CN104032010B - 鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的pcr引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对及其应用。本发明提供的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，为组合物1、组合物2、组合物3或组合物4；组合物1由clf、vvf和mv组成；组合物2由vvf、np和mv组成；组合物3由clf和mv组成；组合物4由vvf和mv组成。本发明还提供了鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的引物对mv。本发明中的四对引物中的每个单链DNA均选用了62℃的退火温度，实现了在同一温度一次PCR完成所有鉴定，且特异性强，检测过程耗时短。

Description

鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对及其应用
技术领域
本发明涉及鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对及其应用。
背景技术
目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生，比如用狐狸、貉子和水貂的肉冒充狗肉、牛肉和羊肉等。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能够适应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。
传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫反应，最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质(主要起作用的部分为抗原决定簇)结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括：1.热加工过程会改变蛋白质(抗原决定簇)的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉类的检测可能出现交叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性，检验的灵敏程度取决于制备的抗体的特异性强弱。
基于以上原因，以核酸为基础的检测方法成为近几年食品检测领域的发展方向，包括DNA分子杂交法和PCR方法等。DNA分子杂交法操作复杂，且成本较高，目前以逐渐被PCR方法所取代。PCR方法灵敏度高、特异性强，可对混合肉类进行鉴别和区分，即使掺杂少量异种肉，也能用PCR方法加以鉴别；PCR方法可用于热加工的肉制品鉴别当中，高温过程仅仅打断了核酸的片断，并不会完全降解核酸，因而热加工的肉制品当中仍然存在可扩增的模板，这在饲料工业肉骨粉来源的鉴别过程中得到了很好的证实；PCR反应迅速，结果易于观测，使得这种检测方法目前广泛应用在饲料、保健品的动物源性成分的鉴别当中。
PCR技术中，引物设计是PCR成功的关键因素，好的引物将是检测实验更加快捷，结果更加清晰。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，为组合物1、组合物2、组合物3或组合物4；
所述组合物1由独立包装的三个引物对组成，即由名称为clf的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对、名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对组成；所述clf由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述动物为家犬、水貂和狐狸这三种动物中的三种、两种或一种；
所述组合物2由独立包装的三个引物对组成，即由名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对、名称为np的鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的PCR引物对和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述np由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述动物为貉子、水貂和狐狸这三种动物中的三种、两种或一种；
所述组合物3由独立包装的两个引物对组成，即由名称为clf的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对组成；所述clf由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述动物为家犬和/或水貂；
所述组合物4由独立包装的两个引物对组成，即由名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述动物为狐狸和/或水貂。
上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物中，所述clf、所述vvf、所述np和所述mv可均独立包装。
