CN104862392B - 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针 - Google Patents

豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针 Download PDF

Info

Publication number
CN104862392B
CN104862392B CN201510229350.XA CN201510229350A CN104862392B CN 104862392 B CN104862392 B CN 104862392B CN 201510229350 A CN201510229350 A CN 201510229350A CN 104862392 B CN104862392 B CN 104862392B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
seq
primer
padlock probe
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510229350.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104862392A (zh
Inventor
冯建军
李志锋
章桂明
王忠文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Priority to CN201510229350.XA priority Critical patent/CN104862392B/zh
Publication of CN104862392A publication Critical patent/CN104862392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104862392B publication Critical patent/CN104862392B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及一种豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针。本申请的检测方法，采用本申请设计的锁式探针同时对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌进行滚环扩增，然后结合液相悬浮芯片技术，对两种重要豆类检疫性植物病原细菌进行高通量检测。本申请的检测方法特异性强、灵敏度高，可以缩短豆类检疫性细菌的检测时间，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本；同时还可以提高进境豆类产品疫情截获率，增强防范外来有害生物入侵的能力，具有重要的技术性和实用性，可产生显著的经济社会效益。

Description

豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针
技术领域
本申请涉及豆类检疫性植物细菌的检测领域，特别是涉及一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，及该检测方法所采用的锁式探针。
背景技术
菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola简称PSPHA)，主要危害豆类经济作物，引起菜豆细菌性晕疫病害，造成严重的经济损失。尽管很多国家对菜豆晕疫病采取防御措施，但其传播速度惊人，在世界各大洲的60多个国家均有分布。该菌在我国属于分布未广的危险性生物，仅在黑龙江发现过这种病害，目前该病菌被列为我国进境检疫性有害生物。该病菌主要通过种子携带方式进行传播，一般可在种子内存活2年以上，一旦入侵我国，将严重危害我国豆类生产，造成重大的经济损失。
豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi简称PSPI)为豆科作物上重要的植物病原细菌，其主要寄主有豌豆、菜豆、扁豆、香豌豆、野菜豆。该病主要在欧洲、美洲、亚洲、大洋洲均有发生，在我国还未见报道。豌豆细菌性疫病的症状主要表现在地上部分组织受害为坏死斑，茎秆和托叶表现较为明显，危害严重时可引发系统病害，使整株萎蔫枯死，早期侵染可造成严重损失，对产量影响大。目前该病菌被列为我国进境检疫性有害生物，是进出境植物源性产品的必检项目。
目前针对以上两种豆类检疫性植物细菌仍无有效的化学药剂防治，控制这两种病害发生最有效的办法是使用不携带病菌种子。近年来，随着我国大豆进口数量增加，进出口检疫是防控豆类植物细菌病害传入我国的关键。目前，豆类检疫性植物细菌的检测方法主要有分离培养、生理生化反应、血清学等传统技术，然而，这些检测方法灵敏度低，特异性不高，耗时长。近年来基于DNA的PCR技术是比较常用的检测方法，如nest-PCR、实时荧光PCR等，具有较高的特异性和灵敏度，但是未见同时检测两种或多种豆类病原菌的检测方法报道，无法满足快速、灵敏的口岸检验检疫要求。
锁式探针也称环式寡核苷酸探针，自被发现以来，以灵敏度高，特异性强等特点被广泛应用到病毒、细菌、真菌的检测中。这种探针主要包括三个部分：第一部分为，分别位于5’端和3’端的检测臂区，用于与靶标序列互补，在连接酶的作用下连接成环；第二部分为通用引物结合区，用于对连接成环的锁式探针进行滚环扩增，不同检测臂的锁式探针可以采用相同的引物结合序列，因此称为通用引物结合区，可以实现一条引物或一对引物等效扩增多条环化的锁式探针实现多重检测；第三部分为与检测无关的Zip区，该部分序列并非必须的，但是，不同的锁式探针可以采用不同的Zip区序列，从而实现多条锁式探针的统一识别，是每条探针独特的识别序列，当然，如果仅有一条锁式探针，并且长度各方面都满足检测的话，Zip区也可以省略不要。滚环扩增技术是借鉴自然界中环状原核生物体DNA分子滚环式复制方式建立的一种核酸扩增技术，在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下由一条引物即可实现环状DNA体外扩增，这种方法称为线性扩增。在此基础上增加一条与DNA模板序列一致的引物，可实现指数扩增也称为超分支滚环扩增(hyper-branched rollingcircle amplification，HRCA)。HRCA具有特异性强、灵敏度高、适用于多靶标检测等特点，常应用于单核苷酸多态性(SNPs)、动植物病毒、植物真菌和细菌等检测。目前尚没有针对PSPHA和PSPI检测的锁式探针或相关检测方法。
液相芯片检测技术是近年来发展的一种快速高通量检测技术，是对生物芯片技术的继承和发展。该技术可提供100种不同荧光编码微球作为探针的载体同时检测多种不同目标核酸或蛋白，较传统的固相芯片优势在于检测准确、信息质量稳定、可重复性好，而且具有操作简便、高通量、高灵敏等特点，可大大缩短检测时间。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，以及该检测方法中所采用的锁式探针。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请公开了一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，包括(1)锁式探针环化和扩增，将受检样品的DNA或菌悬液与锁式探针一起进行环化连接反应，用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；锁式探针包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，第二锁式探针为Seq ID No.2所示序列；通用引物为能够与连接成环的锁式探针发生超分支滚环扩增的引物组合，由与锁式探针序列杂交结合的第一引物和与锁式探针的互补序列杂交结合的第二引物组成，其中第一引物的5'端上具有生物素标记；(2)液相芯片检测，将滚环扩增的产物与液相芯片的编码微球杂交，杂交完成后用液相悬浮芯片检测仪进行检测，液相芯片的编码微球上偶联有与滚环扩增产物杂交的捕获探针；捕获探针包括第一捕获探针和第二捕获探针，两条捕获探针分别偶联到不同的编码微球上，第一捕获探针用于杂交捕获第一锁式探针，第二捕获探针用于杂交捕获第二锁式探针。
