CN102181578B - 检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，该检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。本发明进一步公开了含有上述引物的检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒，尤指多重RT-PCR检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于对动物组织样本的准确检测，还可适用于动物活体样本（咽喉拭子、肛门拭子、粪便、血清、疱疹皮、疱疹液、眼结膜分泌物等）的检测，可用于牛肠道病毒的国内筛查和出入境检疫，以及牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测和鉴别诊断等，属于动物疫病检测、检验检疫领域。
背景技术
牛肠道病毒和口蹄疫病毒都是小RNA病毒科成员。小RNA病毒是一个极为繁杂的病毒科，可分为鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属等5个属，共200多种病毒，能引起人和动物的多种疾病，如甲肝、口蹄疫等，在医学和兽医学研究中均具有重大意义。
肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，病原性不明显，通常引起轻度或不显性感染，但常因侵犯其他器官而引起各种临床综合征，或者在一定条件下引发显著症状，例如牛肠道病毒、猪肠道病毒、禽肠道病毒、人肠道病毒等等。
2005年初北京的牛场中发生牛肠道病毒感染，严重影响了畜牧业生产。部分牛场的产奶牛普遍（约80%）出现了严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数（10-15%）严重的还有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降（约30%）。约两周后康复，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平，特别是日产35千克以上高产奶牛。严重降低了生产性能，并且还有污染奶制品的可能。据跟踪调查，该病两年发生一次。我们在发病的牛场中已经分离到了牛肠道病毒。
随着猪链球菌2型病和高致病性蓝耳病的相继爆发，条件性致病菌／病毒对畜牧业生产和公共卫生安全方面的威胁，或者说潜在的危险也逐渐为人们所认识。因此我们认为随着人们对牛肠道病毒认识的加深和对公共卫生安全的重视日益加强，牛肠道病毒很有可能在将来被列为法检项目，在这种情况下我们提前针对牛肠道病毒建立快速、准确、敏感的诊断方法，进行技术储备显得格外重要，因此开展了牛肠道病毒快速检测技术研究。
口蹄疫病毒可以感染偶蹄动物引起急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等，黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。本病以牛最易感染，羊的感染率低。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。
牛肠道病毒与口蹄疫病毒同属于小RNA病毒科成员，在形态结构、化学组成、部分理化性质和对环境的抵抗力方面有很多相近之处，而国外研究报道了多起牛肠道病毒与口蹄疫病毒同时分离到的病例，因此针对牛肠道病毒和口蹄疫病毒建立鉴别诊断方法也具有重大意义。
在检验检疫过程中，快速、准确、敏感的诊断是检测疫病的关键所在。多重PCR可以同时区别鉴定两种或两种以上的病原，操作也比较简单易行，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，适用于多种病原的鉴别诊断。
因此我们针对牛肠道病毒基因和口蹄疫病毒基因建立多重RT-PCR快速检测技术，用于牛肠道病毒和口蹄疫病毒的鉴别诊断。这种检测方法的建立将为我国出入境牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检验检疫奠定良好的技术基础，可在各口岸和各养殖企业推广应用，以及时检出牛肠道病毒和口蹄疫病毒，保障公共卫生安全，保障我国牛及其产品进出口贸易的正常进行，推动外贸经济的发展。
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
多重PCR的用途主要有两方面：1、多种病原微生物的同时检测或鉴定；2、病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，可系统组合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠；有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠；有时是乙丙型肝炎病毒重叠。②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病。③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断。④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检。 ⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型；乳头瘤病毒的分型；单纯疱疹病毒的分型；杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等。
多重PCR的特点有：1、高效性，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染；2、系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌等的同时侦检；3、经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。因此近年来，多重PCR在兽医诊断、检测领域得到了大量应用。
本发明首次将多重PCR技术应用于牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测和鉴别诊断领域，提供了针对牛肠道病毒和口蹄疫病毒的特异性引物序列、试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的同时鉴别、检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，包括2对引物序列。
