CN110437325A - 转录因子lfc1对金针菇子实体发育的调控以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，本发明公开了一种参与调控金针菇子实体发育的转录因子LFC1及其编码基因与应用。所述的转录因子LFC1编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述的转录因子LFC1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明通过在金针菇中对lfc1进行过表达和RNAi实验发现，lfc1是金针菇子实体发育的重要负向调控因子，影响金针菇原基产生、菌柄长度和菌盖形态。lfc1敲低表达一方面促进金针菇菌柄增长，增加金针菇的商品价值，另一方面缩短出菇周期，降低能耗，减少生产成本。而lfc1高表达导致金针菇子实体畸形。因此，金针菇菌株中lfc1特定的表达量是金针菇子实体发育的重要因素，可将lfc1运用到金针菇优良菌种的选育中，便于筛选长菌柄小伞盖的金针菇。

Description

转录因子LFC1对金针菇子实体发育的调控以及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。
背景技术
金针菇(Flammulina velutipes)又名冬菇、朴菇、毛柄金钱菇等(于荣利,秦旭升et al.2004)，是我国一种传统的栽培食用菌。金针菇子实体菌柄细长脆爽、菌盖滑嫩，同时具有丰富的营养和美味的口感，是重要的商品化食用菌之一，在全世界尤其是亚洲国家广泛栽培(Chang and Buswell 1996)。金针菇的干重中蛋白质占31.2％，脂肪占5.8％，是较好的高蛋白、低脂食品。此外，金针菇还含有丰富的维生素B1、B2、B3、C、D、E，不饱和脂肪酸和18种氨基酸等(周萍2014,孙传博,姜明et al.2015)。金针菇作为一种经济型食用菌，不仅具有丰富的营养价值，而且具有重要的药用价值。比如在金针菇的提取物中发现多酚类化合物具有抗动粥样硬化的效果(Rahman,Abdullah et al.2015)，溶栓酶FVP-I(fibrinolytic enzyme)能够抑制血栓形成(Park,Li et al.2007)，Lovastatin、γ-氨基丁酸具有降血压的功能(Chen,Ho et al.2012)，胞内多糖IPS(Intracellularpolysaccharides)具有抗氧化活性(Nguyen,Nagasaka et al.2012,Ma,Zhang etal.2015)，FIP-fve(Fungal immunomodulatory protein)具有调节免疫力的功效(Chang,Hsiao et al.2013)。
金针菇美味的口感和丰富的营养价值使其成为重要的工厂化食用菌，而对于工厂化生产中，金针菇的品质和生产的能耗是两个决定收益的关键因素。工厂化金针菇对子实体的品质有较高的要求，具体包括菇体整齐，菇柄细密，菇体色泽偏白，菌盖较小，其中菌柄和菌盖的性状决定着金针菇的经济性状，是金针菇优良菌株筛选中的重要考核因素。除了经济性状之外，在金针菇优良菌株的筛选中，生产成本也是一个重要考核因素。金针菇又名冬菇，属低温型食用菌。金针菇菌丝生长和子实体生长都需要在低温下进行，菌丝生长最适温度为20～25℃，子实体生长温度为8～12℃，较大的昼夜温差能够刺激金针菇子实体原基的发生(贾建益and侯艳丽1999)。金针菇这种低温的生长条件造成工厂化栽培中较大的能耗成本，因此降低能耗，节约成本也是筛选金针菇优良菌株的一个突破口。
目前应用于金针菇优良菌种选育的方式主要包括自然选育、杂交育种、诱变育种和基因工程育种，比如彭洪光等人通过人工驯化得到抗霉能力强的“西师8001”(彭洪光,蒋跃清et al.1987)，刘新锐等人通过不同亲本交配得到的早熟金针菇“农金六号”(刘新锐,谢宝贵et al.2014)，杨茹等人利用常压室温等离子体选育出抗病性强的白色金针菇菌株(杨茹,王范et al.2017)。以上三种育种方法虽然能选育出性状优良的菌株，但是耗费人工和时间，而且筛选较为盲目。而基因工程育种是一种目标明确且周期较短的菌种选育方法。此方法基于对调控子实体发育基因的深入理解，对参与子实体发育的重要基因或者发挥特殊功能的基因进行定点的编辑，以期得到抗病虫害、增产或者分泌特殊产物的菌株。随着对金针菇子实体发育分子机制的逐步深入理解，具体包括疏水蛋白编码基因Fv-hyd1(Yamada,Sakuraba et al.2005,龙莹,陈仁良et al.2016)、组氨酸激酶基因(李琼洁2016)、腺苷脱氨酶编码基因Fv-ada(Sekiya,Yamada et al.2013)、苯丙氨酸氨裂解酶编码基因Fvpal(Yun,Koo et al.2015)以及金针菇交配型基因(Wang,Lian et al.2016)、漆酶编码基因(Wang,Liu et al.2015)等，基因工程育种也会在金针菇优良菌株的选育中得到更广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供lfc1基因及该基因在金针菇选育中的应用。
本发明首先公开了一个新的金针菇转录因子LFC1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其次，本发明公开的转录因子LFC1，其在如下任一中的应用：
(1)调控金针菇子实体发育周期；
(2)调控金针菇菌盖发育；
(3)调控金针菇菌柄发育；
(4)选育金针菇优良菌株。
