CN105543350A - 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法 - Google Patents

一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105543350A
CN105543350A CN201511015860.3A CN201511015860A CN105543350A CN 105543350 A CN105543350 A CN 105543350A CN 201511015860 A CN201511015860 A CN 201511015860A CN 105543350 A CN105543350 A CN 105543350A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
reaction
pair
quality control
negative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201511015860.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105543350B (zh
Inventor
柏建山
陈增荣
邓艳
张森
黄燕琼
何淑华
戴金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Prc Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Original Assignee
Prc Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prc Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau filed Critical Prc Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority to CN201511015860.3A priority Critical patent/CN105543350B/zh
Publication of CN105543350A publication Critical patent/CN105543350A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105543350B publication Critical patent/CN105543350B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，包括ITS2检测引物组和质控引物组，ITS2检测引物组根据棘颚口线虫ITS2rDNA基因设计，包括SEQIDNO:1~2的一对外引物、SEQIDNO:3~4的一对内引物和SEQIDNO:5~6的一对环引物；质控引物组根据颚口线虫属28SrDNA设计，包括SEQIDNO:7~8的一对外引物、SEQIDNO:9~10的一对内引物以及SEQIDNO:11~12的一对环引物。本发明具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等优点，可防止因样品中抑制因子和操作原因导致的假阴性检测结果的发生。

Description

一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及食品安全的检测方法，具体地，涉及一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组及检测方法。
背景技术
颚口线虫病是人感染颚口线虫属线虫的幼虫而引起的疾病，主要由于食入生的或未熟的含有颚口线虫的淡水鱼。它能够引起人的移行性皮下包块，还可侵袭深部组织和器官，如肺、眼、肝、肾等，甚至神经系统，引起严重症状。颚口线虫有13个种，已报道的致病种有6个，其中，双核鄂口线虫主要在中南美洲地区流行，棘颚口线虫则广泛存在于亚洲，是主要引起亚洲颚口线虫病的虫种。自1989年Levinson在泰国发现并报道了第一例棘颚口线虫病后，国际上感染颚口线虫的病例越来越多，在几个严重的国家还发生过爆发流行的情况，所以日益受到医学上的重视。而棘颚口线虫病还没有根治的治疗方法。联合国粮农组织（FAO）已将颚口线虫列为重要的致病因子。随着人口流动、文化以及国际贸易全球化，颚口线虫病呈现全球化的趋势，已有非流行地区的游客在流行地区感染颚口线虫病，或者消费进口的民族风味食品而感染颚口线虫病的报。
颚口线虫病主要由棘颚口线虫第三期幼虫引起，特别是在亚洲地区，据调查，棘颚口线虫普遍存在于东南亚地区，美国从东南亚地区进口的黄鳝感染的颚口线虫全部为棘颚口线虫，根据本实验检测的进口黄鳝中感染的颚口线虫也全部为棘颚口线虫。如果鱼类感染棘颚口线虫将直接威胁到人民的健康安全，造成颚口线虫的传播。
为了能够更好地检测棘颚口线虫，控制其传播和感染，快速准确的检测方法是必不可少的。传统的颚口线虫种类的鉴别方法是利用其形态特征，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段的形态不同，虫种间的第三期幼虫的形态相似，用传统的形态学方法很难鉴别棘颚口线虫，而且传统方法费时费力，需要专业人员和专用设备才能完成。利用分子生物学方法鉴定虫种的方法不断发展，如PCR技术。但PCR需要测序才能完成棘颚口线虫的鉴别，周期漫长，而且需要昂贵的仪器设备，也很难在基层推广。同时由于虫体样本复杂，虫体本身过小，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因棘颚口线虫危害严重，漏检造成的危害无法估量。为减少漏检造成概率，史贤明教授等申请一项添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法（专利号：200710040001.9），通过内标的检测结果判断是否发生假阴性。但荧光PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