其中，PCR引物对clf可从家犬的基因组中PCR扩增获得序列表中序列9所示的DNA片段，序列表中序列9共有688个核苷酸，其中前25位和后25位分别为序列表中序列1和序列2所示上下游引物。PCR引物对vvf可从狐狸的基因组中PCR扩增获得序列表中序列10所示的DNA片段，序列表中序列10共有375个核苷酸，其中前23位和后23位分别为序列表中序列3和序列4所示上下游引物。PCR引物对np可从貉子的基因组中PCR扩增获得序列表中序列11所示的DNA片段，序列表中序列11共有456个核苷酸，其中前23位和后20位分别为序列表中序列5和序列6所示上下游引物。PCR引物对mv可从水貂的基因组中PCR扩增获得序列表中序列12所示的DNA片段，序列表中序列12共有523个核苷酸，其中前22位和后23位分别为序列表中序列7和序列8所示上下游引物。
上述PCR引物对组合物中，PCR引物对clf、PCR引物对vvf、PCR引物对np、PCR引物对mv这四种引物对可以单独使用分别进行单独的PCR，也可以组合使用进行多重PCR。这四种引物对组合使用的方式有多种，可以是其中任两种引物对组合在一起使用，也可以是其中任三种引物对组合在一起使用，也可以是四种引物对组合在一起使用。
这四种引物对单独使用时，本申请的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物中这四种引物对的配比没有要求，可以根据待鉴定动物的数量定。这四种引物对组合使用时，组合在一起使用的各引物对的摩尔数相同。如这四种引物对组合在一起使用时，所述四种引物对的摩尔比为1：1：1：1。
本申请中，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。
本发明的另一个目的是提供鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对，名称为mv，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成。
本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的试剂或试剂盒。
本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的试剂或试剂盒。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的试剂或试剂盒，含有上述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对mv。
本发明的又一个目的是提供鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物或其试剂或试剂盒的制备方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物或其试剂或试剂盒的制备方法，包括将上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
本发明的又一个目的是提供鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对或其试剂或试剂盒的制备方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对或其试剂或试剂盒的制备方法，包括将上述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对中的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
本发明的又一个目的是提供上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物或其试剂或试剂盒在鉴定动物组织和/或器官中的应用。
所述鉴定动物组织和/或器官中的应用中，所述动物包括家犬、狐狸、貉子和水貂，具体可为家犬、狐狸、貉子和水貂这四种动物中四种、三种、两种或一种。
所述鉴定动物组织和/或器官中的应用包括下述(1)和(2)的步骤：
(1)在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，优选为62℃，用上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物进行PCR扩增得到PCR产物；
(2)K)或M)：
K)检测步骤(1)中得到的PCR产物的序列，如果PCR产物含有序列表中序列9的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有家犬组织和/或器官或候选含有家犬组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列9的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有家犬组织和/或器官或候选不含有家犬组织和/或器官；如果PCR产物含有序列表中序列10的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有狐狸组织和/或器官或候选含有狐狸组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列10的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有狐狸组织和/或器官或候选不含有狐狸组织和/或器官；如果PCR产物含有序列表中序列11的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有貉子组织和/或器官或候选含有貉子组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列11的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有貉子组织和/或器官或候选不含有貉子组织和/或器官；如果PCR产物含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官；
