CN104232767A

CN104232767A - 香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

Info

Publication number: CN104232767A
Application number: CN201410450393.6A
Authority: CN
Inventors: 王念武; 翁瑞泉; 陈劲松; 吴金枝; 于文涛
Original assignee: Fuqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau Of Prc
Current assignee: Fuqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau Of Prc
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: CN104232767B

Abstract

本发明涉及一种香蕉细菌性枯萎病菌检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对香蕉细菌性枯萎病菌进行滚环扩增的检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。本发明利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点，在香蕉细菌性枯萎病菌特异性基因片段序列上设计锁式探针，通过引物进行超分支滚环扩增，建立香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增检测方法，可以缩短传统香蕉细菌性枯萎病菌检测时间，确保检测的特异性和灵敏度。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。

Description

香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

技术领域

本发明涉及一种香蕉细菌性枯萎病菌检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对香蕉细菌性枯萎病菌进行滚环扩增的检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。

背景技术

香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2, Rs2)是危害香蕉最严重的病原细菌，能导致香蕉植株发生严重的枯萎，最终导致植株死亡^[1,2]。根据寄主的不同，Ralstonia solanacearum可化分为5个races^[3]，而香蕉细菌性枯萎病菌属于race 2，主要侵害三倍体香蕉及赫蕉。香蕉细菌性枯萎病菌是我国禁止进境的检疫性有害生物，在我国没有分布，我国虽然对进境香蕉和香蕉种苗进行检疫，但对进境芭蕉属（Musa）和蝎尾蕉属（Heliconia）的景观类植物缺乏该细菌的检测，这些植物也可作为香蕉细菌性枯萎病菌寄主^[4]，携带并传入香蕉细菌性枯萎病菌存在一定的风险。

自锁式探针被报道以来^[5]，它以灵敏、特异、稳定等特点广泛接受，并越来越多地应用到分子检测中。锁式探针是由3′和5′端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。其工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，锁式探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对, 线型锁式探针在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶标DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，连接成环状的锁式探针在Bst DNA聚合酶和通用引物的作用下恒温扩增^[6]，其扩增效率在1h之内就可以达到10⁹或更多拷贝^[7]。锁式探针的恒温扩增具有极好的检测灵敏度、特异性和实用性，近几年已被广泛地应用于细胞原位检测、微生物、医学病原检测鉴定等领域。本研究旨在依据香蕉细菌性枯萎病菌独有的蛋白基因序列，设计特异的锁式探针及其扩增引物，建立特异、灵敏的香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增（HRCA）检测技术，为我国的口岸把关，也为香蕉细菌性枯萎病菌的疫情动态监测提供新的分子检测技术。

发明内容

本发明旨在提供一种香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，首先设计锁式探针和其扩增引物，然后经过环化连接、消化反应，再用滚环扩增引物进行超分支滚环扩增，最后通过琼脂凝胶电泳成像来实现香蕉细菌性枯萎病菌的检测。

本发明根据Lee等获得的一段1884bp大小的香蕉细菌性枯萎病菌特异性片段（GenBank: AF450275），通过Blast与其近似种进行比对，在与其近似种碱基差异较大的地方找出一段序列作为T1、T2区，根据锁式探针的设计原则，设计锁式探针。并用Mfold（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/）预测探针的二级结构，确保了锁式探针的二级结构最小。线性探针经过环化连接，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在Taq DNA连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在，而后续反应中的核酸外切酶I、Ⅲ将多余的线性锁式探针消化水解。然后再用锁式探针的扩增引物进行超分支滚环扩增，凝胶电泳成像进行分析判断。

本发明的一种香蕉细菌性枯萎病菌锁式探针检测方法，具体操作的步骤如下：

（1）锁式探针环化连接

将锁式探针与香蕉细菌性枯萎病菌以及参照菌株的DNA模板分别进行环化连接，反应体系为10μL：10×Taq DNA连接酶缓冲液1μL，40U/μL的TaqDNA连接酶0.15μL，500pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL。采用热循环连接法连接，反应条件为：94℃ 4 min；94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃15min灭活Taq DNA连接酶。反应结束后立即将反应管冰浴5min。

（2）消化反应

冰浴后的PCR反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL；5U/μL的核酸外切酶I 1.5μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1 μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL，37℃反应2h，彻底消化未环化的线性探针，再于95℃反应3h，灭活剩余的核酸外切酶。

（3）超分支滚环扩增

将锁式探针连接环化消化后的产物作为模板，用扩增引物进行超分支滚环扩增，反应体系为25μL：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，8U/μL的 Bst DNA聚合酶0.5μL，10 μmol/L 的padR 0.5μL，10 μmol/L的padF 0.5 μL，10mmol/L的 dNTPs 1μL，环化连接消化后产物2μL，Sterilized ddH₂O 补足至25μL。反应条件：63 ℃反应1.5 h。反应结束后取7μL于2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外凝胶成像系统照相分析判定。