棘颚口线虫作为食品卫生检验一项重要寄生虫，提高棘颚口线虫检出率，缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，包括ITS2检测引物组和质控引物组，根据ITS2、质控引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，提高检测的准确性。本发明采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过质控检测，可有效的检测到假阴性的检测结果，同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。
本发明的另一目的在于提供一种棘颚口线虫的LAMP检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，包括ITS2检测引物组和质控引物组，其中，ITS2检测引物组根据棘颚口线虫ITS2rDNA基因设计，包括核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQIDNO:5~6所示的一对环引物：
G.Spi-F3：CGAGAGGAGATGTCTAGCA（SEQIDNO:1）；
G.Spi-B3：TCCTCGTCAAGGCGATAA（SEQIDNO:2）；
G.Spi-FIP：AGCATCAACATCATCGTCACCAATCTCTTATCGAGGTGCGTA（SEQIDNO:3）；
G.Spi-BIP：TTTGTGGCAAACGTTGAGGAACAATAACGACGACATCACCG（SEQIDNO:4）；
G.Spi-LF：GCTACCATTTCCCGACGAT（SEQIDNO:5）；
G.Spi-LB：ACGGGGAATATCATGCTACAAA（SEQIDNO:6）；
质控引物组根据颚口线虫属28SrDNA设计，包括核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQIDNO:9~10所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQIDNO:11~12所示的一对环引物：
Gna-F3：TGTGGAGCTGTAGCGTATA（SEQIDNO:7）；
Gna-B3：GGTACTTGTTCGCTATCGG（SEQIDNO:8）；
Gna-FIP：CTCGACCGCACAGGTCTCGATGCTCGACCGAAGTTC（SEQIDNO:9）；
Gna-BIP：CCTTGGAGTCGGGTTGCCTCTCGTGTCGATACTTAGTCT（SEQIDNO:10）；
Gna-LF：CACCTACTTCGGACAGTGG（SEQIDNO:11）；
Gna-LB：CGAAGATGGTGGTAAACCTCA（SEQIDNO:12）。
针对棘颚口线虫的LAMP检测，本发明设计了ITS2检测引物组和质控引物组的引物序列，发明人在前期研究中对引物组序列进行了大量的筛选，只有本发明限定的引物组序列才能达到高特异性、高灵敏度的检测效果；而改变引物序列，将直接影响对棘颚口线虫检测的灵敏性和准确性。
本发明还提供一种棘颚口线虫的LAMP检测方法，所述检测方法包括所述的ITS2检测引物组和质控引物组。
优选地，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物（G.Spi-F3，G.Spi-B3）各0.2μM，一对内引物（G.Spi-FIP，G.Spi-BIP）各1.6μM，一对环引物（G.Spi-LF，G.Spi-LB）各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控组利用质控引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物（Gna-F3，Gna-B3）各0.2μM，一对内引物（Gna-FIP，Gna-BIP）各1.6μM，一对环引物（Gna-LF，Gna-LB）各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
优选地，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的显色液反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物（G.Spi-F3，G.Spi-B3）各0.2μM，一对内引物（G.Spi-FIP，G.Spi-BIP）各1.6μM，一对环引物（G.Spi-LF，G.Spi-LB）各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控组利用质控引物组扩增基因的显色反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物（Gna-F3，Gna-B3）各0.2μM，一对内引物（Gna-FIP，Gna-BIP）各1.6μM，一对环引物（Gna-LF，Gna-LB）各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
优选地，扩增反应结束后，颜色变绿则为阳性。
优选地，所述检测方法包括如下步骤：
S1.处理样品，寻找虫体，提取样品的基因组DNA；
S2.按照所述的反应体系配制棘颚口线虫LAMP检测的反应体系；
S3.检测分析：根据实时读取的荧光信号或者显色液颜色变化来判断扩增结果，如果检测组及质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
如果检测组检测结果为阴性，质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阴性，判断样品为颚口线虫属非棘颚口线虫种；
检测组检测结果为阳性，质控组检测结果全为阴性时，检测结果为阳性。
检测组检测结果为阴性，质控组检测加过全为阴性时，推测为假阴性，重新提取样品DNA进行检测。
优选地，S1所述处理样品按照SN/T3497-2013行业标准。
本发明建立的LAMP检测棘颚口线虫的方法具有灵敏度高、特异性好、方便、快速等优点，不依赖于复杂的仪器和专业的人员，只需要一个恒温水浴锅，30分钟便可完成反应，拥有多种判读方法，最简便的方法是根据显色液的颜色变化便可判读结果；同时也可以用实时荧光的方法对扩增过程进行及时判读，在保证高敏感性的同时，使结果数据化、形象化，具有广泛的实用性和良好的应用前景，特别适合于基层的推广。
