CN102382891B - 鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的pcr引物对及其应用 - Google Patents
鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的pcr引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对及其应用。本发明所提供的引物对为鉴定或辅助鉴定猫、牛、羊、猪和鸡组织和/或器官的共五个PCR引物对中，包含鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对在内的至少一种引物对；所述鉴定或辅助鉴定猫、猪、牛、羊和鸡组织和/或器官的共五个PCR引物对依次分别由序列1和序列2所示两条DNA单链、序列3和序列4所示两条DNA单链组成、序列5和序列6所示两条DNA单链、序列7和序列8所示两条DNA单链、序列9和序列10所示两条DNA单链组成。本发明五个引物对均选用了62℃的退火温度，实现了在同一温度一次PCR完成所有鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对及其应用，特别涉及可以鉴定或辅助鉴定猫、牛、羊、猪、鸡这五种动物中至少一种动物的组织和/或器官的PCR引物对。
背景技术
目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生，比如用猫肉冒充猪肉、牛肉和羊肉等。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能够适应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。
传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫反应，最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质(主要起作用的部分为抗原决定簇)结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括：1.热加工过程会改变蛋白质(抗原决定簇)的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉类的检测可能出现交叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性，检验的灵敏程度取决于制备的抗体的特异性强弱。
基于以上原因，以核酸为基础的检测方法成为近几年食品检测领域的发展方向，包括DNA分子杂交法和PCR方法等。DNA分子杂交法操作复杂，且成本较高，目前以逐渐被PCR方法所取代。PCR方法灵敏度高、特异性强，可对混合肉类进行鉴别和区分，即使掺杂少量异种肉，也能用PCR方法加以鉴别；PCR方法可用于热加工的肉制品鉴别当中，高温过程仅仅打断了核酸的片断，并不会完全降解核酸，因而热加工的肉制品当中仍然存在可扩增的模板，这在饲料工业肉骨粉来源的鉴别过程中得到了很好的证实；PCR反应的迅速，结果易于观测，使得这种检测方法目前广泛应用在饲料、保健品的动物源性成分的鉴别当中。
PCR技术中，引物设计是PCR成功的关键因素，好的引物将使检测实验更加快捷，结果更加清晰。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对或引物对组合物，以及利用所述引物对或引物对组合物鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中至少一种动物的组织和/或器官的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对既可为鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，也可为在含有鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对的前提下，再含有鉴定或辅助鉴定猫、猪、牛、羊、鸡组织和/或器官的5个PCR引物对中其余四个引物对中的全部、或任意三对、或任意两对、或任一对形成的引物对组合物。具体分为如下五种：
1、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的五个引物对组成，第一对引物是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，第二对引物是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，第三对引物是由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对，第四对引物是由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对，第五对引物是由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中的至少一种。
2、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的四个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外三个引物对为下述四个引物对中的任三个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中的至少一种。
3、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的三个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外两个引物对为下述四个引物对中的任两个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中的至少一种。
4、鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的两个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外一个引物对为下述四个引物对中的任一个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中的至少一种。
上述1中所述五个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1；上述2中所述四个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1∶1∶1∶1；上述3中所述三个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1∶1∶1；上述4中所述两个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1∶1。
5、鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，由两条单链DNA组成，所述两条DNA单链分别为序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA。
其中，序列表中的序列1由21个核苷酸组成，序列表中的序列2由18个核苷酸组成，序列表中的序列3由24个核苷酸组成，序列4由26个核苷酸组成，序列5由24个核苷酸组成，序列6由22个核苷酸组成，序列7由22个核苷酸组成，序列8由28个核苷酸组成，序列9由22个核苷酸组成，序列10由22个核苷酸组成。
上述动物组织和/或器官可来源于猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中任一种动物组织和/或器官，也可以来源于猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中的任两种、任三种、任四种或五种动物的混合组织和/或器官。
