2 SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2
HUANG1-Y-1 Hap1 SEQ ID NO.1
HUANG1-Y-2 Hap2 SEQ ID NO.2
JHH Hap3+Hap4 SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4
JHH-Y-1 Hap3 SEQ ID NO.3
JHH-Y-2 Hap4 SEQ ID NO.4
(3)SNP位点分析：使用SeqMan软件对步骤(2)得到的序列进行序列剪 切和拼接，使用MAGA7.0软件进行ITS序列多重比对分析各基因型的SNP位 点，具体SNP位点信息见表2。
表2不同基因型的SNP位点信息
Figure BDA0002712328950000101
注：表2中的“-”代表gap。
(4)特异性引物筛选及AS-PCR扩增：基于SNP位点设计特异性PCR引 物，进行AS-PCR扩增，并采用梯度PCR方法，对引物的退火温度进行筛选， 最终获得4组引物能够稳定扩增出特异性条带，分别是P178-G和P178-A，P217-C 和P217-T，P482-C和P482-T，P619-C和P619-T，具体见表3。
AS-PCR扩增的反应体系包括：1μL含量为100ng的DNA，1μL上游引物 (10μM)，1μL下游引物(10μM)，10μL Es Taq MasterMIX(2×，含染料)， 7μL ddH2O；
所述AS-PCR的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火 30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min；其中，各个引物组的退火 温度及扩增片段大小见表3。
表3四组引物及相关信息
Figure BDA0002712328950000102
Figure BDA0002712328950000111
(5)扩增产物的检测及基因型确定：AS-PCR扩增的产物进行1％琼脂糖凝 胶电泳检测，电泳结果显示178bp和619bp的带型相同，217bp和482bp的带型 相同，对于同一个SNP位点的AS-PCR来说，单核菌株只扩增出一条带，双核 菌株则扩增出具有两种单核菌株带型的两条带。图1-图8分别是不同基因型的 菌株经特异引物AS-PCR扩增得到的特异带型的电泳图谱，图中从左至右分别 是Hap1、Hap2、Hap1+Hap2、Hap3、Hap4、Hap3+Hap4、Hap1+Hap4、Hap2+ Hap3，图1和图2分别是P178-G和P178-A得到的图谱，特异片段大小为500bp； 图3和图4分别是P217-C和P217-T得到的图谱，特异片段大小为311bp；图5 和图6分别是P482-C和P482-T得到的图谱，特异片段大小为191bp；图7和图 8分别是P619-C和P619-T得到的图谱，特异片段大小为484bp。因此，可采用 引物组(P217-C+P217-T)或(P482-C+P482-T)鉴别出HUANG1及其原生质 体单核菌株，采用引物组(P178-G+P178-A)或(P619-C+P619-T)鉴别出JHH 及其原生质体单核菌株，具体带型见表4。
表4不同菌株AS-PCR扩增产生的带型
Figure BDA0002712328950000112
注：表4中“-”代表有特异条带，空白代表无条带。
(6)冀金12基因型鉴定及其杂交子真实性判定：理论上HUANG1和JHH 双单杂交得到的杂交子FJH-x应该有四种类型，分别是：Hap1+Hap3、Hap1+ Hap4、Hap2+Hap3和Hap2+Hap4。但由于交配型以及先导核的原因，实际上， 只得到了两种基因型的杂交子，分别是Hap1+Hap4基因型和Hap2+Hap3基因型。 通过出菇性状筛选得到的一种基因型的优良杂交子FHJ-12，其基因型为 Hap2+Hap3，该杂交子又经单孢自交、出菇试验及组织分离等步骤最终获得性状 稳定遗传的双核菌株FHJ-12-P46命名为冀金12，经检测其基因型仍为 Hap2+Hap3，因此冀金12确为HUANG1和JHH双单杂交得到的杂交种。
实施例2
上述金针菇菌株的选育方法，包括如下步骤：
取黄色栽培金针菇菌株HUANG1的菌丝体接种于盛有液体培养基的三角瓶 中，25℃静止培养8天，每隔24h手摇一次三角瓶，在无菌条件下，收集液体 培养基中的菌丝，用质量浓度为2％溶壁酶酶液(购于广东省微生物研究所)， 在30℃下酶解4h，过滤掉断裂的菌丝，用0.6M蔗糖溶液洗涤3次，得到纯化 的原生质体悬液，用0.6M蔗糖溶液稀释至浓度为300个/ml，吸取0.2ml涂布在 再生培养基上，在25℃下培养8天，挑取单个菌落于试管斜面上保存，在25℃ 下培养4天，取菌丝体制片，在显微镜下观察是否有锁状联合，若无锁状联合， 则说明得到原生质体单核体，保存，将其作为单核亲本，标记为HUANG1-Y-x； 其中，液体培养基的制备方法包括，取30g玉米粉和150g马铃薯，加入500ml 水，煮30min后，过滤，得到浸提液，在浸提液中加入5g葡萄糖、0.2g、0.8g K2HPO4、0.5g MgSO4，然后加水定容至1L，即得；再生培养基的制备方法包括， 取200g马铃薯，加入500ml水，煮30min后，过滤，得到浸提液，在浸提液中 加入4g蛋白胨、23g琼脂、205.2g蔗糖，即得。
取野生金针菇菌株JHH的子实体，经组织分离后得到纯菌丝，作为双核亲 本。
取30-50个原生质体单核菌株HUANG1-Y-x的菌丝块接种在PDA培养基平 板上的一侧，25℃下培养4天，菌落生长至直径为2±0.1cm时，在平板的另一 侧分别接种直径为0.5±0.05cm的双核菌株JHH的活化菌丝块，接种位置距离 单核菌丝边缘为1cm，两种菌丝对峙培养直至两种菌丝接触，在单核菌株一侧， 远离双核菌丝的位置用接种针取出直径为0.3-0.5cm的菌丝块接种到一个新的 PDA斜面培养基上，25℃暗光培养，待菌丝直径生长至1-2cm，得到新菌株 FHJ-x，按照实施例1中的鉴定方法，采用引物组(P178-G+P178-A)、(P217-C +P217-T)、(P482-C+P482-T)或(P619-C+P619-T)批量AS-PCR方法来快 速鉴别出新菌株为单核还是双核菌株，以及是否为杂交子。