同时由于虫体过小而导致提取DNA量不足，样品中含有抑制因子或者操作不当，经常出现假阴性。根据棘颚口线虫ITS2基因设计检测基因，可检测棘颚口线虫；根据28S基因设计质控基因，可鉴别颚口线虫属线虫，同时依据形态学鉴定到颚口线虫属，可作为质控基因。本发明设计的质控基因，可有效防止假阴性的出现，对于棘颚口线虫的检疫防控具有重要意义。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，可有效防止因样品中抑制因子和操作原因导致的假阴性检测结果的发生。
（1）快速高效：整个扩增只用30～45min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据棘颚口线虫ITS2基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到1fg/μl；
（5）鉴定简单：可通过观察扩增曲线判或者显色液颜色变化断扩增与否，适合现场检测。
（6）提高检测的准确性：内含质控引物组，可根据检测质控引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因操作等原因造成假阴性检测结果的情况发生，提高检测的准确性。
附图说明
图1为棘颚口线虫ITS2基因灵敏度图。
图2为颚口线虫质控基因28S灵敏度图。
图3为棘颚口线虫ITS2基因最低检出限重复性图。
图4为颚口线虫质控基因28S最低检出限重复性图。
图5为棘颚口线虫ITS2基因特异性实验。
图6为颚口线虫质控基因28S特异性实验。
图7为实际样品检测；其中，样品1为无抑制因子的实际样品，样品2为含有EDTA抑制因子的实际样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1棘颚口线虫LAMP检测方法的建立
棘颚口线虫的LAMP检测方法，包括LAMP引物组、LAMP反应体系、LAMP检测方法。
（1）LAMP引物组：以棘颚口线虫ITS2基因为靶基因、28S基因为质控基因，利用在线设计软件PrimerExplorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计，每个基因设计6套引物，通过引物筛选试验，得到最优引物序列如下。
ITS2基因引物序列如下：
G.Spi-F3：CGAGAGGAGATGTCTAGCA（SEQIDNO:1）；
G.Spi-B3：TCCTCGTCAAGGCGATAA（SEQIDNO:2）；
G.Spi-FIP：AGCATCAACATCATCGTCACCAATCTCTTATCGAGGTGCGTA（SEQIDNO:3）；
G.Spi-BIP：TTTGTGGCAAACGTTGAGGAACAATAACGACGACATCACCG（SEQIDNO:4）；
G.Spi-LF：GCTACCATTTCCCGACGAT（SEQIDNO:5）；
G.Spi-LB：ACGGGGAATATCATGCTACAAA（SEQIDNO:6）。
质控引物组根据鄂口线虫属28SrDNA设计，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
28S质控引物组如下所示：
Gna-F3：TGTGGAGCTGTAGCGTATA（SEQIDNO:7）；
Gna-B3：GGTACTTGTTCGCTATCGG（SEQIDNO:8）；
Gna-FIP：CTCGACCGCACAGGTCTCGATGCTCGACCGAAGTTC（SEQIDNO:9）；
Gna-BIP：CCTTGGAGTCGGGTTGCCTCTCGTGTCGATACTTAGTCT（SEQIDNO:10）；
Gna-LF：CACCTACTTCGGACAGTGG（SEQIDNO:11）；
Gna-LB：CGAAGATGGTGGTAAACCTCA（SEQIDNO:12）。
（2）棘颚口线虫的LAMP检测方法的基因扩增检测可采用实时荧光反应体系或者显色液反应体系。
检测基因扩增检测的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：G.Spi-F30.2μM，G.Spi-B30.2μM，G.Spi-FIP1.6μM，G.Spi-BIP1.6μM，G.Spi-LF0.8μM，G.Spi-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控基因扩增实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：Gna-F30.2μM，Gna-B30.2μM，Gna-FIP1.6μM，Gna-BIP1.6μM，Gna-LF0.8μM，Gna-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
检测基因扩增检测的显色液反应体系及条件：25μl反应体系含有：G.Spi-F30.2μM，G.Spi-B30.2μM，G.Spi-FIP1.6μM，G.Spi-BIP1.6μM，G.Spi-LF0.8μM，G.Spi-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控基因扩增显色反应体系及条件：25μl反应体系含有：Gna-F30.2μM，Gna-B30.2μM，Gna-FIP1.6μM，Gna-BIP1.6μM，Gna-LF0.8μM，Gna-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
（3）棘颚口线虫的LAMP检测方法，可以使用以下结果判读方法：1）显色液反应体系：利用1000×SYBRGreenI作为显色液，反应前加到反应管盖中间，反应后与反应液混匀，如果颜色变绿则为阳性；2）实时荧光反应体系：将反应管中置于ESE-QuantTubeScanner或荧光PCR仪中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果；
（4）检测基因与质控基因阳性质粒分别为含有棘颚口线虫ITS2基因部分片段和28S基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的棘颚口线虫基因组为模板，分别利用的ITS2引物组的外引物（SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）和28S质控引物组的外引物（SEQIDNO:7和SEQIDNO:8）进行扩增，所得ITS2基因扩增片段序列和28S基因扩增片段序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，并进行灵敏度和稳定性的测试，选择合适浓度的质粒作为阳性对照。
