WO2013024737A1 - キノコの栽培期間決定方法及びキット - Google Patents

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WO2013024737A1
WO2013024737A1 PCT/JP2012/070031 JP2012070031W WO2013024737A1 WO 2013024737 A1 WO2013024737 A1 WO 2013024737A1 JP 2012070031 W JP2012070031 W JP 2012070031W WO 2013024737 A1 WO2013024737 A1 WO 2013024737A1
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gene
protein
platanin
cerato
mushroom
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PCT/JP2012/070031
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敦 倉橋
文啓 藤森
佐藤　真之
慎也 三浦
義明 牧野
耕三 西堀
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株式会社雪国まいたけ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H15/00—Fungi; Lichens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for simply and accurately determining whether or not a sufficient amount of cells and a cultivation period are sufficient for causing mushrooms to produce fruit bodies in artificial mushroom cultivation. More specifically, the present invention relates to a method and kit for determining a cultivation period and a method for producing mushrooms for producing excellent mushrooms using the gene expression level and / or its expression pattern as an index.
  • Non-patent Document 1 In the cultivation of mushrooms, from the inoculation to the fruiting body harvesting, in order to obtain good quality mushrooms, empirical management such as observing changes in the appearance of mushrooms has been performed. The period during which mushrooms can be produced empirically is also adopted for the culture period and the fruiting body growth period of mushroom cells before the fruiting body is made (Non-patent Document 1).
  • the present invention provides a method and means for determining the cultivation period of mushrooms that can make a fruiting body easily and accurately most efficiently without requiring a high technique for visual judgment in mushroom cultivation. For the purpose.
  • the present inventor has identified a gene that correlates with the gene expression level and the cultivation period in which a good fruiting body is obtained from the results of microarray analysis and quantitative real-time PCR.
  • the present inventors have found that the optimal cultivation period of mushrooms can be identified by detecting the expression level and / or expression pattern of the gene, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following [1] to [10].
  • [1] A method for determining an optimum cultivation period of mushrooms using an expression level of a gene and / or its expression pattern as an index.
  • HSP9 gene cerato-platanin-like protein 1 gene
  • cerato-platanin-like protein 2 gene cerato-platanin-like protein 3 gene
  • cerato-platanin-like protein 4 gene The method according to [1], wherein the expression level and / or its expression pattern is used as an index.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the expression level and / or expression pattern of the gene is detected by hybridization, polymerase chain reaction (PCR) or sequencing.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the expression level and / or expression pattern of the protein is detected by Western blotting, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay or sandwich immunoassay using an antibody against the protein. the method of.
  • At least one selected from the group consisting of HSP9 gene, cerato-platanin-like protein 1 gene, cerato-platanin-like protein 2 gene, cerato-platanin-like protein 3 gene and cerato-platanin-like protein 4 gene in the mushroom sample Obtain the expression level and / or expression pattern of the gene of the species, determine whether the cultivation period of the mushroom sample is optimal based on the expression level and / or expression pattern, and derive the fruiting body from the mushroom sample
  • a method for producing mushrooms comprising:
  • a kit for determining the cultivation period of a mushroom comprising means for detecting the expression level and / or expression pattern of the protein encoded by the gene.
  • the present invention provides a method and kit for determining the cultivation period of mushrooms.
  • the present method and kit can determine the optimal cultivation period of mushroom cells by comparing the expression level and / or expression pattern of a gene or protein expressed in the mushroom cultivation process, without visual judgment. Become.
  • gene and protein expression is used as an index, it is possible to reliably determine the optimal cultivation period and to manufacture excellent mushroom fruit bodies, as compared with conventional determination methods. Therefore, the present invention is useful in fields such as agriculture, agricultural chemistry, and breed improvement.
  • marmoreus is derived from beech shimeji
  • P. eryngii is derived from eringi
  • L. edodes is derived from shiitake
  • P. ostreatus is an amino acid sequence of a protein encoded by oyster mushroom.
  • 2 is a graph showing expression patterns of cerato-platanin-like proteins 1 to 4 genes obtained from microarray analysis. The results of alignment of the amino acid sequences of the encoded proteins for the maitake cerato-platanin-like protein 1 gene and its homologous cerato-platanin-like protein 2-4 gene are shown.
  • Hm cerato-platanin-like protein 1 is from beech swordfish
  • Le cerato-platanin-like protein 1 is from shiitake
  • Pe cerato-platanin-like protein 1 is from eringgi
  • Tm cerato-platanin-like protein 1 is from matsutake Represents the amino acid sequence of the protein encoded by the gene.
  • the present invention relates to a method for determining the cultivation period of mushrooms. Specifically, by determining the optimal cultivation period of mushrooms using the expression level of a specific gene and / or its expression pattern as an index, Determine the cultivation period to obtain. More specifically, a mushroom sample to be analyzed is prepared, the expression of a specific gene in the mushroom sample is detected, the expression level and / or expression pattern of the gene is determined, and the expression level and / or expression is determined. Mushroom cultivation period is determined using the pattern as an index.
  • the target mushrooms in the present invention may be any naturally occurring or artificially bred mushrooms, such as maitake (Grifola frondosa), eringi (Pleurotus eryngii), beech shimeji (Hypsizigus marmoreus) , Asteraceae), Shiitake (Lentinus edodes, Asteraceae), Honshimeji (Lyophyllum shimeji, Asteraceae), Hatake shimeji (Lyophyllum decastes), Enokitake (Flammulina velutipes), Azoaceae P Examples include edible mushrooms such as agaricus bisporus (Agaricus bisporus), oyster mushroom (Pleurotus ostreatus), matsutake (Tricholoma matsutake), and related species thereof.
  • maitake Grifola frondosa
  • eringi Pleurotus eryngii
  • a mushroom sample to be analyzed is prepared.
  • Mushrooms are mushrooms that are cultivated in a facility where the environment can be artificially controlled, such as a mushroom cultivation factory (including those that use bags and bottles as containers), and log-grown mushrooms. It is in the state of mycelium.
  • a medium may be included in the sample.
  • the expression level and / or expression pattern of the gene in the mushroom sample is detected.
  • the timing of detecting the expression level of the gene and / or its expression pattern is at an arbitrary point in the hyphal elongation stage. Therefore, the period until the fruiting body is induced from the inoculum, for example, the culture period in which the mycelium is increased in order to make the fruiting body (mycelium culture period), the period in which the fruiting body primordium is made (the primordial induction period) ) Etc. at any point in the period.
  • the cultivation period for obtaining excellent mushroom fruiting bodies is determined based on the difference in the expression level of the gene in the mushroom mycelium sample and the difference in the expression pattern of the gene in the mushroom mycelium sample.
  • a gene (marker) to be detected is a gene that can determine the optimum cultivation period based on its expression level and / or expression pattern, and such a gene is referred to as a “marker gene” in the present specification.
  • marker genes for determining the cultivation period of mushrooms for example, SEQ ID NO: 1 (HSP9), SEQ ID NO: 3 (cerato-platanin-likeanprotein 1), SEQ ID NO: 5 (cerato-platanin-like protein 2), SEQ ID NO: 7 Examples thereof include a maitake gene having a base sequence represented by (cerato-platanin-like protein 3) or SEQ ID NO: 9 (cerato-platanin-like protein ⁇ ⁇ 4). As shown in the examples described later, this gene is identified as a gene that correlates with the cultivation period of mushrooms and the amount of expression of mushrooms that give excellent shape and yield.
  • the “culture period” refers to a period during which the mycelium is cultured to form mushroom fruit bodies, that is, a period from the inoculum to the fruit body induction.
  • the “cultivation period” refers to a period until a fruit body of a mushroom is obtained, and includes a culture period of a mycelium, a period for inducing a primordial body of a fruit body, and a period for generating a fruit body.
  • the “optimum cultivation period” means a minimum cultivation period in which excellent mushroom fruiting bodies are obtained.
  • the marker gene to be detected may be one kind or may be detected by combining a plurality of genes.
  • “gene” includes DNA and its complementary DNA (cDNA), and total RNA and messenger RNA (mRNA).
  • the base sequence of the marker gene since the base sequence of the marker gene contains mutations between species and within species, it hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a sequence complementary to all or part of the above base sequence.
  • a mutant gene encoding a protein that is soybean and has a desired function or activity can also be used as a marker gene in the present invention.
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, it refers to conditions under which nucleic acids having high homology (homology is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more) hybridize.
  • the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM
  • the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C.
  • hybridization conditions are 65 ° C. and washing conditions are 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 10 minutes
  • hybridization is performed by a conventional method such as Southern blotting or dot blot hybridization.
  • Southern blotting or dot blot hybridization When it is confirmed that the hybridization occurs, it can be said that the cells hybridize under stringent conditions.
  • a gene having a base sequence having high homology to the above base sequence is highly likely to encode a protein having a given function or activity, it can be used as a marker gene in the present invention.
  • “Homology” with respect to a gene refers to the base sequence similarity between two polynucleotides, and is determined by comparing two base sequences that are optimally aligned over the region of the base sequence being compared. The sequence homology is calculated as the ratio of the number of the same bases existing at the same position of the two base sequences to the total number of bases in the comparison target region. Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence homology are known in the art, such as blastn.
  • “having homology” with respect to a gene means 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9. Preferably, it means having a base sequence having a homology of 95% or more.
  • Such mutations or homologous genes include, for example, the beech shimeji HSP9 gene (SEQ ID NO: 15), the eringi HSP9 gene (SEQ ID NO: 17), and the shiitake HSP9 gene (SEQ ID NO: 1) having high homology to the maitake HSP9 gene (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 19) or oyster mushroom HSP9 gene (SEQ ID NO: 21).
  • beech sage cerato-platanin-like protein 1 gene SEQ ID NO: 23
  • shiitake mushroom cerato-platanin-like protein 1 gene sequence
  • Eringi cerato-platanin-like protein 1 gene SEQ ID NO: 27
  • Matsutake cerato-platanin-like protein 1 gene SEQ ID NO: 29.
  • a person skilled in the art can appropriately confirm whether or not a mutation or homologous gene has a desired function or activity, that is, whether or not it can be used as a marker for determining the mushroom cultivation period.
  • the expression and / or expression pattern of the target gene is detected, and it is confirmed whether there is a correlation between the cultivation period and the expression level of the mushroom from which a good fruiting body shape can be obtained. Can be evaluated.
  • the specific method can use the method described in the Example.
  • the proteins encoded by the marker genes are SEQ ID NO: 2 (corresponding to SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 4 (corresponding to SEQ ID NO: 3), SEQ ID NO: 6 (corresponding to SEQ ID NO: 5), SEQ ID NO: 8 ( SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 10 (corresponding to SEQ ID NO: 9), SEQ ID NO: 16 (corresponding to SEQ ID NO: 15), SEQ ID NO: 18 (corresponding to SEQ ID NO: 17), SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 19), SEQ ID NO: 22 (corresponding to SEQ ID NO: 21), SEQ ID NO: 24 (corresponding to SEQ ID NO: 23), SEQ ID NO: 26 (corresponding to SEQ ID NO: 25), SEQ ID NO: 28 (corresponding to SEQ ID NO: 27) Or a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 (corresponding to SEQ ID NO: 29).