第三，本发明公开一种干扰RNA的制备方法，包括：
(1)用引物Pgpd-lfc1OE-F和Pgpd-lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-lfc1RNAi)，靶序列为920bp；
(2)用引物lfc1RNAiA-Pgpd-F和lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiA片段，靶序列为206bp；
(3)用引物TtrpC-lfc1RNAiA-F和TtrpC-lfc1OE-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-lfc1RNAi)，靶序列为720bp；
(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物；
(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-lfc1RNAi，lfc1RNAiA和TtrpC-lfc1RNAi片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，得到质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA；
(6)用引物lfc1RNAiB-F和lfc1RNAiB-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiB片段，靶序列为255bp；
(7)用限制性内切酶AflII同时对质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA和lfc1RNAiB片段进行酶切并回收后，用T4Ligase对这两个片段连接过夜；
(8)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，得到最终质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAi。
第四，本发明公开一种筛选产量高、出菇周期短的金针菇菌株的方法，包括：
(1)测定待测金针菇菌株的转录因子LFC1编码基因lfc1的表达量；
(2)所述的表达量低于现有金针菇菌株的表达量，为产量高、出菇周期短的金针菇菌株。
第五，本发明公开一种筛除畸形金针菇菌株的方法，包括：
(1)测定待测金针菇菌株的转录因子LFC1编码基因lfc1的表达量；
(2)所述的表达量高于现有金针菇菌株的表达量，为畸形金针菇菌株。
本发明所提供的转录因子LFC1，敲低表达lfc1能够促进金针菇菌柄增长，增加金针菇商品价值，同时缩短金针菇出菇周期，减少能耗，降低生产成本；同时，高表达lfc1会导致金针菇菌盖畸形化，可将lfc1基因作为筛除畸形菇菌株的分子指标。
附图说明
图1是转录因子LFC1的结构图。
图2是lfc1在出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株中转录水平分析结果图。
图3是金针菇出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株在CYM平板上的菌丝生长结果图。
图4是出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株出菇情况图。
图5是出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株的菌盖差异图。
图6是出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株出菇的生物量统计结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施条例中，用到如下培养基和溶液：
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏，1％NaCl，加适量蒸馏水溶解，pH7.0，定容，高压蒸汽灭菌。
CYM培养基：1％麦芽糖，2％葡萄糖，0.2％胰蛋白胨，0.2％酵母提取物，加适量蒸馏水溶解，自然pH定容，高压蒸汽灭菌。
出菇栽培料培养基：30％木屑，43.5％棉籽壳，25％麸皮，1％轻质碳酸钙，0.5％石灰，60％水，加水后充分混匀并浸润4～5个小时后，分装到容积为350ml的组培瓶中，每瓶装150±5g栽培料，高压蒸气灭菌3个小时。
农杆菌转化诱导培养基(IM)：2.05g K2HPO4，0.15g NaCl，0.5g MgSO4·7H2O，0.067g CaCl2·2H2O，0.0025g FeSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4，1.8g葡萄糖，5ml甘油，8.53g2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid(pH5.3，过滤除菌),200μM乙酰丁香酮(过滤除菌，铺平板时加入)。
2×CTAB buffer:2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4MNaCl，1％PVP(polyvinyl pyrrolidone)。
Soil DNA extraction buffer(SDEB)：100mM NaCl，50mM EDTA，0.25M Tris-HCl，5％SDS。
实施例1
lfc1核苷酸序列和氨基酸序列分析
一、lfc1核苷酸序列分析