M)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有688bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有家犬组织和/或器官或候选含有家犬组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有688bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有家犬组织和/或器官或候选不含有家犬组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有375bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有狐狸组织和/或器官或候选含有狐狸组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有375bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有狐狸组织和/或器官或候选不含有狐狸组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有456bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有貉子组织和/或器官或候选含有貉子组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有456bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有貉子组织和/或器官或候选不含有貉子组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官。
所述鉴定动物组织和/或器官中的应用中，(1)的PCR体系中，每20μlPCR体系中含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物2.0μl，浓度均为20μM的序列1、3、5和7所示单链DNA各1.0μl，浓度均为20μM的序列2、4、6和8所示单链DNA各1.0μl，浓度为10μg/ml的待测动物组织和/或器官基因组DNA2.0μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl。所述PCR扩增的循环条件为先95℃、30s；然后62℃、30s，再72℃、45s，进行30个循环。
本发明的又一个目的是提供上述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对或其试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官中的应用。
所述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官中的应用包括下述(1)和(2)的步骤：
(1)以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，具体可为62℃，用上述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)L)或N)：
L)检测步骤(1)得到的PCR产物的序列，如果PCR产物含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官；
N)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果所述PCR产物不含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官。
所述鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官中的应用中，(1)的PCR体系中，每20μlPCR体系中含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物2.0μl，浓度为20μM的上游引物(序列表中序列7的单链DNA)1.0μl，浓度为20μM的下游引物(序列表中序列8的单链DNA)1.0μl，浓度为10μg/ml的待测动物组织和/或器官基因组DNA2.0μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl。所述PCR扩增的循环条件为先95℃、30s；然后62℃、30s，再72℃、45s，进行30个循环。
所述待测动物组织和/或器官具体可为结缔组织(如血液)、肌肉组织、毛和/或皮。
上文中，所述家犬(Canislupusfamiliaris)可为北京犬、松狮犬或沙皮犬，所述狐狸可为赤狐(Vulpesvulpes)、沙狐(Vulpescorsac)或北极狐(Alopexlagopus)，所述貉子(Nyctereutesprocyonoides)可为乌苏里貉、朝鲜貉或湖北貉，所述水貂(MustelaVison)可为欧洲水貂、金州黑色标准水貂或美国短毛黑貂。