  • amino acid sequence of a protein also includes a variation between species and within a species, in the present invention, as long as the protein has the same activity or function as the protein having the amino acid sequence, a plurality of amino acid sequences, preferably 1 or a number in the amino acid sequence Mutations such as substitution, deletion, insertion and addition may occur in one amino acid. Equivalent activity or function can be confirmed by methods known in the art depending on the nature of the activity or function.
  • 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 or 30 1 to 10 amino acids may be deleted, and 1 to 30 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 or 30 ,
  • Preferably 1-20, more preferably 1-10 amino acids may be added, or SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 , 28 or 30 can also be used in the present invention in which 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 amino acids are substituted with other amino acids.
  • a protein having a mutation in 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids has a high probability of retaining the same activity or function as a protein having the above amino acid sequence.
  • a protein having an amino acid sequence having high homology to the amino acid sequence can also be used in the present invention.
  • “Homology” with respect to proteins refers to the sequence similarity of residues between two proteins and is determined by comparing two amino acid sequences that are optimally aligned over the region of the amino acid sequence being compared.
  • the Sequence homology refers to the ratio of identical amino acid residues to all overlapping amino acids in an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using blastp, which is a mathematical algorithm known in the art. Calculated as (%).
  • “having homology” with respect to proteins means 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10. It preferably means having an amino acid sequence having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more.
  • homologous genes and homologous proteins of the maitake HSP9 gene are known to exist in eringi, bunashimeji, shiitake, and oyster mushrooms (FIGS. 4 and 5).
  • amino acid sequence of the protein has a mutation, it is expected to show an equivalent function or activity (see Example 3 described later).
  • Specific homologous proteins include, for example, Bunashimeji HSP9 protein (SEQ ID NO: 16), Eringi HSP9 protein (SEQ ID NO: 18), Shiitake HSP9 protein (SEQ ID NO: 2) having high homology to the maitake HSP9 protein (SEQ ID NO: 2). 20) or oyster mushroom HSP9 protein (SEQ ID NO: 22).
  • Buna shimeji cerato-platanin-like protein 1 protein SEQ ID NO: 24
  • ering-cerato-platanin-like protein 1 protein SEQ ID NO: 28
  • matsutake cerato-platanin-like protein 1 protein SEQ ID NO: 30.
  • the expression level and / or expression pattern of the marker gene is detected in a mushroom sample.
  • means for detecting the expression level and / or expression pattern of the marker gene include probe DNA or primer DNA designed based on the gene, or an antibody against the protein encoded by the gene. Hereinafter, these means will be described in detail.
  • the expression level and / or expression pattern of a marker gene can be detected using primer DNA or probe DNA containing all or part of the DNA of the marker gene or a complementary sequence thereof.
  • primer DNA or probe DNA can specifically bind to mRNA of a gene expressed in a mushroom sample or cDNA corresponding to the mRNA, the marker in the mushroom sample is based on the binding. It is possible to detect gene expression.
  • Primer DNA and probe DNA can be easily designed by a known program based on the base sequence of the marker gene.
  • the length of the DNA having a substantial function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, still more preferably 15 to 30 bases, or 20 to 30 bases.
  • the length of DNA having a substantial function as a probe is preferably 20 bases or more, more preferably 30 to 60 bases, and further preferably 50 to 60 bases.
  • the primer DNA or probe DNA is, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, or SEQ ID NO: 15, 17, 19 or 21, or SEQ ID NO: 23, 25, 27 or 29, or It may consist of at least 10 bases, preferably at least 15 bases, complementary to it.
  • Specific primer DNA that can be used in the present invention is not limited, for example, but primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 for detecting the HSP9 gene (SEQ ID NO: 1) are included. Can be mentioned.
  • primer DNA and probe DNA designed as described above can be prepared according to methods known to those skilled in the art.
  • the primer DNA or probe DNA may contain sequences other than the portion to be annealed or hybridized, for example, an additional sequence such as a tag sequence. Those in which such an additional sequence is added to DNA can also be used in the present invention.
  • the primer DNA and / or probe DNA is used in the amplification reaction or the hybridization reaction, respectively, and the amplification product or hybrid product is detected.
  • mRNA or cDNA corresponding to the mRNA is prepared from a mushroom sample.
  • mRNA and cDNA can be extracted appropriately using methods well known in the art. For example, when RNA is extracted, a guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, a guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method, or the like can be used.
  • cDNA can be prepared using a known reverse transcriptase. Using the mushroom sample prepared as described above, the following amplification reaction and / or hybridization reaction is performed.
  • the expression of a marker gene in a mushroom sample can be detected by performing an amplification reaction using mRNA or cDNA as a template using primer DNA and detecting the specific amplification reaction.
  • the amplification method is not particularly limited, and a known method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method can be mentioned. Amplification is performed until the amplification product is at a detectable level. The optimum PCR conditions can be easily determined by those skilled in the art.
  • PCR polymerase chain reaction
  • cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using mRNA as a template, and then PCR is performed using the prepared cDNA as a template and a pair of primers.
  • quantitative detection is possible by adopting a quantitative PCR method such as a competitive PCR method or a real-time PCR method as an amplification method.
  • a known means capable of specifically recognizing an amplification product obtained by the amplification reaction can be used.
  • a specific amplification reaction can be detected by confirming whether an amplified fragment of a specific size is amplified using agarose gel electrophoresis or the like.
  • a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be allowed to act on dNTP incorporated during the amplification reaction to detect the label.
  • a radioisotope 32 P, 125 I, 35 S and the like can be used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • SR sulforhodamine
  • TRITC tetramethylrhodamine
  • luminescent substance luciferin or the like can be used.
  • the amplification product bound to the label can be detected using a label such as Cyber Green (for example, SYBR Green I) that binds to the amplification product.
  • Cyber Green for example, SYBR Green I
  • any method known in the art for detecting the above-described labeled body may be used.
  • the radioactivity can be measured using, for example, a liquid scintillation counter or a ⁇ -counter.
  • fluorescence when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
  • the target marker gene is expressed in the mushroom sample.
  • the target marker gene is expressed in the mushroom sample by determining (sequencing) the sequence of the amplification product obtained by performing the amplification reaction as described above.
  • the marker gene in the mushroom sample can be sequenced by a method known in the art.
  • a method for that purpose for example, the technique disclosed in Sambrook et al., “Molecular” Cloning ”“ A ”Laboratory“ Mannual ”(1989)“ Cold ”Spring“ Harbor Laboratory ”, etc. can be used.
  • total RNA extracted and purified from mushroom tissue or mycelium is converted into cDNA using a reverse transcriptase such as M-MLV Reverse Transcriptase, Oligo dT primer, and the like.
  • the sense strand and the antisense strand primer to be soybean are designed, and the region sandwiched between these primers is amplified by the PCR method.
  • the amplified base sequence is determined by a known sequencing method such as the Sanger method.
  • cDNA is synthesized from total RNA to create a library.
  • the library may be comprehensively sequenced by high-speed sequencing such as pyrosequencing.
  • the expression level of the marker gene and / or its expression pattern can be detected by performing a hybridization reaction on the mushroom sample using the probe DNA and detecting its specific binding (hybrid).
  • the hybridization reaction needs to be performed under conditions such that the probe DNA specifically binds only to mRNA or cDNA derived from the marker gene, that is, stringent conditions.
  • an appropriate label such as a fluorescent label (such as fluorescein or rhodamine), a radioactive label (such as 32 P), or a biotin label can be added to the probe DNA. Therefore, in the present invention, a probe to which a label is added is preferably used.
  • the detection using the labeled probe DNA includes contacting the mushroom sample or mRNA or cDNA prepared therefrom with the probe DNA so as to be hybridizable.
  • “To be able to hybridize” means in an environment (temperature, salt concentration) in which specific binding occurs under the above-described stringent conditions.
  • a mushroom sample or mRNA or cDNA is immobilized on an appropriate solid phase such as a slide glass, membrane, microarray, or microtiter plate, and a labeled probe DNA is added or a labeled probe DNA is added.
  • Quantitative detection is also possible by using the label concentration as an index.
  • Examples of the detection method using the labeled probe DNA include Southern hybridization method and Northern hybridization method.
  • the optimal cultivation period of mushroom mycelium can be determined using the expression level and / or expression pattern of the protein encoded by the marker gene as an index. For example, since a protein expressed by a marker gene to be detected expressed in a mushroom can bind to an antibody against the protein, detection of the reaction with the protein in a mushroom sample using such an antibody. By this, the expression level and / or expression pattern of the marker gene in the mushroom sample can be detected.
  • the antibody against the protein encoded by the marker gene is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and includes a complete molecule, Fab, F (ab ′) 2 , Fv fragment and the like.
  • a polyclonal antibody such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal with a protein encoded by a marker gene or a partial fragment thereof as an immunogen.
  • an eukaryotic cell expression vector that expresses the protein or fragment thereof can be prepared by introducing it into the muscle or skin of an animal by injection or gene gun, and then collecting serum.
  • the animal mouse, rat, rabbit, goat, chicken and the like are used.
  • the monoclonal antibody is prepared according to a known monoclonal antibody production method (“monoclonal antibody”, Kamei Nagamune, Hiroko Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996). Can be produced.
  • a protein used for producing an antibody or a partial fragment thereof can also be produced by a method known in the art, for example, a chemical synthesis method and a recombinant technique.
  • antibodies include antibodies labeled with a labeling substance.
  • a label used for such a labeled antibody an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent dye can be used.
  • the enzyme There are no particular restrictions on the enzyme as long as it satisfies conditions such as a high turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloration of a substrate, ordinary enzyme immunoassay (EIA)
  • EIA enzyme immunoassay
  • peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can be used.
  • an enzyme inhibitor a coenzyme, etc.
  • enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound.
  • a crosslinking agent such as a maleimide compound.
  • a known substance can be used according to the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used.
  • radioisotope those used in usual radioimmunoassay (RIA) such as 125 I and 3 H can be used.
  • RIA radioimmunoassay
  • the radiation dose emitted by the radioisotope is measured with a scintillation counter or the like.
  • fluorescent dye those used in usual fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorometer or a fluorescence microscope.
  • the mushroom sample is not particularly limited as long as the protein encoded by the marker gene is expressed, and mushroom crushed material, extract, and the like can be targeted.
  • One method for detecting the expression of a marker gene using an antibody is a method in which the binding between the antibody and a protein in a mushroom sample is tested in a solid phase system.
