CN105039517A - 一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的pcr-hrm引物和方法 - Google Patents

一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的pcr-hrm引物和方法 Download PDF

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黄韧
张钰
饶丹
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Abstract

发明公开了一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法，本发明通过大量的筛选获得可以鉴别胆汁螺杆菌、肝螺杆菌、小家鼠螺杆菌、啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌这5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物（SEQ？ID？NO：1～4）及相应的检测方法，本发明通过分析HRM熔解曲线，能够根据各螺杆菌Tm值进行区分；本发明采用套式PCR结合HRM比一般的检测方法灵敏度高且特异性和重复性好；本发明检测速度快且高通量，10～15分钟即可完成72个样品的PCR产物检测，极大缩短了检测时间，是一种新型的用于检测和鉴别啮齿类动物螺杆菌的方法。

Description

一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法
技术领域
本发明涉及一种细菌的研究方法，具体涉及啮齿动物螺杆菌的研究方法。
背景技术
啮齿动物螺杆菌(RodentHelicobacter)属于螺杆菌属细菌，大小约为（3.5～5.00）μm×（0.5～0.6）μm，呈螺杆形或弯曲状，不形成芽孢，两极有鞭毛。螺杆菌培养条件苛刻，需要微需氧环境（80～90%NO2，5～10%O2和5%～10%CO2混合气体），而且对培养基营养要求高。至1980年以来，已有30多种螺杆菌被正式命名，根据其定居部位可分为胃内螺杆菌与肝肠螺杆菌；啮齿动物螺杆菌属于肝肠螺杆菌，主要定植于盲肠、结肠以及肝胆管系统。世界各国及国际实验动物理事会已将该类螺杆菌列为啮齿实验动物必须排除的病原微生物，但我国由于缺乏模式菌株和有效的检测方法，还未列入实验动物质量国家标准。
此类菌主要以隐性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等啮齿动物的消化系统，可引起宿主不同程度的病理反应从而导致盲肠结肠炎、肝炎、胆囊炎等各种组织炎症甚至恶性肿瘤的发生。模型动物感染螺杆菌时，可引起诱发一些并发疾病，严重影响实验动物质量并对实验数据的可靠性产生潜在的干扰。
目前，啮齿动物螺杆菌感染的检测方法主要有病原学、血清学及分子生物学方法：
（1）细菌分离培养：取粪便沉淀或肠壁粘液，在特殊的培养基和微氧环境下培养分离该菌。本方法检测成本较高实验周期长，需要培养5～7d，生化鉴定试验操作繁琐，耗时费力，检测周期一般为3～4周。
（2）血清学检测：运用ELISA方法来检测血清或粪便中抗螺杆菌特异性抗体。免疫学方法操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但由于交叉反应的存在，使得难以鉴别有些螺杆菌种特异性。
（3）PCR检测：PCR法被认为是检测螺杆菌最有效的方法，已被大量运用。所报道的PCR检测方法包括普通PCR、多重PCR、巢氏PCR、荧光定量PCR等。通常针对16SrRNA序列及各型螺杆菌特异蛋白基因进行引物设计，直接检测粪便、肠内容物及肝组织中该菌体的DNA。关于不同啮齿动物螺杆菌分型的报道较少，
鉴别方法如多重PCR，PCR结合限制性酶切等不同程度存在灵敏度不高、操作较繁琐等缺点。
实验大小鼠是实验动物中使用非常广泛及数量颇多的动物，螺杆菌的感染可对实验数据的可靠性产生严重的干扰。基于目前的各种检测方法，还需要一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的实验动物螺杆菌分型方法用于实际使用实验动物时螺杆菌的快速筛查。
高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)是2003年美国Utah大学Wittwer实验室提出的一项用于基因突变检测和基因分型的新技术。近年来随着附带HRM检测功能的real-timePCR仪的普及，HRM基因分型技术在分子诊断领域受到普遍的关注，动物基因和动物病原基因检测技术也得到了一定的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
F1:5'-CTATGACGGGTATCCGGC-3'（SEQIDNO：1），
R1:5'-CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQIDNO：2）；
F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQIDNO：3），
R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQIDNO：4）。
一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取螺杆菌DNA；
2）以DNA为模板，用上述所述的引物对F1和R1进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用上述所述的引物对F2、R2和荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌类型。
进一步的，上述步骤2）中的PCR预扩增反应体系为：
PreMixrTaq10μL
10μM引物F11μL
10μM引物R11μL
模板1μL
ddH2O7μL。
进一步的，上述步骤2）中的预扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s、58℃退火35s、72℃延伸1min10s，循环35次；72℃终延伸8min。
进一步的，上述步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
ddH2O6μL
PreMixrTaq10μL
染料LCGreen1μL
10μM引物F21μL
10μM引物R21μL
DNA模板1μL。
进一步的，上述步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸5min；在70℃到90℃升温范围内以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