本发明的家犬、狐狸、貉子、水貂的特异性引物(序列表中的序列1-8)，均选用了62℃的退火温度，实现了在同一温度一次PCR完成所有鉴别。本发明的检测方法特异性强，能鉴别掺杂家犬、狐狸、貉子、和/或水貂的组织和/或器官。整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，最短仅需要8小时的时间。
附图说明
图1为利用家犬特异引物对clf对动物肌肉样品进行单重PCR的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准100bpLadder，泳道1为赤狐的PCR产物，泳道2为沙狐的PCR产物，泳道3为北极狐的PCR产物，泳道4为乌苏里貉的PCR产物，泳道5为朝鲜貉的PCR产物，泳道6为湖北貉的PCR产物，泳道7为欧洲水貂的PCR产物，泳道8为金州黑色标准水貂的PCR产物，泳道9为美国短毛黑貂的PCR产物，泳道10为黄牛的PCR产物，泳道11为小尾寒羊的PCR产物，泳道12为东北民猪的PCR产物，泳道13为寿光鸡的PCR产物，泳道14为北京鸭的PCR产物，泳道15为新西兰兔PCR产物，泳道16为北京犬PCR产物，泳道17为松狮犬PCR产物，泳道18为沙皮犬PCR产物。
图2为利用狐狸特异引物对vvf对动物肌肉样品进行单重PCR的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准100bpLadder，泳道1为赤狐的PCR产物，泳道2为沙狐的PCR产物，泳道3为北极狐的PCR产物，泳道4为乌苏里貉的PCR产物，泳道5为朝鲜貉的PCR产物，泳道6为湖北貉的PCR产物，泳道7为欧洲水貂的PCR产物，泳道8为金州黑色标准水貂的PCR产物，泳道9为美国短毛黑貂的PCR产物，泳道10为黄牛的PCR产物，泳道11为小尾寒羊的PCR产物，泳道12为东北民猪的PCR产物，泳道13为寿光鸡的PCR产物，泳道14为北京鸭的PCR产物，泳道15为新西兰兔PCR产物，泳道16为北京犬PCR产物，泳道17为松狮犬PCR产物，泳道18为沙皮犬PCR产物。
图3为利用貉子特异引物np对动物肌肉样品进行单重PCR的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准100bpLadder，泳道1为赤狐的PCR产物，泳道2为沙狐的PCR产物，泳道3为北极狐的PCR产物，泳道4为乌苏里貉的PCR产物，泳道5为朝鲜貉的PCR产物，泳道6为湖北貉的PCR产物，泳道7为欧洲水貂的PCR产物，泳道8为金州黑色标准水貂的PCR产物，泳道9为美国短毛黑貂的PCR产物，泳道10为黄牛的PCR产物，泳道11为小尾寒羊的PCR产物，泳道12为东北民猪的PCR产物，泳道13为寿光鸡的PCR产物，泳道14为北京鸭的PCR产物，泳道15为新西兰兔PCR产物，泳道16为北京犬PCR产物，泳道17为松狮犬PCR产物，泳道18为沙皮犬PCR产物。
图4为利用水貂特异引物mv对动物肌肉样品进行单重PCR的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准100bpLadder，泳道1为赤狐的PCR产物，泳道2为沙狐的PCR产物，泳道3为北极狐的PCR产物，泳道4为乌苏里貉的PCR产物，泳道5为朝鲜貉的PCR产物，泳道6为湖北貉的PCR产物，泳道7为欧洲水貂的PCR产物，泳道8为金州黑色标准水貂的PCR产物，泳道9为美国短毛黑貂的PCR产物，泳道10为黄牛的PCR产物，泳道11为小尾寒羊的PCR产物，泳道12为东北民猪的PCR产物，泳道13为寿光鸡的PCR产物，泳道14为北京鸭的PCR产物，泳道15为新西兰兔PCR产物，泳道16为北京犬PCR产物，泳道17为松狮犬PCR产物，泳道18为沙皮犬PCR产物。
图5为利用家犬特异引物对clf、狐狸特异引物对vvf、貉子特异引物np和水貂特异引物mv对动物肌肉样品进行多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA分子量标准100bpLadder，泳道1为赤狐的PCR产物，泳道2为沙狐的PCR产物，泳道3为北极狐的PCR产物，泳道4为乌苏里貉的PCR产物，泳道5为朝鲜貉的PCR产物，泳道6为湖北貉的PCR产物，泳道7为欧洲水貂的PCR产物，泳道8为金州黑色标准水貂的PCR产物，泳道9为美国短毛黑貂的PCR产物，泳道10为黄牛的PCR产物，泳道11为小尾寒羊的PCR产物，泳道12为东北民猪的PCR产物，泳道13为寿光鸡的PCR产物，泳道14为北京鸭的PCR产物，泳道15为新西兰兔PCR产物，泳道16为北京犬PCR产物，泳道17为松狮犬PCR产物，泳道18为沙皮犬PCR产物，泳道19为掺杂掺杂肌肉样品PCR产物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、单重PCR检测动物纯肌肉样品
一、制备鉴定或辅助鉴定家犬、狐狸、貉子和水貂的组织和/或器官的PCR引物对组合物
本步骤的鉴定或辅助鉴定家犬、狐狸、貉子和水貂组织和/或器官的PCR引物对组合物，由名称为clf的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对(简称家犬特异引物对clf)、名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对(简称狐狸特异引物对vvf)、名称为np的鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的PCR引物对(简称貉子特异引物对np)和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对(简称水貂特异引物对mv)组成；所述clf由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述np由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成。
