CN103114125A - 一种云芝抗病品种室内筛选的方法 - Google Patents

Abstract

一种云芝抗病品种室内筛选的方法，属于生物工程和食药用菌技术领域。本发明首先对云芝确定两种主要病原菌细菌、青霉菌，引进不同的云芝菌株，对细菌、青霉菌抗病能力进行筛选，建立云芝抗病能力筛选的模式；由于食用菌的细菌及霉菌性病害主要通过病原菌分泌的毒素来抑制食用菌菌丝生长，造成食用菌产生各种病害；还有就是食用菌菌丝的生长与病原菌菌丝的生长强弱之间的竞争来确定食用菌抑制病原菌的能力。因此，通过PDA平板培养实验，利用细菌、青霉菌的发酵产物对不同云芝生长的抑制能力与对照菌株进行对比，得出不同云芝菌株的平均抗性，以及不同的云芝菌株生长速度，建立评分体系，经过综合评判，室内筛选出抗病能力强的菌株，最后经云芝实验进一步确定。

Description

一种云芝抗病品种室内筛选的方法

技术领域

本发明一种云芝抗病品种室内筛选的方法，属于生物工程和食药用菌技术领域。 

背景技术

云芝属担子菌纲多孔菌科云芝属真菌，云芝是极具药用价值的真菌之一。研究发现云芝含多糖类、糖肽类、甾体类、三萜类、有机酸类、生物碱类、葡糖醇类、蛋白质类等29种化合物，还含胞外黏性物质(ECMM)、胃蛋白酶抑制剂、真菌激发子、铁黏合螯合剂、环肽、18种人体所需的氨基酸和维生素B1、B2、B6及铜、铁、钾、锌等10多种人体所需的活性微量元素等其他类化合物。云芝具有清热解毒、消炎抗癌、保肝等功效，常用于去湿、化痰、疗肺疾，治疗慢性支气管炎、迁延性慢性肝炎等。云芝多糖和云芝三萜、氨基酸等活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗放射和抗化疗、镇静、强心及抗心肌缺血、调节血脂、降血糖、平喘、保肝、抗缺氧和抗衰老等作用。云芝具有广泛的药理作用和极高的药用价值，随着国内外研究者对云芝更深入全面的药理研究，云芝的药用价值将得到更广泛的挖掘和应用。产量高、生物性状优异、生产性状良好的云芝菌种是保障云芝生产和云芝产业良好发展的先决条件，从野外分离的云芝菌种大多产量不高，需要经过人工驯化和不断的选育，以提高云芝的产量和生产性状，因此，菌种的选育方面的研究就显得尤为重要。自然选育的效率较低，而采取人工选育的方法效果较好，云芝作为一种大型真菌，有其自身的特点，其新菌种的选育研究离不开食用菌育种方面的研究。而云芝抗病品种室内筛选的新方法为食用菌诱变育种、杂交育种和原生质体融合育种，提供抗病出发菌株，为云芝抗病高产新菌株的筛选提供了抗病出发菌株。同时云芝抗病菌株的筛选，为云芝的生产提供了有力的保障，提高了生产者的经济效益。 

目前食用菌室内抗病筛选方法并不是很多，通常食用菌抗病品种室内筛选的方法，主要通过拮抗试验来确定，看菌丝拮抗线处食用菌菌丝的生长强弱和对病原菌菌丝的覆盖情况来判断，这种方法没有一定的评价标准，完全是通过人为的感官分析，通常会出现菌丝生长速度快抗病率就强的错误观点，最后还是要通过复杂的出菇试验，通过室外建立病原菌感染食用菌子实体模式来鉴定，一是工作量大，同时受环境因素的影响；目前有关通过食用菌液体发酵过程中接入病原细菌，最后看食用菌菌丝的得率与对照进行对比得出抗病率，有一定的科学性，而霉菌病害是真菌，真菌菌丝和食用菌菌丝混在一起就没有办法清除，此种方法就不适用；也有研究报道运用病原菌的发酵液直接涂布平板，或者经过一定的温度灭活用多层纱布过滤后涂布平板试验，看食用菌品种的抗病率。病原菌未完全清除，平板试验无法判断，或者是病菌毒素被高温破坏，试验数据不准确，有很多的缺陷，而且没有建立完全科学的评价体系，实验的偶然性很大。目前有关食用菌抗病品种室内筛选的方法还在不断的研究试验当中。 

