CN108660254B - 生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法，本发明的生殖道病原体核酸检测引物，包括：检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑6或SEQ ID No.7‑12所示；检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.13‑14或SEQ ID No.15‑16所示。本发明的生殖道病原体核酸检测试剂盒，基于量子点和PCR技术，可实现14种生殖道病原体和18种HPV基因分型的同时检测，具有操作简单、价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测的优点。

Description

生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术，特别涉及一种生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
量子点(Quantum dot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。
量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：
1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；
2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；
3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；
4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；
5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；
6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；
7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。
8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。
量子点材料在20世纪80年代分别由Alexey I.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。
阴道炎是非常常见的一种妇科疾病，居妇女生殖道感染疾病之首。阴道炎的发生、发展是一个多种因素共同作用的结果，生殖道的病原体感染与阴道炎的发生、发展密切相关，生殖道病原体复杂多样，包括细菌、霉菌、滴虫、支原体、衣原体、淋球菌、病毒等。阴道炎根据感染的病原体不同而又分为细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)、外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)和滴虫性阴道炎(trichomonal vaginitis,TV)。细菌性阴道病感染的病原菌主要包括需氧菌(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌)和厌氧菌(阴道加德纳菌、阴道阿托波尔菌、动弯杆菌)；外阴阴道念珠菌病曾称为霉菌性阴道炎、外阴阴道假丝酵母菌病等，是由念珠菌引起的女性生殖道感染性疾病，其病原菌是以白念珠菌为主的酵母菌，其他如光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等非白念珠菌占少数；滴虫性阴道炎感染的病原菌是阴道毛滴虫。
健康女性阴道菌群由各种需氧茵和厌氧菌组成，各种微生物之间的相互制约、相互作用、相互依赖以及阴道局部的免疫状态，使阴道内微生物群与宿主、环境保持着协调、动态的平衡。在受到内源性和外源性因素影响时(如性激素的变化、抗生素的广泛使用、不当的阴道灌洗、全身性免疫低下性疾病、性交、避孕药具等)，阴道菌群的动态平衡容易被打破，导致阴道菌群失衡，作为优势菌的乳杆菌将被抑制或大量减少，对其他微生物的抑制作用会减弱，引起病源微生物大量增殖，成为异常优势菌，从而会导致生殖道感染的发生，引发阴道炎等。
性传播疾病(sexually transmitted diseases，STD)顾名思义就是一种经性途径而引起的传染性疾病的总称。能引起性传播疾病的病原体有淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体等二十多种。
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的1、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。在1995年，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)发布了有关高危型HPV是宫颈癌必要的致病因子以后，HPV感染受到全球的广泛关注。
对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类，将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关，尤其是HPVl6和18型；26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。
目前临床常用的生殖道感染病原体检测方法有很多，比如镜检、培养、抗原抗体检测的免疫学方法、DNA杂交、PCR等，上述检测方法均不具有高通量的特点，不能满足在一份样品中检测多重感染的情况，使不少患者存在漏检问题。因此，临床上急需一种简单、快捷、经济和高通量的检测技术。
根据BV、VVC等的诊治规范草案和文献资料筛选出14种需检测的生殖道病原体如表1；依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，18种需检测的HPV型别如表2。