将lfc1基因上游和下游序列各延伸2000bp作为参考序列，用Zillions of OligosMapped(ZOOM)软件将转录组的reads定位到参考序列上。
分析得出lfc1基因从起始密码子到终止密码子全长为1172bp，包含6个内含子，大小分别为53bp、54bp、55bp、48bp、52bp和64bp。
序列如SEQ ID NO.1所示。
二、lfc1氨基酸序列分析
用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对LFC1的氨基酸序列进行分析，结果显示蛋白LFC1编码一个具有GAL4-like Zn(II)2Cys6结构域的蛋白，结构如图1所示，并用软件DNAMAN分析分子量为31802.0Da，等电点为9.32。
序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株的构建。
本发明所用的pBHg-BCA1质粒是可用于农杆菌转化的双元表达载体，所用大肠杆菌为DH5α菌株。
一、lfc1过表达载体的构建
(1)用引物Pgpd-lfc1OE-F和Pgpd-lfc1OE-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-lfc1OE)，该gpd启动子包含gpd基因第一个内含子和外显子，靶序列为920bp。
引物序列如下：Pgpd-lfc1OE-F:5’-CAGATCCCCCGAATTAGTCGTGGGTCCAGCATTTTG-3’；
Pgpd-lfc1OE-R:5’-ACTACGACATGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGA-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，65℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(2)用引物lfc1OE-Pgpd-F和lfc1OE-TtrpC-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1OE片段，靶序列为1322bp。
引物序列如下：lfc1OE-Pgpd-F:5’-TTTACAGGTCATGTCGTAGTTAGTCCGATATCTCCC-3’；
lfc1OE-TtrpC-R:5’-AAGTGGATCCTGAGATGTCTATGATCTAGACGGCG-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，66℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(3)用引物TtrpC-lfc1OE-F和TtrpC-lfc1OE-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-lfc1OE)，靶序列为720bp。
引物序列如下：TtrpC-lfc1OE-F:5’-ACATCTCATGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCAT-3’；
TtrpC-lfc1OE-R:5’-AATTAACGCCGAATTTTACCTCTAAACAAGTGTACCTGTGCAT-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，66℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。
(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-lfc1OE，lfc1OE和TtrpC-lfc1OE片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列为1535bp，得到最终质粒pBHg-BCA1-lfc1OE。
引物序列如下：Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃90sec，72℃90sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
二、lfc1敲低表达载体的构建
(1)用引物Pgpd-lfc1OE-F和Pgpd-lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-lfc1RNAi)，靶序列为920bp。
引物序列如下：Pgpd-lfc1OE-F:5’-CAGATCCCCCGAATTATTCGAGCTCGGTACAGTCGTG-3’；
Pgpd-lfc1RNAiA-R:5’-GACGTAACATGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGA-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，65℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(2)用引物lfc1RNAiA-Pgpd-F和lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiA片段，靶序列为206bp。