所述锁式探针的核苷酸序列如下：

锁式探针如下：

Padlock-Prs2：5'-AACACACAGTTGCTCGCACTGGCCGAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTTGGCCAGCACCGATGG-3'

通用引物如下：

PadR：5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT- 3'，

PadF：5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC- 3'

所述环化连接的反应体系为10μL：10×Taq DNA连接酶缓冲液1μL，40U/μL的TaqDNA连接酶0.15μL，500pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL。采用热循环连接法连接，反应条件为：94℃ 4 min；94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃15min灭活Taq DNA连接酶。反应结束后立即将反应管冰浴5min。

所述消化反应的条件如下：向冰浴后的反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL；5U/μL的核酸外切酶I 1.5μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1 μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL，37℃反应2 h，再于95℃反应3h。

所述超分支滚环扩增的反应体系为25μL：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，8U/μL的 Bst DNA聚合酶0.5μL，10 μmol/L 的padR 0.5μL，10 μmol/L的padF 0.5 μL，10mmol/L的 dNTPs 1μL，环化连接消化后产物2μL，Sterilized ddH₂O 补足至25μL。反应条件：63 ℃反应1.5 h。反应结束后取7μL于2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外凝胶成像系统照相分析判定。

本发明主要是利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点，在香蕉细菌性枯萎病菌特异性基因片段序列上设计锁式探针，通过引物进行超分支滚环扩增，建立香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增检测方法，可以缩短传统香蕉细菌性枯萎病菌检测时间，确保检测的特异性和灵敏度。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。

本发明有益效果：

（1）香蕉细菌性枯萎病菌是我国禁止进境的检疫性有害生物，在国内没有分布，目前国内缺乏该细菌的检测方法，本发明提供一种检测方法。

（2）此发明适用于香蕉细菌性枯萎病菌的快速检测，可用于进境香蕉、赫蕉以及芭蕉属（Musa）和蝎尾蕉属（Heliconia）的景观类植物的口岸检疫。

（3）香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增检测方法特异性强，在供试的9种细菌中，只有香蕉细菌性枯萎病菌能被特异检出，见图1。检测灵敏度高，香蕉细菌性枯萎病菌DNA检测最低浓度可达500 fg/μL，见图2。

附图说明

图1为香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增检测的特异性。图1中M为 DNA分子量标准；1为无菌水对照；2为香蕉细菌性枯萎病菌；3为番茄细菌性叶斑病菌；4为番茄细菌性溃疡病菌；5为番茄青枯病菌；6为西瓜细菌性果斑病菌；7为水稻细菌性条斑病菌；8为杨桃细菌性斑点病菌；9为柑橘溃疡病菌；10为枯草芽孢杆菌。

图2 为香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增灵敏度实验图。图2中M为DNA分子量标准，1-7香蕉细菌性枯萎病菌的DN浓度依次为50 ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500 fg/μL、50 fg/μL。

具体实施方式

供试生物材料和试剂：

番茄溃疡病菌[Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis（Smith）Davis et al.]，由福建省农业科学院作物研究所邱思鑫提供；香蕉细菌性枯萎病菌[Ralstonia solanacearum race 2] ，由中国检验检疫科学院赵文军博士提供；番茄细菌性叶斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）、番茄青枯病菌[Ralstonia solanacearum race 1 ]、西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulliWillems et al.）、水稻细菌性条斑病菌 [Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang) swing et al. ]、杨桃细菌性斑点病菌[Pseudomonas syringae pv. averrhoii(Van Hall) Bergey]、柑橘溃疡病菌[Xanthomonascitri(Hasse) Dowson]、枯草芽孢杆菌[ Bacillus subtilis (Ehren-berg) Cohn]、均由福建农林大学细菌实验室提供。

Taq DNA ligase、Exonuclease I、Exonuclease Ⅲ、Bst DNA polymerase、Sterilized ddH₂O均购自New England Biolabs（NEB）公司。dNTPs、100bp DNA ladder、分别购自Promega、Tangen和Roche公司。

1. 连接反应

2. 消化反应

向冰浴后的PCR反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL；5U/μL的核酸外切酶I 1.5μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1 μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL，37℃反应2h，彻底消化未环化的线性探针，再于95℃反应3h，灭活剩余的核酸外切酶。

