CN103210091B

CN103210091B - 用于检测人乳头瘤病毒的基因型的dna芯片、含有该芯片的试剂盒及检测hpv的基因型的方法

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Publication number: CN103210091B
Application number: CN201080068613.9A
Authority: CN
Inventors: 文宇哲; 吴明烈
Original assignee: Goodgene Inc
Current assignee: GOODGENE有限公司; Goodgene Inc
Priority date: 2010-06-17
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: US20130184164A1; WO2011158987A1; CN103210091A; KR20110137642A; KR101239387B1

Abstract

本申请公开一种DNA芯片(或DNA微阵列)、含有该DNA芯片的基因分型试剂盒及使用该DNA芯片的基因分型方法，在所述DNA芯片上点有与作为子宫颈癌的主要成因和性传播疾病的最常见原因的44种HPV的核酸互补结合的探针。根据本公开，可以检测侵入外生殖器的全部44种HPV，而且可以准确地诊断由超过一种类型的HPV引起的同时感染。HPV基因分型的灵敏性和特异性接近于100%，并且可以快速测试许多个样品。本公开对预测子宫颈癌和癌前期病变是非常有用的。

Description

用于检测人乳头瘤病毒的基因型的DNA芯片、含有该芯片的试剂盒及检测HPV的基因型的方法

技术领域

本公开涉及一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片、含有该芯片的试剂盒及HPV基因分型的方法。更具体而言，本公开涉及一种DNA芯片(或DNA微阵列)、含有该DNA芯片的基因分型试剂盒及使用该DNA芯片的基因分型方法，在所述DNA芯片上点有44种HPV（其是子宫颈癌的主要成因和性传播疾病的最常见原因）的核酸互补结合的探针。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一种通过性接触传播到人的病毒并且在两个方面非常重要。

第一，HPV感染是人类最常见的性传播感染，具有最高现患率(prevalence rate)。在美国，26.8%的年龄在14至59之间的女性有HPV感染并且认为80%的女性被感染至少一次。这种感染尤其发生在性活跃的育龄女性身上，而且据估计患病率正在增加。因此，定期的HPV测试对成年女性是必需的，并且性传播感染的测试中包括HPV测试(U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,Centers for Disease Control andPrevention,National Center for HIV/AIDS,Viral Hepatitis,STD,and TB,Prevention Divisionof STD Prevention.Sexually Transmitted Disease Surveillance2008.Division of STDPrevention.2009:November;Tchernev G.Sexually transmitted papillomavirus infections: epidemiology pathogenesis,clinic,morphology，important differential diagnostic aspects, current diagnostic and treatment options.An Bras Dermatol.2009;84(4):377-89)。

第二，HPV已被明确证实在人类中引起肿瘤和癌症。HPV，特别是高危型HPV，是几乎所有子宫颈癌病例的原因。HPV浸润到人皮肤或粘膜上皮中，由此引起炎症和过度增殖。在大多数情况下，过度增殖是简单的皮肤肉赘、生殖器或肛门肉赘、或良性肿瘤(如尖锐湿疣)。然而，HPV能够引起癌症，实际上，几乎所有子宫颈癌、大多数口腔癌、咽癌和喉癌及许多肛门癌均由HPV引起。HPV的重要性在于，其因可以引起癌症而是致命的。通过HPV测试可以早期诊断子宫颈、肛门等的癌症和癌前期病变。实际上，已显示，HPV测试，与作为子宫颈癌诊断用的标准筛查方法的帕帕尼科拉乌试验或巴氏涂片相比，具有非常优异的子宫颈癌预测灵敏性。因此，在包括US的许多国家推行子宫颈癌筛查测试(Howley PM.Virology.Vol2,1996,2045-2109;Murinoz N et al.,NEngl J Med，2003,348:518-27;Parkin M,F.Bray F,J.Ferlay J and P.Pisani P.Global cancer statistics,2002.C..A.Cancer J. Clin.2005;National Network of STD/HIV Prevention Training Center.Genitalhuman papillomavirus infection.Feb2008)。出于这些原因，HPV市场庞大，而且HPV测试具有重大经济价值。

子宫颈癌是继乳腺癌之后全世界女性中的第二最常见癌症。在发展中国家，它还是女性癌症相关死亡的主要原因之一。据报道，全世界每年出现约440,000新病例和270,000例死亡。特别是，它是在发展中国家中引起女性死亡的主要原因。在韩国女性中，子宫颈癌的发病率(10.6%)位列第三，在胃癌(15.8%)和乳腺癌(15.1%)之后。近年来，人乳头瘤病毒感染在20岁和30岁年轻女性中显著增加，占所有性传播疾病患者的32%，且已经成为严重的健康关注对象。根据韩国中心癌登记处（Korea Central Cancer Registry）2002年度报告，与发达国家相比，韩国显示出较高的发病率，在2002年有3,979例。在所有的女性中出现的恶性肿瘤中，子宫颈癌在乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌和甲状腺癌之后位列第五，患病率为9.1%，在40岁女性中患病率最高，为29.3%。根据来自韩国中心癌登记处的数据，当包括子宫颈原位癌(其是一种初癌阶段)时，子宫颈癌位列第二，而当排除原位癌时，其位列第五。然而，如果还包括在癌症统计中没有登记的宫颈非典型增生，其仍然是女性中最重要的癌症。以前，子宫癌的大约90%的癌症都是子宫颈癌。但是，近来，子宫体癌的发病率日益增加，而子宫颈癌的发病率正在减少。目前，子宫颈癌与子宫体癌的比例大约为5:1(http://www.ncc.re.kr:9000/nciapps/user/basicinfo/each_info.jsp?grpcode=1H00)。

关于子宫颈癌的原因的流行病学研究显示，具有低水平教育或经济或糟糕卫生条件的女性、在青少年期开始性交的女性、具有多次分娩经历的女性、具有杂乱性伙伴的女性以及在人乳头瘤病毒测试中被诊断为阳性的女性中患子宫颈癌的风险较高。这说明，子宫颈癌与性传播感染密切相关，并且已被普遍认可的是，人乳头瘤病毒是子宫颈癌的主要原因(Jae Won Kim,Ju Won Roh,Moon Hong Kim,Noh Hyun Park,Polymorphisms in E7Gene ofHuman Papillomavirus Type 16 Found in Cervical Tissues from Korean Women,J KoreanCancer Assoc.2000;32(5)875-883)。

目前，基于亚型或基因型已知大约120种HPV。其中，83种的碱基序列和结构是已知的。大约40种HPV是感染肛门生殖器部位(即，阴道皮肤和粘膜、子宫颈、尿道和阴茎)的所谓的肛门生殖器型或生殖器HPV。在大多数人中大部分HPV感染不会引起症状，但是一些类型可以引起肉赘。其他的可以导致癌前期病变，如高等级鳞状上皮内损伤(HSIL)或子宫颈上皮瘤，而且他们中的一些可以发展成癌症。能够导致癌前期病变和癌症的HPV类型被称为高危型HPV，其他的被称为低危型HPV。一些研究者将HPV分成高危群、中危群和低危群。高危型HPV包括HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV68型和HPV82型。以及，低危型HPV包括HPV6型、HPV11型、HPV34型、HPV40型、HPV42型、HPV43型、HPV44型、HPV54型、HPV55型、HPV61型、HPV62型、HPV72型和HPV81型。被怀疑为高危但尚未被识别的可能的高危型HPV包括HPV26型、HPV53型、HPV HPV66型、HPV67型、HPV69型、HPV70型and HPV73型。除此之外，尚未清楚识别的其他类型有HPV7型、HPV10型、HPV27型、HPV30型、HPV32型、HPV57型、HPV83型、HPV84型和HPV91型。据报道，全世界有49.9%的子宫颈癌患者是被HPV16型感染的，13.7%是被HPV18型感染的，7.2%是被HPV31型、HPV33型和HPV35型感染的，以及8.4%是被HPV45型感染的。

根据Merck的报告，HPV16型和HPV18型尤为重要。这两种类型的HPV被报道引起约60-70%的子宫颈癌、子宫颈上皮瘤(CIN)和HSIL，而且已知的是，HPV6型和HPV11型引起约90%的生殖器赘生物。然而，不同人种和国家中的HPV类型的流行病学有所不同。实际上，如下文将阐述的，来自韩国的数据与来自其他国家的数据略有不同。来自韩国的其他报告将HPV16型和HPV18型归类为引起子宫颈癌的高危HPV，将HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV45型和HPV52型归类为中危HPV，以及将HPV6型和HPV11归类为低危HPV，并且声称通过对HPV进行基因分型使子宫颈癌的早期筛查或诊断成为可能(Jae Won Kim,Ju Won Roh,Moon Hong Kim,Noh Hyun Park,Polymorphisms in E7Gene of Human Papillomavirus Type 16 Found in Cervical Tissuesfrom Korean Women,JKorean Cancer Assoc2000;32(5)875-883;(http://www cmcbaoro or.kr/guide/ guide02_02.jsp?dtno=209&dcno=411;Munoz N,Bosch FX,de Sanjose S,Herrero R,Castellsague X,Shah KV，Snijders PJ,Meijer CJ and International Agency for Research onCancer Multicenter Cervical Cancer Study Group.Epidemiologic classification of humanpapillomavirus types associated with cervical cancer.New England Journal of Medicine.2003;348:518-527;Koutsky LA et al.,N Engl J Med，2002,347:1645-51;http://www.bosa.co.kr/news_board/view.asp?news pk=82896)。

HPV基因组的大小约为8-10kb，并且由封装在类似高尔夫球的病毒壳体中的双螺旋DNA组成。HPV的基因组结构可以大体分为早期转录区E(早期基因区)、晚期转录区L(晚期基因区)和不表达区LCR(长控制区)。HPV的基因组结构极大地影响疾病的暴发类型、危险度和预后。特别是，E6基因和E7基因被整合到受感染细胞的基因组中，并且在它们在此保留并被表达的同时对诱发癌症起到重要作用。如HPV16型和HPV18型的高危型HPV的E6基因和E7基因与作为人类中最重要的肿瘤抑制基因的p53、E6AP、Rb(视网膜母细胞瘤,P105RB)、P107、P130等反应，并且使它们失活。结果，受感染细胞因细胞周期调节和凋亡控制机制的紊乱而被转化为癌细胞。超过99%的子宫颈癌是由高危型HPV引起的，而且在癌细胞的基因组中几乎总是发现E6/E7的HPV基因片段。相反，因为低危型HPV与如p53或Rb的肿瘤抑制基因反应并使其失活的能力低，所以它们通常不引起子宫颈癌。HPV的最大基因是L1。L1存在于大多数HPV类型中，具有同样保守的碱基序列。HPV的壳体蛋白主要由L1组成，而且L1具有最高抗原性。

