CN107142257B

CN107142257B - 一种浅黄色金针菇的选育方法

Info

Publication number: CN107142257B
Application number: CN201710355494.9A
Authority: CN
Inventors: 刘靖宇; 常明昌; 孟俊龙; 冯翠萍; 程红艳; 王术荣; 徐丽婧; 耿雪冉
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: CN107142257A

Abstract

本发明公开了一种浅黄色金针菇的选育方法，包括：种菇采集、培养基制备、单孢分离、单核菌丝获取、单核菌丝极性测定、单单菌株配对杂交、双向核迁移与同核异质菌株获得、双‑单杂交与细胞质纯化、同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证、浅黄色金针菇菌株获取。本发明是一种基于金针菇杂交时存在的双向核迁移现象和布勒现象，通过调节不同极性单核菌株的活性和菌丝纯化，从而实现菌株间的细胞核或细胞质替换，进而选育出浅黄色金针菇品种的方法。通过本发明方法选育的金针菇菌株为浅黄色，抗逆性强。

Description

一种浅黄色金针菇的选育方法

技术领域

本发明涉及食用菌育种技术领域，具体涉及到一种利用双向核迁移技术选育浅黄色金针菇的选育方法。

背景技术

金针菇[Flammlinavelutipes (Fr.) Sing.]，英文名为Winter Mushroom、GoldenMushroom，俗称构菌、朴菇、冬菇、毛柄金线菌、冻菌、金菇、益智菇等，在分类学上隶属担子菌门（Basidiomycota）、担子菌纲（Basidiomycetes）、伞菌目（Agaricales）、白蘑科（Tricholomataceae）、小火焰菌属（Flammulina），是世界上继双孢蘑菇之后的第二大工厂化生产食用菌种类。我国金针菇商业化栽培已有30多年的历史。目前我国金针菇的主要生产模式已从原来袋栽转变为瓶栽工厂化生产，近年来，随着市场需求的变化，产品同质化现象严重，通过品种选育方法，选育具有特色的金针菇品种是产业发展的必然趋势。然而，目前我国金针菇育种中存在的问题：一是我国现有金针菇品种来源于国外引进或野生驯化种，遗传背景较窄，很难通过传统育种方法实现品种种性改良；二是对金针菇细胞质遗传的分析不够，导致种性恢复和种性改良工作严重滞后。

食用菌是有性生殖的真核生物，有性生殖的真核生物中的线粒体遗传对于生物生长和发育来讲是至关重要的，选择不同细胞质或是线粒体基因突变有时会对真菌子代种质性状产生非常明显的影响（Basse 2010）。加拿大著名的真菌学家布勒（Buller 1931）在白绒鬼伞中发现存在布勒现象，即一些担子菌的单核菌丝会被同种双核菌丝双核化，后又称为双单杂交或非对称杂交。之后，双-单杂交被广泛应用于大型担子菌的遗传和育种研究中。Callac等人分析比较了双孢蘑菇中五种繁衍后代的方式，结果表明通过布勒现象有5%的可能性获得具有不同细胞质的有活力的后代（Callacet al., 2006）。Aanen发现担子菌菌丝单-单杂交时细胞核迁移的速度远快于细胞分裂的速度，并提出利用布勒现象可获得异质菌株的实验方法（Aanen, 2008）。Roberts &Gladfelter（2015）和Dundon（2016）等人的近期研究结果也表明真菌细胞质会对于细胞核自治、基因表达、基因突变与进化产生重要影响。上述研究表明：利用申请人已建立的双向核迁移技术选育浅黄色金针菇是合理可行的方法之一。

发明内容

本发明的目的是针对目前金针菇生产存在的品种选育问题，提供一种浅黄色金针菇的选育方法，该方法利用我国金针菇种质资源优势，采用双向核迁移技术和单菌丝纯化方法，选育出了浅黄色金针菇新品种。

本发明浅黄色金针菇品种的选育方法，包括如下步骤：

（1）种菇采集选取白色金针菇品种和黄色金针菇品种的典型种菇进行孢子印收集；

（2）培养基制备用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL配制PDA无菌培养基培养皿和PDA斜面培养基，所述培养皿直径90mm；