发明内容

本发明的目的是提供一种云芝抗病高产新菌株的室内筛选方法，获得抗病出发菌株。 

本发明的技术方案：一种云芝抗病品种室内筛选的方法： 

确定两种主要病原菌（细菌、青霉菌），以云芝进行抗病品种筛选；

通过引进市售的8种不同的云芝菌株进行抗病能力测定，这8种云芝菌株分别命名为：SYZ 1、SYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8；

通过对病原菌的液体发酵培养，病原菌的发酵产物离心得到上清液，然后利用细菌滤膜进行过滤得到无菌滤液，得到的无菌滤液再进行云芝菌株的平板涂布培养实验，利用打孔接种，通过PDA平板培养，利用云芝菌株菌圈生长的大小与未涂布病原菌发酵产物滤液的PDA平板培养试验对照菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性；

通过对不同云芝的生长速度测定，根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、对青霉菌的平均抗性，建立综合评分体系，以确定不同云芝菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株；筛选步骤为：

（1）实验方法的建立：细菌、青霉菌的发酵产物通过离心得到上清液，在45℃进行旋转蒸发浓缩，以确保发酵产物的生理活性不被破坏，然后利用细菌滤膜进行过滤，得到的无菌滤液再进行云芝菌株的平板涂布培养实验，要求PDA平板倒好后放置3天或者用无菌风吹干，以便滤液能被平板吸收及均匀的涂布平板；

（2）确定试验的病原菌发酵产物无菌滤液的浓度：利用两种云芝菌株对不同浓度的病原菌发酵产物无菌滤液进行抗病抑制试验，通过试验效果以确定最佳试验的病原菌发酵产物无菌滤液的浓度；

（3）确定发酵产物无菌滤液的涂布量：在确定病原菌发酵产物无菌滤液的浓度的基础上，再通过平板涂布滤液量的大小对两种云芝菌株所产生的抑制试验效果，确定发酵产物无菌滤液的涂布量；

（4）确定平均抗性：8种不同的云芝菌株在确定的细菌、青霉菌的发酵产物无菌滤液浓度、确定的平板涂布量的条件下，利用打孔接种，通过PDA平板培养，利用云芝菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物无菌滤液的PDA平板试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性：

抗性水平=（试验菌圈直径∕对照菌圈直径）×100%；

（5）抗病性聚类分析：对不同云芝菌株的抗性水平进行方差分析，再进行不同云芝菌株的抗病性聚类分析得出高抗菌株；

（6）生长速度聚类分析：通过PDA平板培养试验对8种不同云芝菌株的生长速度进行测定。通过8种不同云芝菌株的生长速度的聚类分析得出生长速度快的云芝菌株。

（7）综合评分：根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、对青霉菌的平均抗性，建立综合评分体系，以确定不同云芝菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株。 

（8）通过云芝菌株的栽培试验以最终确定筛选出的云芝菌株的抗病能力。 

本发明的有益效果：本发明是一种综合的评价体系，本体系的建立主要来自于我们常用的细菌、霉菌等病原菌抗药性筛选，筛选最佳抗病药物的方法而得来的，具有科学性、适用性、方法的简便性。 

云芝抗病品种室内筛选的方法与目前一些食用菌抗病品种室内筛选方法相比的优点在于： 

① 通常食用菌抗病品种室内筛选的方法，主要通过拮抗试验来确定，一般室内采用病原菌的菌丝和食用菌菌丝的拮抗反应，看菌丝拮抗线处食用菌菌丝的生长强弱和对病原菌菌丝的覆盖情况来判断，这种方法没有一定的评价标准，完全是通过人为的感官分析，通常会出现菌丝生长速度快抗病率就强的错误观点，最后还是要通过复杂的出菇试验，通过室外建立病原菌感染食用菌子实体模式来鉴定，一是工作量大，同时受环境因素的影响，业内都知道这不是一种很可靠的方法，但也没有最佳的室内筛选方法。而云芝抗病品种室内筛选的新方法，根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、青霉菌的平均抗性，建立评分体系，以确定不同云芝菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株。所建立评价体系是一个综合的评价体系，具有科学性和实用性以及方法简便。

②现在出现一种室内筛选抗病品种新方法通过食用菌液体发酵过程中接入病原菌，最后看食用菌菌丝的得率与对照进行对比得出抗病率，有一定的科学性，但病原菌的发酵菌体不能完全清除，对于细菌可以用水冲洗掉，而霉菌病害也是真菌，菌丝和食用菌菌丝混在一起就没有办法清除，此种方法就不适用。而云芝抗病品种室内筛选的新方法利用发酵产物（发酵滤液）对食用菌菌丝的抑制情况来判断，适用性很广。 

