CN101768640A - 河豚鱼成分荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用，系选择不同种河豚鱼之间比较保守的细胞色素B基因片段为靶目标序列，经过精心设计并合成，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为102bp，引物和探针序列为：引物：Takifugu TF：5′-TCTTCACGAAACAGGCTCCAAC-3′，Takifugu TR：5′-GTGAAGCCCAGGAGGTCTTTGTA-3′，探针：5′-FAM-CGCAGACAAAATCCCATTCCACCCATA-TAMRA-3′；本发明是一种对混入鱼糜制品中的河豚鱼成分具有特异性高、敏感性强，快速检测的荧光定量PCR检测试剂；本发明的方法设计合理，定性准确。

Description

河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR检测试剂，具体涉及河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用。

背景技术

河豚鱼肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，享有“鱼中之王”的美誉，备受美食家的青睐，在日本和韩国也很受喜爱。但是河豚鱼内脏、卵巢、血液、鱼皮、鱼头等部位含有剧毒，如加工处理不当或误食常会引起中毒，甚至死亡。一般人由于没有相关的专业知识，有时也会因为不能识别河豚鱼而误食引起中毒死亡，尤其是对于各种已经加工成鱼片、鱼糜等产品，很难靠人的感观来识别的；近年来，有人故意和无意把河豚鱼下脚料加工成鱼片或鱼糜，混在其他鱼产品中，销售倒市场上，甚至是国外，引起了食物中毒事件，这一定程度上影响了我国的鱼糜制品的信誉和销售。为防止鱼糜中掺杂河豚鱼成分引起中毒事件，日本检疫部门专门建立了河豚鱼成分的检测方法，其建立的方法是基因序列分析的方法，该方法操作复杂，耗时费力，对分析人员的检测技术要求也比较高。我国尚无河豚鱼成分检测方法的研究报道。

目前对河豚鱼的检测方法，尚没有相关成分检测的报道，多集中于河豚鱼毒素的检测。人们对河豚毒素的检测方法的研究，相继出现了小鼠生物实验法、荧光法、ELISA方法、气相色谱-质谱联用、毛细管等速电泳、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱法等检测方法。对物种成分的检测研究，目前主要集中在牛羊源成分和转基因成分等的检测研究。物种成分的检测方法主要包括生物学鉴定、ELISA法、近红外光谱法和聚合酶链式反应(PCR)技术等。生物学鉴定和近红外光谱法，费时间，工作量非常大，检测灵敏度不高。由于饲料样品中所含的骨胶等物质会与抗体发生交叉反应从而干扰ELISA结果，使得ELISA法的检测灵敏度低，所以只能用来作为粗筛的方法。PCR是用于检测混入放入其他物种成分，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

荧光定量PCR(Real-time fluorescent PCR)是近几年发展起来的PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。该Ct值与反应体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系。因此，除了可定性确定反应体系中是否含有目标DNA之外，还可以对反应体系中的模板DNA进行相对定量。荧光定量PCR检测方法由于操作简便，快速灵敏，对环境污染小等优点而被广泛的应用于各种转基因、牛羊源成分的检测中。

因此，研究建立特异、敏感、可对低含量的河豚鱼成分进行准确检测的方法，在检疫方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对混入鱼糜制品中的河豚鱼成分具有特异性高、敏感性强，快速检测的荧光定量PCR检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择河豚鱼线粒体细胞色素B基因的保守片段为靶目标，应用primerExpress 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为102bp，引物和探针序列为：

引物：Takifugu TF：5′-TCTTCACGAA ACAGGCTCCA AC-3′

      Takifugu TR：5′-GTGAAGCCCA GGAGGTCTTT GTA-3′

探针：5′-FAM-CGCAGACAAA ATCCCATTCC  ACCCATA-TAMRA-3′，

该检测试剂还包括PCR检测试剂的常用缓冲液。

本发明所述的河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂的制备方法，由下述步骤组成：

一、选择河豚鱼线粒体细胞色素B基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag    50

acaaaatccc attccaccca tacttctctt acaaagacct cctaggcttc    100

ac                                                        102

二、应用primer Express 3.0软件，设计引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团TAMRA；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的上述一对引物和一条探针。这样就制备得到对河豚鱼成分特异性高、敏感性强的荧光定量PCR检测试剂；该方法设计合理，定性准确。