本发明的第二个目的是提供快速、准确、使用方便的同时鉴别、检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的多重PCR 检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
选择牛肠道病毒和口蹄疫病毒5’-非编码区基因序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上，进行引物设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。
一组检测牛肠道病毒的核苷酸序列，如下：
1）5’- GGG GAG TAG TCC GAC TCC GC-3'（SEQ ID NO：1）
2）5’- CRG AGC TAC CAC YGG GDW TGT GG -3’ （SEQ ID NO：2）
R代表嘌呤，此处为A或G；Y代表嘧啶，此处为T或C；D代表A或G或T； W代表A或T；
一组检测口蹄疫病毒的核苷酸序列，如下：
3）5’- GCC TGG TCT TTC CAG GTC T -3'（SEQ ID NO：3）
4）5’- CCA GTC CCC TTC TCA GAT C -3’ （SEQ ID NO：4）
其中序列1）和2）分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物，序列3）和4）分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。
我们采用多重PCR检测技术建立了同时检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物浓度的优化，反应体系的确定等。由于使用RT-PCR固体酶颗粒体系与使用反转录酶M-MLV+ Taq 酶体系都能检测出牛肠道病毒和口蹄疫病毒，而且灵敏度一致，所以两种体系均可以应用于检测。使用RT-PCR固体酶颗粒体系成本较高但操作简单，使用反转录酶M-MLV+ Taq 酶体系操作较复杂但成本比较低。可以根据需要，选择检测试剂盒的组成。
本发明提供的一种检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR检测试剂盒A，由以下组分组成：
1）裂解液：购自INVITROGEN公司，货号：15596-026，按5ml/管进行分装，6管/盒。
2）RT-PCR反应液，900μL/管进行分装，1管/盒。表1为RT-PCR反应液配方。
表1 RT-PCR反应液配方
| 组 分 | 终浓度 |
| 5×RT 缓冲液 | 1×RT 缓冲液 |
| 10×PCR 缓冲液 | 1×PCR 缓冲液 |
| MgCl2 | 3.0mM |
| dNTP | 0.2mM |
| 牛肠道病毒正义引物 | 0.2μM |
| 牛肠道病毒反义引物 | 0.2μM |
| 口蹄疫病毒正义引物 | 0.2μM |
| 口蹄疫病毒反义引物 | 0.2μM |
5×RT 缓冲液、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP 均购于Promega 公司；引物均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mM KCl 、100mM Tris-HCl(pH9.0 25℃)、1.0%Triton X-100。
3）Taq DNA聚合酶（5 U/μL，购自Promega公司，货号：M1665S）240μL/管，1管/盒。
4）反转录酶M-MLV（200U/μl，购自Promega公司，货号：M1 701）250μL/管，1管/盒。
5）DEPC水（用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟）1mL/管，5管/盒。
6）阴性对照：牛肠道病毒和口蹄疫病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时。
7）牛肠道病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成牛肠道病毒保守区基因片段EAV-5’UTR，长度为819bp，克隆在pMD19-T载体上，以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备牛肠道病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。
牛肠道病毒EAV-5’UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
8）口蹄疫病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成口蹄疫病毒保守区基因片段FMD-5’UTR，长度为432bp，克隆在pMD19-T载体上，以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备牛肠道病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。
口蹄疫病毒FMD--5’UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
对合成的引物做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6－2.0之间，即视为合格引物。从1:104稀释的牛肠道病毒和口蹄疫病毒细胞培养液中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对配合使用，可以扩增出特异性的目的条带。
将筛选好的引物浓度从0.1μM至0.8μM以0.1μM为间距递增。对引物不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：不同浓度的引物对于该阳性模板扩增效率不同，引物浓度在0.2μM时目的带较亮，所以选定引物浓度为0.2μM作为检测方法的引物浓度。
研究表明，Mg2+浓度对多重PCR扩增的结果有一定影响，故应用筛选好的引物浓度，将Mg2+的浓度从1.5mM至6.0mM以0.5mM为间距递增，对不同Mg2+浓度条件下的扩增进行了比较，结果表明Mg2+浓度为3.0mM时扩增效果较好。
我们选择Promega公司生产的Taq DNA聚合酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃ 1小时后仍保持50%活性。Taq DNA聚合酶用量（以单位U计）的优化实验模板采用牛肠道病毒细胞培养物（1:104稀释）提取RNA反转录后进行扩增。从多次重复试验结果中选定1.25 U 作为使用的Taq DNA聚合酶用量。
本发明还提供了所述检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测试剂盒A的使用方法：
1）样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5 mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。对于拭子样品（如咽喉拭子、肛门拭子、眼结膜拭子等），在采集拭子后立刻放入含有1.5mLPBS的离心管中，用灭菌剪刀剪去手持部分，密封，涡旋震荡，静置0.5小时后，用灭菌镊子反复挤压棉拭子，收集挤出的液体至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融2次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
2）RNA的提取：在样本处理区进行。
取n个1.5ml灭菌离心管（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），作好标记。 首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。
12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。
12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。
12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。
3）多重RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、反转录酶M-MLV、Taq DNA聚合酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n+1（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系需要14.25μL RT-PCR反应液、0.5μL反转录酶M-MLV和 0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
反应参数设置：
第一阶段，预变性42℃/45min，94 ℃/3 min；
第二阶段，94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，30个循环；
第三阶段，72℃/7 min，4℃保存，电泳观察结果。
4）结果的判定：按所需浓度，以1×TAE溶液配制凝胶液，微波炉加热使完全溶解。稍微冷却，加入溴化乙锭（EB至终浓度为5mg/ml），趁热倒入制胶槽，高度约0.5cm，自然凝固后，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的1×TAE溶解，使之正好漫过制好的琼脂板。PCR产物与6×加样缓冲液混合均匀，用微量进样器吸取，移液管头伸入液面以下，对准加样孔，缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。盖上电泳槽，调节电压为5v/cm，电泳至溴酚蓝和二甲苄青FF分出一定的距离。小心取出凝胶置于Alpha Imager，进行观察，并成像。样品出现单一、特异性目的条带的为阳性，否则判为阴性。牛肠道病毒的目的条带为276bp，口蹄疫病毒的目的条带为328bp。
本发明还提供了一种检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测试剂盒B，由以下组分组成：
1）裂解液：购自INVITROGEN公司，货号：15596-026，按5ml/管进行分装，6管/盒。
2）RT-PCR反应液，按900μL/管分装，1管/盒。表2为使用RT-PCR酶颗粒反应液配方。
表2 使用RT-PCR酶颗粒反应液配方
| 组 分 | 终浓度 |
| 牛肠道病毒正义引物 | 0.2μM |
| 牛肠道病毒反义引物 | 0.2μM |
| 口蹄疫病毒正义引物 | 0.2μM |
| 口蹄疫病毒反义引物 | 0.2μM |
引物均委托大连宝生物生物工程有限公司合成。
3）RT-PCR酶颗粒，GE Healthcare公司产品，货号：27-9556-01，32管/盒。
4）DEPC水（用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟）1mL/管，3管/盒。
5）阴性对照：牛肠道病毒和口蹄疫病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时。
6）牛肠道病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成牛肠道病毒保守区基因片段EAV-5’UTR，长度为819bp，克隆在pMD19-T载体上，以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备牛肠道病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。
牛肠道病毒EAV-5’UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
7）口蹄疫病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。按照下面的序列合成口蹄疫病毒保守区基因片段FMD-5’UTR，长度为432bp，克隆在pMD19-T载体上，以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备牛肠道病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。
口蹄疫病毒FMD--5’UTR目的片段基因序列具有序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
对合成的引物做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6－2.0之间，即视为合格引物。从1:104稀释的牛肠道病毒和口蹄疫病毒细胞培养液中提取的RNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对配合使用，可以扩增出特异性的目的条带。
将筛选好的引物浓度从0.1μM至0.8μM以0.1μM为间距递增。对引物不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：不同浓度的引物对于该阳性模板扩增效率不同，引物浓度在0.2μM时目的带较亮，所以选定引物浓度为0.2μM作为检测方法的引物浓度。
RT-PCR酶颗粒，GE Healthcare公司产品，每个RT-PCR酶颗粒包含PCR或 RT-PCR所需的所有试剂（反转录酶、Rnase抑制剂、缓冲液、核苷酸（dNTP）和Taq DNA 聚合酶），室温下能稳定存放两年之久。使用简单，只需要加入模板和引物，即可进行有效扩增。Ready-To-Go PCR Beads (96 reactions)货号：27-9556-01。
本发明还提供了所述检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测试剂盒B的使用方法：
1）样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5 mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。对于液体样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。对于拭子样品（如咽喉拭子、肛门拭子、眼结膜拭子等），在采集拭子后立刻放入含有1.5mLPBS的离心管中，用灭菌剪刀剪去手持部分，密封，涡旋震荡，静置0.5小时后，用灭菌镊子反复挤压棉拭子，收集挤出的液体至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融2次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
2）RNA的提取：在样本处理区进行。
取n个1.5ml灭菌离心管（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），作好标记。 首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。
12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。
12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。
12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。
3）多重RT-PCR扩增：从试剂盒中取出多重RT-PCR反应液，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n+1（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.5颗RT-PCR酶颗粒。计算好反应液的使用量（（n+1）×15），加入一适当体积试管中，向其中加入（（n+1）×0.5）颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
反应参数设置：
第一阶段，预变性42℃/45min，94 ℃/3 min；
第二阶段，94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，30个循环；
第三阶段，72℃/7 min，4℃保存，电泳观察结果。
4）结果的判定：按所需浓度，以1×TAE溶液配制凝胶液，微波炉加热使完全溶解。稍微冷却，加入溴化乙锭（EB至终浓度为5mg/ml），趁热倒入制胶槽，高度约0.5cm，自然凝固后，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的1×TAE溶解，使之正好漫过制好的琼脂板。PCR产物与6×加样缓冲液混合均匀，用微量进样器吸取，移液管头伸入液面以下，对准加样孔，缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。盖上电泳槽，调节电压为5v/cm，电泳至溴酚蓝和二甲苄青FF分出一定的距离。小心取出凝胶置于Alpha Imager，进行观察，并成像。样品出现单一、特异性目的条带的为阳性，否则判为阴性。牛肠道病毒的目的条带为276bp，口蹄疫病毒的目的条带为328bp。
本发明的优点是：本发明选择牛肠道病毒EAV-5’UTR和口蹄疫病毒FMD-5’UTR基因编码区作为靶区域，设计引物建立并优化了牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果：1）快速：可同时进行牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测，将两个目的基因同时检出，比普通PCR时间缩短了一半；与细胞培养病毒分离相比，更是从21天缩短到了6h。
2）灵敏：由于筛选出了特异性的、扩增效率高的引物，优化了反应体系，用所建立的方法对以10倍梯度稀释的牛肠道病毒和口蹄疫病毒细胞培养物进行检测，结果表明稀释到10-6倍仍为阳性。
3）特异：由于采用了特异性的引物，建立的牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法在检测所收集的牛肠道病毒和口蹄疫病毒以及牛的其他病毒病原时，牛肠道病毒和口蹄疫病毒为阳性，其他病毒的检测结果均为阴性，未发现交叉反应。
4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。
5）用途较广：可分别应用于牛肠道病毒检测、口蹄疫病毒检测、牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测，以及牛肠道病毒和口蹄疫病毒的鉴别诊断等。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1、试剂盒的配制和使用
1、试剂盒A的配制组成，见表3。其中，所述RT-PCR反应液的配方见表1。
表3 试剂盒配制组成
| 组 成 （48 tests/盒） | 数 量 |
| 裂解液 | 5.0mL×6管 |
| RT-PCR 反应液 | 900μL×1管 |
| Taq DNA聚合酶（5U/μL） | 240μL×1管 |
| 反转录酶M-MLV（200U/μl） | 250μL×1管 |
| DEPC水 | 1mL×3管 |
| 阴性对照 | 1mL×5管 |
| 牛肠道病毒阳性对照 | 1mL×5管 |
| 口蹄疫病毒阳性对照 | 1mL×5管 |
2、试剂盒A的使用方法
2.1 RNA提取：
取n个1.5ml灭菌离心管（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），作好标记。 首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。
12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。
12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。
12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。
2.2 扩增试剂准备与配制
从试剂盒中取出RT-PCR反应液、反转录酶M-MLV、 Taq DNA聚合酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n+1（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系需要14.25μL RT-PCR反应液、0.5μL反转录酶M-MLV和0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各PCR管中分别加入制备的RNA溶液10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
2.3反应参数设置：
第一阶段，预变性42℃/45min，94 ℃/3 min；
第二阶段，94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，30个循环；
第三阶段，72℃/7 min，4℃保存，电泳观察结果。
2.4结果判定
按所需浓度，以1×TAE溶液配制凝胶液，微波炉加热使完全溶解。稍微冷却，加入溴化乙锭（EB至终浓度为5mg/ml），趁热倒入制胶槽，高度约0.5cm，自然凝固后，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的1×TAE溶解，使之正好漫过制好的琼脂板。PCR产物与6×加样缓冲液混合均匀，用微量进样器吸取，移液管头伸入液面以下，对准加样孔，缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。盖上电泳槽，调节电压为5v/cm，电泳至溴酚蓝和二甲苄青FF分出一定的距离。小心取出凝胶置于Alpha Imager，进行观察，并成像。样品出现单一、特异性目的条带的为阳性，否则判为阴性。牛肠道病毒的目的条带为276bp，口蹄疫病毒的目的条带为328bp。
3、试剂盒B的配制组成，见表4。其中，所述RT-PCR反应液的配方见表2。
表4 试剂盒配制组成
| 组 成 （48 tests/盒） | 数 量 |
| 裂解液 | 5.0mL×6管 |
| RT-PCR 反应液 | 900μL×1管 |
| RT-PCR酶颗粒 | 32管/盒 |
| DEPC水 | 1mL×2管 |
| 阴性对照 | 1mL×5管 |
| 牛肠道病毒阳性对照 | 1mL×5管 |
| 口蹄疫病毒阳性对照 | 1mL×5管 |
4、试剂盒B的使用方法
4.1 RNA提取：
取n个1.5ml灭菌离心管（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），作好标记。 首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。
12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取离心后上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。
12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。
12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。
4.2 扩增试剂准备与配制
从试剂盒中取出RT-PCR反应液，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n+1（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液和0.5颗RT-PCR酶颗粒。计算好反应液的使用量（（n+1）×15），加入一适当体积试管中，向其中加入（（n+1）×0.5）颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液10μL，盖紧管盖，于400g离心5sec。将PCR管排好放入PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
4.3 反应参数设置：
第一阶段，预变性42℃/45min，94 ℃/3 min；
第二阶段，94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，30个循环；
第三阶段，72℃/7 min，4℃保存，电泳观察结果。
4.4结果判定
按所需浓度，以1×TAE溶液配制凝胶液，微波炉加热使完全溶解。稍微冷却，加入溴化乙锭（EB至终浓度为5mg/ml），趁热倒入制胶槽，高度约0.5cm，自然凝固后，小心拔出梳子，将平板放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的1×TAE溶解，使之正好漫过制好的琼脂板。PCR产物与6×加样缓冲液混合均匀，用微量进样器吸取，移液管头伸入液面以下，对准加样孔，缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。盖上电泳槽，调节电压为5v/cm，电泳至溴酚蓝和二甲苄青FF分出一定的距离。小心取出凝胶置于Alpha Imager，进行观察，并成像。样品出现单一、特异性目的条带的为阳性，否则判为阴性。牛肠道病毒的目的条带为276bp，口蹄疫病毒的目的条带为328bp。
实施例2、试剂盒的灵敏度试验
1、材料：
方法研究过程中应用到的病毒株为本实验室分离保存的牛肠道病毒和口蹄疫病毒。
2、方法
将牛肠道病毒和口蹄疫病毒细胞培养物作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀释，分别进行多重RT-PCR检测，同时将各个稀释度的病毒接种BK细胞，比较两种方法的灵敏度。
3、结果
将牛肠道病毒和口蹄疫病毒细胞培养物作10倍系列稀释，运用装配好的试剂盒A、B分别进行检测，试验结果显示，检测极限均可达 10-6，与细胞分离培养鉴定相当，但检测时间从21天缩短到了6h。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1、材料
表5 方法研究过程中应用到的病毒株
| 病毒 | 来源 |
| 牛肠道病毒 | 本实验室保存 |
| 牛传染性鼻气管炎病毒 | 本实验室保存 |
| 牛病毒性腹泻病毒 | 本实验室保存 |
| 口蹄疫病毒 | 本实验室保存 |
| 水疱性口炎病毒 | 本实验室保存 |
2、方法
用所建立的RT-PCR方法对多种牛常见病毒（包括牛肠道病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒）进行检测，以验证方法的特异性。
3、结果
结果表明，无论使用试剂盒A还是试剂盒B，所建立的方法与上述病毒均无交叉反应，特异性均良好。
实施例4、牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR试剂盒的批间、批内可重复性试验
为对该试剂盒批间、批内重复性进行综合考核，我们对试剂盒A和B分别选择三批合格试剂进行了批间、批内可重复性试验。
1、实验材料
试剂：3批牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR试剂盒A，批号：201003001A、201003002A、201003003A；3批牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR试剂盒B，批号：201003001B、201003002B、201003003B；
检测仪器： 全自动PCR检测仪。
检测样本：将牛肠道病毒细胞培养物作10-4倍稀释后命名为D1，将口蹄疫病毒细胞培养物作10-4倍稀释后，命名为D2，将10-4倍稀释的牛肠道病毒细胞培养物和口蹄疫病毒细胞培养物等体积混合，充分混匀，命名为D3，将阴性样品命名为D4。连续三次分别用牛肠道病毒和口蹄疫病毒多重RT-PCR试剂盒A、B进行批间、批内重复性试验。
2、实验内容：每批试剂均对样品D1、D2、D3、D4进行3次检测，每次每一样本检测10份复管，然后根据以上数据统计试剂盒的批内、批间误差。
3、实验结果
对样本D1、D2、D3、D4，每批试剂均进行3次多重RT-PCR检测，每次每一样本检测10份复管，根据检测结果可见，1、对于同一份样本，同一试剂盒的同一批号试剂，同一次检测结果都一样，说明同一试剂盒的同批试剂同时检测具有很好的重复性；2、对于同一份样本，同一试剂盒的同一批号试剂，各自三次检测结果也相同，说明同一试剂盒的同批试剂在不同时间的检测结果也具有很好的重复性；3、对于同一个样本，同一试剂盒的三批号试剂，各自三次检测结果一致，说明同一试剂盒的不同批次试剂在不同时间对同一样本的检测结果也具有很好的重复性。
根据以上试验数据及统计分析，该试剂盒A、B批内、批间重复性结果均一致，说明试剂盒A、B均具有很好的批内、批间重复性。
实施例6、试剂盒对临床样品检测的实验报告
1、材料
本实验室2005年~2010年间收集的牛组织脏器、咽喉拭子、肛门拭子、粪便、血清、牛奶、牛场水槽中饮水等852份样品。
2、方法
对于这852份临床样品，采用本发明所述的多重PCR检测试剂盒（根据具体试验条件和环境可任选试剂盒A或B）进行检测，对于检测出阳性结果的样品全部采用细胞培养病毒分离方法进行复检，对于检测出阴性的结果，随机抽取50份进行细胞培养病毒分离复检，比较两种方法的检测结果。
3、结果
多重RT-PCR检测试剂盒的检测结果见表6。
表6临床样品的检测结果
| BEV | BEV | FMDV | FMDV | ||
| 样品种类 | 数量 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 |
| 肠道内容物 | 5 | 5 | 5 | ||
| 牛粪便 | 208 | 15 | 193 | 208 | |
| 牛奶 | 30 | 30 | 30 | ||
| 心 | 5 | 5 | 5 | ||
| 肝 | 5 | 5 | 5 | ||
| 脾 | 5 | 5 | 5 | ||
| 肺 | 5 | 5 | 5 | ||
| 肾 | 5 | 5 | 5 | ||
| 小肠 | 5 | 5 | 5 | ||
| 疱疹皮 | 8 | 8 | 8 | ||
| 咽喉拭子 | 51 | 18 | 33 | 10 | 41 |
| 肛门拭子 | 89 | 89 | 89 | ||
| 血清 | 384 | 384 | 384 | ||
| 牛场水槽中饮水 | 47 | 47 | 47 | ||
| 合计 | 852 | 132 | 720 | 18 | 834 |
在本研究中，我们将建立的方法用于临床样品的检测，样品为本实验室2005年~2010年间收集的牛组织脏器、咽喉拭子、肛门拭子、粪便、血清、牛奶、牛场水槽中饮水等共计852份样品，结果显示用多重RT-PCR检出132份牛肠道病毒阳性样品，18份口蹄疫病毒阳性样品；对这132份牛肠道病毒阳性样品、18份口蹄疫病毒阳性样品和随机抽取的50份多重RT-PCR检测出的牛肠道病毒和口蹄疫病毒均为阴性的样品进行细胞培养病毒分离复检，结果细胞分离鉴定试验结果与多重RT-PCR检测完全一致。
序列表
<110> 中华人民共和国北京出入境检验检疫局
<120> 检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成检测牛肠道病毒的正义引物
<400> 1
ggggagtagt ccgactccgc 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成检测牛肠道病毒的反义引物
<400> 2
crgagctacc acygggdwtg tgg 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成检测口蹄疫病毒的正义引物
<400> 3
gcctggtctt tccaggtct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成检测口蹄疫病毒的反义引物
<400> 4
ccagtcccct tctcagatc 19
<210> 5
<211> 819
<212> DNA
<213> 牛肠道病毒EAV-5'UTR目的片段
<400> 5
tttaaaacag cctgggggtt gtacccaccc ctggggccca cgcggcgcta gtactctggt 60
acgttagtac ctttgtacgc ctgttttccc ctcccttaaa taaattaaga ttaccactac 120
tgaggggagt agtccgactc cgctccgaca atgtcgcacc agtgcactgg tacgctagta 180
ccttttcacg gagtagctgg tattccctcc cgaaacttag aagcacttaa atcaaccgac 240
caataggcgc gcggtagcca gccgcgttac ggtcaagcac tcctgtttcc ccggtccaca 300
aggatcgtta cccgcccgac ccactgcgag aaacctagta gttggccaag tggtaacgag 360
gttgcgctca gccacaaccc cagtggtagc tccggaagat ggggctcgca ccacccccgc 420
ggtaacgcgg ttgcttgccc gcgcgtgctt ccgggtccgg tctcgtaccg ttcacctcaa 480
taccacgtaa ccagcaaaga gtctattgcg ctgggacggt tttcctccgg ggccgtgaat 540
gctgctaatc ccaacctccg agcgtgtgcg cacaatccag tgttgctacg tcgtaacgcg 600
taagttggag gcggaacaga ctactttcgg taccccgtgt ttccctatca ttccatttca 660
ttttatggtg acaattgctg agatctgtga tttggcgacc ttaccactga atattgcctt 720
atattacttg gttgcattcc acaaaacctc tgacatacct gcttcctata tcgacctact 780
tgttttcctc aatttaaagt atagactaca aatagcaga 819
<210> 6
<211> 432
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒FMD-5'UTR目的片段
<400> 6
gcaacttgaa actccgcctg gtctttccag gtctagaggg gtgacatttt gtactgtaat 60
tgactccacg ctcggtccac tagcgggtgt tagtagctgt attgttgctt cgtagcggag 120
cataatggcc gtgggaactc ccccttggta acaaggaccc acggggccga aagccacgtc 180
ctgacggacc cattatgtgt gcaaccccag cacggcaact tactgtgaaa accactttaa 240
ggtgacactg atactggtac tcaactactg gtgacaggct aaggatgccc ttcaggtacc 300
ccgaggtaac acgcgacact cgggatctga gaaggggacc gggacttctt taaaagtgcc 360
cggtttaaaa agcttctatg cctgaatagg cgaccggagg ccggcgcctt tcttttgact 420
actactgctt tt 432
Claims (3)
1.一组检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物；序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物；在序列SEQ ID NO：2中R为A或G；Y为T或C；D为A或G或T；W为A或T。
2.一种检测牛肠道病毒和口蹄疫的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
1）裂解液；
2）RT-PCR反应液，包括：1×PCR缓冲液、1×RT缓冲液、3mM MgCL2、0.2mM dNTP、0.2 μM牛肠道病毒正义引物、0.2 μM牛肠道病毒反义引物、0.2 μM口蹄疫病毒正义引物、0.2 μM口蹄疫病毒反义引物；
3）反转录酶M-MLV；
4）Taq DNA聚合酶；
5）DEPC水；
6）阴性对照：牛肠道病毒和口蹄疫病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；
7）牛肠道病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
8）口蹄疫病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
其中，牛肠道病毒正义引物为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，牛肠道病毒反义引物为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中R为A或G；Y为T或C；D为A或G或T；W为A或T；口蹄疫病毒正义引物为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒反义引物为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
3.一种检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
1）裂解液；
2）RT-PCR反应液，包括：0.2 μM牛肠道病毒正义引物、0.2 μM牛肠道病毒反义引物、0.2 μM口蹄疫病毒正义引物、0.2μM口蹄疫病毒反义引物；
3）RT-PCR酶颗粒；
4）DEPC水；
5）阴性对照：牛肠道病毒和口蹄疫病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；
6）牛肠道病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
7）口蹄疫病毒阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
其中，牛肠道病毒正义引物为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，牛肠道病毒反义引物为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中R为A或G；Y为T或C；D为A或G或T；W为A或T；口蹄疫病毒正义引物为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒反义引物为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
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