③最近还有一种室内抗病性筛选方法，运用病原菌的发酵液直接涂布平板，或者经过一定的温度灭活用多层纱布过滤后涂布，看食用菌品种的抗病率，这种方法和本发明的云芝抗病品种室内筛选的方法原理差不多，但有很多的缺陷，一是病原菌没有完全清除，涂布一到二天后病原菌以长满平板使实验无法进行下去，或者发酵液经过灭活或灭菌病原菌发酵产物的活性成分受到破坏，而且没有建立完全科学的评价体系，实验的偶然性很大。而本发明建立的云芝抗病品种室内筛选的方法通过细菌滤膜清除病原菌，病原菌发酵滤液在低温浓缩然后进行平板涂布实验，完全克服了上述缺点，具有科学性。 

通过对病原菌的液体发酵培养，病原菌（细菌、青霉菌）的发酵产物通过离心得到上清液，然后利用细菌滤膜进行过滤，得到的无菌滤液再进行云芝菌株的平板涂布培养实验，利用打孔接种，通过PDA平板培养，利用云芝菌株菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物滤液的PDA平板培养试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性，抗性水平=（试验菌圈直径∕对照菌圈直径）×100%，通过对不同云芝的生长速度测定，最后根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、对青霉菌的平均抗性，建立综合评分体系，以确定不同菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株。本发明是一种综合的评价体系，本体系的建立主要来自于我们常用的细菌、霉菌等病原菌抗药性筛选，筛选最佳抗病药物的方法而得来的，具有科学性、适用性、方法的简便性。 

本发明建立的云芝抗病品种室内筛选的方法通过细菌滤膜清除病原菌，病原菌发酵滤液在低温浓缩后进行平板涂布实验，完全克服了上述缺点，具有科学性；目前尚未见到有关云芝抗病品种室内筛选的方法的任何报道。 

附图说明

图1  8种不同云芝品种对细菌的抗性聚类分析图。 

图2  8种不同云芝品种对青霉菌抗性聚类分析图。 

图3  8种不同云芝品种生长速度聚类分析图。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 

云芝抗病品种室内筛选的方法，其步骤是： 

1、云芝代表病原菌进行筛选，确定两种主要病原菌（细菌、青霉菌）。

从江苏安惠生物科技有限公司及东北、安徽等云芝生产基地进行病原菌的采集，然后进行病原菌的实验室分离培养分析试验，再进行云芝生产基地的病原菌回接确认试验，最后确定两种主要病原菌为细菌（革兰氏阳性菌）、霉菌（青霉菌）。 

2、通过引进8种不同的云芝菌株进行抗病能力测定。 

(1) 从国内各省云芝主产区引进市售的不同品种的云芝菌种8株。接种于PDA斜面培养基上，28℃避光培养7天进行活化。8种云芝菌株分别为：SYZ 1、SYZ 2、SYZ 3、 SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、 SYZ 8。 

(2) 病原菌的培养。 

细菌用LB液体培养基，170转/分旋转式摇床30℃避光培养4天；青霉菌用PD液体培养基，140转/分旋转式摇床28℃避光培养5天，发酵液10000转/分离心10分钟去除菌体，离心后的菌液备用。 

(3) 细菌、青霉菌的发酵产物，通过离心得到上清液，利用45℃进行旋转蒸发浓缩，然后利用细菌滤膜进行过滤得到滤液，利用两种云芝菌株对不同浓度滤液进行抗病抑制试验，通过试验效果以确定最佳试验的发酵产物滤液的浓度。 

①细菌滤膜进行过滤得到滤液分3种处理方式：发酵滤液不浓缩、浓缩至50%、及浓缩至25%。分别以0.1 mL涂布PDA平板，每种处理涂布3块PDA平板。 

②从8种云芝菌株挑选2株菌株SYZ 3、 SYZ 8，利用打孔接种，通过PDA平板26℃恒温培养，利用菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物滤液的PDA平板试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性：抗性水平=（试验菌圈直径∕对照菌圈直径）×100%，试验结果：浓缩至25%的细菌有抑制云芝菌丝生长效果，而青霉菌发酵产物滤液抑制云芝菌丝生长效果不明显，特别是SYZ 8几乎没变化。 