一旦子宫颈细胞被HPV恶性转化，其会经由癌前期病变、发育异常、CIN或鳞状上皮内损伤(SIL)发展成所谓的原位癌。如果原位癌侵入子宫颈上皮下方的基底层，其会变成癌或浸润性癌。在90%的被HPV感染的女性中，免疫系统自然地从机体内清除病毒。然而，HPV保留在10%的被高危型HPV感染的女性中并且诱发癌前期病变(Wallin KL,WinklundF，Angstrim T,et al:Type-specific persistence of human papillomavirus DNA beforethe development of invasive cancer.N Engl J Med 1999;341:1633;Bosch FX,Lorincz A,Munoz N,Meijer CJ,Shah KV.The causal relation between human papillomavirus and cervicalcancer.JClin Pathol2002;55:244-65)。大约8%的癌前期病变发展成原位癌，以及大约20%的原位癌发展成癌症。也就是说，高危型HPV感染维持10-20年或更长，它发展成子宫颈癌，且频率估计为约0.16%。既然子宫颈癌的暴发需要如此长时间并且其是逐渐发展，那么可以通过早期诊断癌前期病变来治疗或预防子宫颈癌。就是说，可以经由保守外科手术消除子宫颈的癌前期病变来预防癌症。

HPV感染几乎不能由培养、染色、组织学检查或免疫检查来检测，并且只能通过遗传测试来准确地诊断。有三种HPV遗传测试。第一种是仅仅调查HPV的存在。典型实例是通过PCR扩增HPV基因的共有序列(即，不变核苷酸序列)接着通过例如电泳识别。第二种是所谓的基因分型分析，不仅鉴定HPV的存在而且鉴定其类型。金标准测试是进行PCR并且通过产物的自动核苷酸序列测定来分析基因型。然而，由于这种方法需要许多成本、时间和劳动，因此其正在被HPV DNA微阵列替代。将多种特异性针对HPV类型的探针点在固体载体上并且将样品DNA的PCR产物放在其上并杂交。然后，使用扫描仪分析结果。第三种是两种测试方法的中间物。杂交捕获测定法(Digene公司,Gaithersburg,MD,USA)是一个实例。虽然它能够鉴定HPV是否存在以及HPV是高危型还是低危型，但是准确的基因分型是不可能的。另外，只有13种高危型HPV和7种低危型HPV可被识别，而其他的20种以上的HPV类型不能被识别(Kim KH,Yoon MS,Na YJ,Park CS,Oh MR,Moon WC.Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirusgenotyping DNA chip.Gynecol Oncol.2006;100(1):38-43;Selva L,Gonzalez-Bos quet E,Rodriguez-Plata MT，Esteva C,Sunol M and Munoz-Almagro C.Detection of humanpapillomavirus infection in women attending a colposcopy clinic.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease.2009;64:416-421)。

关于HPV的另一个重要的事实是可以使用最近开发的HPV疫苗通过接种疫苗预防病毒感染和癌症。目前可用两种HPV疫苗。(Merck & Co.Inc.,Whitehouse Station,NJ,USA)是针对HPV16型、HPV18型、HPV6型和HPV11型制备的四价疫苗。另一种是(GlaxoSmithKline Biologicals,Rixensart,比利时)，其是为预防HPV16型和HPV18型感染设计的二价疫苗。这些疫苗对性活动前的青春期少女最有效，并且在以前已被HPV16或HPV18感染的女性中效力降低。为此，对成年女性接种疫苗是有争论的，但是，其是可行的，除非HPV感染是16型或18型。因此，鉴定HPV感染并且识别准确的HPV类型变得越来越重要(Selva L,Gonzalez-Bosquet E,Rodriguez-Plata M T,Esteva C,Sunol M and Munoz-Almagro C.Detection of human papillomavirus infection in womenattending a colposcopy clinic Diagnostic Microbiologyand Infectious Disease2009;64:416-421;Reynales-Shigematsu LM,Rodrigues ER,Lazcano-Ponce E.Cost-effectivenessanalysis of a quadrivalent human papilloma virus vaccine in Mexico.Arch Med Res.2009Aug；40(6):503-13)。

检查子宫颈细胞的帕帕尼科拉乌试验(帕帕尼科拉乌涂片或巴氏涂片)已被用作子宫颈癌的主要筛查测试。但是，因为巴氏涂片是一种主观测试，所以经常发生假阳性结果，因此，需要对其进行补充的测试方法。事实上，基于巴氏涂片的细胞学测试对于作为子宫颈癌的最重要原因的HPV感染的诊断并不怎么有效，而且预测异常损伤是将会自然消失还是发展成癌症并不容易。实际上，通过显微镜下的细胞形态学检查不可能诊断无症状的感染或潜伏性感染，尤其是区分高危型HPV感染和低危型HPV感染。因此，为了减少子宫颈癌，需要能够监测HPV感染、其危险度及其基因型的诊断方法。

如上所述，需要准确地、快速地、低成本、大规模地测试HPV的存在及其基因型。在这种意义上，DNA微阵列(芯片)技术是最适合的。

海外使用的HPV诊断产品包括Hybrid Capture II(Qiagen,德国;FDA批准)、Cervista^TM HPV HR测试(Hologic Women’s Health Co.;14种高危型;FDA批准),RocheAMPLICOR HPV测试(Roche Molecular Systems,USA;CE标志（CE marking）),PapilloCheck HPV筛查测试试剂盒(Greiner Bio-One GmbH,德国;18种高危型和6种低危型;CE标志)和Digene HPV基因分型RH测试(Qiagen;高危型;CE标志)。

然而，目前商品化的HPV基因分型DNA芯片具有以下缺点。

第一，可被测试的HPV基因型的数目有限。

第二，尽管HPV探针需要基于实际临床样品的HPV基因组的碱基序列信息来设计，但是大多数HPV DNA芯片的设计是基于从文献或美国基因库(US GenBank)中得到的标准碱基序列。因为HPV基因组的DNA碱基序列中有许多变化，如果引物或探针的设计没有考虑它们，那么PCR或杂交不会如所期望的进行，而且会出现错误。

第三，因为没有使用内参基因(对照基因)，所以不容易知道阴性结果是真阴性还是假阴性。

第四，没有考虑能够测试HPV全部基因型的存在的所谓通用探针。为此，对于全部HPV基因型均得到阴性结果时，不容易确定其意味着样品中没有HPV存在，还是其他基因型的HPV会存在。

第五，PCR是在HPV DNA分析之前最重要的步骤，但是条件未被标准化。

第六，为了使HPV DNA芯片和使用该芯片的HPV基因分型标准化，每种基因型的HPV需要用于基因克隆的标准材料。

第七，虽然许多HPV DNA诊断试剂盒是可用的，但是大规模测试以及为研究与标准测试相比它们的准确度有多大以及它们用于筛查子宫颈癌和癌前期病变的帮助有多大而进行的比较是不够的。

本公开的发明人已经在几年内通过PCR后序列测定、DNA微阵列测试和HPV类型特异性PCR等研究了超过250,000个样品的肛门与生殖器HPV的存在及其类型和DNA碱基序列。基于这一结果和对商购的HPVDNA诊断试剂盒的特点的分析，他们注意到了现有技术中有待解决的问题并发明了一种新的HPV DNA微阵列。详细情况如下。

1.生殖器和肛门HPV的类型和数目

根据文献，可以侵入包括子宫颈的生殖器和肛门部位的HPV类型的数目估计为约40种，但并不确定。为了准确地诊断全部类型的生殖器HPV，先决条件是测试全部类型的生殖器HPV的多个样品。但是，这种数据是全世界稀少的。

因此，本公开的发明人针对来自韩国女性的约16,000个子宫颈样品的HPV的L1基因、L2基因和E6/E7基因进行PCR并分析全部PCR产物的碱基序列。基于这些数据，并参考美国和其他国家的报告，他们已经确定了在该新的HPV DNA芯片中应当包含的HPV类型。类型的数目是43，因此，他们发明了一种能够分析全部43种生殖器HPV的DNA芯片。在实施例1中将对其进行详细描述。

2.标准材料

HPV基因分型的基本要求之一是应当针对各种基因型制备全部标准材料(参考材料)。这可以是HPV本身、HPV的整个基因组、HPV的重要基因或质粒克隆。文献中公开的和GenBank储存的生殖器HPV的标准材料的种类和数目非常有限。

如前所述，本发明人已经针对来自韩国女性的约15,000个子宫颈样品的HPV的L1基因、L2基因和E6/E7基因进行PCR并分析了全部PCR产物的碱基序列。基于这一结果，通过完整或部分地克隆43种生殖器HPV的L1基因、L2基因和E6/E7基因，他们得到了质粒DNA克隆。他们决定通过以HPV L1基因的特异性区域为靶识别43种HPV的基因型，并确定了每种类型的HPV L1基因的克隆的质粒标准材料。它们用于DNA芯片的开发及其质量控制(QC)。在实施例2中将对其进行详细描述。

3.PCR扩增

为了可以使用HPV DNA芯片进行准确、灵敏地分析，首先需要适当地进行PCR扩增。为此，应当使用于扩增将要在本公开的HPV DNA芯片上被杂交的HPV L1基因的PCR条件最优化，而且，最重要的是，应当适当地设计PCR引物。此外，优选的是，通过单个双重PCR，在相同条件下，在单管中完成HPV L1基因以及参考和对照基因的扩增。由于文献中报道的或商购HPV DNA芯片推荐的HPV PCR条件常常是嵌套式PCR，因此扩增过程不便，污染危险度高。此外，一些类型的HPV扩增良好，而另一些不好，并且当同时扩增参考基因时经常出现干扰。

因此，通过重复实验，发明人新建了用于PCR的寡核苷酸引物的碱基序列以及基于43种HPV的L1基因和前述标准材料的碱基序列的扩增条件。结果，通过单个双重PCR可以完成HPV L1基因和参考基因的扩增。在实施例3中将对其进行详细描述。

4.对照基因

HPV DNA芯片分析的基本要求之一是不仅应当研究靶基因，而且应当研究为此的内参或对照基因。这对DNA芯片的信号的归一化分析以及假阴性结果与假阳性结果的区分都是必要的。但是，许多DNA芯片测试的进行没有对照基因。

本公开的发明人已使用人β-球蛋白基因作为对照基因。此外，他们发现，持家基因β-肌动蛋白也可用作另一对照基因，并且最近将其加入HPV DNA芯片中。在实施例4-6中将对其进行详细描述。

5.探针结构

在HPV基因分型DNA微阵列测试中最重要的事是对于各种基因型的HPV适当地进行杂交以使其能够被准确地识别。在这方面，探针极其重要。如上所述，本公开的发明人已对于来自韩国女性的超过15,000个子宫颈样品针对HPV的L1基因进行PCR并分析了全部PCR产品的碱基序列。基因这一结果，他们建立了43种生殖器HPV的质粒DNA克隆标准材料，并且确定了HPV DNA芯片的基本的寡核苷酸结构。寡核苷酸的长度为18至30个碱基对(bp)。在实施例5中将对其进行详细描述。

