CN105039304A - 一种食用真菌的单孢杂交方法 - Google Patents

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谭伟
周洁
曹雪莲
苗人云
王国英
杨俊辉
唐杰
贾定洪
吴翔
谢丽源
甘炳成
黄忠乾
彭卫红
王勇
姜邻
唐利民
王波
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四川省农业科学院土壤肥料研究所
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Abstract

一种食用真菌的单孢杂交方法,包括以下步骤:(1)亲本单核菌丝体的预备;(2)YMG液体专用培养基的制备、分装及灭菌;(3)液体培养下配对交配;(4)镜检确认双核化菌丝。本发明具有操作简单、交配时间短、省工省力、准确性高的特点,从而提高杂交育种工作效率。

Description

一种食用真菌的单孢杂交方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种食用真菌的育种交配方法,具体涉及一种食用真菌的单孢杂交方法。
背景技术
[0002] 食用真菌育种研究中的交配方法主要是单孢杂交,也称单、单交配。当前,育种者实际杂交操作的是亲本单孢子萌发形成的单核菌丝之间的杂交,而且单孢杂交都是在固体培养基质上进行,同时在固体培养基上配对杂交,需要仔细移植对位种块、挑取交接区域菌丝、培养菌丝插片、取插片菌丝镜检确认具有锁状联合的双核菌丝等操作环节,存在着步骤繁琐、而且交配时间长、效率不高等缺点。
[0003] 例如,现有技术刘都才、杨曙湘(1989)的配对杂交方法是将两个不同亲株的单核菌丝体同时接种在平板培养基上,相距0.5〜1.0厘米,培养7〜10天,待两菌丝体接触后,挑取接触部分的菌丝镜检,如发现锁状联合,立即将此接触部分的菌丝体转移到新鲜斜面培养基上培养。该方法是在PDA固体培养基上进行交配,需要仔细移植配位种块,操作复杂繁琐,花费较多工作精力和工作时间。
[0004] 谢芝芳(2005)的单核体配对杂交方法是将两亲本单核体菌株在加富PDA斜面培养基上两两配对杂交,接种块两两间相距约2cm,待两菌落接触后,挑取接触处菌丝体转管繁殖备用。配对组合有:西德33X闵31;西德33X曲师9111 ;西德33XP235 ;西德33X川白I号;西德33X侧5 ;西德33X杂优I号。该方法同样是在PDA固体培养基上进行交配,其缺点仍然是需要仔细移植配位种块,操作显得繁琐,花费较多工作精力和工作时间。
[0005] 边银丙、常堃、蔡婧(2014)的多孢自交方法是利用液体培养基多孢自交的育种选育金针菇新菌种,包括以下步骤:(I)从亲本菌株高邮738的子实体中收集单孢子制成孢子液;(2)将含亲本菌株的孢子液加入液体培养基中摇菌,进行多孢自交;(3)将液体菌种摇瓶培养并进行搔菌处理;(4)通过栽培和筛选获得目标菌株金针。该方法是采用多孢悬浮液在常规三角瓶中进行育种,接触不充分,成功率不高。
[0006] 邱立友、王兰青、王淑敏等人(2007)的一种食用菌液体菌种的固化处理方法,包括以下步骤:(I)试管保藏母种扩管活化:将保藏的母种转接到试管斜面上,在适温下培养;(2)制作摇瓶液体菌种;(3)发酵罐深层培养;(4)载体物质处理;(5)液体菌种固化。该方法中液体菌种在三角瓶中培养,其缺点是三角瓶在摇瓶时占的位置太大,效率不高;三角瓶的空间太大,菌种块的生长速度慢。
[0007] 王瑞娟、尚晓冬、张美彦、周峰(2013) —种食用菌交配型研究中检测锁状联合的方法包括:制备专用培养基;将培养基灭菌,用分液器分装至一次性平板中,将测试单核菌株紧挨两两接种于平板中央,置于25〜26°C培养室中培养,7〜8天后观测菌丝生长区域是否有锁状联合。该方法同样是在PDA固体培养基上进行交配,其缺点仍然是需要确定可信区域然后挑取菌丝进行镜检观察,这样使得挑取的部位准确性不高,不可避免人为误差和工作量大。
[0008] 综上,寻求一种操作简单、时间缩短、省工省力、准确性高的食用真菌的单孢杂交方法,可有效地提高了育种研究工作效率,目前尚未见有食用真菌单孢杂交在液体专用培养基质中进行交配的报道。
发明内容
[0009] 本发明所要解决的技术问题是,提供一种操作简单、时间缩短、省工省力、准确性高的食用真菌的单孢杂交方法。
[0010] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是,一种食用真菌的单孢杂交方法,包括以下步骤:
[0011] (I)亲本单核菌丝体的预备:分别从食用真菌亲本的子实体中收集孢子,用无菌水制成孢子为0.5〜1.5 X 10 6的悬浮液,均匀涂布于PDA培养基上,23〜25°C下培养3〜4天,挑取连带基质的星芒状细小菌落移植到PDA培养基上再培养,再挑取其菌丝于显微镜下检查无锁状联合,而且出菇试验验证不出菇,即获得了其单核菌丝,培养单核菌丝菌落至7mm以上,备用;
[0012] (2) YMG液体专用培养基的制备、分装及灭菌:分别称取酵母膏3.8〜4g、麦芽浸膏4.8〜5g、葡萄糖18〜20g、磷酸二氢钾0.8〜lg、硫酸镁0.3〜0.5g,混合添加于自来水中,适当加热使其溶解,最后用水定容至1000ml,得到YMG液体专用培养基;然后分装至
2.6cmX 20.2cm玻璃试管中,装液量25〜30ml/支,灭菌,冷却;