含有上述引物对组合物，或单独的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。
为了提高上述试剂盒的准确性，所述试剂盒除含有上述引物对组合物或单独的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对外，还含有限制性内切酶，所述限制性内切酶为EcoR I和/或Hind III；所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中的至少一种。
由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得猫肉线粒体16S rRNA基因的基因片段(如序列表中序列11所示)，该基因片段共有367个核苷酸，其中前21位和后18位分别为序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第130-135位是Hind III的识别序列。
由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得猪肉线粒体腺苷三磷酸酶VI亚基和VIII亚基基因的基因片段(如序列表中序列12所示)，该基因片段共有611个核苷酸，其中前24位和后26位分别为序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第133-138位是Hind III的识别序列。
由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得牛肉线粒体DNA细胞色素C氧化酶II亚基基因的基因片段(如序列表中序列13所示)，该基因片段共有494个核苷酸，其中前24位和后22位分别为序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第263-268位是Hind III的识别序列。
由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得羊肉线粒体DNA细胞色素B基因的基因片段(如序列表中序列14所示)，该基因片段共有716个核苷酸，其中前22位和后28位分别为序列表中序列7和序列8所示上下游引物，第253-258位是EcoR I的识别序列。
由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对，可PCR扩增获得鸡肉线粒体DNA腺苷三磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基基因的基因片段(如序列表中序列15所示)，该基因片段共有259个核苷酸，其中前22位和后22位分别为序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第97-102位是Hind III的识别序列。
本发明所提供的引物对组合物或引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述引物对组合物或引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括如下步骤：上述引物对组合物或引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和限制性内切酶，所述限制性内切酶为Hind III和/或EcoR I。所述动物为猫、猪、牛、羊、鸡中至少一种。
利用所述引物对组合物或引物对，或所述PCR试剂盒鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法也属于本发明的保护范围。
其中，利用所述引物对组合物或引物对，鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法包括下述1)和2)的步骤：
1)在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，优选为62℃，用上述四种引物对组合物中的任一种组合物，或单独鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的引物对进行PCR扩增；
2)检测步骤1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官：如果所述PCR产物中含有大小是330-380bp，如367bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是580-640bp，如611bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA片段，所述的DNA片段待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官。
所述检测所得到的PCR产物大小的方法是将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示330-380bp之间的一条带，如367bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示580-640bp之间的一条带，如611bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示460-520bp之间的一条带，如494bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示690-750bp之间的一条带，如716bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示230-270bp之间的一条带，如259bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官。
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、猪、牛、羊、鸡。
利用所述PCR试剂盒鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、猪、牛、羊、鸡这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法，包括下述a)-c)的步骤：
a)在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，优选为62℃，用所述试剂盒中的引物对组合物或引物对进行PCR扩增；
b)检测步骤a)得到的PCR产物的大小，根据PCR产物确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法同上；
c)对经步骤b)检测的PCR产物进行酶切鉴定，所述酶切鉴定的步骤及确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法为下述c1)-c5)中的至少一种：
c1)将所述大小是330-380bp，如367bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为100-150bp和200-250bp的两个片段，如132bp和235bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；
c2)将所述大小是580-640bp，如611bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为100-200bp和450-550bp的两个片段，如135bp和476bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；
c3)将所述大小为460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为200-300bp的两个片段，如265bp和229bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；