  • This method in the solid phase system is a preferable method for detecting a trace amount of protein and simplifying the operation. That is, in this solid phase method, the antibody (primary antibody) is immobilized on a solid phase (resin plate, membrane, beads, etc.), the protein in the mushroom sample is bound to this immobilized antibody, and unbound protein is washed away. After that, a labeled antibody (secondary antibody) is bound to the antibody + protein conjugate remaining on the plate, and the signal of this secondary antibody is detected.
  • This method is a so-called “sandwich method”, and is a method widely used as “ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)” when an enzyme is used as a marker. It is also possible to perform Western blotting in which a mushroom sample is subjected to electrophoresis, the separated protein is transferred to a membrane, and then reacted with an antibody.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • Another method is a method in which the antibody and protein are bound in a liquid phase system.
  • the labeled antibody is brought into contact with the mushroom sample to bind the labeled antibody and the protein contained in the mushroom sample, the conjugate is separated by the same method as described above, and the labeled signal is detected by the same method. .
  • Another method of the liquid phase system is to contact the antibody (primary antibody) and the mushroom sample to bind the primary antibody and the protein contained in the mushroom sample, and bind the labeled antibody (secondary antibody) to this conjugate.
  • the label signal in the tripartite conjugate is detected.
  • an unlabeled secondary antibody may be first bound to an antibody + protein conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody.
  • binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance.
  • an antibody that recognizes a partial region (for example, Fc region) of the secondary antibody may be labeled and the tertiary antibody may be bound to the secondary antibody. Separation of the conjugate from the liquid phase can be the same as described above.
  • the protein + antibody + labeled antibody conjugate is separated by a known separation means (chromatography, salting-out method, alcohol precipitation method, enzyme method, solid phase method, etc.), and the signal of the labeled antibody is detected. You may do it.
  • antibodies can be used histologically for in situ detection of gene expression, such as immunohistochemical staining (eg immunostaining) or immunoelectron microscopy.
  • In-situ detection can be performed by excising a mushroom sample (such as a paraffin-embedded section of tissue) and contacting it with a labeled antibody.
  • the expression of the marker gene in the mushroom sample is detected, and the expression level and / or expression pattern of the marker gene is determined. Subsequently, the expression level and / or expression pattern of the marker gene in the target mushroom is compared with the reference marker gene expression level and / or expression pattern.
  • the reference marker gene expression level and / or expression pattern is obtained from the mycelium at the initial stage of culture or from the mycelium after completion of the culture.
  • the specific criterion is when the expression level of the marker gene is changed by 10% or more, preferably 30% or more, or compared with the expression pattern of the reference marker gene. In this case, different expression patterns are shown.
  • the present inventors can compare the expression level and / or expression pattern of the marker gene during the mushroom cultivation process by the cultivation period by microarray analysis and quantitative real-time PCR. It has been confirmed that it is possible to determine the cultivation period during which a fruiting body can be obtained.
  • the present invention can clarify the cultivation period in which an excellent fruiting body can be obtained based on the expression level of the marker gene and / or the difference in the expression pattern, using the marker gene in the mushroom cultivation process as an index. . Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to easily and accurately determine the optimum cultivation period without depending on the grower's experience such as visual judgment.
  • the expression of the marker gene in the mushroom sample is increased by 10% or more, preferably 30% or more compared to the expression level (reference) of the marker gene at the beginning of the culture, or the expression of the marker gene at the completion of the culture If the expression of the marker gene in the mushroom sample is comparable (ie about 80% to 120% of the reference) or increased compared to the amount (reference), the mycelium culture period is optimal And the subsequent operation, for example, guidance of the fruiting body can be performed.
  • a superior fruit body that is, a fruit body having an expected yield can be obtained.
  • the present invention also provides a method for producing mushrooms. Specifically, the expression level and / or expression pattern of at least one marker gene in a mushroom sample is obtained, and the expression level and / or It is determined whether the cultivation period of the mushroom sample is optimal based on the expression pattern, and a fruit body is derived from the mushroom sample.
  • the present invention also relates to a mushroom cultivation period determination kit comprising means for detecting the expression level and / or expression pattern of a marker gene or a protein encoded by the gene.
  • a mushroom cultivation period determination kit comprising means for detecting the expression level and / or expression pattern of a marker gene or a protein encoded by the gene.
  • various components known in the art used for detecting gene expression
  • a buffer, a sample processing reagent, a labeled antibody, etc. may be included.
  • the above-mentioned method for determining the cultivation period of mushrooms and the method for producing mushrooms can be carried out easily and simply.
  • Example 1 Confirmation of expression pattern of molecular marker by quantitative PCR
  • mycelia culture period there is a culture period (hereinafter referred to as "mycelia culture period") in which mycelia are increased to produce fruit bodies.
  • mycelia were obtained from the 20th, 30th, 40th, 50th, 60th, and 70th days after inoculation with the inoculum and immediately frozen in liquid nitrogen.
  • the nucleotide sequence of the maitake HSP9 gene was obtained using the cDNA in-house database (SEQ ID NO: 1). Specific PCR primers were then designed using computer software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). The designed primer sequences are shown in Table 1.
  • cDNA was synthesized using PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa).
  • Real-time quantitative PCR was performed using Chromo 4 (Bio-Rad) with THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO). In real-time quantitative PCR, initial thermal denaturation at 95 ° C. for 1 minute was followed by 40 cycles of 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and fluorescence detection conditions as one cycle.
  • the gene expression level was corrected with the expression level of the GAPDH gene, which was constitutively expressed at any stage.
  • primer sequences for amplifying the GAPDH gene caaccttgac gaatacgact c (SEQ ID NO: 13) and cctcgacgat accgaagttg (SEQ ID NO: 14) were used.
  • the relative ratio of the expression level was calculated using the ⁇ Ct method (Livak KJ, and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR andthe 2 ⁇ CT method. Methods 2001, 25 (4): 402-8).
  • FIG. 1 shows the expression pattern of the HSP9 gene according to the mycelium culture period (relative expression difference when the culture day is 1). From this result, it can be seen that the expression level of the HSP9 gene changes depending on the mycelium culture period.
  • Example 2 Effect on fruit body development in different culture periods Mycelium culture was stopped on the 20th, 30th, 40th, 50th, 60th, and 70th days of culture. The occurrence of. As a result, as shown in FIG. 2, the occurrence of fruiting bodies was remarkably worse on the 20th and 30th days, not good on the 40th and 50th days, but good on the 60th and 70th days. . The yield (%) of the fruiting bodies at that time is shown as a graph in FIG. 3 with the yield (weight) at the maximum culture day 69 days being 100%.
  • the optimum culture period of maitake can be determined after the maximum expression of HSP9 during the mycelium culture period.
  • the yield when the expression level of HSP9 is maximized is increased by about 460% compared to the initial stage of culture.
  • the expression level and / or expression pattern of this HSP9 gene during culture strongly correlates with the phenotype of the fruiting body, and therefore the HSP9 gene can be used in a culture period (ie, cultivation period) during which a good fruiting body can be obtained. It is suitable as a molecular marker for the purpose of determination.
  • Example 3 Confirmation by quantitative PCR with eringi and beech shimeji HSP9 gene In the same manner as described in Example 1, expression patterns of eringi and bun shimeji HSP9 gene were obtained in the whole cultivation process.
  • FIG. 4A is a graph showing changes in the expression level of the maitake HSP9 gene throughout the cultivation process
  • FIG. 4B is a graph showing changes in the expression level of the eringi HSP9 gene throughout the cultivation process
  • FIG. 4C is an expression throughout the cultivation process of Bunashimeji HSP9. It is a graph which shows quantity change. The graph shows the relative expression difference in each culture period when the expression in the early period of culture is 1.
  • the expression level of the maitake HSP9 gene increases rapidly with the passage of culture (cultivation) time.
  • the HSP9 gene of eringi and bunashimeji also showed the same expression pattern as maitake. From these results, it was found that the same expression level change was caused for any kind of HSP9 gene.
  • the HSP9 gene is known to exist in various mushroom species, and the result of aligning the amino acid sequence of the protein encoded by the HSP9 gene with free software ClustalW and arranging the sequence with BOXSHADE is shown in FIG.
  • G. frondosa is derived from maitake
  • H. marmoreus is derived from beech shimeji
  • P. eryngii is derived from eringi
  • L. edodes is derived from shiitake
  • P. ostreatus is an amino acid sequence of a protein encoded by a gene derived from oyster mushroom. .
  • this molecular marker and its homologous gene are considered to have the same function in any mushroom species, and the cultivation period during which the good fruiting bodies shown in Example 1 and Example 2 can be obtained. It is suitable as a molecular marker for the purpose of determination. Therefore, the optimal cultivation period can be determined by using the cultivation period determination method of the present invention that can obtain a good fruiting body using the gene expression level or its expression pattern as an index.
  • Example 4 Confirmation of expression pattern of molecular marker by microarray In maitake cultivation, there is a period in which a primordial body of a fruiting body is made (hereinafter referred to as "primary base induction period"). After the primal base is created during the primordial induction period, a fruiting body is generated (fruiting body induction). The primordium was obtained from the 1st, 3rd and 6th days of the primordial induction period and immediately frozen in liquid nitrogen.
  • RNA was extracted using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). The total RNA obtained was assayed for concentration and purity using Nano® Drop (Thermo) and 2100® Bioanalyzer (Agilent). The expression level was measured by microarray using the assayed total RNA.
  • FIGS. 6A-D line graphs indicated by black circles indicate changes in the expression levels of cerato-platanin-like-protein 1 to 4 genes, respectively. From these results, it was found that all four cerato-platanin-like protein genes possessed by maitake cause the same expression level change. It was also found that these four genes showed the maximum expression level before the fruiting body generation operation.
  • the cerato-platanin-like protein 1 to 4 genes are homologous genes, and the alignment of amino acid sequences encoded by these genes is shown in FIG.
  • this molecular marker is suitable as a molecular marker for the purpose of determining the timing of performing fruiting body generation operation. Therefore, the optimal cultivation period can be determined by using the cultivation period determination method of the present invention that can obtain a good fruiting body using the gene expression level or its expression pattern as an index.
  • Example 5 For the maitake cerato-platanin-like protein 1 gene, homologous genes thereof were searched with bunashimeji (Hm), shiitake (Le), eringi (Pe) and matsutake (Tm). The results are shown in FIG. From the results of FIG. 8, it was found that cerato-platanin-like protein 1 in any bacterial species has high homology.
  • this molecular marker and its homologous gene are considered to have the same function in any mushroom species, and the purpose is to determine the cultivation period in which a good fruiting body shown in Example 4 can be obtained. It is suitable as a molecular marker. Therefore, the optimum cultivation period can be determined by using the cultivation period determination method of the present invention that can obtain a good fruiting body using the gene expression level or its expression pattern as an index.