进一步的，上述步骤4）中所述HRM分析的具体分析方法为：以啮齿螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为78.70±0.12℃，则判定为啮齿螺杆菌；
以胆汁螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为80.51±0.09℃，则判定为胆汁螺杆菌；
以盲肠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为81.6±0.18℃，则判定为盲肠螺杆菌；
以小家鼠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.11±0.18℃，则判定为小家鼠螺杆菌；
以肝螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.95±0.09℃，则判定为肝螺杆菌。
本发明的有益效果是：
1）操作简单，采用rTaq预混酶，仅需2步PCR就可进行HRM分析。
2）灵敏度高，采用套式PCR结合HRM比一般的检测方法灵敏的高；特异性高，且重复性好。
3）本发明检测速度快且高通量：10～15分钟即可完成72个样品的PCR产物检测，极大缩短了检测时间。
4）通过分析HRM熔解曲线，能够根据各螺杆菌Tm值进行区分。
5）成本低廉，不需要特异性探针，仅需要普通聚合酶和饱和核酸荧光染料，每个样品的饱和染料成本为1元左右。
6）本发明采用的是套式PCR方法，在提高检测灵敏度的同时也避免了非特异性扩增；所设计的引物特异性好，能高效率的扩增出啮齿动物螺杆菌，为高质量的PCR反应做好了可靠的保证。利用本发明所述引物扩增的第2次PCR产物进行HRM分析，参照模拟HRM分析图，以鉴别啮齿动物重要的5种螺杆菌。
附图说明
图1是五种螺杆菌质粒阳性标准样品PCR-HRM标准化熔解曲线图；从左至右的熔解曲线依次为H.rodentium（啮齿螺杆菌）、H.bilis（胆汁螺杆菌）、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）、H.hepaticus（肝螺杆菌）的标准化熔解曲线；
图2是五种螺杆菌质粒阳性标准样品PCR-HRM峰型化熔解曲线；从左至右的峰型化熔解曲线依次为H.rodentium（啮齿螺杆菌）、H.bilis（胆汁螺杆菌）、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）、H.hepaticus（肝螺杆菌）的峰型化熔解曲线；
图3是临床样品PCR-HRM标准化熔解曲线图；从左至右的熔解曲线依次为H.rodentium（啮齿螺杆菌）、H.bilis（胆汁螺杆菌）、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）、H.hepaticus（肝螺杆菌）的标准化熔解曲线；
图4是临床样品PCR-HRM峰型化熔解曲线；左至右的峰型化熔解曲线依次为H.rodentium（啮齿螺杆菌）、H.bilis（胆汁螺杆菌）、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）、H.hepaticus（肝螺杆菌）的峰型化熔解曲线；
图5为以F2和R2为引物的PCR产物的电泳检测图，1-5分别是胆汁螺杆菌、肝螺杆菌、小家鼠螺杆菌、啮齿螺杆菌、盲肠螺杆菌；6：鼠伤寒沙门氏菌样品；7：绿脓杆菌样品；8：小肠结肠耶尔森菌；9：大肠杆菌；10：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物
1）PCR预扩增引物
根据螺杆菌基因序列设计、筛选出能够扩增螺杆菌基因序列的引物对F1和R1，其碱基序列如下所示。
F1:5'-CTATGACGGGTATCCGGC-3'（SEQIDNO：1），
R1:5'-CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQIDNO：2）。
2）PCR-HRM引物：
本发明经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对F2、R2和引物对F1、R1的联合使用对PCR-HRM方法区分5种重要啮齿动物螺杆菌的效果最好，引物对F2、R2的碱基序列如下所示。
F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQIDNO：3）；，
R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQIDNO：4）。
实施例2一种鉴别5种重要啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法
1）螺杆菌DNA的提取：
用试剂盒MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0提取啮齿动物粪便、肠道内容物或肝组织等。
2）标准质粒样品的制备：
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的样品检测提供HRM阳性对照，本发明需先制备5种重要啮齿动物螺杆菌的阳性标准样品。标准样品的制备步骤如下：
分别取经过测序确定为肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、啮齿螺杆菌、小家鼠螺杆菌及盲肠螺杆菌的DNA作为模板，分别以F1和R1为引物进行PCR预扩增，其预扩增反应体系为：
PreMixrTaq10μL
上游引物F1（10μM）1μL
下游引物R1（10μM）1μL
模板1μL
ddH2O7μL。
预扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s、58℃退火35s、72℃延伸1min10s，循环35次；72℃终延伸8min。
将上述PCR扩增产物纯化回收，分别连入载体pMD-19Tvector中，并转化大肠杆菌进行扩大培养，提取质粒，即可分别获得肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、啮齿螺杆菌、小家鼠螺杆菌及盲肠螺杆菌的标准样品，作为后续研究的阳性对照样品。
3）阳性标准样品的PCR-HRM操作步骤
分别以上述获得的五种阳性标准样品为DNA模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分析；
PCR-HRM反应体系：
ddH2O6μL
PreMixrTaq10μL
染料LCGreen1μL
上游引物F2（10μM）1μL
下游引物R2（10μM）1μL
DNA模板1μL。
PCR-HRM扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸5min；在70℃到90℃升温范围内以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
