CN110499371B - 鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。所述的微卫星引物GP484为：F:5'‑TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG‑3'；R:5'‑CGACGGACCTATCACTGCACCA‑3'。利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出斜带石斑、马拉巴石斑、斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试 剂盒和鉴定方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术中的石斑鱼分子标记和杂交种鉴定技术，具体涉及一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。
背景技术
斜带石斑(Epinephelus coioides)又称点带石斑，属鲈形目、鮨科、石斑鱼属，俗称青斑，主要分布于红海。由于其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽，市场价格高且稳定，已越来越受到消费者和养殖者的青睐。
马拉巴石斑(Epinephelus malabaricus)俗称虎麻，主要分布于印度-太平洋之暖水域。其与斜带石斑的色泽和外形相似，常被混为同一种鱼，因其体色都呈青褐色也称为青斑。两者区别之处是斜带石斑的斑点为红色，马拉巴石斑的斑点为黑色。斜带石斑一年四季均能产卵，而马拉巴石斑产卵期较短，因此近年斜带石斑已取代马拉巴石斑成为我国最主要养殖品种。
由于马拉巴石斑价格较昂贵，且外形与斜带石斑相似，导致市场上常有人以价格较低的斜带石斑冒充马拉巴石斑，因此，急需一种简单高效的方法对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。
本发明从100对马拉巴石斑EST-SSR引物中筛选出1对微卫星(SSR)引物对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代各50个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效的对真正杂交子一代进行分子鉴定，从而简单高效地对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
本发明的第一个目的是提供鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物 GP484，所述的微卫星引物GP484为：
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的试剂盒，该试剂盒含有上述的微卫星引物GP484。
本发明的第三个目的是提供一种斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的鉴定方法，包括以下步骤：
提取待测石斑鱼样品的基因组DNA，然后用权利要求1所述的微卫星引物GP484进行 PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在230bp～240bp区间内出现条带，则该待测样品为斜带石斑；若在250bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为马拉巴石斑；若同时在230bp～240bp区间和250bp～260bp区间内各出现1条带，则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增，其PCR扩增体系总体积为15μL，具体为：DNA模板2.0μL，10×PCR Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，加灭菌水补足15μL。
PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s， 30个循环，72℃延伸10min。
所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 220V稳压电泳3小时，然后用0.1％AgNO3溶液染色10min，银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL显色，至条带清晰为止。
本发明的第四个目的是提供上述的微卫星引物GP484或上述的试剂盒在鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代中的应用。
由于微卫星引物GP484产生的斜带石斑特异条带范围在230bp～240bp之间，马拉巴石斑特异性条带范围在250bp～260bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种石斑鱼的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比：若在230bp～240bp区间内出现条带，则该待测样品为斜带石斑；若在250bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为马拉巴石斑；若同时在230bp～240bp区间和250bp～260bp区间内各出现1条带，则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
本发明的有益效果为：利用本发明提供的微卫星引物GP484、试剂盒及鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出斜带石斑、马拉巴石斑、斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代，具有重要的实际应用价值，克服了现有技术难以区分斜带石斑、马拉巴石斑的缺陷，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1是微卫星引物GP484在斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代部分个体间的电泳染色对比图谱。1是Marker，2-4是斜带石斑×马拉巴石斑杂交一代个体，5～7是马拉巴石斑个体，8～10是斜带石斑个体。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、基因组DNA提取：分别从斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交种的尾静脉采血0.5mL，采用酚-氯仿抽提法提取斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代各50个个体的基因组DNA。将100μL的血液放入1.5mL离心管中，再加入400μL裂解液和10μL蛋白酶K(10 mg/mL)，在振荡器上混匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600μL酚：氯仿：异戊醇混合液(25:24:1v/v)，振荡20min后12000rpm离心10min，取上清液。再加入酚：氯仿：异戊醇混合液，重复上述操作3次。取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10 体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀。用1mL 的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
2、PCR扩增：分别以提取的斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为15μL，具体为：DNA模板2.0μL，10×PCR Buffer1.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，上、下游引物各0.5μL，Taq DNA 聚合酶0.2μL，加灭菌水补足15μL。其中引物序列为：
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s， 30个循环，72℃延伸10min。
PCR反应结束后，取0.5μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描后，根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比，若在230bp～240bp区间内出现条带，则该待测样品为斜带石斑；若在250bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为马拉巴石斑；若在230bp～240bp区间和250bp～260bp区间内各出现1条带，则该个体为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。具体结果如图1所示，从图1可以看出，斜带石斑在230bp～240bp区间出现条带，马拉巴石斑在250bp～260bp区间出现条带，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种砗磲的个体。斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代同时在230bp～240bp区间和 250bp～260bp区间内各出现1条带。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtatggtt tcggagcgtt tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacggacct atcactgcac ca 22

Claims (7)

1.鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物GP484，其特征在于，所述的微卫星引物GP484为：
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3'；
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'。
2.一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的微卫星引物GP484。
3.一种斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测石斑鱼样品的基因组DNA，然后用权利要求1所述的微卫星引物GP484进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在230bp～240bp区间内出现条带，则该待测样品为斜带石斑；若在250bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为马拉巴石斑；
若同时在230bp～240bp区间和250bp～260bp区间内各出现1条带，则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增，其PCR扩增体系总体积为15μL，具体为：DNA模板2.0μL，10×PCR Buffer1.5μL，2.5mmol/L dNTP0.5μL，MgCl2 1.5μL，上、下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，加灭菌水补足15μL。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增，其PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，然后用0.1％AgNO3溶液染色10min，银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL显色，至条带清晰为止。
7.权利要求1所述的微卫星引物GP484或权利要求2所述的试剂盒在鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代中的应用。
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