引物序列如下：lfc1RNAiA-Pgpd-F:5’-TTTACAGGTCATGTTACGTCGTGCAGAAGGAGG-3’；lfc1RNAiA-R:5’-GGATCCCTTAAGTGTACATGGCCAGATGCGTC-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，68℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(3)用引物TtrpC-lfc1RNAiA-F和TtrpC-lfc1OE-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-lfc1RNAi)，靶序列为720bp。
引物序列如下：TtrpC-lfc1RNAiA-F:5’-TGTACAGTTAAGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCAT-3’；
TtrpC-lfc1OE-R:5’-AATTAACGCCGAATTTTACCTCTAAACAAGTGTACCTGTGCAT-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，66℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。
(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-lfc1RNAi，lfc1RNAiA和TtrpC-lfc1RNAi片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列为419bp，得到最终质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA。
引物序列如下：Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(6)用引物lfc1RNAiB-F和lfc1RNAiB-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiB片段，靶序列为255bp。
引物序列如下：lfc1RNAiB-F:5’-ACTTAAGGTCCGGTCACATTCACGTCTTAG-3’；lfc1RNAiB-R:5’-ACTTAAGATGTTACGTCGTGCAGAAGGAGG-3’。
PCR反应程序为：98℃30sec；98℃10sec，68℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
(7)用限制性内切酶AflII同时对质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA和lfc1RNAiB片段进行酶切并回收后，用T4Ligase对这两个片段连接过夜。
(8)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列为674bp，得到最终质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAi。
引物序列如下：Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃90sec，72℃90sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
三、质粒pBHg-BCA1-lfc1OE和质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAi转化农杆菌
本发明中所用农杆菌感受态为AGL-1菌株感受态(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC302-01)。
(1)取两管50μl AGL-1感受态细胞，分别加入1μg质粒pBHg-BCA1-lfc1OE和质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAi，用移液枪轻轻的吹吸混匀，冰上放置10min。
(2)将离心管放于液氮中速冻5min。
(3)立即置于37℃静置水浴中5min，不要晃动水面。
(4)将离心管放回冰上，保持5min。
(5)加入1ml LB液体培养基，28℃静置培养2～3h。
(6)吸取菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的LB的平板上，28℃先正面放置1h，再倒置培养48～72h。
待单菌落长出后挑取单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列分别为1535bp(pBHg-BCA1-lfc1OE)和674bp(pBHg-BCA1-lfc1RNAi)，分别得到最终带有质粒的农杆菌菌株AGL1-lfc1OE和AGL1-lfc1RNAi。
引物序列如下：Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
四、农杆菌转化金针菇出发菌株FL19
(1)准备金针菇出发菌株FL19菌块：
提前两天用打孔器将长满金针菇菌丝的CYM培养基打成小圆块(d＝5mm)，于CYM液体培养基中静置培养48h。
(2)将含有目的片段质粒的农杆菌(AGL1-lfc1OE和AGL1-lfc1RNAi)分别转接到含利福平及卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养12～16h(150rpm)。
