CN104388319A - 柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件。本发明保藏号为CCTCC M2014484的柑橘褐斑病菌，用于提取粗毒素，所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、纯度高，产量大，周期短，易于规模化制备。此外，用毒素代替病原菌作为研究对象，可以避免消除生物间的相互干扰和交叉污染等。本发明建立了一套简便、经济、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，为该病菌及其毒素的致病机理研究奠定了良好的基础。

Description

柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及柑橘褐斑病菌粗毒素的提取方法和产毒条件。
背景技术
病原真菌在与寄主植物相互作用的过程中能产生引起寄主生理生化反应的代谢产物，主要包括酶、激素和毒素。其中毒素具有对寄主植物诱发病害的敏感性诱导因子，是近几年研究的热点。病原真菌产生的毒素根据其对寄主致病范围不同可分为寄主选择性毒素(HST)和非寄主选择性毒素(NHST)。目前已知约20种病原真菌产生HST，其中大多数HST是病原菌的次级代谢产物。1933年Tanaka从梨黑斑病菌-菊池链格孢(Alternariakikuchiana)中首次分离到链格孢菌产生的HST-AK毒素(Tanaka)。引起柑橘褐斑病的链格孢菌主要是橘致病型链格孢菌，其专化性为害橘及其杂种，产生ACT毒素。Nakatsuka等于1989年，纯化了该病菌产生的毒素并将其命名为ACT毒素Ⅰb和Ⅱb。其中Ⅰb是主要成分。ACT毒素由三个部分组成即EDA(9,10-环氧基-8-羟基-9-甲基三烯酸)、缬氨酸和一个聚酮化合物。Kohmoto等研究发现在理查德培养基中25℃，静置培养24d产毒量最高，同时在培养基中加入微量的Zn2+，能增加产毒量。目前已知的病原菌毒素均为有机类物质，因此可以通过萃取、层析、色谱等方法提取。优化病菌产生毒素的条件是研究病原物生物学特性的重要方面，对毒素的大量制备与提取等研究工作有重要作用。
现有技术中，尚未有提取柑橘褐斑病菌粗毒素的相关报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种适合该柑橘褐斑病菌提取粗毒素的技术和产毒条件，为研究柑橘褐斑病菌粗毒素的生物学特性奠定基础。
本发明首先公开了一种柑橘褐斑病菌株，其保藏号为：CCTCC M 2014484。
本发明从采自重庆万州陈家坝红橘果实中分离筛选到一柑橘褐斑病菌株CJBHJF-2，该菌株已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2014484。在PDA培养基上，菌落呈灰色至橄榄色或青褐色，分生孢子梗单生或数根簇生，直立或顶端微弯曲，有分隔，未见分枝，色泽从基部到顶部深褐色渐变为浅褐色，分生孢子单生或链生，倒棍棒形、倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐色，具纵横隔膜，幼龄孢子多为卵圆形，颜色淡褐色，0～1个横隔，老龄孢子多为棍棒形，颜色深褐色或黑褐色，纵横隔膜较多。
经形态学和分子生物学鉴定，确定该菌株为链格孢属链格孢菌[Alternaria alternata(Fr.)Keissler]，在柑橘上引起褐斑病，命名为柑橘褐斑病菌CJBHJF-2，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2014484。所述柑橘褐斑病菌，生物学特性稳定，菌株产毒量高。
本发明第二方面公开了从柑橘褐斑病菌中提取粗毒素的方法，具体包括以下步骤：
(1)产毒培养：转接柑橘褐斑病菌于PDA培养基上培养至形成菌落，然后取一定大小的菌丝块，于液体培养基中继续培养一段时间，至菌丝开始变黑，得产毒培养液；
(2)滤液制备：将步骤(1)中所得产毒培养液，过滤除去菌丝，离心弃去沉淀，上清液即为培养滤液；
(3)粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步骤(2)中所得培养滤液中加入有机溶剂，萃取，去除有机溶剂，得浓缩物。然后将浓缩物复溶于水中，得粗毒素。