（5）棘颚口线虫LAMP检测方法，其具体过程包括如下步骤：
S1.取虫体在显微镜下进行形态学鉴定，根据SN/T3497-2013行业标准，判断是否为颚口线虫属线虫，使用商业化试剂盒提取基因组DNA；如果不能判断属类，也按照商业化试剂盒提取基因组DNA。
S2.按照上述的反应体系配制棘颚口线虫LAMP检测方法的反应体系。
S3.检测分析：根据仪器实时读取的荧光信号或者显色液颜色变化来判断扩增结果：
ITS2基因检测结果及质控基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
ITS2基因检测结果为阴性，质控基因检测结果全为阳性时，检测结果为阴性，判断其为鄂口线虫属其它种；
ITS2基因检测结果为阳性，质控基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
ITS2基因检测结果为阴性，质控基因检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测。
实施例2灵敏度实验
将构建的质粒进行灵敏度实验，将1ng/μl质粒作10倍梯度稀释以10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl、10ag/μl七个梯度作为灵敏度实验，用实施例1的操作进行检测，通过灵敏度实验确定检测基因和质控基因的最低检出限均为1fg/μl（如图1、2所示）。
实施例3稳定性实验
选取检测基因和质控基因的最低检测1fg/μl，分别做15次重复，用实施例1的操作进行检测，验证检测方法的稳定性和重复性（如图3、4所示），试验表明本检测方法有良好的稳定性和重复性。
实施例4特异性实验
用实施例1的方法分别对棘口吸虫、迭宫绦虫、异尖线虫、泡状带绦虫、胃瘤线虫、宫脂线虫进行DNA提取，按照实施例1用两组引物分别进行检测，结果显示检测引物组和质控引物组对棘颚口线虫扩增正常，对棘口吸虫、迭宫绦虫、异尖线虫、泡状带绦虫、胃瘤线虫、宫脂线虫均无非特异性扩增（图5、6所示）。
实施例4实际样品检测
用上述检测方法进行实际样品的检测。
S1.样品及发现虫体的处理：根据SN/T3497-2013行业标准，处理样品，寻找虫体，将虫体置于显微镜下进行形态学鉴定，判断是否为颚口线虫属线虫，使用商业化试剂盒提取基因组DNA；如果不能判断属类，也按照商业化试剂盒提取基因组DNA。对样品2中加入EDTA抑制因子。
S2.检测基因扩增检测的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：G.Spi-F30.2μM，G.Spi-B30.2μM，G.Spi-FIP1.6μM，G.Spi-BIP1.6μM，G.Spi-LF0.8μM，G.Spi-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控基因扩增实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：Gna-F30.2μM，Gna-B30.2μM，Gna-FIP1.6μM，Gna-BIP1.6μM，Gna-LF0.8μM，Gna-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
检测基因扩增检测的显色液反应体系及条件：25μl反应体系含有：G.Spi-F30.2μM，G.Spi-B30.2μM，G.Spi-FIP1.6μM，G.Spi-BIP1.6μM，G.Spi-LF0.8μM，G.Spi-LB0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
S3.根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据ITS2基因检测结果和质控基因(28S)检测结果进行判断：
检测结果见图7，对不含抑制因子和含有抑制因子的样品进行检测，分别设置阴阳对照，图7显示，检测基因和质控基因都扩增，样品1的检测基因和质控基因都能扩增，判定其为棘颚口线虫，样品2的检测基因和质控基因都没有控制，由于之前的形态学鉴定以确定虫体为颚口线虫属，表明样品2中含有抑制因子或者操作不当。
SEQUENCELISTING
<110>中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局
<120>一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组及检测方法
<130>
<160>14
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>G.Spi-F3
<400>1
cgagaggagatgtctagca19
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>G.Spi-B3
<400>2
tcctcgtcaaggcgataa18
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>G.Spi-FIP
<400>3
agcatcaacatcatcgtcaccaatctcttatcgaggtgcgta42
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>G.Spi-BIP
<400>4
tttgtggcaaacgttgaggaacaataacgacgacatcaccg41
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>G.Spi-LF
<400>5
gctaccatttcccgacgat19
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>G.Spi-LB
<400>6
acggggaatatcatgctacaaa22
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>Gna-F3
<400>7
tgtggagctgtagcgtata19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>Gna-B3
<400>8
ggtacttgttcgctatcgg19
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>Gna-FIP