上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物中，所述clf、所述vvf、所述np和所述mv独立包装。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。
二、检测动物纯肌肉样品
1、检测样品的制备
实验动物分别是北京犬、松狮犬、沙皮犬、赤狐、沙狐、北极狐、乌苏里貉、朝鲜貉、湖北貉、欧洲水貂、金州黑色标准水貂、美国短毛黑貂、黄牛、小尾寒羊、东北民猪、寿光鸡、北京鸭、新西兰兔。每种动物分别取10个个体，将每个个体的肌肉作为检测样品。
2、利用步骤一的PCR引物对组合物对样品的基因组进行PCR扩增
1)样品基因组的提取
使用北京全式金生物技术有限公司EasyPureGenomicDNAExtractionKit(货号EE101-01)提取步骤1中样品的基因组DNA。结果表明，步骤1中的所有样品使用该试剂盒均能有效提取到基因组，提取的数量在电泳检测时可见，足够用作PCR反应的模板。
2)单重PCR反应及电泳检测
分别以上述步骤1中各个样品的基因组DNA为模板，利用如下四种引物对中的一种引物对进行单重PCR：由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的引物对clf；由序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的引物对vvf；由序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的引物对np；由序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的用于鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的引物对mv。
其中，clf单重PCR体系、vvf单重PCR体系、np单重PCR体系和mv单重PCR体系均为：10×Buffer2.0μl(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μl，浓度为20μM的上游引物1.0μl，浓度为20μM的下游引物1.0μl，模板(浓度为10μg/ml的基因组DNA)2.0μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μl，加双蒸水至20μl。
其中，clf单重PCR体系中的上游引物为序列1，下游引物为序列2，该PCR体系为扩增家犬基因的PCR体系；vvf单重PCR体系中上游引物为序列3，下游引物为序列4，该PCR体系为扩增狐狸基因的PCR体系；np单重PCR体系中上游引物为序列5，下游引物为序列6，该PCR体系为扩增貉子基因的PCR体系；mv单重PCR体系中上游引物为序列7，下游引物为序列8，该PCR体系为扩增水貂基因的PCR体系。
各种单重PCR的PCR程序均为：95℃，5min预变性；先95℃、30s，然后62℃、30s，再72℃、45s，扩增反应进行30个循环；72℃，延伸5min；16℃，保温结束。
将各种单重PCR获得的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2％。
3、纯肌肉样品的PCR结果
电泳检测结果显示：(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对clf进行PCR反应，家犬——北京犬、松狮犬和沙皮犬的所有个体的PCR扩增产物均为一条大小为600-700bp的条带(北京犬的该条带简称北京犬PCR特异条带，松狮犬的该条带简称松狮犬PCR特异条带，沙皮犬的该条带简称沙皮犬PCR特异条带)(图1)，赤狐、沙狐、北极狐、乌苏里貉、朝鲜貉、湖北貉、欧洲水貂、金州黑色标准水貂、美国短毛黑貂、黄牛、小尾寒羊、东北民猪、寿光鸡、北京鸭、新西兰兔的PCR扩增产物中均没有DNA条带。说明鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对clf专一性非常好，与其他动物没有交叉反应，没有非特异的杂带产生。分别回收北京犬的所有个体的北京犬PCR特异条带、分别回收松狮犬的所有个体的松狮犬PCR特异条带、分别回收沙皮犬的所有个体的沙皮犬PCR特异条带进行测序，测序结果表明北京犬的所有个体的北京犬PCR特异条带序列、松狮犬的所有个体的松狮犬PCR特异条带序列和沙皮犬的所有个体的沙皮犬PCR特异条带序列均相同，均如序列表中的序列9所示，大小均为688bp。
(2)采用由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对vvf进行PCR反应，狐狸——赤狐、沙狐和北极狐的所有个体中的PCR扩增产物均为一条大小为300-400bp的条带(赤狐的该条带简称赤狐PCR特异条带，沙狐的该条带简称沙狐PCR特异条带，北极狐的该条带简称北极狐PCR特异条带)(图2)，北京犬、松狮犬、沙皮犬、乌苏里貉、朝鲜貉、湖北貉、欧洲水貂、金州黑色标准水貂、美国短毛黑貂、黄牛、小尾寒羊、东北民猪、寿光鸡、北京鸭、新西兰兔的PCR扩增产物中均没有DNA条带。说明鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对vvf专一性非常好，与其他动物没有交叉反应，没有非特异的杂带产生。分别回收赤狐的所有个体的赤狐PCR特异条带、分别回收沙狐的所有个体的沙狐PCR特异条带、分别回收北极狐的所有个体的北极狐PCR特异条带进行测序，测序结果表明赤狐的所有个体的赤狐PCR特异条带序列、沙狐的所有个体的沙狐PCR特异条带序列和北极狐的所有个体的北极狐PCR特异条带序列均相同，均如序列表中的序列10所示，大小均为375bp。