需要说明的是，本申请创造性地率先设计了豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌两种豆类上重要检疫性植物细菌的锁式探针，为这两种病菌的检验检疫提供了一种更为灵敏有效的检测新途径。本申请中，第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，第二锁式探针为SeqID No.2所示序列，
Seq ID No.1：
5’-P-TGTTCAAATACGAAGGCGGTCTGCTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACATGCAGCGTAGGTATCGACTGCAGCGGTAAGGAAGAAT-3’
其中，5’端的“P”为磷酸化标记，从5’端的第一个碱基开始，1-24位的序列为锁式探针的T1检测臂区，第25-65位的序列为通用引物结合区，第66-85位为Zip区，第86-103位为T2检测臂区。
Seq ID No.2：
5’-P-GGTACTCACTTGGTGGGCTTCCGTTTCCCAATAGGTCCAGAATGT CAGCCGTTCCTCACACCAGACGTCACGTATGGTTCGCTGCTCCCACAGCGTGACGGT-3’
其中，5’端的“P”为磷酸化标记，从5’端的第一个碱基开始，1-25位的序列为锁式探针的T1检测臂区，第26-66位的序列为通用引物结合区，第67-86位为Zip区，第87-102位为T2检测臂区。
需要说明的是，锁式探针的环化和扩增中，在连接环化反应之后，通常还包括提取或纯化连接成环的锁式探针的步骤，以方便后续用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增。提取或纯化连接成环的锁式探针的方法包括至少两种，第一，采用外切酶消化没有连接成环的线性探针，以及其他DNA片段；第二，采用磁珠将连接成环的锁式探针分离提纯。可以理解，以上两种获得环化锁式探针的方法都可以用于本申请，在此不做具体限定。
还需要说明的是，第一，本申请的捕获探针实际上就是根据锁式探针的Zip区序列设计的，第一捕获探针的序列与用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针的Zip区序列或部分序列相同；第二捕获探与用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针的Zip区序列或部分序列相同；以便于与滚环扩增的产物杂交；可以理解，捕获探针的序列只要全部或部分与Zip区序列相同，能够实现与滚环扩增产物杂交，将滚环扩增产物捕获即可，本申请优选的方案中对两条捕获探针的具体序列进行了限定，但是不排除，其它的能够与滚环扩增产物杂交的捕获探针同样可以用于本申请。此外，可以理解，捕获探针的目的就是将锁式探针杂交捕获，基于此，实际上捕获探针也可以根据锁式探针的T1检测臂或T2检测臂设计；在此不做具体限定。第二，根据液相芯片的原理，微球的编码是用于定位微球的，因此，只要捕获探针与微球的编码是试验事先设计好的，可以是一条捕获探针对应于一个编码的微球。第三，本申请的一个关键点在于将液相芯片技术与滚环扩增结合，从而充分发挥滚环扩增高效的体外扩增性能和液相芯片高通量的检测功能；实现对受检样品的高灵敏度、高通量检测。通常认为，超分支滚环扩增比常规PCR扩增的效率更高。第四，本领域技术人员熟知，在滚环扩增中，只要锁式探针的序列确定好后，根据其通用引物结合区设计一条引物即可实现对连接成环状的锁式探针进行无限循环的重复扩增，即只需要第一引物即可，并不需要像常规PCR那样使用两条引物；因此，本申请在确定了锁式探针具体序列后，只需要采用常规的方式，根据通用引物结合区设计一条引物即可进行滚环扩增，其具体序列可以根据本申请的锁式探针的通用引物结合区进行设计，不作为本申请的必要限定；只是，本申请的优选方案中对通用引物的具体序列进行了限定。在滚环扩增中，虽然只需第一引物即可实现对连接成环的锁式探针的扩增；但是，为了达到更好的信号放大效果，还可以添加一条与锁式探针的互补序列结合的下游引物，实现指数扩增，即通常所说的超分支滚环扩增。可以理解，实现超分支滚环扩增，只需要采用一条与锁式探针的通用引物结合区序列一样序列的引物，且与第一引物不会形成引物二聚体即可；本申请优选的方案中同样对第二引物的具体序列进行了限定。但是，无论是第一引物，还是第二引物，其具体序列都不仅限于本申请所提供的序列，可以理解，在本申请提供的具体序列的引物基础上，还可以在5’端添加或减少若干碱基，或者根据探针的引物结合区，在3’端添加或减少若干碱基。第五，通用引物中，第一引物上具有生物素标记，这个是为了便于液相芯片检测荧光信号的，可以理解，其它能够被液相芯片检测的荧光信号同样可以用于本申请，并不只限于生物素标记。同样的，如果没有液相芯片检测设备，只是采用本申请的锁式探针、通用引物和捕获探针，也可以实现其它方式的检测，例如斑点杂交技术，又或者，仅仅采用本申请的锁式探针和通用引物进行滚环扩增后通过琼脂糖凝胶电泳检测，此时则不需要对引物进行生物素标记。在进行琼脂糖凝胶电泳检测时，如果仅采用通用引物的第一引物进行扩增，则可以看到弥散状的条带，如果同时采用第一引物和第二引物进行滚环扩增，则可获得阶梯状的条带。本申请的优选方案中，对本申请的多重检测方法中涉及的锁式探针、通用引物和捕获探针进行了保护。
优选的，第一捕获探针为Seq ID No.3所示序列，第二捕获探针为Seq ID No.4所示序列，并且第一捕获探针和第二捕获探针的5'端都分别带有氨基修饰的C12手臂寡核苷酸标记。
Seq ID No.3：5’-ATGCAGCGTAGGTATCGACT-3’
Seq ID No.4：5’-GTCACGTATGGTTCGCTGCT-3’。
需要说明的是，C12标记的作用是提供结合空间，这可以从两个方面理解，第一，C12标记可以方便捕获探针与液相芯片的编码微球结合；第二，C12标记为结合到微球上的捕获探针杂交捕获滚环扩增产物提供了缓冲空间。因此，可以理解，C12的作用就是提供结合空间，其它类似的如C6等，同样能够起到缓冲结合空间作用的寡核苷酸标记也可以用于本申请，在此不做具体限定。
优选的，第一引物为Seq ID No.5所示序列，第二引物为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.5：5’-GACATTCTGGACCTATTGGGA-3’；
Seq ID No.6：5’-AGCCGTTCCTCACACCAGAC-3’。
本申请的另一面公开了一种用于豆类检疫性植物病原细菌高通量检测的锁式探针，包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，第二锁式探针为Seq ID No.2所示序列。
需要说明的是，本申请的锁式探针是特别针对豆类上两种重要的检疫性植物病原细菌设计的，可以理解，除了用于本申请的高通量检测方法以外，其它检测方法同样可以采用本申请的锁式探针。
本申请进一步的还公开了一种与本申请的锁式探针配合使用的通用引物，该通用引物包括与锁式探针结合的第一引物和第二引物，第一引物为Seq ID No.5所示序列，第二引物为Seq ID No.6所示序列。