（3）单孢分离从步骤（1）制备的孢子印中用接种环勾取孢子印，采用稀释涂布的方法接种于步骤（2）制备的PDA无菌培养基培养皿中，倒置，24℃避光培养3天，在体式显微镜下挑取萌发的单个孢子转接入PDA斜面培养基中；

（4）单核菌丝获取从步骤（3）制备的PDA斜面培养基中挑取单孢菌丝，24℃避光培养8~10天，挑取少许菌丝制片，并置于显微镜下镜检，剔除有锁状联合的异核菌丝，获得单核纯单核菌丝；

（5）单核菌丝极性测定采用常规单单杂交的方法，依据单核菌丝间配对杂交线是否有锁状联合，对挑取的无锁状联合的菌丝进行极性测定，通过多轮配对最终分别获得白色和黄色金针菇品种的4个不同极性类型的单核菌丝；

（6）单单菌株配对杂交首先将来源于不同双核菌株的可以配对的不同极性单核菌株接种于步骤（3）制备的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d，观察每个菌株的生长势，先将生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器转接于新的PDA培养皿一侧2/3处，24℃避光培养3~5d，再在同一PDA培养皿的另一侧用同样的工具和方法接入生长势强的单核菌株，两个菌种块间相距20-23mm，继续培养15~20d；

（7）双向核迁移与同核异质菌株获得从步骤（6）的菌落中，分别挑取杂交菌落远离杂交线的两边菌丝置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝转接于新的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；

（8）双-单杂交与细胞质纯化将步骤（7）获得的同核异质菌株和相应的单核菌株分别接种于PDA无菌培养基培养皿A中央，24℃避光培养10d后，先将培养皿A中生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器接种于PDA培养皿B的中央，24℃避光培养3~5d，再在PDA培养皿B一侧的1/3处，接入在步骤7中远离杂交线在该单核菌株一侧获得的同核异质菌株，两个菌种块间相距30-32mm，继续培养10~15d后挑取单核菌落远离杂交线一侧的菌丝，置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝分别转接于PDA无菌培养基培养皿C的中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的细胞质进一步纯化的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；

（9）同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证将步骤（8）获得的同核异质菌株采用菌落形态观察和分子标记技术检测生物学差异，并将相应同核异质菌株转接于出菇培养基，进行出菇试验，进一步验证菌株的可孕性；

（10）浅黄色金针菇菌株获取选取步骤（9）出菇试验获得的同核异质菌株子实体，重复步骤（1）~（5），从而获得分别具有白色菌株的细胞核和黄色菌株细胞质的单核菌株和黄色菌株的细胞核和白色菌株细胞质的单核菌株，然后采用步骤（5）获得的单核菌丝进一步确定新获得的单核菌株的具体交配类型，并采用已建立的双向核迁移、纯化和鉴定技术，分别获得具有白色菌株细胞核和黄色菌株细胞质的白核黄质菌株，及其相应黄色菌株细胞核和白色菌株细胞质的黄核白质菌株，并依次编号，之后，对获得的白核黄质菌株和黄核白质菌株进行了菌落形态观察、分子标记鉴定和出菇试验，并测定其农艺学性状与栽培性状，进而筛选出符合生产需求的白核黄质和黄核白质的浅黄色金针菇菌株。

所述步骤（9）中的出菇培养基为：籽壳34.5%，麸皮31%，玉米芯33%，轻质碳酸钙1.5%。

与现有技术相比，本发明的优点是：（1）本发明是一种基于金针菇杂交时存在的双向核迁移现象和布勒现象，通过调节不同极性单核菌株的活性和菌丝纯化，从而实现菌株间的细胞核或细胞质替换，进而选育出浅黄色金针菇品种的方法。（2）通过本发明方法选育的金针菇菌株为浅黄色，抗逆性强，填补了目前金针菇尚无浅黄色菌株的空白，可以进一步满足我国金针菇产业进一步发展的特色化品种需求。