本发明的河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂是将PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率高和特异性好的一对引物和一条探针，该检测试剂可以对鱼糜中混入的河豚鱼成分作出准确定性和快速灵敏的检测，该检测试剂对河豚鱼成分具有特异性好和稳定性好的优点。该检测试剂还克服了常规PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的河豚鱼成分进行快速准确的定性检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。具体优点如下：

1、本发明与常规PCR检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；本发明可对样品中低含量的河豚鱼成份进行准确检测。

2、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有适用范围广，使用安全的优点；适用范围广；本发明克服了常规PCR的产物须电泳检测、接触有毒试剂的缺点，降低了生物安全隐患，提高了使用安全性。

3、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有检测量大和快速检测的优点；可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少DNA或PCR产物污染的风险；常规PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在4小时之内。

4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个客观的估计，判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值。

5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测实际样品中河豚鱼成分的特异、敏感和稳定的方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物和探针

本发明选择河豚鱼线粒体细胞色素B基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的各种河豚鱼细胞色素B基因序列(基因序列号EU274422.1)进行同源性分析比较，选定河豚鱼特征基因的保守片段(102bp)，应用primer Express 3.0软件，设计引物和探针。引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针，合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团为TAMRA。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的上述一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为102bp的上述扩增目标核苷酸序列。

2、DNA提取

采用异硫氰酸胍法快速提取样品总DNA。取30mg样品粉末于1.5mL离心管中，加入600μL异硫氰酸胍(5mol/L)裂解液，充分混匀后室温静置30min以上，12000r/min离心10min，取上清；等体积氯仿抽提1次，取上清，再加入等体积异丙醇，室温沉淀10min，然后12000r/min离心10min，弃上清；75％乙醇洗涤1次，晾干后，加入30μL双蒸水溶解

3、CytB荧光定量PCR扩增

CytB荧光定量PCR采用20μL体积反应液，在罗氏型荧光定量PCR仪(Ligntcycler2.0)中，按下列反应参数进行：，94℃预变性10sec；94℃变性10sec，58℃延伸20sec，扩增40个循环。

引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立阳性对照和阴性对照：阳性对照采用克隆河豚鱼线粒体细胞色素B基因的保守片段的质粒；阴性对照空质粒每个样品检测做3管平行试验。在阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判断结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

4、河豚鱼成分荧光定量PCR的特异性和敏感性试验

采用对暗鳍腹刺魨 黑腮兔头魨、棕班腹刺魨、阳性质粒、青占鱼、竹荚鱼、鱿鱼、带鱼、三文鱼进行特异性比较检测。结果只有鳍腹刺魨黑腮兔头魨、棕班腹刺魨、阳性质粒出现了扩增曲线。提取阳性质粒，用分光光度计测定其OD值来计算模板DNA的拷贝数，再对其进行十倍比稀释，进行敏感性试验，检测限量可以到100拷贝数左右

5、河豚鱼成分荧光定量PCR的稳定性和重复性试验

在评估荧光定量PCR检测河豚鱼成分方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

6、引物和探针及其浓度的筛选

选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量PCR反应的最低Ct值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用不同DNA模板浓度的标准阳性样品，对设计的引物与探针，采用矩阵法优选得到所述引物和探针的最佳浓度。

7、对样品的检测

对鱼糜中混入河豚鱼成分的样品进行荧光定量PCR检测，结果表明，阳性样品均具有典型的扩增曲线，Ct值小于35.0，阴性对照及阴性样品均无典型扩增曲线，也无Ct值。三个平行试验的结果稳定一致。证明荧光定量PCR检测河豚鱼成分的特异性强、敏感度高和重复性好。

8、河豚鱼成分荧光定量PCR标准化试剂盒和检测程序

8.1标准化试剂盒组份(20μL反应×25次)：

蛋白酶K	0.7mL
		裂解液(Buffer ATL)	5mL
抽提液(Buffer AL)	6mL
		洗脱液1(Buffer AW1)	10mL
洗脱液2(Buffer AW2)	7mL
		DNA溶解液(Buffer AE)	11mL
溶液I(PCR缓冲液，含引物和探针)	200μL
		溶液II(Taq DNA聚合酶，5U/μL)	10μL
溶液III(DEPC处理水)	1.25μL