4）阳性标准样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-GeneQ分析仪进行分析。五啮齿动物螺杆菌的标准质粒为模板的PCR产物的HRM（高分辨率熔解曲线，HighResolutionMeltingcurve）分析结果图如图1、图2所示。
图1为标准化熔解曲线图，依Tm从左至右的熔解曲线依次为啮齿螺杆菌（H.rodentium）、胆汁螺杆菌（H.bilis）、盲肠螺杆菌（H.typhlonius）、小家鼠螺杆菌（H.muridarum）、肝螺杆菌（H.hepaticus）的标准化熔解曲线。标准化熔解曲线图是由原始熔解曲线图经过信号标准化处理后得到，最大限度地消除了由于起始模板浓度不同而造成荧光信号值的差异。从图1的标准化熔解曲线图中可以看出，肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、啮齿螺杆菌、小家鼠螺杆菌和盲肠螺杆菌5种标准样品熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。
图2为五种螺杆菌质粒阳性标准样品PCR-HRM峰型化熔解曲线；从左至右的峰型化熔解曲线依次为H.rodentium（啮齿螺杆菌）、H.bilis（胆汁螺杆菌）、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）、H.hepaticus（肝螺杆菌）的峰型化熔解曲线。峰型化熔解曲线图是对标准化熔解曲线图进行导数化处理后得到。从图2峰型化熔解曲线图更直观地反映了5种螺杆菌熔解曲线的差别。5种标准样品熔解曲线形状相似，均有1个熔解峰，其中，啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌的熔解温度分别为78.70±0.12℃、80.51±0.09℃、81.6±0.18℃、82.11±0.18℃、82.95±0.09℃。在以本试验加样体系及PCR反应条件下，依据统计学原理区分判断标准是：若熔解曲线Tm值为80.51±0.09℃，则判定为胆汁螺杆菌；若Tm值在82.95±0.09℃，判定为肝螺杆菌；若Tm值在82.11±0.18℃，则判定为小家鼠螺杆菌；若Tm值在78.70±0.12℃，则判定为啮齿螺杆菌；若Tm值为81.6±0.18℃，则判定为盲肠螺杆菌。
实施例3临床样品中鉴别5种重要啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法
1）从样本中提取螺杆菌DNA：以大小鼠盲肠或粪便样品提取螺杆菌DNA，具体操作方法同实施例2的步骤1）。
2）以提取的螺杆菌DNA为模板，进行PCR预扩增，预扩增反应体系为：
PreMixrTaq10μL
上游引物F1（10μM）1μL
下游引物R1（10μM）1μL
模板1μL
ddH2O7μL。
预扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s、58℃退火35s、72℃延伸1min10s，循环35次；72℃终延伸8min。
3）预扩增PCR产物稀释50～100倍后作为DNA模板，进行PCR-HRM扩增反应：
PCR-HRM反应体系：
ddH2O6μL
PreMixrTaq10μL
染料LCGreen1μL
上游引物F2（10μM）1μL
下游引物R2（10μM）1μL
DNA模板1μL。
PCR-HRM扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸5min；在70℃到90℃升温范围内以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌的基因型。
本发明从临床样品和分离培养中每种螺杆菌选取4～5份进行检测，共检测19份螺杆菌样品，PCR-HRM检测结果如图3、图4所示。
从图3所示的标准化熔解曲线图上可看出，当分别以实施例2中所述啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌的标准样品作为对照时，19份样品中有含有H.rodentium（啮齿螺杆菌）4份、H.bilis（胆汁螺杆菌）5份、H.typhlonius（盲肠螺杆菌）5份、H.muridarum（小家鼠螺杆菌）5份、H.hepaticus（肝螺杆菌）5份。
图4为19份临床样品峰型化熔解曲线图，在以本试验加样体系及PCR反应条件下，临床样品检测中，胆汁螺杆菌熔解曲线Tm值在80.65±0℃，肝螺杆菌熔解曲线Tm值83.05±0℃，小家鼠螺杆菌熔解曲线Tm值为82.19±0.04℃，啮齿螺杆菌熔解曲线Tm值为78.74±0.07℃，盲肠螺杆菌熔解曲线Tm值为81.74±0.07℃。
下面对本发明建立的PCR-HRM法作特异性检测。
分别提取其他常见啮齿动物病菌DNA，鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、小肠结肠耶尔森菌和大肠杆菌的DNA分别作为PCR模板，以上述实施例3中的PCR预扩增方法分别进行PCR反应，将以F2和R2为引物的PCR产物进行凝胶电泳分析，并与啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌的阳性样品PCR产物进行对比分析，检测结果如图5所示，其中M为Marker（DL2000DNAmarker），泳道1-10分别是胆汁螺杆菌、肝螺杆菌、小家鼠螺杆菌、啮齿螺杆菌、盲肠螺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、小肠结肠耶尔森菌、大肠杆菌和阴性对照。凝胶电泳结果显示，啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌阳性样品在90bp左右有目的条带，而其它样品均未出现电泳条带，表明本发明设计的引物特异性高，适合用于HRM分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省实验动物监测所
<120>一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
ctatgacgggtatccggc18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
cgattactagcgattccagc20
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工引物
<400>3
gaaccttacctaggcttgacatt23
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>4
ttaacccaacatctcacgacac22