杂交子FHJ-x的出菇试验：双核菌株进行菌丝培养，选择菌丝浓密、生长 速度快的杂交子，进行出菇试验。以78g棉籽壳、15g麸皮、5g玉米面和2g石 灰混合均匀，加入186g水搅拌均匀，得到出菇培养基；采用规格为17×33×0.05cm 的高密度聚丙烯塑料作为出菇袋，采用装袋机将培养基装入到一端封口的出菇 袋中，另一端用无棉盖体封口，在0.14MPa的高压灭菌锅中灭菌3h，然后冷却 至30℃以下，将菌种接种到出菇袋中，移至发菌室，发菌室的温度为18-22℃， 空气相对湿度为40-60％；待菌丝长满袋后，将出菇袋移至菇房中，温度为 10-15℃，空气相对湿度为80-90％，打开袋口，微光诱导，促进菇蕾形成；当子 实体的高度生长至2-3cm时，在菌袋外面套上塑料袋筒，继续生长，直至子实 体高度生长至20-25cm、菌盖直径为0.3-0.5cm时，采收，筛选菌盖颜色介于浅 黄色和金黄色之间，菌盖为半圆形，菌柄介于白色和浅黄色之间、纤细、基部 绒毛少、不黏连、不易发生褐变，产量高于亲本的菌株FHJ-12，经AS-PCR方 法鉴定，具有该性状的子实体的菌株的基因型为Hap2+Hap3。
杂交菌株FHJ-12的单孢自交：首先要对FHJ-12的单孢菌株进行分离与鉴 定。具体方法包括，，
取成熟菌株FHJ-12菌盖放置在无菌纸上，无菌环境下放置20h，得到孢子 印，用无菌接种针蘸取少量孢子印悬浮于无菌水中，制作成孢子悬液。再用无 菌水稀释孢子液至2×104个/mL(血球计数板法)，取50μL孢子稀释液均匀涂 布在PDA培养基平板中，在22±1℃下倒置培养6天，待平板上萌发出肉眼可 见的小菌落后，用接种针将菌丝块接种于新的PDA斜面上，待菌丝长至1±0.2cm 时，按照实施例1中的鉴定方法，采用引物组(P178-G+P178-A)、(P217-C+ P217-T)、(P482-C+P482-T)或(P619-C+P619-T)批量AS-PCR方法来快速 鉴别出单/双核菌丝，获得FHJ-12的单孢菌株。
其次，构建自交菌株，具体步骤为，在PDA培养基平板上接种上2个单孢 菌株，相距1.5±0.2cm，在22±1℃下培养，待菌丝生长接触后，取接触部位的 菌丝体转接与斜面PDA培养基上，当菌丝生长距离达到1.5±0.2cm时，取菌丝 进行单双核鉴定，鉴定方法同实施例1，经鉴定后，确定为双核自交菌株。
自交菌株进行出菇试验：自交菌株进行菌丝培养，选择菌丝浓密、生长速 度快的杂交子，进行出菇试验。以78g棉籽壳、15g麸皮、5g玉米面和2g石灰 混合均匀，加入186g水搅拌均匀，得到出菇培养基；采用规格为17×33×0.05cm 的高密度聚丙烯塑料作为出菇袋，采用装袋机将培养基装入到一端封口的出菇 袋中，另一端用无棉盖体封口，在0.14MPa的高压灭菌锅中灭菌3h，然后冷却 至30℃以下，将菌种接种到出菇袋中，移至发菌室，发菌室的温度为18-22℃， 空气相对湿度为40-60％；待菌丝长满袋后，将出菇袋移至菇房中，温度为 10-15℃，空气相对湿度为80-90％，打开袋口，微光诱导，促进菇蕾形成；当子 实体的高度生长至2-3cm时，在菌袋外面套上塑料袋筒，继续生长，直至子实 体高度生长至20-25cm、菌盖直径为0.3-0.5cm时，采收，筛选菌盖颜色介于浅 黄色和金黄色之间，菌盖为半圆形，菌柄介于白色和浅黄色之间、纤细、基部 无绒毛、不黏连、不易发生褐变，产量高于出发菌株的菌株FHJ-12-P46。
菌株性状固定：采用组织分离的方法进一步将菌株FHJ-12-P46性状进行固 定，选取上一步出菇试验后的新鲜子实体，用刀取菌盖和菌柄交接处菌肉组织， 在进行无菌条件下转接到新的PDA培养基上培养，待萌发后，获得纯菌丝，即 为新菌株，通过两个栽培季的出菇试验和性状固定，最终选育出性状优良且稳 定遗传的金针菇新品种，即冀金12。
冀金12按照上述出菇管理方法进行栽培后，得到金针菇，该金针菇菌盖颜 色为金黄色的平均直径在0.25cm左右，菌柄颜色为黄白色且不易褐变，菌柄基 部绒毛少且不黏连；经测定采收期子实体菌柄的平均木质素含量为 2.50×103A280nm/kg显著低于传统品种的木质素含量(3.05×103A280nm/kg)，商品 菇适口性好适合鲜食。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同 形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引 申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 河北省农林科学院遗传生理研究所
<120> 一种金针菇菌株及其鉴定和选育方法
<130> 6
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 804
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 1
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taatgaactt tgaactgctt gtggctcttg 60
ggctgttgct gacgaggacc ttcacgggtt cttcgtacgt gcacgtctgg ggttgcagct 120
ttcttcgtcc acctgtgcac actctgtagg tctggatacc ccattggaag ggtgcgcttt 180
ttgcgctccc tttgccttcc aggcctatgt cttacaaaca ctatagtatg taacgaatgt 240
cattgattat tggacttcac tgtcctttaa actaaataca actttcaaca acggatctct 300
tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa ctaatgtgaa ttgcagaatt 360
cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacct tgcgcccttt ggtactccga agggcatgcc 420
tgtttgagtg tcagtaactt ctcaacctcc ctcactttgt tgtgagctgg cggattggat 480
gtgggggctt gctggacctt atctttgggt tcagctcccc tgaaatgcat tagcagaaac 540