表1
表2
13种高危型别 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68
5种中等风险型别 HPV26、53、66、73、82
目前，国内市面上虽然已经存在相关核酸检测产品(三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒，生产厂家为昆明云大生化科技有限责任公司、性传播疾病监测试剂盒，生产厂家为四川大学华西医院、泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒，生产厂家为广东凯普生物科技股份有限公司、解脲脲原体核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)，生产厂家为上海仁度生物科技有限公司、37种HPV分型检测试剂盒，生产厂家广东凯普生物科技股份有限公司等)，但是暂无生殖道感染病原体和HPV基因分型同时检测的产品。
通过网上查询和市场调研可知，市场上相关产品均不能实现生殖道病原体和HPV基因分型共32种病原体的同时检测，临床上不能全面准确的检测病原体，会给临床指导造成困扰。
技术方面，目前，用于检测生殖道病原体和HPV基因分型的的方法主要有：PCR-荧光探针法和基因芯片(PCR-反向点杂交)。
PCR-荧光探针法，该方法操作简便，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。由于受到荧光报告基团及仪器检测通道的限制，1管PCR mix可检测的突变类型有限，需多管PCRmix才能满足如此多突变类型的检测，成本高。
通过网上查询和市场调研可知，市场上相关产品均不能实现生殖道病原体和HPV基因分型共32种病原体的同时检测，临床上不能全面准确的检测病原体，会给临床指导造成困扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法，基于量子点和PCR技术，可实现14种生殖道病原体和18种HPV基因分型的同时检测。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种生殖道病原体核酸检测引物，所述引物包括：
检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-6和/或SEQ ID No.7-12所示；
检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.13-14和/或SEQ ID No.15-16所示。
一种生殖道病原体核酸检测探针，所述探针包括：
检测生殖道病原体的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.21-34所示；
检测HPV分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.35-52所示。
一种生殖道病原体核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的生殖道病原体核酸检测引物以及上述的生殖道病原体核酸检测探针。
一种生殖道病原体核酸检测方法，采用上述的生殖道病原体核酸检测试剂盒进行检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的上述引物，通过大量试验的优化和筛选，获得能够高效稳定扩增的检测和分型引物。通过引物的具体序列设计，并结合序列长度和位置的调整，提高引物的检测灵敏度和重复性；
(2)本发明的上述探针，通过大量试验的优化和筛选，获得稳定、特异性强的检测和分型探针。通过探针的具体序列设计，并结合探针的长度和碱基组成的调整，提高探针的检测特异性和准确性；
(3)本发明的上述检测试剂盒及其检测方法，提供了一种PCR-量子点荧光检测核酸的新方法，量子点荧光目前大多用于检测蛋白的方面，本发明开创了一个新的方法；同时，本发明建立了一种全面、快速地进行生殖道病原体检测的方法，能在一次试验中，能准确检测32种生殖道病原体，并区分HPV的基因型；使用上述检测试剂盒，可以快速、准确地确定患者感染何种病原体，为病情的判断提供参考依据，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。具有操作简单、价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测的优点。
附图说明
图1为本发明实施例的生殖道病原体核酸检测试剂盒的检测结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：基于量子点和PCR技术，将量子点荧光技术用于检测生殖道病原体核酸。
请参照图1，一种生殖道病原体核酸检测引物，所述引物包括：
检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-6和/或SEQ ID No.7-12所示；
检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.13-14和/或SEQ ID No.15-16所示。
一种生殖道病原体核酸检测探针，所述探针包括：
检测生殖道病原体的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.21-34所示；
检测HPV分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.35-52所示。
一种生殖道病原体核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的生殖道病原体核酸检测引物以及上述的生殖道病原体核酸检测探针。
一种生殖道病原体核酸检测方法，采用上述的生殖道病原体核酸检测试剂盒进行检测。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的上述引物，通过大量试验的优化和筛选，获得能够高效稳定扩增的检测和分型引物。通过引物的具体序列设计，并结合序列长度和位置的调整，提高引物的检测灵敏度和重复性；