c4)将所述大小为690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被EcoR I酶切为200-300bp和400-500bp的两个片段，如255bp和461bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；
c5)将所述大小为230-270bp，如259bp的DNA片段用Hind III进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为50-100bp和150-200bp的两个片段，如99bp和160bp，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官；
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、猪、牛、羊、鸡。
所述待测动物组织和/或器官具体可为结缔组织(如血液)、肌肉组织。
本发明的猫、猪、牛、羊、鸡特异性引物，均选用了62℃的退火温度，实现了在同一温度一次PCR完成所有鉴别。同时，PCR产物的酶切鉴定，进一步增强了检测的精确度。本发明的检测方法特异性强，能鉴别掺杂猫、猪、牛、羊和/或鸡的组织和/或器官。整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，从提取基因组到酶切结束，最短仅需要8小时的时间(样品数量多时酌情延长)。
附图说明
图1为家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡5种肉类基因组的提取结果。其中，泳道M为DNA分子量标准DL15000，泳道1为家猫的基因组，泳道2为民猪的基因组，泳道3为黄牛的基因组，泳道4为山羊的基因组，泳道5为土鸡的基因组。
图2为猫特异引物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准50bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图3为猪特异引物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准100bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图4为牛特异引物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准50bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图5为羊特异引物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准100bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图6为鸡特异引物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准50bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图7为五个引物对组合物PCR检测家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准100bp Ladder，泳道1为家猫的PCR产物，泳道2为民猪的PCR产物，泳道3为黄牛的PCR产物，泳道4为山羊的PCR产物，泳道5为土鸡的PCR产物。
图8为五个引物对PCR扩增特异性片段的酶切结果。其中，泳道M为DNA分子量标准100bp Ladder，泳道1为家猫肌肉的PCR产物，泳道2为家猫PCR产物的酶切结果，泳道3为民猪肌肉的PCR产物，泳道4为民猪PCR产物的酶切结果，泳道5为黄牛肌肉的PCR产物，泳道6为黄牛PCR产物的酶切结果，泳道7为山羊肌肉的PCR产物，泳道8为山羊PCR产物的酶切结果，泳道9为土鸡肌肉的PCR产物，泳道10为土鸡PCR产物的酶切结果。
图9为五对引物对组合物PCR扩增掺杂猫肉的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准100bp Ladder，泳道1为掺杂0.1％猫肉的猪肉的PCR产物，泳道2为掺杂0.1％猫肉的牛肉的PCR产物、泳道3为掺杂0.1％猫肉的羊肉的PCR产物，泳道4为掺杂0.1％猫肉的鸡肉的PCR产物。
图10为猫特异性引物对PCR检测长毛猫、短毛猫，短毛虎皮猫肌肉样品结果。其中，泳道M为DNA分子量标准50bp Ladder，泳道1为长毛猫的PCR结果，泳道2为短毛猫的PCR结果，泳道3为短毛虎皮猫的PCR结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测动物纯肌肉样品
一、制备鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对
以猫肉线粒体16S核糖体RNA基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-AGCGCAACAATCAAAGCATCT-3′(序列表中的序列1)，下游引物的序列为5′-CGCGGCCGTTTAACTAGC-3′(序列表中的序列2)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增家猫的靶序列如序列表中序列11所示。序列表中的序列11的第130-135位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别为132bp和235bp。
以猪肉线粒体腺苷三磷酸酶VI亚基和VIII亚基基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3′(序列表中的序列3)，下游引物的序列为5′-TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3′(序列表中的序列4)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增民猪的靶序列如序列表中序列12所示。序列表中的序列12的第133-138位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别为135bp和476bp。
以牛肉线粒体DNA细胞色素C氧化酶II亚基基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3′(序列表中的序列5)，下游引物的序列为5′-GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3′(序列表中的序列6)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增黄牛的靶序列如序列表中序列13所示。序列表中的序列13的第263-268位是HindIII的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别为265bp和229bp。
以羊肉线粒体DNA细胞色素B基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3′(序列表中的序列7)，下游引物的序列为5′-GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3′(序列表中的序列8)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增山羊的靶序列如序列表中序列14所示。序列表中的序列14的第253-258位是EcoR I的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别为255bp和461bp。
以鸡肉线粒体DNA腺苷三磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基基因为靶基因，设计特异扩增该基因的引物对。上游引物的序列为5′-TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3′(序列表中的序列9)，下游引物的序列为5′-TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3′(序列表中的序列10)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增土鸡的靶序列如序列表中序列15所示。序列表中的序列15的第97-102位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度分别为99bp和160bp。
二、检测动物纯肌肉样品
1、检测样品的制备
该实验中的样品均是纯肌肉，分别是家猫、民猪、黄牛、山羊、土鸡肌肉样品。
2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的相关基因片段
1)样品基因组的提取
使用北京全式金生物技术有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit(货号EE101-01)提取步骤1中样品的基因组DNA。结果表明，步骤1中的所有样品使用该试剂盒均能有效提取到基因组，提取的数量在电泳检测时可见(如图1)，足够用作PCR反应的模板。
2)单重PCR和五重PCR反应及电泳检测
分别以上述步骤1中各个样品的基因组DNA为模板，利用如下五个引物对或者是所述五个引物对的组合物进行单重PCR和五重PCR：由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的引物对；由序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的引物对；由序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的引物对；由序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的引物对；由序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的引物对。
其中，单个引物对的PCR体系：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引物1.0μL，浓度为20μM的下游引物1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸水至20μL。
其中，当上游引物为序列1时，下游引物为序列2，此时PCR体系为扩增猫基因的PCR体系；当上游引物为序列3时，下游引物为序列4，此时PCR体系为扩增猪基因的PCR体系；当上游引物为序列5时，下游引物为序列6，此时PCR体系为扩增牛基因的PCR体系；当上游引物为序列7时，下游引物为序列8，此时PCR体系为扩增羊基因的PCR体系；当上游引物为序列9时，下游引物为序列10，此时PCR体系为扩增鸡基因的PCR体系。
五个引物对组合物的PCR体系：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引物(序列1、3、5、7和9所示单链DNA)各1.0μL，浓度为20μM的下游引物(序列2、4、6、8和10所示单链DNA)各1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸水至20μL。
PCR程序：95℃，5min预变性；95℃，30s，62℃，30s，72℃，45s，扩增反应进行30个循环；72℃，延伸5min；4℃，保温结束。
将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为1.5％-2％。
3、纯肌肉样品的PCR结果
电泳检测结果显示：(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中家猫的PCR扩增产物中得到一条大小330-380的条带(图2)，其它民猪、黄牛、山羊、土鸡的肌肉样品中没有该条带。说明猫特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(2)采用由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中民猪的PCR扩增产物中得到一条大小580-640bp的条带(图3)，其它家猫、黄牛、山羊、土鸡的肌肉样品中没有该条带。说明猪特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(3)采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中黄牛的PCR扩增产物中得到一条大小460-520bp的条带(图4)，其它家猫、民猪、山羊、土鸡的肌肉样品中没有该条带。说明牛特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(4)采用由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中山羊的PCR扩增产物中得到一条大小690-750bp的条带(图5)，其它家猫、民猪、黄牛、土鸡的肌肉样品中没有该条带。说明羊特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(5)采用由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对进行PCR反应，其中土鸡的PCR扩增产物中得到一条大小230-270bp的条带(图6)，其它家猫、民猪、黄牛、山羊的肌肉样品中没有该条带。说明鸡特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。(6)采用五个引物对组合物在同一反应体系中进行PCR反应，其中家猫的PCR扩增产物中只有一条330-380bp的条带，民猪的PCR扩增产物中只有一条大小580-640bp的条带，黄牛的PCR扩增产物中只有一条大小460-520bp的条带，山羊的PCR扩增产物中只有一条大小690-750bp的条带，土鸡的PCR扩增产物中只有一条大小230-270bp的条带(图7)。这一结果再次说明五种PCR引物对专一性非常好，与其他动物DNA没有交叉反应，没有非特异的杂带产生；另外，这一结果还表明，五种引物对可以同时使用，在检测灵敏度方面能达到与单独使用各引物对相同的效果，引物对组合物的形式使得一次PCR反应完成五种肉类的检测，大大节约了检测时间与成本。
4、酶切鉴定
将PCR扩增获得的家猫、民猪、黄牛、土鸡的条带使用Hind III进行酶切反应；山羊的条带使用EcoR I进行酶切反应。
酶切体系：10×Buffer 1.0μL，限制性内切酶0.5μL，PCR产物8.5μL，加双蒸水至20μL。
其中，当PCR产物为家猫、民猪、黄牛、土鸡的条带时，上述10×Buffer为与HindIII匹配使用的10×Buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1060A)，上述限制性内切酶为Hind III(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1060A；当PCR产物为山羊的条带时，上述10×Buffer为与EcoR I匹配使用的10×Buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1040A)，上述限制性内切酶为EcoR I(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1040A)。
酶切反应获得的产物进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为1.5％-2％。
结果显示：PCR扩增获得的家猫肌肉的条带被酶切为100-150bp和200-250bp的两条条带；PCR扩增获得的民猪肌肉的条带被酶切为100-200bp和450-550bp的两条条带；黄牛肌肉的条带被酶切为200-300bp的两条条带；山羊肌肉的条带被酶切为200-300bp和400-500bp的两条条带；土鸡肌肉的条带被酶切为50-100bp和150-200bp的两条条带(图8)。说明PCR产物符合最初的设计，不是非特异性扩增的结果，说明PCR反应结果真实有效。