(3)待农杆菌菌液的OD600达0.5～0.8时，转入灭菌的50ml离心管，封口膜封口后，4500rpm，4℃离心12min，收集菌体。
(4)用IM培养基洗涤农杆菌2次。然后加入5ml的IM培养基(重悬农杆菌菌体)，28℃，150rpm，避光培养4～6小时至OD600为0.3～0.5，以诱导其转化能力。
(5)将(1)中准备好的菌块加入到诱导后的农杆菌中液体静置培养3～6h后，将菌块转到覆有玻璃纸的IM培养基上，25℃共培养3～6天。
(6)共培养完成后，用无菌水清洗菌块以清除农杆菌，转到含有12.5μg/ml潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板上，25℃静置培养3～4周待转化子长出。
五、金针菇转化子的筛选
1.样品准备
(1)将从CYM筛选平板上挑出来的单菌落继续转接到含有12.5μg/ml潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板，筛选5代。
(2)将筛选完5代依然生长良好的菌株转接到不含有潮霉素B的覆有玻璃纸的CYM平板上，长满菌丝后收取菌丝，一部分用于DNA提取，另一部分用于RNA提取。同时接金针菇出发菌株FL19作为对照。
2.菌株DNA提取及验证
(1)收集菌丝出发菌株FL19，迅速扔进液氮保存。
(2)液氮研磨菌丝体，加入400μl提取缓冲液(SDEB)和400μl的2×CTAB缓冲液，涡旋混匀。
(3)加入800μl酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心10min。
(4)吸取上清液并转入新的1.5ml离心管中，加入500μl氯仿，充分混匀，12000rpm，离心10min。
(5)吸取适量上清液并转入新的1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃放置10～20min，12000rpm离心10min，弃上清。
(6)75％的乙醇清洗沉淀两次，12000rpm，离心10min，弃上清。
(7)短暂离心，将多余的酒精吸出，晾干。
(8)加入适量DNA溶解液溶解DNA(DNA溶解液配制：1ml 10mM Tris-HCl，pH8.0中加入10μl RNaseA)。
(9)37℃水浴2h，-20℃保存。
(10)分别以金针菇出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1过表达突变菌株的DNA为模板，进行PCR扩增验证，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列分别为无条带(金针菇出发菌株FL19)、1535bp(lfc1过表达突变菌株)和674bp(lfc1过表达突变菌株)，同时分别以相应质粒作为阳性对照。
引物序列如下：Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30sec，58℃90sec，72℃60sec(25cycles)；72℃10min；4℃。
3.菌株RNA提取及定量PCR验证转录水平
对本发明中上述2中所得到的阳性突变体提取RNA，同时进行定量PCR实验，具体操作如下：
(1)将收集的菌样置于1.5ml离心管并迅速投入液氮中冻存。
(2)液氮研磨菌丝体，加入0.7ml Trizol，混匀，室温放置5min。4℃12000rpm离心10min，吸取上清于1.5ml Axygen离心管中。
(3)加入0.7ml氯仿，涡旋振荡器上轻微振荡15sec，室温放置5min。4℃12000rpm离心15min。
(4)吸取适量上清，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置10min。4℃12000rpm离心10min，弃上清。
(5)75％的冰冷乙醇清洗两次，晾干酒精。
(6)用100μl RNA-free水溶解RNA。
(7)紫外分光光度计检测RNA，记录RNA样品的OD260，OD280及Ratio值。然后根据公式：RNA样品的浓度＝OD260值×40×RNA样品的稀释倍数，计算RNA的浓度。
(8)普通凝胶电泳检测RNA的完整性：1％浓度的琼脂糖凝胶，2μg RNA样品上样量，电压为180V，电泳15min，EB染色后紫外下观察RNA条带。
(9)用cDNA合成试剂盒分别将所有RNA样品反转成cDNA，用于定量PCR。
(10)以上述cDNA样品为模板，用定量PCR引物Q-lfc1-F和Q-lfc1-R对lfc1进行定量扩增，同时以actin为模板作为内参基因，引物为Q-actin-F和Q-actin-R。
引物序列如下：Q-lfc1-F:5’-ACGACCGTCCATCCACAGC-3’；Q-lfc1-R:5’-ACAGGTGGGAGTTGGAGAAAG-3’；Q-actin-F:5’-CACCATGTTCCCTGGTATTG-3’；Q-actin-R:5’-CACCAATCCAGACAGAGTATTT-3’。
95℃预变性60sec；95℃变性15sec、58℃退火15sec、72℃延伸45sec，40个循环；溶解曲线分析：65℃～95℃，每0.05sec增加0.5℃并检测。
采用2-ΔΔCt的计算方法对实验数据进行处理。
(11)对所得的定量PCR数据进行分析，选取相对比出发菌株FL19，lfc1上调表达的菌株作为lfc1过表达突变菌株，lfc1下调表达的菌株作为lfc1敲低表达突变菌株。