优选的，步骤(1)中，所述柑橘褐斑病菌为CJBHJF-2，其保藏号为：CCTCC M2014484。
优选的，步骤(1)中，PDA培养基上培养的方式为：28℃，连续黑暗，培养5～7d。
优选的，步骤(1)中，所述液体培养基选自PSK培养基、理查德培养基、改良理查德培养基、Fries培养基或改良Fries培养基中的任意一种。更优选为改良理查德培养基。
优选的，步骤(1)中，于液体培养基中培养的时间为5～30d，更优选为8～10d。
优选的，步骤(1)中，于液体培养基中培养的温度为10～35℃，更优选为28℃。
优选的，步骤(1)中，于液体培养基中培养的光照条件为连续光照、12光照/12h黑暗或全黑暗，更优选为连续光照。
优选的，步骤(1)中，于液体培养基中培养的方式为静置培养或振荡培养，更优选为振荡培养，最优选为110r/min振荡培养。
优选的，步骤(1)中，液体培养基的pH值为3～7，更优选为4～5。
优选的，步骤(3)中，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中的任意一种或多种。更优选甲醇。
优选的，步骤(3)中，所述有机溶剂与培养滤液等体积。
优选的，步骤(3)中，去除有机溶剂时采用旋转蒸发法。
本发明第三方面公开了由前述方法提取获得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
本发明第四方面公开了前述柑橘褐斑病菌在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明系统比较了时间、温度、光照、通气量、pH值和培养基，优化了柑橘褐斑病菌毒素的产生条件。该方法比较了丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳五种萃取剂，甲醇萃取效果最好。选择甲醇作萃取剂，采用旋转蒸发法去除有机溶剂，方法简单易行，操作简便，成本低。所得柑橘褐斑病菌粗毒素含量高、纯度高，产量大，周期短，易于规模化制备。此外，用毒素代替病原菌作为研究对象，可以避免消除生物间的相互干扰和交叉污染等。本发明建立了一套简便、经济、高效的柑橘褐斑病菌毒素提取方法，为该病菌及其毒素的致病机理研究奠定了良好的基础。
本发明菌株保藏信息如下：
菌株名称：CJBHJF-2；
保藏号为：CCTCC M 2014484。
保藏日期：2014年10月15日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称：CCTCC；
保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。
附图说明
图1有机溶剂萃取柑橘褐斑病菌毒素致病性测定
图2不同培养时间对柑橘褐斑病菌产毒的影响
图3不同培养温度对柑橘褐斑病菌产毒的影响
图4不同培养条件对柑橘褐斑病菌产毒的影响
图5不同pH值对柑橘褐斑病菌产毒的影响
图6不同培养基对柑橘褐斑病菌产毒的影响
图7接种ACT毒素后两天叶片症状
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1产毒菌株的筛选
1.1.菌株与植物
供试菌株：CJBHJF-2、TJCHJ35B、CJBHJL-2、SP-36等29个菌株分离自重庆、西班牙、广东、广西、浙江等地的褐斑病典型发病叶片、枝条和果实。
生物测定材料：采自网室内1年生3～4cm长红橘叶片。
试验中涉及的培养基配方：
PDA培养基(PDA Medium)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，加蒸馏水定容至1L。
PSK培养基(PSK Medium)：马铃薯200g，蔗糖30g，K2HPO41g，加蒸馏水定容至1L。
理查德培养基(Richard’s Medium)：蔗糖50g，KNO310g，KH2PO45g，MgSO42.5g，FeCl20.02g，加蒸馏水至1L。
改良理查德培养基(Improved-Richard Medium)：葡萄糖50g，KNO310g，KH2PO45g，MgSO42.5g，FeCl20.02g，ZnSO40.005g，加蒸馏水至1L。
Frie’s培养基(Frie’s Medium)：蔗糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸出液0.5g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，CaCl2.H2O 0.1g，加蒸馏水至1L。