Claims (7)

1.一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
F1:5'-CTATGACGGGTATCCGGC-3'（SEQIDNO：1），
R1:5'-CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQIDNO：2）；
F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQIDNO：3），
R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQIDNO：4）。
2.一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取螺杆菌DNA；
2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对F1和R1进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对F2、R2和荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌类型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的PCR预扩增反应体系为：
PreMixrTaq10μL
10μM引物F11μL
10μM引物R11μL
模板1μL
ddH2O7μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的预扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s、58℃退火35s、72℃延伸1min10s，循环35次；72℃终延伸8min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
ddH2O6μL
PreMixrTaq10μL
染料LCGreen1μL
10μM引物F21μL
10μM引物R21μL
DNA模板1μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸5min；在70℃到90℃升温范围内以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述HRM分析的具体分析方法为：以啮齿螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为78.70±0.12℃，则判定为啮齿螺杆菌；
以胆汁螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为80.51±0.09℃，则判定为胆汁螺杆菌；
以盲肠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为81.6±0.18℃，则判定为盲肠螺杆菌；
以小家鼠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.11±0.18℃，则判定为小家鼠螺杆菌；
以肝螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.95±0.09℃，则判定为肝螺杆菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107227374A (zh) * 2017-08-01 2017-10-03 扬州大学 一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及鉴定方法
CN110195118A (zh) * 2019-04-22 2019-09-03 中山大学 一种快速检测罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗株tfj0901的pcr-hrm方法
WO2022068785A1 (zh) * 2021-05-08 2022-04-07 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107227374A (zh) * 2017-08-01 2017-10-03 扬州大学 一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及鉴定方法
CN110195118A (zh) * 2019-04-22 2019-09-03 中山大学 一种快速检测罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗株tfj0901的pcr-hrm方法
WO2022068785A1 (zh) * 2021-05-08 2022-04-07 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法

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