共得到lfc1过表达突变菌株3株，分别为：lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24，lfc1敲低表达突变菌株3株，分别为：lfc1RNAi#35、lfc1RNAi#232和lfc1RNAi#309，数据结果如图2。
以上菌株作为实验菌株。
实施例3
对lfc1突变菌株进行菌丝生长观察实验。
(1)分别将金针菇出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株(lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24)和lfc1敲低表达突变菌株(lfc1RNAi#35、lfc1RNAi#232和lfc1RNAi#309)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到不含药物的CYM平板上，25℃培养7天之后拍照。
(2)在培养的过程中，每隔24小时测量菌丝生长长度，并做记录，计算各个菌株平均生长速率。
对不同菌株生长情况和生长速率分析结果如下：在CYM平板上，lfc1过表达突变菌株、lfc1敲低表达菌株菌丝的生长与出发菌株FL19相似，均产生白色蓬松状菌丝，生长7天后，菌丝都能到达平皿边缘，菌丝平均生长速率为7.5mm/d，说明lfc1表达情况并不影响金针菇菌丝生长(图3)。
实施例4
对lfc1突变菌株进行出菇实验。
具体过程如下：
(1)分别将金针菇出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株(lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24)和lfc1敲低表达突变菌株(lfc1RNAi#35、lfc1RNAi#232和lfc1RNAi#309)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到装有150±5g栽培料的组培瓶中，25℃培养，70％湿度，黑暗培养15～20天，直到所有菌株菌丝长满栽培瓶。
(2)分别对每个栽培瓶进行搔菌，即用灭菌处理的手术刀轻轻刮去栽培瓶顶部的厚菌丝，继续25℃培养，70％湿度，黑暗培养至栽培瓶顶部长满新的菌丝，为覆菌。
(3)将覆菌后的栽培瓶转移到15℃培养，95％湿度的培养环境中，进行冷刺激，黑暗培养5～7天会有原基(金针菇最初始的子实体)长出。定期观察并拍照。
对所有菌株出菇结果分析如下：
(1)在刺激出菇后第5天时lfc1敲低表达突变菌株产生原基，此时野生和lfc1过表达突变菌株表面仍是菌丝覆盖。
(2)当刺激出菇后第6天时出发菌株FL19产生原基(金针菇的最初级子实体)，此时lfc1敲低表达突变菌株表面已有大量原基产生，而lfc1过表达突变菌株表面仍没有原基出现。
(3)刺激出菇后第8天，lfc1过表达突变菌株表面开始产生原基(图4)。
(4)继续培养进入收获期，发现lfc1敲低表达突变菌株比出发菌株FL19提前2天进入收获期，lfc1过表达突变菌株比出发菌株FL19推迟3天进入收获期，延长了出菇周期，增加了能耗(图4)。而当lfc1敲低表达后，相比于出发菌株FL19提前1天产生原基，并提前2天进入成熟期，缩短了出菇周期，降低了能耗(图4)。
(5)观察成熟收获期的不同菌株子实体发现，lfc1过表达突变株和出发菌株FL19的菌盖、菌柄差异较大，具体表现如下：lfc1敲低表达突变株和出发菌株FL19相似，菌柄细长，菌盖呈圆形，菌盖边缘规则。而lfc1过表达突变株菌柄较为短粗，菌盖边缘不规则且向上翻卷(图5)。
由以上结果可发现：一方面敲低表达lfc1能够促进金针菇菌柄增长，增加金针菇商品价值，同时缩短出菇周期，减少能耗，说明lfc1可以用于筛选菌柄细长、出菇周期短的金针菇菌株；另一方面，lfc1过表达后会扰乱金针菇子实体发育过程中的正常形态建成，造成子实体畸形。这说明lfc1在金针菇子实体的发育中发挥重要的调控功能。
实施例5
对金针菇出发菌株FL19、lfc1过表达突变菌株和lfc1敲低表达突变菌株进行生物量测定实验为了更详细的得到lfc1对金针菇子实体发育的影响，我们对金针菇出发菌株FL19和所有lfc1突变菌株进行了生物量测定分析。为了更有效的进行统计，我们只对长度>6cm的子实体进行统计学分析。
我们分别从子实体数量、菌盖直径、菌柄长度和子实体干重四个方面对所有菌株进行分析发现：
(1)在子实体数量方面，出发菌株FL19平均子实体数量为78个，lfc1过表达突变株lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24的平均子实体数量分别为31个、25个和32个，分别相对于出发菌株FL19减少59％、68％和59％，而lfc1敲低表达菌株lfc1RNAi#35、lfc1RNAi#232和lfc1RNAi#309平均子实体数量分别为81个、84个和86个与出发菌株FL19没有明显差异(图6)。
(2)菌盖直径方面，出发菌株FL19的菌盖直径平均为13.6±0.97mm，lfc1过表达突变菌株lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24的菌盖直径分别可达到23.7±1.61mm、25.4±1.91mm和24.0±1.73mm(图5，图6)。
(3)lfc1敲低表达菌盖状态与出发菌株FL19相似，菌盖直径与出发菌株FL19无明显差异，处于12～15mm之间(图5，图6)。
(4)菌柄长度方面，出发菌株FL19菌柄细长，平均长度为85.59±4.12mm(图6)。