6.探针的最终设计和制备

通常，寡核苷酸探针的长度为20-30bp并且具有连到其上的C6接头。然而，本公开的发明人凭经验发现，在那种情况下，由于空间不稳定性会导致在载玻片上点样的过程中可能出现问题，。

因此，本公开的发明人设计了一种具有较长C20接头的寡核苷酸探针。在实施例5中将对其进行详细描述。另外，他们通过引入茎部设计了d形探针。在实施例6中将对其进行详细描述。

7.DNA微阵列(芯片)的构建

根据探针对载网(grid)进行设计，并且将混在适合缓冲液中的探针点在显微镜用载玻片上。在实施例7中将对其进行详细描述。

8.在DNA微阵列(芯片)上的反应

使用从各种类型的HPV的一个、两个或三个克隆的多种组合中得到的100个人造标准样品作为用于HPV L1基因和β-肌动蛋白基因的PCR扩增的模板。将PCR产物放在所述芯片上，并且进行杂交至少三次。然后，通过使用荧光扫描仪进行分析来确立最佳条件。在实施例8中将对其进行详细描述。

9.DNA微阵列(芯片)的准确性的评估

将本公开所构建的新HPV DNA芯片与标准序列测定及HPV-类型特异性PCR的HPVDNA芯片进行比较以调查准确性、灵敏性和特异性。此外，研究HPV DNA芯片是否能够用于测试临床样品(如子宫颈细胞)中HPV的存在及其基因型。在实施例9中将对其进行详细描述。现有HPV DNA芯片缺乏这种数据。

10.子宫颈癌早期诊断的准确性的评估

将根据本公开构建的新HPV DNA芯片的子宫颈癌和癌前期病变的诊断的准确性、灵敏性和特异性与现有的杂交捕获测定法2(HCA-2)的子宫颈癌和癌前期病变的诊断的准确性、灵敏性和特异性进行比较。另外，调查本公开的HPV DNA芯片是否能够用于从临床样品(如子宫颈细胞)中预测子宫颈癌或癌前期病变。在实施例10中将对其进行详细描述。现有HPV DNA芯片缺乏这种数据。本公开的HPV DNA芯片已被证实可用于临床应用。

发明内容

技术问题

本公开旨在提供一种用于诊断HPV的DNA芯片，其能够同时地准确、快速地诊断由44种生殖器HPV引起的感染。

本公开还旨在提供一种寡核苷酸探针和一种PCR引物，能够准确地检测44种生殖器HPV，具有高度特异性和灵敏性。

本公开还旨在提供一种用于检测44种生殖器HPV的基因型的试剂盒，在所述试剂盒中，“多合一地”提供所述HPV DNA芯片、所述PCR引物、标记物等。

技术方案

在一个总的方面，本公开提供一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含：具有选自SEQ ID NO6-SEQ ID NO109的碱基序列的线性寡核苷酸探针。

在另一个总的方面，本公开提供一种用于检测来自样品中的HPV的基因型的DNA芯片，包含：具有选自SEQ ID NO110-SEQ ID NO213的碱基序列的d形寡核苷酸探针。

本公开的DNA芯片能够同时检测44种HPV的基因型，所述44种HPV包括：作为高危型HPV的HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b和HPV-82；作为中危型HPV的HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70和HPV-73；作为低危型HPV的HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72和HPV-81；以及作为其他HPV的HPV-90、HPV-10、HPV-27、HPV-30、HPV-32、HPV-57、HPV-83、HPV-84和HPV-91。

在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID NO6-SEQ ID NO97或SEQID NO110-SEQ ID NO201的碱基序列的寡核苷酸探针可与各个类型HPV所特有的L1基因区互补结合。

在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID NO98-SEQ ID NO105或SEQID NO202-SEQ ID NO209的碱基序列的寡核苷酸探针可为与存在于全部类型的HPV中的L1基因区互补结合的通用探针。

在本公开的一个示例性实施方式中，具有选自SEQ ID NO106-SEQ ID NO109或SEQ ID NO210-SEQ ID NO213的碱基序列的寡核苷酸探针可以与作为阳性对照的β-肌动蛋白基因互补结合。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述DNA芯片可以具有8-24个分隔孔，所述探针可以被点在所述分隔孔上。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述寡核苷酸探针的浓度可为至少38pmol。

在本公开的一个示例性实施方式中，可以将C6胺修饰的双脱氧胸腺嘧啶核苷连接到所述寡核苷酸探针上作为接头从而将所述寡核苷酸探针点在SuperAldehyde涂敷载体上。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述载体可以选自载玻片、纸、硝酸纤维素膜、微量培养板孔、塑料、硅、DVD和小珠。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述样品可以选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及其癌前细胞。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述DNA芯片可以用于决定是否将施用HPV疫苗。

在另一个总的方面中，本公开提供一种用于检测HPV的基因型的试剂盒，包括：所述DNA芯片，用于通过PCR扩增靶基因的引物，和用于检测扩增的DNA的标记物。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述引物可为具有选自SEQ ID NO1-SEQ IDNO 2的碱基序列的用于扩增人β-肌动蛋白基因的引物或者具有选自SEQ ID NO3-SEQID NO 5的碱基序列的用于扩增HPV L1基因的引物。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述标记物可为选自Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、Texas Red、Orange Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、JOE、Oyster556、Oyster645、BODIPY630/650、BODIPY650/665、Calfluor Orange546、Calfluor Red610、Quasar670、生物素、Au、Ag和聚苯乙烯中的一种或多种。

在另一个总的方面中，本公开提供一种用于检测HPV的基因型的方法，包括：

(a)使用具有选自SEQ ID NO1-SEQ ID NO5的碱基序列的引物通过单一、双重或嵌套式PCR扩增样品的靶基因；

(b)对DNA芯片的寡核苷酸探针进行标记；

(c)使经标记的探针与经扩增的PCR产物杂交；和

(d)检测杂交的产物。

在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行：用选自Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、Texas Red、Orange Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、JOE、Oyster556、Oyster645、BODIPY630/650、BODIPY650/665、Calfluor Orange546、Calfluor Red610、Quasar670和生物素中的标记物对所述寡核苷酸探针进行标记。

在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行：首先用Au纳米颗粒然后用银染色标记靶探针以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。

在本公开的一个示例性实施方式中，(b)中所述标记可通过以下方式进行：首先用Au纳米颗标记靶探针而后形成银壳以及将所述靶探针与所述DNA芯片的寡核苷酸探针互补地结合。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述靶探针可以具有选自SEQ ID NO214-SEQID NO215的碱基序列，并且在3'-末端依次连接C18接头、A10和巯基。

在本公开的一个示例性实施方式中，所述基因分型方法可以进一步包括使用质粒载体进行分析，在所述质粒载体中插入表1中描述的65种HPV的L1基因作为阳性对照克隆。

根据本公开的用于检测HPV的基因型的寡核苷酸探针、含有所述寡核苷酸探针的DNA芯片和诊断试剂盒以及用于检测HPV的基因型的方法按照如下九步完成。

1.标准样品和对照样品的制备

本公开的发明人对于来自韩国女性的约16,000个子宫颈样品，针对HPV的L1、L2和E6/E7基因进行PCR，并且分析全部PCR产物的碱基序列。基于这些数据，并且参考美国和其他国家的报告，他们确定了应当被包含在新型HPV DNA芯片中的HPV类型。所述类型的数目为43，因此，他们发明了一种能够分析全部43种生殖器HPV的DNA芯片。

2.DNA的分离

使用适当确立的方法从步骤1中得到的样品中分离DNA。

3.双重PCR

设计用于扩增HPV L1基因和人β-肌动蛋白基因的寡核苷酸引物，并且确立适当的PCR条件。以双重方式进行PCR并且在不同的引物浓度下针对各种基因确立条件。使用在步骤2中分离的DNA作为模板，针对HPV L1基因和人β-肌动蛋白基因进行PCR。

4.序列测定和克隆

PCR后，通过序列测定分析HPV L1基因的碱基序列，并且基于结果建立数据库。将HPV类型已被识别的PCR产物克隆到质粒载体中。随后，在确立用于本公开的DNA芯片的反应条件的过程中，将所述克隆用作标准样品和对照样品。HPV基因型已被识别的临床DNA样品被贮藏并且用于本公开的DNA芯片的准确分析。

5.探针设计

基于通过检测来自韩国人的子宫颈细胞和癌组织的HPV的基因型而在步骤4中建立的序列数据库以及外国的HPV相关数据库，设计与全部43种可以感染人子宫颈的HPV的L1基因和人β-肌动蛋白基因互补且能够通过在所述DNA芯片上杂交检测它们的寡核苷酸探针。此外，设计具有茎部的d形寡核苷酸探针。

6.DNA芯片的构建

设计载网，在步骤5中设计的探针将被点在所述载网上，并且将与适当的缓冲液混合的探针点(或排列)在显微镜用载玻片上。对所得到的DNA芯片进行稳定化和质量控制。

7.在DNA芯片上的反应和分析条件的确立

对于在步骤4中得到的各个类型HPV，使用一个、两个或三个克隆的多种组合作为模板，通过双重PCR扩增HPV L1基因和β-肌动蛋白基因。将PCR产物置于所述DNA芯片上，并且几次进行杂交。然后，通过使用荧光扫描仪进行分析来确立最佳条件。

8.在DNA芯片上进行临床样品的分析

将在步骤3和4中通过PCR和序列测定已经确认HPV的存在和类型的临床样品的DNA再次进行双重PCR。将PCR产物置于在步骤6中构建的DNA芯片上并且使其在步骤7中确立的条件下进行杂交。清洗后，使用荧光扫描仪分析结果。由此，分析本公开的DNA芯片的灵敏性、特异性和再现性，并且再次确立使用本公开的DNA芯片诊断HPV基因型的最佳条件。

9.在于DNA芯片上分析临床样品之后分析与临床数据的相关性

将在步骤8中PCR后DNA芯片分析的结果与临床数据(如巴氏涂片的数据)进行比较，并且研究它们的相关性。分析本公开的DNA芯片是否对预测子宫颈癌或癌前期病变有用。结果，可以确认的是，本公开的DNA芯片不仅可以用于HPV的基因分型，还可以用于子宫颈癌的筛查。

使用本公开的DNA芯片的诊断试剂盒提供了：1)用于从样品(如子宫颈拭子、石蜡切片等)中提取DNA的试剂；2)用于通过PCR扩增HPV L1基因和β-肌动蛋白基因的试剂；3)在HPV基因扩增过程中用作阳性对照的质粒DNA克隆；4)用于HPV基因分型的寡DNA芯片；和5)“多合一地”使用DNA芯片的杂交用反应溶液和清洗溶液。

有益效果

根据本公开，可以检测侵入外生殖器的全部44种HPV，而且可以准确诊断由超过一种类型的HPV引起的同时感染。HPV基因分型的灵敏性和特异性接近于100%，并且可以快速测试许多个样品。本公开对预测子宫颈癌和癌前期病变是非常有用的。