可以理解，只要锁式探针的序列是确定的，其通用引物的序列可以根据锁式探针的通用引物结合区进行设计，本申请Seq ID No.5所示序列的第一引物或Seq ID No.6所示序列的第二引物只是一个优选的实现方式，不排除还可以根据本申请的锁式探针的通用引物结合区设计出其它引物。
本申请的再一面公开了一种用于杂交捕获本申请的锁式探针的捕获探针，该捕获探针包括第一捕获探针和第二捕获探针，第一捕获探针用于杂交捕获第一锁式探针，第一捕获探针为Seq ID No.3所示序列，第二捕获探针用于杂交捕获第二锁式探针，第二捕获探针为Seq ID No.4所示序列。
可以理解，本申请的锁式探针、通用引物和捕获探针等都可以制成试剂盒以方便使用。同样的，为了便于适应不同的使用需求，锁式探针、通用引物和捕获探针可以一起做成试剂盒，也可以单独做成不同的试剂盒，在此不做具体限定。当然，为了便于使用，试剂盒中也可以包含用于锁式探针连接成环的试剂和滚环扩增的试剂。此外，如果是用于液相芯片检测，则第一引物的5’端需要进行生物素标记，而两条捕获探针的5’端也需要分别进行带有氨基修饰的C12手臂寡核苷酸标记。如果仅仅采用凝胶电泳对滚环扩增产物进行检测，不仅不需要对第一引物进行生物素标记，甚至都不需要捕获探针。如果不是用于液相芯片，而是采用其它显色方式，则第一引物的5’端会需要相应的显色的基团标记，在此不做具体限定；同样的，如果采用其它载体，如斑点杂交，则两条捕获探针可能需要其它基团标记，以便于捕获探针结合到载体上；总的来说，根据不同的载体，捕获探针的5'端可以进行不同的标记，以便于捕获探针结合到载体上；而根据不同的显色方式，第一引物的5’端也会采用不同的标记，在此不做具体限定。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请首次设计了豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌两种重要检疫性植物病原细菌的锁式探针，并构建了豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法。本申请的高通量检测方法，首次将滚环扩增和液相芯片技术结合，其特异性强、灵敏度高，实现了两个重要检疫性植物细菌的双重检测，缩短了传统豆类检疫性细菌的检测时间，加快了我国口岸进出口货物的通关速度，降低了企业成本，为我国口岸检验检疫提供了一种快速、准确的新检测技术，具有重要的技术性和实用性，其推广应用前景强，能带来重要的经济和社会效益。
附图说明
图1是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌的滚环扩增产物的凝胶电泳结果图；
图2是本申请实施例中菜豆晕疫病菌的滚环扩增产物的凝胶电泳结果图；
图3是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌DNA进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图4是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌DNA进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图5是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌悬液直接进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图6是本申请实施例中豌豆细菌性疫病菌悬液直接进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图7是本申请实施例中菜豆晕疫病菌DNA进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图8是本申请实施例中菜豆晕疫病菌DNA进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图9是本申请实施例中菜豆晕疫病菌悬液直接进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图10是本申请实施例中菜豆晕疫病菌悬液直接进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图；
图11是本申请实施例中荧光编码微球与捕获探针偶联效率验证结果图；
图12是本申请实施例中另一荧光编码微球与捕获探针偶联效率验证结果图；
图13是本申请实施例中液相芯片杂交的温度优化结果图；
图14是本申请实施例中液相芯片杂交的时间优化结果图；
图15是本申请实施例中采用豆类检疫性植物细菌的液相芯片检测方法对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌进行双重检测的特异性检测结果图；
图16是本申请实施例中采用豆类检疫性植物细菌的液相芯片检测方法对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌进行双重检测的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
本申请率先设计了豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌两个豆类检疫性植物细菌的锁式探针，并创造性地将滚环扩增与液相芯片结合，建立了基于滚环扩增的豆类检疫性植物细菌的液相芯片双重检测方法，实现了对豆类上两个重要的检疫性细菌灵敏、高效、特异的检测。可以理解，本申请的两条锁式探针可以一起使用，实现两个检疫性细菌的双重检测，也可以单独使用，实现对其中一个检疫性细菌的检测；另外，也可以整合到其它的检疫性病害检测方法中，实现更多重的检测。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例
一、材料
1.1供试菌株
本例的供试菌株如表1所示。
表1 供试菌株情况
编号 中文名称 菌株
470101 燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae subsp.avenae
470122 瓜类细菌性果斑病菌 Acidovorax avenae subsp.citrulli
470308 番茄细菌性溃疡病菌 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis
470326 密歇根棒形杆菌棋盘亚种 Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius
470356 菜豆细菌性萎蔫病菌 Curtobacterium flaccumfacienspv.flaccumfaciens
470363 甜菜细菌性叶斑病菌 Curtobacterium flaccumfaciens pv.betae
470404 梨火疫病菌 Erwania amylovora
470550 桃树溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv.persicae
470520 猕猴桃溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv.actinidiae
470522 玉米细菌性枯萎病菌 Pantoea stewartii pv.stewartii
470549 核果树溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv.morsprunorum