(5)lfc1过表达突变菌株菌柄较短且粗，lfc1OE#15、lfc1OE#23和lfc1OE#24的长度分别为76.11±4.67mm、77.41±6.98mm和80.38±7.88mm mm(图6)。
(7)lfc1敲低表达后菌柄细长，菌株lfc1RNAi#35、lfc1RNAi#232和lfc1RNAi#309菌柄长度分别为111.16±10.36mm、106.45±12.23mm和104.62±12.34mm，比菌柄长度长于出发菌株(图6)。
以上结果说明：
lfc1在金针菇子实体发育中具有重要的调控功能，高表达lfc1会导致金针菇菌盖呈不规则状态增大，影响子实体外观，降低商品价值，因此可以将lfc1基因作为筛除畸形菇菌株的分子指标；而敲低表达lfc1会促进金针菇菌柄增长，增加金针菇的商品价值，可用于选育金针菇优良菌种。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 转录因子LFC1对金针菇子实体发育的调控以及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1172
<212> DNA
<213> 金针菇(Flammulina velutipes)
<400> 1
atgtcgtagt tagtccgata tctccctccg cttagaccct cgcctaacac tcgcctaaca 60
gcccatcgca aggtcactac cttccaccgg aacaccagta ccttacggct gcgacgttgg 120
cctctcacgg tcatgagcac ttgtacgccc acagtcagct gtcggactct ccaccgcgtc 180
aggacctcgc tcaacgaaag cgtccaaagt acactcgcag caagaccggc tgtcttacat 240
gtcgcatgaa gaaaatcaag gtatgtccat tgctgttgcc gacgccgctg cacgcctcta 300
aacaatccct acagtgcgac gagaccaagc cgacgtgcgc tcgctgtact catggtcaaa 360
gagaggtccg gtcacattca cgtcttagga cccattcctg atcctgaact tccgttttag 420
tgtacatggc cagatgcgtc gtctcctcga aggagagctc ctcttcgccg ggggtccatc 480
gacgaccgtc catccacagc aggttcctcc gtctccgacg actctagtcc ttcaattcga 540
aactcaacac ctccgagacg ttttcaaatg gactctccgg aaagcggtct gcttccgcct 600
ccttctgcac gacgtaacat gtccgtttcc gaagacctct cacttcattc gcgtctcacg 660
tcttgcaggg acccctttct ccaactccca cctgtggtgg caccagaatc ccggcaccaa 720
cacatgtaag attaccattc gccacaatca cccagataac tgacgcctac caaccagcag 780
gcctcgacct cctcccttca ctccgcctca atctgagcaa cacaacctaa cgctctcccc 840
ggatccctct gaatattgtc gctatgatcg ttacgatgct acctatgctc agactcatca 900
tctccattca tcacactctt ctccatcatc gcgagcaccg catatggtta ctggaatccg 960
tgggatgggg tactctcccg agtccgtgca tcagtggaac tcaccgcctc tgctgtcgcc 1020
catcgaatca tcatcatacg tgagtcacta ctaagcgcct cttcctcccc aaatctttta 1080
ctaataatcg attcccttca cagcagcact atcccctgca ggagagaggc atggtgggcc 1140
cttctgacaa tcatcatttc agataccaat ga 1172
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> 金针菇(Flammulina velutipes)
<400> 2
Met Ser Tyr Pro Ser Gln Gly His Tyr Leu Pro Pro Glu His Gln Tyr
1 5 10 15
Leu Thr Ala Ala Thr Leu Ala Ser His Gly His Glu His Leu Tyr Ala
20 25 30
His Ser Gln Leu Ser Asp Ser Pro Pro Arg Gln Asp Leu Ala Gln Arg
35 40 45
Lys Arg Pro Lys Tyr Thr Arg Ser Lys Thr Gly Cys Leu Thr Cys Arg
50 55 60
Met Lys Lys Ile Lys Cys Asp Glu Thr Lys Pro Thr Cys Ala Arg Cys
65 70 75 80
Thr His Gly Gln Arg Glu Cys Thr Trp Pro Asp Ala Ser Ser Pro Arg