(3)采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的PCR引物对np进行PCR反应，貉子——乌苏里貉、朝鲜貉和湖北貉的所有个体中的PCR扩增产物均为一条大小为400-500bp的条带(乌苏里貉的该条带简称乌苏里貉PCR特异条带，朝鲜貉的该条带简称朝鲜貉PCR特异条带，湖北貉的该条带简称湖北貉PCR特异条带)(图3)，北京犬、松狮犬、沙皮犬、赤狐、沙狐、北极狐、欧洲水貂、金州黑色标准水貂、美国短毛黑貂、黄牛、小尾寒羊、东北民猪、寿光鸡、北京鸭、新西兰兔的PCR扩增产物中均没有DNA条带。说明鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的PCR引物对np专一性非常好，与其他动物没有交叉反应；没有非特异的杂带产生。分别回收乌苏里貉的所有个体的乌苏里貉PCR特异条带、分别回收朝鲜貉的所有个体的朝鲜貉PCR特异条带、分别回收湖北貉的所有个体的湖北貉PCR特异条带进行测序，测序结果表明乌苏里貉的所有个体的乌苏里貉PCR特异条带序列、朝鲜貉的所有个体的朝鲜貉PCR特异条带序列和湖北貉的所有个体的湖北貉PCR特异条带序列均相同，均如序列表中的序列11所示，大小均为456bp。
(4)采用由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对mv进行PCR反应，水貂——欧洲水貂、金州黑色标准水貂和美国短毛黑貂的所有个体中的PCR扩增产物均为一条大小为500-600bp的条带(欧洲水貂的该条带简称欧洲水貂PCR特异条带，金州黑色标准水貂的该条带简称金州黑色标准水貂PCR特异条带，美国短毛黑貂的该条带简称美国短毛黑貂PCR特异条带)(图4)，北京犬、松狮犬、沙皮犬、赤狐、沙狐、北极狐、乌苏里貉、朝鲜貉、湖北貉、黄牛、小尾寒羊、东北民猪、寿光鸡、北京鸭、新西兰兔的PCR扩增产物中均没有DNA条带。说明鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对mv专一性非常好，与其他动物没有交叉反应，没有非特异的杂带产生。分别回收欧洲水貂的所有个体的欧洲水貂PCR特异条带、分别回收金州黑色标准水貂的所有个体的金州黑色标准水貂PCR特异条带、分别回收美国短毛黑貂的所有个体的美国短毛黑貂PCR特异条带进行测序，测序结果表明欧洲水貂的所有个体的欧洲水貂PCR特异条带序列、金州黑色标准水貂的所有个体的金州黑色标准水貂PCR特异条带序列和美国短毛黑貂的所有个体的美国短毛黑貂PCR特异条带序列均相同，均如序列表中的序列12所示，大小均为523bp。
上述实验表明，本发明的检测方法特异性强，引物之间没有交叉反应。扩增产物符合预计的大小，说明扩增产物不是非特异性扩增的结果。整个结果清晰、可信度高。
实施例2、多重PCR检测掺杂肌肉样品
一、制备鉴定或辅助鉴定家犬、狐狸、貉子和水貂的组织和/或器官的PCR引物对组合物
本步骤的鉴定或辅助鉴定家犬、狐狸、貉子和水貂组织和/或器官的PCR引物对组合物，由名称为clf的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对(简称家犬特异引物对clf)、名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对(简称狐狸特异引物对vvf)、名称为np的鉴定或辅助鉴定貉子组织和/或器官的PCR引物对(简称貉子特异引物对np)和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对(简称水貂特异引物对mv)组成；所述clf由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述np由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成。
上述鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物中，所述clf、所述vvf、所述np和所述mv独立包装，这四种PCR引物对的摩尔比为1:1:1:1。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。
二、检测动物掺杂肌肉样品
1、掺杂肌肉样品的制备
掺杂肌肉样品由0.1g北京犬肌肉、0.1g赤狐肌肉、0.1g乌苏里貉肌肉、0.1g欧洲水貂肌肉、20.0g黄牛肌肉、20.0g小尾寒羊肌肉、20.0g东北民猪肌肉、20.0g寿光鸡肌肉、10.0g北京鸭肌肉、9.6g新西兰兔肌肉组成，将这些组分混匀后进行下述实验。
同时以未掺杂的纯北京犬肌肉、未掺杂的纯松狮犬肌肉、未掺杂的纯沙皮犬肌肉、未掺杂的纯赤狐肌肉、未掺杂的纯沙狐肌肉、未掺杂的纯北极狐肌肉、未掺杂的纯乌苏里貉肌肉、未掺杂的纯朝鲜貉肌肉、未掺杂的纯湖北貉肌肉、未掺杂的纯欧洲水貂肌肉、未掺杂的纯金州黑色标准水貂肌肉、未掺杂的纯美国短毛黑貂肌肉、未掺杂的纯黄牛肌肉、未掺杂的纯小尾寒羊肌肉、未掺杂的纯东北民猪肌肉、未掺杂的纯寿光鸡肌肉、未掺杂的纯北京鸭肌肉、未掺杂的纯新西兰兔肌肉分别作为对照肌肉样品。每种样品均取3份，同时进行下述实验。
2、利用步骤一的PCR引物对组合物对样品的基因组进行PCR扩增
1)样品基因组的提取