改良Frie’s培养基(Improved-Fries Medium)：蔗糖20g，酒石酸铵5g，酵母浸出液1g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O 0.5g,NaCl 0.1g，CaCl2.H2O 0.13g，加蒸馏水至1L。
查彼克培养基(Czapek-Dox Medium)：蔗糖30g，NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO40.01g，加蒸馏水至1L。
1.2产毒培养方法
转接菌种于PDA培养基上培养5～7d(28℃，连续黑暗)，然后取一定大小的菌丝块放于盛有50ml改良Richard’s液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，12h光照/12h黑暗(12L/12D)，110r/min培养8d，至菌丝开始变黑。
1.3粗毒素的制备及其接种方法
粗毒素的制备方法：菌株按上述产毒方法培养后，先用4层纱布过滤，除去菌丝。滤液经15000r/min离心30min，得上清。上清中加入等体积甲醇，300r/min，萃取30min。然后旋转蒸发仪65℃蒸馏至近干，以去除甲醇，溶液用无菌水定容至5ml离心管中，经0.22μm滤膜过滤，得粗毒素。
接种方法：采用离体叶片针刺法测定毒力。培养皿中放入无菌滤纸(Thomma 2003)，并用无菌水浸湿，叶片放于其中。在距叶片中脉2cm处针刺，滴加50μl粗毒素，保鲜膜保湿，置于培养箱中一段时间，测量产生的病斑直径。
1.4产毒菌株
从本实验室保存的29个链格孢菌株中筛选出两个菌株。这两个菌株用于产毒特性试验，同时比较国外和国内的这两个菌株的产毒条件是否有差异。
实施例2产毒条件的优化
2.1萃取剂的选择
高产毒菌株按确定的产毒条件培养后，得到培养滤液。分别取15ml培养滤液加入等体积的丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳，300r/min萃取30min。旋转蒸发仪蒸发去除有机溶剂，得到的粗毒素用离体叶片针刺法进行生测。
2.2产毒培养条件的优化
2.2.1按实施例1中方法筛选出的菌株用于产毒培养条件的优化实验。
2.2.2时间：按实施例1中1.2方法在液体培养基中培养5、10、15、20、25、30d取样，制备粗毒素。
2.2.3温度：按实施例1中1.2方法分别于5、10、15、20、25、28、30、35℃条件下，在液体培养基中培养菌株一定时间，制备粗毒素。
2.2.4光照条件：按实施例1中1.2方法分别于连续光照、12L/12D、全黑暗三种条件下，在液体培养基中培养菌株一定时间，制备粗毒素。
2.2.5通气量：分别于静置和110r/min振荡条件下，在液体培养基中培养菌株一定时间，制备粗毒素。
2.2.6pH值：调节改良Richard’s培养基的pH值为2、3、4、5、6、7，培养菌株一定时间，制备粗毒素。
2.2.7培养基：PSK、Richard’s、改良Richard’s、Fries、改良Fries、Czapek六种培养基培养菌株，一定时间后制备粗毒素。
各处理得到的粗毒素在用于生物测定前均可保存于4℃。离体叶片针刺法进行生物测定。以无菌水和经0.22μm滤膜过滤的培养基分别作为清水对照(CK0)和负对照(CK1)。
2.3数据分析
每个条件处理3个重复，离体叶片接种粗毒素两天后拍照，应用IMAGEJ软件计算病斑直径。实验结果采用Microsoft Excel 2007进行数据统计，利用SPSS软件进行数据的方差分析和多重比较。
2.4结果
2.4.1产毒菌株
从本实验室保存的29个链格孢菌株中筛选出两个菌株：西班牙菌株SP-36和万州菌株CJBHJF-2。这两个菌株用于产毒特性试验。
2.4.2萃取剂的选择
