CN109917132A - 针对hpv 16和hpv 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法。所述针对HPV 16基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。针对HPV 18基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所述双重侧向流层析试纸条包括支撑板，所述支撑板的上端面包括依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗的检测线T1、T2和质控线C。本发明公开的检测方法特异性好，灵敏度高，特异性好，重复性好，操作简单，适用性强。

Description

针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸 条及检测方法

技术领域

本发明涉及一种HPV 16和HPV 18基因型的检测方法，尤其涉及针对HPV 16和HPV18基因型的引物对，一种基于乳胶微球标记原理的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条及相应的检测方法，属于生物医学领域。

背景技术

癌症的早期诊断和预防一直是临床检测领域亟待解决的问题。作为世界女性群体中发生率和致死率排名第四的癌症，宫颈癌的检测和预防一直受到全世界人们的关注。据估计，在2018年，全世界宫颈癌的新增病例为570000，死亡病例为311000。现有研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)感染实际上是导致宫颈癌的主要原因，超过99％的宫颈癌与高危HPV基因型有关。已有证据表明，以HPV为基础的筛查方法比巴氏涂片能更有效地预防宫颈癌，基于HPV基因型鉴定的方法有望成为宫颈癌早期诊断和预防的首要方法。研究表明，高危HPV基因型有12种，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59型。在检出的宫颈癌病例中，以HPV 16的检出率为最高，其次是HPV 18。综合考虑，开发一种快速、可靠、方便且同时筛查和检测高危HPV 16和HPV 18基因型的方法具有重要意义。

迄今为止，已开发的用于检测HPV基因型的方法有很多，但只有很少的一部分可用于临床诊断。其中，基于免疫学和形态学的检测方法灵敏度不足，且不能区分特定HPV基因型的种类，因此不能满足临床检测和预防的需求；二代杂交捕获技术可以灵敏地检测出13种HPV基因型，但容易产生交叉反应，从而导致假阳性或者检测结果不准确的结果。聚合酶链式反应(PCR)技术得益于其简单的操作和指数的扩增能力，已成为HPV基因型筛查和检测的主要手段。然而依赖于电泳、扩增产物水解后杂交或特殊仪器检测的表征手段极大地限制了PCR技术的广泛应用。其他技术，如微阵列技术和实时聚合酶链反应(real-time PCR)，也需要专门和昂贵的设备，而这些设备可能在资源有限的实验室无法获得，同时需要专业的操作人员进行相关检测工作。因此，发明一种简单、方便、灵敏的HPV高危基因型筛查和检测手段，对于基层和硬件匮乏地区的宫颈癌筛查工作的有效开展具有重要意义。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一主要目的在于提供一种同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条。

本发明的另一目的还在于提供一种同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种针对HPV 16基因型的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。

本发明实施例还提供了一种针对HPV 18基因型的引物对，其包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。

本发明实施例还提供了一种同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。

本发明实施例还提供了前述的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其包括：

将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；

将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，

将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。

本发明实施例还提供了前述的针对HPV 16基因型的引物对、针对HPV 18基因型的引物对或同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条于制备检测HPV 16和HPV 18基因型的产品中的用途。

进一步地，应用所述产品检测HPV 16和HPV 18基因型的方法包括：

提取待检测HPV样品中的DNA；

采用前述的针对HPV 16基因型的引物对、针对HPV 18基因型的引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；

将所获双链DNA产物加入前述的双重侧向流层析试纸条进行检测，根据检测线的显色结果实现待检测HPV样品中HPV 16或HPV 18的定性或定量检测。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明利用两组分别针对HPV 16和HPV 18基因型的特异性功能化引物对，根据宫颈癌高危HPV 16或HPV 18基因型存在时，通过PCR扩增分别获得对应的两端功能化的双链DNA产物，利用不同双链DNA产物的桥接作用，把FITC抗体偶联的乳胶微球分别连接到对应的检测线上，从而实现通过乳胶微球颜色进行检测结果肉眼判断或读卡判断的目的。根据特定高危HPV的含量不同，连接到检测线上的FITC抗体偶联的乳胶微球的数量不同，进而使检测线颜色的深浅不同，建立起检测线颜色的深浅强度与特定HPV含量之间的关系，进而实现一次扩增、加样同时对宫颈癌临床样品中高危HPV 16和HPV 18基因型进行灵敏筛查和检测的目的；