470543 梨花枯萎病菌 Pseudomonas syringae pv.syringae
470537 番茄细菌性叶斑病菌 Pseudomonas syringae pv.tomato
470572 豌豆细菌性疫病菌 Pseudomonas syringae pv.pisi
470575 豌豆细菌性疫病菌 Pseudomonas syringae pv.pisi
470580 豌豆细菌性疫病菌 Pseudomonas syringae pv.pisi
470581 菜豆晕疫病菌 Pseudomonas syringae pv.phaseolicola
470582 菜豆晕疫病菌 Pseudomonas syringae pv.phaseolicola
470583 菜豆晕疫病菌 Pseudomonas syringae pv.phaseolicola
470545 十字花科黑斑病菌 Pseudomonas syringae pv.maculicola
470530 黄瓜细菌性角斑病菌 Pseudomonas syringae pv.lachrymans
470532 板栗溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv.castaneae
470533 向日葵细菌性叶斑病菌 Pseudomonas syringae pv.helianthi
470534 苹果疱斑病菌 Pseudomonas syringae pv.papulans
470701 柑橘溃疡病菌 Xanthomonas axonopodis pv.citri
470719 菜豆细菌性疫病菌 Xanthomonas campestris pv.phaseoli
470709 大豆斑疹病菌 Xanthomonas axonopodis pv.glycines
470712 十字花科蔬菜黑腐病菌 Xanthomonas campestris pv.campestris
表中六位数字的编号为深圳出入境检验检疫局植物检验检疫实验室植物病原细菌保存库菌株编号；所有供式菌株均由深圳出入境检验检疫局植物检验检疫实验室提供。
1.2试剂和仪器
试剂：Taq DNA ligase、Exonuclease I、ExonucleaseⅢ、Bst DNA polymerase、dNTPs、100bp DNA ladder、DL2000Maker，以上试剂均购买于NEW ENGLAND Biolabs。2×PCRMaster Mix(themol scientific)、DNA提取试剂盒(Axygen)，羧基化非磁性微球#21和#37(1.25×10-7beads/ml)(Bio-Rad)；碳化二亚胺(EDC)(Pierce)、2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、氯化四甲胺(TMAC)(sigma)、链霉素-藻红蛋白(SA-PE)(prozyme)。
仪器：ND-2000微量外分光光度计、PCR扩增仪(C1000Touch,Bio-Rad,USA)、DU640紫外分光光度计(Beckman DU,USA)、凝胶成像系统VersarDoc 1000(Bio-Rad,USA)、Bio-Suspension Array System。
1.3锁式探针和引物的设计
本例分别针对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌的DNA序列，设计了能够特异性的分别与两个靶标序列杂交的锁式探针，并通过NCBI确定其特异性，证实设计的锁式探针仅能与其对应的靶标序列杂交，保障其特异性。并通过RNAstructure检测所设计探针的二级结构，保障所设计的锁式探针具备良好的二级结构。
与此同时，本例还合成了两条通用引物，即第一引物和第二引物。并且，还设计了分别针对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌常规PCR引物，以作为滚环扩增的对照。另外，还根据设计的锁式探针合成了两条捕获探针。
所有锁式探针、通用引物、常规PCR引物、捕获探针均由大连宝生物工程有限公司合成。锁式探针5’端进行磷酸化修饰；滚环扩增的第一引物用生物素标记；两条捕获探针的5’端分别进行氨基修饰的C12寡核苷酸标记。各序列如表2所示。
表2 锁式探针、通用引物、常规PCR引物和捕获探针
二、实验方法
2.1菌株核酸提取
菌株核酸提取采用Axygen的基因组DNA提取试剂盒，提取方法参照说明书，具体包括：用1.5mL离心管收集细胞悬浮液，2000g转离心5min后弃上清液；加入350μL去离子水或PBS悬浮细胞，振荡混匀；加入0.8μL RNaseA，漩涡震荡15s，室温静置1min；加入150μLBufferC-L和8μL proteinase K立即漩涡震荡1min，短暂离心后，置56℃水浴30min以上；水浴后加入350μL BufferP-D，漩涡震荡30s后混匀，12000转离心10min；将DNA制备管至于2mL离心管中，将12000转离心后的上清液转移至制备管，12000转离心1min；弃滤液加500μLBuffer W1，12000转离心1min；弃滤液加700μL Buffer W2，12000转离心1min，重复1次；弃滤液后再离心1min；另置于洁净的1.5ml离心管中，加入120μL Eluent，静置1min后离心1min，离心获得的液体即DNA溶液。
2.2单重滚环扩增检测体系建立
2.2.1锁式探针连接环化反应
将锁式探针与对应的靶标菌以及对照菌株的DNA模板分别进行连接环化反应，无菌水作为空白对照，反应体系为10μL：10×Taq DNA Buffer 1μL，40U/μL的TaqDNA连接酶0.15μL，200pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，无菌ddH2O补足10μL。
采用热循环连接法连接，反应条件为：94℃4min；然后进入15个循环94℃30s，65℃5min；循环完成后，95℃15min灭活Taq DNA连接酶，最后4℃保存。
2.2.2消化反应
向已连接好的PCR反应管中加入消化反应混合液10μL，混合液包括：10×Exonuclease I Buffer 2μL，20U/μL的ExonucleaseI 0.5μL，10×ExonucleaseⅢBuffer 2μL，100U/μL的ExonucleaseⅢ0.05μL，无菌ddH2O补足10μL。
消化反应条件为：37℃反应2.5h，彻底消化未环化的线性探针和未反应的DNA模板，然后于95℃反应20min，灭活剩余的核酸外切酶。
2.2.3滚环扩增反应
将锁式探针连接消化后的产物作为模板，用通用引物，即第一引物和第二引物，进行滚环扩增。反应体系为25μL：10×Bst DNA Buffer 2.5μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶0.5μL，10μmol/L的45F 0.5μL，10μmol/L的45R 0.5μL，10mmol/L的dNTPs 1μL，环化连接消化后产物2μL，无菌ddH2O补足25μL。
反应条件为：62.5℃反应1h。反应结束后取7μL反应产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外凝胶成像系统照相分析。
2.3常规PCR扩增
PSPI常规PCR采用引物EFEP1/EFEP2进行扩增，反应体系为25μL:2×PCR Mastermix 12.5μL，10μmol/L的EFEP10.5μL，10μmol/L的EFEP20.5μL，模板2μL，无菌ddH2O补足25μL；反应条件为：95℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后在72℃下10min。反应结束后取7μL反应产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外凝胶成像系统照相分析，其阳性结果具有303bp的扩增产物。