结果表明：不同的萃取剂分层特征不同(见表1)，萃取效果也不同(见图1)。ACT毒素是小分子物质，主要存在于水相中。四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮这五种萃取剂的极性分别是1.60、3.40、4.30、5.10、5.40。由图1可以看出，用极性强、与水互溶的甲醇和丙酮萃取，均产生少量白色絮状沉淀物。经离心除去沉淀后的溶液基本为澄清状态，把有机溶剂和水的混合相经减压蒸发去除有机溶剂，分别将得到的浓缩物和离心获得的沉淀物复溶于水中进行生物活性测定。甲醇有机相减压蒸发后得到的浓缩物所产生的病斑直径较大，而絮状沉淀引起的病斑较小，说明甲醇的有机相中含有大量的毒素，而且柑橘褐斑病菌在液体培养基中产生的毒素成分是小分子物质，甲醇萃取效果最好。由此可知，毒素的极性较大，在5.10～5.40之间。
表1有机溶剂萃取柑橘褐斑病菌毒素有机相和水相的外观性状
2.4.3产毒条件的优化
2.4.3.1培养时间对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
如表2所示，SP-36和CJBHJF-2两个菌株在改良Richard’s培养基中培养到8～10d时引起的病斑最大，表明产毒量最高。前10d，产毒量随培养时间的延长而增多，到第10d达到峰值，引起的病斑直径分别达到0.45cm和0.60cm。然后开始下降，15d后下降变得很缓慢(图2)。
表2不同培养时间对柑橘褐斑病菌产毒的影响
注：不同小写字母表示差异达5％显著水平。
2.4.3.2培养温度对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
褐斑病菌在测定的温度范围内均能产毒。SP-36和CJBHJF-2两个菌株在培养温度为28℃时产毒量最高，测试叶片的病斑直径分别为0.40cm和0.39cm。温度为5℃时菌丝不生长，产毒量为0。随着培养温度的升高，产毒量增多，28℃是达到最高峰，然后开始下降。10℃和35℃温度下，接种毒素的叶片产生的病斑直径均小于0.25cm，结果表明低温和高温都不利于产毒(图3)。
表3不同培养温度对柑橘褐斑病菌产毒的影响
注：不同小写字母表示差异达5％显著水平。
2.4.3.3光照对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
光照对菌株的产毒量有很大影响(图3)。菌株SP-36在连续光照条件下培养得到的粗毒素引起病斑的平均直径(0.37～0.39cm)远大于全黑暗(病斑直径0.27～0.28cm)和12小时光照/12小时黑暗(病斑直径0.25～0.27cm)条件。说明连续光照有利于产毒。
表4光照对柑橘褐斑病菌产毒的影响
注：不同小写字母表示差异达5％显著水平。
2.4.3.4通气量对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
一定大小的菌丝块放于改良Richard’s培养基中分别于静置和110r/min振荡条件下培养。静置时，7d时在培养基表面产生一层深色的菌膜，两个菌株提取的粗毒素致叶片产生0.26cm左右的病斑。振荡培养时，随着培养时间的延长，菌丝球逐渐变大，颜色逐渐加深。两个菌株提取的毒素能致叶片产生0.45cm左右的病斑。结果表明链格孢菌可能在生长过程中需氧。
2.4.3.5pH值对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
柑橘褐斑病菌在不同pH值的培养基下培养7d，提取的粗毒素对柑橘叶片的致病性不同。当培养基pH值为2～3时，菌丝不生长。当pH值为4时，SP-36菌株产毒量最高，CJBHJF-2菌株产毒的最适pH值为5。pH值为5～7时，产毒量随培养基酸度的降低而下降(图5)。
表5不同pH值对柑橘褐斑病菌产毒的影响
注：不同小写字母表示差异达5％显著水平。
2.4.3.6培养基对CJBHJF-2和SP-36菌株产毒的影响
供试菌株在六种培养基中培养7d后，提取粗毒素进行生测，结果显示，在改良Richard’s培养基中产毒量最高，两个菌株提取粗毒素引起的病斑直径均为0.45cm，与其他培养基有显著差异(p<0.05)。其次是Frie's和改良Frie's培养基，在Czapek's培养基中不产毒。结果表明培养液成分对柑橘褐斑病菌毒素的产生有很大影响(图6)。
表6不同培养基对柑橘褐斑病菌产毒的影响
注：不同小写字母表示差异达5％显著水平。
2.5讨论