(2)本发明的上述探针，通过大量试验的优化和筛选，获得稳定、特异性强的检测和分型探针。通过探针的具体序列设计，并结合探针的长度和碱基组成的调整，提高探针的检测特异性和准确性；
(3)本发明的上述检测试剂盒及其检测方法，提供了一种PCR-量子点荧光检测核酸的新方法，量子点荧光目前大多用于检测蛋白的方面，本发明开创了一个新的方法；同时，本发明建立了一种全面、快速地进行生殖道病原体检测的方法，能在一次试验中，能准确检测32种生殖道病原体，并区分HPV的基因型；使用上述检测试剂盒，可以快速、准确地确定患者感染何种病原体，为病情的判断提供参考依据，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。具有操作简单、价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测的优点。
进一步的，所述引物还包括：内控引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.17-18和/或SEQ ID No.19-20所示。
进一步的，所述探针还包括：内控探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.53所示。
进一步的，所述探针的5’端进行氨基修饰。
进一步的，所述PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液包括核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示的检测生殖道病原体的引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的内控引物；所述第二PCR反应液包括核苷酸序列如SEQ ID No.13-14的检测HPV分型的引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的内控引物。
将基因芯片(PCR-反向点杂交)用于检测生殖道病原体和HPV基因分型，具有快速、高效等优点，可检测已知变异位点，灵敏性较好。现有技术中，基因芯片的信号放大系统还是采用传统的酶联免疫技术，通过底物的显色反应来间接的检测目的基因。而本发明的PCR-量子点荧光技术则是直接通过量子点来放大检测信号，相对于酶联免疫反应的间接放大检测的效果更好，操作更简单，省去了检测放大的步骤，结果更可靠。本公司基于此技术开发的生殖道病原体核酸检测产品，操作简单，价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测。
实施例
1 技术基础
1.1 根据16SrRNA、18SrRNA、28SrRNA基因序列进行引物及扩增反应液的设计和实施
其主要研究内容是：根据细菌的16S rRNA以其在进化上的特征性序列，设计通用的PCR引物对；各念珠菌18S rRNA和28S rRNA之间的基因序列，设计特异的PCR引物对；阴道毛滴虫18S rRNA和28S rRNA之间的基因序列，设计特异的PCR引物对；HPV基因晚期转录区(L区)的基因序列设计多对特异的引物对，所有下游引物5’端均用生物素进行标记，扩增获得一定长度的用于分型检测的目的片段；此外，还设计IC内控，用于监测整个实验过程。
PCR反应液分为2管，第一管细菌、念珠菌、阴道毛滴虫扩增引物，第二管为HPV基因分型引物，每一管反应液中均含有IC内控(β-globin)。
1.2 本项目将开发的芯片建立在膜芯片的基础上
基因芯片由玻璃片或尼龙膜和固定在其上的探针阵列构成，二者基本原理相似，玻璃芯片的制备工艺复杂，检测过程繁琐，尤其是信号检测需要激光扫描仪，直接导致了其使用成本高昂，在市场特别是临床检测中不能得到有效的推广，因此其研发方向主要针对科学研究机构；膜芯片的开发则具有制备相对简单、操作简便、成本低廉等明显优势，十分有利于市场的推广，更能快速、有效地实现研究成果的产业化。
1.3 根据已知的生殖道病原体及HPV基因分型研究成果进行检测探针和基因芯片的设计和实施
其主要研究内容是：根据不同病原体基因在16S rRNA序列之间的差异、念珠菌和阴道毛滴虫特有序列以及HPV不同基因型别之间的差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种病原体序列以及基因型别的寡核苷酸探针；所有寡核苷酸探针3’端用氨基标记，通过化学键作用固定在尼龙膜的特定位置上，制成包含探针阵列的膜条。
2 具体技术实施方案
2.1 扩增引物的设计和筛选
在Genebank数据库中查找并下载细菌的16S rRNA以其在进化上的特征性序列、各念珠菌18S rRNA和28S rRNA之间的基因序列、阴道毛滴虫18S rRNA和28S rRNA之间的基因序列、HPV基因晚期转录区(L区)的基因序列，用primer premier5.0设计引物，所有扩增引物的Tm值尽可能相近；如此，生殖道病原体检测和HPV分型引物可以在同一条件下进行扩增。设计好的引物由Invitrogen Trading公司合成。引物合成后由公司人员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。通过大量试验筛选到能够高效稳定扩增的检测和分型引物。此引物的长度和位置的改变会降低本试剂盒的灵敏度和重复性，因此，引物序列是本发明的保护内容。引物的编号和序列见表3。
表3
2.2 PCR扩增反应体系的确认
利用正交试验方法，通过大量实验对比优化，最终确定的PCR反应体系见表4。
表4
注：扩增模板加样量为4μL，总反应体积为25μL。
2.3 PCR扩增反应条件的确定
经过大量试验的对比优化，最终确定的PCR扩增反应条件见表5。
表5
2.4 探针和基因芯片的设计和实施
探针的设计根据以下原则进行设计：
1、探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40％－70％。