PSPHA常规PCR采用引物HB14F/HB14R进行扩增，反应体系为25μL：2×PCR Mastermix 12.5μL，10μmol/L的HB14F 0.5μL，10μmol/L的HB14R0.5μL，模板2μL，无菌ddH2O补足25μL；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性1min，65℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后在72℃下10min。反应结束后取7μL反应产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外凝胶成像系统照相分析，其阳性结果具有1400bp的条带。
2.4单重滚环扩增检测体系性能测试
2.4.1特异性测试
分别取所有供试菌株DNA按2.2.3进行滚环扩增检测，测试锁式探针的特异性。
2.4.2灵敏度测试
选取菌株470580、470582作为PSPI和PSPHA的阳性标准菌，将其DNA和纯菌悬液以10倍梯度稀释后作为模板。分别取2μL进行滚环扩增和常规PCR反应，比较两者方法的灵敏度。
2.5双重液相芯片检测体系的建立
2.5.1双重滚环扩增
双重滚环扩增关键步骤在连接反应体系中添加两条锁式探针进行连接，体系为10μL：10×Taq DNA Buffer 1μL，40U/μL的Taq DNA连接酶0.15μL，200pmol/L的混合锁式探针0.2μL，模板2μL，补充H20至10μL。连接反应条件同2.2.1，消化反应参见2.2.2，滚环扩增反应参见2.2.3，滚环扩增中使用生物素标记的第一引物，将反应产物保留用于液相芯片杂交。
2.5.2捕获探针与荧光编码微球偶联
选取#21及#37羟基微球分别与PSPI和PSPHA的捕获探针进行偶联，偶联操作步骤如下：取2份新鲜的EDC粉末，恢复至室温，蜗旋仪上以最高转速悬浮微球30s混匀，然后在超声清洗仪上超声微球30s；取100μL微球到EP离心管中，最高转速离心2min弃上清，用50μL0.1M，pH4.5的MES重悬微球，彻底蜗旋30s，超声20s，使微球分散；加入2μL稀释好的0.1nmol/μL的捕获探针于重悬微球中，混匀涡旋震荡20s。制备新鲜的EDC溶液10mg/ml，加入2.5μL EDC至微球中，彻底混匀。室温黑暗条件下600rpm震荡孵育30min。再次制备新鲜的EDC溶液10mg/ml，加入2.5μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孵育30min。加入1mL 0.02％Tween 20，稍微蜗旋混匀，最高转速离心2min，弃上清液。用1mL0.1％的SDS重悬沉淀40s，最高转速离心1-2min，弃上清液。用100μL pH8.0的1×TE buffer重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋30s，超声20s，4℃黑暗条件下储存。
2.5.3微球与捕获探针偶联效率验证
将偶联好的微球与其验证探针在不同浓度梯度下进行杂交检测，以确定微球的有效性。每种微球个数不少于100，且阴性对照的荧光信号中位值(MFI)不高于300为偶联成功的判断标准。其中，验证探针为与捕获探针序列反向互补的探针，并且验证探针上具有生物素标记，验证探针由大连宝生物工程有限公司合成。阴性对照即空白对照采用TE。将偶联好的微球按照浓度0、5、10、20、50、100、200fmol，7个梯度稀释，然后与验证探针杂交，检测其偶联效率；其中0fmol即不含偶联微球的稀释液。
2.5.4双重液相芯片杂交
根据Bio-rad公司推荐的微球与产物杂交方法，首先配置工作混合微球，把11μLTE与6μL滚环扩增产物进行混匀，加入工作微球33μL,充分混匀，避光置于PCR仪，50℃杂交15min，然后向孔中加入100μL提前预热的SA-PE报告混合液，再转移到反应板上，室温孵育10min。孵育完后直接上Bio-plex 200System检测，读取检测结果并分析。液相芯片定性比值结果判定(luminex qualitative ratio result,LQRR)等于样品的校正后荧光强度中位值(Median florescence intensity，MFI)与空白对照MFI的平均值(MFIB)的比值，即LQRR＝MFI/MFIB。如果LQRR≥3，判定为阳性样本；如果2≤LQRR＜3，则判定可疑，需复检；如果LQRR＜2，则判定为阴性。
2.5.5液湘芯片体系优化
为确保检测体系灵敏性，分别对杂交温度和杂交时间进行优化，即根据捕获探针的Tm值选定46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃，六个温度梯度进行研究，杂交时间为15min，其他条件保持一致，观察不同杂交温度下的液相芯片检测结果，进行3个重复，以确定最佳的杂交温度。同时，在保持反应体系完全相同的条件下，以最佳杂交温度分别设置杂交时间10min、15min、20min、25min、30min、40min六个时间进行优化，观察不同杂交时间下的液相芯片检测效果，进行3个重复，确定最佳的杂交时间。
2.6双重液相芯片检测体系性能测试
2.6.1特异性测试
选取DNA 470572、470575、470580作为PISI阳性样本和470581、470582和470583作为PSPHA阳性样本，以及470101、470549、470520、470537、470356、470701、470719的DNA作为阴性样本进行二重液相芯片检测的特异性试验，无菌水作空白对照。按照2.5建立的双重液相芯片检测体系进行检测。
2.6.2灵敏度测试
选取PSPI和PSPHA的DNA，以10倍梯度稀释，以混合DNA作为二重滚环扩增的模板，并将扩增产物进行液相芯片检测，确定其灵敏度。
2.6.3重复性测试
按照2.6.1的特异性检测试验，进行3次重复的液相芯片特异性检测试验，判断该双重液相芯片的稳定性。
三、结果及分析
3.1单重滚环扩增检测的特异性
PSPI和PSPHA的单重滚环扩增检测特异性试验结果如表3所示。从表3的统计结果可见，供试的28株菌株中，第一锁式探针，即13#-PLP能够特异性的扩增出PSPI的3株细菌，而其它近似种则无扩增出阶梯状条带，证实本例设计的第一锁式探针能够特异性的检测出PSPI；第二锁式探针，即14#-PLP能够特异性的扩增出PSPHA的3株细菌，而其它近似种则无扩增出条带，证实本例设计的第二锁式探针能够特异性的检测出PSPHA；表明，建立PSPI和PSPHA的单重滚环扩增检测技术特异性强，可用于豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌的日常检测。
部分检测结果如图1-图2所示，图1为豌豆细菌性疫病菌的滚环扩增产物的凝胶电泳结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1为无菌水对照，泳道2为470575，泳道3为470580，泳道4为470101，泳道5为470308，泳道6为470356，泳道7为470404，泳道8为470520，泳道9为470549，泳道10为470543，泳道11为470537，泳道12为470581，泳道13为470582，泳道14为470545，泳道15为470533，泳道16为470719，泳道17为470709。图2为菜豆晕疫病菌的滚环扩增产物的凝胶电泳结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1为无菌水对照，泳道2为470581，泳道3为470582，泳道4为470583，泳道5为470101，泳道6为470308，泳道7为470356，泳道8为470404，泳道9为470520，泳道10为470549，泳道11为470543，泳道12为470537，泳道13为470575，泳道14为470545，泳道15为470533，泳道16为470719，泳道17为470709。