真菌毒素作为病原菌致病的重要因子，对于其研究不仅能揭示病原菌致病机理，同时还具有一定的实际应用价值。(1)真菌毒素可以代替病原菌检测品种的抗病性，以便简单快速的筛选出抗性品种。(2)利用毒素对寄主的专转化性不同，可以在真菌分类上起辅助作用。(3)真菌毒素可以使杂草产生病害，可以开发为除草剂。已有报道链格孢菌株可以作为防除紫茎泽兰的菌株。从西班牙、广东、广西、浙江、重庆等地的褐斑病典型发病叶片、枝条和果实分离得到的29个致病菌株经致病性试验，采自西班牙的SP-36菌株产孢量最多，致病力最强。SP-36菌株在改良Richard’s培养液中进行诱导产毒，对其培养滤液用四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮萃取，结果显示，甲醇萃取效果最好。萃取得到的粗毒素通过离体叶片针刺能使叶片产生褐色病斑，和病原菌引起的症状相似。说明毒素是主要致病因子。
真菌毒素的培养，要选择产毒最旺盛的培养基。而不同病原菌的最适产毒培养基有差异。已报道黄氏根腐病菌在PSC培养液中产毒能力最强。大蒜叶枯病菌在Czape-Dox培养液中产毒最多。而试验中发现橘致病型链格孢菌在改良Richard’s培养基中产毒量最高，改良Richard’s培养基和其他培养基最大的区别是加入了微量Zn2+，可能是Zn2+促进了产毒。不仅培养基，培养温度对产毒也有影响。大部分真菌的产毒温度都相对温和，如镰刀菌、玉米大斑病菌的产毒温度在24-25℃。SP-36菌株在25-28℃时产毒量较高，该现象和田间褐斑病在春秋天发病率较高一致。pH值对毒素的产生也很重要，在分离得到的29个菌株培养过程中，国外菌株SP-36产毒最适pH值为4，而国内菌株CJBHJF-2产毒最适pH值为5。两个菌株在pH 2-12的条件下培养时，酸性培养条件下提取的粗毒素接种均能引起褐色病斑，和田间发病症状相似。但碱性条件下提取的粗毒素接种叶片能引起叶片溃烂，并不引起典型症状。推测可能是由于病菌在碱性条件下次级代谢产物发生了变化，ACT毒素不是主要成分，该结果有待于进一步验证。培养方式同样影响产毒量，如大丽轮枝菌在震荡条件下产毒最多，而玉米大斑病菌静止培养时产毒最多。有的菌如玉米大斑病菌在黑暗条件下产毒量达最大。柑橘褐斑病菌在连续光照、振荡条件下产毒量最高。因此，柑橘褐斑病菌最适宜的产毒条件是：在pH 4～5的改良Richard’s培养基中28℃、连续光照、振荡培养8～10d。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种柑橘褐斑病菌株，其保藏号为：CCTCC M 2014484。
2.一种从柑橘褐斑病菌株中提取粗毒素的方法，具体包括以下步骤：
(1)产毒培养：转接柑橘褐斑病菌株于PDA培养基上培养至形成菌落，然后取一定大小的菌丝块，于液体培养基中继续培养一段时间，至菌丝开始变黑，得产毒培养液；
(2)滤液制备：将步骤(1)中所得产毒培养液，过滤除去菌丝，离心弃去沉淀，上清液即为培养滤液；
(3)粗毒素提取：采用小分子萃取法，在步骤(2)中所得培养滤液中加入有机溶剂，萃取，去除有机溶剂，得浓缩物。然后将浓缩物复溶于水中，得柑橘褐斑病菌粗毒素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述柑橘褐斑病菌株为CJBHJF-2，其保藏号为：CCTCC M 2014484。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基选自PSK培养基、理查德培养基、改良理查德培养基、Fries培养基或改良Fries培养基中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，于液体培养基中培养的时间为5～30d；于液体培养基中培养的温度为10～35℃；于液体培养基中培养的光照条件为连续光照、12光照/12h黑暗或全黑暗。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，于液体培养基中培养的方式为静置培养或振荡培养。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，液体培养基的pH值为3～7。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙酸乙酯、氯仿或四氯化碳中的任意一种或多种。
9.一种由权利要求2-8任一项权利要求所述的方法制备获得的柑橘褐斑病菌粗毒素。
10.根据权利要求1所述的柑橘褐斑病菌株在提取柑橘褐斑病菌粗毒素中的应用。
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