蛋白酶K	0.7mL
		溶液IV(阳性对照，含有河豚鱼成分阳性DNA)	25μL
溶液V(阴性对照，不含有河豚鱼成分阳性DNA)	25μL

按照优化的反应条件配制。

8.2操作方法

8.2.1DNA提取

(1)取样品组织25mg磨碎混匀，放入1.5mL的离心管中，加入180μL Buffer ATL。

(2)加入20μL蛋白酶K，振荡混匀，在56℃温育至到组织被完全溶解，在温育过程中适时振荡消化样品。

(3)振荡15秒，加入200μL Buffer AL到样品中，振荡混匀，再加入200μL酒精(96-100％)，振荡混匀，得到样品混合物。

(4)将上述样品混合物加入滤膜离心管(Dneasy Mini spin column)，再装入2mL收集管中离心，8000rpm，1分钟，收集滤膜离心管。

(5)接着将收集的Dneasy Mini spin column装入新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW1离心，1分钟，8000rpm，再次收集滤膜离心管。

(6)将再次收集的Dneasy Mini spin column再装入新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW2离心，3分钟，14000rpm，又一次收集滤膜离心管。

(7)将又一次收集的Dneasy Mini spin column装入一干净的1.5mL收集管中，加入200μL BufferAE，直接加在滤膜上，在常温下温育1分钟，离心，1分钟，8000rpm，收集滤液。-20℃保存备用。

9.2.2反应组份配制

(1)取一支200μL光学PCR反应管，反应总体积为20μL，向反应管中加入下列反应物：

(2)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管。

8.2.3扩增

在罗氏型荧光定量PCR仪(Ligntcycler 2.0)中，按下列反应参数进行：，94℃预变性10sec；94℃变性10sec，58℃延伸20sec，扩增40个循环。

8.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

阈值线设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

(2)质控标准

——阴性对照无Ct值，并且无典型扩增曲线。

——阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，

(3)结果描述及判定

——阴性

无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无河豚鱼成分。

——阳性

Ct值应小于等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在河豚鱼成分。

——有效原则

Ct值在35.0～40.0的样本建议重做。重做结果无Ct值或无典型扩增曲线判为阴性，否则判为阳性。

序列表

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

<120>河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据河豚鱼线粒体细胞色素B基因设计的用于检测河豚鱼成分的特异性荧光探针序列

<400>1

5′-CGCAGACAAA ATCCCATTCC  ACCCATA-3′27

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据河豚鱼线粒体细胞色素B基因设计的用于检测河豚鱼成分的特异性引物序列

<400>2

5′-TCTTCACGAA  ACAGGCTCCA  AC -3′22

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据河豚鱼线粒体细胞色素B基因设计的用于检测河豚鱼成分的特异性引物序列

<400>3

5′-GTGAAGCCCA  GGAGGTCTTT  GTA-3′23

<210>4

<211>102

<212>DNA

<213>河豚鱼线粒体细胞色素B基因

<400>4

tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag     50

acaaaatccc attccaccca tacttctctt  acaaagacct  cctaggcttc   100

ac                                                         102

Claims (3)

1.河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂，其特征在于该检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为102bp，引物和探针序列分别如下所述：

引物：Takifugu TF：5′-TCTTCACGAA ACAGGCTCCA AC-3′

Takifugu TR：5′-GTGAAGCCCA GGAGGTCTTT  GTA-3′

探针：5′FAM-CGCAGACAAA ATCCCATTCC ACCCATA-TAMRA-3′。

2.权利要求1所述的河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由下述步骤组成：

(1)选择河豚鱼线粒体细胞色素B基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag    50

acaaaatccc attccaccca tacttctctt acaaagacct cctaggcttc    100

ac                                                        102

(2)应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；

(3)引物和探针的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

(4)探针合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团TAMRA；

(5)将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

(6)经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的上述一对引物和一条探针。

3.权利要求1所述的河豚鱼成分荧光定量PCR检测试剂在制备河豚鱼成分荧光定量PCR标准化试剂盒中的应用。