使用北京全式金生物技术有限公司EasyPureGenomicDNAExtractionKit(货号EE101-01)分别提取步骤1中掺杂肌肉样品和各种纯肌肉样品的基因组DNA。
2)PCR反应及电泳检测
以上述步骤1中掺杂肌肉样品的基因组DNA和10种对照肌肉样品分别为模板，分别进行多重PCR扩增，体系均为：10×Buffer2.0μl(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030)2.0μl，浓度均为20μM的序列1、3、5和7所示单链DNA(上游引物)各1.0μl，浓度均为20μM的序列2、4、6和8所示单链DNA(下游引物)各1.0μl，模板(浓度为10μg/ml的基因组DNA)2.0μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A)0.5μl，加双蒸水至20μl。
PCR程序均为：95℃，5min预变性；先95℃、30s，然后62℃、30s，再72℃、45s，扩增反应进行30个循环；72℃，延伸5min；16℃，保温结束。
3)电泳检测
将2)PCR反应获得的产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，如图5所示。电泳结果表明3份掺杂肌肉样品的PCR产物均为四种条带，大小分别为600-700bp、300-400bp、400-500bp和500-600bp，分别回收这四种条带进行测序，测序结果表明3份掺杂肌肉样品的600-700bp条带的序列均如序列表中的序列9所示，大小均为688bp；测序结果表明3份掺杂肌肉样品的300-400bp条带的序列均如序列表中的序列10所示，大小均为375bp；测序结果表明3份掺杂肌肉样品的400-500bp条带的序列均如序列表中的序列11所示，大小均为456bp；测序结果表明3份掺杂肌肉样品的500-600bp条带的序列均如序列表中的序列12所示，大小均为523bp。3份未掺杂的纯北京犬肌肉的PCR产物均为600-700bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯北京犬肌肉样品的600-700bp条带的序列均如序列表中的序列9所示，大小均为688bp。3份未掺杂的纯松狮犬肌肉的PCR产物均为600-700bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯松狮犬肌肉样品的600-700bp条带的序列均如序列表中的序列9所示，大小均为688bp。3份未掺杂的纯沙皮犬肌肉的PCR产物均为600-700bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯沙皮犬肌肉样品的600-700bp条带的序列均如序列表中的序列9所示，大小均为688bp。3份未掺杂的纯赤狐肌肉的PCR产物均为300-400bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯赤狐肌肉样品的300-400bp条带的序列均如序列表中的序列10所示，大小均为375bp。3份未掺杂的纯沙狐肌肉的PCR产物均为300-400bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯沙狐肌肉样品的300-400bp条带的序列均如序列表中的序列10所示，大小均为375bp。3份未掺杂的纯北极狐肌肉的PCR产物均为300-400bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯北极狐肌肉样品的300-400bp条带的序列均如序列表中的序列10所示，大小均为375bp。3份未掺杂的纯乌苏里貉肌肉的PCR产物均为400-500bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯乌苏里貉肌肉样品的400-500bp条带的序列均如序列表中的序列11所示，大小均为456bp。3份未掺杂的纯朝鲜貉肌肉的PCR产物均为400-500bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯朝鲜貉肌肉样品的400-500bp条带的序列均如序列表中的序列11所示，大小均为456bp。3份未掺杂的纯湖北貉肌肉的PCR产物均为400-500bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯湖北貉肌肉样品的400-500bp条带的序列均如序列表中的序列11所示，大小均为456bp。3份未掺杂的纯欧洲水貂肌肉的PCR产物均为500-600bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯欧洲水貂肌肉样品的500-600bp条带的序列均如序列表中的序列12所示，大小均为523bp。3份未掺杂的纯金州黑色标准水貂肌肉的PCR产物均为500-600bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯金州黑色标准水貂肌肉样品的500-600bp条带的序列均如序列表中的序列12所示，大小均为523bp。3份未掺杂的纯美国短毛黑貂肌肉的PCR产物均为500-600bp的一个条带，回收该条带进行测序，测序结果表明3份未掺杂的纯美国短毛黑貂肌肉样品的500-600bp条带的序列均如序列表中的序列12所示，大小均为523bp。3份未掺杂的纯黄牛肌肉的PCR产物均没有DNA条带，3份未掺杂的纯小尾寒羊肌肉的PCR产物均没有DNA条带，3份未掺杂的纯东北民猪肌肉的PCR产物均没有DNA条带，3份未掺杂的纯寿光鸡肌肉的PCR产物均没有DNA条带，3份未掺杂的纯北京鸭肌肉的PCR产物均没有DNA条带，3份未掺杂的纯新西兰兔肌肉的PCR产物均没有DNA条带。