[0013] (3)液体培养下配对交配:在无菌操作下,采用打孔器(打孔直径7_)打取供亲本菌株的两单核菌丝菌种块,两接种块紧密挨着接入试管培养基中,置放于摇床内,在23〜25°C、转速100〜200r/min条件下振荡培养4〜5d,可见,因振荡作用两个菌种块紧密搅浑“成团”在一起,双亲单核菌丝充分接触并交配;
[0014] (4)镜检确认双核化菌丝:在无菌操作下,将成团种块移植于PDA平板培养基上培养3〜4天,然后在菌落边缘处直接挑取新萌发出的菌丝,镜检具有锁状联合的双核菌丝,即成功获得了单孢杂交的新菌株。
[0015] 进一步,步骤(I)中,所述食用真菌为姬菇,平菇、香菇、凤尾菇、金针菇、毛木耳或银耳。
[0016] 进一步,步骤(2)中,所述YMG液体专用培养基由酵母膏4g、麦芽浸膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.5g,混合添加于自来水中,适当加热使其溶解,最后用水定容至100ml制备而成。
[0017] 本发明具有操作简单、交配时间短、省工省力的特点,并可准确地挑取杂交成功部位,适用于具有异宗结合的有性生殖特性的其它大型真菌的单孢杂交育种研究。
附图说明
[0018] 图1为本发明使用的单核菌丝。
[0019] 图2为本发明单核杂交图。
[0020] 图3为本发明杂交成功后插片镜检图。
[0021] 图4为现有技术中挑取菌丝。
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0023] 实施例1:
[0024] 1、食用真菌的单孢杂交
[0025] (I)预备亲本单核菌丝体:分别从姬菇亲本的子实体中收集孢子,用无菌水制成孢子10 6的悬浮液,均匀涂布于PDA培养基上,25°C下培养3〜4天,采用解剖针尖挑取连带基质的星芒状细小菌落移植到PDA培养基上再度培养,再挑取其菌丝于显微镜下检查无锁状联合,见图1,而且做出菇试验验证不出菇,即获得了其单核菌丝,培养单核菌丝菌落至7mm以上,备用。
[0026] (2)制备YMG液体专用培养基:分别称取酵母膏4g、麦芽浸膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.5g,混合添加于自来水中,适当加热使其溶解,最后用水定容至1000ml,得到YMG液体专用培养基;然后用分液器将上述专用培养基分装至2.6cmX20.2cm玻璃试管中,装液量30ml/支,灭菌,冷却。
[0027] (4)液体培养下配对交配:在无菌操作下,用打孔器(打孔直径7_)打取供亲本菌株的单核菌丝菌种块,两接种块紧密挨着接入试管培养基中,置放于摇床内,在25°C、转速150r/min条件下振荡培养5天,可见因振荡作用两个菌种块紧密搅浑“成团”在一起,双亲单核菌丝充分接触并交配,见图2。
[0028] (5)镜检确认双核化菌丝:在无菌操作下,将成团种块移植于PDA平板培养基上培养3〜4天,在菌落边缘处直接挑取新萌发出的菌丝,于显微镜下检查,可见该菌丝为亲本间单核菌丝细胞已经杂交融合、双核化,形成了具有锁状联合的双核菌丝,见图3,即成功获得了单孢杂交的新菌株。
[0029] (6)出菇验证新菌株:挑取双核菌丝体,扩大繁殖,玻璃瓶栽培,能够正常形成子实体,表现性状有别于亲本,进一步验证出杂交新菌株的真实性。
[0030] 2、结果分析
[0031] (I)本发明在液体专用培养基中让双亲本的单核菌丝之间进行交配,只需简单地将双亲本单核菌丝种块转接于液体培养基中即可,省略了现有方法在固体培养基上交配,必须将双亲单核菌丝种块两两配对移植于固体培养基表面“相距0.5-1.0厘米”位置或“相距约2cm”位置[5],即省去了这个仔细移接对位的复杂繁琐操作过程。
[0032] (2)本发明采用液体专用培养基进行交配,节约了现有方法使用PDA固体培养基需要花费马铃薯去皮、切块和煮汁,以及摆斜面等时间,现有技术中比本发明制作液体培养基至少多花费半天时间。
[0033] (3)本发明可节约交配时间大约3.5天。本发明中双亲单核菌丝在液体专用培养基中只需振荡培养5天时间,即可检查出双核化的杂交菌丝;而现有方法在常规PDA固体培养基上需要“培养7-10天”,平均8.5天,才能检查出双核化的杂交菌丝。
[0034] (4)本发明节约获取镜检用双核化菌丝时间3天,本发明将成团种块移植于PDA平板培养基上培养3〜4天,在菌落边缘处直接挑取新萌发出的菌丝,于显微镜下检查确认双核化菌丝;而现有方法是还需要“挑取交接区域菌丝、培养菌丝插片”,再显微镜下检查确认双核化菌丝,见图4,比本发明方法至少多花费3天时间。
[0035] (5)本发明采用带有单核菌丝的琼脂块,在改变酵母菌浸膏、麦芽浸膏、葡萄糖比例的专用培养基上交配,用规格为2.6cmX20.2cm玻璃试管代替常规三角瓶进行液体培养,比普通的试管大(普通试管规格:1.5cmX 10.0cm、1.5cmX 15.0cm、1.8cmX 18.0cm、
2.0cmX 20.0cm),与三角瓶相比空间变小,并且使得两菌块充分接触加大了成功率。
[0036] (6)本发明在液体的环境中进行的杂交,杂交完成后再接入到准备好的PDA平板上培养,等菌丝球长出菌丝后可以随机准确挑取不同部位的菌丝,为了节省时间和提高效率可以提前插片,即在接菌丝球时同时插片。现有技术在平板中培养时杂交成功部位不确定而盲目挑取,可见本发明避免了在不确定杂交成功部位随机挑取时人为造成的误差。