附图说明

图1为本发明种菇采集原始白色金针菇品种。

图2为本发明种菇采集原始黄色金针菇品种。

图3为本发明单孢菌株萌发PDA斜面培养基。

图4为本发明双向核迁移菌株生长图。

图5为本发明纯化的单根菌丝萌发。

图6为本发明双核菌株纯化和单向核迁移菌株生长图。

图7为本发明具有黄色菌株细胞质的同核异质菌株菌落形态图。

图8为本发明具有白色菌株细胞质的同核异质菌株菌落形态图。

图9为本发明同核异质菌株SRAP Me4-Em12扩增图谱。

图10为本发明具有白色菌株细胞核和黄色菌株细胞质的白核黄质菌株菌落形态图。

图11为本发明具有黄色菌株细胞核和白色菌株细胞质的黄核白质菌株菌落形态图。

图12为本发明白核黄质菌株出菇图。

图13为本发明黄核白质菌株出菇图。

图中：1、生长势强的单核菌株，2、生长势弱的单核菌株，3、杂交线，4、远离杂交线的生长势强的单核菌株一侧的菌丝，5、远离杂交线的生长势弱的单核菌株一侧的菌丝，6、单核菌株，7、同核异质菌株，8、单核菌落远离杂交线一侧的菌丝，9、DL2000 Marker，10、生长势强的单核菌株DNA的SRAP Me4-Em12扩增图谱，11、具有黄色菌株细胞质的同核异质菌株DNA的SRAP Me4-Em12扩增图谱，12、具有白色菌株细胞质的同核异质菌株DNA的SRAPMe4-Em12扩增图谱，13、生长势弱的单核菌株DNA的SRAP Me4-Em12扩增图谱，14、SRAP Me4-Em12扩增的差异DNA多态性条带。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

利用本发明方法选育浅黄色金针菇品种，包括如下步骤：

（1）种菇采集选取白色金针菇品种（见图1）和黄色金针菇品种（见图2）的典型种菇进行孢子印收集；

（3）单孢分离从步骤（1）制备的孢子印中用接种环勾取孢子印，采用稀释涂布的方法接种于步骤（2）制备的PDA无菌培养基培养皿中，倒置，24℃避光培养3天，在体式显微镜下挑取萌发的单个孢子转接入PDA斜面培养基中（见图3）；

（6）单单菌株配对杂交首先将来源于不同双核菌株的可以配对的不同极性单核菌株接种于步骤（3）制备的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d，观察每个菌株的生长势，先将生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器转接于新的PDA培养皿一侧2/3处，24℃避光培养3~5d，再在同一PDA培养皿的另一侧用同样的工具和方法接入生长势强的单核菌株，两个菌种块间相距20-23mm，继续培养15~20d（见图4）；

（7）双向核迁移与同核异质菌株获得从步骤（6）的菌落中，分别挑取杂交菌落远离杂交线的两边菌丝（见图4）置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝转接于新的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化（见图5），进而获得相应的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；

（8）双-单杂交与细胞质纯化将步骤（7）获得的同核异质菌株和相应的单核菌株分别接种于PDA无菌培养基培养皿A中央，24℃避光培养10d后，先将培养皿A中生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器接种于PDA培养皿B的中央，24℃避光培养3~5d，再在PDA培养皿B一侧的1/3处，接入在步骤7中远离杂交线在该单核菌株一侧获得的同核异质菌株，两个菌种块间相距30-32mm，继续培养10~15d后挑取单核菌落远离杂交线一侧的菌丝（见图6），置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝分别转接于PDA无菌培养基培养皿C的中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化（见图5），进而获得相应的细胞质进一步纯化的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；

（9）同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证将步骤（8）获得的同核异质菌株采用菌落形态观察（见图7，图8）和分子标记技术（见图9）检测生物学差异，并将相应同核异质菌株转接于出菇培养基，进行出菇试验，进一步验证菌株的可孕性；出菇培养基的组成成分为：籽壳34.5%，麸皮31%，玉米芯33%，轻质碳酸钙1.5%；

（10）浅黄色金针菇菌株获取选取步骤（9）出菇试验获得的同核异质菌株子实体，重复步骤（1）~（5），从而获得分别具有白色菌株的细胞核和黄色菌株细胞质的单核菌株和黄色菌株的细胞核和白色菌株细胞质的单核菌株，然后采用步骤（5）获得的单核菌丝进一步确定新获得的单核菌株的具体交配类型，并采用已建立的双向核迁移、纯化和鉴定技术，分别获得具有白色菌株细胞核和黄色菌株细胞质的白核黄质菌株，及其相应黄色菌株细胞核和白色菌株细胞质的黄核白质菌株，并依次编号，之后，对获得的白核黄质菌株和黄核白质菌株进行了菌落形态观察（见图10，图11）、分子标记鉴定和出菇试验（见图12，图13），并测定其农艺学性状与栽培性状，进而筛选出符合生产需求的白核黄质和黄核白质的浅黄色金针菇菌株。