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Abstract

　本発明は、遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標としてキノコの最適な栽培期間を決定する方法に関する。具体的には、HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標としてキノコの最適栽培期間を決定する方法を提供する。

Description

キノコの栽培期間決定方法及びキット
　本発明は、キノコの人工栽培において、キノコ菌体に子実体を作らせるのに十分な菌体量及び栽培期間を経ているかを簡便かつ正確に判定する方法及びキットに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標として優良なキノコを作らせるための栽培期間の決定方法及びキット、並びにキノコの製造方法に関する。
　従来、キノコの栽培において、種菌接種から子実体収穫に至るまで、品質の良いキノコを得るために、キノコの外観変化を観察する等、栽培者による経験的な管理が行われている。子実体を作らせる前のキノコ菌体の培養期間や子実体生育期間についても、経験的に優良なキノコを作らせることができる期間を採用している（非特許文献１）。
　しかしながら、当該技術も含め、多くの技術は目視検査であり、栽培者といえど、高度な観察眼が要求される。加えて、目視検査は外観に依存しているため、表面的な菌糸の成長具合しか見ることができず、培地内部やキノコ菌体内部の変化は確認することができない。この場合、菌叢や菌まわりで異常を感知できなかったときには、子実体発生の段階で異常に気付くことになり、採算性が低下する。
大森及び小出編 (2001) キノコ栽培全科, 第102頁, 農文協
　上述のような技術背景から、当該技術分野においては、優良な子実体を作らせることができるキノコの最短の培養期間や子実体生育期間を決定することのできる方法及び手段が望まれている。従って、本発明は、キノコ栽培において、目視判断のための高い技術を不要として、簡便かつ正確に最も効率的に子実体を作らせることのできるキノコの栽培期間を決定する方法及び手段を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、マイクロアレイ解析及び定量リアルタイムPCRの結果から、その遺伝子発現量と優良な子実体が得られる栽培期間とに相関のある遺伝子を特定することに成功し、該遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出することによって、キノコの最適な栽培期間を識別可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の［1］～［10］である。
［1］遺伝子の発現量及び/又はその発現パターンを指標としてキノコの最適な栽培期間を決定する方法。
［2］HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標とすることを特徴とする［1］に記載の方法。
［3］キノコの栽培期間が菌糸体の培養期間、原基形成、又は子実体の生育期間であることを特徴とする［1］又は［2］に記載の方法。
［4］遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又はシークエンシングによって検出することを特徴とする［1］～［3］のいずれかに記載の方法。
［5］遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを、該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンにより検出することを特徴とする［1］～［3］のいずれかに記載の方法。
［6］タンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを、該タンパク質に対する抗体を用いた、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ又はサンドイッチイムノアッセイによって検出することを特徴とする［5］に記載の方法。
［7］キノコが、マイタケ、エリンギ、ブナシメジ、シイタケ、ホンシメジ、ハタケシメジ、エノキタケ、ナメコ、ツクリタケ、ヒラタケ及びマツタケを含む食用キノコより選択されることを特徴とする［1］～［6］のいずれかに記載の方法。
［8］キノコ試料において、HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを取得し、該発現量及び／又は発現パターンに基づいて該キノコ試料の栽培期間が最適であるかを判定し、該キノコ試料から子実体を誘導することを特徴とするキノコの製造方法。
［9］HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子又は該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを検出するための手段を含むことを特徴とするキノコの栽培期間決定用キット。
［10］遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出するための手段がプライマー又はプローブであることを特徴とする［9］に記載のキット。
　本発明により、キノコの栽培期間決定方法及びキットが提供される。本方法及びキットは、キノコ栽培過程において発現する遺伝子又はタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを比較することによって、目視判断によらず、キノコ菌体の最適栽培期間を決定することが可能となる。また、遺伝子及びタンパク質の発現を指標としているため、従来の判定方法よりも、確実に最適栽培期間を決定し、優良なキノコ子実体を製造することが可能となる。従って、本発明は、農業、農芸化学、品種改良などの分野において有用である。
定量PCR解析から得られたマイタケにおけるHSP9遺伝子の発現パターンを示すグラフである。 異なる期間培養で、かつ同時に発生させた子実体の写真である。 異なる期間培養で、かつ同時に発生させた子実体の収率（％）を示したグラフである。 マイタケHSP9遺伝子とそのエリンギ及びブナシメジ相同遺伝子について、それぞれの全栽培工程での発現挙動を示したグラフである。 マイタケHSP9遺伝子とその相同遺伝子について、コードされるタンパク質のアミノ酸配列をアライメントした結果を示す。図中、G.frondosaはマイタケ由来、H.marmoreusはブナシメジ由来、P.eryngiiはエリンギ由来、L.edodesはシイタケ由来、P.ostreatusはヒラタケ由来の遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。 マイクロアレイ解析から得られたcerato-platanin様タンパク質1～4遺伝子の発現パターンを示すグラフである。 マイタケcerato-platanin様タンパク質1遺伝子とその相同遺伝子であるcerato-platanin様タンパク質2～4遺伝子について、コードされるタンパク質のアミノ酸配列をアライメントした結果を示す。 マイタケcerato-platanin様タンパク質1遺伝子とその相同遺伝子について、コードされるタンパク質のアミノ酸配列をアライメントした結果を示す。図中、Hm cerato-platanin-like protein 1はブナシメジ由来、Le cerato-platanin-like protein 1はシイタケ由来、Pe cerato-platanin-like protein 1はエリンギ由来、Tm cerato-platanin-like protein 1はマツタケ由来の遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
　以下、本発明について詳細に説明する。本願は、2011年8月12日に出願された日本国特許出願第2011-176899号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明においては、キノコを人工栽培する際に、キノコの発現遺伝子や発現タンパク質の量及び／又はその発現パターンをモニタリングすることで、目視判断によらず、優良なキノコを得るための最適な栽培期間を見分ける。
　従って、本発明は、キノコの栽培期間決定方法に関し、具体的には、特定の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標としてキノコの最適な栽培期間を判断することにより、優良なキノコを得るための栽培期間を決定する。より具体的には、解析対象となるキノコ試料を準備し、キノコ試料における特定の遺伝子の発現を検出し、該遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを決定し、その発現量及び／又は発現パターンを指標としてキノコの栽培期間を決定する。
　本発明において対象となるキノコは、天然に存在する又は人工的に育種されているキノコのいずれでもよく、例えばマイタケ（Grifola frondosa、サルノコシカケ科）、エリンギ（Pleurotus eryngii、ヒラタケ科）、ブナシメジ（Hypsizigus marmoreus、キシメジ科）、シイタケ（Lentinus edodes、ヒラタケ科）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji、キシメジ科）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes、キシメジ科）、エノキタケ（Flammulina velutipes、キシメジ科）、ナメコ（Pholiota nameko、モエギタケ科）、ツクリタケ（Agaricus bisporus、ハラタケ科）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus、ヒラタケ科）、マツタケ（Tricholoma matsutake、キシメジ科）等の食用キノコ、及びこれらの近縁種が挙げられる。例えばマイタケの近縁種として、マイタケ属（Grifola）に属するシロマイタケ（G. albicans Imaz.）の他、トンビマイタケ（Meripilus giganteus）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）などがある。
　本発明においては、まず解析対象のキノコ試料を準備する。キノコは、例えばキノコ栽培工場等、人為的に環境の制御が可能な施設内で栽培される菌床栽培（袋や瓶を容器とするものも含む）や、原木栽培のキノコであり、培養中の菌糸の状態のものである。また、キノコ試料の調製時には、試料中に培地が含まれてもよい。
　続いて、キノコ試料における遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出する。遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出するタイミングは、菌糸伸長段階の任意の時点である。従って、種菌から子実体を誘導するまでの期間、例えば、子実体を作らせるために菌糸体を増やす培養期間（菌糸体培養期間）や、子実体の原基を作らせる期間（原基誘導期間）などの期間の任意の時点である。本発明においては、キノコ菌糸体試料における遺伝子の発現量の相違や、キノコ菌糸体試料における遺伝子の発現パターンの相違に基づいて、優良なキノコ子実体を得るための栽培期間を決定する。
　検出対象となる遺伝子（マーカー）は、その発現量及び／又は発現パターンに基づいて最適栽培期間を決定できる遺伝子であり、本明細書中でそのような遺伝子を「マーカー遺伝子」という。キノコの栽培期間を決定するためのマーカー遺伝子として、例えば配列番号1（HSP9）、配列番号3（cerato-platanin-like protein 1）、配列番号5（cerato-platanin-like protein 2）、配列番号7（cerato-platanin-like protein 3）又は配列番号9（cerato-platanin-like protein 4）に示される塩基配列を有するマイタケ遺伝子が挙げられる。この遺伝子は、後述する実施例に示されるように、優良な子実体の形状・収量が得られるキノコの栽培期間とその発現量とに相関のある遺伝子として特定されたものである。
　本発明において「培養期間」とは、キノコの子実体を作らせるために菌糸体を培養する期間、すなわち種菌から子実体誘導までの期間を指す。また、「栽培期間」とは、キノコの子実体を得るまでの期間を指し、菌糸体の培養期間、子実体の原基を誘導する期間、子実体を発生させる期間を含む。さらに「最適栽培期間」とは、優良なキノコ子実体が得られ、かつ最低限必要な栽培期間を意味する。
　なお、検出対象となるマーカー遺伝子は、1種でもよいし、又は複数の遺伝子を組み合わせて検出してもよい。また、本発明において「遺伝子」には、DNA及びその相補的DNA（cDNA）、並びに全RNA及びメッセンジャーRNA（mRNA）が含まれる。
　また、マーカー遺伝子の塩基配列は、種間で、また種内においても変異を含むものであるため、上記塩基配列の全部又は一部の配列に相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的の機能又は活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子も、本発明においてマーカー遺伝子として使用することができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上）を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150～900mM、好ましくは600～900mMであり、温度が60～68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
　また、上記塩基配列に対し高い相同性を有する塩基配列を有する遺伝子も、所与の機能又は活性を有するタンパク質をコードする蓋然性が高いため、本発明においてマーカー遺伝子として使用することができる。遺伝子に関して「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド間の塩基の配列類似性をいい、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアライメントされた2つの塩基配列を比較することで決定される。配列相同性は、2つの塩基配列の同一の位置に存在する同一の塩基数を決定し、この数の、比較対象領域内の塩基総数に対する比として算出される。最適なアライメント及び配列相同性を得るためのアルゴリズムは、当技術分野で公知であり、例えばblastn等が挙げられる。
　本発明において、遺伝子に関して「相同性を有する」とは、配列番号1、3、5、7若しくは9に示される塩基配列と50％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列を有することを意味する。
　そのような変異又は相同遺伝子としては、例えばマイタケHSP9遺伝子（配列番号1）に対して高い相同性を有する、ブナシメジHSP9遺伝子（配列番号15）、エリンギHSP9遺伝子（配列番号17）、シイタケHSP9遺伝子（配列番号19）又はヒラタケHSP9遺伝子（配列番号21）が挙げられる。また、マイタケcerato-platanin-like protein 1遺伝子（配列番号3）に対して高い相同性を有するブナシメジ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子（配列番号23）、シイタケ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子（配列番号25）、エリンギ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子（配列番号27）又はマツタケ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子（配列番号29）が挙げられる。
　変異又は相同遺伝子が目的の機能又は活性を有しているか否か、すなわちキノコの栽培期間を決定するマーカーとして使用することができるか否かは、当業者であれば適宜確認することができる。例えば、任意の種のキノコにおいて、対象の遺伝子の発現及び／又は発現パターンを検出し、優良な子実体の形状が得られるキノコの栽培期間とその発現量とに相関があるか否かを確認することによって評価することができる。具体的な方法は、実施例に記載された方法を用いることができる。