<400>9
ctcgaccgcacaggtctcgatgctcgaccgaagttc36
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>Gna-BIP
<400>10
ccttggagtcgggttgcctctcgtgtcgatacttagtct39
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>Gna-LF
<400>11
cacctacttcggacagtgg19
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>Gna-LB
<400>12
cgaagatggtggtaaacctca21
<210>13
<211>219
<212>DNA
<213>ITS2gene
<400>13
cgagaggagatgtctagcatcatctcttatcgaggtgcgtacgcgtgtggcgcatcgtcg60
ggaaatggtagcgatggtgacgatgatgttgatgctcgaattttgtggcaaacgttgagg120
aacgtacggggaatatcatgctacaaatcgagttgatcacgcggtgatgtcgtcgttatt180
gttgcttatcattgagcacgtttatcgccttgacgagga219
<210>14
<211>223
<212>DNA
<213>28Sgene
<400>14
tgtggagctgtagcgtataggtgcggctttcggcatacgatgctcgaccgaagttccctt60
gattgggaccactgtccgaagtaggtgcgagacctgtgcggtcgagcggaatgtgctggt120
tgccgttccttggagtcgggttgcctgggaacgcagcccgaagatggtggtaaacctcat180
ctaagactaagtatcgacacgagaccgatagcgaacaagtacc223

Claims (6)

1.一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，其特征在于，包括ITS2检测引物组和质控引物组，其中，ITS2检测引物组根据棘颚口线虫ITS2rDNA基因设计，包括核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQIDNO:5~6所示的一对环引物；
质控引物组根据颚口线虫属28SrDNA设计，包括核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQIDNO:9~10所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQIDNO:11~12所示的一对环引物。
2.一种棘颚口线虫的LAMP检测方法，其特征在于，所述检测方法包括权利要求1所述的ITS2检测引物组和质控引物组。
3.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物各0.2μM，一对内引物各1.6μM，一对环引物各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控组利用质控引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物各0.2μM，一对内引物各1.6μM，一对环引物各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
4.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的显色液反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物各0.2μM，一对内引物各1.6μM，一对环引物各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
质控组利用质控引物组扩增基因的显色反应体系及条件：25μl反应体系含有：一对外引物各0.2μM，一对内引物各1.6μM，一对环引物各0.8μM，8mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl，加20μl密封液；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，将1μl显色液滴在反应管盖中间，并于63℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
5.根据权利要求3或4所述的LAMP检测方法，其特征在于，扩增反应结束后，颜色变绿则为阳性。
6.根据权利要求5所述的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.处理样品，寻找虫体，提取样品的基因组DNA；
S2.按照所述的反应体系配制棘颚口线虫LAMP检测的反应体系；
S3.检测分析：根据实时读取的荧光信号或者显色液颜色变化来判断扩增结果，如果检测组及质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
如果检测组检测结果为阴性，质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阴性，判断样品为颚口线虫属非棘颚口线虫种；
检测组检测结果为阳性，质控组检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
检测组检测结果为阴性，质控组检测加过全为阴性时，推测为假阴性，重新提取样品DNA进行检测。
CN201511015860.3A 2015-12-31 2015-12-31 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法 Active CN105543350B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511015860.3A CN105543350B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511015860.3A CN105543350B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105543350A true CN105543350A (zh) 2016-05-04