Claims (3)

1.一种食用真菌的单孢杂交方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)亲本单核菌丝体的预备:分别从食用真菌亲本的子实体中收集孢子,用无菌水制成孢子为0.5〜1.5 X 10 6的悬浮液,均匀涂布于PDA培养基上,23〜25°C下培养3〜4天,挑取连带基质的星芒状细小菌落移植到PDA培养基上再培养,再挑取其菌丝于显微镜下检查无锁状联合,而且出菇试验验证不出菇,即获得了其单核菌丝,培养单核菌丝菌落至7mm以上,备用; (2) YMG液体专用培养基的制备、分装及灭菌:分别称取酵母膏3.8〜4g、麦芽浸膏4.8〜5g、葡萄糖18〜20g、磷酸二氢钾0.8〜lg、硫酸镁0.3〜0.5g,混合添加于自来水中,适当加热使其溶解,最后用水定容至1000ml,得到YMG液体专用培养基;然后分装至2.6cmX 20.2cm玻璃试管中,装液量25〜30ml/支,灭菌,冷却; (3)液体培养下配对交配:在无菌操作下,采用打孔器(打孔直径7_)打取供亲本菌株的两单核菌丝菌种块,两接种块紧密挨着接入试管培养基中,置放于摇床内,在23〜25°C、转速100〜200r/min条件下振荡培养4〜5d ; (4)镜检确认双核化菌丝:在无菌操作下,将成团种块移植于PDA平板培养基上培养3〜4天,然后在菌落边缘处直接挑取新萌发出的菌丝,镜检具有锁状联合的双核菌丝,即成功获得了单孢杂交的新菌株。
2.根据权利要求1所述的食用真菌的单孢杂交方法,其特征在于,步骤(I)中,所述食用真菌为姬菇,平菇、香菇、凤尾菇、金针菇、毛木耳或银耳。
3.根据权利要求1或2所述的食用真菌的单孢杂交方法,其特征在于,步骤(2)中,所述YMG液体专用培养基由酵母膏4g、麦芽浸膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.5g,混合添加于自来水中,适当加热使其溶解,最后用水定容至100ml制备而成。
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