5、测序验证
将家猫肌肉的PCR产物进行测序，结果表明家猫(序列表中的序列11)PCR产物的序列与NCBI数据库中家猫NC_001700的16S核糖体RNA基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为367bp。
将民猪肌肉的PCR产物进行测序，结果表明民猪(序列表中的序列12)PCR产物的序列与NCBI数据库中家猪AP003428.1基因腺苷酸磷酸酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为611bp。
将黄牛肌肉的PCR产物进行测序，结果表明黄牛(序列表中的序列13)PCR产物的序列与NCBI数据库中黄牛AY526085.1的细胞色素C氧化酶II亚基基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为494bp。
将山羊肌肉的PCR产物进行测序，结果表明山羊(序列表中的序列14)PCR产物的序列与NCBI数据库中山羊GU068049的细胞色素B基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为716bp。
将土鸡肌肉的PCR产物进行测序，结果表明土鸡(序列表中的序列15)PCR产物的序列与NCBI数据库中原鸡AY235571.1腺苷酸磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为259bp。
上述实验表明，本发明的检测方法特异性强，引物之间没有交叉反应。扩增产物符合预计的大小，且都能被设计好的限制性内切酶切割，说明扩增产物不是非特异性扩增的结果。整个结果清晰、可信度高。
实施例2检测掺杂肌肉样品
一、制备鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对
设计和制备方法同实施例1一。
二、检测动物肌肉样品
1、检测样品的制备
该实验中的样品是掺杂家猫肉的民猪肉、黄牛肉、山羊肉和土鸡肉：
1)掺杂猫肉的猪肉：
在99.9g猪肉中掺杂0.1g猫肉，制成0.1％的掺杂猫肉的猪肉。
2)掺杂猫肉的牛肉：
在99.9g牛肉中掺杂0.1g猫肉，制成0.1％的掺杂猫肉的牛肉。
3)掺杂猫肉的羊肉：
在99.9g羊肉中掺杂0.1g猫肉，制成0.1％的掺杂猫肉的羊肉。
4)掺杂猫肉的鸡肉：
在99.9g鸡肉中掺杂0.1g猫肉，制成0.1％的掺杂猫肉的鸡肉。
2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的相应基因片段
1)样品基因组的提取
制备方法同实施例1步骤二2。
2)PCR反应及电泳检测
分别以上述步骤1中各个样品的基因组DNA为模板，以序列表中序列1、3、5、7和9所示的上游引物和序列表中序列2、4、6、8和10所示的下游引物，进行PCR扩增反应。
其PCR反应(五个引物对组合物)体系为：10×Buffer 2.0μL(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μL，浓度为20μM的上游引物(序列1、3、5、7和9所示单链DNA)各1.0μL，浓度为20μM的下游引物(序列2、4、6、8和10所示单链DNA)各1.0μL，模板(总DNA)2.0μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μL，加双蒸水至20μL。
PCR程序：95℃，5min预变性；95℃，30s，62℃，30s，72℃，45s，扩增反应进行30个循环；72℃，延伸5min；4℃，保温结束。
将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为1.5％-2％。
3、掺杂猫肉的肌肉样品检测结果
电泳检测结果表明，掺杂0.1％猫肉的猪肉中得到两条大小分别为330-380bp和580-640bp的条带，掺杂0.1％猫肉的牛肉中得到两条大小分别为330-380bp和460-520bp的条带，掺杂0.1％猫肉的羊肉中得到两条大小分别为330-380bp和690-750bp的条带，掺杂0.1％猫肉的鸡肉中得到两条大小分别为330-380bp和230-270bp的条带(图9)。
4、测序验证
将如下PCR产物均进行测序：230-270bp(鸡)、330-380bp(猫)、460-520bp(牛)、580-640bp(猪)、690-750bp(羊)，结果表明家猫(序列表中的序列11)PCR产物的序列与NCBI数据库中家猫NC_001700的16S核糖体RNA基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为367bp，且在130-135位有HindIII酶切位点。民猪(序列表中的序列12)PCR产物的序列与NCBI数据库中家猪AP003428.1基因腺苷酸磷酸酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为611bp，且在133-138位有HindIII酶切位点；黄牛(序列表中的序列13)PCR产物的序列与NCBI数据库中黄牛AY526085.1的细胞色素C氧化酶II亚基基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为494bp，且在263-268位有HindIII酶切位点；山羊(序列表中的序列14)PCR产物的序列与NCBI数据库中山羊GU068049的细胞色素B基因片段的序列同源性达到98％以上，大小为716bp，且在253-258位有EcoRI酶切位点；土鸡(序列表中的序列15)PCR产物的序列与NCBI数据库中原鸡AY235571.1腺苷酸磷酸合成酶VI亚基和VIII亚基片段的序列同源性达到98％以上，大小为259bp，且在97-102位有HindIII酶切位点。
实施例3、利用鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对检测不同猫肉样品
一、制备鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对
设计和制备方法同实施例1步骤一。
二、检测各种猫肉样品
1、检测样品
检测样品为长毛猫、短毛猫和短毛虎皮猫肌肉。
2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的16S核糖体RNA基因片段
1)样品基因组的提取
同实施例1。
2)PCR反应
同实施例1。
将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2％。电泳检测结果表明长毛猫、短毛猫和短毛虎皮猫肌肉中均得到一条大小330-380bp的条带(图10)。这说明猫的引物对猫类具有通用性，能适合多种猫的鉴定。
3、测序验证
将所有的长毛猫、短毛猫和短毛虎皮猫肌肉的PCR产物进行测序，结果表明长毛猫(序列表中的序列16)、短毛猫(序列表中的序列17)和短毛虎皮猫(序列表中的序列18)肌肉的PCR产物的大小均为367bp，均在第130-135位有HindIII的识别位点。
Claims (13)
1.鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的五个引物对组成，第一对引物是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，第二对引物是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对，第三对引物是由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对，第四对引物是由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对，第五对引物是由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、牛、羊、猪、鸡中的至少一种。
2.鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，为下述1）-3）中任一种：