表3 滚环扩增和常规PCR的扩增产物凝胶电泳结果统计
表中，PSPI表示PSPI的锁式探针或常规PCR检测结果统计，PSPHA表示PSPHA的锁式探针或常规PCR检测结果统计，RCA表示滚环扩增的检测结果，PCR表示常规PCR的检测结果，“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
3.2单重滚环扩增检测的灵敏度
3.2.1 PSPI单重滚环扩增灵敏度
本试验采用470580菌株作灵敏度试验的标准菌株，并制成1×108cfu/mL的菌悬液，按照10倍梯度稀释，分别稀释成107cfu/mL，106cfu/mL，105cfu/mL，104cfu/mL，103cfu/mL和102cfu/mL的菌悬液，以供灵敏度测试。并提取470580菌株的DNA，用紫外分光光度计测量，配制成初始浓度为60ng的原始溶液，按照10倍梯度进行稀释，分别稀释成6ng，600pg，60pg，6pg，600fg，60fg，以供灵敏度测试。分别采用滚环扩增和常规PCR进行灵敏度测试。
灵敏度检测结果如图3-6所示，图3为豌豆细菌性疫病菌DNA进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1-7依序为60ng、6ng、600pg、60pg、6pg、600fg和60fg的DNA扩增的结果，泳道8为无菌水对照，其电泳图表明：滚环扩增检测PSPI的DNA的下限为6pg，600fg的样品仍然有微弱的信号。图4为豌豆细菌性疫病菌DNA进行常规PCR扩增后其产物通过凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，各泳道与图3相同，其电泳结果表明：常规PCR检测PSPI的DNA的下限为6pg，但信号已经比较弱。
图5为豌豆细菌性疫病菌悬液直接进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1-7依序为108cfu/mL、107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL和102cfu/mL的菌悬液扩增的结果，泳道8为无菌水对照，其电泳图表明：检测PSPI菌悬液的下限为103cfu/mL。图6为豌豆细菌性疫病菌悬液直接进行常规PCR扩增后其产物通过凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，各泳道与图5相同，其电泳结果表明：检测PSPI的菌悬液的下限为105cfu/mL。可见，滚环扩增检测DNA的灵敏度和常规PCR相近，而在检测菌悬液灵敏度方面滚环扩增要比常规PCR高出两个数量级。可能是因为细胞菌悬液存在着一些菌体残质，会对低浓度下常规PCR扩增产生一定影响，然而这些杂质对滚环扩增影响更小，更适合口岸快速、准确的检测需求。
3.2.2 PSPHA单重滚环扩增灵敏度
本试验以470582作灵敏度试验标准菌株，并制成1×108cfu/mL的菌悬液，按照10倍梯度稀释，分别稀释成107cfu/mL，106cfu/mL，105cfu/mL，104cfu/mL，103cfu/mL和102cfu/mL的菌悬液，以供灵敏度测试。并提取470582菌株的DNA，用紫外分光光度计测量，配制成初始浓度为60ng的原始溶液，按照10倍梯度进行稀释，分别稀释成6ng，600pg，60pg，6pg，600fg，60fg，以供灵敏度测试。分别采用滚环扩增和常规PCR进行灵敏度测试。
灵敏度检测结果如图7-10所示，图7为菜豆晕疫病菌DNA进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1-7依序为60ng、6ng、600pg、60pg、6pg、600fg和60fg的DNA扩增的结果，泳道8为无菌水对照，其电泳图结果表明：滚环扩增检测PSPHA的DNA的下限为600fg，60fg的样品仍然有微弱的信号；而图8为菜豆晕疫病菌DNA进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，各泳道与图7相同，其电泳结果表明：常规PCR检测PSPHA的DNA的下限为600fg。图9为菜豆晕疫病菌悬液直接进行滚环扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，泳道M为100bp DNA ladder，泳道1-7依序为108cfu/mL、107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL和102cfu/mL的菌悬液扩增的结果，泳道8为无菌水对照，其电泳图结果表明：检测PSPHA的菌悬液的下限为102cfu/mL。图10为菜豆晕疫病菌悬液直接进行常规PCR扩增后凝胶电泳检测其灵敏度的结果图，各泳道与图9相同，其电泳图结果表明：检测PSPHA的菌悬液的下限为104cfu/mL。可见，滚环扩增检测PSPHA的DNA灵敏度和常规PCR相近，而在检测菌悬液灵敏度方面滚环扩增要比PCR高出两个数量级，与PSPI的检测结果相似。
3.3荧光编码微球与捕获探针偶联效率验证
结果如图11和图12所示，图11为#21羟基微球与PSPI的捕获探针，即第一捕获探针偶联效率验证结果，图14是#37羟基微球与PSPHA的捕获探针，即第二捕获探针偶联效率验证结果。结果显示，荧光信号随着探针浓度的升高逐渐升高，低浓度到高浓度有一定的线性关系，阴性对照0fmol的MFI小于300，说明微球偶联效果良好。
3.4液湘芯片体系优化
滚环扩增产物与偶联微球的捕获探针杂交的最佳条件是保证体系检测特异性和灵敏性的关键。
由于温度对杂交效果有显著的影响，选择合适的温度既可以增强特异性杂交，又能降低非特异性杂交的荧光强度。因此，根据捕获探针的Tm值选定46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃六个梯度温度进行研究，杂交时间为15min，观察不同杂交温度下的液相芯片检测结果，检测结果如图13所示，各个参与计数的荧光编码微球均在100个以上，每个微球的空白荧光值均小于300，其结果有效；同时，从46℃到52℃随着温度的升高PSPI和PSPHA对应的两种微球的荧光信号不断增强，52℃到56℃开始略微下降，所以确定52℃为杂交的最佳温度。
为了达到快速、准确检测的目的，在保持反应体系完全相同的条件下，以52℃的杂交温度，分别设置杂交时间10min、15min、20min、25min、30min、40min六个时间进行优化，观察不同杂交时间下的液相芯片检测效果，试验结果如图14所示，结果表明，各个参与计数的荧光编码微球均在100个以上，每个微球的空白荧光值均小于300，结果有效；而且杂交时间从15min到40min之间，PSPI和PSPHA对应的荧光信号逐渐增强，30min到40min，变化量少，根据其本底荧光值的大小，足以判定结果，因此为了节省检测时间，选30min作为杂交时间。
图13和图14，其各温度点或时间点的柱状图中，左边的条柱为PSPI的结果，右边的条柱为PSPHA的结果。
3.5双重液相芯片特异性
PSPI和PSPHA的双重液相芯片检测特异性结果如表4和图15所示。
表4 双重液相芯片特异性检测结果