2)本发明的检测方法特异性好，灵敏度高(10²-10³拷贝数)，特异性好，重复性好，操作简单，适用性强，能同时检测到700个拷贝的HPV 16DNA和HPV 18DNA；

3)本发明的检测方法不需要特殊贵重仪器，仅需要常规PCR扩增仪及对应的双重侧向流层析试纸条，即可实现同时对宫颈癌高危HPV 16和HPV 18的快速、准确、同时筛查，适用于基层及检测硬件资源匮乏地区开展相关的宫颈癌普查工作。

附图说明

图1是本发明实施例1中采用侧向层析方法同时筛查和检测宫颈癌高危HPV 16和HPV 18基因型的灵敏度示意图。

具体实施方式

鉴于现有宫颈癌HPV基因型筛查和检测方法应用所存在的不足和缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，建立了一种基于乳胶微球标记原理的同时检测宫颈癌高危HPV 16和HPV 18基因型的灵敏度高、特异性好且操作简便的双重侧向流层析试纸条及检测新方法，实现更加简单、灵敏、准确地筛查和检测宫颈癌高危HPV16和HPV 18基因型。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明实施例的一个方面提供了一种针对HPV 16基因型的引物对，其包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。

进一步地，所述针对HPV 16基因型特异性的引物，能够实现对目标HPV16基因的特异性、有效扩增。

进一步地，所述第一引物为FITC功能化的上游引物，其具体序列表示为：5’-FITC-GACTTTGCaTTaTTCGGGATT-3’。

进一步地，所述第二引物为生物素功能化的下游引物，其具体序列表示为：5’-BIO-CTTTGCTTaTTcTTCAGGAC-3’。

本发明实施例的另一个方面提供了一种针对HPV 18基因型的引物对，其包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。

进一步地，所述针对HPV 18基因型特异性的引物，能够实现对目标HPV18基因的特异性、有效扩增。

进一步地，所述第三引物为FITC功能化的上游引物，其具体序列表示为：5’-FITC-TGTCACGAaGCAAcTTAAGC-3’。

进一步地，所述第四引物为地高辛功能化的下游引物，其具体序列表示为：5’-DIG-CTGGCTTCAaCACTaTACAACA-3’。

本发明提供的所述的FITC功能化上游引物，生物素功能化或地高辛功能化的下游引物，为特异性设计针对HPV16和HPV18的引物对，便于产生两端功能化扩增产物。

本发明基于上述上游引物、下游引物对的组合，实现对目标HPV基因型有效扩增的同时，实现了扩增产物的两端同时标记，是基于扩增产物的侧向流层析同时筛查和检测HPV16和18的关键设计。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。

在一些实施例中，所述FITC抗体选自FITC的单克隆抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL。

在一些实施例中，所述乳胶微球为红色或蓝色，粒径为50～200nm。

进一步地，所述链霉亲和素的浓度为0.5～1.0mg/mL。

在一些实施例中，所述地高辛抗体选自地高辛的单克隆抗体，浓度为0.6～1.2mg/mL。

在一些实施例中，所述二抗选自FITC抗体的羊抗鼠抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL。

进一步地，所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板或塑料板，但不仅限于此。

进一步地，所述上样区的材质包括对样品吸附力弱的玻璃纤维棉或聚酯膜，但不仅限于此。

进一步地，所述标记区为滴加和预固定了FITC抗体偶联的乳胶微球。

进一步地，所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜，但不仅限于此。

进一步地，所述划线区用合适浓度的链霉亲和素、地高辛抗体和二抗溶液分别制作检测线T1和T2和质控线C。

进一步地，所述吸水区为吸水性强的滤纸，但不仅限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其包括：

将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；

将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，

将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。

在一些优选实施例中，所述的制备方法具体包括：使包含乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合体系于室温避光活化30～40min，之后加入FITC抗体孵育，再加入BSA溶液，获得FITC抗体偶联的乳胶微球。

进一步地，所述乳胶微球表面所含羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1：1～1：15：15。