另外，上述实验结果还表明，四种引物对可以同时使用，在检测灵敏度方面能达到与单独使用各引物对相同的效果，引物对组合物的形式使得一次PCR反应完成四种肉类的检测，大大节约了检测时间与成本。

Claims (5)

1.鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物，由独立包装的三个引物对组成，即由名称为clf的鉴定或辅助鉴定家犬组织和/或器官的PCR引物对、名称为vvf的鉴定或辅助鉴定狐狸组织和/或器官的PCR引物对和名称为mv的鉴定或辅助鉴定水貂组织和/或器官的PCR引物对组成；所述clf由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述vvf由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述mv由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述动物为家犬、水貂和狐狸这三种动物。
2.鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有权利要求1所述的PCR引物对组合物；所述动物为家犬、狐狸和水貂这三种动物。
3.权利要求1所述的PCR引物对组合物或权利要求2所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述的PCR引物对组合物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
4.权利要求1所述的PCR引物对组合物或权利要求2所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官中的应用，所述动物为家犬、水貂和狐狸这三种动物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括下述（1）和（2）的步骤：
（1）在同一个PCR反应体系中，以待测动物组织和/或器官的基因组DNA为模板，选用60-64℃的退火温度，用权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定动物组织和/或器官的PCR引物对组合物进行PCR扩增得到PCR产物；
（2）K）或M）：
K）检测步骤（1）中得到的PCR产物的序列，如果PCR产物含有序列表中序列9的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有家犬组织和/或器官或候选含有家犬组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列9的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有家犬组织和/或器官或候选不含有家犬组织和/或器官；如果PCR产物含有序列表中序列10的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有狐狸组织和/或器官或候选含有狐狸组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列10的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有狐狸组织和/或器官或候选不含有狐狸组织和/或器官；如果PCR产物含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果PCR产物不含有序列表中序列12的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官；
M）检测步骤（1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有688bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有家犬组织和/或器官或候选含有家犬组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有688bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有家犬组织和/或器官或候选不含有家犬组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有375bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有狐狸组织和/或器官或候选含有狐狸组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有375bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有狐狸组织和/或器官或候选不含有狐狸组织和/或器官；如果所述PCR产物中含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中含有水貂组织和/或器官或候选含有水貂组织和/或器官；如果所述PCR产物中不含有523bp的DNA片段，所述待测动物组织和/或器官中不含有水貂组织和/或器官或候选不含有水貂组织和/或器官。
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