　上記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質は、配列番号2（配列番号1に対応する）、配列番号4（配列番号3に対応する）、配列番号6（配列番号5に対応する）、配列番号8（配列番号7に対応する）、配列番号10（配列番号9に対応する）、配列番号16（配列番号15に対応する）、配列番号18（配列番号17に対応する）、配列番号20（配列番号19に対応する）、配列番号22（配列番号21に対応する）、配列番号24（配列番号23に対応する）、配列番号26（配列番号25に対応する）、配列番号28（配列番号27に対応する）、又は配列番号30（配列番号29に対応する）に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
　タンパク質のアミノ酸配列も、種間及び種内において変異を含むものであるため、本発明では、上記アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の活性又は機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加等の変異が生じてもよい。同等の活性又は機能は、その活性又は機能の性質に応じて、当技術分野で公知の方法により確認することができる。例えば、配列番号2、4、6、8、10、16、18、20、22、24、26、28若しくは30に示されるアミノ酸配列の1～30個、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号2、4、6、8、10、16、18、20、22、24、26、28若しくは30に示されるアミノ酸配列に1～30個、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号2、4、6、8、10、16、18、20、22、24、26、28若しくは30に示されるアミノ酸配列の1～30個、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明において使用することができる。特に、1～5個、好ましくは1～3個、より好ましくは1若しくは2個のアミノ酸に変異を有するタンパク質は、上記アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の活性又は機能を保持する蓋然性が高い。
　また、上記アミノ酸配列に対し高い相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明において使用することができる。タンパク質に関して「相同性」とは、2つのタンパク質間の残基の配列類似性をいい、比較対象のアミノ酸配列の領域にわたって、最適な状態にアライメントされた2つのアミノ酸配列を比較することで決定される。配列相同性は、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムであるblastp等を用いて2つのアミノ酸配列をアライメントさせた場合の、最適なアライメントにおける、オーバーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）として算出される。
　本発明において、タンパク質に関して「相同性を有する」とは、配列番号2、4、6、8若しくは10に示されるアミノ酸配列と40％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上、また好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することを意味する。
　例えば、マイタケHSP9遺伝子（配列番号1）の相同遺伝子及び相同タンパク質は、エリンギ、ブナシメジ、シイタケ、及びヒラタケにおいて存在することがわかっており（図4及び5）、これらの相同遺伝子の塩基配列及び相同タンパク質のアミノ酸配列は変異を有するものの、同等の機能又は活性を示すことが予想される（後述する実施例3参照）。
　具体的な相同タンパク質としては、例えばマイタケHSP9タンパク質（配列番号2）に対して高い相同性を有する、ブナシメジHSP9タンパク質（配列番号16）、エリンギHSP9タンパク質（配列番号18）、シイタケHSP9タンパク質（配列番号20）又はヒラタケHSP9タンパク質（配列番号22）が挙げられる。また、マイタケcerato-platanin-like protein 1タンパク質（配列番号4）に対して高い相同性を有するブナシメジ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質（配列番号24）、シイタケ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質（配列番号26）、エリンギ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質（配列番号28）又はマツタケ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質（配列番号30）が挙げられる。
　本発明においては、キノコ試料において、上記のマーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを検出する。マーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを検出する手段としては、遺伝子に基づいて設計されたプローブDNA又はプライマーDNA、あるいは遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体が挙げられる。以下、これらの手段について詳述する。
　本発明においては、マーカー遺伝子のDNAの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマーDNA又はプローブDNAを用いて、マーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを検出することができる。具体的には、該プライマーDNA又はプローブDNAは、キノコ試料において発現している遺伝子のmRNA又は該mRNAに対応するcDNAと特異的に結合することができるため、その結合に基づいてキノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現を検出することが可能である。
　プライマーDNA及びプローブDNAは、マーカー遺伝子の塩基配列に基づいて、公知のプログラムにより容易に設計することができる。プライマーとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15～50塩基であり、さらに好ましくは15～30塩基、20～30塩基である。またプローブとして実質的な機能を有するDNAの長さとしては、20塩基以上が好ましく、さらに好ましくは30～60塩基であり、さらに好ましくは50～60塩基である。
　従って、プライマーDNA又はプローブDNAは、例えば、配列番号1、3、5、7若しくは9、又は配列番号15、17、19若しくは21、又は配列番号23、25、27若しくは29に示される塩基配列又はそれに対して相補的な配列の少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも15塩基からなるものとすることができる。本発明において用いることができる具体的なプライマーDNAとしては、例えば限定されるものではないが、HSP9遺伝子（配列番号1）を検出するために配列番号11及び12に示される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
　上述のように設計したプライマーDNA及びプローブDNAは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマーDNA又はプローブDNAには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマーDNA又はプローブDNAにそのような付加配列が付加されたものも本発明において用いることができる。
　キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出するためには、上記プライマーDNA及び／又はプローブDNAをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。
　増幅反応又はハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、キノコ試料からmRNA又は該mRNAに対応するcDNAを調製する。mRNA及びcDNAは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、RNAを抽出する場合には、グアニジン-塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム-フェノール-クロロホルム（AGPC）法などを利用することができる。cDNAは、公知の逆転写酵素を利用して調製することができる。以上のように調製したキノコ試料を用いて、以下に示す増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応を行う。
　1つの方法では、プライマーDNAを用いてmRNA又はcDNAを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現の検出を行うことができる。増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。またRT-PCR法では、まず、mRNAを鋳型として、逆転写酵素反応によりcDNAを作製し、その後、作製したcDNAを鋳型として一対のプライマーを用いてPCR法を行う。なお、増幅手法として競合PCR法やリアルタイムPCR法等の定量的PCR法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。
　上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
　あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、スルホローダミン（SR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
　さらに、増幅産物に結合するサイバーグリーン（例えばSYBR Green I）などの標識体を利用して、標識体と結合した増幅産物を検出することができる。
　標識体を取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
　以上のようにして特異的な増幅反応が検出された場合には、キノコ試料において目的のマーカー遺伝子が発現していることとなる。
　あるいは、上述のように増幅反応を行って得られる増幅産物の配列を決定（シークエンシング）することにより、キノコ試料において目的のマーカー遺伝子が発現していることを確認することも可能である。
　本発明において、キノコ試料中のマーカー遺伝子は、当技術分野で公知の方法により配列決定することができる。そのための実験手法として、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning A Laboratory Mannual (1989) Cold Spring HarborLaboratory Press等に開示される手法を利用することができる。具体的には、例えば、キノコの組織又は菌糸体から抽出・精製した全RNAから、M-MLV Reverse Transcriptase等の逆転写酵素とOligo dTプライマー等を用いてcDNAに変換する。cDNAから、配列番号1、3、5、7若しくは9、又は配列番号15、17、19若しくは21、又は配列番号23、25、27若しくは29のいずれかに示される塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするセンス鎖とアンチセンス鎖プライマーを設計し、これらのプライマーによって挟まれる領域をPCR法によって増幅する。増幅された塩基配列は、サンガー法等の公知の配列決定方法によって決定される。また、全RNAからcDNAを合成し、ライブラリーを作製する。このライブラリーをパイロシークエンシング等の高速シークエンシングによって、網羅的に塩基配列決定してもよい。
　また別の方法では、プローブDNAを用いてキノコ試料に対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、マーカー遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出することもできる。
　ハイブリダイゼーション反応は、プローブDNAがマーカー遺伝子に由来するmRNA又はcDNAのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。
　ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブDNAに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Pなど）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、本発明においては、好ましくは、標識を付加したプローブを用いる。
　標識化プローブDNAを用いた検出は、キノコ試料又はそれから調製したmRNA若しくはcDNAとプローブDNAとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、キノコ試料又はmRNA若しくはcDNAをスライドグラス、メンブラン、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブDNAを添加することにより、あるいは標識化プローブDNAを適当な固相に固定化し、キノコ試料又はmRNA若しくはcDNAを添加することにより、プローブDNAとキノコ試料又はmRNA若しくはcDNAとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブDNA又はキノコ試料等を除去した後、キノコ試料又はmRNA若しくはcDNAとハイブリダイズしているプローブDNAの標識を検出する。標識が検出された場合には、キノコ試料において目的のマーカー遺伝子が発現していることとなる。
　また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブDNAを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。
　別の実施形態において、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを指標としても、キノコ菌糸体の最適栽培期間を判定することができる。例えば、キノコにおいて発現された、検出対象のマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質は、該タンパク質に対する抗体と結合することができるため、そのような抗体を用いてキノコ試料におけるタンパク質との反応を検出することによって、キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを検出することができる。
　マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり、完全な分子、及びFab、F(ab’)2、Fvフラグメント等が含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、該タンパク質又はその断片を発現する真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" JamesW. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。
　抗体を作製するために使用するタンパク質又はその一部断片も、当技術分野で公知の方法、例えば化学合成法及び組換え手法を用いて、作製することができる。
　また抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。そのような標識化抗体に使用する標識としては、酵素、放射性同位体又は蛍光色素を使用することができる。酵素は、代謝回転数が大きいこと、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の酵素イムノアッセイ（EIA）に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース-6-リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。
　酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。
　放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。
　蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。蛍光色素を用いる場合には、蛍光光度計や蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
　抗体を用いてキノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを検出する場合には、キノコ試料中に、検出対象のマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が存在するか否かを試験する。また、キノコ試料としては、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が発現される試料であれば特に限定されるものではなく、キノコの破砕物、抽出物などを対象とすることができる。
　抗体を用いてマーカー遺伝子の発現を検出する方法の1つは、抗体とキノコ試料中のタンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のタンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体にキノコ試料中のタンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋タンパク質結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。また、キノコ試料を電気泳動に供し、分離したタンパク質をメンブレンに転写した後、抗体と反応させる、ウエスタンブロッティングを行うことも可能である。
　また別の方法は、抗体とタンパク質との結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体とキノコ試料とを接触させて標識化抗体とキノコ試料中に含まれるタンパク質を結合させ、この結合体を上記と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。
　液相系の別の方法は、抗体（一次抗体）とキノコ試料とを接触させて一次抗体とキノコ試料中に含まれるタンパク質を結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるために、非標識の二次抗体を先ず抗体＋タンパク質結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。液相からの結合体の分離は上記と同様とすることができる。
　反応後のシグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、タンパク質＋抗体＋標識化抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。
　あるいは、免疫組織化学染色法（例えば免疫染色法）又は免疫電顕法のように、遺伝子発現のin situ検出のために、抗体を組織学的に用いることも可能である。in situ検出は、キノコ試料を切除し（組織のパラフィン包埋切片など）、それに標識した抗体を接触させることにより実施しうる。
　以上のようにして、キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現を検出し、マーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを決定する。続いて、対象のキノコにおけるマーカー遺伝子の発現量及び／又は発現パターンを、参照のマーカー遺伝子発現量及び／又は発現パターンと比較する。参照のマーカー遺伝子発現量及び／又は発現パターンは、培養初期の菌糸体や、培養完了時の菌糸体から得られる。具体的な判定基準は、そのような参照（培養初期）のマーカー遺伝子発現量と比較して、10％以上、好ましくは30％以上変化している場合、あるいは参照のマーカー遺伝子の発現パターンと比較して、異なる発現パターンを示す場合である。
　本発明者らは、後述する実施例に示されるように、マイクロアレイ解析及び定量リアルタイムPCRにより、キノコ栽培工程中のマーカー遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを栽培期間で比較することによって、優良な子実体を得られる栽培期間を決定できることを確認している。
　従って、本発明は、キノコ栽培工程中のマーカー遺伝子を指標として、このマーカー遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンの差異に基づき、優良な子実体を得られる栽培期間を明らかにすることができる。そのため、本発明の方法により、目視判断のような栽培者の経験に頼ることなく、簡便かつ正確に最適栽培期間を決定することが可能となる。
　例えば、培養初期のマーカー遺伝子の発現量（参照）と比較して、キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現が10％以上、好ましくは30％以上増大している場合、あるいは培養完了時のマーカー遺伝子の発現量（参照）と比較して、キノコ試料におけるマーカー遺伝子の発現が同等（すなわち参照の80％～120％程度）であるか又は増大している場合には、菌糸体の培養期間が最適であると判定し、その後の操作、例えば子実体の誘導を行うことができる。このように最適栽培期間を経て子実体の誘導を行うと、優良なキノコ子実体、すなわち期待する収量となる子実体を得ることができる。
　従って、本発明は、キノコの製造方法も提供するものであり、具体的には、キノコ試料において少なくとも1種のマーカー遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを取得し、該発現量及び／又は発現パターンに基づいて該キノコ試料の栽培期間が最適であるかを判定し、該キノコ試料から子実体を誘導する工程を含む。
　また本発明は、マーカー遺伝子又は該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又は発現パターンを検出するための手段を含むことを特徴とするキノコの栽培期間決定用キットに関する。このようなキットには、マーカー遺伝子の発現を検出するための手段（プライマーDNA、プローブDNA、抗体など）のほか、遺伝子発現を検出するために使用される、当技術分野で公知の各種成分（例えばバッファー、サンプル処理用試薬、標識化抗体など）が含まれてもよい。
　本発明のキットを用いることによって、上述したキノコの栽培期間決定方法及びキノコの製造方法を容易かつ簡便に行うことができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明する。この実施例の記載により、本発明の範囲が限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
［実施例１］定量PCRによる分子マーカーの発現パターンの確認
　マイタケ栽培において、子実体を作らせるために菌糸体を増やす培養期間（以下、「菌糸体培養期間」という）がある。本実施例では、種菌を接種してから培養20日目、30日目、40日目、50日目、60日目及び70日目から菌糸体を得て、ただちに液体窒素で凍結した。
　凍結した菌糸体を液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて摩砕して、これを出発材料として、RNeasy Plant Mini kit（Qiagen）を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAはNano Drop（Thermo）と2100 Bioanalyzer（Agilent）を用いて濃度及び純度を検定した。cDNAインハウスデータベースを用いて、マイタケHSP9遺伝子の塩基配列を得た（配列番号1）。次いで特異的なPCRプライマーをコンピューターソフトウェアPrimer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）を用いて設計した。設計したプライマー配列を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　抽出した全RNAからTURBO DNA-freeTM Kit（ABI）を用いて混入するゲノムDNAを除去した後、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）を用いてcDNAを合成した。リアルタイム定量PCRはTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を用いて、Chromo 4（Bio-Rad）にてPCR反応を行った。リアルタイム定量PCRは、95℃で1分間の初期熱変性の後、95℃で15秒間、60℃で30秒間、蛍光検出の条件を1サイクルとして40サイクルを行った。
　遺伝子の発現量は、いずれのステージにおいても一定量構成的に発現しているGAPDH遺伝子の発現量で補正した。GAPDH遺伝子を増幅するプライマー配列として、caaccttgac gaatacgact c（配列番号13）及びcctcgacgat accgaagttg（配列番号14）を用いた。発現量の相対比率はΔΔCt法（Livak KJ, and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR andthe 2ΔΔCT method. Methods 2001, 25(4):402-8）を用いて算出した。
　その結果を図1に示す。図1で示される線グラフは、菌糸体培養期間に応じたHSP9遺伝子の発現パターン（培養20日を1としたときの相対発現差）を示す。この結果から、菌糸体培養期間に応じてHSP9遺伝子の発現量が変化することがわかる。
［実施例２］異なる培養期間における子実体発生への影響
　培養20日目、30日目、40日目、50日目、60日目、70日目でそれぞれ菌糸体の培養を止め、子実体の発生を行った。その結果、図2に示すように、20日目及び30日目では子実体の発生は著しく悪く、40日目及び50日目で良好ではなく、60日目及び70日目で良好となった。そのときの子実体の収率（％）を最大培養日数69日目のときの収量（重量）を100％として図3にグラフとして示す。
　以上の実施例1及び実施例2の結果から、菌糸体培養期間中にHSP9の発現が最大値となった以降をマイタケの最適な培養期間とすることができる。HSP9の発現量が最大となったときの収率は、培養初期と比較しておおよそ460％増大となる。このHSP9遺伝子の培養中の発現量及び／又は発現パターンと子実体の表現型とが強く相関しており、従って、HSP9遺伝子は良好な子実体を得ることができる培養期間（すなわち栽培期間）の決定を目的とする分子マーカーとして好適である。
［実施例３］エリンギ及びブナシメジHSP9遺伝子での定量PCRによる確認
　実施例1に記載した方法と同様にして、エリンギ及びブナシメジHSP9遺伝子を全栽培工程で発現パターンを取得した。
　その結果を図4A～Cに示す。図4AはマイタケHSP9遺伝子の栽培工程全体での発現量変化を示すグラフ、図4BはエリンギHSP9遺伝子の栽培工程全体での発現量変化を示すグラフ、図4CはブナシメジHSP9の栽培工程全体での発現量変化を示すグラフである。なお、グラフは、培養前期における発現を1としたときの各培養時期における相対発現差を表す。マイタケHSP9遺伝子は、培養（栽培）時間の経過と共に発現量が急増する。エリンギ及びブナシメジのHSP9遺伝子についてもマイタケと同様の発現パターンを示した。これらの結果から、いずれの種のHSP9遺伝子についても同じ発現量変化を起こすことが判明した。
　HSP9遺伝子は、様々なキノコ種において存在することがわかっており、HSP9遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をフリーソフトウェアClustalWでアライメントし、BOXSHADEで配列整形した結果を図5に示す。図5において、G.frondosaはマイタケ由来、H.marmoreusはブナシメジ由来、P.eryngiiはエリンギ由来、L.edodesはシイタケ由来、P.ostreatusはヒラタケ由来の遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
　よって、この分子マーカー及びその相同遺伝子はどのようなキノコ種であっても同様の機能を持つと考えられ、実施例1及び実施例2で示した良好な子実体を得ることができる栽培期間の決定を目的とする分子マーカーとして好適である。従って、遺伝子発現量又はその発現パターンを指標とした良好な子実体を得ることができる本発明の栽培期間決定方法を利用することにより、最適な栽培期間を決定することができる。
［実施例４］マイクロアレイによる分子マーカーの発現パターンの確認
　マイタケ栽培において、子実体の原基を作らせる期間（以下、「原基誘導期間」という）がある。原基誘導期間に原基を作らせた後に子実体を発生させる（子実体誘導）。原基誘導期間の1日目、3日目及び6日目から原基を得て、直ちに液体窒素で凍結した。
　凍結した菌糸体を液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて摩砕して、これを出発材料として、RNeasy Plant Mini kit（Qiagen）を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAはNano Drop（Thermo）と2100 Bioanalyzer（Agilent）を用いて濃度及び純度を検定した。検定された全RNAを用いてマイクロアレイによって発現量の測定を行った。
　その結果を図6A～Dに示す。図6A～Dにおいて、黒丸で示される線グラフはそれぞれcerato-platanin-like protein 1～4遺伝子の発現量変化を示す。この結果から、マイタケが保有するcerato-platanin-like protein遺伝子が4種類とも同じ発現量変化を起こすことが判明した。また、この4種の遺伝子は子実体発生操作の前に最大発現量を示すことが判明した。なお、cerato-platanin-like protein 1～4遺伝子は相同遺伝子であり、これらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のアライメントを図7に示す。
　よって、この分子マーカーは子実体発生操作を行う時期の決定を目的とする分子マーカーとして好適である。従って、遺伝子発現量又はその発現パターンを指標とした良好な子実体を得ることができる本発明の栽培期間決定方法を利用することにより、最適な栽培期間を決定することができる。
［実施例５］
　マイタケcerato-platanin-like protein 1遺伝子について、その相同遺伝子をブナシメジ（Hm）、シイタケ（Le）、エリンギ（Pe）及びマツタケ（Tm）で検索した。
　その結果を図8に示す。図8の結果からいずれの菌種におけるcerato-platanin-like protein 1も相同性が高いことが判明した。
　よって、この分子マーカー及びその相同遺伝子はどのようなキノコ種であっても同様の機能を持つと考えられ、実施例4で示した良好な子実体を得ることができる栽培期間の決定を目的とする分子マーカーとして好適である。従って、遺伝子発現量又はその発現パターンを指標とした良好な子実体を得ることができる本発明の栽培期間判定方法を利用することにより、最適な栽培期間を決定することができる。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
配列情報
>マイタケHSP9遺伝子
ATGGCTGACGCTGGCAGACAATCCTTCACCGACAAGATGTCCTCCTCCATGAAGCCCGACACCCAGAAGTCGATGACCGAGTCCATGGGCGACAAGATGAAGGGGATGGGCGACAGCGTGGCGTCCACCCTCCAGCCTGAGAGCCAGAAGTCCACCACCCAGCAGGTTGGTGATTCGATGAGCGGCAACTCGAACGAGAACCAGGACTCGATGATGAACAAGATGAAGAACGCTGTCGGCATGGGCGACAAC（配列番号1）