2、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，由于G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
3、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
设计好的探针由Invitrogen Trading公司合成，并在每条探针的5’端进行氨基修饰。探针合成后由公司人员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。通过氨基与羧基的缩合反应将探针固定在尼龙膜上，制备成检测生殖道病原体和HPV基因分型检测芯片。通过大量试验的优化和筛选，获得稳定、特异性强的检测和分型探针。此探针的长度和碱基组成会影响本试剂盒检测的特异性和准确性，因此，探针序列是本发明的保护内容。各位点的探针编号和序列见表6。膜条上探针位点图见表7。
表6
注，所有探针的5’端进行氨基(-NH2)修饰。
表7
2.5 杂交条件的确定
通过一系列优化实验，最终确定的杂交、洗膜和显色等条件如下：
2.5.1 杂交
取5mL的六联塑料盒，放入标有样本编号的膜条(用中性笔标记)，将六联塑料盒放入杂交仪中，加入A液1mL，48℃预热20分钟，然后将对应编号的变性后的两管PCR产物加入A液中，48℃杂交1.5小时。
2.5.2 洗膜
吸出A液，加入48℃预热B液的1mL，于48℃轻摇洗涤15分钟。
2.5.3 荧光显色
孵育液配方：A液：QD＝10000:1
按照孵育液配方配制孵育液，吸出B液，往每个孔格中加入孵育液1ml，室温轻摇孵育30分钟，吸出孵育液。每个孔格中加入A液1ml，室温轻摇洗膜5分钟。吸出A液，在荧光检测仪中观察结果，检测结果参见图1。
目前，现有专利中，除本发明可以实现一次试验即可同时进行生殖道病原体和HPV基因分型检测外，其它现有市场上的产品均不具备这样的功能，其检测生殖道病原体的种类也远远少于14种，而且多数为引起性传播疾病的病原体，如解脲脲原体、生殖支原体等。众所周知，生殖道感染疾病因感染致病菌不同而引起相关不同的炎症，所以现有的检测病原体的专利中，检测的致病菌不够全面，不能准确确定患者感染了何种妇科炎症，会给临床指导造成困扰。
而针对上述，本发明建立一种全面、快速地进行14种生殖道病原体检测和18种HPV基因分型检测的方法，并开发了相应的试剂盒。14种病原体的检测可以快速准确的诊断患者是否感染阴道炎及具体炎症类型，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。HPV基因分型检测可以实现对患者的宫颈病变风险进行个体化评估，从而指导临床医生对患者做出最佳的处理方案，有利于预防和尽早发现宫颈癌，有利于预测宫颈病变治疗残留/复发的风险。
综上所述，本发明提供的生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法，基于量子点和PCR技术，可实现14种生殖道病原体和18种HPV基因分型的同时检测，具有操作简单、价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测的优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种生殖道病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，包括第一PCR反应液、第二PCR反应液、探针、量子点和固定探针的膜条；
所述第一PCR反应液包括核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示的检测生殖道病原体的引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的内控引物；所述第二PCR反应液包括核苷酸序列如SEQ ID No.13-14的检测HPV分型的引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的内控引物；
其中，下游引物5’端均用生物素进行标记；
所述探针包括：
检测生殖道病原体的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.21-34所示；
检测HPV分型的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.35-52所示；
内控探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.53所示；
所述膜条的材质为尼龙。
2.根据权利要求1所述的生殖道病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端进行氨基修饰。
3.根据权利要求1所述的生殖道病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一PCR反应液的组分含量为：
水：12.7μL，
10×PCR buffer：2.5μL，
25mM MgCl2：1.5μL，
25mM dNUTP：0.2μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示的引物各0.5μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.5-6所示的引物各0.4μL，
10μM内控引物各0.1μL，
5U/μL Taq酶：1.0μL，
1U/μL UNG酶：0.1μL；
所述第二PCR反应液的组分含量为：
水：14.5μL，
10×PCR buffer：2.5μL，
25mM MgCl2：1.5μL，
25mM dNUTP：0.2μL，
10μM检测HPV分型的引物各0.5μL，
10μM内控引物各0.1μL，
5U/μL Taq酶：1.0μL，
1U/μL UNG酶：0.1μL。
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