Claims

1.一种浅黄色金针菇的选育方法，包括如下步骤：

（1）单核菌丝制备选取白色金针菇品种和黄色金针菇品种的典型种菇进行孢子印收集；用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL配制PDA无菌培养基培养皿和PDA斜面培养基，所述培养皿直径90mm；从制备的孢子印中用接种环勾取孢子印，采用稀释涂布的方法接种于PDA无菌培养基培养皿中，倒置，24℃避光培养3天，在体式显微镜下挑取萌发的单个孢子转接入PDA斜面培养基中；从制备的PDA斜面培养基中挑取单孢菌丝，24℃避光培养8~10天，挑取少许菌丝制片，并置于显微镜下镜检，剔除有锁状联合的异核菌丝，获得单核纯单核菌丝；采用常规单单杂交的方法，依据单核菌丝间配对杂交线是否有锁状联合，对挑取的无锁状联合的菌丝进行极性测定，通过多轮配对最终分别获得白色和黄色金针菇品种的4个不同极性类型的单核菌丝；

（2）同核异质菌株的制备首先将来源于不同双核菌株的可以配对的不同极性单核菌株接种于制备的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d，观察每个菌株的生长势，先将生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器转接于新的PDA培养皿一侧2/3处，24℃避光培养3~5d，再在同一PDA培养皿的另一侧用同样的工具和方法接入生长势强的单核菌株，两个菌种块间相距20-23mm，继续培养15~20d；从上述菌落中，分别挑取杂交菌落远离杂交线的两边菌丝置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝转接于新的PDA无菌培养基培养皿中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；将获得的同核异质菌株和相应的单核菌株分别接种于PDA无菌培养基培养皿A中央，24℃避光培养10d后，先将培养皿A中生长势弱的单核菌株用直径5mm的打孔器接种于PDA培养皿B的中央，24℃避光培养3~5d，再在PDA培养皿B一侧的1/3处，接入在步骤7中远离杂交线在该单核菌株一侧获得的同核异质菌株，两个菌种块间相距30-32mm，继续培养10~15d后挑取单核菌落远离杂交线一侧的菌丝，置于荧光正置显微镜下观察，将有锁状联合的菌丝分别转接于PDA无菌培养基培养皿C的中央，24℃避光培养8~10d后，在光学显微镜下挑取菌落边缘的单根菌丝进行相应菌株纯化，进而获得相应的细胞质进一步纯化的分别具有黄色菌株细胞质和白色菌株细胞质的同核异质菌株；

（3）同核异质菌株生物学差异检测与可孕性验证将步骤（2）获得的同核异质菌株采用菌落形态观察和分子标记技术检测生物学差异，并将相应同核异质菌株转接于出菇培养基，进行出菇试验，进一步验证菌株的可孕性；

（4）浅黄色金针菇菌株获取选取步骤（3）出菇试验获得的同核异质菌株子实体，重复步骤（1），从而获得分别具有白色菌株的细胞核和黄色菌株细胞质的单核菌株和黄色菌株的细胞核和白色菌株细胞质的单核菌株，然后采用步骤（1）获得的单核菌丝进一步确定新获得的单核菌株的具体交配类型，并采用已建立的双向核迁移、纯化和鉴定技术，分别获得具有白色菌株细胞核和黄色菌株细胞质的白核黄质菌株，及其相应黄色菌株细胞核和白色菌株细胞质的黄核白质菌株，并依次编号，之后，对获得的白核黄质菌株和黄核白质菌株进行了菌落形态观察、分子标记鉴定和出菇试验，并测定其农艺学性状与栽培性状，进而筛选出符合生产需求的白核黄质和黄核白质的浅黄色金针菇菌株。

2.根据权利要求1所述的浅黄色金针菇的选育方法，其特征在于，所述出菇培养基为：籽壳34.5%，麸皮31%，玉米芯33%，轻质碳酸钙1.5%。