在一些更为具体的实施案例之中，所述的基于乳胶微球的同时检测HPV 16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)FITC抗体偶联的乳胶微球的制备：将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联制备FITC抗体偶联的红色乳胶微球；

2)标记区的制备：每个标记区滴加适量FITC抗体偶联的红色乳胶微球，25～40℃烘箱中烘干并保存备用；

3)划线区的印制：用喷膜仪分别将合适浓度的链霉亲和素、地高辛抗体和二抗印制到划线区的检测线T1和T2以及质控线C，25～40℃烘箱干燥后备用；

4)试纸条的组装：将上样区、标记区、划线区和吸水区依次组装在支撑板上，组成基于乳胶微球的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条。

更进一步地，所述步骤1)中FITC抗体偶联的乳胶微球的制备方法具体包括：

活化：往适量浓度的乳胶微球溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使乳胶微球表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1:10:10，室温避光活化30～40min；

偶联：离心(10000～12000g，4℃，15min)，去上清，加入PB(10mM，pH 7.0)缓冲液重悬，加入适量的FITC抗体，室温孵育2h；

封闭：加入质量体积比为10～20％的BSA溶液，室温孵育1h；

重悬：离心(10000～12000g，4℃，10-20min)，去上清，加入质量体积比为1～2％的BSA溶液重悬，4℃保存。

进一步地，所述乳胶微球为红色或蓝色，粒径为50～200nm。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的针对HPV 16基因型的引物对、针对HPV 18基因型的引物对或同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析试纸条于制备检测HPV16和HPV 18基因型的产品中的用途。

进一步地，应用所述产品检测HPV 16和HPV 18基因型的方法包括：

提取待检测HPV样品中的DNA；

采用前述的针对HPV 16基因型的引物对、针对HPV 18基因型的引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；

将所获双链DNA产物加入前述的双重侧向流层析试纸条进行检测，根据检测线的显色结果实现待检测HPV样品中HPV 16或HPV 18的定性或定量检测。

在一些实施例中，所述方法具体包括：利用磁珠法提取待检测HPV样品的DNA，使用分别针对HPV 16和HPV 18基因型特异性的功能化引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；把扩增产物直接滴加到试纸条的上样区，流经标记区和划线区，利用双功能化的双链DNA产物把乳胶微球分别连接在划线区对应的检测线上，通过肉眼直接观察检测线上乳胶微球的颜色，同时实现对HPV 16和HPV 18基因型的灵敏筛查和检测。

在一些实施例中，应用所述产品检测HPV 16和HPV 18基因型的方法具体包括：采用细胞裂解液和蛋白酶K溶液使待检测HPV样品裂解，再加入羧基修饰的磁珠和包被液，所获DNA经洗涤液洗涤，之后以重悬液重悬，获得检测HPV样品的DNA。

进一步地，所述磁珠法使用的磁珠为羧基修饰的磁性纳米粒子，具体方案为：取20-100μL HPV样品加入300-700μL细胞裂解液和10-30μL蛋白酶K溶液使样品完全裂解；加入5-30μg羧基修饰的磁珠和100-300μL包被液吸附、分离HPV DNA，经300-1000μL洗涤液洗涤后加入30-100μL重悬液重悬，取上清即为所提DNA。

进一步地，所述裂解液为含有Tris-HCl缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)和十二烷基硫酸钠(SDS)；其中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L；EDTA的浓度为1～20mmol/L，所述氯化钠(NaCl)的浓度为100～500mmol/L，所述十二烷基硫酸钠与裂解液的质量体积比为0.5～2g：100mL，亦即，SDS的质量体积比为0.5～2％。

进一步地，所述蛋白酶K溶液的终浓度为0.5～2mg/mL。

进一步地，所述包被液主要包含成分聚乙二醇(PEG)和氯化钠(NaCl)，其中，所述聚乙二醇的平均质均分子量为200～20000，例如可以是200、400、600、800、1000、2000、6000、10000或20000，所述聚乙二醇与包被液的质量体积比为5～30g：100mL，亦即，PEG的质量体积比为5～30％，所述包被液中氯化钠的浓度为0.5～3mol/L。

进一步地，所述洗涤液包括乙醇含量为50～80vt％的水溶液。

进一步地，所述重悬液的主要成分包括Tris-HCl缓冲液和乙二胺四乙酸(EDTA)，其中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L，所述乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度为1～20mmol/L。

综上所述，本发明检测方法的实施步骤为：(1)FITC抗体偶联的乳胶微球的制备；(2)划线区的包埋；(3)试纸条的制作；(4)HPV样品DNA的提取及PCR扩增；(5)样品检测。本发明使用了两对分别针对HPV 16和HPV 18基因型特异性功能化引物对，根据待测样品中目标HPV种类和含量不同时，扩增得到的双功能化的产物不同，试纸条上检测线(T1和T2)的颜色深浅也不相同，从而建立起检测线颜色的深浅与对应的HPV含量之间的关系，进而实现同时对宫颈癌临床样品中HPV 16和HPV 18基因型灵敏检测的目的，适用于基层医疗机构开展相关筛查工作。

以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例提供的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析检测方法包括以下步骤：

(1)FITC抗体偶联的乳胶微球的制备

活化：往适量浓度的乳胶微球溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使乳胶微球表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：10：10，室温避光活化30min；

偶联：离心(10000g，4℃，15min)，去上清，加入PB(10mM，pH值7.0)缓冲液重悬，加入适量的FITC抗体，室温孵育2h；

封闭：加入质量体积比为10％的BSA溶液，室温孵育1h；

重悬：离心(10000g，4℃，10min)，去上清，加入质量体积比为1％的BSA溶液重悬，4℃保存；

标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的乳胶微球，25℃烘箱中烘干并保存备用。

(2)划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、地高辛抗体和二抗溶液分别印制到检测线T1和T2以及质控线C，25℃烘箱中烘干并保存备用。

(3)试纸条的制作：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。

(4)待检测HPV样品DNA的提取及PCR扩增

DNA采用磁珠法提取，利用羧基修饰的磁性纳米粒子作为DNA提取的载体，具体实施方式为：在干净的离心管中加入20μL HPV样品，300μL细胞裂解液和10μL蛋白酶K溶液，60℃孵育15min；室温冷却，加入5μg羧基修饰的磁珠和100μL包被液，室温下旋转5min；磁性吸附，去上清，加入300μL洗涤液洗涤两次；磁性吸附，去上清，加入30μL重悬液重悬，磁性吸附，取上清即为所提DNA。

PCR反应体系(25μL)为：1×PCR缓冲液，2.0mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，Taq酶1U，10μM的HPV 16上下游引物各0.4μL，10μM的HPV 18上下游引物各0.2μL，DNA模板1μL，补水至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸3min。

其中，采用的HPV 16上游引物的具体序列为：5’-FITC-GACTTTGCaTTaTTCGGGATT-3’，下游引物的具体序列为：5’-BIO-CTTTGCTTaTTcTTCAGGAC-3’。采用的HPV 18上游引物的具体序列为：5’-FITC-TGTCACGAaGCAAcTTAAGC-3’，下游引物的具体序列为：5’-DIG-CTGGCTTCAaCACTaTACAACA-3’。

(5)样品检测

本实施例步骤(4)中的PCR产物经上样缓冲液稀释后直接滴加到试纸条的上样区，室温下反应5min，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T1和T2的强度进行分析。本实施例中采用侧向层析方法同时筛查和检测宫颈癌高危HPV 16和HPV 18基因型的灵敏度示意图请参阅图1所示。

实施例2

本实施例提供的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析检测方法包括以下步骤：

(1)FITC抗体偶联的乳胶微球的制备

活化：往适量浓度的乳胶微球溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使乳胶微球表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：1：1，室温避光活化35min；

偶联：离心(11000g，4℃，15min)，去上清，加入PB(10mM，pH值7.0)缓冲液重悬，加入适量的FITC抗体，室温孵育2h；

封闭：加入质量体积比为15％的BSA溶液，室温孵育1h；

重悬：离心(11000g，4℃，15min)，去上清，加入质量体积比为1.5％的BSA溶液重悬，4℃保存；

标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的乳胶微球，35℃烘箱中烘干并保存备用。

(2)划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、地高辛抗体和二抗溶液分别印制到检测线T1和T2以及质控线C，35℃烘箱中烘干并保存备用。

(3)试纸条的制作：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。

(4)待检测HPV样品DNA的提取及PCR扩增

DNA采用磁珠法提取，利用羧基修饰的磁性纳米粒子作为DNA提取的载体，具体实施方式为：在干净的离心管中加入50μL HPV样品，500μL细胞裂解液和20μL蛋白酶K溶液，60℃孵育15min；室温冷却，加入15μL羧基修饰的磁珠和200μL包被液，室温下旋转5min；磁性吸附，去上清，加入600μL洗涤液洗涤两次；磁性吸附，去上清，加入50μL重悬液重悬，磁性吸附，取上清即为所提DNA。

PCR反应体系(25μL)为：1×PCR缓冲液，2.0mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，Taq酶1U，10μM的HPV 16上下游引物各0.4μL，10μM的HPV 18上下游引物各0.2μL，DNA模板1μL，补水至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸3min。

其中，采用的HPV 16上游引物的具体序列为：5’-FITC-GACTTTGCaTTaTTCGGGATT-3’，下游引物的具体序列为：5’-BIO-CTTTGCTTaTTcTTCAGGAC-3’。采用的HPV 18上游引物的具体序列为：5’-FITC-TGTCACGAaGCAAcTTAAGC-3’，下游引物的具体序列为：5’-DIG-CTGGCTTCAaCACTaTACAACA-3’。

(5)样品检测

本实施例步骤(4)中的PCR产物经上样缓冲液稀释后直接滴加到试纸条的上样区，室温下反应5min，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T1和T2的强度进行分析。本实施例中采用侧向层析方法同时筛查和检测宫颈癌高危HPV 16和HPV 18基因型的灵敏度示意图与图1相似。

实施例3

本实施例提供的同时检测HPV 16和HPV 18基因型的双重侧向流层析检测方法包括以下步骤：

(1)FITC抗体偶联的乳胶微球的制备

活化：往适量浓度的乳胶微球溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使乳胶微球表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：15：15，室温避光活化40min；

偶联：离心(12000g，4℃，15min)，去上清，加入PB(10mM，pH值7.0)缓冲液重悬，加入适量的FITC抗体，室温孵育2h；

封闭：加入质量体积比为20％的BSA溶液，室温孵育1h；

重悬：离心(12000g，4℃，20min)，去上清，加入质量体积比为2％的BSA溶液重悬，4℃保存；

标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的乳胶微球，40℃烘箱中烘干并保存备用。

(2)划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、地高辛抗体和二抗溶液分别印制到检测线T1和T2以及质控线C，40℃烘箱中烘干并保存备用。

(3)试纸条的制作：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。

(4)待检测HPV样品DNA的提取及PCR扩增

DNA采用磁珠法提取，利用羧基修饰的磁性纳米粒子作为DNA提取的载体，具体实施方式为：在干净的离心管中加入100μL HPV样品，700μL细胞裂解液和30μL蛋白酶K溶液，60℃孵育15min；室温冷却，加入30μg羧基修饰的磁珠和包被液，室温下旋转5min；磁性吸附，去上清，加入1000μL洗涤液洗涤两次；磁性吸附，去上清，加入100μL重悬液重悬，磁性吸附，取上清即为所提DNA。

PCR反应体系(25μL)为：1×PCR缓冲液，2.0mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，Taq酶1U，10μM的HPV 16上下游引物各0.4μL，10μM的HPV 18上下游引物各0.2μL，DNA模板1μL，补水至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸3min。

其中，采用的HPV 16上游引物的具体序列为：5’-FITC-GACTTTGCaTTaTTCGGGATT-3’，下游引物的具体序列为：5’-BIO-CTTTGCTTaTTcTTCAGGAC-3’。采用的HPV 18上游引物的具体序列为：5’-FITC-TGTCACGAaGCAAcTTAAGC-3’，下游引物的具体序列为：5’-DIG-CTGGCTTCAaCACTaTACAACA-3’。

(5)样品检测

本实施例步骤(4)中的PCR产物经上样缓冲液稀释后直接滴加到试纸条的上样区，室温下反应5min，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T1和T2的强度进行分析。本实施例中采用侧向层析方法同时筛查和检测宫颈癌高危HPV 16和HPV 18基因型的灵敏度示意图与图1相似。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明根据宫颈癌高危HPV 16或HPV 18基因型存在时，通过PCR扩增分别获得对应的两端双功能化的双链DNA扩增产物，利用双链DNA扩增产物的桥接作用，分别把乳胶微球连接到对应的不同检测线上，根据不同高危HPV的含量不同时，连接到不同检测线上的乳胶微球的数量不同，进而使不同检测线颜色的深浅不同，建立起不同检测线颜色的深浅与不同高危HPV含量之间的关系，进而实现一次扩增、加样同时对高危HPV 16和HPV 18基因型灵敏筛查和检测的目的。此方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简单，适用性强，能同时检测到700个拷贝的宫颈癌高危HPV 16和HPV 18DNA。此方法，不需要特殊贵重仪器，仅需要常规PCR扩增仪及对应的双重侧向流层析试纸条，即可实现同时对宫颈癌高危HPV 16和HPV 18的快速、准确、同时筛查，适用于基层及检测硬件资源匮乏地区开展相关的宫颈癌普查工作。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽深蓝医疗科技股份有限公司

<120> 针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gactttgcat tattcgggat t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

ctttgcttat tcttcaggac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

tgtcacgaag caacttaagc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ctggcttcaa cactatacaa ca 22

Claims (10)

1.一种针对HPV16基因型的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。

2.一种针对HPV18基因型的引物对，其特征在于包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。

3.一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，其特征在于：所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。

4.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述FITC抗体选自FITC的单克隆抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL；和/或，所述乳胶微球为红色或蓝色，粒径为50～200nm；和/或，所述链霉亲和素的浓度为0.5～1.0mg/mL；和/或，所述地高辛抗体选自地高辛的单克隆抗体，浓度为0.6～1.2mg/mL；和/或，所述二抗选自FITC抗体的羊抗鼠抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL。

5.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板或塑料板；和/或，所述上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；和/或，所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；和/或，所述吸水区的材质包括滤纸。

6.权利要求3-5中任一项所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其特征在于包括：

将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；

将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，

将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于具体包括：使包含乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合体系于室温避光活化30～40min，之后加入FITC抗体孵育，再加入BSA溶液，获得FITC抗体偶联的乳胶微球；优选的，所述乳胶微球表面所含羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1：1～1：15：15。

8.权利要求1所述的针对HPV16基因型的引物对、权利要求2所述的针对HPV18基因型的引物对或权利要求3-5中任一项所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条于制备检测HPV16和HPV18基因型的产品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测HPV16和HPV18基因型的方法包括：

提取待检测HPV样品中的DNA；

采用权利要求1所述的针对HPV16基因型的引物对、权利要求2所述的针对HPV18基因型的引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；

将所获双链DNA产物加入权利要求3-5中任一项所述的双重侧向流层析试纸条进行检测，根据检测线的显色结果实现待检测HPV样品中HPV16或HPV18的定性或定量检测。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测HPV16和HPV18基因型的方法具体包括：采用细胞裂解液和蛋白酶K溶液使待检测HPV样品裂解，再加入羧基修饰的磁珠和包被液，所获DNA经洗涤液洗涤，之后以重悬液重悬，获得检测HPV样品的DNA；

优选的，所述裂解液包含Tris-HCl缓冲液、乙二胺四乙酸、氯化钠和十二烷基硫酸钠，其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1～20mmol/L，所述氯化钠的浓度为100～500mmol/L，所述十二烷基硫酸钠与裂解液的质量体积比为0.5～2g：100mL；

优选的，所述蛋白酶K溶液的终浓度为0.5～3mg/mL；

优选的，所述包被液包含聚乙二醇和氯化钠，其中，所述聚乙二醇的质均分子量为200～20000，所述聚乙二醇与包被液的质量体积比为5～30g：100mL，所述包被液中氯化钠的浓度为0.5～3mol/L；

优选的，所述洗涤液包括乙醇含量为50～80vt％的水溶液；

优选的，所述重悬液包括Tris-HCl缓冲液和乙二胺四乙酸，其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1～20mmol/L。