CN110499371B - 鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。所述的微卫星引物GP484为:F:5'‑TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG‑3';R:5'‑CGACGGACCTATCACTGCACCA‑3'。利用本发明方法,可以快速、准确地鉴定出斜带石斑、马拉巴石斑、斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代,具有重要的实际应用价值,同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试 剂盒和鉴定方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术中的石斑鱼分子标记和杂交种鉴定技术,具体涉及一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。
背景技术
斜带石斑(Epinephelus coioides)又称点带石斑,属鲈形目、鮨科、石斑鱼属,俗称青斑,主要分布于红海。由于其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽,市场价格高且稳定,已越来越受到消费者和养殖者的青睐。
马拉巴石斑(Epinephelus malabaricus)俗称虎麻,主要分布于印度-太平洋之暖水域。其与斜带石斑的色泽和外形相似,常被混为同一种鱼,因其体色都呈青褐色也称为青斑。两者区别之处是斜带石斑的斑点为红色,马拉巴石斑的斑点为黑色。斜带石斑一年四季均能产卵,而马拉巴石斑产卵期较短,因此近年斜带石斑已取代马拉巴石斑成为我国最主要养殖品种。
由于马拉巴石斑价格较昂贵,且外形与斜带石斑相似,导致市场上常有人以价格较低的斜带石斑冒充马拉巴石斑,因此,急需一种简单高效的方法对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。
本发明从100对马拉巴石斑EST-SSR引物中筛选出1对微卫星(SSR)引物对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代各50个个体的基因组DNA进行PCR扩增,通过扩增图谱可以简单高效的对真正杂交子一代进行分子鉴定,从而简单高效地对斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
本发明的第一个目的是提供鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物 GP484,所述的微卫星引物GP484为:
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示);
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的试剂盒,该试剂盒含有上述的微卫星引物GP484。
本发明的第三个目的是提供一种斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的鉴定方法,包括以下步骤:
提取待测石斑鱼样品的基因组DNA,然后用权利要求1所述的微卫星引物GP484进行 PCR扩增,将扩增产物进行电泳和染色,若在230bp~240bp区间内出现条带,则该待测样品为斜带石斑;若在250bp~260bp区间内出现条带,则该待测样品为马拉巴石斑;若同时在230bp~240bp区间和250bp~260bp区间内各出现1条带,则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代,缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增,其PCR扩增体系总体积为15μL,具体为:DNA模板2.0μL,10×PCR Buffer 1.5μL,2.5mmol/L dNTP 0.5μL,MgCl2 1.5μL,上、下游引物各0.5μL,Taq DNA聚合酶0.2μL,加灭菌水补足15μL。
PCR反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s, 30个循环,72℃延伸10min。
所述的将扩增产物进行电泳和染色,是将扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 220V稳压电泳3小时,然后用0.1%AgNO3溶液染色10min,银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL显色,至条带清晰为止。
本发明的第四个目的是提供上述的微卫星引物GP484或上述的试剂盒在鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代中的应用。
由于微卫星引物GP484产生的斜带石斑特异条带范围在230bp~240bp之间,马拉巴石斑特异性条带范围在250bp~260bp之间,两者之间没有等位基因重叠区,可以明显区分两种石斑鱼的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比:若在230bp~240bp区间内出现条带,则该待测样品为斜带石斑;若在250bp~260bp区间内出现条带,则该待测样品为马拉巴石斑;若同时在230bp~240bp区间和250bp~260bp区间内各出现1条带,则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代,缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
本发明的有益效果为:利用本发明提供的微卫星引物GP484、试剂盒及鉴定方法,可以快速、准确地鉴定出斜带石斑、马拉巴石斑、斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代,具有重要的实际应用价值,克服了现有技术难以区分斜带石斑、马拉巴石斑的缺陷,同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1是微卫星引物GP484在斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代部分个体间的电泳染色对比图谱。1是Marker,2-4是斜带石斑×马拉巴石斑杂交一代个体,5~7是马拉巴石斑个体,8~10是斜带石斑个体。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1