1）由独立包装的四个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外三个引物对为下述四个引物对中的任三个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、牛、羊、猪、鸡中的至少一种；
2）由独立包装的三个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外两个引物对为下述四个引物对中的任两个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、牛、羊、猪、鸡中的至少一种；
3）由独立包装的两个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，另外一个引物对为下述四个引物对中的任一个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链 DNA组成的鉴定或辅助鉴定猪组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定牛组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定羊组织和/或器官的PCR引物对、由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定鸡组织和/或器官的PCR引物对；所述动物为猫、牛、羊、猪、鸡中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的引物对组合物，其特征在于：权利要求1所述五个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1：1：1：1：1；权利要求2中1）所述四个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1：1：1：1；权利要求2中2）所述三个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1：1：1；权利要求2中3）所述两个引物对在PCR反应体系中的摩尔比为1：1。
4.鉴定或辅助鉴定猫组织和/或器官的PCR引物对，由两条单链DNA组成，所述两条DNA单链分别为序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA。
5.鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-4中任一所述的引物对组合物或引物对，和限制性内切酶，所述限制性内切酶为EcoR I和/或Hind III；所述动物为猫、牛、羊、猪、鸡中的至少一种。
6.权利要求1-4中任一所述的引物对组合物或引物对的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1-4中任一所述的引物对组合物或引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
7.权利要求5所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的引物对组合物或引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP和限制性内切酶；所述限制性内切酶为Hind III和/或EcoR I。
8.利用权利要求1-4中任一所述的引物对组合物或引物对鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、牛、羊、猪、鸡这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法，包括下述（1）和（2）的步骤：
所述（1）为如下A）-E）中任一步骤：
A）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求1所述的引物对组合物进行PCR扩增；
B）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求2中1）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
C）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板， 选用60-64℃的退火温度，用权利要求2中2）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
D）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求2中3）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
E）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求4所述的引物对进行PCR扩增；
（2）检测步骤（1）得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官：如果所述PCR产物中含有大小是330-380bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是580-640bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是460-520bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是690-750bp的DNA片段，所述的DNA片段待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是230-270bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官；
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、牛、羊、猪、鸡。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括下述（1）和（2）的步骤：
所述（1）为如下A）-E）中任一步骤：
A）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求1所述的引物对组合物进行PCR扩增；
B）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求2中1）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
C）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求2中2）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
D）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求2中3）所述的引物对组合物进行PCR扩增；
E）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求4所述的引物对进行PCR扩增；
（2）检测步骤（1）得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官：如果所述PCR产物中含有大小是367bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是611bp的DNA片段，所 述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是494bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是716bp的DNA片段，所述的DNA片段待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有大小是259bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官；