细菌、青霉菌发酵产物滤液不同浓度抑制情况表 

M代表青霉菌，B代表细菌，下同。

(4) 在确定发酵产物滤液的浓度的基础上，再通过平板涂布滤液量的大小对两种云芝菌株所产生的抑制试验效果，确定发酵产物滤液的涂布量。 

①发酵产物滤液的涂布量分3种处理方式：分别以0.1mL、0.5mL、0.8mL涂布PDA平板，每种处理方式涂布3块PDA平板。要求PDA平板倒好后放置3天或者用无菌风吹干，以便滤液能被平板吸收及均匀的涂布平板。 

②从8种云芝菌株挑选2株菌株SYZ 3、 SYZ 8，利用打孔接种，通过平板26℃恒温培养，利用菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物滤液的平板试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性（抗性水平=试验菌圈直径∕对照菌圈直径×100%）。试验结果：细菌在涂布量0.5mL时抑制云芝SYZ 3、 SYZ 8菌丝生长效果就很明显，因此确定细菌滤液的涂布量为0.5mL。青霉菌涂布量0.8mL时抑制云芝SYZ 3、SYZ 8菌丝生长效果就很明显，因此确定青霉菌滤液的涂布量为0.8 mL。 

浓缩至25%的细菌、青霉菌发酵产物滤液不同涂布量抑制情况表 

(5) 8种不同的云芝菌株在确定的细菌、青霉菌的发酵产物滤液浓度、以及确定的平板涂布量的条件下，利用打孔接种，通过平板培养，利用菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物滤液的平板试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性（抗性水平=试验菌圈直径∕对照菌圈直径×100%）。

①细菌、青霉菌发酵产物用细菌滤膜进行过滤得到滤液浓缩至25%，细菌滤液涂布量0.5mL、青霉菌滤液的涂布量0.8 mL的条件下对8种云芝菌株SYZ 1、SYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8进行PDA平板涂布试验，每个云芝品种涂布3块PDA平板，要求PDA平板倒好后放置3天或者用无菌风吹干，以便滤液能被平板吸收及均匀的涂布平板。 

②8种云芝菌株利用打孔接种，通过PDA平板26℃恒温培养，利用菌圈生长的大小与对照（没有涂布发酵产物滤液的平板试验）菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性（抗性水平=试验菌圈直径∕对照菌圈直径×100）。 

细菌发酵产物滤液浓缩至25%、涂布量细菌0.5mL抑制情况表 

青霉菌发酵产物滤液浓缩至25%、涂布量0.8mL抑制情况表

(6)对8种不同云芝的抗性水平进行方差分析，再进行不同云芝的抗病性聚类分析得出高抗菌株。

8种不同云芝的抗性水平比较表 

注：*5%方差分析结果 

8种不同云芝品种的抗病性聚类分析：

经以上对细菌的聚类分析见图1，可将8种云芝分成3类：

高抗品种：SYZ 8抗性水平为66.41%；

中抗品种：SYZ 1、 SYZ 4、 SYZ 5 、SYZ 6抗性水平分别为：48.81%、59.01%、57.65%、54.73%；

低抗品种：SYZ 2、 SYZ 3、 SYZ 7抗性水平分别为：43.90%、44.33%、41.02%；

经以上对青霉菌的聚类分析见图2，可将8种云芝分成3类：

高抗品种：SYZ 1、 SYZ 7、 SYZ 8抗性水平分别为：88.33%、88.84%、89.25%；

中抗品种：SYZ 3、 SYZ 6抗性水平分别为：81.63%、80.93%；

低抗品种：SYZ 2、 SYZ 4、 SYZ 5抗性水平分别为：74.82%、69.92%、70.34%；

(7) 8种不同云芝的生长速度测定。

8种云芝菌株利用打孔接种，通过PDA平板26℃恒温培养，每个云芝品种接种3块PDA平板，通过对菌丝生长速度的测量、分析得出8种云芝菌株菌丝平均生长速度。 

8种云芝菌株菌丝平均生长速度表 

注：生长速度的聚类分析以菌丝生长6天的数据为准。

经以上生长速度的聚类分析见图3，可将8种云芝分成3类： 

高速品种：SYZ 5生长速度水平分别为：8.43cm；

中速品种：SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8抗性水平分别为：7.42cm、6.9cm、7.47cm；

低速品种：SYZ 1、SYZ 2、SYZ 3、SYZ 4抗性水平分别为：6.17cm、5.52cm、6.37cm、5.32cm；

(8)根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、青霉菌的平均抗性，建立评分体系，以确定不同菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株。