表中“sample”表示菌株样品DNA的滚环扩增产物，“PSPI-13#(21)”表示第一捕获探针与21号微球偶联后通过液相悬浮芯片仪检测到PISI的结果数据，“PSPHA-14#(37)”表示第二捕获探针与37号微球偶联后通过液相悬浮芯片仪检测到PSPHA的结果。“MFI”即样品的校正后荧光强度中位值(Median florescence intensity，MFI)，“LQRR”表示定性比值结果判定，“Result”即判定结果，“+”表示阳性，“-”表示阴性。“*”表示空白点。
结果显示，检测样本中只有含有PSPI和PSPHA单重或混合模板对应微球的LQRR值大于3，检测结果判定为阳性，其余都小于3，检测结果判定为阴性。同时，PSPI和PSPHA两条捕获探针与各自模板无非特异性扩增，表明该二重液相芯片具有良好的特异性。
柱状图15中从左到右，即第一到第三个样本均为PSPI和PSPHA的混合DNA模板，对应的各自微球都显示出强烈的荧光信号，结果呈阳性；第四个样本为PSPI和阴性对照菌的混合DNA模板，只有PSPI对应的微球显示荧光信号，第五个样本为PSPHA和阴性对照菌的混合DNA模板，只有PSPHA对应的微球显示荧光信号；第六至第十一为PSPI或PSPHA的单重DNA模板，相对应微球信号也显阳性；第十二至十八均为阴性对照菌的单重DNA模板，结果均为阴性；第十九为空白对照，两种微球荧光信号值均小于300，说明试验结果可信。从以上结果分析说明双重液相芯片检测具有良好的特异性。
3.6双重液相芯片灵敏度
PSPI和PSPHA的双重液相检测灵敏度结果如表5和图16所示。
表5 双重液相芯片灵敏度检测结果
从表5和图16结果表明，根据LQRR值大于3，检测结果判定为阳性的原则，二重液相芯片对PSPI核酸模板的检测的最低浓度为600fg；对PSPHA核酸模板的检测最低浓度为60fg。
3.7双重液相芯片检测稳定性
计算3次检测的平均荧光强度值的变异系数，结果显示各个变异系数均在10％以内，表明该二重液相芯片检测方法具有可重复性和稳定性。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，其特征在于：包括(1)锁式探针环化和扩增：将受检样品的DNA或菌悬液与锁式探针一起进行环化连接反应，用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；(2)液相芯片检测：将滚环扩增的产物与液相芯片的编码微球杂交，杂交完成后用液相悬浮芯片检测仪进行检测；
所述锁式探针包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，所述第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，所述第二锁式探针为Seq ID No.2所示序列，第一锁式探针和第二锁式探针的5'端都有磷酸化标记；
所述液相芯片的编码微球上偶联有与滚环扩增产物杂交的捕获探针；所述捕获探针包括第一捕获探针和第二捕获探针，两条捕获探针分别偶联到不同的编码微球上，所述第一捕获探针用于杂交捕获所述第一锁式探针，所述第二捕获探针用于杂交捕获所述第二锁式探针；
所述通用引物为能够与连接成环的锁式探针发生超分支滚环扩增的引物组合，由与锁式探针杂交结合的第一引物和与锁式探针互补序列杂交结合的第二引物组成，其中第一引物的5'端具有生物素标记；
Seq ID No.1：
5’-P-TGTTCAAATACGAAGGCGGTCTGCTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACATGCAGCGTAGGTATCGACTGCAGCGGTAAGGAAGAAT-3’，
Seq ID No.2：
5’-P-GGTACTCACTTGGTGGGCTTCCGTTTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACGTCACGTATGGTTCGCTGCTCCCACAGCGTGACGGT-3’；
所述第一捕获探针为Seq ID No.3所示序列，所述第二捕获探针为Seq ID No.4所示序列，并且第一捕获探针和第二捕获探针的5'端都分别带有氨基修饰的C12手臂寡核苷酸标记；
Seq ID No.3：5’-ATGCAGCGTAGGTATCGACT-3’
Seq ID No.4：5’-GTCACGTATGGTTCGCTGCT-3’；
所述第一引物为Seq ID No.5所示序列，所述第二引物为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.5：5’-GACATTCTGGACCTATTGGGA-3’；
Seq ID No.6：5’-AGCCGTTCCTCACACCAGAC-3’。
2.一种用于豆类检疫性植物病原细菌高通量检测的锁式探针，其特征在于：包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，所述第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，所述第二锁式探针为Seq ID No.2所示序列。
3.一种用于杂交捕获权利要求2所述的锁式探针的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针包括第一捕获探针和第二捕获探针，所述第一捕获探针用于杂交捕获所述第一锁式探针，第一捕获探针为Seq ID No.3所示序列，所述第二捕获探针用于杂交捕获所述第二锁式探针，第二捕获探针为Seq ID No.4所示序列。
4.一种用于豆类检疫性植物病原细菌高通量检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求2所述的锁式探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有权利要求3所述的捕获探针。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有通用引物，所述通用引物由与锁式探针杂交结合的第一引物和与锁式探针的互补序列杂交结合的第二引物组成；所述第一引物为Seq ID No.5所示序列，所述第二引物为Seq ID No.6所示序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述第一引物上具有生物素标记。
8.根据权利要求4-7任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有用于锁式探针连接成环的试剂和滚环扩增的试剂。
CN201510229350.XA 2015-05-07 2015-05-07 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针 Expired - Fee Related CN104862392B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510229350.XA CN104862392B (zh) 2015-05-07 2015-05-07 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510229350.XA CN104862392B (zh) 2015-05-07 2015-05-07 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104862392A CN104862392A (zh) 2015-08-26
CN104862392B true CN104862392B (zh) 2018-01-16

Family