>マイタケHSP9タンパク質
MADAGRQSFTDKMSSSMKPDTQKSMTESMGDKMKGMGDSVASTLQPESQKSTTQQVGDSMSGNSNENQDSMMNKMKNAVGMGDN（配列番号2）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子
ATGAGATTTTTCGCCGTCCTCGCTTCCTTGCTGTGTGCCGCGCCCGCCGTGTTCAGCGCGCCAACCGCGGCGCTCAGCGCGCGGAGCGCGGTGCAGACGTTGCAAGTGACGTACGACCAGACGTACGACGTGGCGTCGAACTCGCTGGACATCGTCGCGTGCTCTAACGGCGTGAACGGGCTCCTCGCCAAGGGATTCACGACTTTCGGGTCGCTCCCCGACTTCCCATTCATCGGCGGTGCACAGGCCGTCGAAGGCTGGAATTCGCCGAACTGCGGCACCTGCTGGCAGCTGCAGTACGGGAACACGACGATCAATGTGCTGGCGATCGACCATGCCGGATCGGGCTTCAACATTGGGCTCGATGCGATGAACAAGCTCACGAACAACCAGGCCGTGGACCTAGGCGTCGTGGAGGTCGTCTCCGTGCGGACCGCTGAGTCAGTGTGCGGGCTGCATTGA（配列番号3）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質
MRFFAVLASLLCAAPAVFSAPTAALSARSAVQTLQVTYDQTYDVASNSLDIVACSNGVNGLLAKGFTTFGSLPDFPFIGGAQAVEGWNSPNCGTCWQLQYGNTTINVLAIDHAGSGFNIGLDAMNKLTNNQAVDLGVVEVVSVRTAESVCGLH（配列番号4）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 2 遺伝子
ATGAGATTTTTCGCCGTCCTCGCTTCCTTGCTGTGTGCCGCGCCCGCCGTGCTCAGCGCGCCGACTGCGGCATCGACGGTGCAGGTGACGTACGACCAGACGTACGACGTGGCTTCGAACTCGTTGGCCATCGTCGCGTGCTCTAACGGCGCGAACGGGCTCCTCACCAAGGGTGCGTGCGCTCTACAAGTTTCCTGACCCCGTTCATTGCTGACGCGCACGCCGTAACGCAGGATTCACTACCTTCGGGTCGCTCCCCGACTTCCCGTTCATCGGCGGTGCACAGGCCGTCGCAGGTATGCCGAAACCGAAGCCGCCACGCGCACGCACACACGCTGACGCCACtTTTTTTTTGTAGGCTGGAACTCGCCGAACTGCGGCACCTGCTGGCAGCTGCAGTACGGGAACACGACGATCAATGTGTTGGCGGTCGACCATGCCGGATCGGGCTTCAACATTGGGCTCGATGCGATGAACAAGCTCACGAACAACCACGCCGTGGAGCTGGGCGTCGTGCAGGTCGCCTCCAAGCAGGTCGCTGCGTCGGTGTGCGGGCTGTGA（配列番号5）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 2 タンパク質
MRFFAVLASLLCAAPAVLSAPTAASTVQVTYDQTYDVASNSLAIVACSNGANGLLTKGFTTFGSLPDFPFIGGAQAVAGWNSPNCGTCWQLQYGNTTINVLAVDHAGSGFNIGLDAMNKLTNNHAVELGVVQVASKQVAASVCGL（配列番号6）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 3 遺伝子
ATGCAGTTCAAGACGCTTCTTTTTTCCACCGTCGCCCTCTTCCTCTCCACCGCATTCGCTCAAACTACTGTCAGCGTCTCCTACGATCAAACATACGACACCGCCTCCACGTCCCTCGCCGAAGTTGCTTGCTCCGACGGCCCTAACGGGCTGCTTTCCAAGGGCTTCACGACTTTCGGGTCTCTCCCGGACTTCCCGTTCATCGGCGGTGCCCAAGCCGTTGCGGGATTCGACTCCCCGAACTGTGGGACATGCTGGACGTTGAGCTTCAACGGCAATAGCATCCACGTGCTCGCGATCGACACAACTGCAAACGGGTTCAACATTGCATTGGAAGCGATGAATGTGTTGACGGACAACCAGGGGGTGTTCTTGGGCAGGGTGAATGCCACGGCAGAGCAGACTACTGCTGCGACGTGTGGGCTCTGACCGGTAGTGCCTATCTATTCTCCTGCATAAAGTGTCTCACTGATGTCGCTGTGTGATTGTAGATGTTCCCTTCGTTCACTCGCACGGGGGCGGTTTAACGGTAGAGGCATGTTGTCAGGACTTTTCACGACTGGACCTTGGCAATGTTGTGCTGCGTCATCGCATACGGACTTTAATGATGAACGTCTGGACTAG（配列番号7）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 3 タンパク質
MQFKTLLFSTVALFLSTAFAQTTVSVSYDQTYDTASTSLAEVACSDGPNGLLSKGFTTFGSLPDFPFIGGAQAVAGFDSPNCGTCWTLSFNGNSIHVLAIDTTANGFNIALEAMNSRLLLRRVGSDRCSLRSLARGRFNGRGMLSGLFTTGPWQCCAASSHTDFNDERLD（配列番号8）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 4 遺伝子
ATGCAGTTCAAGGCTCTTCTCTTCTCCACCATCG
CCCTCTTCCTCCCCGCCGCATTCGCCCAAGTTATACCCGTCAGCGTATCCTACGATCAAGTATATGACGTCGCCTCTACGCCTCTCACCGAAGTTGCTTGCTCCAACGGCCCTAACGGCATGCTCTCCAAGGGCTACACGACTTTCGGGACTCTCCCGATCTTCCCGTGGATTGGCGGTGCTCAGGCAATTACGGGATGGGACTCCCCGGAGTGTGGGTCGTGCTGGACGTTGCGCTACGAAGGCAACAGCATAGACATCCTCGCGATCGACTACACTGCAAACGGGTTCAACATCGCATTGTCGGCGATGAATCTGTTGACGAACAACCAGGCCGTGtTCTTAGGCAGGGTGAATGCCACGGCGGAGCAGGTCGATGCCACTAATTGTGGAATCGGACTTTGA（配列番号9）