85 90 95
Arg Arg Ala Pro Leu Arg Arg Gly Ser Ile Asp Asp Arg Pro Ser Thr
100 105 110
Ala Gly Ser Ser Val Ser Asp Asp Ser Ser Pro Ser Ile Arg Asn Ser
115 120 125
Thr Pro Pro Arg Arg Phe Gln Met Asp Ser Pro Glu Ser Gly Leu Leu
130 135 140
Pro Pro Pro Ser Ala Arg Arg Asn Met Asp Pro Phe Leu Gln Leu Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ala Pro Glu Ser Arg His Gln His Ile Arg Pro Arg Pro
165 170 175
Pro Pro Phe Thr Pro Pro Gln Ser Glu Gln His Asn Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Pro Asp Pro Ser Glu Tyr Cys Arg Tyr Asp Arg Tyr Asp Ala Thr Tyr
195 200 205
Ala Gln Thr His His Leu His Ser Ser His Ser Ser Pro Ser Ser Arg
210 215 220
Ala Pro His Met Val Thr Gly Ile Arg Gly Met Gly Tyr Ser Pro Glu
225 230 235 240
Ser Val His Gln Trp Asn Ser Pro Pro Leu Leu Ser Pro Ile Glu Ser
245 250 255
Ser Ser Tyr Gln His Tyr Pro Leu Gln Glu Arg Gly Met Val Gly Pro
260 265 270
Ser Asp Asn His His Phe Arg Tyr Gln
275 280

Claims (7)

1.转录因子LFC1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的转录因子LFC1，其特征在于，在如下任一中的应用：
(1)调控金针菇子实体发育周期；
(2)调控金针菇菌盖发育；
(3)调控金针菇菌柄发育；
(4)选育金针菇优良菌株。
3.一种DNA，其特征在于，它包含编码转录因子LFC1的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的DNA，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
5.一种干扰RNA的制备方法，其特征在于，包括：
(1)用引物Pgpd-lfc1OE-F和Pgpd-lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-lfc1RNAi)，靶序列为920bp；
(2)用引物lfc1RNAiA-Pgpd-F和lfc1RNAiA-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiA片段，靶序列为206bp；
(3)用引物TtrpC-lfc1RNAiA-F和TtrpC-lfc1OE-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-lfc1RNAi)，靶序列为720bp；
(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物；
(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-lfc1RNAi，lfc1RNAiA和TtrpC-lfc1RNAi片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，得到质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA；
(6)用引物lfc1RNAiB-F和lfc1RNAiB-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到lfc1RNAiB片段，靶序列为255bp；
(7)用限制性内切酶AflII同时对质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAiA和lfc1RNAiB片段进行酶切并回收后，用T4Ligase对这两个片段连接过夜；
(8)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，得到最终质粒pBHg-BCA1-lfc1RNAi。
6.一种筛选产量高、出菇周期短的金针菇菌株的方法，其特征在于，包括：
(1)测定待测金针菇菌株的转录因子LFC1编码基因lfc1的表达量；
(2)所述的表达量低于现有金针菇菌株的表达量，为产量高、出菇周期短的金针菇菌株。
7.一种筛除畸形金针菇菌株的方法，其特征在于，包括：
(1)测定待测金针菇菌株的转录因子LFC1编码基因lfc1的表达量；
(2)所述的表达量高于现有金针菇菌株的表达量，为畸形金针菇菌株。
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