cgttaccttt tggcgcgctg cagctgtgat aattatctac ggctatggct gggctgactg 600
tgttgtagcg ctcgtctcgt ctctgaagtg gtttcgcctt agttggtgct tccctttgcc 660
ttctctctca cgagagatac ctgtgacgcg agtgcgcggg ctattccgct tctaaccgtc 720
cccttgtggg acaaactatt gaccatttga cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac 780
ttaagcatat caataagcgg agga 804
<210> 2
<211> 805
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 2
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taatgaactt tgaactgctt gtggctcttt 60
aggctgttgc tgacgaggac cttcacgggt tcttcgtacg tgcacgtctg gggttgcagc 120
tttcttcgtc cacctgtgca cactctgtag gtctggatac cccattggaa gggtgcgctt 180
tttgcgctcc ctttgccttc caggcctatg tcttataaac actatagtat gtaacgaatg 240
tcattgatta ttggacttca ctgtccttta aactaaatac aactttcaac aacggatctc 300
ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga attgcagaat 360
tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcacc ttgcgccctt tggtactccg aagggcatgc 420
ctgtttgagt gtcagtaact tctcaacctc cctcactttg ttgtgagctg gcggattgga 480
cgtgggggct tgctggaccc ttatctttgg gttcagctcc cctgaaatgc attagcagaa 540
accgttacct tttggcgcgc tgcagctgtg ataattatct acggctatgg ctgggctgac 600
tgtgttgtag cgctcgtctc gtctctgaag tggtttcgcc ttagctggtg cttccctttg 660
ccttctctct cacgagagat acctgtgacg cgagtgcgcg ggctattccg cttctaaccg 720
tccccttgtg ggacaactat tgaccatttg acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa 780
cttaagcata tcaataagcg gagga 805
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 3
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taatgaactt tgaactgctt gtggctcttg 60
ggctgttgct gaccgaggac cttcacgggt tcttcgtacg tgcacgtctg gggttgcagc 120
tttcttcgtc cacctgtgca cactctgtag gtctggatac cccattggaa gggtgcactt 180
tttgcgctcc ctttgccttc caggcctatg tcttataaac actatagtat gtaacgaatg 240
tcattgatta ttggacttca ctgtccttta aactaaatac aactttcaac aacggatctc 300
ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga attgcagaat 360
tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcacc ttgcgccctt tggtactccg aagggcatgc 420
ctgtttgagt gtcagtaact tctcaacctc cctcactttg ttgtgagctg gcggattgga 480
cgtgggggct tgctggacct tatctttggg ttcagctccc ctgaaatgca ttagcagaaa 540
ccgttacctt ttggcgcgct gcagctgtga taattatcta cggctatggc tgggctgact 600
gtgttgtagc gctcgtttcg tctctgaagt ggtttcgcct tagttggtgc ttccctttgc 660
cttctctctc acgagagata cctgtgacgc gagtgcgcgg gctattccgc ttctaaccgt 720
ccccttgtgg gacaactatt gaccatttga cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac 780
ttaagcatat caataagcgg agga 804
<210> 4
<211> 805
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 4
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taatgaactt tgaactgctt gtggctcttg 60
ggctgttgct gaccgaggac cttcacgggt tcttcgtacg tgcacgtctg gggttgcagc 120
tttcttcgtc cacctgtgca cactctgtag gtctggatac cccattggaa gggtgcgctt 180