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、牛、羊、猪、鸡。
10.利用权利要求5所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否含有或候选含有猫、牛、羊、猪、鸡这五种动物中至少一种动物组织和/或器官的方法，包括下述a）-c）的步骤：
a）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求5所述试剂盒中的引物对组合物或引物对进行PCR扩增；
b）检测步骤a）得到的PCR产物的大小，确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官，方法如权利要求8步骤（2）所述；
c）对经步骤b）检测的PCR产物进行酶切鉴定，所述酶切鉴定的步骤及确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法为下述c1）-c5）中的至少一种：
c1）将所述大小是330-380bp的DNA片段用HindIII进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被HindIII酶切为100-150bp和200-250bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；
c2）将所述大小是580-640bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为100-200bp和450-550bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；
c3）将所述大小为460-520bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为200-300bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；
c4）将所述大小为690-750bp的DNA片段用EcoRⅠ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被EcoRⅠ酶切为200-300bp和400-500bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；
c5）将所述大小为230-280bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为50-100bp和150-200bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官；
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、牛、羊、猪、鸡。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述方法包括下述a）-c）的步骤：
a）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用62℃的退火温度，用权利要求5所述试剂盒中的引物对组合物或引物对进行PCR扩增；
b）检测步骤a）得到的PCR产物的大小，确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官，方法如权利要求9步骤（2）所述；
c）对经步骤b）检测的PCR产物进行酶切鉴定，所述酶切鉴定的步骤及确定所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有哪种或哪些动物组织和/或器官的方法为下述c1）-c5）中的至少一种：
c1）将所述大小是367bp的DNA片段用HindIII进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被HindIII酶切为132bp和235bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；
c2）将所述大小是611bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为135bp和476bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；
c3）将所述大小为494bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为265bp和229bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；
c4）将所述大小为716bp的DNA片段用EcoRⅠ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被EcoRⅠ酶切为255bp和461bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；
c5）将所述大小为259bp的DNA片段用Hind Ⅲ进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind Ⅲ酶切为99bp和160bp的两个片段，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官；
所述待测动物组织和/或器官来源于下述动物中的至少一种：猫、牛、羊、猪、鸡。
12.根据权利要求8或10所述方法，其特征在于：所述检测所得到的PCR产物大小的方法是将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示330-380bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示580-640bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示460-520bp之间的一条带，所述待测动物组织和/ 或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示690-750bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示230-280bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官。
13.根据权利要求12所述方法，其特征在于：所述检测所得到的PCR产物大小的方法是将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示367bp的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猫组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示611bp的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有猪组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示494bp的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有牛组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示716bp的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有羊组织和/或器官；如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示259bp的一条带，所述待测动物组织和/或器官中含有或候选含有鸡组织和/或器官。
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