8种云芝菌株评分体系评分表 

	对细菌抗性	对青霉菌抗性	生长速度	评分
					SYZ 1	中抗	高抗	低速	12
SYZ 2	低抗	低抗	低速	9
					SYZ 3	低抗	中抗	低速	10
SYZ 4	中抗	低抗	低速	10
					SYZ 5	中抗	低抗	高速	12
SYZ 6	中抗	中抗	中速	12
					SYZ 7	低抗	高抗	中速	12
SYZ  8	高抗	高抗	中速	14

注：每个类别高5分、中4分、低3分。

SYZ 8得分为14分是我们筛选出的最佳抗病云芝菌株。 

(9) 室内筛选出最佳抗病云芝菌株最后通过云芝的栽培试验以最终确定筛选出的菌株的抗病能力。 

仪器和设备：离心机(15000r/min)，旋转蒸发仪，旋转摇床，超净工作台，手提式灭菌锅。 

试剂和材料：10cm平板  吸管(1mL、5mL)，针式滤器，0.22μm微孔滤膜。 

PD液体培养基：马铃薯200g(煮后取汁)，葡萄糖20g，MgSO₄  0.5g，KH₂PO₄ 1g，水1000mL， pH自然。 

LB液体培养基：酵母浸提液 5.0g ，蛋白胨 10.0g ，氯化钠 10.0g，混合后加去离子水（或注射用水）800mL，待充分溶解后加去离子水（或注射用水）定容至1000mL； 

PDA培养基：马铃薯200g(煮后取汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，水1000mL，pH自然。

Claims (1)

1.一种云芝抗病品种室内筛选的方法，其特征在于： 

以细菌、青霉菌为病原菌，对云芝进行抗病品种筛选；

通过引进市售的8种不同的云芝菌株进行抗病能力测定，这8种云芝菌株分别命名为：SYZ 1、SYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8；

通过对病原菌的液体发酵培养，病原菌的发酵产物离心得到上清液，然后利用细菌滤膜进行过滤得到无菌滤液，得到的无菌滤液再进行云芝菌株的平板涂布培养实验，利用打孔接种，通过PDA平板培养，利用云芝菌株菌圈生长的大小与未涂布病原菌发酵产物滤液的PDA平板培养试验对照菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性；

通过对不同云芝的生长速度测定，根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、对青霉菌的平均抗性，建立综合评分体系，以确定不同云芝菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株；筛选步骤为：

（1）实验方法的建立：细菌、青霉菌的发酵产物通过离心得到上清液，在45℃进行旋转蒸发浓缩，以确保发酵产物的生理活性不被破坏，然后利用细菌滤膜进行过滤，得到的无菌滤液再进行云芝菌株的平板涂布培养实验，要求PDA平板倒好后放置3天或者用无菌风吹干，以便滤液能被平板吸收及均匀的涂布平板；

（2）确定试验的病原菌发酵产物无菌滤液的浓度：利用两种云芝菌株对不同浓度的病原菌发酵产物无菌滤液进行抗病抑制试验，通过试验效果以确定最佳试验的病原菌发酵产物无菌滤液的浓度；

（3）确定发酵产物无菌滤液的涂布量：在确定病原菌发酵产物无菌滤液的浓度的基础上，再通过平板涂布滤液量的大小对两种云芝菌株所产生的抑制试验效果，确定发酵产物无菌滤液的涂布量；

（4）确定平均抗性：8种不同的云芝菌株在确定的细菌、青霉菌的发酵产物无菌滤液浓度、确定的平板涂布量的条件下，利用打孔接种，通过PDA平板培养，利用云芝菌株菌圈生长的大小与未涂布发酵产物无菌滤液的PDA平板培养试验对照菌株菌圈生长的大小进行比较，得出平均抗性：

抗性水平=（试验菌圈直径∕对照菌圈直径）×100%；

（5）抗病性聚类分析：对不同云芝菌株的抗性水平进行方差分析，再进行不同云芝菌株的抗病性聚类分析得出高抗菌株；

（6）生长速度聚类分析：通过PDA平板培养试验对8种不同云芝菌株的生长速度进行测定：通过8种不同云芝菌株的生长速度的聚类分析得出生长速度快的云芝菌株；

（7）综合评分：根据不同云芝的生长速度、对细菌的平均抗性、对青霉菌的平均抗性，建立综合评分体系，以确定不同云芝菌株的抗病能力，筛选出最佳抗病云芝菌株；

（8）通过云芝菌株的栽培试验以最终确定筛选出的云芝菌株的抗病能力。

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