tttgcgctcc ctttgccttc caggcctatg tcttataaac actatagtat gtaacgaatg 240
tcattgatta ttggacttca ctgtccttta aactaaatac aactttcaac aacggatctc 300
ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga attgcagaat 360
tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcacc ttgcgccctt tggtactccg aagggcatgc 420
ctgtttgagt gtcagtaact tctcaacctc cctcactttg ttgtgagctg gcggattgga 480
cgtgggggct tgctggaccc ttatctttgg gttcagctcc cctgaaatgc attagcagaa 540
accgttacct tttggcgcgc tgcagctgtg ataattatct acggctatgg ctgggctgac 600
tgtgttgtag cgctcgtctc gtctctgaag tggtttcgcc ttagctggtg cttccctttg 660
ccttctctct cacgagagat acctgtgacg cgagtgcgcg ggctattccg cttctaaccg 720
tccccttgtg ggacaactat tgaccatttg acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa 780
cttaagcata tcaataagcg gagga 805
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 5
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列(SEQUENCE LISTING)
<400> 6
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (5)

1.一种金针菇菌株(Flammulinafiliformis)，其特征在于，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19644；
所述金针菇菌株的ITS序列包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两种DNA序列。
2.一种权利要求1所述的金针菇菌株的鉴定方法，其特征在于，包括对所述金针菇的亲本菌株及其原生质体单核菌株进行菌丝培养后提取DNA、ITS序列扩增及测序、SNP位点分析、特异性引物设计与筛选、AS-PCR扩增以及电泳检测；
所述特异性引物包括四组引物，分别是P178-G和P178-A，P217-C和P217-T，P482-C和P482-T，P619-C和P619-T，具体核苷酸序列如下：
引物P178-G正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCG，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；
引物P178-A正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCA，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；
引物P217-C正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAC，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；
引物P217-T正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAT，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；
引物P482-C正向序列为：GCTGGCGGATTGTAC，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；
引物P482-T正向序列为：GCTGGCGGATTGTAT，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；
引物P619-C正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCG；
引物P619-T正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCA。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述ITS序列扩增的反应体系包括：3μL含量为100ng的DNA，2.5μL浓度为10μM的引物ITS1，2.5μL浓度为10μM的引物ITS2，25μL 2×Es TaqMasterMIX，17μL ddH2O；
所述ITS的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。
4.根据权利要求2或3所述的鉴定方法，其特征在于，所述AS-PCR扩增的反应体系包括：1μL含量为100ng的DNA，1μL浓度为10μM的上游引物，1μL浓度为10μM的下游引物，10μL 2×Es Taq MasterMIX，7μL ddH2O；
所述AS-PCR的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物P178-G的退火温度为68.4℃；引物P178-A的退火温度为68℃；引物P217-C的退火温度为68.5℃；引物P217-T的退火温度为66.7℃；引物P482-C的退火温度为63.1℃；引物P482-T的退火温度为62.9℃；引物P619-C的退火温度为67.4℃；引物P619-T的退火温度为66.4℃。
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