特别是，根据本公开的用于检测HPV的基因型的DNA芯片和使用该DNA芯片的试剂盒对通过HPV及其基因分型大规模自动化诊断样品(如子宫颈拭子、阴道拭子、尿、肛门组织、口腔组织、咽组织等)感染非常有用。此外，它们可以与巴氏涂片一起使用或者单独使用以筛查子宫颈癌及其癌前期病变，减少测试成本、工作和时间。此外，因为可以准确地分析HPV的基因型，所以它们可以用于定制接种疫苗。

因此，本公开将通过减少HPV相关癌症和由此引起的死亡而非常有助于卫生健康的改善，并且对医药产业非常有价值。

附图说明

图1显示根据本公开的用于检测HPV的基因型的DNA微阵列(芯片)的载网。在一个DNA芯片上形成八个孔，并且将特异性针对各个类型的HPV L1基因的探针、对全部类型的HPVL1基因共用的通用探针和针对对照或参考基因的探针点在每个孔上。图1中，红色斑点对应于引起癌症的14种高危型HPV：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68和HPV82。粉红色斑点对应于7种可能的高危型HPV(尽管未明确证实但其可能引起癌症)：HPV26、HPV53、HPV66、HPV67、HPV69、HPV70和HPV73。天蓝色斑点对应于14种低危型HPV：HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72、HPV-81和HPV-90。黄色斑点对应于8种其他的HPV类型(癌症风险尚不明确)：HPV10、HPV27、HPV30、HPV32、HPV57、HPV83、HPV84和HPV91。紫色斑点，对应于通用探针，当样品中存在HPV时，给出阳性结果。绿色斑点对应于对照基因探针，对照基因探针用作角标记(corner marker)并表明已成功地从样品中提取DNA。本公开中，使用所谓的持家基因之一的人β-肌动蛋白(ACTB)基因作为对照基因。

图2是显示确定用于通过双重PCR扩增HPV L1基因(作为靶基因)和人β-肌动蛋白基因(作为对照基因)的HPV L1引物和ACTB引物的最佳浓度比的实验结果的电泳图像。使用My11、GP6-1和GP6+作为HPV L1引物，并且使用ACTBF和ACTBR作为β-肌动蛋白引物。泳道M:100bp大小标记；泳道1-5：10pmol HPV L1引物，10pmolACTB引物；泳道6-10：10pmol HPV L1引物，5pmol ACTB引物；泳道11-15：10pmol HPV L1引物，1pmol ACTB引物。样品1：HPV56型阳性的人子宫颈拭子样品；样品2：HPV16型阳性的人子宫颈拭子样品；样品3-4：未被HPV感染的子宫颈拭子样品；样品5：作为阳性标准材料的含有HPV18型的基因的海拉(HeLa)子宫颈癌细胞样品。已证实，就双重PCR而言，泳道6-10的条件是最好的条件。

图3显示在将图2中泳道6-10的样品放在本公开的HPV DNA芯片上之后进行杂交及使用荧光扫描仪在635nm波长下进行扫描的结果。

图4显示按照现有方法分别进行HPV L1基因和β-球蛋白基因的单一PCR与使用对HPV和非特异的低信号表现出阴性结果的样品进行双重PCR的实验结果。样品1-2是作为未被HPV感染的阴性对照的HEK细胞的gDNA样品，以及样品3是被HPV35、HPV39、HPV-53、HPV58、HPV72和HPV-66同时感染的子宫颈拭子样品。

图5显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV6型感染。因为对于通用探针和β-肌动蛋白探针样品给出阳性结果，所以可以确定为真阳性，而非假阳性。这一结果也通过序列测定而被证实。

图6显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV39L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV39型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图7显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV11L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV11型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图8显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV43L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-43同时感染（混合感染）。这一结果也通过序列测定而被证实。

图9显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV11L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-11同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图10显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV52L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV52型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图11显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV33L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV33型感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图12显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV56L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-56同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图13显示从韩国女性的子宫颈拭子样品和阴道拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV-6L1基因的探针、特异性针对HPV30L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-6和HPV-30同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图14显示从其子宫颈中经组织学鉴定为具有高级别的鳞状上皮内损伤的韩国女性的子宫颈拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR、在本公开的HPV DNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交以及在清洗后用荧光扫描仪扫描的示例性结果。样品表现出对于特异性针对HPV16L1基因的探针、特异性针对HPV81L1基因的探针、通用探针和β-肌动蛋白探针的阳性结果，于是被诊断为被HPV-16和HPV-81同时感染。这一结果也通过序列测定而被证实。

图15示意性显示在使被点在芯片上的探针与PCR产物杂交之后，先用金纳米颗粒(AuNP)而后用银进行标记的过程。

图16显示HPV-6-AuNP-Ag增强芯片的扫描图像。左侧图像显示扫描全部8个孔的结果，以及右侧图像显示点在每个孔中的斑点。

图17显示HPV-6-AuNP-Ag核壳芯片的扫描图像。左侧图像显示扫描全部8个孔的结果，以及右侧图像显示点在每个孔中的斑点。不同于图16的银(Ag)染色图像，斑点被清楚地显示。

图18显示利用扫描电子显微镜术(SEM)分析HPV-6-AuNP-Ag染色芯片的斑点和背景(BG)的结果。已证实，在每个斑点中金纳米颗粒以高密度存在。

图19显示利用SEM分析HPV-6-AuNP-Ag核壳芯片的斑点和背景(BG)的结果。已证实，在每个斑点中金纳米颗粒以高密度存在。

图20显示HPV-6-AuNP-Ag增强斑点和HPV-6-AuNP-Ag核壳-标记斑点的SEM图像。可以看出，与Ag染色相比，Ag核壳标记赋予稳定得多的结果。在Ag染色的情况下，染色是非特异的。

图21显示使用装备有PD的扫描仪在不同的模板浓度下扫描其中用AuNP(HPV-6-AuNP)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片、其中用AuNP标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)而后用银(HPV-6-AuAg染色)增强的芯片以及先用Au然后用Ag核壳(HPV-6-AuAg核壳)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片以及使用SBR比较每个斑点的反射率的结果。

图22示意性显示用于DNA芯片的d形探针的示例性结构。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更加详细地描述本公开。但是，本公开并不被下列实施例限制。

实施例1：对照样品的制备和DNA的提取

制备将要用作标准材料的样品以及从其中提取DNA。

作为第一样品，被HPV感染且其类型已被识别并且已被广泛用于HPV基因分型研究的人子宫颈癌细胞购自ATCC(马纳萨斯,VA20108,USA)和韩国细胞系库(KCLB;SeoulNational University Cancer Research Institute,韩国)，并且在单层培养后使用。从其中分离基因组DNA。

第二样品从已被诊断为子宫颈癌或原位癌的100个韩国女性的CIN子宫颈组织得到。将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切成5-10片(10-μm厚)，并且放在显微镜用载玻片上。然后，只对癌细胞进行显微解剖。在100例子宫颈癌损伤中，98例有子宫颈上皮瘤(CIN)。

作为第三样品，子宫颈样品从在2005年至2007年期间就诊Hamchun诊断中心(韩国首尔)或韩国妇科癌症基金会(Korea Gynecologic Cancer Foundation)(韩国首尔)并且接受子宫颈拭子和巴氏涂片测试的15,708个女性得到。她们的年龄在16至80岁之间，且平均年龄是47岁。

如下从样品中分离DNA。

为了从细胞、子宫颈拭子样品和石蜡切片样品中提取DNA，使用Labo Pass^TM组织迷你试剂盒(CME0112,CosmoGenetech,韩国)浓缩和纯化DNA。详情如下：

A.从细胞中分离基因组DNA

分离单层培养的细胞并将其加入到50-mL离心管中。在于3500rpm下离心30分钟后，弃去上清液并将沉淀在500μL PBS中重悬浮，然后转移到1.5-mL离心管中。再次于12,000rpm下离心2分钟后，通过清洗除去残留培养基，于是得到基因组DNA。

B.从子宫颈拭子样品中分离基因组DNA

1)将1.5mL样品溶液转移到1.5-mL离心管中。通过在13,500xg下离心2分钟使细胞沉降。

2)移除上清液并加入500μLPBS。

3)利用涡旋使细胞与溶液充分混合。

4)在13,500xg下离心2分钟后，移除上清液。

5)加入200μL TL缓冲液。

6)加入20μL蛋白酶K后，利用涡旋使混合物充分混合。

7)在56°C恒温水浴中进行反应30分钟。

8)反应完成后，在6,000xg以上的条件下进行离心约10秒。

9)加入400μL TB缓冲液后，使混合物充分混合。然后，在6,000xg以上的条件下进行离心约10秒。

10)将反应溶液加入到安装在收集管处的离心柱(spin column)中。

11)在6,000xg下进行离心1分钟。

12)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。

13)加入700μL BW缓冲液后，在6,000xg进行离心1分钟。

14)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。

15)加入500μL NW缓冲液后，在13,500xg下进行离心3分钟。

16)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的1.5-mL的管。

17)加入200μL AE缓冲液或净化水后，使离心柱在室温下静置2分钟。

18)在6,000xg下进行离心1分钟。

19)提取的基因组DNA可以直接用于PCR，或者可以贮存在-20°C备用。

20)提取的基因组DNA可以在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳并且用UV检测。

C.从石蜡包埋的样品中分离基因组DNA

1)使用切片机或外科手术刀将石蜡包埋的样品切成20μm厚的片。

2)将样品转移到1.5-mL管中。

3)加入1.2mL二甲苯后，利用涡旋剧烈混合该混合物2分钟。

4)在13,500xg下离心5分钟后，移除上清液。

5)加入1.2mL乙醇后，利用涡旋剧烈混合该混合物2分钟。

6)在13,500xg下离心5分钟后，移除上清液。

7)重复步骤3)-5)以彻底除去石蜡。

8)使容纳样品的管在37°C静置15分钟以使乙醇可被蒸发。

9)将200μLTL缓冲液加入到管中的样品中。

10)加入20μL蛋白酶K后，利用涡旋充分混合该混合物。

11)在56°C恒温水浴中进行反应30分钟。

12)加入400μL TB缓冲液后充分混合该混合物。在6,000xg以上的条件下进行离心约10秒。

13)将反应溶液加入到安装在收集管处的离心柱中。

14)在6,000xg下进行离心1分钟。

15)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。

16)加入700μL BW缓冲液后，在6,000xg下进行离心1分钟。

17)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的收集管。

18)加入500μL NW缓冲液后，在13,500xg下进行离心3分钟。

19)弃去已经通过离心柱的滤液并且安装新的1.5-mL管。

20)加入200μL AE缓冲液或净化水后，使离心柱在室温下静置2分钟。

21)在6,000xg下进行离心1分钟。

22)提取的基因组DNA可以直接用于PCR，或者可以贮存在-20°C备用。

23)提取的基因组DNA可以在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳并且用UV检测。

实施例2：标准样品和对照样品的制备

制备将要在下列基因分型和分析中用作标准材料的HPV L1基因的质粒DNA克隆。

首先，从人子宫颈癌细胞中提取DNA并且获得HPV L1基因的PCR产物。其次，从韩国食品和医药管理局(Korea Food & Drug Administration(KFDA))获得42种类型的HPV的L1基因的PCR产物。再次，从100个韩国女性的子宫颈癌组织和15,708个女性的子宫颈拭子样品中得到HPV的PCR产物。在通过PCR后序列测定对HPV L1基因进行基因分型之后，将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体上以获得每种HPV基因型的L1克隆。在本公开的DNA芯片的反应条件的确立的过程中，使用这些克隆作为标准样品和对照样品。如下进行克隆：

1)在琼脂糖凝胶上使用凝胶回收试剂盒(Zymo Research,USA)分离扩增的L1基因的PCR产物，并且使用分光光度计或在琼脂糖凝胶上测量浓度。

2)使已贮存在-20°C的pGEM-T Easy载体(Promega,A1360,USA)和2x快速连接缓冲液熔化并且通过用手指轻微地摇动而轻微地混合。在低速离心之后，接着以下列比例混合将要被克隆的插入DNA，将混合物加入到用于连接反应的0.5-mL管中。

3)在使用吸量管使反应溶液充分混合之后，在室温下进行连接约一小时。在需要大量产物时，在4°C进行反应过夜。

4)将由此连接的样品用50μL贮存在-70°C的JM109感受态细胞(≥1x10⁸cfu/μgDNA)转化。

5)将2μL的连接产物加入到1.5mL管中，并且加入50μL感受态细胞(加入前立即在冰浴中融化)。充分混合后，在冰上进行反应20分钟。

6)在于42°C恒温水浴中施加热激45-50秒之后，立刻使该管在冰浴中静置2分钟。

7)在加入950μL SOC培养基至室温之后，将该管在37°C下于摇床中孵育约1.5小时。

8)在LB/氨苄青霉素/IPTG/X-Gal平板上施加约100μL培养基。在倒转该平板以及在37°C下于摇床中孵育约16-24小时之后，进行菌落计数。然后，只选择白色菌落并且将其培养在3mL LB/氨苄青霉素肉汤中。小量制备质粒DNA并且通过PCR或者使用限制性核酸内切酶检查插入DNA是否被正确插入。为了更加准确分析，使用自动碱基顺序分析仪分析所得到的全部克隆。在表1中说明阳性对照克隆。

表1.阳性对照克隆

实施例3：PCR扩增

扩增作为内对照基因的HPV L1基因和人β-肌动蛋白基因以调查HPV的基因型。

对于PCR扩增，首先选择和设计寡核苷酸引物。所述引物包括用于检测HPV L1基因的MY11引物、GP6-1引物和GP6+引物(SEQ ID NO1-SEQ ID NO3)以及用于确认DNA提取和PCR效率的人β-肌动蛋白基因的ACTBF(正向)引物和ACTBR(反向)引物。GP6-1引物、ACTBF引物和ACTBR引物由发明人设计，而其他引物选自先前已知的引物。HPVL1基因的PCR产物的长度为185bp，而β-肌动蛋白基因的PCR产物的长度为102bp。表2中说明针对各基因的PCR引物的碱基序列。

表2.PCR引物

(在碱基序列中，M是A或C，W是A或T，且Y是C或T。)

确立用于双重PCR的最佳条件并且使用实施例2中分离的DNA作为模板进行HPVL1基因和人β-肌动蛋白基因的PCR。具体如下。

如表2中所述，通过将1μL(10pmol)MY11引物、1μL(8pmol)GP6-1引物、1μL(8pmol)GP6+引物、1μL(5pmol)ACTBF引物和1μL(5pmol)ACTBR引物加入到15μL购自Super Bio(Seoul,Korea)的SuperTaq Plus预混物(10x缓冲液2.5μL,10mM MgCl₂3.75μL,10mM dNTP0.5μL,Taq聚合酶0.5μL)中来制备用于检测HPV感染的PCR反应溶液。加入4μL(150ng/μL)的样品模板DNA，并且通过加入蒸馏水将反应溶液的总体积调至30μL。

对于双重PCR，使含有各引物的反应溶液在95°C预变性5分钟，以及重复40个循环的95°C30秒、50°C30秒和72°C30秒。然后，在72°C进行延伸5分钟。

图2中显示结果。可以证实的是，对于子宫颈拭子样品和石蜡包埋的子宫颈癌组织，准确确立了双重PCR条件并且成功地进行了PCR。

表3中给出15,708个子宫颈临床样品的HPV L1基因的PCR结果。7,371个样品表现出阳性结果。特别是，不能由GP6-1引物扩增的HPV-11或HPV-56能够由GP6+引物扩增。此外，通过双重PCR能够制止当DNA浓度太低时可能会出现的非特异PCR。基于这样的结果，可以设计本公开的HPV基因型DNA芯片。

表3.对于来自韩国人的子宫颈细胞样品针对HPV的PCR结果

根据本公开通过双重PCR可以制止当HPV阴性样品的DNA浓度低时在单一PCR中可能会出现的非特异的芯片反应。为了比较，分别对使用现有的针对43种HPV的HPVDNA基因分型芯片(L1基因探针& HBB基因探针)进行单一PCR的产物与根据本公开进行双重PCR的产物进行芯片反应并且在扫描之后比较芯片图像(见图4)。从图4中可以看出，在单一PCR中观察到的非特异的反应没有出现在双重PCR产物中。因此，可以看出，双重PCR比单一PCR要有效得多。

实施例4：序列测定分析和数据库的建立

在实施例3中的PCR之后，进行PCR产物的自动序列测定分析以分析HPV L1的碱基序列并且基于该结果建立数据库。另外，贮存HPV基因型已被确认的临床DNA样品并将其用于本公开的DNA芯片的准确性的分析。根据已知方法使用ABI3130XL顺序分析仪和BigDye Terminatorv2.0进行序列测定反应。

首先，使用本公开的DNA芯片，通过序列测定，对100个石蜡包埋的子宫颈癌组织样品和50个正常子宫颈组织样品进行HPV基因分型。结果，发现100例子宫颈癌组织样品中有98例是高危型HPV。相反，正常子宫颈组织样品中没有发现高危型HPV(表4)。

表4.100个CIN样品的HPV基因分型结果

也就是说，作为DNA芯片分析的结果，100例子宫颈癌组织样品中发现有98例是高危型HPV(98%)。其中，42个样品是HPV-16，18个样品是HPV-58，14个样品是HPV-31，5个样品是HPV-18，5个样品是HPV-35，以及5个样品是HPV-33。这7种类型占98%。和本公开的DNA芯片形成对比，通过PCR序列测定只有89个样品(90.8%)可被识别。尤其是，使用PCR序列测定不能检测到混合感染。这样的结果说明，本公开的HPV DNA芯片可以用于预测子宫颈的病理状态，特别是，可以用于筛查子宫颈癌和原位癌。此外，再次证实了可以准确地检测使用序列测定不能检测的混合HPV感染。

实施例5：DNA芯片的探针的设计

为了设计将要设置在DNA芯片上的寡核苷酸探针，分析包含关于在实施例4-5中通过PCR后序列测定从韩国女性的良性和恶性子宫颈样品中识别的98种HPV的L1基因的碱基序列的信息的庞大数据库和US HPV数据库。此外，对于每个人种，根据HPV基因型及其频率，分析存在于每种基因中的变体内碱基序列。结果，侵入子宫颈的43种生殖器型HPV被选出，并且设计出用于检测它们的基因型的寡核苷酸探针(表5)。

寡核苷酸探针被设计成能够特异性结合所述43种HPV的HPV L1基因DNA的基因型特异性探针。

基于(1)美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information(NCBI))的HPV数据库、(2)US Los Alamos HPV数据库和(3)在实施例4中从韩国女性的子宫颈样品中检测的45种HPV的数据库，得到共计79种HPV的基因组DNA碱基序列：HPV-1a、HPV-2a、HPV-3、HPV-4、HPV-5、HPV-6b、HPV-7、HPV-8、HPV-9、HPV-10、HPV-11、HPV-12、HPV-13、HPV-15、HPV-16、HPV-16r、HPV-17、HPV-18、HPV-19、HPV-20、HPV-21、HPV-22、HPV-23、HPV-24、HPV-25、HPV-26、HPV-27、HPV-28、HPV-29、HPV-30、HPV-31、HPV-32、HPV-33、HPV-34、HPV-35、HPV-35h、HPV-36、HPV-37、HPV-38、HPV-39、HPV-40、HPV-41、HPV-42、HPV-44、HPV-45、HPV-47、HPV-48、HPV-49、HPV-50、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-54、HPV-55、HPV-56、HPV-57、HPV-58、HPV-59、HPV-60、HPV-61、HPV-63、HPV-65、HPV-66、HPV-67、HPV-68a、HPV-68b、HPV-70、HPV-72、HPV-73、HPV-75、HPV-76、HPV-77、HPV-80、HPV-90、HPV-91、MM4(82)、MM7(83)、MM8(84)和CP8304。基于所得到的DNA序列，按照ClustalW方法(配对对比和多序列对比)使用计算机程序DNASTAR(MegAlign^TM5,DNASTAR Inc.)绘制系统树。在筛选到用于各群体的基因型特异性碱基序列之后，使用计算机程序Primer Premier5(Premier Biosoft International Co.)设计基因型特异性探针。

首先通过将探针长度设定为20±2和18±2bp设计110个基因型特异性寡核苷酸探针。在根据本公开的HPV DNA芯片和诊断试剂盒中，DNA探针以包括14种高危型HPVL1基因、22种低危型HPV L1基因和7种中危型HPV L1基因的共计43种HPV L1基因为靶子。高危型HPV包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-82、HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70和HPV-73，以及低危型HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55HPV-61、HPV-62、HPV-72、HPV-81、HPV-90、HPV-10、HPV-27、HPV-30、HPV-32、HPV-57、HPV-83、HPV-84和HPV-91。

使用计算机程序Amplify1.2(威斯康辛大学)分析上面所设计的110个探针对76种不同类型的HPV的有效结合能力。设计对韩国人共用的和子宫颈癌密切相关的针对HPV-16、HPV-58、HPV-31和HPV-33的探针。接着，选择能够特异性地结合HPV-18、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-82、HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70、HPV-73、HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55HPV-61、HPV-62、HPV-72、HPV-81、HPV-90、HPV-10、HPV-27、HPV-30、HPV-32、HPV-57、HPV-83、HPV-84和HPV91的探针。表5中总结了线性寡核苷酸探针的名称、SEQ ID NO.和类型。

表5.线性寡核苷酸探针

(在碱基序列中，D是G、A或T，K是G或T，以及Y是C或T。)

实施例6：d形探针的设计

设计具有茎结构的d形寡核苷酸探针。本公开的d形探针包括：以5'->3'方向且从左上到右上的(1)左茎部、(2)接头部、(3)右茎部和(4)右探针部(见图22)。表6中示出了针对HPV L1基因和人β-肌动蛋白基因的d-形探针的碱基序列。

(1)茎部

对于要在结构上稳定的本公开的d形探针，应当准确地设计支持探针的茎部。所述茎部包含具有彼此结合的互补序列的寡核苷酸。为了稳固结合，所述茎部应当包含至少一半的C碱基和G碱基，而可以将T碱基或A碱基插入其间。所述茎部可以包含天然产生的端粒。在真核生物的染色体末端，存在由重复碱基序列组成的端粒。所述序列是对于包括人的哺乳动物而言是TTAGGG、TTTAGGG或T1-3(T/A)G3，而对于其他生物而言是TTGGGG或TTTTGGGG(Balagurumoothy P，Brahmachari SK,Mohnaty D,Bansal M andSasisekharan V. Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences.Nucleic AcidsResearch.1992;20(15):4061-4067;Balagurumoothy P and Brahmachari SK.Structure andstability of human telomeric sequence.Journal of Biochemistry.1994;269(34):21858-21869)。因此，在一个链上，本公开的d形探针的茎部可以包含至少一种选自下列的重复碱基。

例如)

1.TTGGG

2.TAGGG

3.TTGGGG

4.TTTGGG

5.TTAGGG

6.TTTGGGG

7.TTTAGGG

8.TTTTGGGG

9.TTTAGGGG

也就是说，5-9个寡核苷酸可以互补结合，并且寡核苷酸的数目可以进一步增加。根据成本和效率，含有核苷酸序列TTAGGG-AATCCC的人端粒可被用作重复单元。然而，长度可以进行各种变化。

(2)接头部

本公开中，插入n为3至60的氨基修饰的双脱氧胸腺嘧啶核苷(内部氨基改性剂CndT;iAmMCnT)。根据经济效率，可以使用具有6个碳的短的iAmMC6T。在iAmMC6dT的5’-末端，左茎部的修饰的C6胺接头与载玻片表面上涂敷的醛基结合。3’-末端的碱基A与右茎部的5’-末端的碱基T结合。可以将d形探针通过与iAmMC6dT的核糖结合而固定在芯片上。

(3)右探针部

右探针部被设计成与待检测靶基因互补。可以是任何碱基序列，但是应当准确地设计右探针部的寡核苷酸序列和长度。应当以不会形成二级结构的方式选择右探针部。右探针部的长度通常可为约15-75bp，但是根据情况，长度可以增加至约150bp或减少至比15bp短。如果样品是如本公开中的PCR产物，以及如果需要不仅仅检测HPV感染而且还要分析其准确类型和亚型，则探针长度可为约20bp，并且设计探针使得在中心部分的至少三个核苷酸的区别是可辨别的。

表6.d形寡核苷酸探针的碱基序列

(在序列中，n指的是iAmMC6T。)

实施例7：DNA芯片的构建

相应于在实施例6中设计的探针设计载网，并且将与适当的缓冲液混合的探针点在显微镜用载玻片上。然后，使该载玻片经适当处理而稳定并且在质量控制后贮存直到测试。详细情况如下：

1.制备将要设置在DNA芯片上的载网

如图1中所示，制备载网从而快速、容易地确定在芯片上检测的HPV是否是高危型、中危型或低危型。从图1中可以看出，针对高危型HPV的14种探针被点在左侧两列，并且针对中危型HPV L1的探针被点在第二列的底部。针对低危型HPV的14种探针被点在第三列系，并且针对其他类型的8种探针和通用L1探针被点在最右列。对于HPV-68，点上HPV-68a探针和68b探针的1:1混合物。此外，特异性针对人β-肌动蛋白基因的共计12种寡核苷酸探针被点在11x11载网上介于各L1探针之间以担当角标记，并且确认用于质量控制(QC)的DNA分离和PCR扩增的适合性。

除人β-肌动蛋白基因之外，也可以使用球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为标准标记探针。

使用阵列仪(arrayer)点上各种寡核苷酸探针。为了至少两次检测各种基因型的HPV，重复点上相同探针。

2.制备用于将寡核苷酸探针点在芯片上的溶液并转移到样板(master plate)

利用高效液相色谱(HPLC)纯化实施例6中通过连接5'-C6胺合成的探针，并且将其溶于已灭菌的三蒸馏水中至终浓度为200pM。将由此制备的探针与4.3倍体积的点样液（microspotting solution）混合至终浓度为38pM。将所得到的混合物继续地转移到384孔样板中。

3.探针的点样和固定

Q arrayer2(Genetixs,UK)或可与其媲美的阵列仪被用于将包含来自样板的探针的点样溶液转移到涂有醛的载玻片，并且重复点上(击两下)各探针。载玻片可以是LuminanoAldehyde LSAL-A、硅片或可与其媲美的产品。各斑点的大小可为10-200μm。使通过将探针点到载玻片上构建的DNA芯片在维持80%湿度的玻璃缸中于室温下反应15分钟，然后，按照已知方法进行后处理(Zammatteo,N.,L.Jeanmart,S.Hamels,S.Courtois,P.Louette,L.Hevesi,and J.Remacle.2000.Comparison between different strategies of covalentattachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays.Anal.Biochem.280:143-150.)。

4.微阵列的清洗与贮存

A.试剂的制备

1)10%十二烷基硫酸钠(SDS;100mL)：称重10g SDS(Sigma,L4509-1KG)试剂置入500-mL烧杯中。在加入蒸馏水(超纯水)使最终体积为100mL并且溶解之后，在室温下于密封容器中放置溶液。

2)0.1%SDS(4L)：将10mL10%SDS加入到四个分别的1-L容器中。在加入蒸馏水(超纯水)使最终体积为1L并且混合之后，在室温下于密封容器中放置该溶液。

3)1M乙醇胺溶液(300mL)：将18.3mL的16.6M乙醇胺溶液(Sigma,E0135)加入到500-mL容器中。在加入蒸馏水(超纯水)使最终体积为300mL并且混合之后，在室温下于密封容器中放置溶液。因为该溶液对光敏感，所以需要阻断光。

4)封闭溶液(425mL)：使用前立即制备封闭溶液。将1x PBS(300mL)与100%乙醇(100mL)和1M乙醇胺(25mL)混合。

5)1x磷酸盐缓冲液：加入0.9L蒸馏水(超纯水)溶解5片PBS缓冲系片剂(Sigma,P4417)。在用10N HCl将pH调至7.4之后，将最终体积调至1L。

6)25%乙醇溶液：将250mL的100%乙醇(Merck,1.00983.2511)加入到1-L容器。在加入蒸馏水(超纯水)使最终体积为1L之后，在室温下于密封容器中放置溶液。

B.微阵列的清洗

1)准备反应器、清洗容器和试剂(0.1%SDS，1M乙醇胺，1x磷酸盐缓冲液，100%乙醇和25%乙醇)。

2)将300mL的0.1%SDS溶液加入到清洗容器中，并且使用往复震动器在150rpm下清洗载玻片2分钟。该步骤重复进行两次。

3)使用往复震动器在150rpm下将载玻片用三蒸馏水清洗2分钟。该步骤重复进行两次。

4)将用电预热的蒸馏水加入到蒸馏水专用的清洗容器中并且将芯片放在水中3分钟。

5)将芯片在室温下放在三蒸馏水中1分钟。

6)使用前立即制备封闭溶液。

7)将芯片放在封闭溶液中30分钟。

8)将300mL的25%乙醇溶液加入到清洗容器中，并且使用往复震动器在150rpm下将载玻片清洗2分钟。该步骤只进行一次。

9)使用往复震动器在150rpm下将载玻片用三蒸馏水清洗2分钟。该步骤重复进行两次。

10)完成清洗后，从最后的清洗溶液(水)中缓慢取出芯片。

11)通过在1,000rpm下离心3分钟(MF-600,Hanil Science)移除水。

12)将载玻片置于载玻片盒中并于干燥器中贮存直到使用。

如实施例8所述，使用上述构建的本公开的DNA芯片进行杂交。

实施例8：DNA芯片上的杂交和分析条件的确立

将从实施例5中各个类型HPV的一个、两个或三个克隆的各种组合得到的100个人造标准样品用作用于HPV L1基因和β-肌动蛋白基因的PCR扩增的模板。将PCR产物放在实施例6-7中制备的芯片上并进行杂交至少3次。然后，通过使用荧光扫描仪进行分析来确立最佳条件。具体情况如下：

1.双重PCR

按照实施例3，进行HPV L1基因和人β-肌动蛋白基因的PCR。在引物组合(即，GP6-1、GP6+和ACTBR)中，对于反向引物，使用Cy-5-标记的寡核苷酸。

所述标记可以替换为Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa660、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、TexasRed、Orange Green488X、Orange Green514X、HEX、TET、JOE、Oyster556、Oyster645、BODIPY630/650、BODIPY650/665、Calfluor Orange546、Calfluor Red610、Quasar670、生物素或AuNP(直径为5nm、10nm、20nm或50nm的金纳米颗粒)。此外，可以使用银核壳或银增强。特别是，当使用AuNP或银核壳作为标记时，在3'-末端具有巯基而因此能够与PCR模板互补结合的靶探针在杂交时被连接到金纳米颗粒上，并且进行银增强，或者在与金纳米颗粒连接的靶探针上形成银壳。反应后，使用PD扫描仪(一种使用PMT作为检测器的非通常的荧光扫描仪)测量芯片的反射率，或者拍摄SEM图像来检测。

2.杂交反应

在将PCR扩增的HPV PCR产物放到固定有各种HPV寡核苷酸探针的载玻片基板上之后，进行杂交反应。使用100-μL8-孔灌注室(Schleicher&Schuell BioScience,德国)作为杂交室。详细情况如下：

1)根据样品数量，准备新的1.5-mL或200-μL管。

2)将50μL纯水加入到各管中。

3)加入15μL的L1基因和ACTB基因的双重PCR产物并充分混合。

4)使管静置在加热块上保持在95°C3分钟。

5)然后使管静置在冰上5分钟。

6)使反应管离心30秒。

7)将65μL的HYB I溶液(2mL20x SSC,6.3mL5x磷酸盐缓冲液,和1.7mL90%甘油,最终体积:10mL)加入到管中，并用吸量管充分混合。

8)将所制备的反应溶液缓慢注入被附加到芯片表面的盖玻片上的注射口。检查在芯片和孔盖之间是否观察到泡沫。如有，则用戴手套的手扫除而除去泡沫。

9)使芯片在反应浴中于48°C杂交30分钟。

3.清洗

1)杂交完成后，从芯片上移除孔盖。

2)将事先制备好的清洗溶液1加入到清洗容器中使得芯片被浸透，并且使用往复震动器在8振动速度下于室温下清洗芯片2分钟。如果芯片数量是一，则可以将芯片在装有40mL清洗溶液的50-mL圆锥管中通过在每分钟往复50次的速度下上下摇动管而清洗。在没有使用往复震动器的情况下用手进行清洗时，将清洗溶液加入到清洗容器中使得芯片被浸透，并且以每分钟往复50次的速度下左右摇动清洗容器2分钟。

3)弃去所用的清洗溶液并且加入新鲜的清洗溶液1。再次进行清洗2分钟。

4)弃去所用的清洗溶液并且加入新鲜的清洗溶液1。再次进行清洗2分钟。

5)弃去所用的清洗溶液并且加入新鲜的清洗溶液2。再次进行清洗2分钟。

6)清洗后，使用旋转式脱水机或空气压缩机除去在芯片上残留的缓冲液。

4.扫描

在杂交、接着通过清洗除去非特异的信号之后，使用扫描仪扫描干燥的载玻片以分析芯片图像。对于扫描仪，可以使用Genepix4000B、Easy Scan-1、Affymetrix428ArrayScanner(Affymetrix,USA)、ScanArray Lite(Packard Bioscience,USA)或可与其媲美的仪器。

实施例9：在DNA芯片上分析子宫颈临床样品

对于在实施例3-4中通过PCR后序列测定已经确认HPV存在或不存在及HPV类型的子宫颈临床样品的DNA，再次按照实施例3所述进行双重PCR。将PCR产物放在实施例6-7中构建的DNA芯片上并且按照实施例8进行杂交。清洗后，使用荧光扫描仪进行分析。分析DNA芯片的灵敏性、特异性和再现性，并且再次评估本公开的DNA芯片用于HPV基因分型的的最佳条件。结果示于图5-13中。

图5-13显示使用被点在本公开的DNA芯片上的45种寡核苷酸探针对被各种类型的HPV感染的样品进行杂交反应的结果。从图中可以看出，对于各个探针，发生类型特异性的杂交，而没有交叉杂交。

也就是说，特异性针对DNA芯片的HPV类型的45种探针特异性结合各自类型的HPV的DNA，在探针之间没有发生交叉杂交。另外，能够准确地诊断被超过一种类型的HPV同时感染的样品。也就是说，本公开的DNA芯片在被HPV单一和混合感染的诊断中表现出100%灵敏性和100%特异性。此外，由于有时间间隔的不同试验者进行三次或更多次诊断时得到相同结果，因此表现出100%再现性。根据本公开合成的45种探针能够准确地分析大量的HPV类型的组合，这是使用现有DNA微阵列无法处理的。

特别是，图14是显示从其子宫颈中经组织学鉴定为具有高级别的鳞状上皮内损伤的韩国女性的子宫颈拭子样品中提取DNA、按照本公开进行双重PCR以及在本公开的HPVDNA芯片上进行HPV L1扩增产物和β-肌动蛋白扩增产物的杂交的结果的扫描图像。

根据本公开构建的DNA芯片能够准确地诊断子宫颈拭子样品中的HPV的类型。用于各个HPV类型的探针特异性地结合于特定类型HPV的DNA，并且探针之间没有发生交叉杂交。另外，即使是被超过一种类型的HPV同时感染的样品（其难以通过直接序列测定来诊断并且可以通过克隆后多种测序测定法来诊断）也能使用本公开的DNA芯片准确地诊断。也就是说，本公开的DNA芯片在诊断被HPV单一和混合感染中表现出100%灵敏性和100%特异性。此外，由于有时间间隔的不同试验者进行三次或更多次诊断时得到相同结果，因此表现出100%再现性。

实施例10：使用DNA芯片诊断子宫颈临床样品与临床数据的相关性

将实施例9中PCR之后使用DNA芯片的分析结果与由子宫颈组织测试、巴氏涂片等得到的临床数据进行比较，从而分析他们的相关性并且调查本公开的DNA芯片是否对预测子宫颈癌或癌前期病变有用。已证实，本公开的DNA芯片不仅可用于HPV基因分型，而且还可用于子宫颈癌筛查。

在15,708个韩国女性子宫颈细胞样品中，7,371个样品被鉴定有HPV感染。现患率是463.93%。45种类型的HPV被识别。在所检测的HPV类型中，HPV-16是最常见的，接下来是HPV-53、HPV-39、HPV-56、HPV-58、HPV-52、HPV-70、HPV-84、HPV-18、HPV-68以及HPV-35。这一结果不同于欧洲的结果，其中，HPV-16是最常见的，接下来是HPV-18、HPV-45、HPV-52、HPV-31、HPV-33以及HPV-58(Murinoz N et al.,N Engl J Med,2003,348:518-27)。

HPV-53在韩国人中显示出高现患率，而在欧洲人中没有。因此，可以看出，在韩国人中HPV-53是子宫颈癌的主要成因。

实施例11：使用本公开的DNA芯片诊断子宫颈样品

本公开的HPV DNA芯片用于诊断子宫颈样品。试验目的，首先，是为了调查HPVDNA芯片能够怎样准确地诊断HPV感染和HPV基因型，其次，是为了评估其在预测癌症和包括癌前期病变的重要的子宫颈损伤中的帮助有多大。为此，从被怀疑患有子宫颈HPV感染和损伤的韩国女性子宫颈拭子样品中分离DNA，并且进行(1)使用本公开的HPVDNA微阵列的试验，(2)HPV L1基因的PCR接着自动序列测定分析，以及(3)利用HybridCapture Assay-II(HCA-II;Digene公司)的试验，其是一种USFDA批准的HPV DNA测试。

本公开的HPV DNA芯片能够检测侵入人子宫颈、肛门、口腔等的全部43种HPV类型，而HCA-II测试了12种高危型HPV。在集中(1)HPV感染诊断的灵敏性和特异性、(2)HPV基因型诊断的准确性以及(3)子宫颈癌和包括癌前期病变的严重损伤的预测的准确性的情况下，进行比较。如实施例2和8所述，进行HPVDNA微阵列测试，并且按照已知方法进行PCR和碱基序列测定(Kim KH,Yoon MS,Na YJ,Park CS,Oh MR,Moon WC.Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip.Gynecol Oncol.2006;100(1):38-43)。按照制造商的说明书进行HCA-II测试。

201个测试对象年龄在18岁至81岁之间，并且平均年龄为52.4岁。进行HPV L1基因的PCR的结果总结于表7中。201个对象中有191个被鉴定为HPV感染。149例是高危HPV，72例是由超过一种HPV类型的混合感染的。

将使用本公开的HPV DNA芯片的分析结果与HCA-II的分析结果进行比较(表7-10)。本公开的HPV DNA芯片准确地诊断全部(100%)191例阳性HPV感染。其中，174例(91.1%)被准确地确定基因型。尽管准确地识别了149例高危型，但是使用本公开的芯片不能识别HPV的罕见类型。同时，HCA-II未能检测到191例HPV-阳性样品中的40例HPV，而且未能检测到149例高危HPV感染样品中的12例(8.1%)。本公开的HPV DNA芯片能够准确地预测包括子宫颈癌、子宫颈上皮瘤、子宫颈上皮瘤(CIN)和高等级鳞状上皮内损伤(HSIL)的全部高危型子宫颈损伤。相反，HCA-II测试没有检测到八例子宫颈癌中的一例以及十二例HSIL中的一例。另外，与HCA-II相比，本公开的HPV芯片显示出更好的检测低等级SIL的能力(92.2%对56.9%,p<0.05)。

这些结果显示，本公开的HPV DNA芯片在HPV感染和HPV基因分型诊断(特别是高危HPV)中表现出接近于100%灵敏性，并且在预测子宫颈癌和癌前期病变中是优异的。此外，其胜过现有HCA-II测试。

表7.使用本公开的DNA芯片进行HPV基因分型的结果

结果	例数(%)
		全部	201
HPV阳性	191
		单一感染	119
混合感染	72
		高危HPV	149(74.9)
低危HPV	48
		未确定危险	31
罕见类型	17

表8.本公开的HPV DNA芯片与杂交捕获测定法(HCA)-II的比较

*在HPV DNA芯片中没有包括的17种类型。

表9.使用HCA-II未能检测的案例的分析

表10.本公开的HPV DNA芯片与HCA-II在子宫颈癌和癌前期病变诊断中的比较

实施例12：使用HPV DNA芯片分析肛门和头颈样品

HPV不仅能够引起外生殖器中的癌症，而且还能引起其他的器官和组织中的癌症。实际上，许多口腔癌、咽癌、喉癌和肛门癌均由HPV引起。因此，本公开的HPV DNA芯片用于分析癌和癌前期病变中的HPV感染。为了实验，使用本公开的芯片测试取自韩国人的24个扁桃腺组织样品和179个直肠及肛门组织样品。

在24个扁桃腺组织样品中，13个是HPV-阳性，而19个是HPV-阴性。在13个HPV-阳性样品中，5个是单一感染，而8个是混合感染。全部13个HPV-阳性样品被高危型HPV(HPV-16:26%,HPV-56:13%,HPV-33:13%,HPV-52:8%)感染。

从首尔国立大学医院和Asan医疗中心(Seoul National University Hospital and AsanMedical Center)获得179个直肠及肛门组织样品(19个来自女性，160个来自男性，年龄在27岁至83岁之间，平均年龄：40岁)。使用本公开DNA芯片进行测试显示，63个样品是HPV-阳性，其中，10个来自女性，53个来自男性。在63个HPV-阳性样品中，44个是单一感染，19个是混合感染。在63个HPV-阳性样品中，49个被高危型HPV感染(单一和混合感染)，14个被低危型HPV感染(HPV-16:21%,HPV-18:21%,HPV-68:8%)。

因此，已证实，本公开的DNA芯片不仅可用于诊断引起子宫颈癌的HPV感染，而且还可用于诊断引起肛门癌或喉癌的HPV感染。

实施例13：使用金纳米颗粒标记DNA芯片

为了进行实施例8中的杂交，在PCR之后，使用金纳米颗粒(AuNP;直径为20nm,BBI)标记DNA芯片，或者施用银壳增强DNA芯片。也就是说，在3'-末端具有巯基而因此能够与PCR模板互补结合的靶探针在杂交时被连接到金纳米颗粒上，并且进行银增强，或者在与金纳米颗粒连接的靶探针上形成银壳。反应后，使用PD扫描仪(一种使用PMT作为检测器的非通常的荧光扫描仪)测量芯片的反射率，或者拍摄SEM图像来进行检测。详细情况如下：

1.靶探针的设计

标记金纳米颗粒的靶探针如下。如果被点在芯片上的探针以正向方向，则PCR模板通常以反向方向结合。因此，设计能够互补地结合与芯片上的探针结合的PCR模板。也就是说，因为结合ACTB探针的PCR模板的末端通常是反向引物，所以合成靶探针使其具有与该反向引物互补的序列。由于靶探针的末端应当结合有AuNP(直径为20nm)，因此在互补碱基序列之后插入内部C18接头和10个腺嘌呤残基，然后加入3'-末端巯基。由此设计的靶探针示于表11中。LTP是用于HPV L1基因的PCR产物的靶探针，而ATP是用于ACTB基因的PCR产物的靶探针。

表11.靶探针序列

2.将金纳米颗粒连接到PCR产物上

使用AuNP或者采用以下两种方法中的任一种标记通过杂交与被点在芯片上的寡核苷酸探针结合的PCR产物(图15)。一种方法是银增强(银染色)，而另一种方法是使用AuNP标记靶探针、使用AuNP作为种子在其上形成银壳而后将银壳靶探针连到用探针杂交的PCR产物上。详细情况如下。

I.裂解巯基修饰的寡核苷酸的二硫基

为了使金纳米颗粒与靶探针结合，应当活化靶探针的巯基。

1)将表11中所述的寡核苷酸探针快速自旋并通过充分混合1,517μL蒸馏水而溶解。

2)将15.4mg的0.1M DTT溶于1mL二硫化物裂解缓冲液(pH8.0;170nM磷酸盐缓冲液,11.468g Na₂HPO₄,0.509g NaH₂PO₄,500mL纳米级纯水(nanopure water))中。

3)将100μL的0.1M DTT溶液加入到1.5-mL管中，与100μL的溶解的寡核苷酸探针(10nM)充分混合，并且在室温下反应2小时。

4)通过固定到架子上制备NAP-5柱(Sephadex G-25DNA grade,GE Healthcare,Cat.No.17-0853-02)。

5)弃去缓冲液并且通过使用塑料挤瓶填充DW来清洗所述柱。为了充分清洗，该步骤重复进行3次。然后，给所述柱盖上盖子备用。

6)在NAP-5柱中加样200μL的经反应的寡核苷酸探针。注意不要在柱中形成气泡。在溶液离开柱(需要大约1分钟25秒)之后，加入450μL蒸馏水。在溶液再次离开柱(需要大约1分钟28秒)之后，在7个1.5-mL管的每个中各收集四滴，同时加入950μL DW。

II.寡核苷酸探针浓度的确定

1)使用分光光度计在260nm下测量70μL的在管1、2和5中收集的溶液的吸光率。

2)在管2中混合管1-5的溶液并且再次测量吸光率。

3)按照公式C=A/ε计算摩尔浓度。

4)根据AuNP的尺寸(例如，20nm或50nm)由上述公式计算寡核苷酸探针浓度和AuNP浓度。

III.使用AuNP标记靶探针

1)基于计算结果，将2mL的AuNP(20nm)加入到15-mL圆锥管中。在与543μL寡核苷酸探针充分混合后，在设定为25°C的振荡培养箱中进行反应20分钟。

2)在加入254.356μL的100mM PBS(Na₂HPO₄0.562g+NaH₂PO₄0.125g+H₂O50mL)之后，孵育该混合物20分钟。

3)在加入2.797μL的10%SDS之后，孵育该混合物20分钟。

4)在加入140.035μL的2MNaCl之后，孵育该混合物20分钟。该步骤重复进行一次以上。

5)在加入70.0179μL的2M NaCl之后，孵育该混合物20分钟。该步骤重复进行一次以上，而后将该混合物孵育过夜。

6)将溶液分装到两个1.5-mL管中(每管1.5mL)并在10,000rpm下离心20分钟。通过加入1mL的0.01%SDS溶液在0.3M PBS(10mM PB,40mL+2M NaCl,6mL)中)重悬浮所产生的沉淀。在于10,000rpm下离心20分钟后，通过加入1mL的0.3M PBS(NaCl,8.766g+Na₂HPO₄,0.562g,NaH₂PO₄,0.25g+DW，500mL)两次(共计2mL)重悬浮所产生的沉淀。

3.使用用金纳米颗粒作为种子的银壳(核壳)进行标记

基于在步骤2中测量的靶探针-AuNP的吸光率确定银壳厚度。然后，按照表12的数据确定银(Ag)的总量及其他试剂的量。

表12.7mL银壳所需要的试剂的量

LTP-AuNP	ABS=0.9017	X70	HTP-AuNP	ABS=0.90309	X70
						DNA-AuNP	100μl	7ml	DNA-AuNP	100μl	7ml
1%PVP	50μl	3.5ml	1%PVP	50μl	3.5ml
						L-SA(10-1M)	20μl	1.4ml	L-SA(10-1M)	20μl	1.4ml
AgNO3(10-3M)	55.7μl	3.9ml	AgNO3(10-3M)	55.8μl	3.9ml
						靶厚度	5nm	5nm	靶厚度	5nm	5nm

1)在依次加入所需用量的DNA-AuNP、1%PVP、10^-1M L-SA和10^-3M AgNO₃并充分混合之后，将混合物在于150rpm下振荡的同时孵育过夜。

2)将溶液分装到1.5-mL管中并在8,000rpm下离心20分钟。

3)移除上清液并加入1mL的0.3M PBS。充分混合后，再次在10,000rpm下进行离心20分钟。

4)移除上清液后，根据AuNP的最初体积加入0.3M PBS。如果不使沉淀重悬浮，则将混合物放在60°C水浴中，而后重悬浮。

5)测量重悬浮的DNA-AuNP核壳的吸光率(λ=260nm)。

4.杂交和清洗

1)将在低温下贮存的AuNP标记的靶探针悬浮在60°C水浴中。将100μL的靶探针加到芯片上，并在室温下反应4小时。

2)用0.3M PBS清洗芯片两次，而后干燥。

使用本公开的探针的实验结果显示于图16-21中。图16-17显示HPV-6-AuNP-Ag增强的芯片和HPV-6-AuNP核壳处理的芯片的扫描图像。左侧图像显示全部8个孔的扫描结果，以及右侧图像显示被点在每个孔中的斑点。与图16的银染色图像不同，图17中清楚地看见斑点。

图18-19显示利用扫描电子显微镜(SEM)分析HPV-6-AuNP-Ag增强的芯片和HPV-6-AuNP核壳处理的芯片的斑点和背景的结果。可以看出，与两种芯片中的背景相比，金纳米颗粒以高密度存在于HPV-6探针斑点中。

图20显示HPV-6-AuNP-Ag增强斑点和HPV-6-AuNP-Ag核壳-标记斑点的SEM图像。可以看出，与Ag染色相比，Ag核壳标记赋予稳定得多的结果。而且还可以看出，在Ag染色的情况下，染色是非特异的。

图21显示使用装备有PD的扫描仪在不同的模板浓度下扫描其中用AuNP(HPV-6-AuNP)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片、其中用AuNP标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)而后用银(HPV-6-AuAg染色)增强的芯片以及先用Au然后用Ag核壳(HPV-6-AuAg核壳)标记针对HPV-6的PCR模板和靶探针(LTP)的芯片以及使用SBR比较每个斑点的反射率的结果。可以看出，当模板浓度为1pmol时，SBR值最高。特别是，当使用银核壳进行第二种标记时，反射率最佳，具有HPV-6-AuNP<HPV-6-AuAg染色<HPV-60AuAg核壳。因此，可以看出，纳米颗粒标记可以适用于本公开的芯片。

正如上述实施例所述，本公开的HPVDNA芯片可以用于检测侵入人外生殖器、肛门和头颈的43种HPV的存在以及用于其基因分型。此外，与现有产品相比，其更加有效地用于诊断子宫颈癌和癌前期病变。

Claims

1.一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含：

分别与各个类型HPV中的每一种所特有的L1基因区域互补结合的SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 97的碱基序列的线形寡核苷酸探针；

分别与存在于全部类型的HPV中的L1基因区域互补结合的SEQ ID NO 98-SEQ IDNO 105的碱基序列的线形寡核苷酸探针作为通用探针；

分别与作为阳性对照的β-肌动蛋白基因互补结合的SEQ ID NO 106-SEQ ID NO 109的碱基序列的线形寡核苷酸探针；

其中，所述DNA芯片用于同时检测44种HPV的基因型，所述44种HPV包括：作为高危型HPV的HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68a、HPV-68b和HPV-82；作为中危型HPV的HPV-26、HPV-53、HPV-66、HPV-67、HPV-69、HPV-70和HPV-73；作为低危型HPV的HPV-6、HPV-11、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-62、HPV-72和HPV-81；以及作为其他HPV的HPV-90、HPV-10、HPV-27、HPV-30、HPV-32、HPV-57、HPV-83、HPV-84和HPV-91。

2.一种用于检测来自样品中的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的DNA芯片，包含：

分别与各个类型HPV中的每一种所特有的L1基因区域互补结合的SEQ ID NO 110-SEQ ID NO 201的碱基序列的d形寡核苷酸探针；

分别与存在于全部类型的HPV中的L1基因区域互补结合的SEQ ID NO 202-SEQ IDNO 209的碱基序列的d形寡核苷酸探针作为通用探针；

分别与作为阳性对照的β-肌动蛋白基因互补结合的SEQ ID NO SEQ ID NO 210-SEQ ID NO 213的碱基序列的d形寡核苷酸探针；

3.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述DNA芯片具有8-24个分隔孔，所述探针能够被点在所述分隔孔上。

4.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述寡核苷酸探针的浓度为至少38pmol。

5.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，将C6胺修饰的双脱氧胸腺嘧啶核苷连接到所述寡核苷酸探针上作为接头从而将所述寡核苷酸探针点在SuperAldehyde涂敷载体上。

6.根据权利要求5所述的DNA芯片，其中，所述载体选自载玻片、纸、硝酸纤维素膜、微量培养板孔、塑料、硅、DVD和小珠。

7.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述样品选自子宫颈拭子、阴道拭子、子宫颈组织、阴茎组织、尿、肛门组织、直肠组织、咽组织、口腔组织和头颈组织。

8.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述样品选自阴茎癌细胞、尿道癌细胞、肛门癌细胞、头颈癌细胞及它们的癌前细胞。

9.根据权利要求1或2所述的DNA芯片，其中，所述DNA芯片用于确定是否将施用HPV疫苗。

10.一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)基因型的试剂盒，包括：根据权利要求1或2所述的DNA芯片，用于通过PCR扩增靶基因的引物，和用于检测所述经扩增DNA的标记物。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述引物是由选自SEQ ID NO 1-SEQ IDNO 2的碱基序列组成的用于扩增人β-肌动蛋白基因的引物或者由选自SEQ ID NO 3-SEQ ID NO 5的碱基序列组成的用于扩增HPV L1基因的引物。

12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述标记物是选自Cy3、Cy5、Cy5.5、BODIPY、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 660、若丹明、TAMRA、FAM、FITC、Fluor X、ROX、Texas Red、Orange Green 488X、Orange Green 514X、HEX、TET、JOE、Oyster 556、Oyster 645、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、CalfluorOrange 546、Calfluor Red 610、Quasar 670、生物素、Au、Ag和聚苯乙烯的一种或多种。