ID=53908563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510229350.XA Expired - Fee Related CN104862392B (zh) 2015-05-07 2015-05-07 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104862392B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886644B (zh) * 2016-05-25 2019-08-20 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012245B (zh) * 2017-05-12 2023-05-12 兰州海关技术中心 一种检测菜豆晕疫病菌实时荧光pcr试剂盒及其检测方法
CN108085369B (zh) * 2017-12-28 2021-07-09 东南大学 一种量子点荧光编码微球—滚环扩增高通量筛选g-四链体dna的方法
CN110577984A (zh) * 2019-08-21 2019-12-17 南京艾瑞谱生物技术有限公司 一种多重可视化核酸检测方法
CN110878356B (zh) * 2019-11-29 2022-02-18 西安交通大学 一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用
CN116463445B (zh) * 2023-03-24 2024-04-30 西南大学 一种柑橘全基因组40k液相芯片及应用
CN116162731B (zh) * 2023-03-31 2023-07-14 北京林业大学 基于锁式探针的落叶松枯梢病菌滚环扩增引物组及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014169A (zh) * 2012-12-28 2013-04-03 北京大学 基于纳米颗粒和滚环扩增的核酸定性检测方法
CN104232767A (zh) * 2014-09-05 2014-12-24 中华人民共和国福清出入境检验检疫局 香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014169A (zh) * 2012-12-28 2013-04-03 北京大学 基于纳米颗粒和滚环扩增的核酸定性检测方法
CN104232767A (zh) * 2014-09-05 2014-12-24 中华人民共和国福清出入境检验检疫局 香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于锁式探针的滚环扩增技术在植物病原检测中的应用;刘倩 等;《植物检疫》;20091231;第23卷(第3期);第38-41页 *
植物材料中丁香假单胞菌的初筛;刘鹏 等;《植物病理学研究进展》;20061024;第89-92页 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886644B (zh) * 2016-05-25 2019-08-20 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104862392A (zh) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104862392B (zh) 豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针
CN104862406B (zh) 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒
CN106399490B (zh) 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用
CN104846097B (zh) 幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒
CN105331714A (zh) 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法
CN106755416B (zh) 用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、试剂盒及其应用
CN106399486A (zh) 用于多重pcr检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒
Herath et al. Detection of elm yellows phytoplasma in elms and insects using real-time PCR
Kang et al. Simple detection of Cochliobolus fungal pathogens in maize
Burnie et al. Semiquantitative polymerase chain reaction enzyme immunoassay for diagnosis of disseminated candidiasis
Chen et al. Rapid detection of Phytophthora cinnamomi based on a new target gene Pcinn13739
JP5522820B2 (ja) イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー
CN110982922A (zh) 基于lamp快速检测水稻恶苗病病原菌藤仓镰孢菌的引物组合物及方法
CN104372092B (zh) 一种木香疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN106381341A (zh) 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用
CN109295247A (zh) 大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403、引物及应用
CN101712982A (zh) 用于水稻细菌性谷枯病菌检测的引物对及检测方法
CN106801103B (zh) 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法
CN106884056A (zh) 检测寨卡病毒的引物、试剂盒和方法
CN106868113A (zh) 用于鉴定牛型结核分枝杆菌的snp标记及其应用
CN107447049B (zh) 一种快速检测土壤中病原微生物的方法
AU2020103778A4 (en) Primer Set for Detection of Streptococcus agalactiae, Detection Kit and Multiplex PCR Detection Method
CN109943624A (zh) 一种基于rpa-侧流层析技术检测大豆疫霉的方法及其专用引物及探针组合
CN109825627B (zh) 一种基于rpa-侧流层析技术检测丁香疫霉的引物和探针组合及其应用
CN109321666A (zh) SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180116

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee