CN103805718A - 基于纳米金的hpv基因分型检测方法 - Google Patents

基于纳米金的hpv基因分型检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种基于纳米金的HPV基因分型检测方法,该检测方法中引入的信号物质为纳米金,利用金能够置换出银的原理,使待检测核酸片段做不对称PCR扩增后连上纳米金,并与基因芯片上的寡核苷酸探针杂交,最后银染显色,直接观测或使用平板扫描仪进行HPV基因分型记录分析。本发明通过在目视化芯片中由于引入了纳米金,使得芯片所产生的信号不再需要特殊昂贵的仪器进行检测,肉眼就可以直接观测且纳米金没有污染对人体没有伤害。该方法具有高通量,高灵敏的,且廉价等优点,因而具有广阔的市场前景。

Description

基于纳米金的HPV基因分型检测方法
技术领域
本发明涉及病毒分型检测技术领域,尤其是涉及一种引入多重不对称聚合酶链式反应(PCR)扩增及纳米金银染着色技术的HPV基因分型检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavims,HPV)是性传播疾病之一,它是一类嗜上皮性的、无包膜的小型双链环状DNA肿瘤病毒,具有高度种属及组织特异性,可感染人类皮肤及粘膜组织。HPV病毒颗粒呈球形,直径约为55nm,衣壳呈20面立体对称,内含7200~8000个碱基对,相对分子量为5X106Da;其中88%是病毒蛋白。
我们将已知的所有亚型的HPV的基因序列组成一个数据库,把新发现的病毒序列和这个数据库进行比较,当未知的HPV基因序列和已知的HPV基因序列同源性小于90%时称为一个独立的新型,当同源性大于90%时称为一个亚型。按此标准,已在人体不同的组织中发现120余型不同类型的HPV,鉴定了90余型,不同亚型的HPV可以感染人体的不同部位引起不同程度的病变,HPV能够感染生殖器官,肛门,宫颈,面部及手部皮肤从而引起良性表皮损害、高分化的先兆性损害及侵袭性肿瘤等,因此根据病毒致病性的高低又可以将病毒分为高危型和低危型两类。其中HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等12种型别被确定为低危型。这些低危型的病毒致癌性不高多引起尖锐湿疣等良性病变,HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82等15种型别被确定为高危型,人体感染这15型病毒后很容易导致宫颈癌的发生。其中人体最容易感染的亚型为HPV16和HPV18型。HPV16型在HPV阳性的宫颈癌患者中平均感染率为57.4%,而HPV18型的感染率为16.6%,因此在1995年,WHO公认HPV16和HPV18作为人类的癌基因,HPV31和HPV33为人类可能的癌基因。
宫颈癌是目前已知的由HPV病毒引起的癌症,因此宫颈癌筛查的重点就是筛查HPV的存在。但是HPV这种病毒不能在体外培养,又没有合适的实验动物,另外血清学检测也不敏感,多数为阴性。所以目前检测HPV感染主要基于基因序列的分子水平检测及分型。主要有以下几种检测方法:
1、原位杂交法
宫颈刮片或活检标本的HPV可以通过在病理切片上和设计好的分子探针进行原位杂交的方法来检测,这种方法即可观察到组织形态的变化,又可以对感染样品中的HPV进行单独或共同定位,是一种比较理想的病毒学检测方法。但HPV分型鉴定需要不同型别的特异性探针进行多次的原位杂交分析,目前国内还缺乏比较稳定的探针。这种方法敏感性高,但操作复杂不适于大规模普查。
2、型特异性PCR检测法
针对HPV不同亚型设计出特异性引物,对宫颈刮片或活检标本的基因提取物进行PCR扩增,然后利用凝胶电泳技术对扩增产物进行分离,根据片段大小来检测HPV,这种方法在病理及妇产科应用比较广泛,但PCR法产物易污染,容易出现假阳性,工作量大且检测类型有限。
3、杂交捕获法(HC)
HC是由美国Digene公司基于液相杂交加敏感的化学发光加信号放大原理开发的一款可对HPV基因进行分型和定量分析的系统。该系统含有两组不同的RNA混合探针,一组为高危型探针分别为HPV6、11、42、43和44型;一组为低危型探针分别为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。首先样本DNA被降解为单链;单链DNA和RNA探针结合形成一种DNA.RNA结合体;在系统中在加入一种结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体,抗体和杂交结合体固定在微孔壁上;碱性磷酸酶可以使酶底物发光,根据光的强弱就可以判定出碱性磷酸酶的含量从而间接的判定出DNA.RNA结合体的含量。HC采用的是96孔平板法。该系统是唯一获得美国FDA认证的用于检测HPV的临床商品化试剂盒,已被包括我国在内的许多国家作为标准方法应用于临床研究中。
但这种方法也有一些不足,由于使用到了抗体和核酸杂交等对检测设备要求高,试剂检测费用较贵。而且HC仅能区分高危和低危型两个群,而无法鉴定病变组织中存在的HPV具体基因型,更不能检测出多重感染。
4、HPV基因芯片检测法
基因芯片是一种采用原位合成或显微点样技术将核酸探针固化于尼龙膜或玻片等支持物表面上,生成二维DNA探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现快速、并行、高效的检测。2005年有文献报道已设计出了1种芯片可同时检测45种亚型的HPV。虽然目前基因芯片技术成本昂贵,检测需要昂贵的仪器,在临床研究中报道不多,但基因芯片技术对HPV的分型检测有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,采用纳米金作为信号物质,提供一种快速、简便、经济、灵敏的HPV基因分型检测方法。
为实现上述目的,本发明提出如下技术方案:一种基于纳米金的HPV基因分型检测方法,包括以下步骤:
1)从生物样品中提取出待测核酸片段,用PCR扩增引物对所述待测核酸片段作不对称PCR扩增,得到目的核酸片段,所述PCR扩增引物包括第一HPV引物和第二HPV引物,其中所述第一HPV引物和第二HPV引物的序列分别为:
第一HPV引物:TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
第二HPV引物:GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC;
2)将纳米金与标记引物P1的3′端或5′端共价连接,形成HPV纳米金标记探针,并与步骤1)中的所述目的核酸片段混合,其中所述标记引物P1的序列为:
P1:GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC:
3)将各型别的HPV寡核苷酸探针点样到基因芯片上,在所述基因芯片上进行目的核酸片段与HPV寡核苷酸探针的杂交反应;
4)对所述步骤3)中杂交后的产物清洗后银染显色及分析,目视化观察结果。
优选地,对所述标记引物P1的3′端或5′端做巯基修饰,便于与纳米金共价连接,对各型别的所述HPV寡核苷酸探针的5′端做H2N(CH2)6修饰。
优选地,在步骤1)中,采用柠檬酸三钠还原法制备出所述纳米金,其制备过程包括:将浓度为0.01%的氯金酸(HAuCl)液加热至沸腾,迅速加入浓度为1%柠檬酸三钠水溶液后,煮沸7~10min即制得所述纳米金。
优选地,所述基因芯片采用醛基修饰的基因芯片,所述醛基修饰的基因芯片的制作过程包括以下步骤:(1)Gold seal载玻片的准备;(2)将寡核苷酸探针有序地点制在所述Gold seal载玻片上;(3)将点样后的Gold seal载玻片用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭。
在步骤2)中采用的各型别的HPV寡核苷酸探针的序列包括:
HPV6:ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA
HPV11:ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA
HPV16:GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
HPV18:TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
HPV31:TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC
HPV33:TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC
HPV35:GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA
HPV45:ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT
HPV51:AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA
HPV52:TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA
HPV53:TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT
HPV56:GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG
HPV58:ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC。
步骤3)中,从生物样品中提取出待测核酸片段的过程包括:用细胞裂解液对生物样品中的HPV进行裂解,分离,提取出待测核酸片段。
所述细胞裂解液中包括:10mM NaOH,0.45%Tween.20,0.45%Triton-100。
本发明的有益效果是:(1)该检测方法中引入的信号物质为纳米金,使得所产生的信号不再需要特殊昂贵的仪器进行检测,肉眼就可以直接观测且纳米金没有污染对人体没有伤害;(2)以目视化基因芯片为平台,引入多重不对称PCR及纳米金银染着色技术,以13种高、低危人乳头瘤病毒为模板,建立了可目视化基因分型的新方法,对HPV的传播、宫颈癌的癌前诊断及预防提供重要依据;(3)该方法具有高通量,高灵敏,且廉价等优点,因而具有广阔的市场前景。
附图说明
图1a、图1b是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-6亚型杂交结果示意图;
图2是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-16亚型杂交结果示意图;
图3是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-18亚型杂交结果示意图;
图4是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-6、11亚型混合杂交结果示意图;
图5是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-51、52亚型混合杂交结果示意图;
图6是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-16、52、56亚型混合杂交结果示意图;
图7是本发明基于纳米金的HPV基因分型检测方法的HPV-16、35、51亚型混合杂交结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。
在实施HPV基因分型检测之前,需要预先进行纳米金、醛基修饰的基因芯片的制备。其中,本发明实施例中采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金,具体制备过程为:先将0.01%的氯金酸(HAuCl)液加热至沸腾后,向内迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液,开始混合后的溶液有些呈蓝色,然后逐渐呈浅蓝、蓝色,再加热则会出现红色,持续煮沸7~10min后出现透明的橙红色,这样即制得了纳米金,其制备程序非常简单,而且制备的纳米金颗粒大小比较均一。
所述醛基修饰的基因芯片的制备过程为:
1)取表面光洁、无划痕的Gold seal载玻片在无水乙醇中清洗三次,每次10min;清洗后500r/min离心5min,将芯片甩干;
2)在10%NAOH溶液中浸泡1h,接着超声15min;
3)在超纯水中提洗4次,每次2min,再在无水乙醇中提洗2次,每次2min,500r/min离心5min,将芯片甩干;
4)将芯片浸泡在1%APTES(APTES与无水酒精比例为198:2)溶液中3h,用无水酒精清洗3次,每次10min,500r/min离心5min,芯片甩干;
5)将甩干的芯片浸泡在2.5%的戊二醛(超纯水:0.1M PBS:25%戊二醛比例为203:22:25)溶液中3h,然后超纯水清洗3次,每次5min,500r/min离心5min后甩干;
6)抽真空后干燥保存,制成探针载体。
7)将寡核苷酸探针干粉用无菌水溶解至50umol/L,与2×点样缓冲液按1:1混合后得到寡核苷酸探针溶液,通过晶芯smart arrayer48生物芯片点样仪有序地将30-mer寡核苷酸探针点制在所述探针载体上;
8)最后用1%牛血清白蛋白BSA封闭芯片,制成醛基修饰的基因芯片。
在步骤7)中,所述HPV寡核苷酸探针的5′端做H2N(CH2)6修饰。
另外,本发明实施例以13种高、低危人乳头瘤病毒为模板,这13种HPV模板基因序列为:
HPV6:ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA
HPV11:ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA
HPV16:GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
HPV18:TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
HPV31:TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC
HPV33:TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC
HPV35:GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA
HPV45:ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT
HPV51:AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA
HPV52:TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA
HPV53:TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT
HPV56:GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG
HPV58:ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC。
实施例1
本发明实施例1以检测HPV各单一基因型样本为例。
第一步,用细胞裂解液对生物样品中的HPV进行裂解,分离提取出待测核酸片段,作为HPV基因扩增模板,用PCR扩增引物对HPV基因扩增模板做不对称PCR扩增,具体步骤为:
(1)取1mL宫颈分泌物的洗脱液,13000r/min离心10min,弃去上清液,收集管底的细胞块;
(2)向细胞块中加入100uL的、PH调至8.0且经高压灭菌过的细胞裂解液(10mM NaOH,0.45%Tween.20,0.45%Triton-100),涡旋振荡使细胞块充分悬浮分散。
(3)将步骤(2)中加入裂解液的细胞块煮沸10min,13000r/min离心10min后,保留上清液,取2uL上清液做HPV基因扩增模板。
(4)按1:20的容积比例向HPV基因扩增模板中加入PCR扩增引物,在95℃预变性5min,95℃变性30s,43℃退火30s,72℃延伸30s,共计40个循环,再在72℃最后延伸5min,完成不对称PCR扩增,得到目的核酸片段,其中,所述PCR扩增引物采用设计的第一HPV引物和第二HPV引物,两者的序列分别为TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC和GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC。
第二步,将纳米金与标记引物P1的3′端或5′端共价连接,形成HPV纳米金标记探针,并与第一步中得到的所述目的核酸片段混合,标记引物P1的3′端或5′端做HS(CH2)6-(Tho修饰,其中所述标记引物P1的序列为:
P1:GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC;
第三步,将目的核酸片段与HPV纳米金标记探针的混合液与醛基修饰的基因芯片上的寡核苷酸探针杂交,杂交温度为53℃;
第四步,对第三步中杂交后的产物清洗后,银染10分钟;目视化观察结果。
实验对照结果
如下面表1-1所示,及结合图1a、图1b、图2和图3,运用目视化HPV芯片对临床生物样品检测,共检测了单一HPV亚型感染84例,阳性结果中信号灰度值都在50以上,肉眼可以明显分辨出。
表1-1目视化基因分型方法检测结果统计表
单一亚型 目视化芯片法宫颈糜烂(N)
HPV6 28
HPV11 30
HPV16 7
HPV18 5
HPV31 0
HPV33 5
HPV35 0
HPV45 0
HPV51 2
HPV52 0
HPV53 0
HPV56 7
HPV58 0
总计 84
另外,在目视化芯片检测法与细胞学检测法间阳性率比较表中,我们发现目视化芯片检测法与细胞学检测法的阳性率间无显著性差异(P>O.05),表明本发明基于纳米金进行HPV基因分型检测的目视化芯片检测法的精确度较高。
实施例2
本发明实施例2以检测HPV混合基因型样本为例。
第一步,用细胞裂解液对生物样品中的HPV进行裂解,分离提取出待测核酸片段,作为HPV基因扩增模板,用PCR扩增引物对HPV基因扩增模板做不对称PCR扩增,具体步骤为:
(1)取1mL宫颈分泌物的洗脱液,13000r/min离心10min,弃去上清液,收集管底的细胞块;
(2)向细胞块中加入100uL的、PH调至8.0且经高压灭菌过的细胞裂解液(10mM NaOH,0.45%Tween.20,0.45%Triton-100),涡旋振荡使细胞块充分悬浮分散。