3. 超分支滚环扩增

应用实例1：

取香蕉细菌性枯萎病菌细菌培养物，提取DNA，其他8种供试菌也提取DNA，备用。将香蕉细菌性枯萎病菌和其它8种细菌的DNA分别进行锁式探连接、环化化处理，再用锁式探针的扩增引物PadR /PadF进行超分支滚环扩增，得到的产物进行琼脂凝胶电泳，结果显示，在供试的9种细菌中，香蕉细菌性枯萎病菌被特异性检出，琼脂凝胶电泳出现典型的阶梯状分布条带，结果成阳性，而其它8种细菌未出现典型的阶梯状分布条带，出现阴性结果，见图1。灵敏度实验表明，香蕉细菌性枯萎病菌的DNA检测灵敏度高，达500 fg/μL，见图2。

参考文献：

[1] Buddenhagen I W. Strain of Pseudomonas solanacearum in indigenous hosts in banana plantations of Costa Rica ,and their relationship to bacterial wilt of bananas. Phytopathology.1960,50(9): 660-664.

[2] Buddenhagen I, Kelman A.1964. Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum . Annual Review of Phytopathology,1964,2: 203-230.

[3] Buddenhagen I W, Sequeira L, Kelman A. Designation of races in Pseudomonas solanacearum.

Phytopathology, 1962,52:726.

[4] Diatloff A,Akiew E.,Wood B., et al.Characteristics of isolates of Ralstonia solanacearum from HeliconiaAustralasian Plant Pathol.1992,21:163-168

[5] Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, et al. Padlock Probes: Circularizing oligonucleotides

for localized DNA detection[J]. Science, 1994, 265(5181): 2085-2088.

[6] Szemes M, Bonants P, Weerdt M D, et al. Diagnostic application of padlock probes-multiplex

detection of plant pathogens using universal microarrays [J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33

(8): e70.

[7] Lizardi P M, Huang X H, Zhu Z R, et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification [J]. Nature Genetics, 1998, 19: 225-232.

[8] Lee,Yung-An, Khor Chin-Ni. A novel insertion sequence, ISRso19, isolated from Ralstonia solanacearum and its application to race differentiation. Plant Pathology Bulletin.2003,12:57-64.

[9] Pickering J, Bamford A, Godbole V, et al. Integration of DNA ligation and rolling circle amp

lification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms [J].

Nucleic Acids Research,2002,30 (12):e60.

[10] Wang B,Potter SJ, Lin YG, et a1. Rapid and Sensitive Detection of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus by Rolling Circle Amplification[J].Clinical Microbiology,2005,43(5)：

2339-2344.

[11] Zhang D Y, Zhang W., Li X, et al. Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification [J]. Gene, 2001, 274 (1-2): 209-216.

[12] Hafner G J, Yang I C, Wolter L C, et al. Isothermal Amplification and Multimerization of

DNA by Bst DNA Polymerase[J]. BioTechniques, 2001, 30(4): 852-867.

SEQUENCE LISTING

<110> 中华人民共和国福清出入境检验检疫局

<120> 香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacacacagt tgctcgcact ggccgagtgg aaccgaggaa atagagaacc ccatccagca 60

cttccctatg tctctcccgt atggtttctt ggccagcacc gatgg 105

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatccagca cttccctatg tct 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttctctat ttcctcggtt ccac 24

Claims

1.一种香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：步骤如下：首先设计锁式探针和其扩增引物，然后经过环化连接、消化反应，再用滚环扩增引物进行超分支滚环扩增；阳性菌琼脂凝胶电泳后，会出现典型的阶梯状的条带，从而达到检测的目的；

所述锁式探针和引物的核苷酸序列如下：

锁式探针：

Padlock-Prs2：5'-AACACACAGTTGCTCGCACTGGCCGAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTTGGCCAGCACCGATGG-3'；

滚环扩增引物如下：

PadR：5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT- 3'，；

PadF：5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC- 3'。

2.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：所述环化连接的反应体系为10μL：10×Taq DNA连接酶缓冲液1μL，40U/μL的Taq DNA连接酶0.15μL，500pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL，采用热循环连接法连接：94℃ 4 min； 94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃ 15min灭活Taq DNA连接酶，反应结束后立即将反应管冰浴5min。

3.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：所述消化反应的条件如下：向冰浴后的反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL；5U/μL的核酸外切酶I 1.5μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1 μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL，37℃反应2 h，再于95℃反应3h。

4.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：超分支滚环扩增反应体系为25μL：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，8U/μL的 Bst DNA聚合酶0.5μL，10 μmol/L 的padR 0.5μL，10 μmol/L的padF 0.5 μL，10mmol/L的 dNTPs 1μL，环化连接消化后产物2μL，Sterilized ddH₂O 补足至25μL；反应条件：63 ℃反应1.5 h。

5.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：凝胶成像分析：取7μL滚环扩增产物于2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外凝胶成像系统照相分析。