>マイタケ cerato-platanin-like protein 4 タンパク質
MQFKALLFSTIALFLPAAFAQVIPVSVSYDQVYDVASTPLTEVACSNGPNGMLSKGYTTFGTLPIFPWIGGAQAITGWDSPECGSCWTLRYEGNSIDILAIDYTANGFNIALSAMNLLTNNQAVFLGRVNATAEQVDATNCGIGL（配列番号10）

>ブナシメジHSP9遺伝子
ATGTCCGACACTGGCCGTCAATCTTTCACCGACAAAGCTGGCTCTGCTTTGAAGCCCGACTCTCAGAAGACTACCGTTGAACAAGCTGGTGACTACGTCAAGGGCACAGCGGATTCTGCCGCCTCGACTCTTACGCCTAGCAGCGAAAAGTCCACAAGCCAGAAGGCTGGTGACACCGTGAGCGGTAGCCAGACCGAGGAATCTCTTCTTGACAAAGCGAAGCACGCCGTCGGCATGGGCAAGTAA（配列番号15）

>ブナシメジHSP9タンパク質
MSDTGRQSFTDKAGSALKPDSQKTTVEQAGDYVKGTADSAASTLTPSSEKSTSQKAGDTVSGSQTEESLLDKAKHAVGMGK（配列番号16）

>エリンギHSP9遺伝子
ATGTCTGACGCCGGACGCCAATCTTTCACCGACAAGGCTGGCGCTGCCATGAAGCCCGACTCGCAGAAGACCACCACCGAGTCCATGGGAGACTCTATCAAGGGCACGGCCGACTCCATCGCTTCCACCATGCAACCCAACAGCGAGAAATCGGCGGCCAGCGCATGGGTGACGCCGTGA（配列番号17）

>エリンギHSP9タンパク質
MSDAGRQSFTDKAGAAMKPDSQKTTTESMGDSIKGTADSIASTMQPNSEKSAASAWVTP（配列番号18）

>シイタケHSP9遺伝子
ATGTCTGACACTGGCCGCCAAAACTTCACTAACAAGGCTGCTGATGCTTTGAAGCCCGAGTCTGAAAAATCTACTTTCGAAAGTCTGGGCGACTCAGCTAAATCCACCGGTGACTCACTAGCTTCGACCCTTCAGCCAGAGAGCCAGAAATCTACTACTCAAAAGGCCGGTGACGCCTTGAGCTCCAACTCGAACGGAACGAAGNCTCGTTGTTGA（配列番号19）

>シイタケHSP9タンパク質
MSDTGRQNFTNKAADALKPESEKSTFESLGDSAKSTGDSLASTLQPESQKSTTQKAGDALSSNSNGTKXRC（配列番号20）

>ヒラタケHSP9遺伝子
ATGTCTGACGCAGGACGCCAATCTTTCACCGACAAAGCTGGCGCTGCCATGAAGCCCGACTCGCAGAAGACCACAACCGAGTCCATGGGTGACTCCATGAAGGGCATGGCCGACTCCGTCGCGTCTACCATGCAACCCAACAGCGAGAAATCAGGCGGTCAACGTATGGGCGACGCCATGAGCGGCAACTCTAACCACAATGATGTGCGTTGA（配列番号21） 

>ヒラタケHSP9タンパク質
MSDAGRQSFTDKAGAAMKPDSQKTTTESMGDSMKGMADSVASTMQPNSEKSGGQRMGDAMSGNSNHNDVR（配列番号22）

>ブナシメジ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子
ATGAAGTTCTCCGCTTTACTTGCTCCCTTCGCCCTCTTCTCATCCGTCGCTCTGGCCGTGACCACCGCATACGACCCAGTCTATGATAACCCCAACGGCTCTATGGCCAGCGTCGCATGCTCAAATGGAGCCAACGGCCTCATCACTCGTGGCTACAACACCTTCGGTGCCCTCAGTAACTTCCCAAACATCGGAGGCGCCCAGGCCGTTACGGGCTGGAATTCGCCTAACTGCGGGACATGTTGGGAACTCACGTACACCAATTCGACGGGGGTCAAGAAGACCATCAATATAGTCGCACTTGACGTTTCCACGAATGGATTCGTGCTTTCGCTGAAGGCAATGAACACGCTTACGAATAACAATGCTGTTCAATTCGGGCGTGTCGACGTAGCATCGAGGAAAGTTGCTGCGTCAGTTTGTGGGCTGTGA（配列番号23）

>ブナシメジ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質
MKFSALLAPFALFSSVALAVTTAYDPVYDNPNGSMASVACSNGANGLITRGYNTFGALSNFPNIGGAQAVTGWNSPNCGTCWELTYTNSTGVKKTINIVALDVSTNGFVLSLKAMNTLTNNNAVQFGRVDVASRKVAASVCGL（配列番号24）

>シイタケ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子
ATGAAATTCTTCTCCCTCTTTGTCCCAGCTATTGTCGCTGCCTTCGTTGCCGCTGACACCCTCCAGTACGACCCCATCTACGACCAAGGAAGCGAGTCATTGGATGTCGTTGCCTGCTCCGATGGTGCCAATGGTCTTCTGACCAAAGGATTTACCACATTCAACTCACTCCCCACTTTCCCCAACATTGGCGCTTTTGGTGCCGTGACTGGATGGAATTCCCCCGAATGTGGCACATGCTGGCAAATCGTCTACACCAATTCGAACGGGGCTCAAACTACATTAAATGCTATTGCTGTTGATCATGCCGGTGCTGGCTTGATTAACCTTTCTGAGGAGGCCATGAATACTTTAACGAATGGAAATGCGGTTCAGTTCGGTGCTGTACCGGTGACTGCCACACAAGTGGCTAGTTCTGTGTGTGGTTTGTGA（配列番号25）

>シイタケ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質
MKFFSLFVPAIVAAFVAADTLQYDPIYDQGSESLDVVACSDGANGLLTKGFTTFNSLPTFPNIGAFGAVTGWNSPECGTCWQIVYTNSNGAQTTLNAIAVDHAGAGLINLSEEAMNTLTNGNAVQFGAVPVTATQVASSVCGL（配列番号26）

>エリンギ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子
ATGATGATGTTCTTCTTCGCTGCCCTTGCCGCCCTCGCCGCGCCAGCTCTCTCCGTCTCGGTCACGTACGACCAGACGTACGACAACCGCCAAGGCTCCCTCTCCACCGTCGCGTGCTCCAACGGCATAAACGGCCTCCTCACGCGCGGCTACAGGACCTTCGGCGACCTCCCCACCTTCCCTAATATCGGTGGTGCTTCGGCCGTCACAGGCTGGAACTCCCCGAACTGCGGCACCTGCTGGGAGCTCACGTTCACCGACGAGAACAACGGGAAGAGGAGGGTCAATGTGCTGGCAGTTGACTATGCTGCGAACGGATTCAATATCGGGTTGACGGCGATGAACCAGCTGACGAATGGGCATGGCGTTGAATACGGTGTTGTGGATGTGGATGCCAAGCAAGTCGCTGCAACAGTTTGCGGAATGCCCGCGAAGTAA（配列番号27）

>エリンギ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質
MMMFFFAALAALAAPALSVSVTYDQTYDNRQGSLSTVACSNGINGLLTRGYRTFGDLPTFPNIGGASAVTGWNSPNCGTCWELTFTDENNGKRRVNVLAVDYAANGFNIGLTAMNQLTNGHGVEYGVVDVDAKQVAATVCGMPAK（配列番号28）

>マツタケ cerato-platanin-like protein 1 遺伝子
ATGAAGTTCTCTGCTCTTTTCGCtCCCCTCGCTCTCGCCTTGCTAGGCCCATACACAaCCCTCGCCGACGaGGTATCCTATGATaCCGCATACGATAACAGTGCAGCGTCGCTTTCCACTGTGGCCTGCTCCGACGGAGCTAACGGACTCATCACTCGTGGCTTCACAACTTTCGGCTCTCTCCCGGGTTTCCCAcACATTGGAGGAGCcGCTGCtATTGCTGGGTGGAATTCACCAAGCTGtGGCACATGCTGGGCACTCACATACACAAATATGACCATCAATGTTTTAGCGATTGACGTTGCGAAaTATGGCTTCAATATCGCCcTGTCGGCAATGAATCACCTTACGAATGGAAATGCAGTACAATATGGGAGGATAAATGTGACGTCAACCAGTGTAGCTCCGTCGGTTTGTGGGCTTTAA（配列番号29）

>マツタケ cerato-platanin-like protein 1 タンパク質
MKFSALFAPLALALLGPYTTLADEVSYDTAYDNSAASLSTVACSDGANGLITRGFTTFGSLPGFPHIGGAAAIAGWNSPSCGTCWALTYTNMTINVLAIDVAKYGFNIALSAMNHLTNGNAVQYGRINVTSTSVAPSVCGL（配列番号30）
　配列番号19：核酸（n＝A, T, G, C）
　配列番号11～14：人工配列（プライマー）

Claims (10)

  1. 　遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標としてキノコの最適な栽培期間を決定する方法。
  2. 　HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを指標とすることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 　キノコの栽培期間が、菌糸体の培養期間、原基形成、又は子実体の生育期間であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
  4. 　遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又はシークエンシングによって検出することを特徴とする請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを、該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンにより検出することを特徴とする請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　タンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを、該タンパク質に対する抗体を用いた、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ又はサンドイッチイムノアッセイによって検出することを特徴とする請求項5に記載の方法。
  7. 　キノコが、マイタケ、エリンギ、ブナシメジ、シイタケ、ホンシメジ、ハタケシメジ、エノキタケ、ナメコ、ツクリタケ、ヒラタケ及びマツタケを含む食用キノコより選択されることを特徴とする請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 　キノコ試料において、HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを取得し、該発現量及び／又は発現パターンに基づいて該キノコ試料の栽培期間が最適であるかを判定し、該キノコ試料から子実体を誘導することを特徴とするキノコの製造方法。
  9. 　HSP9遺伝子、cerato-platanin様タンパク質1遺伝子、cerato-platanin様タンパク質2遺伝子、cerato-platanin様タンパク質3遺伝子及びcerato-platanin様タンパク質4遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子又は該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現量及び／又はその発現パターンを検出するための手段を含むことを特徴とするキノコの栽培期間決定用キット。
  10. 　遺伝子の発現量及び／又はその発現パターンを検出するための手段がプライマー又はプローブであることを特徴とする請求項9に記載のキット。
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