(3)将步骤(2)中加入裂解液的细胞块煮沸10min,13000r/min离心10min后,保留上清液,取2uL上清液做HPV基因扩增模板。
(4)按1:20的容积比例向HPV基因扩增模板中加入PCR扩增引物,在95℃预变性5min,95℃变性30s,43℃退火30s,72℃延伸30s,共计40个循环,再在72℃最后延伸5min,完成不对称PCR扩增,得到目的核酸片段,其中,所述PCR扩增引物采用设计的第一HPV引物和第二HPV引物,两者的序列分别为TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC和GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC。
第二步,将纳米金与标记引物P1的3′端或5′端共价连接,形成HPV纳米金标记探针,并与第一步中得到的所述目的核酸片段混合,其中所述标记引物P1的序列为:
P1:GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC;
第三步,将目的核酸片段与HPV纳米金标记探针的混合液与醛基修饰的基因芯片上的寡核苷酸探针杂交,杂交温度为53℃;
第四步,对第三步中杂交后的产物清洗后,银染10分钟;目视化观察结果。
实验对照结果
如下面表1-1所示,及结合图4、图5,运用目视化HPV芯片对临床生物样品检测,共检测了混合HPV亚型感染12例,阳性结果中信号灰度值都在50以上,肉眼可以明显分辨出。
表1-2目视化基因分型方法检测结果统计表
混合亚型 目视化芯片法宫颈糜烂(N)
HPV6、HPV11 3
HPV6、HPV16 3
HPV6、HPV51 1
HPV11、HPV16 3
HPV16、HPV45 1
HPV45、HPV51 1
总计 12
另外,在目视化芯片检测法与细胞学检测法间阳性率比较表中,我们发现目视化芯片检测法与细胞学检测法的阳性率间无显著性差异(P>O.05),表明本发明基于纳米金进行HPV基因分型检测的目视化芯片检测法的精确度较高。
在进行HPV混合基因型样本检测时,本发明实施例同样也支持三种及三种以上的HPV混合基因型样本的检测,如图6、图7所示,为三种HPV亚型基因混合杂交的结果示意图,其实施步骤与实施例2相同。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上,然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰,因此,本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容,而应包括各种不背离本发明的替换及修饰,并为本专利申请权利要求所涵盖。
TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC
ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA
ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA
GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC
TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC
GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA
ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT
AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA
TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA
TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT
GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG
ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC

Claims (9)

1.一种基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)从生物样品中提取出待测核酸片段,用PCR扩增引物对所述待测核酸片段作不对称PCR扩增,得到目的核酸片段,所述PCR扩增引物包括第一HPV引物和第二HPV引物,其中所述第一HPV引物和第二HPV引物的序列分别为:
第一HPV引物:TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
第二HPV引物:GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC;
2)将纳米金与标记引物P1的3′端或5′端共价连接,形成HPV纳米金标记探针,并与步骤1)中的所述目的核酸片段混合,其中所述标记引物P1的序列为:
P1:GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC:
3)将各型别的HPV寡核苷酸探针点样到基因芯片上,在所述基因芯片上进行目的核酸片段与HPV寡核苷酸探针的杂交反应;
4)对所述步骤3)中杂交后的产物清洗后银染显色及分析,目视化观察结果。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,对所述标记引物P1的3′端或5′端做巯基修饰,对各型别的所述HPV寡核苷酸探针的5′端做H2N(CH2)6修饰。
3.根据权利要求2所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,所述巯基修饰包括采用HS(CH2)6-(Tho修饰。
4.根据权利要求1所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,在步骤2)中,采用柠檬酸三钠还原法制备出所述纳米金。
5.根据权利要求4所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,采用柠檬酸三钠还原法制备出所述纳米金的过程包括:将浓度为0.01%的氯金酸(HAuCl)液加热至沸腾,迅速加入浓度为1%柠檬酸三钠水溶液后,煮沸7~10min即制得所述纳米金。
6.根据权利要求1所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,所述基因芯片采用醛基修饰的基因芯片,所述醛基修饰的基因芯片的制作过程包括以下步骤:(1)Gold seal载玻片的准备;(2)将寡核苷酸探针有序地点制在所述Gold seal载玻片上;(3)将点样后的Gold seal载玻片用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭。
7.根据权利要求1所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,在步骤3)中采用的各型别的HPV寡核苷酸探针的序列包括:
HPV6:ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA
HPV11:ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA
HPV16:GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA
HPV18:TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
HPV31:TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC
HPV33:TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC
HPV35:GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA
HPV45:ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT
HPV51:AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA
HPV52:TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA
HPV53:TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT
HPV56:GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG
HPV58:ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC。
8.根据权利要求1所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,步骤1)中,从生物样品中提取出待测核酸片段的过程包括:用细胞裂解液对生物样品中的HPV进行裂解,分离,提取出待测核酸片段。
9.根据权利要求8所述的基于纳米金的HPV基因分型检测方法,其特征在于,所述细胞裂解液中包括:10mM NaOH,0.45%Tween.20,0.45%Triton-100。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109610007A (zh) * 2018-10-12 2019-04-12 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种蛋白共修饰的dna芯片及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182578A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于纳米金探针的基因芯片的dna检测方法
CN101470111A (zh) * 2007-12-26 2009-07-01 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种新的纳米金复合底物ncs的制备和用途
CN101792819A (zh) * 2009-12-17 2010-08-04 陕西北美基因股份有限公司 高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182578A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于纳米金探针的基因芯片的dna检测方法
CN101470111A (zh) * 2007-12-26 2009-07-01 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种新的纳米金复合底物ncs的制备和用途
CN101792819A (zh) * 2009-12-17 2010-08-04 陕西北美基因股份有限公司 高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尹晋津等: "生物检测用纳米粒子还原制备方法比较", 《湖南工业大学学报》, vol. 22, no. 1, 31 January 2008 (2008-01-31), pages 104 - 108 *
郭森: "人乳头瘤病毒快速分型的目视化基因芯片技术研究及应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, no. 9, 15 September 2010 (2010-09-15), pages 059 - 69 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109610007A (zh) * 2018-10-12 2019-04-12 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种蛋白共修饰的dna芯片及其制备方法

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