1、基因组DNA提取:分别从斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交种的尾静脉采血0.5mL,采用酚-氯仿抽提法提取斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代各50个个体的基因组DNA。将100μL的血液放入1.5mL离心管中,再加入400μL裂解液和10μL蛋白酶K(10 mg/mL),在振荡器上混匀,37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600μL酚:氯仿:异戊醇混合液(25:24:1v/v),振荡20min后12000rpm离心10min,取上清液。再加入酚:氯仿:异戊醇混合液,重复上述操作3次。取上清液,加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10 体积的3mol/L的醋酸钠,12000rpm离心10min,弃去上清液,保留DNA沉淀。用1mL 的无水乙醇沉淀DNA,经70%酒精洗涤,室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
2、PCR扩增:分别以提取的斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交种的基因组DNA为模板,进行PCR扩增反应:PCR反应体系的总体积为15μL,具体为:DNA模板2.0μL,10×PCR Buffer1.5μL,2.5mmol/L dNTP 0.5μL,MgCl2 1.5μL,上、下游引物各0.5μL,Taq DNA 聚合酶0.2μL,加灭菌水补足15μL。其中引物序列为:
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示);
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
PCR反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s, 30个循环,72℃延伸10min。
PCR反应结束后,取0.5μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,220V稳压电泳3小时,电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中,用去离子水清洗两次,然后加入0.1%AgNO3溶液(AgNO3 1g,dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次,加入显色液(2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL)显色,直至条带清晰为止,于UMAX扫描仪下扫描后,根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比,若在230bp~240bp区间内出现条带,则该待测样品为斜带石斑;若在250bp~260bp区间内出现条带,则该待测样品为马拉巴石斑;若在230bp~240bp区间和250bp~260bp区间内各出现1条带,则该个体为真正的斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代,缺少其中的任意一个条带均为假杂种。具体结果如图1所示,从图1可以看出,斜带石斑在230bp~240bp区间出现条带,马拉巴石斑在250bp~260bp区间出现条带,两者之间没有等位基因重叠区,可以明显区分两种砗磲的个体。斜带石斑×马拉巴石斑杂交子一代同时在230bp~240bp区间和 250bp~260bp区间内各出现1条带。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtatggtt tcggagcgtt tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacggacct atcactgcac ca 22

Claims (7)

1.鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的微卫星引物GP484,其特征在于,所述的微卫星引物GP484为:
F:5'-TCGTATGGTTTCGGAGCGTTTG-3';
R:5'-CGACGGACCTATCACTGCACCA-3'。
2.一种鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的微卫星引物GP484。
3.一种斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代的鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
提取待测石斑鱼样品的基因组DNA,然后用权利要求1所述的微卫星引物GP484进行PCR扩增,将扩增产物进行电泳和染色,若在230bp~240bp区间内出现条带,则该待测样品为斜带石斑;若在250bp~260bp区间内出现条带,则该待测样品为马拉巴石斑;
若同时在230bp~240bp区间和250bp~260bp区间内各出现1条带,则该待测样品为斜带石斑与马拉巴石斑杂交子一代。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增,其PCR扩增体系总体积为15μL,具体为:DNA模板2.0μL,10×PCR Buffer1.5μL,2.5mmol/L dNTP0.5μL,MgCl2 1.5μL,上、下游引物各0.5μL,Taq DNA聚合酶0.2μL,加灭菌水补足15μL。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,所述的用微卫星引物GP484进行PCR扩增,其PCR反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环,72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的鉴定方法,其特征在于,所述的将扩增产物进行电泳和染色,是将扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,220V稳压电泳3小时,然后用0.1%AgNO3溶液染色10min,银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL显色,至条带清晰为止。
7.权利要求1所述的微卫星引物GP484或权利要求2所述的试剂盒在鉴定斜带石斑、马拉巴石斑及其杂交子一代中的应用。
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