CN105543350B CN105543350B (zh) 2019-04-30

Family

ID=55822907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511015860.3A Active CN105543350B (zh) 2015-12-31 2015-12-31 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543350B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109540886A (zh) * 2017-09-22 2019-03-29 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种检测寄生虫时使用的滤沉装置
CN113862381A (zh) * 2021-11-24 2021-12-31 中国人民解放军疾病预防控制中心 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张森等: "环介导等温扩增法检测棘颚口线虫方法的建立", 《现代食品科技》 *
李雯雯: "上海、广州等地市售与上海入境黄鳝、泥鳅中颚口线虫调查与分类鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
熊玉芬等: "环介导等温扩增特异检测香蕉穿孔线虫", 《植物检疫》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109540886A (zh) * 2017-09-22 2019-03-29 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种检测寄生虫时使用的滤沉装置
CN113862381A (zh) * 2021-11-24 2021-12-31 中国人民解放军疾病预防控制中心 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法
CN113862381B (zh) * 2021-11-24 2024-04-26 中国人民解放军疾病预防控制中心 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543350B (zh) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103320434B (zh) 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法
CN102776297B (zh) 一种登革病毒/黄热病毒/西尼罗病毒/基孔肯雅病毒鉴别检测试剂盒
CN106191298A (zh) 一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的方法
CN108796131A (zh) 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN113322338B (zh) 一种检测志贺氏菌的cda引物组、试剂盒及其应用
CN103397107B (zh) 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN102827925A (zh) 一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法
CN104032035A (zh) 一种同时检测人的ⅰ型、ⅱ型及ⅲ型副流感病毒的方法及试剂盒
CN103397105A (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN104450961A (zh) 草鱼呼肠孤病毒i型ii型iii型rt-lamp可视化检测试剂盒及其检测方法
CN106434989B (zh) 烟草赤星病菌的lamp快速检测方法
CN110592268A (zh) 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
CN104513857A (zh) 副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
CN105543350A (zh) 一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法
CN109439801A (zh) 一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
CN104328216A (zh) 一种埃博拉病毒快速分型鉴别检测试剂盒
CN103952495B (zh) 一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的lamp检测方法
CN104152550B (zh) 采用lamp技术检测牛无浆体方法
CN105331677B (zh) 针对食品中的沙门氏菌和志贺氏菌的多重pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法
CN102676653A (zh) 一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法
CN102399903B (zh) 一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物
CN105039517A (zh) 一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的pcr-hrm引物和方法
CN103820570B (zh) 对虾桃拉综合症病毒可视化lamp检测试剂及检测方法
CN103937912A (zh) 用于检测传染性胰脏坏死病毒的lamp引物组合物及其应用
CN113215324A (zh) 用于现场恒温可视化和荧光检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant