CN102094069A

CN102094069A - 吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用

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Publication number: CN102094069A
Application number: CN2009102001915A
Authority: CN
Inventors: 李思发; 蔡完其; 许映芳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN102094069B

Abstract

本发明提供了吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用。具体地，本发明提供了一种适合海水养殖的新品种-吉鲡罗非鱼(尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼的属间远缘杂交和选育子代)的遗传特性的甑别方法及其应用。一种方法包括：对待检测的鱼类进行同工酶、染色体组型、和/或微卫星标记检测，并将检测结果与阳性对照或标准品进行比较，从而确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶。本发明方法能够可靠的准确地甄别吉鲡罗非鱼。

Description

吉鲡鱼遗传特性甑别方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物鉴别领域。更具体地，本发明涉及适合海水养殖的新品种--吉鲡罗非鱼(尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼的属间远缘杂交和选育子代)的遗传特性的甑别方法及其应用。

背景技术

目前在我国的咸、海水水域中，养殖生产存在一些亟待解决的问题，比如，海水网箱养殖缺少适合的养殖对象和适宜我国国情的养殖模式，现有的养殖对象几乎全部是肉食性鱼类，苗种来源困难，饵料不易解决，不仅养殖成本高昂，养殖风险大，而且由于大量、长期投喂冰鲜杂鱼也容易产生生态和环境问题；而中西部咸水养殖的主要问题是缺乏优良的养殖对象，现有的鱼类，大多生长缓慢、经济价值低。

罗非鱼类原产非洲，属热带性鱼类。其中尼罗罗非鱼因个体大、肉厚色白、质嫩刺少、富有弹性、细腻味美，含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁和维生素等营养成分，同时含有多种不饱和脂肪酸等特点，是老少皆宜的健康食品，符合人类追求健康食品的要求。随着世界鳕鱼和野生鲑鳟鱼类资源的减少，美国、欧洲、日本、韩国白鱼肉市场正在寻找新的替代品种。

罗非鱼因其具有生长速度快、抗病能力强、饲料易解决、养殖周期短、易加工保鲜、生产成本低、营养价值高，市场前景广等特点，成为联合国粮农组织向世界推荐的最有发展前景的水产优良养殖对象之一。同时由于肉质洁白而少刺，而被称为“白色三文鱼”，可替代短缺的鳕鱼等海洋优质鱼，成为人类的“21世纪的鱼”。目前罗非鱼总产量为200万吨。其中养殖产量约占3/4，而尼罗罗非鱼占90％以上。海水中养殖的罗非鱼，不仅没有淡水养殖罗非鱼常有的土腥味，而且肉质紧密富弹性，商品品质高，但因缺少良种，产量很少。

萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron Rüppell，1852)，又叫黑颊罗非鱼 (Blackchin tilapia)，鲈形目(Perciformes)，丽鱼科(Cichlidae)，萨罗属(Sarotherodon)，它自然分布于西非从象牙海岸到塞内加尔河海湾和内陆泻湖的广大咸淡水水域中。在罗非鱼类中，萨罗罗非鱼是耐盐性最强的种类。据报道，在盐度为35时可正常繁殖，目前萨罗罗非鱼已被引种到美国、日本和前苏联等国家，在除南极洲以外的五大洲都有分布。但这种罗非鱼生长速度慢，养殖价值不大。

上海海洋大学以耐盐性强的萨罗罗非鱼和生产长快的尼罗罗非鱼(“新吉富”品系)为主要遗传材料，通过杂交和选育，产生了耐盐性和生长速度兼优的罗非鱼新品种-吉鲡罗非鱼(简称为“吉鲡”鱼)。

杂交鱼吉鲡罗非鱼具有保留了亲本的优势、兼具优良生长性能和耐盐性能、能在海水中正常养殖。从性状特征来看，本发明的方法获得的杂交鱼形似“萨罗”鱼，但有部分可数性状与“新吉富”鱼相似。并且，所述的吉鲡罗非鱼的后代性状稳定，具有良好的耐盐性，可正常繁育，且生长速度较快，肉质鲜美。同时，吉鲡罗非鱼在盐度为20度的条件下的生长速度是父本“萨罗”鱼的4倍多，耐盐性能较其母本尼罗罗非鱼(在20盐度下不能存活)有了极大的提高，且肉质似海鱼，无泥腥味。因此，吉鲡罗非鱼是一种应用前景极为广阔的鱼类。

然而，虽然吉鲡罗非鱼的外形介于父母本之间，有经验的专业人员可以辨认，但一般科技人员和消费者则难以辨别。为了便于学术界的研究、养殖界的保种制种，罗非鱼产业的追溯，以及商业界的新品种推介，本领域迫切需要开发可靠的、准确地鉴别吉鲡罗非鱼的鉴别技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可靠的、准确地鉴别吉鲡罗非鱼的鉴别技术。

在本发明的第一方面，提供了一种确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的方法，包括步骤：

对待检测的鱼类进行同工酶检测，并将检测结果与阳性对照或标准品进行比较，从而确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶。

在另一优选例中，所述的检测同工酶包括：对鱼组织进行匀浆，然后离心获得上清，再通过电泳法检测同工酶。

在另一优选例中，所述的待检测的鱼类包括吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼或其组合。

在另一优选例中，所述的鱼组织包括选自下组的组织：肌肉组织、肝组织、肾脏组织、心组织、眼、或其组合。

在另一优选例中，所述的鱼类组织是肾脏组织或肝脏组织。

在另一优选例中，所述的阳性对照是吉鲡罗非鱼的乳酸脱氢酶的同工酶图谱，或者标准品包括以下鱼类的乳酸脱氢酶的同工酶图谱：吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼。

在另一优选例中，所述的图谱是电泳图谱和/或扫描图。

在另一优选例中，所述的吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼的乳酸脱氢酶的同工酶图谱如图3所示。

在另一优选例中，如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。

在另一优选例中，所述的同工酶检测按中华人民共和国国家标准(GB/T18654.13-2008)进行。

在另一优选例中，所述方法还包括：

对待检测的鱼类进行染色体组型检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼；和/或

对待检测的鱼类进行微卫星标记检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼。

在另一优选例中，如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝6sm+24st+14；则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝2m+4sm+24st+14t；则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝1m+5sm+24st+14t，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。

在另一优选例中，直接判断染色体组型种是否出现了一对m+sm的染色体，如存在m+sm的染色体，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。

在另一优选例中，用选自下组的一对或多对引物对，通过PCR扩增微卫星标记：SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22。

在另一优选例中，根据扩增获得的微卫星标记，计算以下一种或多种指标：①有效等位基因数；②平均遗传杂合度；和③多态信息含量(PIC)，并根据指标的高低来确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼，其中高指标则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；高指标则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；低指标则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。

具体地，①有效等位基因数：吉鲡罗非鱼＞尼罗罗非鱼＞和萨罗罗非鱼；②平均遗传杂合度：吉鲡罗非鱼＞尼罗罗非鱼＞和萨罗罗非鱼；③多态信息含量(PIC)：吉鲡罗非鱼＞尼罗罗非鱼＞和萨罗罗非鱼。

在本发明的第二方面，提供了一种用于甑别吉鲡罗非鱼(即确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼)的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(a)一容器，所述的容器内包括进行鱼类同工酶检测所需的试剂，其中所述的同工酶是乳酸脱氢酶；

(b)说明书，所述的说明书说明了基于乳酸脱氢酶的同工酶检测结果判定鱼类是否是吉鲡罗非鱼的标准。

更佳地，所述的试剂盒还包括：任选的用于染色体组型检测的试剂和/或用于微卫星标记检测的试剂。

在另一优选例中，所述的说明书中记载：如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：用于染色体组型检测的试剂和/或用于微卫星标记检测的试剂。

在另一优选例中，所述的用于微卫星标记检测的试剂是下组的一对或多对引物对进行PCR扩增微卫星标记：SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22。

在本发明的第三方面，提供了鱼类的乳酸脱氢酶同工酶的用途，它们用作鉴定吉鲡罗非鱼的遗传标记，或用于制备甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒。

在本发明的第四方面，提供了通过染色体组型来确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的方法，包括步骤：

对待检测的鱼类进行染色体组型检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼。

在本发明的第五方面，提供了通过微卫星标记来确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的方法，包括步骤：对待检测的鱼类进行微卫星标记检测，并根据检测结果确定或判断所检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼。

本发明的其它方面由于本文的技术公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。此外，应理解，在本发明范围内，本发明上述的以及下述的技术特征(包括实施例中的技术特征)可以互相组合，从而构成新的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了吉鲡鱼(图1A)、尼罗罗非鱼(图1B)、萨罗罗非鱼(图1C)的染色体中期分裂相。

图2显示了吉鲡鱼(图2A)、尼罗罗非鱼(图2B)、萨罗罗非鱼(图2C)的染色体核型图。

图3显示了吉鲡鱼(图3A)、尼罗罗非鱼(图3B)、萨罗罗非鱼(图3C)的同工酶电泳图和扫描图。

图4显示了吉鲡鱼(13-18)、尼罗罗非鱼(19-24)、萨罗罗非鱼(7-12)的4对微卫星引物扩增谱带图。其中，M：分子标记(GeneRulerTM 100bp Ladder)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，虽然吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼的外形难以辨别，但是通过其某些特定的遗传特性，可以可靠而准确地将吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼有效地区分开。具体地，适合作为甄别的遗传特性或遗传特征包括以下：(a)染色体组型，(b)同工酶，(3)微卫星标记。其中，尤其以同工酶的检测更为方便和直观。

“萨罗罗非鱼”(Sarotherodon melanotheron)，与“尼罗罗非鱼”(Oreochromisniloticus)同为鲈形目(Perciformes)，丽鱼科(Cichlidae)，但为不同属。“尼罗罗非鱼”归“罗非”鱼属(Oreochromis)，而“萨罗罗非鱼”归“萨罗”鱼属(Sarotherodon)，它们的亲缘关系较远。

如本文所用，术语“吉鲡鱼”、“吉鲡罗非鱼”、“吉丽鱼”、““吉丽罗非鱼”、等可互换使用，都是指“尼罗罗非鱼”和“萨罗罗非鱼”的杂交后代，尤其是由“尼罗罗非鱼”(“新吉富”品系)为母本，“萨罗罗非鱼”为父本，杂交(正交)所获得的罗非鱼品种。在中国专利申请CN200810042029.0(2008年8月25日申请)中，公开了吉鲡鱼的育种方法。

就方法而言，本领域中已有的(1)染色体组型检测方法和试剂，(2)同工酶检测方法和试剂，(3)微卫星标记的检测方法和试剂，都可用于本发明。

以染色体组型检测为例，可用常规方法获得鱼类的染色体显微照片，并用常规方法进行染色体分类和分组等分析。例如，染色体分类可依据Levan等的标准确定；染色体分组可参照Bickham的标准；臂数统计可按Gorman的方法进行，即中部和亚中部着丝粒染色体的臂数计为2。

以同工酶检测为例，同工酶为该酶基因产物的表现型，根据其所带电荷的不同和分子大小、形状的不同，在电场和凝胶中出现各同工酶组分不同的迁移率，经催化、染色、扫描，根据酶带迁移距离、数目及吸收强度进行分析比较，判定鱼类物种、种群的遗传特性。

通常，同工酶检测时，先对鱼组织进行匀浆，然后离心获得上清，再通过电泳法检测同工酶。针对不同的类型同工酶的检测，可用相应的染色剂进行染色。例如，对于苹果酸脱氢酶(MDH)，可用含辅酶I、NBT，PMS的Tris-HCl染色缓冲液(pH9.5)+苹果酸钠溶液进行染色；对于乳酸脱氢酶(LDH)，可用含辅酶I、NBT，PMS的Tris-HCl染色缓冲液(pH9.5)+乳酸钠溶液进行染色。详见例如中华人民共和国国家标准(GB/T18654.13-2008)：《养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析》。

本发明的主要优点在于：

(a)通过本发明揭示的遗传标记，能够可靠的、准确地鉴别出吉鲡罗非鱼。

(b)本发明的种质检测方法简便，重现性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1染色体组型分析

1.1方法

采用植物血球凝集素(PHA)体内注射法制备染色体玻片标本。取健康鱼10尾，体重100g左右。实验鱼在实验前一周暂养于室内控温、充气水族箱中，水温约为30℃。按10μg/g鱼体重胸鳍注射PHA，16～18h后按2μg/g鱼体重注射秋水仙素溶液，3h后剪鳃放血，取头肾置于盛生理盐水的平皿中，磨碎，使其中的细胞游离出来。吸取细胞悬液在0.075mol/LKCL溶液中37℃低渗30min。随后用1000r/min离心8min，弃去上清液，加入新配的Carnoy氏液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定15min再离心8min，后重复固定并离心2次。最后一次固定并离心后，弃去大部分上清液，制成悬液并进行冰冻滴片，干燥后，用3％Giemsa氏染液进行扣染，烘干后镜检，显微拍照。染色体分类依据Levan等的标准确定；染色体分组参照Bickham的标准；臂数统计按Gorman的方法进行，即中部和亚中部着丝粒染色体的臂数计为2。

1.2结果

(1)母本尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的染色体数据

编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型
									1	2.5	sm1	8	4.3	st2	15	5.5	st9
2	2.8	sm2	9	3.3	st3	16	5.5	st10
									3	1.9	sm3	10	3.3	st4	17	6	st11

4	2.0	sm4	11	3.3	st5	18	6	st12
									5	2.9	sm5	12	3.3	st6	19	4.8	st13
6	3.0	sm6	13	3.5	st7	20	4.9	st14
									7	3.6	st1	14	3.9	st8	21	5.2	st15

编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型
									22	4.8	st16	29	4.4	st23	37	∞	t7
23	5.4	st17	30	3.9	st24	38	∞	t8
									24	6.1	st18	31	∞	t1	39	∞	t9
25	5.7	st19	32	∞	t2	40	∞	t10
									26	5.8	st20	33	∞	t3	41	∞	t11
27	4	st21	34	∞	t4	42	∞	t12
									28	4.6	st22	35	∞	t5	43	∞	t13
			36	∞	t6	44	∞	t14

(2)父本萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)的染色体数据

编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型
									1	1	m1	8	4.1	st2	15	4.1	st9
2	1.1	m2	9	3.2	st3	16	4.3	st10
									3	2	sm1	10	4.0	st4	17	4.6	st11
4	2.1	sm2	11	4.0	st5	18	4.0	st12
									5	2	sm3	12	4.1	st6	19	4.0	st13
6	2.4	sm4	13	4	st7	20	4.7	st14
									7	4	st1	14	4.83	st8	21	4	st15

编号

臂比

染色体类

编号

臂比

染色体类型

编号

臂比

染色体类型

22

4.1

st16

29

3.6

st23

37

∞

t7

23

4.7

st17

30

3.4

st24

38

∞

t8

24	4.6	st18	31	∞	t1	39	∞	t9
									25	3.4	st19	32	∞	t2	40	∞	t10
26	3.4	st20	33	∞	t3	41	∞	t11
									27	3.5	st21	34	∞	t4	42	∞	t12

28	3.6	st22	35	∞	t5	43	∞	t13
												36	∞	t6	44	∞	t14

(3)吉鲡罗非鱼(O.niloticus♀×S.melanotheron♂)F1的染色体数据

编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型
									1	1.3	m1	8	5.8	st2	15	4	st9
2	2.0	sm1	9	3.8	st3	16	3.9	st10
									3	2.0	sm2	10	4	st4	17	4	st11
4	2.1	sm3	11	4.6	st5	18	4	st12
									5	2.1	sm4	12	4.3	st6	19	5	st13
6	1.9	sm5	13	5	st7	20	4.9	st14
									7	5.0	st1	14	4.9	st8	21	4.4	st15

编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型	编号	臂比	染色体类型
									22	4.6	st16	29	4.1	st23	37	∞	t7
23	4.7	st17	30	4.1	st24	38	∞	t8
									24	4.4	st18	31	∞	t1	39	∞	t9
25	5	st19	32	∞	t2	40	∞	t10
									26	4.9	st20	33	∞	t3	41	∞	t11
27	4	st21	34	∞	t4	42	∞	t12
									28	4	st22	35	∞	t5	43	∞	t13
			36	∞	t6	44	∞	t14

结果如图1A-1C以及图2A-2C所示。

吉鲡罗非鱼与其父母本的2n都是44，NF都是50。

尼罗罗非鱼的染色体组型公式为2n＝6sm+24st+14。

萨罗罗非鱼的染色体组型公式为2n＝2m+4sm+24st+14t。

吉鲡罗非鱼的染色体组型公式为2n＝1m+5sm+24st+14t。值得注意的是，吉鲡鱼出现了一对m+sm的染色体，是为杂交种的证据。

实施例2同工酶

2.1方法

挑选体型较好，健康、体重100g左右的鱼各30尾。按中华人民共和国国家标准(GB/T18654.13-2008)：《养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析》执行。

简而言之，该包括包括：获取鱼类的组织(分别为肌、肝、肾、心、眼组织)，匀浆后，将匀浆样品于15000rpm离心直至上清液澄清，取离心后形成的上清液进行同工酶电泳检测。

2.2结果

对吉鲡罗非鱼及两亲本的肌、肝、肾、心、眼组织中ADH、LDH、IDH、等同工酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

结果发现，对于ADH和IDH而言，吉鲡罗非鱼及两亲本未表现出明显的多态性，然而对于LDH而言，却表现有明显的多态性。

如图3所示，图中给出了这三种鱼的肾脏乳酸脱氢酶的电泳图谱和扫描图。其中，吉鲡鱼有6个条带(LDH1～LDH6)(图3A)、尼罗罗非鱼有5个条带(LDH1～LDH5)(图3B)、萨罗罗非鱼有3个条带(LDH1～LDH3)(图3C)，这提示吉鲡罗非鱼为两亲本的整合。因此，可以基于肾脏乳酸脱氢酶的电泳图谱，方便地区分吉鲡鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼。

实施例3微卫星标记

3.1方法

随机采样30尾鱼，剪取尾鳍，分别编号后以95％乙醇保存备用。基因组DNA提取采用常规的“酚-氯仿”方法进行，具体步骤是：取0.1g左右尾鳍，加入400μL STE(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/LNaCl)缓冲液，混匀后加入终浓度分别为1％的SDS 200μg/mL的蛋白酶K，55℃ 左右作用过夜。加入等体积饱和酚于混合均匀1h，10,000r离心10min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混合均匀0.5h，吸取上清液加入等体积的混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，混合均匀0.5h，弃下层液；再加入2倍体积的无水乙醇(最好要冰冻)沉淀DNA，然后在-20℃的冰箱内冷冻(时间最好长一点)，再用75％的乙醇洗涤两次，12,000r离心10min，自然风干(不能太干)，加入500μL的TE溶解备用。用752型紫外分光光度计检测样品的浓度与纯度。

委托上海生物工程有限公司合成以下引物，用于微卫星标记的检测。

表1 11对微卫星引物序列、特异退火温度

基因座位	上游序列	SEQ ID NO：	下游序列	SEQ ID NO：	退火温度/℃
						U69153	CTGCTCTAACAACAACAACA	1	GCTTCAAAGGTGTTTCATGCC	2	60.9
X99800	GTGCTTTTACATTTTCTCCTC	3	AATGGCTTGGATCAATGTCG	4	61.5
						X99799	GATGCTGACTGTGACTCTAT	5	TCGTGTGGTTCTTGCTAAGT	6	61.5
UNH828	ATGCTAGCAAACATCAAAGGTC	7	GATATGCTGATGATGCACAGAGTC	8	59.8
						GM354	CGGGAGAGCAGGTCAG	9	CACGTTCAGGGTTACTGTGTT	10	60.0
UNH129	AGAAGTCGTGCATCTCTC	11	TGTACATCATCTGTGGG	12	61.5
						UNH216	GGGAAACTAAAGCTGAAATA	13	TGCAAGGAATATCAGCA	14	58.7
UNH907	TTGTGAAATTGCATTGCACTC	15	AACTCCCTTTGATCCTCTGC	16	61.5
						GM559	GCACCATTTTTAACCAGTGCT	17	ATTTTCCACCGAGCTCACCT	18	60.4
PRL1	GTTAGCCCCCTCCTCACTCT	19	ACCTTGCTCGTCACACCTG	20	60.0
						PRL2	TCGTGTCTTGTGGGGAAACC	21	TGAATGGATGCAACAGGATG	22	60.5

微卫星PCR扩增及产物检测

反应体系为：3μL缓冲液(10mmol·L^-1Tris-HCl，pH9.0，50mmol·L^-1KCl，3.0mmol·L^-1MgCl₂，0.001％的明胶)，0.1mmol·L^-1每种dNTP，引物浓度为0.2μmol·L^-1，约100ng基因组DNA，1单位Taq酶，反应总体积为25μL，加入30μL石蜡油。反应在EppendorfMastercycler Gradient PCR仪上进行。

PCR反应程序为：94℃预变性4min，接着94℃30s，49～70℃(根据引物的退火温度进行调整)30s，72℃30s。35个循环后，72℃延伸10min。扩增产物在8％(w/v)的非变性聚丙烯酰胺电泳检测。然后进行银染。

染色程序如下：

①固定：电泳后凝胶先在10％乙酸溶液中固定30min；

②漂洗：用双蒸去离子水漂洗两次，每次5min；

③染色：将凝胶浸泡在0.1％硝酸银(临用配制1L含1.5mL 37％甲醛)中，轻轻混匀30min；

④漂洗：用双蒸去离子水快速漂洗(5s内)两次；

⑤显色：加入显色液(临用配制，1L含3％Na₂CO₃、1％200μL Na₂S₂O₄和1.5mL 37％甲醛，冰浴0.5h)并轻轻混匀至DNA条带清晰(约10min)；

⑥终止：加入预冷的10％乙酸终止显色(约5min)。显色后用Syngene凝胶成像分析系统进行扫描摄像，并用GeneTools软件相对于分子量标准pBR322DNA/MspI对每对微卫星引物扩增的等位基因的分子量大小进行估算。每个微卫星座位至少被重扩一次以保证结果的准确性。在整个染色和显色的过程中，应注意将染色器皿放在摇床上轻轻地摇动，使凝胶各处反应均匀，以避免染色和显影不均匀的现象发生。

数据统计分析为，根据电泳图谱进行微卫星的多态性分析：利用市售的POPGENE1.31软件，根据Nei的方法，用公式(1)计算有效等位基因数(Ne)。群体平均杂合度(H)按公式(2)计算，多态信息含量(PIC)按公式(3)计算。

有效等位基因数(N_e)：

N_{e} = 1 / Σ_{i = 1}^{n} p_{i}^{2} - - - (1)

群体平均杂合度期望值(H)

H = 1 - (Σ_{i = 1}^{n} P_{i}^{2}) - - - (2)

多态信息含量(PIC)

PIC = 1 - (Σ_{i = 1}^{n} P_{i}^{2}) - (Σ_{i = 1}^{n - 1} Σ_{j = i + 1}^{n} 2 p_{i}^{2} p_{j}^{2}) - - - (3)

其中p_i、p_j分别为第i和第j个等位基因的频率，n为等位基因数目。

根据Nei和Nei的方法，用下式(4)和(5)计算较正前、后群体间遗传相似系数和群体间遗传距离。采用NJ法构建群体间的系统树。

I＝2n_xy/(n_x+n_y) (4)

遗传距离D＝1-I (5)

其中n_x+n_y是两个材料所有的等位基因数，n_xy为个体X、Y共有位点数。

3.2结果

在吉鲡鱼及其亲本尼罗罗非鱼及萨罗罗非鱼，4对微卫星引物都扩增出较好的谱带，图4显示的是PRL1、PRL2、PRL3及IGF扩增产物片段的大小范围为180-276bp，等位基因大小差异范围为96bp。相应的等位基因数、等位基因频率、基因型频率如表2、3。

经方差检验，群体间、微卫星座位间及等位基因间都存在极显著差异(P＜0.01)。吉鲡鱼的基因杂合性比亲本尼罗与萨罗有了显著的增强，这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础。

表2吉鲡鱼、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼4个微卫星座位等位基因频率

“*”表示同一微卫星座位同一位点唯一不具有该等位基因的鱼；

“**”表示同一微卫星座位同一位点唯一具有该等位基因的鱼。

表3吉鲡鱼、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼4个微卫星座位等位基因频率

吉鲡鱼、尼罗罗非鱼及萨罗罗非鱼间的Nei氏标准遗传距离D_n和D_A遗传距离见表3和图4。吉鲡鱼同两亲本的距离都小于父、母本间的距离。

表4吉鲡鱼、尼罗罗非鱼及萨罗罗非鱼间的Nei氏标准遗传距离(D_n和D_A)

利用11对微卫星引物进行遗传多样性分析的结果表明(表5)：①有效等位基因数--吉鲡的有效等位基因数(3.28)大于亲本尼罗(3.06)与萨罗(2.35)；②平均遗传杂合度-吉鲡(0.651)大于亲本尼罗(0.618)和萨罗(0.494)；③多态信息含量(P C)-吉鲡(0.602)高于尼罗(0.563)和萨罗(0.469)。从这三个指标清楚可见，吉鲡的遗传多样性比亲本有显著提高。

表5吉鲡鱼、尼罗罗非鱼及萨罗罗非鱼的

有效等位基因数、多态信息含量和群体平均杂合度

群体	引物数	平均等位基因数	有效等位基因数	多态信息含量 PIC	群体平均杂合度 H
						尼罗	11	4.00	3.06	0.563	0.618
萨罗	11	3.36	2.36	0.469	0.494
						吉鲡	11	4.36	3.28	0.602	0.651

实施例4

双盲法验证LDH同工酶检测甄别吉鲡罗非鱼的可靠性

随机从挑选吉鲡罗非鱼(5条)、尼罗罗非鱼(10条)、和萨罗罗非鱼(4条)，构成一混合试验组。同实施例2相同方法，对获取的各鱼的肾脏组织进行匀浆，将匀浆样品于15000rpm离心直至上清液澄清，取离心后形成的上清液作为测试样品，进行LDH同工酶电泳检测。

根据LDH同工酶的电泳图谱中，LDH的条带数目来判断鱼类的种类。6条LDH条带则判定为吉鲡罗非鱼；5LDH条带则判定为尼罗罗非鱼；3LDH条带则判定为萨罗罗非鱼。

结果表明，在未知检测样品来自何种鱼类的情况下，同工酶的检测甄别结果与各样品所对应的实际鱼类完全相符。

实施例5

试剂盒的制备和检测

制备一吉鲡罗非鱼种质检测和鉴定的试剂盒，它含有以下成分：

用于乳酸脱氢酶同工酶检测的试剂	溶液一：含辅酶I、NBT，PMS的Tris-HCl染色缓冲液 (pH9.5) 溶液二：乳酸钠(底物)
		说明书	一份注：所述的说明书说明了基于乳酸脱氢酶的同工酶检测结果判定鱼类是否是吉鲡罗非鱼的标准。并且在说明书中给出了以下鱼类的乳酸脱氢酶的同工酶图谱：吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼(即图3的同工酶电泳图谱和扫描图)。
用于微卫星标记检测的试剂 (任选的试剂)	选自下组的一对或多对引物对进行PCR扩增微卫星标记：SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11 和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>李，思发

<120>“吉鲡”鱼遗传特性甑别方法及其应用

<130>096672

<160>22

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

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Claims

1.一种确定或判断待检测的鱼类是否是吉鲡罗非鱼的方法，其特征在于，包括步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测同工酶包括：对鱼组织进行匀浆，然后离心获得上清，再通过电泳法检测同工酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待检测的鱼类包括吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼或其组合。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鱼组织包括选自下组的组织：肌肉组织、肝组织、肾脏组织、心组织、眼、或其组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阳性对照是吉鲡罗非鱼的乳酸脱氢酶的同工酶图谱，或者标准品包括以下鱼类的乳酸脱氢酶的同工酶图谱：吉鲡罗非鱼、尼罗罗非鱼、和萨罗罗非鱼。

6.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，如果检测结果表明存在6种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼；如果检测结果表明存在5种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果表明存在3种乳酸脱氢酶，则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼。

7.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝6sm+24st+14；则提示或初步判断待检测鱼类是尼罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝2m+4sm+24st+14t；则提示或初步判断待检测鱼类是萨罗罗非鱼；如果检测结果显示染色体组型公式为2n＝1m+5sm+24st+14t，则提示或初步判断待检测鱼类是吉鲡罗非鱼。

9.一种用于甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(b)说明书，所述的说明书说明了基于乳酸脱氢酶的同工酶检测结果判定鱼类是否是吉鲡罗非鱼的标准；

更佳地，所述的试剂盒还包括：任选的用于染色体组型检测的试剂和/或任选的用于微卫星标记检测的试剂。

10.一种鱼类的乳酸脱氢酶同工酶的用途，其特征在于，用作鉴定吉鲡罗非鱼的遗传标记，或用于制备甑别吉鲡罗非鱼的试剂盒。